Appendices
Werbung
University of Groningen Dengue and Chikungunya virus van Duijl-Richter, Mareike IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): van Duijl-Richter, M. (2016). Dengue and Chikungunya virus: Cell entry mechanisms and the impact of antibodies on infectivity [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 03-06-2017 Appendices Nederlandse Samenvatting Deutsche Zusammenfassung Contributing Authors Curriculum Vitae Dankwoord Appendices A 224 Appendices Nederlandse Samenvatting Dengue- en chikungunyavirus: Hoe het virus de cel binnendringt en de invloed van antistoffen op virusinfectie Steeds meer mensen worden besmet met het denguevirus (DENV) en het chikungunyavirus (CHIKV). Besmetting vindt voornamelijk plaats in de subtropische en tropische gebieden van de wereld. Zowel DENV als CHIKV worden overgedragen op mensen door muggenbeten. Belangrijke muggen zijn de Aedes aegypti (denguemug) en de Aedes albopictus (Aziatische tijgermug). Een DENVinfectie leidt veelal tot knokkelkoorts en een CHIKV-infectie tot chikungunyakoorts. De symptomen van de ziektes komen overeen en patiënten hebben vaak koorts, gewrichtspijn, hoofdpijn en huiduitslag. Voor DENV noch CHIKV is een specifiek geneesmiddel of vaccin beschikbaar. De behandeling is derhalve gebaseerd op het bestrijden van de symptomen. Voor het ontwikkelen van vaccins en geneesmiddelen is het belangrijk het samenspel van het virus en de gastheer tijdens de vermeerdering van het virus beter te begrijpen. Zowel DENV als CHIKV bevatten één RNA molecuul dat samengepakt wordt door capside-eiwitten. Dit wordt ook wel het nucleocapside genoemd. Het nucleocapside wordt omgeven door een laag van lipiden (membraan). In deze membraan bevinden zich de virale spike-eiwitten, eiwitten die belangrijk zijn voor het binnendringen in de cel. Beide virussen worden door de gastheercel opgenomen door middel van receptor-gemedieerde endocytose. Na opname in de cel wordt het virusdeeltje naar zure blaasjes (endosomen) getransporteerd. Door de zure omgeving vinden er veranderingen plaats in de virale spike-eiwitten waardoor het virale membraan samensmelt met het endosomale membraan. Dit proces wordt membraanfusie genoemd. Nadat fusie heeft plaatsgevonden komt het virale RNA genoom in de gastheercel terecht waarna de synthese van nieuwe virusdeeltjes begint. In dit proefschrift hebben wij de mechanismen onderzocht die een rol spelen bij het binnendringen van het virus in de cel. Bovendien hebben wij bestudeerd hoe antistoffen gericht tegen het virus de infectiviteit van het virus kunnen beïnvloeden. DENV structuur en infectiviteit – de invloed van het receptormolecuul DC-SIGN en antistoffen DENV is met een geschatte 390 miljoen infecties per jaar de meest voorkomende door muggen overgedragen virale ziekte in de wereld. Infectie leidt in ongeveer 100 miljoen van de gevallen tot ziektesymptomen. Er zijn vier serotypen van DENV (DENV-1 tot en met 4), en elk serotype kan ziekteverschijnselen A 225 Appendices veroorzaken. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) heeft de ziekte die door DENV wordt veroorzaakt geclassificeerd in drie categorieën; “dengue zonder waarschuwingssignalen”, “dengue met waarschuwingssignalen” en “ernstige dengue”. In het merendeel van de gevallen is dengue mild met symptomen zoals koorts, huiduitslag, spier- en gewrichtspijn en misselijkheid. Dit wordt in Nederland vaak knokkelkoorts genoemd. Bijkomende symptomen (waarschuwingssignalen) kunnen overgeven, lethargie, bloedingen, buikpijn, leververgroting en een afwijkend bloedbeeld zijn. Ernstige dengue is gekenmerkt door plasmalekkage, bloedingen en verslechtering van de orgaanfuncties. Als ernstige dengue niet adequaat wordt behandeld kunnen patiënten het dengue-shocksyndroom ontwikkelen, hetgeen een fataal beloop kan hebben. Elk jaar worden ongeveer een half miljoen patiënten met dengue in het ziekenhuis opgenomen en ongeveer 25.000 patiënten overlijden aan de gevolgen van dengue. Als individuen herstellen van dengue zijn ze door de verworven adaptieve immuniteit levenslang beschermd tegen herinfectie met hetzelfde serotype. Echter, ernstige dengue wordt bijna uitsluitend vastgesteld in patiënten die een tweede infectie doormaken met een ander serotype (secondaire heterologe herinfectie); en in zuigelingen waarvan de moeder ten tijde van de geboorte antistoffen tegen DENV had. Deze observaties hebben geleid tot de theorie “antibody-dependent enhancement of disease” (ADE). Hierin wordt aangenomen dat reeds aanwezige, kruis-reactieve antistoffen de virusdeeltjes niet neutraliseren maar versterken. Antistof-gebonden virusdeeltjes zullen worden gestuurd naar Fc-receptor bevattende cellen, cellen die in staat zijn het virus te vermeerderen. Virusopname vindt plaats door binding van het antistof aan de Fc-receptor. In geval van een secondaire heterologe herinfectie worden bovendien memory B- en T-lymfocyten geactiveerd, met als resultaat nog meer kruisreactieve antistoffen en weinig effectieve T lymfocyten. Samen leiden ADE en het inefficiënt opruimen van geïnfecteerde cellen tot grote aantallen geïnfecteerde cellen en virusdeeltjes