Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

Aus dem Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Immunhistochemische Diagnostik
von intraokulären Melanomen bei Hund und Katze
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Silke Glage
aus Gronau/Leine
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer
1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer
2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M.H. Boevé
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2001
„ Der Gesichtssinn ist der Treffpunkt
zwischen Dingen und Denken,
er ist das Perlentor
zwischen Sonne und Sinn.“
(Jostein Gaarder)
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
6
2 Literatur
7
2.1 Auftreten von intraokulären Tumoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
2.1.1 Sekundäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze . . . . . . . . .
8
2.1.2 Primäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze . . . . . . . . . . .
9
2.1.3 Klinische und lichtmikroskopische Diagnose und Differentialdiagnose des okulären Melanoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
2.1.4 Therapie und Prognose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
2.1.5 Okuläre Melanome beim Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
2.2 Immunhistochemie zur Differenzierung von Melanomen . . . . . . . . . . .
21
2.2.1 Immunhistochemie der Melanomdiagnostik in der Humanmedizin . .
21
2.2.2 Immunhistochemie in der Diagnostik der Veterinärmedizin . . . . . .
22
3 Eigene Untersuchungen
27
3.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
3.1.1 Untersuchungsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
3.1.2 Präparation des Bulbus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
3.1.3 Paraffineinbettung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
3.1.4 Schnittherstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
3.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
3.2.1 Lichtmikroskopische Untersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
1
3.2.2 Auswertung der lichtmikroskopischen Untersuchungen . . . . . . . .
33
3.2.3 Immunhistochemische Untersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
3.2.4 Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
3.2.5 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
3.3 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
3.3.1 Vorberichte und makroskopische Untersuchungsergebnisse der Hunde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
3.3.2 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Hunde . . . . .
47
3.3.3 Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der Hunde . . . .
52
3.3.4 Vorberichte und makroskopische Untersuchungsergebnisse der Katzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
3.3.5 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Katzen . . . . .
69
3.3.6 Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der Katzen . . . .
75
3.3.7 Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse anderer okulärer
Tumore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
83
4 Diskussion
85
5 Zusammenfassung
96
6 Anhang
100
6.1 Bezugsadressen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
6.2 Reagenzien für die Immunhistologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
6.2.1 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
6.2.2 Demaskieren der Antigene mit Demaskierungslösung G . . . . . . . 101
2
6.2.3 Bleichen von Melanin mit Wasserstoffperoxid . . . . . . . . . . . . . 101
6.3 ABC-Methode der immunhistochemischen Färbungen . . . . . . . . . . . . 101
7 Literaturverzeichnis
104
3
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AEC 3- Amino-9-ethylcarbazol
bzw. beziehungsweise
chron. chronisch
DAB 3,3-Diaminobenzidin-tetra-hydrochloriddihydrat
EKH Europäisch Kurzhaar
E.-Nr. Einsendungsnummer
epith.Typ epitheloider Typ
Fa. Firma
GAM “goat anti mouse”
GAR “goat anti rabbit”
Æ
C Grad Celsius
ggr geringgradig
H.&E. Hämalaun-Eosin Färbung
hgr hochgradig
infiltr. infiltriert
k. kastriert
kD Kilodalton
4
Ln. Lymphonodus
m. männlich
mgr mittelgradig
Min. Minuten
nm Nanometer
Nr. Nummer
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Sp.A Spindelzelltyp A
Sp.B Spindelzelltyp B
Tab. Tabelle
w. weiblich
WHO World Health Organisation
z.B. zum Beispiel
m Mikrometer
5
1 Einleitung
Immunhistologische Färbungen haben in den letzten 15 Jahren in der Humanmedizin, insbesondere nach Etablierung der monoklonalen Antikörpern, zu einem enormen Fortschritt
in der Tumordiagnostik geführt. So können aufgrund der Oberflächenantigene Neoplasien
genau ihrem zytologischen Ursprungsgewebe zugeordnet werden und bieten dem Pathologen eine wesentliche Entscheidungshilfe bei der Diagnostik (HASTKA 1997). Auch in der
Veterinärmedizin hat die immunhistologische Diagnostik an Bedeutung gewonnen. Viele
in der Humanmedizin verwendeten Antikörper weisen eine Kreuzreaktivität zu Geweben
tierischen Ursprungs auf und sind so auch in der veterinärpathologischen Diagnostik verwendbar. Sie sollten jedoch vor ihrer routinemäßigen Anwendung auf ihre Spezifität im
jeweiligen Gewebe sowie in den unterschiedlichen Tierarten geprüft werden.
Das von zwei Arbeitsgruppen nahezu zeitgleich entdeckte Gen eines für Melanome spezifischen Proteins und der dazu entwickelte Antikörper Melan A wird in der Humanmedizin
bereits routinemäßig eingesetzt (KAWAKAMI et al. 1994, COULIE et al. 1994, CHEN et
al. 1996, FETSCH et al. 1997). Da dieser Antikörper eine Kreuzreaktivität zu caninen Gewebe aufweist, ist er auch für die veterinärmedizinische Diagnostik von Bedeutung. Seine
Spezifität und andere Eigenschaften an tierischen Geweben gilt es jedoch noch genau
zu evaluieren. In der Dissertation von VON REISWITZ 1999 wurden verschiedene canine
Gewebe und canine Tumoren auf eine Reaktion mit dem Antikörper Melan A untersucht.
Der Antikörper konnte dabei regelmäßig in kutanen und oralen Melanomen und in einem
okulären Melanom nachgewiesen werden. Des weiteren sind die in der Literatur bekannten positiven Reaktionen mit Sertoli- und Leydigzellen, den Granulosazellen der Ovarien
und Neoplasien der Nebennierenrinde aufgetreten. Positive Reaktionen traten außerdem
in epithelialen Gewebe der unveränderten Mamma auf.
Sowohl beim Hund als auch bei der Katze ist das okuläre Melanom der häufigste primäre
intraokuläre Tumor. In jüngster Zeit werden diese Neoplasien immer häufiger diagnosti6
ziert. Ob für diesen Anstieg die verbesserte Augenuntersuchung in der Kleintiermedizin
die Ursache ist, oder ob Umweltfaktoren wie eine erhöhte ultraviolette Einstrahlung eine
Rolle spielen, ist dabei noch ungeklärt. Ein für Melanome spezifischer Antikörper würde
die Unterscheidung zu anderen pigmentierten Tumoren erleichtern bzw. die Diagnostik
von amelanotischen Melanomen absichern. Ebenso würde es dem Kliniker ermöglichen,
dem Patientenbesitzer genauere Aussagen hinsichtlich der Prognose zu machen und die
weitere Therapie abzukären. Die vorliegende Arbeit untersucht die Spezifität und färberischen Qualitäten des Antikörpers Melan A an caninen und felinen okulären Melanomen
im Vergleich zu den in der Veterinärmedizin routinemäßig zur immunhistologischen Diagnostik von Melanomen eingesetzten Antikörpern S100 und Vimentin, die jedoch nicht
spezifisch für Melanome sind. Dabei soll die Kreuzreaktivität dieses Antikörpers sowohl
zu caninen als auch zu felinen Material gezeigt werden. Die zur Untersuchung ausgewählten Tumore am Auge von Hund und Katze sind im Rahmen der Auftragsdiagnostik
am Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in der lichtmikroskopischen Beurteilung (H. & E.-Färbung) als Melanom befundet worden. Diese Diagnose soll
hier mittels des neuen Immunmarkers Melan A überprüft werden.
2 Literatur
2.1
Auftreten von intraokulären Tumoren
Bei dem Auftreten von intraokulären Tumoren werden primäre und sekundäre oder metastatische Neoplasien unterschieden. Dabei sind metastatische Uveatumoren sowohl beim
Tier als auch beim Menschen häufiger zu finden als bisher angenommen wurde, wenn
systematisch nach ihnen gesucht wird (BARRON et al. 1963, SCHAEFFER u. JOSTEN
1999). So werden die uveovaskulären Karzinommetastasen beim Menschen als die häufigsten intraokulären Tumoren betrachtet (NELSON et al. 1983).
7
2.1.1
Sekundäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze
Da das Auge frei von Lymphbahnen ist, erfolgt die Metastasierung von Sekundärtumoren
in das Auge ausschließlich auf hämatogenem Weg (SCHAEFFER u. JOSTEN 1999).
In den meisten Fällen der in der Literatur beschriebenen metastatischen intraokulären Tumoren handelt es sich um einen epithelialen Primärtumor (BARRON et al. 1963), wobei zu
beachten ist, daß epitheliale Tumore häufiger vorkommen als mesenchymale (SCHAEFFER u. JOSTEN 1999). Dabei treten Mammakarzinome (LADDS et al. 1979, WEST et
al. 1979) und Lungenkarzinome am häufigsten als Primärtumoren auf (HAMILTON et al.
1984, GIONFRIDDO et al. 1990, HEIDER et al. 1997). Aber auch Adenokarzinome (DUNN
O´ROURKE u. GEIB 1970, BELLHORN 1972, MOISE et al. 1982, MURPHY et al. 1989,
ZIPS u. ZIPS 1991, HABIN u. ELSE 1995) und Plattenepithelkarzinome (COOK et al.
1984, HAYDEN 1976) sowie Metastasen von Nierenkarzinomen (HAIMOVICI et al. 1997)
und Sticker-Tumoren (BARRON et al. 1963, MILLER et al. 1990) werden diagnostiziert.
Selten kommen Medulloepitheliome (WILCOCK u. WILLIAMS 1980) und Metastasen von
Seminomen (HOGEN ESCH et al. 1987) vor. Von den mesenchymalen Tumoren werden
Metastasen von Hämangiosarkomen (SZYMANSKI 1972), Leiomyosarkomen, Fibrosarkomen (VERWER u. THIJE 1967, PEIFFER et al. 1978, PEIFFER 1983), Lymphomen
(SAUNDERS u. BARRON 1964, DARBES et al. 1999), Osteosarkomen (RENDER et al.
1982) und Gangliomen (SAUNDERS et al. 1969) mit Lokalisation im Auge beschrieben.
WILIAMS et al. (1981) nennt das uveale Lymphosarkom als den häufigsten intraokulären
metastatischen Tumor der Katze.
HABIN u. ELSE (1995) sind der Meinung, daß ein unilateral auftretender okulärer Tumorprozeß für eine primäre Neoplasie spricht, während ein bilaterales Auftreten auf eine Metastasierung hindeutet. Jedoch werden die Mehrzahl der Fälle von metastatischen
Uveatumoren mit bekanntem Primärtumor als unilateral beschrieben, so daß dies nicht
als allgemeingültig angenommen werden kann (SCHAEFFER u. JOSTEN 1999).
8
Bei der Katze wird als einziger Tierart ein post-traumatisches Tumorsyndrom beschrieben.
Dabei lag das Trauma bei der Diagnose typischerweise bereits mehrere Jahre zurück. Diagnostiziert wurden dabei Osteosarkome und undifferenzierte Sarkome. Da in den meisten
Fällen die Linsenkapsel rupturiert war, vermutet man bei dem post-traumatischen Tumorsyndrom das Linsenepithel als Ausgangsgewebe für das Tumorwachstum (WOOG et al.
1983, DUBIELZIG 1984, DUBIELZIG u. EVERITT 1986, PEIFFER 1986, MILLER et al.
1987, HAKASON et al. 1990).
Das Durchschnittsalter der betroffenen Tiere bei der Diagnose eines sekundären intraokulären Tumors liegt bei 10 Jahren (Hund) bzw. 11 Jahren (Katze). Die Prognose der
betroffenen Tiere wird als schlecht beurteilt, meist erliegen sie bald nach der okulären
Diagnose der Primärerkrankung (HASTKA 1997).
2.1.2
Primäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze
Primäre intraokuläre Tumore bei Hund und Katze sind selten (ACLAND 1979, DITERS
et al. 1983). Genaue statistische Angaben fehlen daher bislang in der Literatur (RYAN u.
DITERS 1984). Bei beiden Tierarten sind jedoch Melanome die am häufigsten beschriebenen primären okulären Neoplasien (GWIN et al. 1982, AGUIRRE et al. 1984, DUGAN et
al. 1993). In einer Statistik des Armed Forces Institute of Pathology wurden die Ursachen
von Enukleationen in 404 enukleierten caninen Augen erhoben. In 12% der Fälle waren
hier primäre Melanome der Grund, in 14% andere primäre okuläre Tumore und in 9% wurden okuläre Metastasen diagnostiziert (GELATT et al. 1979). In einer anderen Erhebung
des North Carolina Center for Comparative Ophthalmology waren 12 von 69 enukleierten
Augen uveale Melanome der Pars anterior (PEIFFER 1981).
Die Primärlokalisation des Melanoms befindet sich meist in Iris und Ciliarkörper, Uvea
anterior (ACLAND 1979, DITERS et al. 1983), selten im hinteren Augensegment, Uvea
postalis, wie es beim Menschen der Fall ist (WEISSE et al. 1985, BORNFELD et al. 1986).
9
So ist das klinische Bild eines sekundären Glaukoms häufig, da infolge des Dickenwachstums der Iris der Abflußwinkel für das Kammerwasser verlegt wird. Auch können frei in der
Augenkammer schwimmende Tumorzellen den Abflußwinkel verlegen. Weitere klinische
Merkmale sind Pigmentveränderungen, Linsentrübungen und Umfangszunahme des betroffenen Auges (COLLINSON u. PEIFFER 1995).
Es werden auch Fälle mit Primärlokalisation in der Uvea postalis beschrieben (McCLELLAND 1941, SAUNDERS u. BARRON 1958, WEISSE et al. 1971, DITERS et al. 1983).
Alle Autoren sind sich einig, daß diese Lokalisation selten beschrieben wird. Als klinischer
Befund ist hier eine Ablösung der Retina zu finden. Histologisch läßt sich eine hypertrophierte retinale Pigmentschicht feststellen. In einer Studie von fünf Melanomen mit Lokalisation in der Uvea postalis beschreiben DUBIELZIG et al. (1985) ein im Vergleich zum
Melanom der Uvea anterior auffallend gutartiges histologisches Erscheinungsbild und ein
Fehlen von infiltrativen Wachstum ebenso wie Anzeichen von Anaplasien der Tumorzellen. Sie folgern daraus ein vorwiegend benignes Verhalten von primären Melanomen der
Uvea postalis beim Hund, wie es auch beim Mensch bekannt ist. Allerdings räumen sie
eine schlechtere Prognose für Neoplasien ein, die auf den Nervus opticus übergreifen. Sie
vermuten außerdem, daß das vermehrte Diagnostizieren von Melanomen der Uvea anterior auf die oft ungenügende Augenhintergrunduntersuchung bei Hunden zurückzuführen
sei (WEISSE et al. 1985). O‘TOOLE u. MURPHY (1983) stellen Ähnlichkeiten mit den
uvealen Melanomen der Uvea postalis des Menschen fest. Sie vermuten den Ursprung
dieser ihrer Meinung nach ebenfalls benignen Veränderungen in Naevi und beschreiben
im Fall eines Schnauzers eine Ruptur der Bruchschen Membran, naevus-ähnliche Zellen
und ein orange-gelbes Pigment, welches ebenfalls beim Menschen im uvealen Melanom
der Pars posterior gefunden wird.
Das okuläre Melanom tritt meist unilateral und ohne Seitenbevorzugung auf (SAUNDERS
u. BARRON 1958), es werden jedoch auch sehr seltene Fälle von bilateralem Auftreten
beschrieben (BUCKLER 1931, SCHAEFFER u. FUNKE 1985).
10
Zur Metastasierung der primären okulären Melanome fehlen genaue systematische Untersuchungen bei Hund und Katze (SCHAEFFER u. FUNKE 1985). Es werden dazu in
der Literatur sehr unterschiedliche Angaben und Vermutungen geäußert. Alle Aussagen
bestätigen jedoch, daß das primäre okuläre Melanom metastasiert, auch nach Bulbusentfernung und teilweise mit mehreren Jahren Inzidenzzeit.
Die histologische Klassifizierung der Melanome erfolgte meist nach den 1974 von KIRCHER und Mitarbeitern ausgearbeiteten und von der WHO übernommenen morphologischen Kriterien für das primär-okulare maligne Melanom. Diese Einteilung orientierte sich
an der ursprünglich von CALLENDER (1931) für das primäre intraokulare Melanom beim
Menschen begonnenen Einteilung der morphologischen und klinischen Kriterien. Dabei
wird von einer zunehmenden Malignität in der folgenden Reihenfolge der histologischen
Befunde ausgegangen:
Spindelzelltyp A (längliche Tumorzellen mit ovoiden Kernen ohne Kernkörperchen)
Spindelzelltyp B (plumpe, teilweise pigmentierte Spindelzellen mit großen Kernen und
deutlichen Kernkörperchen)
epitheloider Zelltyp (pigmentreiche, polyedrische Zellen mit großen Kernen und deutlichen
Kernkörperchen)
gemischtzelliger Typ (variierend aus spindelförmigen und epitheloiden Zellen zusammengesetztes Zellbild)
Diese Malignitätseinteilung konnten SCHAEFFER et al. 1985 in ihrer Studie bestätigen.
Sie berücksichtigten außerdem weitere histologische Kriterien wie einen hohen Pigmentgehalt, eine hohe Mitoserate, ein geringer Gehalt an von Tumorzellen produzierten Retikulinfasern und das Vorkommen von Tumorzellnekrosen. Auch ein expansiv-infiltratives
Wachstum mit Skleraeinbruch und Hornhautinfiltration gehört zu den Malignitätszeichen.
Dabei muß beachtet werden, daß der Pigmentgehalt des epitheloiden Zelltypes bei der
Katze auffallend gering ist und auch Retikulinfasern weniger vorkommen (SCHAEFFER
11
u. FUNKE 1985).
Primäre intraokuläre Melanome beim Hund
Beim Hund treten die okulären Tumore vorwiegend in der vorderen Uvea auf. Melanome
sind dabei etwa doppelt so häufig wie andere Neoplasien und damit die häufigsten primären intraokulären Tumore beim Hund (SAUNDERS u. BARRON 1958, ACLAND 1979,
DITERS et al. 1983). Insgesamt treten intraokuläre Melanome beim Hund seltener auf als
kutane und orale Melanome (SCHAEFFER u. FUNKE 1985).
Das durchschnittliche Alter der Hunde zum Zeitpunkt der Diagnose eines okulären Melanoms liegt bei 9 Jahren (MARTIN 1994) bzw. 8 Jahren (DITERS et al. 1983, SCHAEFFER
u. FUNKE 1985).
Das histologische Erscheinungsbild beim Hund wird als vorwiegend benigne beschrieben,
es kommen oft sogenannte “baloon cells” vor. Dies sind große, runde Zellen mit kleinem
Zellkern und viel feingranuliertem Melanin, deren Entstehung unbekannt ist (CALDERWOOD MAYS et al. 1985). Auch WEISSE et al. (1985) beschreiben das Auftreten von
plumpen Zellen, die mit Melanosomen gefüllt sind. Sie können nicht unterscheiden, ob es
sich hierbei um Melanocyten oder Makrophagen handelt. Sie beschreiben außerdem eine Autophagozytose, die abhängig vom Alter in unveränderten Melanosomen auftritt, und
die sie ebenfalls in malignen Melanozyten beim Tier gefunden haben. In einer Studie von
insgesamt 23 okulären Melanomen beim Hund ordnen DITERS et al. (1983) 12 Tumoren
dem Spindelzell A-Typ zu, vier dem Spindelzell B-Typ, nur eines dem Epitheloidzelltyp und
fünf dem gemischtzelligen Typ. Die großen, mit viel Pigment beladenen Zellen, die an beladene Makrophagen erinnern, bezeichnen sie als Tumorzellen mit eigener Synthese von
Melanosomen.
Das Auftreten von intraokulären Melanomen beim Hund ist spontan (SCHAEFFER u.
FUNKE 1985), konnte allerdings beim Beagle durch eine einmalige intravenöse Injektion
von radioaktiven Nucleotiden (Radium 226) induziert werden (TAYLOR et al. 1972).
