Inhaltsverzeichnis

Hämolymphe
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................... 1
1. Theoretische Einleitung...................................................................................................... 2
1.1
Blut und Hämolymphe............................................................................................. 2
1.1.1
Blut ..................................................................................................................... 2
1.1.2
Hämolymphe .................................................................................................... 2
1.2
Informationsübertragende Moleküle..................................................................... 2
1.2.1 Hormone ................................................................................................................. 3
1.2.2 Neurotransmitter .................................................................................................... 3
1.2.3 Pheromone ............................................................................................................. 4
1.3 Die Entwicklung der Insekten...................................................................................... 4
1.3.1 Die Metamorphose ................................................................................................ 4
1.3.2 Die Hormonelle Steuerung der Metamorphose und Häutung........................ 4
1.4 Die Photometrie............................................................................................................. 6
1.5 Chromatographie .......................................................................................................... 7
2. Praktische Durchführung ................................................................................................. 10
2.1 Aufgabenstellung des Versuchs............................................................................... 10
2.1 Material und Methoden .............................................................................................. 10
3. Ergebnisse ......................................................................................................................... 12
3.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolymphe und
Vergleich mit desulfo-Sinalbin ......................................................................................... 12
3.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließender
photometrischer Nachweis von Sinalbin ............................................................... 12
3.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung von
Carcinus maenas........................................................................................................... 13
4. Diskussion ...................................................................................................................... 14
4.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolymphe und
Vergleich mit desulfo-Sinalbin ......................................................................................... 14
4.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließender
photometrischer Nachweis von Sinalbin........................................................................ 14
4.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung von
Carcinus maenas........................................................................................................... 15
5. Zusammenfassung ........................................................................................................... 15
1
Hämolymphe
1. Theoretische Einleitung
1.1 Blut und Hämolymphe
Im Körper von Tieren und Menschen ist das Kreislaufsystem das wichtigste Transportmittel.
Über dieses System können Nährstoffe, Atemgase, Abwehrstoffe und Botenstoffe an den Ort
im Körper gebracht werden, am dem sie benötigt werden. Stoffwechselprodukte werden
durch das Kreislaufsystem zu den Exkretionsorganen befördert.
1.1.1 Blut
Das Blut ist die transportierende Flüssigkeit im Körper von Tieren mit einem geschlossenen
Kreislaufsystem. Es fließt in den Blutgefäßen und ist von der Interzellular-Flüssigkeit
getrennt. Der Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe (bzw. Interzellular-Flüssigkeit)
erfolgt durch Diffusion oder aktiven Transport an den Membranen.
Das Vertebraten-Blut besteht aus besonderen Zellen und dem flüssigen Blutplasma.
Die Blutzellen kann man in drei Gruppen unterteilen: die Erythrocyten, deren Hauptaufgabe
der O2-Transport ist, die Leukocyten, die für die spezifische Immunabwehr zuständig sind,
und die Thrombocyten, die bei der Blutgerinnung mitwirken. In den Erythrocyten befinden
sich die respiratorischen Proteine (z.B. das Hämoglobin beim Menschen), die O2 binden und
transportieren können.
Das Blutplasma setzt sich aus Wasser (ca.90%), darin gelösten Elektrolyten (pH-Pufferung)
und Plasmaproteinen, wie z.B. Albumin (Erhaltung des osmotischen Gleichgewichts),
Immunglobulinen (Immunabwehr) und Fibrinogen (Blutgerinnung) zusammen. Außerdem
sind im Blutplasma auch Glucose (Nährstoff) und Harnstoff (Exkretion) enthalten.
1.1.2 Hämolymphe
Bei Tieren mit einem offenen Kreislaufsystem nennt man die transportierende Flüssigkeit
Hämolymphe. Diese fließt, kaum von Gefäßen umschlossen, durch den Körper; InterzellularFlüssigkeit und Hämolymphe sind nicht getrennt, man spricht hier von einer
hämocoelfüllenden Hämolymphe.
Hämolymphe ist dem Blut der Wirbeltiere sehr ähnlich, mit der Ausnahme, dass sich in der
Hämolymphe keine Erythrocyten zum O2-Transport befinden. Der Sauerstoff wird hier über
das Tracheensystem direkt zu den Organen und Geweben befördert. Da der Sauerstoff in
der Gasphase transportiert wird, geht der Transport sehr viel schneller als bei den
Vertebraten: ein Insekt kann eine Zelle mit 100mal mehr O2 pro Zeiteinheit versorgen als ein
Wirbeltier.
Respiratorische Pigmente werden meist nicht benötigt und schwimmen, wenn vorhanden,
frei in der Hämolymphe.
1.2 Informationsübertragende Moleküle
In einem komplexen vielzelligen Organismus, in dem verschiedene Gewebe und Organe
spezielle Aufgaben übernehmen, muss gewährleistet sein, dass die verschiedenen
Tätigkeiten genau aufeinander abgestimmt sind. Hierfür ist ein gut funktionierendes
Kommunikationssystem innerhalb des Körpers unerlässlich.
2
Hämolymphe
Bei den Metazoen haben sich zwei Kommunikationsysteme entwickelt, das Nervensystem
und das Endokrinsystem. Im Nervensystem wird Information in Form von Aktionspotentialen
und mit Hilfe von Neurotransmittern über die Nervenbahnen weitergeleitet, im endokrinen
System dienen Hormone als Informationsträger. Für die Kommunikation zwischen einzelnen
Individuen derselben Art gibt es weitere chemische Botenstoffe, die Pheromone.
