TCSPC (TFH)
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Aktuelle Verfahren der biomedizinischen Optik Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung Time-correlated single-photon counting (TCSPC) 1 Messaufgabe und Messprinzip • Situation 1: diffuse Transmission oder Reflexion – Die Laufzeit des Lichtes durch eine Probe soll sehr genau gemessen werden – Die Probe transmittiert nur sehr wenig Licht (z.B. 10-10) • Situation 2: Fluoreszenz – Charakteristisches Fluoreszenzlicht von sehr gering konzentrierten Fluorophoren soll gemessen werden – Verschiedene Fluorophore können anhand der Fluoreszenzlebensdauer, d.h. der Zeit zwischen Anregung und Fluoreszenz, unterschieden werden • Messprinzip – Es wird eine große Zahl sehr kurzer Lichtpulse eingestrahlt – Für jeden Lichtpuls wird festgestellt, ob und wann ein Photon detektiert wird 2 Photomultiplier • Schema • Anschluss 3 Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung • Detektion einzelner Photonen eines periodischen Lichtsignals • Lichtintensität so gering, daß Wahrscheinlichkeit, in einer Periode überhaupt ein Photon zu detektieren, sehr klein • Perioden mit mehr als einem Photon sind extrem selten • Für jedes detektierte Photon wird die Zeit relativ zum anregenden Laserpuls gemessen • Über viele Pulse baut sich dann im Speicher eine Laufzeitverteilung auf • Zeitauflösung bis 25ps 4 TCSPC: Blockschaltbild • PMT: Pulse vom Photomultiplier • SYNC: Synchronpulse • CFD: Constant-Fraction Discriminator dienen zur genauen Festlegung der Zeit des Eintreffens der jeweiligen Pulse • TAC: Time-to-Amplitude Converter • PGA: Programmable Gain Amplifier verstärkt die TAC-Ausgangsspannung um einen einstellbaren Faktor • ADC: Analog-to-Digital-Converter wandelt die Zeit zwischen Photonenpuls und • Synchronpuls in eine Spannung durch Ladung eines Kondensators mit Konstantstrom wandelt die Spannung in eine Zahl, z.B. zwischen 0 (früheste Photonen) und 1024 (späteste Photonen) MEM: Memory hat z.B. 1024 Zähler, der der Zeit des Photons entsprechende wird um 1 erhöht 5 Constant Fraction Discriminator (CFD) • Problem: – die Ausgangspulse des Photomultipliers (detektierte Photonen) und evtl. die Synchronpulse (z.B. einzelne Laserpulse auf einer Photodiode) haben unterschiedliche Amplituden aber immer die gleiche Pulsform – die Zeit des Eintreffens der Pulse muss mit einer Zeitauflösung bestimmt werden, die viel kürzer als die Pulsdauer ist • Lösung: – es muß detektiert werden, wann ein bestimmter Bruchteil der Pulshöhe (constant fraction) erreicht ist • Ausführung – die Differenz aus dem eigentlichen Puls und dem zeitlich verzögerten Puls hat einen von der Amplitude unabhängigen Nulldurchgang – die Detektion dieses Nulldurchgangs liefert das gewünschte Signal 6 TCSPC: 4-Kanal-Modul • 27000 € 7 TCSPC Beispiel: Fluorescence Lifetime Imaging • Laser-Scanning Mikroskop • Zellschicht mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt • Farbdarstellung: Fluoreszenzlebensdauer 8