12
Eine Disposition wird bei den Hunden bei Dackel, Boxer und Schäferhund vermutet (RYAN u. DITERS 1984, SCHAEFFER u. FUNKE 1985). DITERS et al. (1983) konnten in
ihrer Untersuchung von 23 intraokulären Melanomen allerdings keine Rassedisposition
nachweisen. AGUIRRE et al. (1984) stellen ein gehäuftes Auftreten von Melanomen in
der Uvea postalis beim Beagle fest.
Es herrscht ein ausgeglichenes Geschlechterverhältnis (COLLINSON u. PEIFFER 1995).
Zu der Frage nach dem Metastasieren von primären intraokularen Melanomen finden sich
in der Literatur sehr unterschiedliche Meinungen. In einigen Untersuchungen sind Metastasierungen von primären okulären Melanomen beim Hund relativ selten (O´TOOLE u.
MURPHY 1983). In verschiedenen Studien werden 2 von 27, 2 von 31, 1 von 22 bzw. 7
von 129 Fälle mit Metastasen beschrieben (DITTER et al. 1983, RYAN u. DITERS 1984,
WILCOCK u. PEIFFER 1985). SAUNDERS u. BARRON (1958) sind dagegen der Auffassung, eine Metastasierung tritt häufiger auf. RYAN u. DITERS (1984) differenzieren
nach dem Zellbild. Sie halten die Metastasierungsgefahr bei epitheloiden und gemischtzelligen Tumoren beim Hund für höher als bei einem spindelförmigen Zellbild. Für eine
allgemeine Aussage reicht ihrer Meinung nach die alleinige Auswertung des histologischen Bildes allerdings nicht aus. Sie schließen sich damit weiteren Arbeitsgruppen an
und fordern für eine sichere Aussage Untersuchungen aus Langzeitstudien (KIRCHER
et al. 1974, O‘TOOLE u. MURPHY 1983). TRUCKSA et al. (1985) sind der Meinung, die
einzigen Indikatoren für eine mögliche Metastasierung seien extrasklerale und sekundäre
Glaukome, dagegen meinen WILCOCK u. PEIFFER (1985), eine Prognose bezüglich der
Metastasierung sei nur anhand des Mitoseindexes zu stellen. Sie kommen dabei auf eine
Metastasierungsrate von 5-7%. SCHAEFFER u. FUNKE 1985 ziehen aus den Aussagen
ihrer Kollegen und aus eigenen Untersuchungen 1985 den Schluß, daß das primäre intraokuläre Melanom beim Hund häufig, aber erst spät metastasiert.
Insgesamt scheinen beim Hund okuläre Adenokarzinome eher zur metastasieren als Melanome (MARTIN et al. 1994).
13
Primäre intraokuläre Melanome bei der Katze
Auch bei der Katze fehlen genaue statistische Angaben zum Auftreten von primären okulären Tumoren. Insgesamt sollen sie jedoch seltener auftreten, als beim Hund (ACLAND
1979, SCHAEFFER u. FUNKE 1985), wobei das Melanom bei der Katze ebenso wie beim
Hund der häufigste intraokuläre Tumor ist (DUBIELZIG et al. 1985, WEISSE et a. 1985,
COLLINSON u. PEIFFER 1995, DAY u. LUCKE 1995). Okuläre Melanome treten bei der
Katze häufiger auf, als kutane und orale Melanome (PRIESTER u. McKAY 1980, PATNAIK u. MOONEY 1988). Vorwiegend tritt das primäre intraokuläre Melanom der Katze
wie auch beim Hund in der vorderen Uvea auf (BELLHORN u. HENKIND 1970, SOURI
1978, ACLAND et al. 1980, DUNCAN u. PEIFFER 1991).
Im Rahmen der ophthalmopathologischen Diagnostik am GSF-Institut für Pathologie in
den Jahren 1990-1992 fällt abweichend zu den Literaturangaben eine zunehmende Häufigkeit von okulären Melanomen bei der Katze auf (SCHAEFFER u. GORDON 1993).
Klinisch ist bei der Katze das okuläre Melanom der Uvea anterior durch eine diffuse oder
fokale braune Pigmentierung der Iris gekennzeichnet, die leicht erhaben zu sein scheint.
Durch ein fortschreitendes Dickenwachstum verformt sich die Iris wellenförmig und verengt so den Filtrationswinkel. Es entsteht ein sekundäres Glaukom. In 14 von 37 untersuchten felinen okulären Melanomen am GSF-Institut für Pathologie konnte dieser Prozeß
nachgewiesen werden (SCHAEFFER u. GORDON 1993). Des weiteren werden häufig
Hydrophthalmus und Ophthalmie beobachtet (PATNAIK u. MOONEY 1988).
Das Durchschnittsalter bei der Katze zum Zeitpunkt der Diagnose wird mit neun Jahren
(SCHAEFFER u. FUNKE 1985), zehn Jahren (SCHAEFFER u. GORDON 1993), bzw elf
Jahren (PATNAIK u. MOONEY 1988) angegeben.
Bei der Katze ist das Zellbild der okulären Melanome vorwiegend maligne (BELLHORN u.
HENKIND 1970, ACLAND et al. 1980). Die Tumore sind häufig pigmentarm (SCHAEFFER
u. FUNKE 1985, PATNAIK u. MOONEY 1988), bestehen vorwiegend aus epitheloiden
14
Zellen (PEIFFER 1981) und zeigen vielfach eine diffuse Wuchsform mit anaplastischen
Epitheloidzellen und Kernpleomorphien. So waren in einer Studie dieser Arbeitsgruppe
35 von 37 intraokulären Melanomen der Katze vom epitheloiden Zelltyp. Zwei von 37 untersuchten Fällen waren vom gemischtzelligen Typ. Außerdem wurde ein hohen Anteil an
Fällen mit Sklerainvasion beobachtet. Hierdurch kann es zum Eindringen von Tumorzellen in den intraskleralen Plexus venosus und damit zur Metastasierung kommen. Diese
Beobachtung steht mit der in der Literatur allgemeinen Meinung einer häufigen Metastasierung des felinen primären intraokulären Melanoms im Einklang (SCHAEFFER u.
GORDON 1993). Dies zeigt eine im Vergleich zu den primären intraokulären Melanomen der Hunden höhere maligne Potenz. Warum das primäre intraokuläre Melanom der
Katze dabei jedoch häufig amelanotisch bzw. pigmentarm ist, bleibt ungeklärt (SOURI
1978, SCHULTZE SCHLEITHOFF u. OPITZ 1983). ACLAND et al. (1980) beschreiben
in einer Veröffentlichung drei Fälle von primär-intraokulären Melanomen bei der Katze,
die ein benignes histologisches Bild zeigen. Sie betonen jedoch das seltene Auftreten
dieses Erscheinungsbildes bei der Katze. Die beobachteten Neoplasien zeigten ein langsames, diffuses Wachstum, das Auftreten sogenannter “baloon cells”, wie sie vom Hund
und Menschen bekannt sind ebenso wie epitheloide Zellen mit Zeichen von Anaplasie, die
den Abflußwinkel des Kammerwassers verlegen und so zu einem sekundären Glaukom
führten. Es wurden keine Metastasen beobachtet.
Das Auftreten von intraokulären Melanomen ist auch bei der Katze spontan (SCHAEFFER
u. FUNKE 1985). Es kann jedoch durch Injektion von felinen Sarkomavirus in die vordere
Augenkammer induziert werden (ALBERT et al. 1981).
Bezüglich einer Disposition bestimmter Katzenrassen sind in der Literatur keine Angabe
vorhanden. In ihrer Untersuchung von 16 intraokularen Melanomen fanden PATNAIK u.
MOONEY (1988) folgende Rasseverteilung: 11 Domestic short hair, 3 Domestic long hair,
1 Siamese und 1 Perser.
Bei der Katze wird von SCHAEFFER u. FUNKE (1985) sowie SCHAEFFER u. GORDON
15
(1993) ein vermehrtes Erkranken männlicher Tiere an primären intraokulären Melanomen
beobachtet, dabei aber eingeräumt, daß sonst in der Literatur ein ausgeglichenes Geschlechterverhältnis beschrieben wird. BELLHORN u. HENKIND (1970) dagegen finden
mehr weibliche Tiere, die an primären intraokulären Melanomem erkrankt sind.
Auch bei der Katze gibt es in der Literatur unterschiedliche Meinungen bei der Frage nach
dem Auftreten von Metastasen des primär-intraokulären Melanoms. So wird ihm einerseits
trotz des malignen Zellbildes und Skleraeinbrüchen eine allgemein geringe Neigung zu
schnellem Wachstum und Metastasierung zugesprochen (SCHULTZE SCHLEITHOFF u.
OPITZ 1983, CHAUDIEU u. FONK 1981). DUNCAN u. PEIFFER (1991) beschreiben eine
lange Latenzperiode der Metastasen des intraokulären Melanoms bei der Katze. ACLAND
et al. beobachteten andererseits 1980 ein schnelles Wachstum und eine frühe Metastasierung. SCHAEFFER u. GORDON (1993) lehnen eine verbindliche Aussage zum Risiko des
Metastasierens aufgrund unzureichender Folgeuntersuchungen der enukleierten Katzen
ab. PATNAIK u. MOONEY (1988) fanden in einer Untersuchung von 16 intraokulären Melanomen der Katze in 63% eine Metastasierung. Von diesen Tieren konnten sie in 14 Fällen
Informationen zum weiteren Krankheitsverlauf bekommen. So wurden von den 14 Katzen
10 nach einem Zeitraum von durchschnittlich 156 Tagen aufgrund des Tumors getötet,
nur vier lebten nach durchschnittlich 255 Tagen noch. In einer Auswertung von 50 in der
Literatur beschriebenen primär-okulären Melanome bei der Katze finden SCHAEFFER u.
GORDON (1993) insgesamt 18 Fälle mit Metastasen, im eigenen Untersuchungsmaterial
3 von 37. Die Metastasen traten dabei nach einer Latenzperiode von wenigen Monaten bis
zu zwei Jahren post enukleationem auf. Der Hauptsitz lag dabei in der Leber, an zweiter
Stelle stand die Lunge (DUBIELZIG 1990). Dieses Verteilungsmuster der Metastasen wird
auch beim Menschen beobachtet (ZIMMERMANN 1986). PATNAIK u. MOONEY (1988)
finden dagegen den Hauptsitz der Metastasen bei den Katzen in den mandibulären und
submandibulären Lymphknoten (8 von 10), in den restlichen zwei Tieren lag eine diffuse
Verteilung der Metastasen in nahezu allen visceralen Organen und der Skelettmuskulatur
16
vor.
2.1.3
Klinische und lichtmikroskopische Diagnose und Differentialdiagnose des
okulären Melanoms
Das primär-intraokulare Melanom zeigt ein klinisch wie morphologisch variables und differenzialdiagnostisch schwieriges Erscheinungsbild (SCHAEFFER u. FUNKE 1985). So
wurden nur 14 von 37 zur Diagnostik an das GSF-Institut für Pathologie eingesandte enukleierte Augen mit Melanomen von Katzen vom Kliniker als solche im Vorfeld diagnostiziert
(SCHAEFFER u. GORDON 1993). Lichtmikroskopisch zeigen vor allem die Melanome
der Katze ein variables Erscheinungsbild. Sie sind häufig pleomorph, unregelmäßig pigmentiert oder amelanotisch und zeigen Nekrosen und Blutungen (PATNAIK u. MOONEY
1988). Sie sind im Gegensatz zu den gut pigmentierten Melanomen schwierig zu diagnostizieren (SCHULTZE SCHLEITHOFF u. OPITZ 1983). Dies bestätigt auch HASTKA
(1997). Er stellt fest, daß die melaninhaltigen Melanome histologisch meist keine differenzialdiagnostischen Probleme machen, amelanotische Melanome dagegen häufig als
entdifferenzierte Karzinome oder Lymphome fehldiagnostiziert werden. Er weist darauf
hin, sich bei dem Verdacht des Vorliegens eines Melanomes nicht ausschließlich auf die
Immunhistologie zu verlassen und auch nach Melaningranula in den Zellen zu suchen.
Häufig weisen auch amelanotische Formen des Melanoms vereinzelt melaninhaltige Zellen auf .
Für den Kliniker kommen differenzialdiagnostisch Pigmentflecken der Iris anderer Genese
in Frage, wie zum Beispiel benigne hyperplastische Melanozyten (Sommersprossen) oder
Irisnaevi (benigne Zellproliferation neuroektodermalen Ursprungs) (PEIFFER 1981). Unter
Umständen kann mittels einer Biopsie ein Irismelanom histologisch ausgeschlossen werden. Ebenso sollte dies bei einer diffusen Pigmentveränderung mit Dickenwachstum der
Iris erfolgen (SCHAEFFER u. FUNKE 1985). Dabei ist allerdings die Gefahr der intraoku-
17
lären Aussaat von Tumorzellen und damit der Metastasierung zu beachten (SCHAEFFER
u. GORDON 1993). Beim Hund sind weiter frei in der Augenkammer schwimmende oder
an Iris und Ziliarkörper fixierte, pigmentierte Zysten bekannt, die eine Glaukomsymptomatik auslösen können (CARTER u. MAUSOLF 1970). Bei der Katze gibt es altersbedingte
oder als Folge von Entzündungen entstandene fokale Pigmentierungen der Uvea anterior.
Im Falle solch fraglicher Läsionen ist eine Kontrolle in regelmäßigen zeitlichen Abständen
empfehlenswert (SCHAEFFER u. GORDON 1993).
Die klinische Unterscheidung zu Adenomen und Adenokarzinomen, der zweithäufigsten
Tumorgruppe bei dem primären intraokulären Tumoren von Hund und Katze, ist äußerst
schwierig und erfordert eine histologische Abklärung (KELLER 1981). Diese Tumore infiltriern meist nicht diffus die Uvea anterior, sondern profilieren als nicht pigmentierter
Tumor im vorderen Augensegment (Adenom) oder im gesamten okulären Binnenraum
(Karzinom) (SCHAEFFER u. THYSSEN 1987). Das Lymphosarkom der Uvea anterior
ist ebenfalls eine nichtpigmentierte, die Uvea anterior infiltrierende Tumorerkrankung, die
allerdings meist nur bei dem systemischen Krankheitsbild der Leukose mit einer okulären
Manifestation auftritt (SCHAEFFER u. GORDON 1993).
2.1.4
Therapie und Prognose
Das uveale Melanom wird von PFEIFFER et al. (1979) als eine lebensbedrohliche Tumorerkrankung angesehen, dessen Prognose auch nach einer OP infaust ist. PATNAIK u.
MOONEY (1988) finden in ihrer Studie, in der 16 uveale Melanome von Katzen untersucht
worden sind, bei 10 Tieren Metastasen. Weitere Arbeitsgruppen unterscheiden beim Hund
hinsichtlich der Prognose zwischen benignen und malignen histologischen Erscheinungsbildern. So sind ihrer Meinung nach die Mehrzahl der intraokulären Melanome benigne
und damit nur lokal invasiv und zerstörend. Diese Melanome bedrohen aber das Leben
des Patienten nicht durch Metastasen. Die selten vorkommenden malignen Melanome
18
dagegen metastasieren häufig (DITERS et al. 1983, RYAN u. DITERS 1984, WILCOCK
u. PEIFFER 1986).
Bei uvealen Melanomen, die kein diffuses Wachstum zeigen und noch keinen Visusverlust verursacht haben, kann auch eine sektorenfömige Iridektomie bzw. Iridozyklektomie
versucht werden (PEIFFER 1981).
Dagegen empfehlen SCHAEFFER u. GORDON (1993) nach der Diagnose eines okulären
Melanoms bei der Katze die sofortige Enukleation, auch wenn an dem betroffenen Auge
noch keine Folgeerscheinungen mit Visusverlust aufgetreten sind. Sie halten die Gefahr
eines Einbruches des Tumors in die Sklera anterior und einer damit verbundenen Metastasierung für zu hoch. Ebenso empfehlen sie in ungeklärten Fällen mit dem dringenden
Verdacht eines okulären Melanoms die sofortige Enukleation. Dabei sollte eine sorgfältige
Allgemeinuntersuchung mit Röntgen von Thorax und Abdomen vorausgehen, um Metastasen auszuschließen. Beim Menschen ist bekannt, daß es während der Enukleation zu
einer massiven Ausschwemmung von Tumorzellen in den Kreislauf kommen kann und
somit das Risiko einer Metastasierung hoch ist. Deshalb sollte die Enukleation möglichst
atraumatisch durchgeführt werden (ZIMMERMANN 1986).
2.1.5
Okuläre Melanome beim Menschen
In Mitteleuropa tritt das maligne Melanom beim Menschen mit einer Häufigkeit von 1-2 %
aller diagnostizierten Tumoren auf. Der Anteil steigt jedoch bei Menschen, die in sonnenreichen Gebieten leben. So beträgt die Häufigkeit in Australien 10 % aller diagnostizierten
Tumoren (GARBE u. ORFANOS 1993). Davon tritt jedoch das primär-okuläre Melanom
beim Menschen weitaus seltener als das kutane Melanom auf. Es wird mit einer Inzidenzrate von 1:100.000 angegeben (CUTLER u. JUNG 1975). Im Gegensatz zu Hund und Katze tritt das maligne Melanom der Iris in nur 8% der intraokulären Melanome auf (HOGAN
u. ZIMMERMAN 1962, YANOFF u. FINE 1975). Hauptsitz der Neoplasie beim Menschen
19
ist die Uvea postalis (WEISSE et al. 1985, BORNFELD et al. 1986). Beim Menschen werden außerdem promovierende Faktoren wie Rasse, Alter und geographischer Lebensraum beschrieben. Dazu kommen genetische und umweltbedingte Faktoren. Ebenfalls
bekannt ist das Auftreten einer kongenitalen Melanosis oculi. Diese Hyperpigmentation
begrenzter Areale im Auge ist bekannt dafür, häufig zu entarten (ZIMMERMANN 1986).
Das durchschnittliche Alter der Menschen bei der Diagnose des okulären Melanoms liegt
bei den Frauen bei über 60 Jahren, bei den Männern bei über 70. Dabei tritt das okuläre Melanom häufiger bei Männern als bei Frauen auf (NAUMANN 1980). Das uveale
Melanom wird bei blauäugigen, blonden und hellhäutigen Menschenrassen häufiger diagnostiziert, als bei allen nichtweißen Rassen, wie Asiaten und Schwarzen. Damit liegt das
höchste Tumorrisiko bei den Skandinaviern. ZIMMERMANN (1986) beschreibt eine inverse Korrelation zwischen dem Pigmentgehalt des Auges und dem Tumorrisiko. Dementsprechend tritt das uveale Melanom des Menschen in Afrika und Asien weitaus seltener
auf als in Europa und Nordamerika. Es scheinen demnach auch die ultravioletten Strahlen nicht den Einfluß auf das Auftreten von uvealen Veränderungen zu haben, wie bei
kutanen Neoplasien. Abgesehen von der geographischen Verteilung tritt das uveale Melanom beim Menschen hauptsächlich in der Uvea postalis auf, die gegen die Exposition
von ultravioletten Strahlen durch ihre Lage viel besser geschützt ist als die Uvea anterior .
Hinsichtlich der Prognose werden beim Menschen sowohl Lage, Größe und Pigmentgehalt als auch das histologische Erscheinungsbild berücksichtigt. Dabei werden die meisten
der uvealen Melanome als maligne eingestuft (McLEAN et al. 1977, 1982). Eine Enukleation steigert in der Meinung einiger Autoren das Risiko eines Metastasierens (ZIMMERMANN u. McLEAN 1979, McLEAN et al. 1982).
20
2.2
Immunhistochemie zur Differenzierung von Melanomen
Die Immunhistochemie ist zu einer der wichtigsten Methoden in der humanen Tumordiagnostik geworden (MIETTINEN 1993) und hat auch in der Veterinärmedizin eine weite
Verbreitung gefunden, da viele in der Humanmedizin verwendete Antikörper eine Kreuzreaktivität zu Geweben tierischen Ursprungs aufweisen (SANDUSKY et al. 1987, LAROCK
u. GINN 1997). So können mit Hilfe von mono- und polyklonaler Antikörper zellassoziierte
Antigene gefunden werden und bei der Identifizierung des Ausgangsgewebes neoplastischer Veränderungen wichtige Hinweise liefern. Aufgrund der häufig mangelnden Spezifität der Antikörper und der wechselnden Antigenexpression einiger Tumoren sollte die
Immunhistochemie jedoch nur in Verbindung und zur Bestätigung der histopathologischen
Diagnose verwendet werden (NEUMANN et al. 1990).