1.2.1 Hormone
Das endokrine System nutzt als Botenstoffe ausschließlich chemische Botenstoffe, die
Hormone. In der Regel werden die Hormone in bestimmten Zellen oder endokrinen Organen
(z.B. Schilddrüse) gebildet, in den Blutkreislauf ausgeschüttet und gelangen über das Blut an
ihren Zielort. Hier binden sie an spezifische Rezeptoren und entfalten ihre Wirkung. Natürlich
gibt es auch Ausnahmen, wie z.B. die Prohormone, die erst an ihrem Bestimmungsort in das
eigentliche Hormon umgewandelt werden, oder Hormone, die nur auf die eigene Zelle (oder
benachbarte) wirken, ihren Entstehungsort also nie verlassen. Manche Hormone bewegen
sich auch nur durch Diffusion im Gewebe oder werden sowohl von endokrinen, als auch von
Nervenzellen gebildet.
Die Hormone spielen eine Rolle bei der Stoffwechsel- und Fortpflanzungsregulierung, sie
fördern das Wachstum und die Entwicklung, die Anpassung eines Organismus an seine
Umwelt und steuern Verhaltensprozesse. Hormone verhalten sich wirkungsspezifisch und
nicht streng artspezifisch (Sexualhormone wirken zum Beispiel auch bei Amphibien),
außerdem kann ein Hormon auch mehrere Funktionen haben.
Die Hormone können in vier Gruppen unterteilt werden, die sich in ihrem chemischen Aufbau
unterscheiden: die Protein- und Peptidhormone (mit komplexer Molekülform, die einer
Aminosäuresequenz zu Grunde liegt, z.B. Insulin), die Aminosäurederivate (z.B. Adrenalin),
die Steroidhormone (cyclische Kohlenwasserstoffderivate, z.B. Östrogene und Testosteron)
und die Prostaglandine (cyclische, ungesättigte Fettsäuren).
Hormone können ihre Wirkungsweise auf zwei verschiedene Arten entfalten:
•
Direkte Wirkungsweise: Auf Grund ihres meist lipophilen Charakters wirken die
Steroidhormone direkt, da sie die Zellmembran ungehindert passieren können. Im
Innern der Zelle binden die Hormone an einen spezifischen Rezeptor (HormonRezeptor-Komplex), der sich entweder im Cytoplasma oder im Zellkern befindet.
Der Hormon-Rezeptor-Komplex dockt an die Promotorregion bestimmter
abzulesender Gene (gene responsive elements) an und beeinflusst somit die
Transkription entweder in hemmender oder in fördernder Art und Weise.
•
Indirekte Wirkungsweise: Die anderen drei Hormonklassen wirken indirekt, da ihr
lipophiler Anteil meist nicht ausreicht, um die Zellmembran passieren zu können. Die
Hormone binden als first messenger an einen Rezeptor in der Zellmembran. Durch
Konformationsänderungen wird ein second messenger (z.B. cGMP) im Zellinnern
aktiviert. Durch Aktivierung dieses second messengers kommt es zur Auslösung
einer Verstärkugskaskade, die die Zelle wiederum in hemmender oder fördernder Art
und Weise beeinflusst.
1.2.2 Neurotransmitter
Im Nervensystem findet die Informationsweiterleitung hauptsächlich auf elektrischem Weg
statt. Die Information wird mit Hilfe von Aktionspotentialen (APs), die auf Grund der
Potentialdifferenz an der Axonmembran entstehen können, über die Nervenzellen
weitergeleitet. Für die interzelluläre Signalweitergabe an den Synapsen verwendet auch
dieses System chemische Botenstoffe. Diese Neurotransmitter (z.B. Adrenalin, Acetylcholin)
werden bei einem ankommenden AP von der Synapse in den postsynaptischen Spalt
3
Hämolymphe
entleert. Die Neurotransmitter binden an Rezeptoren, die sich auf der postsynaptischen
Membran der „Empfängerzelle“ befinden und lösen dort eine Erregung aus. Die Weiterleitung
zwischen Neuron und Neuron oder Neuron und Effektor findet also auch auf chemischem
Weg statt und kann mit der hormonellen Wirkungsweise verglichen werden. Jedoch ist die
Wirkung der Neurotransmitter auf sehr kleine Distanzen beschränkt.
1.2.3 Pheromone
Unter den Pheromonen versteht man eine Gruppe von chemischen Botenstoffen, die der
chemischen Kommunikation zwischen Individuen derselben Art dienen. Sie werden von
exokrinen Drüsen produziert und nach außen abgegeben. Dort werden sie dann mittels
Sinneszellen (meist Riechzellen) aufgenommen und führen zu einer Reaktion. Ein bekanntes
Beispiel für Pheromone sind die Sexuallockstoffe.
Eine Form der Pheromone sind die sog. Kairomone, die der Kommunikation zwischen
verschiedenen Arten bzw. auch zwischen Tier und Pflanze dienen.
1.3 Die Entwicklung der Insekten
1.3.1 Die Metamorphose
Unter Metamorphose versteht man bei Tieren Entwicklungsvorgänge, die unter
Gestaltswechsel vom Larven- zum Adultstadium führen; sie ist bei den Insekten durch
Häutungen gekennzeichnet.
Man unterscheidet bei den Insekten zwischen einer vollständigen und einer unvollständigen
Metamorphose.
