Mitochondrien und oxidativer Stress in nozizeptiven Prozessen

5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Ziel der hier präsentierten Arbeit war es, Erkenntnisse über die Bedeutung von reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) in Interaktion mit Mitochondrien in der Pathophysiologie des
peripheren Nervensystems (PNS) zu gewinnen. Als methodischer Ansatzpunkt wurde die
Photodynamische Therapie von Hauttumoren gewählt. Diese moderne Therapieform beruht
auf der gezielten Induktion von ROS in erkrankten epidermalen Zellen durch die Kombination
eines photoaktivierbaren Moleküls (Photosensitizer) und Licht einer geeigneten Wellenlänge,
mit dem Ziel erkrankte epidermale Zellen abzutöten. Die hier im Speziellen untersuchte
Variante der PDT nutzt als Photosensitizer das Protoporphyrin IX (PpIX), welches von den
behandelten Zellen aus δ-Aminolevulinsäure (5-ALA) oder deren Methylester (MAL)
intramitochondrial synthetisiert wird. Diese Therapie stellt ein Bindeglied zwischen
oxidativem Stress und der Aktivierung von Schmerz-sensitiven Nervenzellen dar, da die
Erzeugung von ROS ihr zentraler Mechanismus ist und sie in ihrer klinischen Anwendung
häufig von Schmerzen begleitet wird. Die für diese Nebenwirkung verantwortlichen zellulären
und molekularen Mechanismen sind bisher noch nicht experimentell untersucht worden
Um den Fragestellungen zu begegnen, wie mitochondrial erzeugte ROS in sensorischen
Neuronen wirken, und wie dies im Fall der PDT zu Schmerzen führt, wurde sowohl eine
direkte Aktivierung sensorischer Neurone aus dem Hinterwurzelganglion (DRG) der Ratte als
auch die Interaktion solcher Neurone mit Keratinozyten in Betracht gezogen.
Im ersten Schritt wurden die direkten Konsequenzen der ROS-Entstehung in kultivieren
peripheren Neuronen nach Behandlung mit 5-ALA und MAL untersucht.
Dabei konnte herausgearbeitet werden, dass 5-ALA und MAL in diese Zellen aufgenommen
werden und die Synthese des Photosensitizers PpIX in Neuronen induziert wird. Mit
pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden wurden MembrantransportMoleküle identifiziert, die für den Aufnahmeschritt von 5-ALA und MAL in sensorische
Neurone verantwortlich sind. Den Transportern für den Neurotransmitter γ-Aminobuttersäure
(GABA), insbesondere dem GABA-Transporter 3 (GAT-3), ist hierbei eine zentrale Rolle
zuzuschreiben. Ein Unterschied zwischen der Aufnahme von 5-ALA und MAL wurde nicht
gefunden. Ein solcher hätte einen Unterschied in der Schmerzintensität während der PDT
mit diesen beiden PpIX-Vorläufern möglich gemacht.
Weiterhin wurde gezeigt, dass die Erzeugung von oxidativem Stress durch die PDT in
kultivierten sensorischen Neuronen in vitro möglich ist. Hierzu wurden Neurone, die PpIX aus
5-ALA synthetisiert hatten, mit einer entsprechenden Lichtquelle bestrahlt. An diesen
Zellkulturen wurden zunächst Parameter der mitochondrialen Funktion nach der PDT
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analysiert. Dabei konnte eine sehr starke Korrelation zwischen der Stärke der induzierten
ROS,
definiert
über
die
PDT-Dosis,
sowie
einer
strukturellen
wie
funktionellen
mitochondrialen Dysfunktion gefunden werden. Je nach eingesetzter PDT-Dosis konnte der
Grad an oxidativem Stress variiert werden. Dies führte zu einer transienten Störung der
mitochondrialen Funktion unter geringen Stressbedingungen, zu Apoptose bei moderatem
und zu Nekrose bei maximalem oxidativem Stress. Zudem korrelierte die Degeneration
neuronaler Fortsätze signifikant mit der Stärke der erzeugten ROS. Es ist folglich gelungen
ein neues in vitro Testsystem zu generieren, in dem oxidativer Stress auf regulierte Weise
erzeugt werden kann. Ein solches System eignet sich einerseits, um Antioxidantien und
neuroprotektive Pharmaka zu untersuchen, andererseits wurde hiermit der Einfluss der
Photodynamischen Therapie mit PpIX auf sensorische Neurone erstmals detailliert in vitro
charakterisiert.
In funktionellen Analysen zur neuronalen Aktivität konnte gezeigt werden, dass die in vitro
PDT einen Anstieg des zytosolischen Kalziums in sensorischen Neuronen bewirkt. Dieser
Anstieg ist maßgeblich von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen (VGCCs) abhängig,
allerdings konnte auch eine vorgeschaltete Beteiligung von Natriumkanälen gezeigt werden.
Intrazelluläre Kalziumspeicher wie die Mitochondrien oder das Endoplasmatische Retikulum
sind hieran nur geringfügig beteiligt. Diese Ergebnisse weisen auf die direkte Aktivierung
freier Nervenendigungen in der Haut als wichtigen Mechanismus der Schmerzentstehung
nach der PDT hin, und zeigen zudem, dass den ROS im peripheren Nervensystem eine
wichtige Rolle in der Erregung von Nervenfasern zukommt.
Werden
epidermale
Keratinozyten
mit
der
PDT
behandelt,
sekretieren
sie
Adenosintriphosphat (ATP), welches als pro-nozizeptiver Botenstoff im PNS bekannt ist. Da
die ATP–Freisetzung bereits ohne erkennbare Zellschädigungen auftrat, liegt offenbar ein
aktiver Prozess zugrunde. Dies könnte einen weiteren Anhaltspunkt für die Entstehung der
Schmerzreaktion bei der PDT darstellen. Die Menge des von Keratinozyten bei der PDT
abgegebenen ATPs sollte zur Aktivierung der Neuronen ausreichen. Somit scheint eine
ROS-induzierte Kommunikation von Keratinozyten und Nervenfasern in der Haut
vorzuliegen. Darüber hinaus spricht diese Erkenntnis dafür, dass oxidativer Stress von den
Zellen des sensorischen Systems, zu denen inzwischen auch die Keratinozyten gezählt
werden sollten, wahrgenommen werden kann.
Es konnten somit im Rahmen dieser Arbeit zwei Wege gefunden werden, über die reaktive
Sauerstoffspezies auf die sensorische Schnittstelle aus Keratinozyten und intraepidermalen,
nozizeptiven Nervenfasern des PNS wirken. Beide Wege liefern nicht nur Anhaltspunkte zum
Verständnis der Schmerzentstehung während der PDT, sondern weisen auch auf die Rolle
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5. Zusammenfassung
der ROS als Aktivatoren des peripheren Nervensystems hin. Zusammenfassend betrachtet
lässt dies oxidativen Stress in der Epidermis als eine Modalität erscheinen, die von den
sensorischen Strukturen der Haut erfasst und kommuniziert werden kann. Dies bekommt
besondere Relevanz, wenn man berücksichtigt, dass 5-ALA und PpIX in jeder Zelle in
kleinen Mengen vorkommen. Daher liegen die bei der PDT ablaufenden Prozesse in
geringer Menge in jeder Zelle vor und bei starker Lichtbelastung der Haut kann der PDTSchmerz schützende Funktion haben.
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