2.2.1
Immunhistochemie der Melanomdiagnostik in der Humanmedizin
Der immunhistochemische Nachweis von Melanomen in der Humanmedizin kann mit verschiedenen Antigenen erfolgen. Diese lassen sich folgendermaßen unterteilen (HASTKA
1997):
- Oberflächenantigene: Glykoproteine ( z.B. Epitope p94, p97a - c), Polypeptide ( z.B.
p210), Ganglioside.
- Plasmaproteine wie z.B.: S100 ( Ca-bindendes Protein), NKI/C3, HMB45 .
- Peptide wie: Vimentin und Zytokeratine.
Die Oberflächenantigene sind alle mehr oder weniger spezifisch für Melanome. Am regelmäßigsten expremiert werden die 97 Kilodalton schweren Gykoproteine (WOODBURY
et al. 1975). Diese sind jedoch am stärksten in melaninhaltigen Zellen nachweisbar, am
schwächsten in amelanotischen Melanomen, was ihren Nachweis mittels Farbreaktion erschwert. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß sie nur in relativ frischen Präparaten
21
nachweisbar sind (bis zu drei Tagen) (HASTKA 1997). Die Expremierung der anderen
aufgeführten Antigene ist nur unregelmäßig ausgeprägt.
Das immunzytologische Bild normaler Melanozyten und maligner Melanome ist folgendes:
Zytokeratin
Vimentin
S100
HMB 45
negativ
positiv
positiv
positiv
Dabei sind bei Vimentin und S 100 die kräftigsten Färbungen bei amelanotischen Melanomen zu beobachten, während sie in pigmentierten Zellen deutlich schwächer ausfällt
(HASTKA 1997).
In der humanen Routinediagnose haben sich die Antikörper gegen S100 und HMB45
durchgesetzt. Großer Vorteil von HMB45 ist, daß mit ihm zum Teil maligne von benignen
Läsionen abgegrenzt werden können. Bei PALAZZO u. DURAY (1989) waren drei von vier
benignen Läsionen negativ. Allerdings sind auch oft maligne Melanome negativ, die aus
benignen Veränderungen oder Naevi entstanden sind (GOWN et al. 1986, BUSAM et al.
1998) und die Färbung in malignen Melanomen ist häufig nur unregelmäßig und fleckig
(PALAZZO u. DURAY 1989).
2.2.2
Immunhistochemie in der Diagnostik der Veterinärmedizin
Für die Immundiagnostik in der Veterinärmedizin scheidet HMB 45 als Marker aus. In
einer Untersuchung von sieben verschiedenen humanen Antikörpern an caninen Melanomen stellten BERRINGTON et al. (1994) bei folgenden Antikörpern keine Kreuzreaktivität
fest: HMB 45, HMB 50, 225.28S, NKI/C3 und NKI/beteb. Sie sind daher für die Immunhistologie in der veterinärmedizinischen Diagnostik ungeeignet. Zwei ihrer untersuchten Antikörper, HMSA-1 und HMSA-5, zeigen in 60% bzw 69% der untersuchten Gewebeproben
ein positives Ergebnis. Allerdings reagiert HMSA-1 ebenfalls mit einigen Plasmazytomen,
Granularzelltumoren und Basalzelltumoren. Um das Ergebnis in der Praxis aussagekräf22
tiger zu machen, raten sie, die beiden Antikörper zu kombinieren. Sie kommen dann auf
eine Positivreaktion von 83%. In ihrem Untersuchungsgut befanden sich zwei uveale Melanome. Diese sind von beiden Antikörpern als solche erkannt worden.
Ein weiterer monoklonaler Antikörper, der mit caninen Melanomen reagiert ist IBF9, der
1992 von OLIVER u. WOLFE entwickelt wurde. In ihrer Studie reagierten 24 von 38 caninen Melanomen positiv. Es wurde ebenfalls bei einigen Karzinomen, Basalzelltumoren
und kutanen Lymphosarkomen eine Kreuzreaktion festgestellt.
Zur Routinediagnostik von Melanomen in der Veterinärmedizin werden zur Zeit verschiedene zellassoziierte Antigene benutzt, auf die im folgenden weiter eingegangen wird.
Intermediäre Filamente
Das Zytoskelett der Zelle setzt sich aus verschiedenen faserartigen Systemen zusammen. In der Ultrastruktur kann man drei verschiedene Faserstrukturen unterscheiden: die
ca. 6 m im Durchmesser messenden Mikrofilamente, die 22 nm dicken Mikrotubuli und
schließlich die 7-11 nm im Durchmesser messenden intermediären Filamente. Die zwei
erstgenannten Strukturen bestehen in jeder Zelle, gleich welcher Herkunft, immer aus
dem jeweils gleichen Protein: die Mikrofilamente aus Aktin, die Mikrotubuli aus Tubulin.
Dagegen setzen sich die intermediären Filamente aus unterschiedlichen Proteinen zusammen, die wiederum spezifisch für jedes Gewebe sind. Sie sind somit für den Nachweis und die Beurteilung von Geweben von großer Bedeutung. Ein weiterer Vorteil der
intermediären Filamente liegt darin, daß sie sowohl in gesunden Zellen als auch in deren neoplastischen Formen vorkommen (HASTKA 1997). Die in der Immunhistochemie
wichtigsten intermediären Filamente sind Zytokeratine als spezifische Struktur von Epithelzellen, Vimentin für Zellen mesenchymaler Herkunft, Desmin für Muskelzellen, Gliafilament für Gliazellen und Neurofilament für neurogene Strukturen. Mit Ausnahme der
Neurofilamente bestehen sie aus einem bzw. mehreren (Zytokeratin) Polypeptiden mit
einem Molekulargewicht von 40-68 kD. Das Neurofilament setzt sich aus einem Protein-
23
triplett zusammen mit den Molekulargewichten 68kD, 145kD und 220 kD (OSBORN et al.
1983). Alle intermediären Filamente besitzen eine Proteinuntereinheit, die eine zentrale
alpha-Helixstruktur mit 311-314 Aminosäuren aufweist. Je nach ihrer Funktion variieren
die jeweiligen C- und N-terminalen Enddomänen (STEINERT et al. 1985).
Von Bedeutung bei der Diagnostik der Melanome ist das eigentlich für Zellen mesenchymaler Herkunft spezifische intermediäre Filament Vimentin. Es wiegt 58kD und ist in
Fibrozyten, -blasten, Osteozyten, -blasten, Myozyten, -blasten, Lymphozyten, Neuroblasten, Schwann-Zellen, Sertolizellen, Granulosaluteinzellen und in Melanozyten nachweisbar (FRANKE et al. 1979, RAMAEKERS et al. 1982, DENK et al. 1983, SANDUSKY et al.
1985, MIETTINEN 1993, MOLL 1993). Ebenso positiv sind die meisten Knochentumore
(LOENING et al. 1970), maligne Melanome (CASELITZ et al. 1983) und nichtmuskuläre
Sarkome (ALTMANNSBERGER et al. 1986), ausgenommen des synovialen (MIETTINEN
et al. 1984) und des epitheloiden Sarkoms (CHASE et al 1984). Lymphome reagieren
meist nur heterogen positiv (GIORNO u. SCIOTTO 1985). In einer Studie von NEUMANN
et al. (1990) waren 16% der untersuchten mesenchymalen Tumoren Vimentin-negativ.
Er führte dies auf eine weitgehende Enddifferenzierung der Neoplasien, verbunden mit
einem Verlust der Antigene zurück.
S100
Das S100-Protein ist ein weiteres zelluläres Antigen im Zytoplasma, welches in der immunhistochemischen Diagnostik von Melanomen Verwendung findet (HASTKA 1997). Es
gilt heute als der klassische Melanommarker und wurde erstmals 1965 von MOORE aus
Rinderhirnextrakten isoliert . Seinen Namen bekam es aufgrund seiner Löslichkeit in 100%
Ammoniumsulfat bei neutralem pH. Es werden drei Dimere unterschieden, die aus je zwei
Untereinheiten, der alpha-Kette und der beta-Kette gebildet werden (ISOBE et al. 1981,
1978). Die physiologische Funktion dieses Eiweißes ist noch nicht geklärt. Aufgrund seiner Konfigurationsänderungen bei Kalium- und Kalziumeinwirkungen auf die Zelle wird
jedoch ein Mitwirken bei der Ionenregulation im Gehirn angenommen. Es weist außerdem
24
partielle Sequenzhomologien zu Calmodulin auf (ENZINGER u. WEISS 1995).
Es wurde zunächst als spezifisch für Nervenzellen angesehen und in der Diagnostik von
Glia- und Ependymzelltumoren des Gehirnes als glialer Marker angewandt. Inzwischen
wurde es jedoch in einer Reihe anderer Zellen und Tumore nachgewiesen. So fanden es
MOELLER u. HELLMEN (1994) bei ihrer Untersuchung der caninen Milchdrüse außer in
den Myoepithelien auch in Melanozyten und Adipozyten. Sie kommen zu dem Schluß, daß
sowohl myoepitheliale als auch epitheliale Zellen das S100 Protein exprimieren. Bei einer
Untersuchung von humanen Adenokarzinomen reagierte 42% des Untersuchungsgutes
positiv (HERRERA et al. 1988). Weiter wurde es bei Speicheldrüsentumoren, Mammakarzinomen und Phäochromozytomen nachgewiesen (KAHN et al. 1983). SANDUSKY et al.
(1985,1987) stellten in zwei Veröffenlichungen ihre Untersuchungen des S100 Antigens
in der Melanomdiagnostik vor. In ihrer Studie von 1985 über weitgehend amelanotische
canine Melanome färbten sich 26 von 31 Tumoren an. Davon ist bei einigen der Nachweis
allerdings nur als schwach beschrieben worden. Trotzdem kommen sie zu dem Schluß,
das S100 Protein sei ein guter Nachweis in der Diagnostik der amelanotischen caninen
Melanome. 1987 untersuchte die gleiche Arbeitsgruppe 18 amelanoische canine Melanome, von denen sich zehn als positiv für S100 zeigten. Wieder war die Färbung jedoch
meist scheckig oder diffus. In der aktuellen Diagnostik besteht die Bedeutung des S100
Proteins in dem regelmäßigen Nachweis bei malignen Melanomen (GAYNOR et al. 1981).
Das Protein ist in Gewebematerial mindestens vier Wochen lang nachweisbar und kann
damit als sehr stabil bezeichnet werden (HASTKA 1997).
Melan A / MART 1
Melan A oder MART 1 (melanoma specific antigen recognized by T-cells) ist ein transmembranes Protein, welches in den ersten Untersuchungen regelmäßig in Melanozyten
der Haut und der Retina, Melanomen, ihren Metastasen und in kultivierten Melanozyten nachweisbar war, jedoch nicht in anderen Geweben gefunden wurde (COULIE et al.
1994). Es wird von tumor-infiltrierenden Lymphozyten erkannt, seine genaue physiologi25
sche Funktion ist bislang jedoch noch ungeklärt (KAWAKAMI et al. 1994). Das codierende
Gen wurde 1994 nahezu zeitgleich von COULIE et al. und KAWAKAMI et al. entdeckt. Ein
von CHEN et al. (1996) und FETSCH et al. (1997) in Mäusen hergestellter monoklonaler
Antikörper kann in der immunhistologischen Diagnostik eingesetzt werden. Mit diesem Antikörper gegen Melan A konnte in einer Studie bei humanen Melanomen eine Expression
in 17 von 21 der untersuchten Fälle nachgewiesen werden. Dabei färbten sich bei den
positiven Gewebeproben über 80% der Zellen. Bei dem Untersuchungsgut handelte es
sich dabei sowohl um primäre als auch um sekundäre Melanome. FETSCH et al. (1997)
verbesserten den Nachweis mit Melan A mit Hilfe einer Demaskierung durch Mikrowellen.
Von 23 untersuchten Gewebeproben reagierten 14 positiv. Mit einer Mikrowellenbehandlung waren 21 Gewebeproben positiv. Außerdem wurde die Farbintensität der positiven
Proben deutlich verbessert.
Obwohl erste Untersuchungen mit dem Antikörper nahelegten, er sei spezifisch für alle adulten Melanozyten der Haut und Retina (CHEN et al. 1996, BEATY et al. 1997,
FETSCH et al. 1997), fanden BUSAM et al. (1998) einige weitere Tumoren und Zellen,
die sich mit diesem Antikörper anfärben lassen. Dazu gehören Zellen der Nebennierenrinde. Hier färbt sich diffus die Zona fasciculata an. Die Leydig-Zellen färben sich deutlich
an, während die Sertolizellen eine nur fleckige Färbung aufweisen. Die Theka- und Granulosazellen der Ovarien und die Zellen des Corpus luteum reagieren ebenfalls deutlich
positiv, sowie Adenome und Karzinome der Nebennierenrinde und ihre Metastasen. In
diesen Geweben konnte jedoch kein Melan-A Antigen oder eine entsprechende m-RNA
nachgewiesen werden, so daß eine Kreuzreaktion vermutet wird (BLESSING et al. 1998,
JUNGBLUTH et al. 1998).
Übereinstimmend wird von verschiedenen Arbeitsgruppen berichtet, daß der Melan ANachweis in spindelzellförmigen und desmoplastischen Melanomen nur diffus oder negativ ist (BLESSING et al. 1998, BUSAM et al. 1998, JUNGBLUTH et al. 1998). Dabei
beziehen sie sich nur auf kutane Läsionen.
26
Bei einem Vergleich der Melanom-Marker S100 und HMB45 mit Melan A stellten NICOTRA et al. (1997) fest, daß Melan A zwar alle Zubildungen melanozytären Ursprungs
kennzeichnet, jedoch nicht zwischen benignen und malignen Läsionen unterscheidet. Melan A ist also zu deren Nachweis, nicht jedoch zur Differenzierung geeignet. Sie konnten
jedoch keine Reaktion von unveränderter Retina, Iris, Ciliarkörper und pigmentierten Choroideazellen feststellen. In ihrem untersuchten Probenmaterial waren weiterhin insgesamt
12 okuläre Melanome. Davon zeigten sich jedoch nur drei, also 25% Melan A positiv. Dagegen ist in kutanen Gewebe der Melan A Nachweis in Melanozyten positiv, unabhängig
von Differenzierung, Transformierung und Pigmentgehalt.
3 Eigene Untersuchungen
3.1
3.1.1
Material
Untersuchungsmaterial
Insgesamt umfaßte das untersuchte Material 43 Augen von Hunden und Katzen beiderlei
Geschlechtes mit Neoplasien. Davon stammten 20 Proben von Hunden und 23 Proben
von Katzen. Von den 20 caninen Proben stand bei 17 Fällen im Vorfeld die Diagnose
eines Melanomes. In den anderen Proben wurde eine Metastase eines Plattenepithelzellkarzinoms, eines Lymphoms bzw. ein Fibrosarkom diagnostiziert. In 20 von 23 Fällen
der Neoplasien der Katze wurde im Vorfeld histologisch ein Melanom diagnostiziert, in je
einem Fall ein Lymphosarkom und ein undifferenzierter mesenchymaler Tumor sowie eine
Irisreaktion nach einem perforierenden Korneaulcus. Das Durchschnittsalter bei der Diagnose eines Melanoms lag bei den Hunden bei 9, bei den Katzen bei 10 Jahren. Dabei
variierte das Alter bei den Hunden zwischen 2 und 17 Jahren, bei der Katze zwischen 3
und 16 Jahren 8 (Tab. 1-3).
27
Das Untersuchungsmaterial stammte aus Einsendungen zu diagnostischen Zwecken an
das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in der Zeit vom Januar
1996 bis zum Juli 2000 von Hunden, bzw. Januar 97 bis zum Juli 2000 von Katzen. Teilweise wurde es im Rahmen einer Studie in Zusammenarbeit mit der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover von Frau Dr. Meyer-Lindenberg übersandt.
Es stand zum Teil bereits als in Paraffin eingebettetes Material zur Verfügung, oder wurde
aus formalinfixiertem Naßmaterial aufgearbeitet. Dabei waren alle Proben mindestens 48
h formalinfixiert. Bei allen Färbevorgängen lief jeweils eine Positiv- und eine Negativprobe mit. Es wurde ebenfalls ein unveränderter Hunde- bzw. Katzenbulbus gefärbt, um die
Reaktion von Melan A mit unveränderten Melanozyten darzustellen.
In den folgenden Tabellen werden die Patientendaten soweit bekannt zusammenfassend
dargestellt.
28
Tabelle 1: Zusammenfassung der Hunde mit intraokulären Melanomen.
Fall-Nr.
1
E-Nr., Jahr
0015/00
Rasse
Windhund-Mix
Alter
Geschlecht
12 Jahre
m
2
0437/00
Golden Retriever
2 Jahre
m
3
3104/00
Jagdterrier
9 Jahre
m
4
5
2188/99
1191/98
Mischling
Airdale Terrier
15 Jahre
11 Jahre
w
w, k
6
2863/98
Alaskan Malamute
10 Jahre
m
7
8
9
3787/98
4377/98
4487/98
Cairn Terrier
Cairn Terrier
Mischling
9 Jahre
16 Jahre
13 Jahre
m
m
w, k
10
4797/98
Cairn Terrier
16 Jahre
m
11
5435/98
Mischling
4 Jahre
w, k
12
2891/97
Airdale Terrier
11 Jahre
m
13
2926/97
Labrador
5 Jahre
w
14
6472/97
Airedale Terrier
10 Jahre
m
15
16
17
7641/97
4617/96
6451/96
Dackel
Rauhaardackel
unbekannt
10 Jahre
-
m
-
29
Diagnose
Melanom des Ziliarkörpers
Melanom des Ziliarkörpers
Melanom Pap. nervus optici
uveales Melanom
uvealer Naevus pigmentosus
Melanom des Ziliarkörpers
uveales Melanom
uveales Melanom
Melanom des Ziliarkörpers
uvaeles
Melanom,
Metastase LK
Melanom des Ziliarkörpers
Melanom des Ziliarkörpers
amelanotisches Melanom der Iris
Melanom des Ziliarkörpers
uveales Melanom
uveales Melanom
uveales
Melanom,
Metastasen
Tabelle 2: Zusammenfassung der Katzen mit intraokulären Melanomen.
Fall-Nr.
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
E-Nr., Jahr
0313/00
0536/00
1424/00
0523/99
0809/99
1059/99
1950/99
2044/99
2838/99
2908/99
3134/99
2315/98
4415/98
4931/98
6008/98
1591/97
2156/97
2925/97
5955/97
7022/97
Rasse
EKH
EKH
EKH
EKH
EKH
EKH
Burma
Main Coon
EKH
Perser
Perser
EKH
Mischling
Perser
EKH
EKH
Perser
Alter
Geschlecht
13 Jahre
m, k
13 Jahre
w, k
13 Jahre
k
14 Jahre
m
5 Jahre
m, k
8 Jahre
w
11 Jahre
6 Jahre
w
9 Jahre
w, k
12 Jahre
m, k
13 Jahre
w, k
8 Jahre
w, k
15 Jahre
m
17 Jahre
m, k
14 Jahre
w
14 Jahre
w, k
16 Jahre
m
9 Jahre
w, k
Diagnose
amelan. Melanom ges. Bulbus
amelan. Melanom Iris
amelan. Melanom
Melanom der Iris
Melanom der Iris
benignes Melanom der Iris
Melanom der Iris
uveales Melanom
diffuses uveales Melanom
Melanom der Iris
Melanom der Iris
diffuses uveales Melanom
amelan. Melanom der Iris
Melanom der Iris und Sklera
Melanom der Iris
Melanom der Iris
Melanom der Iris
Melanom der Iris
Melanom ges. Bulbus
Melanom der Iris
Tabelle 3: Zusammenfassung anderer intraokulärer Tumore von Hunden und Katzen.