•
•
Hemimetabolie (unvollständige Verwandlung): Bei dieser Entwicklung schlüpft die
Larve aus einem Ei. Über mehrere, untereinander ähnliche Häutungsstadien
entwickelt sie sich direkt zur Imago. Zwischen den Larvenstadien und der Imago
liegen meist nur geringe morphologische Unterschiede (die Larve ist kleiner als die
Imago und bei pterygoten Insekten flügellos). Durch diese Entwicklung sind zum
Beispiel Wanzen und Heuschrecken gekennzeichnet.
Holometabolie (vollständige Entwicklung): Hier liegt zwischen dem Larven- und
dem Adultstadium ein unbewegliches Ruhestadium, das Puppenstadium. Während
der Verpuppung werden große Teile des Larvenkörpers enzymatisch aufgelöst und
nur noch wenige Imaginalscheiben (undifferenzierte Stammzellen) bleiben übrig. Aus
diesen werden dann neue Körperteile aufgebaut, sodass die Imago der Larve
morphologisch völlig unähnlich ist. Diese Art der Entwicklung weisen zum Beispiel
Schmetterlinge, Fliegen und Käfer auf.
1.3.2 Die Hormonelle Steuerung der Metamorphose und Häutung
Die Metamorphose wird sowohl bei Insekten als auch bei Amphibien hormonell gesteuert.
Im Gehirn der Tiere wird durch neurosekretorische Zellen das prothorakotrophe Hormon
(PTTH) gebildet. Über die Axone dieser Zellen wandert dieses Hormon zu paarigen
Gehirnanhangsorganen (Corpora cardiaca) und wird dort gespeichert. Von hier aus gelangt
4
Hämolymphe
das PTTH in die Hämolymphe, wo es die Prothorakaldrüse stimuliert, woraufhin diese das
Prohormon Ecdyson, ein Steroidhormon, ausschüttet (siehe Abb.2).
Dieses wird dann in den Epidermiszellen (Zielorgane) in aktives Ecdysteron (20-OHEcdyson), das Häutungshormon, umgewandelt. Diese Ecdysonausschüttung findet am
Anfang jeder Häutung statt.
Ob es sich aber um eine Larval- oder eine Imaginal-Häutung handelt, bestimmt die
Konzentration der in der Corpora allata gebildeten Juvenilhormone (JH). Befinden sich
größere Mengen JH in der Hämolymphe, so kommt es zu einer Larval-Larval-Häutung; sinkt
die JH-Konzentration jedoch unter einen bestimmten Pegel, kommt es bei den
holometabolen Insekten zu einer Larval-Puppal-Häutung, bei den hemimetabolen Insekten
zu einer Larval-Imaginal-Häutung.
Das Ausschlüpfen der Imago aus der Exuvie (alte Exocuticula) wird vom eclosion hormone
(Schlüpfhormon) induziert, indem es das motorische Verhaltensprogramm einer Häutung
auslöst. Ecdysteron hingegen fördert den Abbau der alten Endocuticula und die Synthese
einer neuen Cuticula aus Epidermiszellen.
Nachdem das Tier geschlüpft ist, wird Bursicon ausgeschüttet, das die Sklerotisierung und
Färbung der neuen, noch weichen Exocuticula stimuliert.
Abb. 1: Hormonale Regulation der Entwicklung eines holometabolen Insekts (Wehner/Gehring,
Zoologie; 1995, 23.Aufl.,Thieme Verlag)
Ca: Corpora allata; Cc: Corpora cardiaca; Im: Imago; La: Larve; Pu: Puppe; Nsz: neurosekretorische
Zellen; Pt: Prothorakaldrüse
5
Hämolymphe
1.4 Die Photometrie
Trifft Licht auf Materie, kommt es zu Wechselwirkungen, bei denen die innere Energie der
Moleküle erhöht wird. Dabei laufen verschiedene Teilvorgänge gleichzeitig ab:
• Absorption von Strahlung
• Elastische und unelastische Streuung von Strahlung
• Reflexion von Strahlung
Da es verschiedene Reaktionen zwischen Materie und Licht gibt, kann man auch
verschiedene Messverfahren anwenden.
Bei der Photometrie verwendet man den von der Probe absorbierten Teil der gesamten
Eingangsstrahlung für die Messung.
Damit der absorbierte Teil gemessen werden kann, verwendet man bei der Photometrie nur
monochromatisches Licht.
Diese Messung kann nur instrumentell vorgenommen werden. Ein Photometer hat, einfach
beschrieben, folgenden Aufbau:
Kontinuumstrahler Æ Monochromator (Prisma) Æ Probe Æ Empfänger Æ Anzeige
Von einer Lichtquelle (Kontinuumstrahler) wird ein Strahl weißes (monochromatisches) Licht
auf ein Prisma oder Gitter gelenkt. Hier wird er gebrochen und so in verschiedene
Spektralfarben zerlegt. Der Photometrie liegt das Prinzip zu Grunde, dass verschiedene
Wellenlängen auch unterschiedlich stark gebrochen werden.
Ein Gitter setzt sich aus einer großen Anzahl von schmalen, parallelen Spalten zusammen,
die sich in derselben Ebene befinden und die in der Praxis oft durch Furchen oder Spalten
ersetzt sind. Sobald nun ein Lichtstrahl auf das Gitter fällt, entstehen sog. Beugungsbilder.
Der Brechungsindex (Vorzugsrichtung des Lichts) ist abhängig von der Wellenlänge.
Die Probe absorbiert einen Teil des Lichtes, der nichtabsorbierte Teil wird von einem
Halbleiter-Photoelement aufgefangen.
Abb. 2: Photometer (alte Protokolle)
Man verwendet einen Detektor (Halbleiter-Photoelemente), um die Lichtintensität nach
Durchlaufen der Probenküvette zu bestimmen. Als Halbleiter benutzt man z.B. Substanzen
wie PbS oder CdS.
Ein Halbleiter-Photoelement setzt sich aus drei Schichten zusammen: eine semitransparente
Photokathode, eine ringförmige Elektrode und eine leitende Trägerplatte.
Durch auf die Photokathode auftreffende Lichtstrahlen werden gebundene Elektronen frei
(freie Ladungsträger). Dadurch wird zum einen die Sperrschicht leitfähig, zum anderen
6
Hämolymphe
ändert sich an bestimmten Stellen durch das Wandern der Elektronen deren Dichte und es
entstehen „Löcher“, die ebenfalls zu einem Anstieg der Leitfähigkeit führen.
So kommt es zu einer direkten Umwandlung der Strahlungsenergie in elektrische Energie
und das Ausmaß der Absorption kann gemessen werden.
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt durch das Lambert-Beersche-Gesetz: Man rechnet
die Konzentration eines gelösten Stoffes in einer Probe aus, indem man das Verhältnis der
austretenden mit der einstrahlenden Lichtintensität vergleicht:
E = log
†
I0
=e⋅c⋅ d
I
E: Extinktion (Maß der Absorption)
I0: Intensität des in eine Messlösung eintretenden Lichts
I: Intensität des aus der Messlösung austretenden Lichts
e: Stoffkonstante (Extinktionskoeffizient in [dm_])
c: Konzentration des gelösten Farbstoffes
d: Schichtdicke
Man unterscheidet zwei verschiedene Typen von Photometern, das Einstrahl- und das
Zweistrahl-Photometer.
•
•
Einstrahl-Photometer
Zuerst wird das Gerät mit einer Leerwertprobe abgeglichen. Nach diesem Abgleich
können die Absorptionsspektren der einzelnen Küvetten mit den eigentlichen Proben
diskontinuierlich gemessen werden.
Zweistrahl-Photometer
Bei diesem Gerät wird der monochromatische Messstrahl getrennt; die
Vergleichsmessung und die Messung der Absorptionsspektren der einzelnen Proben
finden gleichzeitig statt.
1.5 Chromatographie
Trennmethoden, mit denen man Substanzgemische durch Verteilung auf zwei Phasen in ihre
Komponenten zerlegen kann, bezeichnet man als Chromatographie.
Zur Trennung der Substanzgemische nutzt man Gleichgewichte aus, die zwischen beiden
Phasen entstehen können. Je nach Methode können die verschiedenen Phasen fest, flüssig
oder gasförmig sein. Die beiden Phasen dürfen auf keinen Fall miteinander mischbar sein;
man unterscheidet die stationäre Phase, die immer unbeweglich ist und die mobile Phase,
die an der stationären Phase vorbeiströmt. Die Substanzgemische, die aufgetrennt werden
sollen, befinden sich in der mobilen Phase, entweder sind sie in einem Fließmittel gelöst
oder sie befinden sich als Gase in einem Trägergas.
Aufgrund unterschiedlicher Wechselwirkungen werden die einzelnen Komponenten der
mobilen Phase an der stationären Phase mehr oder weniger stark zurückgehalten, die
Trennung der Substanzen erfolgt also auf Grund des verschiedenen Retentionsgrades der
unterschiedlichen Stoffe.
Man unterscheidet verschiedene Effekte, auf denen diese Trennung beruht: es kommt zur
Einstellung eines Gleichgewichtes durch Adsorption, Austausch und Verteilung.
7
Hämolymphe
Man kann verschiedene Arten der Chromatographie unterscheiden:
•
Gelfiltration:
Die Gelfiltration wird v.a. zur Trennung polymerer Gemische und zur Bestimmung von
Molekülmassen (vor allem bei Naturstoffen wie z.B. Proteinen) verwendet, sie eignet
sich also besonders zur Auftrennung verschieden großer Moleküle.
Als stationäre Phase wird hier eine Matrix mit Hohlräumen, die eine bestimmte
Porengröße aufweisen, verwendet, die die Moleküle unterschiedlich schnell bzw. tief
passieren. Die kleineren Moleküle dringen unterschiedlich stark in die Gelmatrix ein,
während die größeren Moleküle die Poren nicht passieren und somit nicht in das
Innere gelangen können. Im Eluat erscheinen zuerst die größeren Moleküle, d.h. die
einzelnen Komponenten werden in der Reihenfolge abnehmender Molekülgröße
nacheinander eluiert.
•
Ionenaustauschchromatographie:
Man verwendet die Ionenaustauschchromatographie v.a. zur Auftrennung von
Proteinen und nützt dabei deren amphoteren Charakter aus.
Das Grundgerüst von Ionenaustauschern trägt Festionen (fest gebundene Ionen) von
anionischem oder kationischem Charakter (z.B. COO-, SO3+). Diese bewirken zum
einen die Unlöslichkeit des Lösungsmittels, zum anderen einen positiven oder
negativen Ladungsüberschuss. Dieser Ladungsüberschuss wird durch Gegenionen,
die eine konträre Ladung zu den Festionen besitzen, kompensiert. Diese Gegenionen
sind frei beweglich und somit der austauschbare Bestandteil des Grundgerüsts. Je
nach Ladung der Gegenionen spricht man von Kationen- bzw. Anionenaustauschern.