Fall-Nr. E-Nr., Jahr
Hunde
38
0340/98
39
3656/97
Rasse
Alter
Geschlecht
Kuvasz
Briard
4 Jahre
7 Jahre
m
m
40
7312/97
Hoverward
8 Jahre
m
41
Katzen
0506/00
Perser
11 Jahre
w, k
42
0378/98
EKH
10 Jahre
w, k
43
6246/97
EKH
13 Jahre
w
30
Diagnose
V.a. Fibrosarkom
Lymphosarkom der
Iris
Adenokarzinom des
Ziliarkörpers
Lymphosarkom der
Iris
mesenchym. Tumor
ges. Bulbus
Iritis nach perforiertem Korneaulcus
3.1.2
Präparation des Bulbus
Die im Ganzen eingesandten Bulbi wurden vor der Einbettung in Paraffin in ihrer Längsachse halbiert. Dabei sollte die Schnittebene im hinteren Bulbusabschnitt exakt durch den
Nervus opticus liegen, um die Gefahr einer artifiziellen Retinaablösung zu minimieren.
Hier befindet sich neben der Ora serrata, der Umschlagstelle von innerer zu äußerer Retinalage im vorderen Bulbusabschnitt, die zweite feste Verbindung dieser beiden Schichten. Diese galt es für die nachfolgenden Präparationen zu erhalten. Des weiteren sollte die
Schnittebene, soweit makroskopisch erkennbar, durch die veränderten Bulbusabschnitte
geführt werden. Nach der Halbierung des Bulbus wurde die im Glaskörper ruhende Linse
durch vorsichtigen Zug an den Processus ciliares entfernt. Dies konnte erfolgen, da ihre
Struktur bei der geplanten Untersuchung von Melanomen nicht von Intresse war. Für das
weitere Vorgehen war eine Entfernung der Linse von Vorteil, da das Linsenmaterial beim
Herstellen von Paraffinschnitten nur schwer zu bearbeiten ist.
Jetzt erfolgte eine erste makroskopische Befundung, um zu gewährleisten, daß die Schnittebene durch die veränderten Bereiche verlief. War dies nicht der Fall, so erfolgte eine
Korrektur der Schnittführung unter Einbeziehung des veränderten Areals. Von jedem so
bearbeiteten Bulbus wurde eine der Bulbushälften für die weitere lichtmikroskopische und
immunhistologische Bearbeitung in Paraffin eingebettet. Die zweite Bulbushälfte wurde
weiter in Formalin fixiert und für einen eventuellen Bedarf asserviert.
3.1.3
Paraffineinbettung
Jeweils eine Hälfte der formalinfixierten Augen wurde mit Hilfe des Automatensystems
“Hypercenter” der Firma Shandon aus Frankfurt bearbeitet. Dabei erfolgte zunächst eine Lagerung der Proben in einer ungepufferten 10%igen Formalinlösung, anschließend
eine Wässerung in Leitungswasser und schließlich die Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe mit anschließender Lagerung der Probe in 60Æ C warmen Paraffin über 2
31
Stunden. Abschließend gelangte die Probe zur Einbettung mit Paraffin in eine Kunststoffkapsel.
3.1.4
Schnittherstellung
Nach der Einbettung wurden mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms 2-4 m dicke Paraffinschnitte angefertigt. Nachdem sich diese in einem Wasserbad bei ca. 40Æ C gestreckt hatten, wurden sie auf mit Chromalaungelantine beschichteten Objektträgern aufgezogen.
Anschließend gelangten sie zur Trocknung bei ca. 60Æ C für 30 Minuten in einen Wärmeschrank.
Für die immunhistologische Bearbeitung erfolgte die Herstellung der Paraffinschnitte in
derselben Weise, nur wurden die Schnitte nach der Streckung auf Parafrost-Objektträger
aufgezogen und anschließend getrocknet. Das Beschichtungsmittel dieser Objektträger
gewährleistet eine besonders gute Haftung der Schnitte, welches bei den besonderen
Manipulationen während der immunhistologischen Aufarbeitung nötig war, um die Gefahr
eines Abschwimmens der Schnitte zu minimieren.
3.2
3.2.1
Methoden
Lichtmikroskopische Untersuchung
Für die lichtmikroskopische Beurteilung der Proben wurden die Schnitte zunächst entparaffiniert und rehydriert, dann mit Hämalaun-Eosin gefärbt (ROMEIS 1989), in aufsteigender Alkoholreihe dehydriert, mit Corbitbalsam eingedeckt und anschließend lichtmikroskopisch befundet. Dabei wurde besonderer Wert auf das biologische Erscheinungsbild
hinsichtlich der Malignitätsbeurteilung gelegt.
32
3.2.2
Auswertung der lichtmikroskopischen Untersuchungen
Zur Beurteilung des biologischen Verhaltens der Melanome wurde die in der Literatur am
häufigsten benutzte Einteilung von KIRCHER, H.C. et al. (1974) gewählt. Dabei erfolgte
eine Orientierung an folgenden histologischen Zellbildern:
Spindelzelltyp A: längliche Tumorzelle mit ovoidem Kern und ohne Kernkörperchen (Sp.A).
Spindelzelltyp B: plumpe Spindelzellen mit großem Kern und deutlichem Kernkörperchen
(Sp.B).
epitheloider Zelltyp: polyedrische Zellen mit großem Kern und deutlichem Kernkörperchen
(epith. Typ)
gemischtzelliger Typ: aus spindelförmigen und epitheloiden Zellen zusammengesetztes
Zellbild (gem. Typ)
Es wird in dieser Reihenfolge von einer zunehmenden Malignität ausgegangen. Bei der
weiteren Beurteilung des biologischen Verhaltens der Melanome wurden noch andere
Malignitätszeichen beachtet, wie zum Beispiel ein hoher Pigmentgehalt, ein geringer Gehalt an von Tumorzellen produzierten Retikulinfasern, das Auftreten von Nekrosen und
Anzeichen von destruierendem Wachstum.
Als ein weiteres Malignitätszeichen wurde der Mitoseindex bewertet nach der Anzahl von
Mitosefiguren pro Sichtfeld in der 40-fachen Vergrößerung. Dabei ist die Gradeinteilung
ggr.(geringgradig) - mgr.(mittelgradig) - hgr.(hochgradig) folgendermaßen eingeteilt worden:
ggr.: Auftreten von 1-2 Mitosefiguren, mgr.: Auftreten von 3-5 Mitosefiguren, hgr.: Auftreten
von 5 und mehr Mitosefiguren pro Sichtfeld.
33
3.2.3
Immunhistochemische Untersuchung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Primärantikörper verwendet, mit deren Hilfe der
Ursprung der neoplastischen Veränderungen geklärt , bzw. die ursprüngliche Diagnose
nachvollzogen werden sollte:
Antikörper
Spezifität
Herkunft
Melan A
Klon A103
Dako Diagnostics, Vertrieb Hamburg, Art.Nr.: M-7196
Vimentin
Klon V9
Dako Diagnostics, Vertrieb Hamburg, Art.Nr.: M-0725
S100
Polyklon
Sigma Diagnostics, Deisenhofen, Art.Nr.: S-2644
Hiervon wurden die Antikörper Vimentin und S100 zur Identifizierung von Melanozyten
bislang in der Melanomdiagnostik im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover routinemäßig eingesetzt. Diese Reaktionen dienten als Vergleichsmaterial
für die mit Melan A behandelten Schnitte, dem in der veterinärmedizinischen Diagnostik
neuen Antikörper. Dabei ist Vimentin ein intermediäres Filament und wird als spezifische
Struktur von Zellen mesenchymaler Herkunft angesehen. Im immunhistochemischen Bild
von Melanozyten stellt sich der Nachweis von Vimentin ebenfalls als positiv dar, obwohl
sie nicht mesenchymaler Herkunft sind. Als zweite Vergleichsfärbung wurde ein gegen
das Plasmaprotein S100 gerichteter Antikörper verwendet. Auch dieser Nachweis stellt
sich im immunhistochemischen Bild von Melanomen immer als positiv dar. Das Plasmaprotein wird des weiteren in Myoepithelien und Adipozyten ausgebildet und zeigt somit
auch in diesen Zellen eine positive Reaktion.
Als sekundäre Antikörper kommen in der ABC-Methode Immunglobuline gegen Antikörper
der Spezies zum Einsatz, aus der die Primärantikörper gewonnen sind. Die Primärantikörper für die Nachweise von Melan A und Vimentin wurden beide aus Mäusen gewonnen, so
daß in diesen beiden Nachweisreihen als Sekundärantikörper ein biotinylierter “goat-anti
mouse” - Antikörper eingesetzt wurde. Der Primärantikörper für den Nachweis von S100
34
stammt aus dem Serum von Kaninchen. Aus diesem Grund mußte für diese Nachweisreihen als Sekundärantikörper ein biotinylierter “goat-anit-rabbit”-Antikörper verwendet werden.
So konnte in allen drei Fällen ein biotinylierter Sekundärantikörper eingesetzt werden, welcher die Avidin-Biotin-Komplex-Immunperoxidase-Methode (ABC-Methode) ermöglicht. Als
farbgebende Reaktion wurde das 3-Amino-9-Ethylcarbazol-Substrat gewählt (ACE), da
sich der rote Farbstoff gut gegen die braune Färbung der im Auge vorhandenen Melanozyten abgrenzen läßt. Es wäre ebenfalls als farbgebende Reaktion eine Behandlung mit Diaminobenzidin-tetra-hydrochlorid (DAB-Methode) möglich gewesen. Wegen
der schlechteren Unterscheidbarkeit des braunen Farbstoffes von der ebenfalls braunen
Färbung der Melanozyten wurde diese Methode jedoch verworfen.
Als Protokollschema wurde bei allen drei Antikörpern die ABC-Methode durchgeführt. Diese wird im folgenden allgemein wiedergegeben.
35
ABC-Methode:
I
Entparaffinieren und Rehydrieren
II
Hemmung der endogenen Peroxidase
III
Spülen mit PBS-Puffer
IV
Wechsel von Küvetten in Coverplates
V
Inkubation mit dem Blockserum
VI
Inkubation mit dem primären Antikörper
VII
Spülen mit PBS-Puffer
VIII
Inkubation mit dem sekundären biotinylierten Antikörper
IX
Spülen mit PBS-Puffer
X
Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Komplex
XI
Wechsel von Coverplates zu Küvetten
XII
Inkubation mit AEC+Chromogen-Substrat
XIII
Spülen mit PBS-Puffer
XIV
Verbringen in fließendes Leitungswasser
XV
Gegenfärben mit Hämalaun nach Meyer
XVI
Bläuen unter fließendem Leitungswasser
XVII Eindecken mit Kaisers Glyceringelantine
Bei den immunhistochemischen Nachweisen von Vimentin und Melan A ist des weiteren
eine Demaskierung der Paraffinschnitte notwendig, um die von der Fixation in Formalin
vernetzten Antigene für den Antikörper erkennbar zu machen. Hierfür wird vor der Inkubation mit dem Blockserum ein weiterer Schritt eingefügt. Die Demaskierung von Paraffinschnitten ist mittels verschiedener Reagenzien erreichbar. In dieser Arbeit wurden zwei
verschiedene Methoden genutzt. Dabei erwies sich die Inkubation in Citratpuffer bei 121Æ C
über 10 Minuten im Autoklaven als langwieriger und schwieriger im Handling. Außerdem
36
traten häufiger Schäden durch das Aufsteigen von Luftblasen während des Erhitzens in
Form von teilweisen oder vollständigen Abschwimmen der Schnitte auf. Als die Methode
der Wahl für das Demaskieren wurde die Demaskierungslösung G der Firma Biologo in
einer Verdünnung von 1:4 mit PBS-Puffer gewählt. Hier betrug die Inkubationszeit 30 Minuten bei einer Temperatur von 92-95Æ C im Wasserbad. Nach der Inkubationszeit in dem
Demaskierungsreagenz erfolgte erneut ein Spülen in PBS-Puffer (Inkubationszeit 3x5 Minuten), danach das Verbringen in Coverplates und das Auftragen des Blockserums.
Die jeweiligen Gebrauchsverdünnungen der Antikörper und des Blockserums in PBSPuffer wurden nach den Herstellerangaben gewählt. Diese sind folgendermaßen angegeben:
Blockserum:
Normal-Goat-Serum 1:5
Primärer Antikörper:
monoklonaler Maus-Melan A-Antikörper 1:15, monoklonaler Maus-anti-Human-VimentinAntikörper 1:15, Kaninchen-anti-S100-Antikörper 1:800.
Sekundärer Antikörper:
biotinyliertes Ziege-anti-Maus-Serum 1:200, biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen-Serum 1:200.
Die genaue Rezeptur des verwendeten PBS-Puffers wird im Anhang dieser Arbeit wiedergegeben.
3.2.4
Kontrollen
Um die Spezifität der verwendeten Antikörper zu kontrollieren, sowie um falsch positive
Reaktionen und auch um mögliche Vorgehensfehler ausschließen zu können, wurden bei
jeder Färbereihe sowohl eine Positiv- als auch eine Negativkontrolle mitgeführt.
37
Von dem für die immunhistochemische Untersuchung vorhandenen Material wurden Serienschnitte angefertigt und je zwei Schnitte pro Färbung verwendet, so daß zu jedem
Schnitt, der mit einem der aufgeführten primären Antikörper behandelt wurde, eine negativKontrolle in der gleichen Färbereihe vorhanden war. Bei dieser negativ-Kontrolle ist statt
des primären Antikörpers Balb C Mäuse-Ascites Serum in einer Verdünnung von 1:600
mit PBS-Puffer aufgetragen worden, während alle weiteren Schritte der immunhistochemischen Reaktion beibehalten wurden. So war zu überprüfen, ob der Sekundärantikörper
mit anderen Strukturen des Gewebes und nicht einzig mit dem primären Antikörper reagiert. Bei einem negativen Färbeergebnis der mit dem Balb C Mäuse-Ascites Serum inkubierten Schnitte und einem gleichzeitig positiven Ergebnis des dazugehörigen Schnittes,
der mit einem der drei Primärantikörper behandelt wurde, ist eine Spezifität des Sekundärantikörpers als sicher anzusehen.
3.2.5
Auswertung
Bei der Beurteilung der erfolgten Reaktionen wurden zwei Aspekte berücksichtigt und sind
in den Tabellen im Ergebnisteil als Zahlenkombination angegeben. Zum einen wurde die
Anzahl der angefärbten Zellen bewertet. Dabei steht die 1 für einen angefärbten Zellanteil
von bis 25 %, bzw. die 4 für einen angefärbten Zellanteil von 75 - 100 %. Zum anderen ist
die Qualität der Farbreaktion ebenfalls in einer Skala von 1 bis 4 bewertet worden. Dabei
steht die 1 für eine nur schwache Farbqualität, die 4 dagegen für eine deutliche Anfärbung
der positiv reagierenden Zellen.
Grad
Anzahl
Qualität
1
-25%
schwach
2
25-50%
mäßig
3
50-75%
gut
4
>75%
deutlich
38
Die erste Zahl in der Tabelle der Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen steht
für die Anzahl der positiv reagierenden Zellen, die zweite gibt die Qualität der Anfärbung
an. Reaktionen werden im Folgenden als schwach bewertet, wenn sowohl die Anzahl der
positiv reagierten Zellen als auch die Qualität der Farbausprägung mit nicht mehr als zwei
beurteilt worden sind.
In drei Fällen wurde die Beurteilung der Färbeergebnisse aufgrund des starken Pigmentgehaltes des Tumors erschwert. Hier erfolgte ein 24 bzw. 48 stündiges Lagern der Schnitte
in Wasserstoffperoxid zur Pigmentbleichung und anschließend wurde erneut die immunhistochemische Färbung durchgeführt und beurteilt.
Die Vergrößerung bei den abgebildeten Aufnahmen der histologischen Schnitte ist als
Grundvergrößerung angegeben, d.h. als Vergrößerung des Negatives der Aufnahme.
3.3
3.3.1
Ergebnisse
Vorberichte und makroskopische Untersuchungsergebnisse der Hunde
Aus dem Zeitraum vom Januar 1996 bis zum Juli 2000 sind 17 Augentumoren von Hunden
im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover als Melanome diagnostiziert worden.
Das Durchschnittsalter der betroffenen Hunde lag bei neun Jahren.
Insgesamt befanden sich unter den Tieren zehn männliche, zwei weibliche und drei weiblich/kastrierte Tiere. Bei den restlichen Tieren fehlten diesbezüglich Angaben.
In zehn Fällen war das linke Auge, in drei Fällen das rechte Auge von den Veränderungen betroffen. Bei vier eingesandten Bulbi fehlte eine Seitenbezeichnung. In allen Fällen
handelte es sich um ein unilaterales Auftreten.
Bei zwölf Tieren wurde eine Enukleation des betroffenen Auges durchgeführt und die Tiere lebten zum Zeitpunkt der Diagnose noch. Über den weiteren Krankheitsverlauf fehlten
39
statistische Erhebungen. So kann in dieser Arbeit keine Aussage zum Metastasierungsverhalten von primären okulären Melanomen bei Hunden gemacht werden.
Zur Äthiologie der Augenveränderungen konnte in keinem Fall vom Besitzer eine Angabe
gemacht werden. Lediglich in einem Fall wird ein seit einem Jahr verdickter Ln. mandibularis vom Tierarzt beschrieben und der Verdacht einer Metastase geäußert. Bei diesem
Tier befand sich außerdem ein malignes Melanom am gleichseitigen Augenlid.
Bei 16 der untersuchten 17 Melanomen von Hunden befand sich die Primärlokalisation
der Veränderungen in der Uvea anterior (Abb. 1, 2, 4). Nur im Fall-Nr. 3 lag der Ausgangspunkt der Veränderung in der Uvea posterior. Hier ragte von der Papilla nervi optici ausgehend eine ca. 1 x 1,5 cm große, schwarze Neubildung ohne makroskopisch erkennbare
Strukturierung in den Innenraum des Bulbus (Abb.3).
Bei 13 von den 17 untersuchten Melanomen der Hunde ist im Vorbericht eine Zeitangabe gemacht worden, seit wann Veränderungen vom Besitzer beobachtet worden sind
(Tab. 4). Dabei wird in sechs Fällen eine sichtbare Vergrößerung des Bulbus verbunden
mit Schmerzen, Rötung und getrübter Kornea beschrieben. Der Zeitraum dieser Beobachtungen variiert von zwei Tagen bis drei Monaten. In einem dieser Fälle wurde vom
Haustierarzt sechs bis acht Wochen zuvor eine Linsenluxation festgestellt.
In drei weiteren Fällen wird allgemein “seit einem Jahr Probleme mit dem Auge” angegeben und ein starker Juckreiz beschrieben, der in zwei Fällen bis zum Blutigkratzen führte.
In einem Fall wird zusätzlich seit einer Woche ein purulenter Ausfluß beobachtet, in einem
anderen Fall entwickelte sich eine dunkle Pigmentierung der Cornea.
Da diese Beobachtungen den klinischen Symptomen eines Glaukoms entsprechen und
ein sekundäres Glaukom bei sieben von den neun Fällen in der histologischen Untersuchung zu finden ist, kann davon ausgegangen werden, daß die Besitzer diese Entwicklung
hier beobachtet haben. In einem der Fälle, in denen kein sekundäres Glaukom zu diagnostizieren war, lag eine vollständige Destruktion des gesamten Bulbus vor. Im anderen Fall
40
konnte keine Verlegung des Kammerwinkels mit freischwimmenden Tumorzellen festgestellt werden, wie sie häufig bei Melanomen der Iris auftreten und so zu einem sekundären
Glaukom führen (Abb. 5).
Bei weiteren drei Fällen wurde seit zwei Monaten eine Trübung des Auges beobachtet,
traten seit zwei Monaten Sehbeschwerden auf, bzw. wurde seit sechs Monaten eine Umfangsvermehrung der Iris festgestellt.
Bei einem Fall wurde im Vorbericht nur der Zeitraum von zwei Wochen als Erkrankungsdauer ohne weitere Angaben gemacht.
41
Tabelle 4: Angaben zum Krankheitsverlauf der untersuchten okulären Melanome der Hunde.
Fall Nr. E-Nr., Jahr
1
0015/00
2
3
4
0437/00
3104/00
2188/99
5
6
7
1191/98
2863/98
3787/98
8
4377/98
9
4487/98
10
4797/98
11
5435/98
12
2891/97
13
14
15
16
17
2926/97
6472/97
7641/97
4617/96
6251/96
Rasse
Windhundmix
Beobachtungs
zeitraum
6 Monate
Symtome
Umfangsvermehrung der
Iris
Golden Retriever 2 Monaten
Sehbeschwerden
Jagdterrier
Mischling
6-8 Wochen
Linsenluxation, Auge vergrößert
Airdale Terrier
Alaskan Malamute 2 Monate
Trübung der Cornea
Cairn Terrier
2 Tage
Schwellung des Bulbus,
Schmerzen
Cairn Terrier
1 Jahr / 1 Wo- “Probleme mit dem Auge” /
che
Juckreiz, dunkle Cornea
Mischling
einige Tage
Schwellung des Bulbus,
Schmerzen
Cairn Terrier
1 Jahr
“Probleme mit dem Auge”,
kratzt sich blutig
Mischling
1 Monat
vergrößerter Bulbus, getrübte Cornea, Schmerzen
Airdale Terrier
1 Jahr / 1 Wo- “Probleme mit dem Auge” /
che
purulenter Ausfluß
Labrador
3 Monaten
vergrößerter Bulbus
Airdale Terrier
4 Wochen
Schwellung des Bulbus
Dackel
Rauhaardackel
2 Wochen
keine weiteren Angaben
unbekannt
-
42
Abbildung 1: Fall-Nr. 1, Windhundmix, m., zwölf Jahre, Melanom der Iris und des Ziliarkörpers (Pfeile), makroskopische Aufnahme
43
Abbildung 2: Fall-Nr. 6, Alaskan Malamute, m., zehn Jahre, Melanom des Ziliarkörpers
(Pfeile), makroskopische Aufnahme.
44
Abbildung 3: Fall-Nr. 3, Jagdterrier, m., neun Jahre, Melanom der Uvea posterior (Pfeile),
makroskopische Aufnahme.
45
Abbildung 4: Fall-Nr. 11, Mischling, w.k., vier Jahre, Melanom der Iris (Pfeile), makroskopische Aufnahme.
46
3.3.2
Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Hunde
In den lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden insgesamt zwölf Fälle dem epitheloiden Zelltyp (Abb. 12) , drei dem gemischtzelligem Typ (Abb 29), nur einer dem Spindelzelltyp B und keiner der Tumore dem Spindelzelltyp A zugeordnet.
Ein Zusammenhang zwischen dieser Zelltypeinteilung und dem Auftreten der übrigen Malignitätskriterien konnte nicht gefunden werden.
Insgesamt wurde der Gehalt an Retikulinfasern bei 14 Fällen als geringgradig bezeichnet
und in den übrigen drei Fällen als mittelgradig (Tab. 5). Dabei befanden sich unter diesen
drei Fällen je ein Spindelzelltyp B, ein epitheloider Typ und ein gemischtzelliger Typ.
Keiner der 17 Tumore war amelanotisch, drei wiesen jedoch einen nur geringgradigen
Pigmentgehalt auf. Bei vier Tumoren konnte der Pigmentgehalt als mittelgradig bezeichnet
werden, die übrigen zehn Tumore wiesen einen hochgradigen Pigmentgehalt auf (Tab. 5).
In allen der untersuchten 17 Melanome fanden sich Mitosefiguren. Davon fanden sich
in drei der Melanome eine geringgradige Anzahl an Mitosefiguren, in vier Fällen eine
mittelgradige und in zehn der untersuchten Melanome ist die Anzahl der Mitosefiguren
mit hochgradig zu beurteilen. Es konnte hierbei keine Beziehung zum Zelltyp gefunden
werden.
In fünf der untersuchten Melanome fanden sich keine Nekroseherde im Tumorgewebe.
Einzelzellnekrosen traten in ebenfalls in fünf der untersuchten Fälle auf, in zwei Fällen
konnte ein Nekroseherd gefunden werden, in den restlichen fünf Fällen traten diese multifokal auf. Alle fünf Melanome ohne Auftreten von Nekrosearealen oder Einzelzellnekrosen
waren dem epitheloiden Zelltyp zugeteilt worden. Vier der fünf Fälle mit Einzelzellnekrosen
gehörten zum epitheloiden Zelltyp, davon einer mit Arealen vom Spindelzelltyp A. Ein Fall
mit dem Auftreten von Einzelzellnekrosen gehörte zum Spindelzelltyp B. Von den insgesamt sieben Fällen mit einem oder multifokalen Nekroseherden gehörten drei zum Zelltyp
des Spindelzelltyp B, davon einer mit Arealen von epitheloiden Zellen, die restlichen vier
47
Fälle sind dem epitheloiden Zellbild zugeordnet worden. Zum Auftreten von Mitosefiguren
ließ sich keine Beziehung feststellen. In den sieben Fällen mit ein bis mehreren großen
Nekroseherden wurden drei mal keine Mitosefiguren gefunden, zwei mal eine mittelgradige Anzahl und zwei mal hochgradig viele Mitosefiguren (Tab. 5).
Tabelle 5: Lichtmikroskopische Untersuchungsbefunde der Hunde unter besonderer Berücksichtigung von Malignitätszeichen.
Fall-Nr.
E-Nr, Jahr
1
2
3
4
0015/00
0437/00
3104/00
2188/99
5
6
1191/98
2863/98
7
8
9
10
3787/98
4377/98
4487/98
4797/98
11
5435/98
12
Klassifizierung
Retikulin
faser
gehalt
Sp. B
ggr.
epith. Typ
ggr.
epith. Typ
mgr.
Sp. B + epith. ggr.
Areale
epith. Typ
ggr.
epith. Typ + mgr.
Areale von Sp.
A
epith. Typ
ggr.
epith. Typ
ggr.
epith. Typ
ggr.
epith. Typ
ggr.
Pigment Mitose
gehalt
rate
Nekrosen
ggr.
ggr.
mgr.
hgr.
ggr.
ggr.
mgr.
hgr.
hgr.
hgr.
hgr.
hgr.
Einzelzellnekr.
Einzelzellnekr.
fokaler Herd
multifokal Areale
Einzelzellnekr.
mgr.
hgr.
hgr.
ggr.
mgr.
hgr.
hgr.
ggr.
hgr.
hgr.
2891/97
Sp. B + epith. ggr.
Areale
epith. Typ
ggr.
mgr.
mgr.
13
2926/97
epith. Typ
ggr.
mgr.
mgr.
14
15
16
17
6472/97
7641/97
4617/96
6251/96
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
Sp. B
ggr.
ggr.
ggr.
mgr.
hgr.
hgr.
hgr.
hgr.
hgr.
hgr.
hgr.
hgr.
48
multifokal Areale
fokaler Herd
multifokal Areale
multifokal Areale
Einzelzellnekr.
Einzelzellnekr.
multifokal Areale
Als weitere Malignitätsanzeichen des primären intraokulären Melanoms sind destruktive
Veränderungen am Auge beurteilt worden, die auf ein invasives Wachstum der Tumore
hindeuten. Dazu gehören Blutungen ins Gewebe (Abb. 6), eine Infiltration der Sklera mit
tumorösen Zellen sowie die Destruktion der Descemetschen Membran (Tab. 6).
Gefäßeinbrüche, die verbunden mit Blutungen auftraten, konnten bei zehn der 17 Melanome gefunden werden. Dabei fand sich keine Korrelation zum Zelltyp der Tumore.
Eine Infiltration der Sklera mit tumorösen Zellen konnte bei acht der untersuchten Melanome beobachtet werden. Dabei handelte es sich einmal um einen Tumor des Spindelzelltyp
B, alle anderen Fälle waren von einem epitheloiden Wuchsbild.
In einem Fall war der Nervus opticus sowie der Glaskörper des betroffenen Bulbus von
Tumorzellen infiltriert.
Die Descemetsche Membran war in insgesamt vier Fällen von Veränderungen betroffen.
Davon konnte in zwei Fällen eine komplette Destruktion der Descemetschen Membran
festgestellt werden. Diese beiden Fälle waren vom epitheloiden Wuchsbild. In weiteren
zwei Fällen war die Descemetsche Membran lediglich abgehoben. Diese Fälle gehörten
beide zum Wuchsbild des Spindelzelltyp B und wiesen beide Areale von epitheloiden Zellen auf.
Als weiterer Befund in der lichtmikroskopischen Untersuchung fand sich das Auftreten eines sekundären Glaukoms. Es war in allen Fällen ausgelöst durch frei in der Augenkammer schwimmende Tumorzellen, die den Kammerwinkel verlegten. Dieser Befund konnte
in elf Fällen erhoben werden. In einem Fall war der gesamte Bulbus destruiert, so daß
keine Aussage hierzu getroffen werden konnte.
Eine in der Literatur beschriebene Pigmentepithelhyperplasie, die häufig beim Vorliegen
eines primären intraokulären Melanoms diagnostiziert werden kann, konnte in dieser Untersuchung in sieben Fällen gefunden werden (Abb. 7).
49
Tabelle 6: Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Hunde unter besonderer
Berücksichtigung der destruktiven Veränderungen.
Fall-Nr.
E-Nr., Jahr
1
2
3
4
0015/00
0437/00
3104/00
2188/99
5
6
1191/98
2863/98
7
8
9
10
11
3787/98
4377/98
4487/98
4797/98
5435/98
12
13
14
15
16
17
2891/97
2926/97
6472/97
7641/97
4617/96
6251/96
Klassifizierung
Blut.
Sklera
Sp. B
epith. Typ
epith. Typ
Sp.B + epith.
Areale
epith. Typ
epith. Typ + Sp.
A
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
Sp.B + epith.
Areale
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
Sp. B
ja
nein
ja
ja
-
intakt
intakt
intakt
abgehoben
ja
nein
nein
ja
Pigment
epithel
hyperpl.
nein
ja
ja
nein
ja
nein
-
intakt
intakt
ja
ja
ja
ja
nein
nein
ja
ja
ja
infiltr.
infiltr.
infiltr.
-
intakt
intakt
intakt
intakt
abgehoben
ja
ja
ja
nein
ja
nein
nein
nein
nein
ja
ja
ja
nein
ja
nein
nein
infiltr.
infiltr.
infiltr.
infiltr.
infiltr.
destruiert
destruiert
intakt
intakt
intakt
intakt
ja
ja
ja
nein
nein
nein
nein
nein
ja
ja
nein
50
Descemet. sek.
Membran
Glauk.
Abbildung 5: Fall-Nr. 6, Übersichtsaufnahme, H. & E., Vergr. 6,25x, Alaskan Malamute, m.,
10 Jahre.
Deutliche Ansammlung von pigmentierten Tumorzellen in der vorderen Augenkammer und
im Kammerwinkel.
Abbildung 6: Fall-Nr. 9, H. & E., Vergr.50x, Mischling, w.k., 13 Jahre.
Ansammlung von Erythrozyten und Fibrin in der Augenkammer und im Kammerwinkel
sowie Ansammlung von Erythrozyten im Gewebe.
51
Abbildung 7: Fall-Nr. 8, Übersichtsaufnahme, H. & E., Vergr. 6,25x, Cairn Terrier, m., 16
Jahre.
Deutliche Dickenzunahme mit starker Pigmentierung der Iris sowie des Ziliarkörpers und
der vordersten Anteile der Retina.
3.3.3
Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der Hunde
Die makroskopisch sowie lichtmikroskopisch beschriebenen okulären Melanome wurden
im weiteren immunhistochemisch untersucht. Es erfolgte dabei ein Vergleich zu zwei anderen, in der immunhistologischen Diagnostik der Vetetinärmedizin üblichen Färbungen
zur Identifizierung von Melanomen, den Antikörpern gegen Vimentin und S100.
Bei jedem Färbedurchgang wurde je eine Positiv- und Negativkontrolle mitgeführt. Es wurde in keinem Fall eine positive Reaktion in einer der Negativkontrollen festgestellt.
An einem unverändertem Bulbus von einem Hund wurden ebenfalls alle drei Färbungen
durchgeführt. Dabei zeigten sich auch die unveränderten Melanozyten positiv in der Reaktion mit dem Antikörper Melan A (Abb. 19).
Die genaue Beurteilung der immunhistochemischen Färbungen sind in Tabelle 7 dargestellt. Dabei steht die erste Zahl in der Tabelle für die Anzahl der positiv reagierenden
52
Zellen, die zweite gibt die Qualität der Farbreaktion an.
Tabelle 7: Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der Hunde.
Fall-Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
E-Nr., Jahr S100
0015/00
0437/00
3104/00
2188/99
1191/98
2863/98
3786/98
4377/98
4487/98
4797/98
5435/98
2891/97
2926/97
6472/97
7641/97
4617/96
6251/96
3/4
3/4
3/3
0/0
0/0
1/4
1/3
3/4
1/1
0/0
3/2
0/0
4/1
2/2
1/1
0/0
0/0
Vimentin
Melan A
4/4
2/1
3/3
3/1
2/1
1/4
1/1
3/3
3/3
2/2
3/2
3/3
4/1
2/3
1/1
1/1
0/0
4/4
3/4
3/4
0/0
0/0
1/4
1/3
0/0
3/4
0/0
0/0
3/4
4/3
2/4
2/2
0/0
3/4
Melan A 24h Melan A 48h
bleichen
bleichen
4/4
4/4
4/4
4/4
3/4
3/4
Bei der Auswertung der Farbreaktionen der Melanome der Hunde fiel eine insgesamt
sehr inhomogene Verteilung sowohl der Anzahl der positiv reagierenden Zellen als auch
der Farbqualität auf.
Bei der Reaktion mit S100 konnte insgesamt 6 mal keine positive Reaktion festgestellt
werden. In weiteren 3 Fällen fiel die Reaktion nur schwach aus.
Die Reaktion mit dem Antikörper Vimentin ist in einem Fall negativ ausgefallen und in 6
Fällen als nur schwach bewertet worden. Dabei ist der einzige negative Fall der Reaktion
mit Vimentin ebenfalls in der Reaktion mit S100 negativ ausgefallen (Fall-Nr. 17), vier
weitere als nur schwach beurteilte Fälle (Fall-Nr. 5, 10, 15,16) sind in der Reaktion mit
S100 ebenfall nur schwach oder negativ ausgefallen.
53
In insgesamt sechs Fällen war die Farbreaktion mit dem Antikörper Melan A negativ. Diese Reaktionen fielen in vier Fällen mit negativen Färbeergebnissen der Reaktion mit S100
zusammen (Fall-Nr. 4, 5, 10, 16). In drei Fällen waren die Ergebnisse auch bei der Reakton
mit Vimentin nur schwach (Fall-Nr. 5, 10, 16). Zwei der negativ ausgefallenen Färbeergebnisse mit Melan A sind an mit Wasserstoffperoxid gebleichten Schnitten wiederholt worden
und konnten nach der Reduzierung des Tumorfarbstoffes Melanin als deutlich positiv beurteilt werden (Fall-Nr. 11, 16). In einem Fall (Fall-Nr. 15) war die Farbreaktion mit Melan A
als nur schwach bewertet worden. Dieser Tumor zeigte auch in den immunhistologischen
Reaktionen der anderen beiden Antikörper eine nur schwache Reaktion.
Abbildung 8: Fall-Nr. 6, Melan A, Vergr. 100x; Alaskan Malamute, m., 10 Jahre.
Die schlanken, spindelförmigen Zellen zeigen eine deutlich positive rote Farbreaktion
(Pfeile). Die großen runden Zellen mit viel Melanin (“ballon cells”) sind reaktionslos.
54
Abbildung 9: Fall-Nr. 6, Melan A, Vergr. 100x, Alaskan Malamute, m., 10 Jahre. Beurteilung der Reaktion: 1/4.
Abbildung 10: Fall-Nr. 13, Melan A, Vergr. 100x, Labrador, w., 5 Jahre. Beurteilung der
Reaktion: 4/3.
55
Abbildung 11: Fall-Nr. 13, S100, Vergr. 100x, Labrador, w., 5 Jahre. Beurteilung der Reaktion: 4/1
Abbildung 12: Fall-Nr. 12, Melan A, Vergr. 100x, Airedale Terrier, m., 11 Jahre. Beurteilung
der Reaktion: 3/4
56
Abbildung 13: Fall-Nr. 12, Melan A, Vergr. 100x, Airedale Terrier, m., 11 Jahre. Der gleiche
Fall, in diesem Ausschnitt mit einer geringeren Anzahl an reagierenden Zellen.
Abbildung 14: Fall-Nr. 12, S100, Vergr. 100x, Airdale Terrier, m., 11 Jahre. Beurteilung der
Reaktion: 0/0
57
Abbildung 15: Fall-Nr. 12, Vimentin, Vergr. 100x, Airedale Terrier, m., 11 Jahre. Beurteilung der Reaktion: 3/3
Abbildung 16: Fall-Nr. 9, MelanA, Vergr. 50x, Mischling, w.k., 13 Jahre. Beurteilung der
Reaktion: 3/4. Dieser und die zwei folgenden Schnitte entstammen einem Serienschnitt.
58
Abbildung 17: Fall-Nr. 9, S100, Vergr. 50x, Mischling, w.k., 13 Jahre. Beurteilung der Reaktion: 3/3
Abbildung 18: Fall-Nr. 9, Vimentin, Vergr. 50x, Mischling, w.k., 13 Jahre. Beurteilung der
Reaktion: 1/1
59
Abbildung 19: Unveränderter Bulbus, 6657-98A, Melan A, Vergr. 25x, Kontrollbulbus, Foxhound, m., 3 Jahre.
Deutlich positive Reaktion der unveränderten Melanozyten.
Abbildung 20: Fall-Nr. 16, MelanA nach 24h bleichen in Wasserstoffperoxid, Vergr. 100x,
Rauhaardackel, m., 10 Jahre. Die positiven Zellen stellen sich deutlich dunkler dar (Pfeile).
60
Abbildung 21: Fall-Nr. 16, MelanA nach 48h bleichen in Wasserstoffperoxid, Vergr. 50x,
Rauhaardackel, m., 10 Jahre. Deutliche Darstellung der positiven Zellen (Pfeile).
3.3.4
Vorberichte und makroskopische Untersuchungsergebnisse der Katzen
Aus dem Zeitraum vom Januar 1997 bis zum Juli 2000 sind 20 Augentumoren von Katzen im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach histologischer
Untersuchung als Melanome diagnostiziert worden.
Das Durchschnittsalter der betroffenen Katzen lag bei 10 Jahren.
Insgesamt befanden sich unter den Tieren drei männliche, drei weibliche, vier männlich
kastrierte und sechs weiblich kastrierte Tiere. Bei den restlichen Fällen fehlten diesbezügliche Angaben (Tab. 8).
In acht Fällen war der linke Bulbus, in vier Fällen der rechte Bulbus von den Veränderungen betroffen. Bei den restlichen acht Fällen fehlt diesbezüglich eine Angabe im Vorbericht. In allen Fällen handelte es sich um ein unilaterales Auftreten.
Bei insgesamt neun Tieren wurde nach der Diagnose einer Augenveränderung vom Tierarzt eine Enukleation des betroffenen Auges durchgeführt und die Tiere lebten zu diesem
61
Zeitpunkt noch. Über das weitere Schicksal dieser Tiere fehlen statistische Erhebungen.
So kann in dieser Arbeit keine Aussage zum Metastasierungsverhalten von primären okulären Melanomen bei der Katze gemacht werden.
In zwei Fällen wird von den Tierbesitzern zur Frage nach der Äthiologie der Veränderung
eine Traumatisierung des betroffenen Auges mit einer Korneaverletzung angegeben. In
einem Fall lag diese Verletzung etwa einen Monat zurück, bei dem zweiten Fall wurde im
Vorbericht keine Angabe hierzu gemacht.
Bei 18 der untersuchten 20 Melanome der Katzen befand sich die Primärlokalisation der
Veränderungen in der Uvea anterior (Abb. 22-26). Von diesen Fällen waren fünf Veränderungen bereits auf Anteile der hinteren Retina übergegangen. In zwei Fällen war der
Bulbus völlig destruiert und es konnte keine Ausgangslokalisation der Veränderungen bestimmt werden.