Auf Grund dieser Anordnung kann es nun zu einem Austausch der frei beweglichen
Ionen Gegenionen mit gleichsinnig geladen Ionen der mobilen Phase kommen.
Je nach Ladung und Molekülgröße werden die Ionen in unterschiedlichem Ausmaß
ausgetauscht. Ungeladene bzw. gegensinnig geladene Moleküle werden vom
Ionenaustauscher nicht zurückgehalten.
Dieses für den Ionenaustauscher charakteristische Prinzip der reversiblen Adsorption
ermöglicht auch eine Trennung verschieden stark geladener Moleküle (z.B. Proteine
und Nukleinsäuren).
Durch Anlegen eines Salzgradienten im Laufmittel können die ausgetauschten
Moleküle später wieder verdrängt werden, da die Bindungen reversibel sind. Die
Moleküle werden je nach Affinität zu den Festionen nacheinander verdrängt.
Außerdem können die Moleküle auch durch pH-Wert-Veränderungen wieder abgelöst
werden, da diese die Bindungseigenschaften beeinflussen.
•
Affinitätschromatographie:
Bei diesem Verfahren nutzt man spezifische Wechselwirkungen zwischen affinen
Reaktionspartnern, die miteinander Komplexe bilden können. Gebildet werden solche
Komplexe z.B. zwischen Enzymen und deren spezifischen Inhibitoren oder zwischen
Antikörpern und Antigenen.
Wird ein Reaktionspartner (Effektor) an einen Träger gebunden, entsteht ein sog.
Affinitätsharz, das zur stationären Phase wird. Es kommt zur Komplexbildung, wenn
die mobile Phase mit dem affinen Reaktionspartner des Effektors an der stationären
Phase vorbeifließt. Das heißt, die in der mobilen Phase enthaltene Komponente
lagert sich an, die Begleitsubstanzen der mobilen Phase können ohne
Wechselwirkungen mit dem Affinitätsharz ungehindert an diesem vorbeifließen.
Der affine Reaktionspartner kann im Anschluss durch Zerstörung des Komplexes
eluiert und isoliert werden.
8
Hämolymphe
•
Reversed-Phase-Chromatography:
Unter der Reversed-Phase-Chromatography versteht man einen Spezialfall der
Adsorptionschromatographie.
Bei diesem Verfahren können Substanzen getrennt werden, die in lipophilen
Systemen gut löslich sind, z.B. Peptide.
Stark polare Trägermaterialien (z.B. Kieselgel, Papier, Cellulose) werden durch
Veretherung ihrer funktionellen Gruppen weitgehend unpolar gemacht, da die polaren
Gruppen den Ablauf der Chromatographie stören und die Bindung von lipophilen
Stoffen verhindern würden. Durch Veretherung der funktionellen Gruppen werden
lipophile Wechselwirkungen möglich. Auf diese Weise wird –nach dem Nernst´schen
Verteilungsgesetz- das mobile Substanzengemisch zwischen den beiden Phasen
(gegenüber dem polaren Trägermaterial) in umgekehrter Folge getrennt.
Durch hydrophobe Wechselwirkungen werden so lipophile Substanzen gebunden,
während hydrophile Substanzen ungehindert an der stationären Phase vorbeifließen
können.
Die lipophilen Stoffe können später mit Hilfe eines unpolaren Lösungsmittels wieder
entfernt werden.
Nernst´sches Verteilungsgesetz:
K=
c A (Oberphase)
c A (Unterphase)
K= Verteilungskoeffizient
cA= Konzentration des Stoffes A (in mol/l oder g/l)
•
Hochleisungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC):
Unter der HPLC versteht man ein Verfahren mit sehr hoher Trennschärfe; es stellt
eine Verbesserung der Gelfiltration dar und wird zur schnellen Trennung von leicht
flüchtigen Substanzen verwendet.
Als mobile Phase wird hier eine Flüssigkeit verwendet, in der das Gemisch, das
getrennt werden soll, gelöst ist. Man benutzt ein besonders feinkörniges
Trägermaterial, um eine möglichst große Adsorption zu erreichen. Durch die
Feinkörnigkeit des Trägermaterials kommt es zu einem erhöhten
Strömungswiderstand, der aber durch die Erhöhung der Fließgeschwindigkeit
(erhöhter Eingangsdruck) kompensiert wird.
Abb. 3: Aufbau des HPLC (alte Protokolle)
9
Hämolymphe
2. Praktische Durchführung
2.1 Aufgabenstellung des Versuchs
Der von uns durchgeführte Versuch ist ein Teil des Forschungsprojektes „Mechanismus der
Sekretion, lokale Veränderungen des Cuticulastoffwechsels und dessen hormonelle
Steuerung“, der die Schwerpunkte Proteinstoffwechsel, Chitinstoffwechsel und
Sklerotisierung aufweist.
Thema unseres Versuchs ist die fraßhemmende Wirkung von Insektenhämolymphe, in die
zur Abwehr von Fraßfeinden toxische Stoffe eingelagert werden können. Ein Beispiel für
diese Taktik der Einlagerung von toxischen Stoffen ist die Larve der Blattwespe Athalia
rosae.
Der Fraßschutz der Larve kann zwei verschiedene Ursachen haben: zum einen kann sie das
Hormon 20-OH-Ecdyson selbst synthetisieren, zum anderen kann sie aus sekundären
Pflanzenstoffen, die sie mit ihrer Futterpflanze Senf (Sinapis sp.) aufnimmt, das Glucosinolat
Sinalbin synthetisieren. Beide Stoffe sind in der Hämolymphe nachweisbar.
Im Carcinus Maenas Assey (Carcinus Maenas Biotest) werden abwechselnd Senfextrakte
und Hämolymphe von Athalia rosae Larven getestet. Von diesen werden mit Hilfe der HPLC
die Sinalbingehalte ermittelt. Das Sinalbin muss mit dem Enzym Sulfatase behandelt
werden, da es sich mit dem vorhandenen HPLC-System nicht direkt nachweisen lässt. Die
Sulfatgruppe wird durch die Sulfatase vom Sinalbinmolekül abgespalten, es wird zum
desulfo-Sinalbin, das aufgrund veränderter Laufeigenschaft auf der HPLC nun nachgewiesen
werden kann.
Abb. 4: Strukturformel von Sinalbin (alte Protokolle)
2.1 Material und Methoden
Der Versuch umfasst 5 verschiedene Schritte:
•
•
•
Herstellung von Extrakten aus den Futterpflanzen Sinapis alba (Senf) und
Brassica pekinensis (Chinakohl), die bereits durch den Assistenten vorbereitet sind;
Das Assistent zerreibt eine definierte Masse Blätter der Futtermasse mit feinem
Seesand in einer Reibschale und gibt dies anschließend in 70%iges Methanol. Das
Extrakt wird filtriert und das Filtrat wird weiterverarbeitet: 1min Vortex, 1min
Ultraschall, 10min Zentrifugieren (so entstehen die Futterpellets).
Herstellung von Extrakten aus der Hämolymphe von Athalia rosae, die ebenfalls
vom
Assistenten
vorbereitet
sind;
Die Cuticula der Larven wird mit einer feinen Nadel durchstochen. Auf diese Weise
wird den Larven die Hämolymphe entnommen. Das Volumen der autretenden
Hämolymphe wird in eine Eppendorftube mit 200ml 70%igem Methanol überführt und
weiterverarbeitet: 1min Vortex, 1min Ultraschall, 10min Zentrifugieren (so entstehen
die Futterpellets).
Trennung der Extrakte mit HPLC:
Die Probenschleife (loop) der HPLC fasst 200ml. Man trägt ca. 250ml auf, der
Überschuß wird in ein Überlaufgefäß geleitet. Nach dem Lauf wird das
10
Hämolymphe
Sinalbinpeakpaar integriert (Peakfläche). Man bezieht sich auf die aufgetragenen
200ml um die Fläche zu berechnen.
Nach Sulfatasebehnadlung beträgt das Gesamtvolumen des Hämolymphextraktes
ca. 2000ml (die Hämolymphprobe wurde aus 50ml = 50mg FG hergestellt). 10
Flächeneinheiten entsprechen ca. 30nmol Sinalbinäquivalenten.
Aus diesen Angaben soll errechnet werden, wie hoch der Sinalbingehalt in der
Hämolymphe in Bezug auf 1g Frischgewicht (FG) ist (Angabe in mmol/g FG).
Die HPLC-Trennung findet unter folgenden Laufbedingungen statt:
o Stationäre Phase: RP-18 Absorptionssäule
o Mobile Phase: H2O-Methanol
0-45 min: 100% H2O
46-50 min: 40% H2O, 60%Methanol
51-60 min. 100% Methanol
61-70 min: 100% H2O
Während der ersten 45min erfolgt die Auftrennung, in der Zeit von 46-60min die
Reinigung der Säule, damit sie danach wieder auf die Ausgangsbedingungen
k a l i b r i e r t
w e r d e n
k a n n .
•
Nachweis der Substanz mit Hilfe eines UV-Spektrums:
Das Spektrum des Hämolymphextraktes wird mit Hilfe eines Spektralphotometers in
einem Bereich von 200-400nm erstellt. Die Hämolymhprobe liegt als wässrige Probe
vor, und wurde zuvor mit Sulfatase behandelt. Der Nullabgleich des Photometers
erfolgt mit H2O als Leerwertprobe.
Das Spektrum des Hämolymphextraktes soll mit Spektren von 20-Hydroxyecdyson
und desulfo-Sinalbin verglichen werden.
•
Biologischer Test:
Fraßhemmung bei der Strandkrabbe Carcinus maenas
Abb. 5: Cacinus Maenas (alte Protokolle)
Bei diesem Test soll die minimale Hemmkonzentration ausgetestet werden und
soweit möglich quantifiziert werden (mmol/ml Futterpelletvolumen).
Zur Herstellung der Futterpellets werden die eingetrockneten Proben in jeweils 10ml
destilliertem H2O gelöst, daraufhin kurz anzentrifugiert und mit 20ml MUPU
(Muschelpulver)-Gelatine versetzt: Aus jedem Ansatz stellt man nun ein großes
Futterpellet her, das nach dem Festwerden in vier Teile zerschnitten, und an Carcinus
maenas getestet wird. Futterpellets, die nur aus MUPU-Gelatine bestehen, dienen als
Negativkontrolle. Als Positivkontrolle verwendet man 20-Hydroxy-Ecdyson (20E-OH)
in unterschiedlichen Verdünnungen. Diese sind bereits vorbereitet und liegen als
getrocknete Proben vor.