In neun Fällen ist im Vorbericht eine Zeitangabe gemacht worden, seit wann die Veränderungen vom Besitzter beobachtet wurden (Tab. 8). Dabei wird in einem Fall nur der
Zeitraum, in dem die Veränderung vom Tierbesitzer beobachtet worden ist, ohne Befundbeschreibung genannt. Dieser Zeitraum betrug zehn Monate. In drei Fällen wird vom Besitzer eine Vergrößerung des Bulbus beschrieben, in einem Fall verbunden mit einer Trübung
der Kornea. In den anderen Fällen ging die Vergrößerung des gesamten Bulbus mit einer
sichtbaren Verfärbung der Iris einher, bzw. mit einer Glaukomsymptomatik.. Insgesamt ist
eine Pigmentveränderung im Sinne einer stärkeren Pigmentierung bei drei Tieren beobachtet worden. Bei einem Fall fiel eine zusätzliche Verdickung der Iris auf, im dritten Fall
wird zusätzlich eine Anisokorie geschildert, die ebenso in einem anderen Fall als einziges Symptom genannt wird. In einem Fall werden die klinischen Symptome im Vorbericht
lediglich als “Augenveränderungen” beschrieben und bei zwei Fällen lag im Vorfeld eine
Traumatisierung der Kornea vor, die sich im weiteren Verlauf permanent verschlechterte
und sich schließlich als Wucherung darstellte. Dabei lag das Trauma bei einem Tier ca.
einen Monat zurück, im zweiten Fall sind diesbezüglich keine Angaben im Vorbericht ge62
macht worden.
Tabelle 8: Angaben zum Krankheitsverlauf der Katzen.
Fall-Nr. E-Nr., Jahr
Rasse
18
0313/00
EKH
19
20
21
22
23
24
25
0536/00
1424/00
0523/99
0809/99
1059/99
1950/99
2044/99
EKH
EKH
EKH
EKH
EKH
Burma
Main Coon
26
2838/99
EKH
27
28
29
30
2908/99
3134/99
2315/98
4415/98
Perser
Perser
EKH
EKH
31
32
4931/98
6008/98
Mischling
Perser
33
34
35
36
37
1591/97
2156/97
2925/97
5955/97
7022/97
EKH
EKH
Perser
Beobachtungs
zeitraum
einige Jahre
1 Monat
2 Jahre
einige Zeit
4 Monate
einige Wochen
1 Woche
10 Monate
-
63
Symptome
Verschlechterung nach Hornhautverletzung
Irisverfärbung, Bulbusvergrößerung, verdickte Iris
nach Unfall weitere Verschlechterung
Irisverfärbung, verdickte Iris
Anisokorie
Bulbusvergrößerung, Glaukomsymptome
Bulbusvergrößerung, getrübte
Kornea
Anisokorie, Irisverfärbung
“Augenveränderungen”
-
Abbildung 22: Fall-Nr. 22, EKH, m.k., 5 Jahre, Melanom der Iris (Pfeile), makroskopische
Aufnahme.
64
Abbildung 23: Fall-Nr. 19, EKH, m., 14 Jahre, geringgradig pigmentiertes Melanom der Iris
(Pfeile), makroskopische Aufnahme.
65
Abbildung 24: Fall-Nr. 30, keine Rasse angegeben, w.k., 8 Jahre, Melanom Iris und Ziliarkörper (Pfeile), makroskopische Aufnahme.
66
Abbildung 25: Fall-Nr. 20, EKH, k., 13 Jahre, Melanom der Iris bei geschlossenem Bulbus
(Pfeile), makroskopische Aufnahme.
67
Abbildung 26: Fall-Nr. 20, EKH, k., 13 Jahre, nahezu amelanotisches Melanom der Iris bei
geöffnetem Bulbus, markoskopische Aufnahme.
68
3.3.5
Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Katzen
Zur Beurteilung des biologischen Verhaltens der Melanome der Katze wurde wie bei der
Beurteilung des biologischen Verhaltens der Melanome der Hunde die in der Literatur am
häufigsten benutzte Einteilung gewählt.
In der lichtmikroskopischen Untersuchung konnte nur ein Zelltyp dem Spindelzelltyp A
zugeordnet werden. Vier Fälle sind als Spindelzelltyp B zu beschreiben, von denen allerdings bei einem Fall Areale mit epitheloiden Zellen auftreten (Abb. 39). Bei insgesamt
vierzehn Fällen findet sich ein reiner epitheloider Zelltyp (Abb.32) , während nur ein Melanom einen gemischten Zelltyp aufweist (Abb. 29).
Es kann kein Zusammenhang zwischen dem Zelltyp und der Ausbildung des Gehaltes an
Retikulinfasern gefunden werden.
Insgesamt wurde der Gehalt an Retikulinfasern in zwölf Fällen als geringgradig, in sechs
Fällen als mittelgradig und in zwei Fällen als mittel- bis hochgradig beschrieben. Dabei
waren die beiden Fälle mit dem hochgradigen Retikulinfasergehalt in der Beurteilung des
histologischen Zellbildes als Spindelzelltyp A bzw epitheloider Zelltyp eingestuft worden.
Von den zwölf Fällen mit einer geringgradigen Ausbildung von Retikulinfasern waren neun
Fälle als epitheloider Zelltyp bezeichnet worden, einer als Spindelzelltyp B und einer als
gemischtzelliger Typ. Die Zelltypen bei der mittelgradigen Ausbildung von Retikulinfasern
waren in je drei Fällen vom Spindelzelltyp B und vom epitheloiden Zelltyp (Tab. 9).
Bei der Beurteilung des Pigmentgehaltes waren drei Fälle als amelanotisch zu beschreiben, sechs Fälle wiesen einen nur geringen Pigmentgehalt auf. In weitern sechs Fällen
war der Pigmentgehalt als mittelgradig und in fünf Fällen als hochgradig zu bezeichnen.
Weitere Malignitätsanzeichen im Zellbild des primären okulären Melanoms, die hier untersucht worden sind, waren das Auftreten von Nekroseherden im Tumorgewebe und die
Häufigkeit des Auftretens von Mitosefiguren (Tab. 9).
69
Bei sieben der 20 untersuchten Melanome konnten Nekroseareale gefunden werden. Von
diesen Befunden traten in einem Fall multifokal Einzelzellnekrosen auf. Bei drei Fällen
konnte fokal ein kleiner Nekroseherd gefunden werden, bei weiteren drei Fällen traten
multifokal kleine und größere Nekroseherde auf. Bezüglich des Zellbildes konnte hier keine Korrelation gefunden werden. Bei fünf Fällen, in denen Nekroseareale auftraten, lag
der epitheloide Zelltyp vor, in den restlichen zwei Fällen handelte es sich um den Spindelzelltyp B, einmal mit dem Vorliegen von epitheloiden Arealen.
Bei nur einem beurteilten Tumor fanden sich keine Mitosefiguren. Auffälligerweise war dies
auch der einzige Tumor mit einem Zellbild vom Spindelzelltyp A. Die Verteilung der Mitosehäufigkeit bei den anderen Fällen war elf mal mit geringgradig und je viermal mit mittelbzw. hochgradig zu beschreiben. Dabei war ein Fall mit einem hochgradigem Auftreten
von Mitosefiguren von der Zellbildeinteilung des Spindelzelltyps B mit Arealen von epitheloiden Zellen. Die anderen drei Fälle mit einem hochgradigen Auftreten von Mitosefiguren
waren vom epitheloiden Zelltyp.
Eine Korrelation der Häufigkeit der Mitosefiguren zum Auftreten von Nekrosearealen bzw.
Einzelzellnekrosen konnte nicht beobachtet werden.
70
Tabelle 9: Lichtmikroskopische Untersuchungsbefunde der Katzen unter besonderer Berücksichtigung von Malignitätszeichen.
Fall-Nr.
E-Nr., Jahr
Klassifizierung
18
0313/00
epith. Typ
Retikulin
faser
gehalt
ggr.
19
0536/00
epith. Typ
hgr.
20
1424/00
epith. Typ
ggr.
21
22
23
24
25
26
0523/99
0809/99
1059/99
1950/99
2044/99
2838/99
27
28
29
30
2908/99
3134/99
2315/98
4415/98
epith. Typ
ggr.
gemischt.
ggr.
epith. Typ
mgr.
epith. Typ
mgr.
Sp. B
mgr.
Sp. B + epith. mgr.
Areale
epith. Typ
ggr.
epith. Typ
ggr.
epith. Typ
ggr.
Sp. B
mgr.
31
32
33
34
35
36
4931/98
6008/98
1591/97
2156/97
2925/97
5955/97
Sp. B
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
Sp. A
epith. Typ
ggr.
ggr.
mgr.
ggr.
hgr.
ggr.
37
7022/97
epith. Typ
ggr.
Pigment Nekrosen
gehalt
Mitose
rate
amelan.
hgr.
multifokale Nekroseherde
ggr.
fokal kleiner Nekroseherd
amelan. multifokal Nekroseherde
ggr.
hgr.
amelan. ggr.
ggr.
mgr.
Einzelzell
nekrosen
mgr.
ggr.
mgr.
ggr.
fokal Nekroseherd
mgr.
hgr.
hgr.
mgr.
mgr.
hgr.
multifokal Nekroseherde
hgr.
fokal Nekroseherd
ggr.
ggr.
hgr.
mgr.
ggr.
mgr.
ggr.
hgr.
ggr.
ggr.
ggr
mgr.
ggr.
hgr.
ggr.
ggr.
mgr.
ggr.
Nach der immunhistologischen Diagnose sind die Fälle 18 und 26 als Sarkome eingestuft
worden.
In der weiteren lichtmikroskopischen Beurteilung sind destruktive Veränderungen des Auges, die bei einem infiltrativen Wachstum des Melanoms auftreten, beurteilt worden. Hierzu zählten Blutungen ins Gewebe, eine Infiltration der Sklera und die Destruktion der
Descemetschen Membran (Tab. 10).
71
Blutungen traten bei 10 von den 20 untersuchten Tumoren auf. Es konnte dabei keine
Korrelation zum Zelltyp des Tumors gefunden werden.
Eine Infiltration der Sklera mit Tumorzellen trat insgesamt fünf mal auf. Hierbei handelte
es sich einmal um den Tumor vom Spindelzelltyp A, einmal um einen Tumor vom Spindelzelltyp B mit Arealen von epitheloiden Zellen, bei den drei anderen Fällen handelte es
sich um Tumore vom epitheloiden Zelltyp.
Die Descemetsche Membran war bei vier Tumoren destruiert. Alle diese Tumore wiesen
einen mittelgradigen oder hochgradigen Mitoseindex auf und zeigten alle Blutungen. Drei
dieser Tumore waren vom Spindelzelltyp B, zwei davon mit Arealen von epitheloiden Zellen. Einer dieser Tumore war vom epithloiden Zelltyp.
Weitere Befunde der lichtmikroskopischen Untersuchung waren Symptome eines sekundären Glaukoms, welches häufig durch frei in der vorderen Augenkammer schwimmende
Tumorzellen ausgelöst wird, die den Kammerwinkel verlegen. Dieser Befund fand sich 14
mal im Untersuchungsgut (Abb. 27).
Die in der Literatur beschriebene Pigmentepithelhyperplasie, die eine häufige Begleiterscheinung beim primären okulären Melanom der Haustiere sein soll, ließ sich in diesem
Untersuchungsmaterial an insgesamt 13 von 20 Tumoren nachweisen (Tab. 10).
In einem einzigen Fall fanden sich Anzeichen einer neuronalen Degeneration des Nervus
optici. Dieser Tumor war vom Spindelzelltyp B mit Arealen von epitheloiden Zellen und
zeigte in allen untersuchten Beurteilungskriterien Hinweise auf eine hochgradige Malignität.
72
Tabelle 10: Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse der Katzen unter besonderer
Berücksichtigung der destruktiven Veränderungen.
Fall-Nr.
E-Nr., Jahr
18
19
20
21
22
23
24
25
26
0313/00
0536/00
1424/00
0523/99
0809/99
1059/99
1950/99
2044/99
2838/99
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
2908/99
3134/99
2315/98
4415/98
4931/98
6008/98
1591/97
2156/97
2925/97
5955/97
7022/97
Klassifizierung
Blut.
Sklera
Descemet. sek.
Membr.
Glauk.
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
gemischt.
epith. Typ
epith. Typ
Sp. B
Sp. B + epith.
Areale
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
Sp. B
Sp. B
epith. Typ
epith. Typ
epith. Typ
Sp. A
epith. Typ
epith. Typ
ja
nein
ja
ja
nein
ja
nein
nein
ja
infiltr.
infiltr.
destruiert
intakt
intakt
intakt
intakt
intakt
intakt
intakt
destruiert
nein
ja
ja
ja
ja
nein
ja
ja
ja
Pigment
epithel
hyperpl.
nein
ja
ja
nein
ja
ja
nein
ja
nein
nein
ja
nein
ja
ja
ja
nein
nein
nein
ja
nein
infiltr.
infiltr.
infiltr.
-
intakt
intakt
intakt
rupturiert
intakt
intakt
intakt
intakt
intakt
destruiert
intakt
ja
ja
ja
ja
ja
ja
nein
nein
nein
nein
ja
nein
nein
ja
nein
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
Nach der immunhistologischen Diagnose sind die Fälle 18 und 26 als Sarkome eingestuft
worden.
73
Abbildung 27: Fall-Nr. 30, Melan A, Vergr. 100x, ohne Angabe von Rasse und Geschlecht.
Deutlich positiv reagierende Zellen in der vorderen Augenkammer (dunkelrot gefärbt, Pfeile).
Abbildung 28: Fall-Nr. 22, Melan A, Vergr. 50x, EKH, m.k., 5 Jahre.
Pigmentreiche und pigmentarme Bereiche im Tumor.
74
Abbildung 29: Fall-Nr. 22, Melan A, Vergr. 50x, EKH, m.k., 5 Jahre.
Deutlich das Nebeneinander von epitheloiden und schlanken spindelzellförmigen Zellen
beim gemischten Zelltyp.
3.3.6
Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der Katzen
Analog zu dem Untersuchungsmaterial der Hunde wurde das Material der Katzen behandelt und mit den Antikörpern gegen S100, Vimentin und Melan A gefärbt.
Es wurde in keinem Fall eine positive Reaktion in einer der Negativkontrollen zu den jeweiligen Schnitten festgestellt.
Die bei jedem Färbedurchgang mitgeführte Positiv- und Negativkontrolle fiel in allen Färbegängen den Erwartungen entsprechend aus.
Es wurden an einem unverändertem Bulbus von einer Katze ebenfalls alle drei Färbungen durchgeführt. Dabei zeigten sich auch die unveränderten Melanozyten positiv in der
Färbung mit dem Antikörper Melan A.
In zwei Fällen der Katzenmelanome behinderte die starke Pigmentierung der Melanome
die Auswertung der Farbreaktion. Daher wurde eine Bleichung durch 24 stündiges bzw. 48
75
stündiges Lagern in Wasserstoffperoxid durchgeführt. Anschließend erfolgte die weitere
Behandlung der Schnitte gemäß dem Färbeprotokoll.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt.
Tabelle 11: Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse der okulären Melanome der
Katzen.
Fall-Nr.
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
E-Nr., Jahr S100
0313/00
0536/00
1424/00
0523/99
0809/99
1059/99
1950/99
2044/99
2838/99
2908/99
3134/99
2315/98
4415/98
4931/98
6008/98
1591/97
2156/97
2925/97
5955/97
7022/97
4/3
3/3
4/3
4/4
4/3
2/4
4/2
1/1
1/2
3/2
4/4
1/1
4/4
3/3
4/3
4/3
3/4
3/1
1/1
2/1
Vimentin
Melan A
1/3
3/2
4/3
3/4
4/3
2/3
4/4
4/3
4/4
4/4
2/4
4/4
4/3
3/2
4/3
4/3
3/4
4/4
4/1
4/1
4/2
4/3
4/4
4/2
4/2
2/4
4/3
0/0
0/0
1/1
3/3
3/4
4/4
2/4
3/3
2/2
3/1
4/1
3/4
2/4
Melan A 24h Melan A 48h
bleichen
bleichen
4/4
4/4
4/4
4/4
Nach der immunhistologischen Diagnose sind die Fälle 18 und 26 als Sarkome eingestuft
worden.
Die Auswertung wurde ebenso wie bei den Hunden in die Aspekte Quantität und Qualität
der Färbung eingeteilt und die Bewertung erfolgte in dem oben erklärten Bewertungsschema auf einer Skala von 1-4. Dabei steht die erste Zahl für die Anzahl der positiv
reagierenden Zellen, die zweite für die Qualität der Färbung.
Bei der Beurteilung der immunhistologischen Färbeergebnisse der Melanome von Katzen
76
fiel auf, daß die Reaktionen mit Vimentin durchweg deutlich positiv ausfielen.
Die Reaktion mit S100 fiel in insgesamt fünf Fällen nur schwach aus.
Melan A zeigte in insgesamt 2 Fällen keine Reaktion mit dem gefärbten Gewebe. Diese
zwei Fälle waren ebenso in der Reaktion mit S100 nur schwach (Fall-Nr. 25, 26). Weitere
zwei Fälle konnten nur mit einer schwachen Reaktion in der Skala bewertet werden (FallNr. 27, 33). Dabei wurde keine Korrelation zu der Reaktion mit S100 festgestellt.
In zwei Fällen (Fall-Nr. 31, 37) wurde die Reaktion mit Melan A nach einer Bleichung in
Wasserstoffperoxid von 24 bzw. 48 h wiederholt. Es war in beiden Fällen nach der Reduzierung des Tumorfarbstoffes Melanin eine deutlich positive Farbreaktion erkennbar.
Abbildung 30: Fall-Nr. 24, Melan A, Vergr. 100x, Burmakatze, 11 Jahre. Epitheloider Zelltyp, Beurteilung der Reaktion: 4/3
77
Abbildung 31: Fall-Nr.24, S100, Vergr. 100x, Burmakatze, 11 Jahre. Epitheloider Zelltyp,
Beurteilung der Reaktion: 4/1
Abbildung 32: Fall-Nr.18, Melan A, Vergr. 100x, EKH, m.k., 13 Jahre. Epitheloider Zelltyp,
Beurteilung der Reaktion: 4/2. Dieser und die zwei folgenden Schnitte entstammen einem
Serienschnitt eines Tumors, der nach dieser Untersuchung nicht als Melanom diagnostiziert werden kann, obwohl er sich hier mit Melan A als positiv darstellt.
78
Abbildung 33: Fall-Nr. 18, S100, Vergr. 100x, EKH, m.k., 13 Jahre. Epitheloider Zelltyp,
Beurteilung der Reaktion: 4/3
Abbildung 34: Fall-Nr. 18, Vimentin, Vergr. 100x, EKH, m.k., 13 Jahre. Epitheloider Zelltyp,
Beurteilung der Reaktion: 1/3
79
Abbildung 35: Fall-Nr. 22, Melan A, Vergr. 100x, EKH, m.k., 5 Jahre. Gemischtzelliger Typ,
hier vorwiegend Spindelzellen erkennbar. Beurteilung der Reaktion: 4/2
Abbildung 36: Fall-Nr. 22, S100, Vergr. 100x, EKH, m.k., 5 Jahre. Gemischtzelliger Typ,
Beurteilung der Reaktion: 4/3
80
Abbildung 37: Fall-Nr. 22, Vimentin, Vergr. 100x, EKH, m.k., 5 Jahre. Gemischtzelliger
Typ, hier vorwiegend epitheloide Zellen erkennbar. Beurteilung der Reaktion: 4/3
Abbildung 38: Fall-Nr. 31, Melan A, Vergr. 100x, Mischling, m., 15 Jahre. Spindelzelltyp B,
Beurteilung der Reaktion: 2/4
81
Abbildung 39: Fall-Nr. 31, Melan A, nach 24h bleichen mit Wasserstoffperoxid, Vergr.100x,
Mischling, m., 15 Jahre. Nach dem Bleichen des Schnittes ist die rote Farbreaktion wesentlich deutlicher erkennbar.
Abbildung 40: Fall-Nr. 31, Melan A, nach 48h bleichen mit Wasserstoffperoxid, Vergr.
100x, Mischling, m., 15 Jahre. Deutliches Verschwimmen der Zellgrenzen aufgrund des
Bleichens.