Die Stoffmengen in den jeweiligen Verdünnungen betragen gerundet:
20E CO = 21.600nmol
20E C1 = 10.800nmol
11
Hämolymphe
20E C2 = 5.400 nmol
20E C3 = 2.700 nmol
20E C4 = 1.350 nmol
Abb. 6: Futterpellets (alte Protokolle)
3. Ergebnisse
3.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolymphe
und Vergleich mit desulfo-Sinalbin
Beim Spektrum von Wasser (H2O bidest) fällt auf (siehe Abb.1 im Anhang), dass im
Wellenlängenbereich von ca. 215-250 nm große Messfehler auftreten, die vom Gerät
verursacht werden. Diese dürfen im Folgenden nicht weiter berücksichtigt werden.
Das Spektrum der Athalia-Hämolymphe (desulfo) weist ein Absorptionsmaximum in
einem Wellenlängenbereich von ca. 260-297nm auf (siehe Abb.2 im Anhang), wobei
die Kurve dann langsam abnimmt, in diesen Wellenlängenbereichen (297-400nm)
wird also auch noch Licht absorbiert.
Das Spektrum vom desulfo-Sinalbin hat einen Peak bei ca. 265 nm und bereits ab
ca.280 nm wird nur noch wenig absorbiert (siehe Abb.3 im Anhang).
3.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließender
photometrischer Nachweis von Sinalbin
Die Abb.4 im Anhang zeigt die von uns erstellte photometrische Kurve des Sinalbins
nach Trennung des Hämolymphextrakts durch HPLC. Leider zeigt diese keinen
charakteristischen Peak im Bereich von ca. 14-16 Minuten und ist daher für eine
Auswertung ungeeignet.
Aus diesem Grund verwenden wir die Kurve des Kurses vom 29.06.99 (siehe
Anhang Abb.5). Hierbei handelt es sich allerdings um den photometrischen Nachweis
von Sinalbin in Senfextrakt und nicht in Hämolymphe. Diese Kurve weißt nach einer
ungefähren Laufzeit von 14-17 Minuten einen Peak mit einem Maximum von ca. 0,48
mV auf. Der Peak sinkt bei 15,5 Minuten um ca.0,3 mV und steigt dann bei 16
Minuten wieder um ca. 0,05 mV an.
12
Hämolymphe
Vor und nach dem Peak beträgt die Spannung ungefähr 0 mV.
Mit Hilfe der Peakfläche lässt sich der Sinalbingehalt in 1g Frischgewicht Senf
bestimmen:
o 1. 10 Peakflächeneinheiten entsprechen 30 nmol Sinalbin
unser Peak hat 36,28971 FE, dies entspricht 108,86913 nmol Sinalbin.
o 2. Eine Probenschleife (Loop) der HPLC fasst exakt 200ml Senfextrakt
welches in unserem Fall 108,86913 nmol Sinalbin enthält.
Das Gesamtextrakt beträgt 5300 ml und enthält 2650 nmol Sinalbin.
o 3. Umrechnung des Sinalbingehalts in die Einheit mmol/g:
100 mg Senf enthalten 2650 nmol Sinalbin, das heißt in 1mg Senf sind
26,5 nmol Sinalbin enthalten.
2650nmol 26,50nmol 26,50 ⋅ 10 -3 mmol
mmol
=
=
= 26,50
-3
100mg
1mg
g
10 g
Ergebnis: in 1g Senf (FG) sind 26,50 mmol Sinalbin enthalten.
3.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung von
Carcinus maenas
Zu Beginn des Biotests wurde die Strandkrabbe mit MUPU-Gelatine-Pellets gefüttert,
um zu überprüfen, ob sie überhaupt frisst. Dies wurde auch zwischen den anderen
Fütterungen immer wieder überprüft. Die Krabbe hat alle unbehandelten MUPUPellets gefressen und somit war die Richtigkeit des Versuchs gewährleistet.
Tab. 1: Fraßhemmung bei 20-OH-Ecdyson
Verdünnungsgrad [nmol]
C0 (21,60)
Stoffmengenkonzentration [mmol/ml] 0,00072
Reaktion der Krabbe
C1 (10,80)
0,00036
C2 (5,40)
0,00018
+
C3 (2,70)
0,00009
+
C4 (1,350)
0,000045
-
+ : positive Reaktion (Futterpellet wurde nicht gefressen)
- : negative Reaktion (Futterpellet wurde gefressen)
Die Krabbe zeigte bei der C4-Probe keine Fraßhemmung. Doch bereits ab der C3Probe wurden die Futterpellets nach einer kurzen Geschmacksprobe wieder
ausgespuckt. Das heißt, die Grenzkonzentration für die Fraßhemmung liegt bei einer
Ecdysonkonzentration von 0,00009 mmol/ml.
13
Hämolymphe
Tab. 2: Fraßhemmung bei Senfrohextrakt
Verdünnungsgrad [mg]
Stoffmengenkonzentration [mmol/ml]
Reaktion der Krabbe
C0 (100)
0,088
C1 (50)
0,044
+
C2 (10)
0,0088
-
C3 (5)
0,0044
-
+ : positive Reaktion (Futterpellet wurde nicht gefressen)
- : negative Reaktion (Futterpellet wurde gefressen)
Hier erfolgte die Fraßhemmung ab Futterpellet C1, die Proben C3 und C2 wurden
gefressen. Die Grenzkonzentration für die Fraßhemmung beim Senfrohextrakt liegt
bei einer Sinalbinkonzentration von 0,044 mmol/ml.
4. Diskussion
4.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolymphe
und Vergleich mit desulfo-Sinalbin
Der Kurvenverlauf von Hämolymphe desulfo und desulfo-Sinalbin ist nicht identisch;
das Sinalbin weißt einen Peak bei ca. 265 nm auf, während das Absorptiosmaximum
bei Hämolymphe-desulfo bei ca. 278 liegt. Man kann anhand der photometrischen
Kurven also keinen sicheren Rückschluß darauf ziehen, dass in der Hämolymphe
Sinalbin enthalten ist.
Der Unterschied in den Kurven ergibt sich dadurch, dass das Sinalbin in der
Hämolymphe in einer anderen Form vorliegt, da es mit anderen in der Hämolymphe
enthaltenen Stoffen reagiert hat. Verschidene Sinalbinvarianten lkann man zum
Beispiel durch die Substitution der OH-Gruppen unterscheiden. Auch gibt es vom
Sinalbin mehrere Arten, die alle in unterschiedlicher Konzentration in verschiedenen
Senfpflanzen vorkommen können. Außerdem ist die Art und die Menge des Sinalbins
je nach Senfpflanze, deren Standort und der Jahreszeit der Ernte unterschiedlich.
Auch entspricht die Pflanze die die Larve fraß nicht der, aus der das Sinalbinextrakt
gewonnen wurde.
4.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließender
photometrischer Nachweis von Sinalbin
Der steile Anstieg der Kurve sowohl in unserem Chromatogramm (Anhang Abb.4),
als auch im Chromatogramm der anderen Gruppe (Anhang Abb.5), das wir zur
Konzentrationsberechnung verwendet haben, lässt sich durch Ionen erklären, die ihr
Absorptionsmaximum in einem Bereich von 400-200 nm haben. Für unseren Versuch
ist dies vernachlässigbar, da das Sinalbin aufgrund seiner Molekülgröße erst nach
ca. 14 Minuten einen Peak aufweist.
14
Hämolymphe
Unser Chromatogram ist zur Konzentrationsberechnung unbrauchbar, da es keinen
Peak bei 14 Minuten aufweist. Ein Grund dafür sind mit großer Wahrscheinlichkeit
die Druckschwankungen in der HPLC-Säule, die durch Luftblasen im System
entstanden sind.
Unser Ergebnis kann demnach also nicht zur Berechnung der Sinalbinkonzentration
verwendet werden. Aufgrund dessen verwendeten wir die fast ideale Kurve einer
anderen Gruppe, bei der man den charakteristischen „zweigipfeligen“ Peak nach 14
Minuten gut erkennen kann.
4.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung von
Carcinus maenas
Bei diesem Versuch hängen die Ergebnisse vom Fressverhalten und der Tagesform
des Versuchstiers ab. Außerdem werden meistens andere Krabben für den Biotest
verwendet. Das heißt, dass die Ergebnisse an den verschiedenen Kurstagen stark
voneinander abweichen können.
Um repräsentative Ergebnisse ermitteln zu können, müsste man das Fressverhalten
über längere Zeit beobachten. Eine Möglichkeit dafür wäre zum Beispiel die Bildung
des Mittelwerts aller während des Semesters erhaltenen Grenzkonzentrationen.
Die Fraßhemmung tritt bei Ecdyson bereits bei einer Konzentration von 0,00009
mmol/ml auf, bei Senfrohextrakt liegt die Grenzkonzentation bei 0,044 mmol/ml. Die
Krabbe reagiert also auf 20-OH-Ecdyson wesentlich empfindlicher, als auf Sinalbin.
Für einen genauen Beweis sind jedoch genauere Daten nötig, auch hier müsste man
die gesamten Werte aller Kurstage heranziehen.
5. Zusammenfassung
In unseren Versuchen haben wir versucht, durch eine HPLC den Hämolymphextrakt
einer Athalia rosae-Larve in seine Bestandteile aufzutrennen. Anschließend sollte
durch photometrische Methoden das Absorptionsspektrum des Hämolymphextraktes
bestimmt werden.
Außerdem haben wir das Absorptionsspektrum von Hämolymphe-desulfo mit dem
von desulfo-Sinalbin verglichen.
Im darauffolgendem Biotest wurden die Grenzkonzentrationen von Senfrohextrakt
und 20-OH-Ecdyson ermittelt, ab denen bei Carcinus maenas eine Fraßhemmung
einsetzt.
15
Hämolymphe
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Hormonale Regulation der Entwicklung eines holometabolen Insekts ............. 5
Abb. 2: Photometer ................................................................................................................. 6
Abb. 3: Aufbau des HPLC ...................................................................................................... 9
Abb. 4: Strukturformel von Sinalbin .................................................................................... 10
Abb. 5: Cacinus Maenas ...................................................................................................... 11
Abb. 6: Futterpellets .............................................................................................................. 12
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Fraßhemmung bei 20-OH-Ecdyson ...................................................................... 13
Tab. 2: Fraßhemmung bei Senfrohextrakt......................................................................... 14
Literatuverzeichnis
-
Wehner/Gehring, Zoologie; 23.Auflage 1995, Thieme Verlag
Campbell, Biologie; 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Akademischer
Verlag
Schmidt/Thews, Physiologie des Menschen; 26.Auflage 1993, Springer Verlag
Klinke/Silbernagl, Lehrbuch der Physiologie; 2.Auflage 2000, Thieme Verlag
Scherf, Wörterbuch Biologie; 1997, dtv
Vogel/Angermann, Taschenatlas der Biologie, Band 2; 1990, Thieme Verlag
16