82
Abbildung 41: Fall-Nr. 31, S100, Vergr. 100x, Mischling, m., 15 Jahre. Spindelzelltyp B,
Beurteilung der Reaktion: 3/3
3.3.7
Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse anderer okulärer Tumore
Zusätzlich zu den Färbungen von primären intraokulären Melanomen von Hund und Katze
wurden von jeder Tierart drei weitere Veränderungen am Bulbus mit den drei immunhistologischen Färbungen gefärbt. Dies diente zur Überprüfung der Spezifität des jeweiligen
Antikörpers. Es wurden ebenso von dem vorhandenen Untersuchungsmaterial für jede
Färbung zwei Schnitte angefertigt, wovon je ein Schnitt als Negativkontrolle diente. Bei
diesen Negativkontrollen ist in keinem Fall eine positive Reaktion aufgetreten.
Zusätzlich begleitete jeden Färbedurchgang eine Positiv- und Negativkontrolle. Diese fielen in allen Färbegängen den Erwartungen entsprechend aus und zeigten so eine korrekte
Durchführung der Färbungen sowie das Funktionieren der verwendeten Reagenzien.
Die Auswertung wurde ebenso wie bei den Färbungen der primären intraokulären Melanome in die Aspekte Quantität und Qualität der Färbung eingeteilt und die Berwertung
erfolgte in dem oben erklärten Berwertungsschema auf einer Skala von 1-4. Dabei steht
83
die erste Zahl für die Anzahl der positiv reagierenden Zellen, die zweite für die Qualität
der Färbung.
Die Ergebnisse der Färbung sind in Tabelle 12 zusammengefaßt.
Tabelle 12: Immunhistochemische Untersuchungsergebnisse anderer Tumoren von Hunden und Katzen.
Fall-Nr.
Diagnose
S100
Vimentin
Melan A
38
39
40
E-Nr., Jahr
Hunde
0340/98
3656/97
7312/97
V. a. Fibrosarkom
Lymphosarkom
Adenokarzinom
0/0
4/3
4/4
3/3
2/4
3/2
0/0
1/2
0/0
41
42
43
Katzen
0506/00
0378/98
6246/97
Lymphosarkom
mesenchym. Tumor
Iritis nach perf. Corneaulcus
4/2
4/4
3/3
1/4
2/4
3/4
0/0
0/0
0/0
Bei der Auswertung der immunhistologischen Färbungen der nicht-melanozytären Tumore
fiel auf, daß die Reaktionen sowohl mit S100 als auch mit Vimentin durchweg deutlich positiv ausfielen. Einzige Ausnahme war hier das Fibrosarkom von einem Hund, Fall-Nr. 38
(0340/98), welches in der Färbung mit S100 keine positive Reaktion zeigte. Da die während des Reaktionsvorganges mitgeführte Positivkontrolle deutlich positiv ausfiel, muß
von einer korrekten Durchführung der Färbung ausgegangen werden. Bei dem Fall-Nr. 40
fiel die Farbreaktion mit Vimentin bei den positiv reagierenden Zellen nur schwach aus
und wurde mit 2 bewertet.
In dem Fall des Lymphosarkoms bei den Hunden, Fall-Nr. 39 (3656/97), ist die Färbung mit
Melan A in der Bewertungsskala mit 1/2 beurteilt worden. Dabei fiel auf, daß ausschließlich schlanke, spindelförmige Zellen angefärbt waren, während die übrigen, vorwiegend
plumpen, runden Zellen mit großen Zellkernen keine Farbreaktion zeigten.
84
4 Diskussion
Für die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit wurden Augen von insgesamt 20 Hunden und 23 Katzen histologisch aufgearbeitet, gefärbt und beurteilt. Es handelte sich dabei um Einsendungsmaterial an das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover aus dem Zeitraum vom Januar 1996 - Juli 2000 bei den Hunden, bzw. vom Januar 1997 - Juli 2000 bei den Katzen. Bei 17 der 20 Tumorproben der Hunde und bei 20
von den 23 Tumorproben der Katzen war im Vorfeld durch lichtmikroskopische Beurteilung
des Zellbildes in der H. & E.-Färbung ein primäres intraokuläres Melanom diagnostiziert
worden. Diese Diagnosestellung sollte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Des
weiteren sind je drei Augentumore nichtmelanozytären Ursprungs von Hunden und Katzen
zum Untersuchungsmaterial hinzugezogen worden, um eine positive Reaktion des neuen
Melanommarkers Melan A mit anderen Neoplasien am Auge auszuschließen und mit den
Reaktionen der anderen Marker zu vergleichen. Es handelte sich dabei je einmal ein canines Plattenepithelkarzinom, Lymphom und Fibrosarkom. Bei den Katzen wurde einmal ein
Lymphosarkom, einmal ein nicht näher bestimmter mesenchymaler Tumor und einmal eine Iritis nach einer Corneaverletzung untersucht. Des weiteren wurde je ein Kontrollauge
ohne Veränderungen von einem Hund und einer Katze bei den Färbungen mitgeführt.
Besonderer Augenmerk bei dem Vergleich der drei Immunmarker lag dabei auf der deutlichen und zuverlässigen Anfärbung der neoplastischen Zellen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der in der Humanmedizin neu entwickelte Antikörper Melan A zur Identifizierung von Melanomen auf intraokuläre Melanome von Hund und Katze übertragen werden und seine Spezifität sowie färberische Qualität dargestellt werden.
Von diesem Antikörper ist eine Kreuzreaktivität zu caninen Gewebe bekannt und verifiziert
worden (VON REISWITZ 1999, NICOTRA et al. 1997). In der vorliegenden Arbeit konnte des weiteren auch eine Kreuzreaktivität zu felinen Gewebe nachgewiesen werden. Es
wurde der Vergleich zu zwei in der Routinediagnostik der Veterinärmedizin üblichen An85
tikörpern, S100 und Vimentin, gezogen. Dabei wurde bei der Auswertung der Färbungen
die Anzahl der positiv reagierten Zellen sowie die Farbqualität in einer Bewertungsskala
von 1 bis 4 beurteilt. Als insgesamt schwach wird die Färbung im folgenden bezeichnet,
wenn sowohl die Anzahl der positiv reagierten Zellen als auch die Farbqualität mit nicht
mehr als zwei in der Bewertungsskala beurteilt wurde.
Bei allen Färbungen ist je eine Positiv- und Negativkontrolle mitgeführt worden. Diese
fielen in der Farbreaktion den Erwartungen entsprechend aus und zeigten so eine korrekte
Durchführung der Reaktionen sowie das Funktionieren der verwendeten Reagenzien.
Zu jedem bearbeiteten Schnitt wurde in der gleichen Färbereihe eine Negativkontrolle
mitgeführt. Bei keinem dieser ausgewerteten Kontrollen konnte eine positive Reaktion
festgestellt werden. So zeigten diese Kontrollschnitte die Spezifität der verwendeten Sekundärantikörper an.
Je ein unveränderter Bulbus von Hund und Katze ist ebenfalls in der gleichen Weise behandelt und gefärbt worden wie die intraokulären Melanome. Es sollte dadurch ein Hinweis gefunden werden, ob mit Hilfe des Immunmarkers Melan A eine Unterscheidung zwischen unveränderten und veränderten Melanozyten getroffen werden kann. In der Auswertung der Färbeergebnisse ist jedoch eine deutlich positive Reaktion der unveränderten
Melanozyten in beiden Tierarten zu erkennen (siehe Abb. 19). Mit Hilfe des Antikörpers
Melan A können also veränderte und unveränderte Melanozyten nicht unterschieden werden. Dies Ergebnis steht im Widerspruch zu den von NICOTRA et al. (1997) veröffentlichen Angaben, unveränderte Retina reagiere nicht mit Melan A.
Nach den Aussagen in der Literatur ist Vimentin ein zuverlässiger Marker für Zellen mesenchymalen Ursprungs. Er soll auch mit Melanozyten deutlich und zuverlässig positiv
reagieren (FRANKE et al. 1979, RAMAEKERS et al. 1982, DENK et al. 1983, SANDUSKY et al. 1985, MIETTINEN 1993, MOLL 1993). Bei der Auswertung der Ergebnisse der
immunhistologischen Färbungen der Hunde ist die Färbung mit Vimentin von insgesamt
86
17 gefärbten Tumoren jedoch in einem Fall negativ, in drei weiteren nur schwach ausgefallen. Dagegen sind die Reaktionen der Schnitte mit Vimentin bei der Katze durchweg
deutlich positiv.
Noch schlechter ist das Färbeergebnis von S100 ausgefallen. Bei den Hunden war von
17 untersuchten Fällen sechs mal keine Reaktion festzustellen und in weiteren drei Fällen
sind nur schwach positive Reaktionen aufgetreten. Die immunhistologischen Färbungen
mit S100 bei der Katze konnten in sechs Fällen als nur schwach bezeichnet werden, ein
negatives Färbeergbnis wies keiner der Schnitte auf. Diese Beurteilungen lassen insgesamt auf ein nicht zuverlässiges Ausbilden des entsprechenden Plasmaproteins in den
Melanozyten schließen, mit welchem S100 positiv reagiert.
Die Färbungen mit dem neuen Antikörper Melan A waren bei den Hunden in insgesamt
sechs von 17 Fällen negativ, in einem Fall ist die Farbreaktion als schwach bewertet worden. Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen der Katze ändert sich die
Verteilung, da von den 20 untersuchten Tumoren der Katze, die im Vorfeld in der lichtmikroskopischen Beurteilung als Melanome diagnostiziert worden sind, zwei nach der
immunhistochemischen Untersuchung als Sarkome einzuordnen sind (Fall-Nr. 18, 26).
Das Ergebnis der immunhistologischen Untersuchung muß daher lauten, daß zwei von
18 untersuchten Melanomen der Katze negativ reagierten, ein weiterer Fall nur schwach.
Auffällig ist dabei das Zusammenfallen von negativen Färbeergebnissen von Melan A und
S100 bei den Fällen der Hunde. Von den insgesamt sechs negativen Färbeergebnissen
mit Melan A sind ebenfalls vier in der Färbung mit S100 negativ (Fall-Nr. 4, 5, 10, 16).
Diese Fälle stellen sich also nach der immunhistologischen Auswertung eher unspezifisch
als ein mesenchymaler Tumor dar. Eine sichere Zuordnung zu den Melanomen kann mit
diesen Ergebnissen nicht erfolgen. So ein Ergebnis ist bei den Katzen nicht zu erheben,
die einzige negativ ausgefallene Färbung mit Melan A der Melanome ist in der Reaktion
mit S100 jedoch auch als schwach beurteilt worden (Fall-Nr. 25).
87
Die durch die Beurteilung einer H. & E.-Färbung im Vorfeld gestellten Diagnosen eines
intraokulären Melanoms sind in den Fällen 18 und 26 der Katzen in der immunhistochemischen Reaktionen nicht bestätigt worden. In diesen beiden Fällen hatte sich der im Vorfeld
als Melanom diagnostizierte Tumor als Folge eines Traumas mit Korneaperforation entwickelt. Fälle mit dieser Äthiologie sind auch in der Literatur bekannt (WOOG et al. 1983,
DUBIELZIG et al. 1984, MILLER u. BOOSINGER 1987, HAKANSON et al. 1990). Während sich der Fall-Nr. 26 in der Reaktion mit Melan A als negativ darstellt und damit die
ursprüngliche Diagnose eines Melanoms nicht bestätigt werden kann, ist der Fall-Nr. 18
positiv ausgefallen. Wird jedoch das Zellbild dieses Tumors betrachtet, fällt ein für Melanome eher untypisches Erscheinungsbild auf (Abb. 32-34). Dieser Tumors ist amelanotisch,
der Retikulinfasergehalt nur gering und die Mitoserate wird als hochgradig eingestuft. Dies
sind alles Beurteilungen, die, neben der Äthiologie der Veränderung, gegen das Vorliegen
eines Melanoms sprechen.
Abgesehen von den oben aufgezählten Fällen mit negativen Reaktionen mit Melan A,
zeigen die Ergebnisse der Hunde bei den drei Immunmarkern in den einzelnen Fällen
eine auffallend gleichmäßige Ausprägung. Das heißt, ein Fall mit einer guten färberischen
Darstellung mit S100 und Vimentin ist im Regelfall auch in der Darstellung mit Melan A gut
und umgekehrt. Fiel die Färbung mit den zwei Routineantikörpern nur schwach aus, war
dies auch bei der Färbung mit Melan A der Fall. Ausnahmen bilden hier die Fälle 9, 12 und
17. Im Fall-Nr. 9 ist die Reaktion mit S100 nur schwach ausgefallen, der Tumor läßt sich
aber aufgrund der Reaktionen mit Vimentin und Melan A gut den Melanomen zuordnen.
Dies ist ebenfalls im Fall-Nr. 12 so, wo die Färbung mit S100 negativ war, Vimentin und
Melan A jedoch deutlich positiv ausgefallen sind. Im Fall-Nr. 17 dagegen sind sowohl
S100 als auch Vimentin negativ, Melan A ist hingegen gut positiv ausgefallen und weist
den Tumor so deutlich als Melanom aus.
Das weitgehend gleichmäßige Ausfallen der Färbeergebnisse in den einzelnen Fällen läßt
sich auch auf die Färbeergebnisse der Katze übertragen, die insgesamt noch homogener
88
ausgefallen sind als die der Hunde. Ausnahmen bilden hier, abgesehen von den oben aufgeführten negativen Reaktionen mit Melan A, die Fälle 27, 29 und 36, wobei in den Fällen
29 und 36 die Reaktion mit S100 nur schwach ausgefallen ist, im Fall-Nr. 27 die Reaktion
mit Melan A. In allen drei Fällen läßt sich der Tumor jedoch aufgrund der Färbeergebnisse
der anderen beiden Immunmarkern und der histologischen Beurteilung gut dem Melanom
zuordnen.
Eine Färbung der Schnitte nach einem Bleichen in Wasserstoffperoxid für 24 und 48 Stunden mit Melan A ist bei den Hunden bei drei Fällen von stark pigmentierten Melanomen
durchgeführt worden, bei den Katzen in zwei Fällen. Statistisch läßt diese geringe Fallzahl
keine sichere Aussage und Beurteilung zu. Auffallend ist das durchweg deutlich positive
Reagieren der Schnitte mit Melan A nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid. Dies
läßt eine falsch positive Reaktion des Antikörpers vermuten, zumal in allen Fällen der Hunde eine vorher negative bzw. schwache Reaktion mit Melan A nach der Behandlung mit
Wasserstoffperoxid sehr deutlich positiv ausgefallen ist. Die mitgeführten Negativkontrollen, die derselben Behandlung unterzogen worden sind, zeigten jedoch alle eine deutlich
negative Reaktion. Trotzdem ist der Ausfall dieser Färbungen vorsichtig zu beurteilen.
Um eine fundiertere Aussage bezüglich der Spezifität der drei Immunmarker finden zu
können, wurden insgesamt sechs intraokuläre Veränderungen anderen Ursprungs in der
gleichen Weise wie die intraokulären Melanome behandelt und gefärbt (siehe Tabelle 12).
Davon waren je drei Veränderungen von Hunden und Katzen. Es handelte sich zweimal
um ein Lymphosarkom, um ein Adenokarzinom, um einen undifferenzierten mesenchymalen Tumor, um einen Verdachtsfall eines Fibrosarkoms und in einem Fall der Katzen
um eine Irisreaktion nach einem perforierendem Korneaulcus. Diese letztgenannte Veränderung nichttumoröser Art wurde gewählt, da sich Parallelen zu den Fällen 18 und 26 der
Katzen finden. Hier hatte sich die Wucherung der Iris nach einem Trauma mit Korneaperforation entwickelt.
Bei der Auswertung der immunhistologischen Färbungen zeigten alle Schnitte eine deut89
lich positive Reaktion mit Vimentin. Lediglich der Fall eines Adenokarzinoms bei einem
Hund zeigte nur eine schwache Farbreaktion der positiv reagierenden Zellen, was aufgrund des nicht-mesenchymalen Ursprungs dieser Tumorzellen zu erwarten war. In den
Fällen 38 und 39, die beide im Vorfeld als ein Sarkom diagnostiziert worden sind, sollte
die Reaktion beim Zutreffen dieser Diagnose eigentlich mit Vimentin negativ ausfallen. Die
Zellen der anderen Veränderungen werden durch den Ausfall der immunhistochemischen
Reaktionen klar als Zellen mesenchymalen Ursprungs identifiziert.
Die immunhistologische Färbung mit S100 war bis auf eine Ausnahme ebenfalls in allen
Fällen deutlich positiv. Einzige Ausnahme ist der Fall-Nr. 38, bei dem der Verdacht eines
Fibrosarkoms bei einem Hund geäußert wurde. Beim Zutreffen dieser Diagnose hätte die
Reaktion mit S100 eigentlich ebenfalls negativ ausfallen müssen.
Bei den Färbungen dieser nichtmelanozytären Veränderungen mit dem neuen Antikörper
Melan A waren alle Fälle bis auf eine Ausnahme negativ. Im Fall-Nr. 39, eines Lymphosarkoms der Hunde, zeigte sich eine schwach positive Reaktion von vorwiegend schlanken
spindelzellförmigen Zellen. Hier kann vermutet werden, daß es sich bei den Zellen mit einer positiven Farbreaktion um Melanozyten handelt, die auch im unveränderten Zustand
positiv mit Melan A reagieren.
Aus diesen Ergebnissen läßt sich folgern, daß mit Hilfe des Antikörpers Melan A eine
Differenzierung von Melanomen am Auge bei Hund und Katze zu Tumoren anderen Ursprungs geschehen kann. Es zeigt aber auch, daß eine Diagnose allein aus dem Ergebnis
der immunhistologischen Färbungen nicht sicher möglich ist, sondern immer auch das histologische Erscheinungsbild und gegebenenfalls auch die Krankheitsgeschichte beurteilt
werden muß. Im Falle des Antikörpers Melan A ist dem Diagnostiker jedoch eine wichtige Hilfestellung zur Differenzierung von intraokulären Melanomen bei Hund und Katze
gegeben.
Ein in der Literatur beschriebenes häufigeres Auftreten von primär-okulären Melanomen
90
bei Hunden (ACLAND 1979, SCHAEFFER u. FUNKE 1985) konnte in dieser Arbeit nicht
bestätigt werden. Unter den Einsendungen an das Institut für Pathologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover in dem angegebenen Zeitraum von 4 Jahren befanden sich weitaus
mehr intra-okuläre Melanome von Katzen. Diese Beobachtung geht konform mit der 1993
von SCHAEFFER u. GORDON beobachteten zunehmenden Häufigkeit von intraokulären
Melanomen bei den Katzen.
Die in der Literatur vermuteten Dispositionen bestimmter Hunderassen (Dackel, Boxer
und Schäferhund ) konnte in dem vorliegendem Material nicht bestätigt werden (RYAN u.
DITERS 1984, SCHAEFFER u. FUNKE 1985). Im vorliegenden Untersuchungsmaterial
waren Mischlinge mit 4 Fällen und Airdale Terrier und Cairn Terrier mit jeweils 3 Fällen am
häufigsten vertreten.
Bei den Katzen war die Rasse Europäisch Kurzhaar mit 10 Tieren deutlich in der Überzahl.
Bei der Interpretation dieser Zahl muß jedoch bedacht werden, daß es sich hierbei um
die im Einzugsgebiet der Tierärztlichen Hochschule Hannover am weitesten verbreitetste
Katzenrasse handelt, so daß dieser Befund bei der geringen Fallzahl dieser Untersuchung
nicht als Disposition interpretiert werden kann. Auffällig ist dagegen die mit 5 von 20 Fällen
hohe Häufigkeit der Perserkatzen im Untersuchungsmaterial.
Das Durchschnittsalter der Hunde im vorliegenden Untersuchungsmaterial liegt bei 9 Jahren und stimmt mit den in der Literatur gemachten Angaben überein (DITTER et al. 1983,
MARTIN 1994). Ebenso stimmt die bei den Katzen in der Literatur gefundene Angabe
zum Durchschnittsalter (10 Jahre) mit dem eignen Material überein ( PATNAIK u. MOONEY 1988, SCHAEFFER u. GORDON 1993).
Bezüglich der Geschlechterverteilung überwiegen bei den Hunden die männlichen Tiere
mit einem Auftreten von 10 von 15 Tieren mit einer Angabe zum Geschlecht signifikant.
Dagegen sind bei den Katzen von 16 Fällen mit einer Angabe zum Geschlecht 9 weiblich,
davon 6 weiblich kastriert, und somit deutlich in der Überzahl. In der Literatur wird ein
91
ausgeglichenes Geschlechterverhältnis beschrieben (SCHAEFFER u. GORDON 1993,
COLLINSON u. PEIFFER 1995). Aufgrund der statistisch nicht aussagekräftigen Fallzahl
der hier vorliegenden Untersuchung, kann jedoch keine Interpretation dieser Ergebnisse
hinsichtlich einer Disposition stattfinden.
In 16 von den 17 untersuchten Fällen eines primär-intraokulären Melanoms der Hunde
liegt die Primärlokalisation der Veränderungen in der Uvea anterior. Dies stimmt mit den
in der Literatur gefundenen Angaben überein (BELLHORN u. HENKIND 1970, SOURI
1978, DUNCAN u. PEIFFER 1991) wo ein signifikant häufigeres Auftreten dieser Veränderungen in dem vorderen Teil der Retina beschrieben wird. Nur in dem Fall-Nr. 3 der
untersuchten Hunde lag die Primärlokalisation im hinteren Teil der Retina, der Uvea posterior. Hier ragte von der Papilla nervi optici ausgehend eine Neubildung ohne makroskopisch erkennbare Strukturierung in den Innenraum des Bulbus. Auch in der Literatur wird
das Auftreten von Melanomen in dieser Lokalisation beschrieben und als sehr selten bezeichnet (SAUNDERS u. BARRON 1958, DITTER et al. 1983). Bei den Katzen stimmen
die im eigenen Untersuchungsmaterial beobachteten Primärlokalisationen mit den in der
Literatur gemachten Angaben ebenso überein. So ist bei 16 von 18 Fällen die Ausgangslokalisation der Veränderungen in der Uvea anterior, von denen in 5 Fällen die Wucherungen schon auf hintere Anteile der Retina übergreifen. Bei den übrigen zwei untersuchten
Bulbi waren die Veränderungen schon soweit fortgeschritten, daß sie den gesamten Bulbus destruiert hatten. In diesen Fällen kann eine Primärlokalisation der Veränderungen
nicht mehr bestimmt werden.
Die in der Literatur erwähnten typischen klinischen Anzeichen wie sichtbare Veränderungen der Iris, Entwicklung eines sekundären Glaukoms und Umfangszunahme des betroffenen Bulbus (COLLINSON u. PEIFFER 1995) konnte auch in den Vorberichten des hier
untersuchten Materials gefunden werden.
Bei der Klassifikation des Zelltypes der Tumore wurde die ursprünglich von CALLENDER (1931) begonnene und 1974 von KIRCHER et al. ausgearbeitete Klassifizierung
92
anhand von morphologischen Merkmalen verwendet.
In den vorliegenden Untersuchungen wurden 14 von 18 okulären Melanomen der Katze
als epitheloider Zelltyp bezeichnet. Bei den Hunden sind es 12 von 17. Ein signifikant
häufigeres Auftreten des epitheloiden Zelltyps bei der Katze im Vergleich zum Hund kann
nicht festgestellt werden. Auffällig ist das Überwiegen dieses Zelltyps bei beiden Tierarten,
was ein Hinweis auf ein malignes Verhalten der Veränderungen ist.
Der Gehalt an von den Tumorzellen produzierten Retikulinfasern ist bei den Hunden geringer als bei den Katzen. Dieses Untersuchungsergebnis stimmt nicht mit den in der
Literatur gefundenen Angaben überein. So geben SCHAEFFER u. FUNKE 1985 einen
geringen Retikulinfasergehalt bei der Katze an. In der vorliegenden Untersuchung sind
nur drei der untersuchten 17 Fälle der Hunde mit einem mittelgradigen Retikulinfasergehalt gefunden worden, die übrigen wurden als geringgradig eingestuft. Dagegen wurden
bei den untersuchten Melanomen der Katze insgesamt fünf von 18 mit einem mittelgradigen Retikulinfasergehalt gefunden, zwei weitere als hochgradig eingestuft. Dies entspricht
dem vorwiegend malignen Erscheinungsbild des intraokulären Melanoms der Katze, welches überwiegend in der Literatur beschrieben wird ( BELLHORN u. HENKIND 1970,
ACLAND et al. 1980, SCHAEFFER u. GORDON 1993).
Des weiteren fiel die deutlich höhere Mitoserate der caninen okulären Melanome auf. Hier
zeigten zehn der 17 untersuchten Melanome eine hochgradige Mitoserate, vier wurden
als mittelgradig eingestuft, die übrigen als geringgradig. Im Gegensatz dazu sind bei den
Katzen nur zwei Fälle mit einer hochgradigen Mitoserate, ebenfalls vier mit einer mittelgradigen Mitoserate und die übrigen mit einer geringgradigen Mitoserate gefunden worden.
Dies Untersuchungsergebnis weist auf eine malignere Erscheinungsform des caninen Melanoms hin, stimmt jedoch mit der Aussage von PATNAIK u. MOONEY (1988) überein, die
in ihrer Untersuchung zu dem Ergebnis kamen, daß das intraokuläre Melanom der Katzen trotz des malignen Zellbildes eine allgemein geringe Tendenz zu schnellem Wachstum
aufweist. Bei der Beurteilung der Mitoserate muß jedoch beachtet werden, daß die Anzahl
93
der im Schnitt aufgefundenen Mitosefigure auch aufgrund einer zu späten Fixierung des
Materials verfälscht sein kann. Es wird dann eine geringerer Mitoseindex festgestellt.
Die von PATNAIK u. MOONEY beschriebenen Blutungen und Nekrosen konnten auch
in dieser Arbeit beobachtet werden. Dabei traten bei den Hunden in 12 von 17 Fällen
Nekrosen auf, die sich in fünf Fällen lediglich als Einzelzellnekrosen darstellten, sonst
jedoch fokale oder multifokale Nekroseareale waren. Im Vergleich dazu wurden bei den
Katzen in nur fünf der 18 Fälle Nekroseanzeichen gefunden. Dabei handelte es sich in
drei Fällen um einen fokalen Nekroseherd, in zwei Fällen traten multifokale Nekroseherde
auf. Blutungen waren bei den Fällen der Hunde in zehn von 17 Fällen aufzuweisen, bei
den Katzen in acht von 18 Fällen.
Insgesamt läßt sich in dem untersuchten Material ein häufigeres Auftreten von Nekrosen
und Blutungen beim Hund beobachten.
Des weiteren fiel der deutlich höhere Pigmentgehalt der caninen okulären Melanome auf.
Es wurden insgesamt zehn von 17 untersuchten caninen Melanomen als hochgradig pigmentiert eingestuft, von den übrigen nur drei als geringgradig und keines der Melanome als amelanotisch. Im Vergleich hierzu waren bei den Katzen nur fünf Melanome als
hochgradig pigmentiert einzustufen, von den übrigen sind sechs geringgradig pigmentiert und zwei amelanotisch. Es konnte also die in der Literatur gefundene Aussage, das
okuläre Melanom der Katze sei im Gegensatz zu dem der Hunde vorwiegend amelanotisch bzw. nur gering pigmentiert, bestätigt werden (SCHULTZE SCHLEITHOFF u. OPITZ
1983, SCHAEFFER u. FUNKE 1985, PATNAIK u. MOONEY 1988).
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß das primäre intraokuläre Melanom beim Hund
häufig stark pigmentiert ist, aus vorwiegend epitheloiden Zellen besteht und eine hohe
Neigung zu Sklerainvasionen, Nekrosen und Blutungen zeigt. Die ebenfalls häufig hohe
Mitoserate läßt auf ein schnelles Wachstum der Veränderungen schließen.
Die untersuchten primären intraokulären Melanome der Katze zeigen ein vorwiegend
94
gering pigmentiertes, epitheloides Erscheinungsbild. Sie stellen sich im histologischem
Schnitt als deutlich weniger maligne dar, als die Schnitte der Hunde. Eine geringere Neigung zu Sklerainvasionen, Nekrosen und Blutungen lassen auf eine allgemein niedrige
Tendenz zum invasiven Wachstum schließen. Die ebenfalls geringere Mitoserate zeigt ein
langsames Wachstum der Veränderungen und damit ebenfalls ein eher benignes Verhalten.
95
5 Zusammenfassung
Silke Glage (2001)
Immunhistochemische Diagnostik von intraokulären Melanomen bei Hund und Katze
Mit Hilfe dieser Arbeit soll eine Aussage zu der Frage gefunden werden, ob die in der
Humanmedizin neue immunhistochemische Nachweismethode mit dem Antikörper Melan
A auf die Diagnostik von intraokulären Melanomen bei Hund und Katze in der Veterinärmedizin übertragen werden kann und ob sie einen wesentlichen Vorteil gegenüber den
bisher routinemäßig eingesetzten Färbemethoden mit S100 und Vimentin besitzt. Dabei
wurden auch die im Vorfeld mittels der lichtmikroskopischen Beurteilung gestellten Diagnosen überprüft. Ferner sollte durch eine sorgfältige lichtmikroskopische Beurteilung der
in den intraokulären Melanomen beider Tierarten gefundenen histologischen Befunde ein
Vergleich zu den in der Literatur genannten Angaben zum histologischen Erscheinungsbild sowie dem malignen oder benignen Zellbild und Verhalten des Tumors gezogen werden.
Für diese Untersuchungen wurden insgesamt 43 Augen von Hunden und Katzen beiderlei
Geschlechtes mit Neoplasien ausgewertet. Davon stammten 20 Proben von Hunden im
Alter von 2 bis 17 Jahren und 23 Proben von Katzen im Alter von 3 bis 16 Jahren. Von
den 20 caninen Proben stand bei 17 Fällen im Vorfeld aus der lichtmikroskopischen Beurteilung der H. & E.-Färbung die Diagnose eines Melanomes, ebenso in 20 von 23 Fällen
der Neoplasien der Katze.
Sechs intraokuläre Veränderungen mit einer anderen Diagnose ( Tab. 12) wurden zur
Darstellung der Spezifität der verwendeten Antikörper gefärbt.
Bei der Auswertung der immunhistochemischen Färbungen zeigt sich Vimentin bei beiden Tierarten als ein zuverlässiger Marker für Melanome. Er reagierte jedoch mit allen
96
Veränderungen nichtmelanozytären Ursprungs ebenfalls deutlich positiv.
S100 reagierte in dieser Untersuchung vor allem bei den Melanomen der Hunde unzuverlässig. Auch bei den untersuchten Melanomen der Katze zeigten sich deutliche Schwankungen hinsichtlich der Farbqualität und -spezifität. Die Reaktionen mit Tumoren nichtmelanozytären Ursprungs waren bis auf eine Ausnahme ebenfalls positiv ausgefallen.
Die Reaktionen mit dem neuen Antikörper Melan A zeigten mit den Melanomen der Hunde eine sehr unterschiedliche Ausprägung. So war das Ergebnis in sechs von 17 Fällen
negativ und in einem Fall nur schwach ausgefallen. Auffällig ist, daß vier Fälle mit einem negativen Färbeergebnis ebenfalls mit S100 negativ reagierten. Dieses Ergebnis der
immunhistochemischen Färbungen deutet nicht auf das Vorliegen eines Melanoms hin,
welches jedoch anhand der lichtmikroskopischen Befunde als Diagnose bestätigt werden
muß.
Bei den Katzen reagierte Melan A zuverlässiger, wies jedoch ebenfalls in zwei Fällen
ein negatives Ergebnis auf. In zwei Fällen, in denen sich die Veränderungen aus einer
vorhergehenden Korneaverletzung entwickelt hatte, konnte die Diagnose eines Melanoms
nach der immunhistochemischen Auswertung nicht bestätigt werden.
Melan A zeigte bis auf eine Ausnahme keine Reaktion mit nichtmelanozytären Veränderungen. Einzig im Fall-Nr. 39 eines Lymphosarkoms bei einem Hund war die Farbreaktion
schwach positiv beurteilt worden.
Bei der Färbung je eines unveränderten Bulbus von Hunden und Katzen reagierte der Antikörper Melan A deutlich positiv mit den unveränderten Melanozyten. Es kann mit seiner
Hilfe nicht zwischen gesunden und entarteten Melanozyten unterschieden werden.
Das primäre intraokuläre Melanom des Hundes trat im Durchschnitt ab einem Alter von
9 Jahren auf. Die Primärlokalisation befand sich dabei vorwiegend in der Uvea anterior.
Nur in einem Fall im Untersuchungmaterial befand sich die Primärlokalisation in der Uvea
posterior. Bei den lichtmikroskopischen Untersuchungen der Hunde fiel eine häufig star97
ke Pigmentierung sowie eine hohe Mitoserate auf. Insgesamt sind Malignitätszeichen wie
invasives Wachstum, Auftreten von Nekrosen und Blutungen beim Hund häufiger ausgeprägt als bei der Katze.
Bei den Katzen ist die Diagnose eines intraokulären Melanoms im Schnitt im Alter von 10
Jahren gestellt worden. Die Primärlokalisation befand sich hier ausschließlich in der Uvea
anterior. In der lichtmikroskopischen Auswertung zeigte das primäre intraokuläre Melanom
der Katze ein relativ benignes Erscheinungsbild. Es ist vorwiegend gering pigmentiert
und es finden sich nur wenig Mitosefiguren. Es zeigt eine geringe Neigung zu invasiven
Wachtum, Nekrosen und Blutungen.
Summary
Silke Glage (2001)
Immunhistochemical diagnosis of intraokular melanomas in cats and dogs
The purpose of this study was to evaluate, wether the new antibody Melan A, which was
developed for human histochemical diagnosis, is transferable to veterinary histochemical
diagnosis and if it has substantial adventage to the normally used histochemical staining
with S100 and Vimentin. The previous found diagnosis using the lightmicroscopy were
also checked. Additionally, the histology characteristics of the intraocular melanomas were
carefully examined and compared to the statements found in literature.
Alltogether 43 bulbi of dogs and cats with neoplasia were investigated and stained immunhistochemically. The age ranged between 2 and 17 years within the dogs and between 3
and 16 years within the cats. In 17 of 20 cases of dogs and in 20 of 23 cases of cats the
diagnosis of intraocular melanoma were made previously. In two cases of the cats this
diagnosis could not be confirmed.
98
For evaluating the specifity of the used antibodies six other intraocular pathological changings were also investigated.
Vimentin seems to be a reliable marker for melanomas, but all none melanocytic tumors
were also positive.
S100 did not show a reliable staining, especially in the tissue of dogs. It varied in the quality
of staining as well as in the specifity. All reactions except of one of the none melanocytic
tumors reacted also positive.
The results of Melan A showed an irregular staining especially with the tissue of the dogs.
6 of 17 examined cases were negative. Four of them were also negative in the staining with
S100 but the diagnosis of melanoma of these cases could be confirmed in lightmicroscopy.
All except of one case of the none melanocytic tumors reacted negative with Melan A. Only
case 39, a lymphosarcoma of a dog, showed a weak positive reaction.
Melan A reacted positive in physiological bulbi of a dog and a cat.
The results of the antecedents and the histologic characteristics were as following:
The intraocular melanoma in dogs was diagnosed at an average age of 9 years. The
prefered localisation was the Uvea anterior. Only in one bulbi in this study the location was
in the Uvea posterior. The melanomas of dogs were in most cases high pigmented and
showed a high rate of mitoses. All signs of malignicy like invasive growing, necropsy and
bleeding were frequently found.
In cats the intraocular melanoma was found at an average age of 10 years. The location
was always the Uvea anterior. In most cases the histological findings were more benigne
than in dogs. The melanomas were in most cases less pigmented or amelanotic, showed
no invasive growing, necropsy and bleeding.
99
6 Anhang
6.1
Bezugsadressen
1. Melan A, Klon A103
DAKO A/S, Denmark, Vertrieb Hamburg, Am Stadtrand 52, Art.Nr.: M-7196
2. Vimentin
DAKO A/S, Denmark, Vertrieb Hamburg, Am Stadtrand 52, Art.Nr.: M-0725
3. S100
Sigma Diagnostics, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Grünwalder Weg 30, 82039 Deisenhofen, Art.Nr.: S-2644
4. biotinylierter goat-anti-mouse Antikörper
Vector Laboratories, 30 Ingold Road, Burlingham, USA, Art.Nr.: CA 94010
5. biotinylierter goat-anti-rabbit Antikörper
Vector Laboratories, Petersborough, U.K., Art.Nr.: BA-100
6. AEC-Substrat
Sigma Chemicol Co., St. Louis, USA, Nr. A-57754
7. Demaskierungslösung G
BIOLOGO, Steindamm 1h, 24119 Kronshagen, Art.Nr.: DE-007
8. Coverplates
Shandon GmbH, Berner Str. 53, 60437 Frankfurth / Main
9. Parafrost-Objektträger
Fa. Menzel-Gläser, Deutschland, Art.Nr. 041300
100
10. Kaisers Glyceringelantine
Fa. Merk, Darmstadt, Art.Nr.: 9242
6.2
6.2.1
Reagenzien für die Immunhistologie
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
40g NaCl (Fa. Fluka, Buchs, CH, Art.Nr. 71381) und
7,8g NaH2 PO4 (Fa. Fluka, Buchs, CH, Art.Nr. 71496)
werden in 5 Liter destilliertem Wasser gelöst und mit
1M Natronlauge (Fa. Merck, Darmstadt, Art.Nr. 9137) auf pH 7,1 eingestellt.
6.2.2
Demaskieren der Antigene mit Demaskierungslösung G
Demaskierungslösung G (Fa. Biologo, Kronshagen, Art.Nr.: DE-007)
in einer Verdünnung von 1:4 mit PBS-Puffer ansetzen.
Die Schnitte 30 Minuten bei einer Temperatur von 92-95Æ C im Wasserbad inkubieren.
6.2.3
Bleichen von Melanin mit Wasserstoffperoxid
Entparaffinieren der Schnitte bis Aqua dest., verbringen für 24 bzw. 48 h in 10%iger H2 O2 Lösung.
6.3
ABC-Methode der immunhistochemischen Färbungen
I. Entparaffinieren und Rehydrieren
101
Xylol 1: 5 Minuten, Xylol 2: 5 Minuten, Xylol 3: 5 Minuten, Isopropanol: 5 Minuten, Ethanol 96%: 2-3 Minuten.
II. Hemmung der endogenen Peroxidase
197ml Ethanol 85% + 3ml 30% Perhydrol (Inkubationszeit 30 Minuten)
III. Spülen mit PBS-Puffer (Inkubationszeit 3x5 Minuten)
IV. Wechsel von Küvetten in Coverplates (Shandon GmbH, Frankfurth/Main) und erneutes
Spülen mit PBS-Puffer (Inkubationszeit 2x5 Minuten)
V. Inkubation mit dem Blockserum in Gebrauchsverdünnung (inaktiviertes Normalserum
der Spezies, aus der der Sekundärantikörper gewonnen wurde, zur Unterdrückung
von unspezifischen Hintergrundfärbungen, Inkubationszeit 20 Minuten)
VI. Inkubation mit dem primären Antikörper in Gebrauchsverdünnung mit PBS-Puffer (Inkubationszeit: über Nacht bei -4Æ C)
VII. Spülen mit PBS-Puffer (Inkubationszeit 3x5 Minuten)
VIII. Überschichten mit dem sekundären, biotinylierten Antikörper in Gebrauchsverdünnung (Inkubationszeit 30-45 Minuten)
IX. Spülen mit PBS-Puffer (Inkubationszeit 3x5 Minuten)
X. Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Komplex in Verdünnung von 1:250
mit PBS-Puffer (Inkubationszeit 30-60 Minuten)
XI. Wechsel von Coverplates in Küvetten, Spülen mit PBS-Puffer (Inkubationszeit 3x5
Minuten)
XII. Inkubation mit AEC+Chromogen-Substrat (Inkubationszeit 5-30 Minuten)
102
XIII. Spülen mit PBS-Puffer (Inkubationszeit 3x5 Minuten)
XIV. Verbringen in fließendes Leitungswasser (Inkubationszeit 15 Minuten)
XV. Gegenfärben mit Hämalaun nach Meyer (Inkubationszeit 1,5 Minuten)
XVI. Bläuen unter fließendem Leitungswasser (Inkubationszeit 10-15 Minuten)
XVII. Eindecken der Schnitte mit Kaisers Glyceringelantine
103
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