in het bloed. Hierdoor worden veel ontstekingsstimulerende moleculen (cytokines) geproduceerd, met als uiteindelijk mogelijk gevolg plasmalekkage en bloedingen. In de afgelopen jaren hebben wij de invloed van het virale prM eiwit op DENV infectie en ziekte onderzocht. prM is één van de twee virale spikeeiwitten die in het membraan van het virusdeeltje zijn verankerd. Het andere membraaneiwit, genaamd E, wordt door prM beschermd en gestabiliseerd tijdens de vorming van nieuwe virusdeeltjes. Het E eiwit is het virale fusie-eiwit, dat wil zeggen dat dit eiwit het samensmelten van de virale membraan met het endosomale membraan bewerkstelligt. Echter, om te voorkomen dat deze reactie al tijdens de vorming van nieuwe virusdeeltjes plaatsvindt, worden nieuwe virusdeeltjes in een immature (onrijpe) vorm geproduceerd waarbij het pr gedeelte van prM het E eiwit afschermt. Tijdens het transport naar de buitenkant van de cel passeert het virusdeeltje verschillende compartimenten van de cel waarvan de omgeving steeds A 226 Appendices iets zuurder wordt. Door deze zure omgeving verandert de vorm van het prM eiwit, waardoor het prM eiwit door de cellulaire protease furine in een pr-peptide en het M-eiwit wordt geknipt. Nadat het virusdeeltje de cel heeft verlaten en dus in een neutrale (niet meer zure) omgeving terechtkomt, laat het pr-peptide los en kan het virusdeeltje nieuwe cellen infecteren. Dit maturatieproces is echter niet erg efficiënt: viruspreparaten geproduceerd in muggencellen bestaan uit een mengsel van volledig mature, gedeeltelijk immature (ten minste 40%) en volledig immature (ten minste 3%) deeltjes. In hoofdstuk 2 van dit proefschrift wordt een overzicht gegeven van de structuur, levenscyclus en pathogenese van DENV. Zoals hierboven beschreven scheiden geïnfecteerde cellen virusdeeltjes met een variabele hoeveelheid prM in het membraan uit. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat volledig immature DENV deeltjes nauwelijks infectieus zijn op verschillende types gastheercellen. De algemene toepasbaarheid van deze vinding werd echter in kwestie gesteld toen werd aangetoond dat het receptormolecuul DC-SIGN – dat ook tot expressie wordt gebracht in de natuurlijke gastheercellen van DENV – de infectiviteit van matuur en immatuur West Nijl virus versterkt. Het West Nijl virus is sterk verwant met DENV. Om deze reden hebben wij in hoofdstuk 3 de infectiviteit van verschillende DENV serotypen en maturatiestatussen op cellen met of zonder het receptormolecuul DC-SIGN onderzocht. Als eerste laten wij zien dat naast immature deeltjes van DENV-2 ook de immatuur virus van andere DENV serotypen niet in staat zijn macrofagen en endotheel cellen te infecteren. Immature dendritische cellen, cellen die veel DC-SIGN tot expressie brengen, kunnen echter wél met immatuur DENV van verschillende serotypes worden geïnfecteerd, zij het met een lagere efficiëntie dan infectie door mature en gedeeltelijk mature deeltjes. Onze resultaten tonen aan dat deze infectie inderdaad afhankelijk is van DC-SIGN expressie en dat furine activiteit noodzakelijk is voor infectie. Dit wijst erop dat prM wordt geknipt tot het pr-peptide en het M eiwit nadat het is opgenomen door de gastheercel. Het is bekend dat antistof-gebonden immature DENV deeltjes Fc-receptor bevattende cellen kunnen infecteren. De gedachte is dat immature deeltjes bijdragen aan de toegenomen hoeveelheid geïnfecteerde cellen tijdens een heterologe secondaire infectie. Immature dendritische cellen brengen zowel DC-SIGN als Fc-receptoren tot expressie. Wij hebben onderzocht of het serum (waarin zich antistoffen bevinden) van een DENV-immune patiënt de infectiviteit van verschillende DENV serotypes kan versterken. Wij tonen in dit proefschrift aan dat in immature dendritische cellen de infectiviteit van immature virusdeeltjes van verschillende serotypes echter niet versterkt wordt door humaan serum met antistoffen tegen DENV-2. In macrofaagachtige cellen zagen wij daarentegen dat de infectiviteit van immature virusdeeltjes in sterke mate toenam als deze waren geïncubeerd met hetzelfde serum. De bevindingen van hoofdstuk 3 laten zien dat immatuur DENV immature dendritische cellen via interactie met DC-SIGN kan infecteren. Dit kan een aanwijzing A 227 Appendices zijn dat ook immature en gedeeltelijk immature deeltjes kunnen bijdragen aan de primaire infectie, zij het in mindere mate vergeleken met matuur virus. De infectiviteit van immature deeltjes in immature dendritische cellen wordt verder niet versterkt door antistoffen. Infectie van immature dendritische cellen is kennelijk al zo efficiënt dat het niet verder kan worden versterkt door antistoffen. Hieruit concluderen we dat tijdens een secondaire infectie vooral macrofagen en monocyten bijdragen aan de hogere hoeveelheid virusdeeltjes die worden geproduceerd tijdens een secondaire infectie met een nieuw serotype. Vroege stappen van CHIKV infectie – infectiemechanisme en neutralisatie door antistoffen De meest recente en nog steeds aanhoudende CHIKV uitbraak begon in 2004 en heeft zich sindsdien verspreid naar meer dan 45 landen in Zuid-Europa, Afrika, Zuidoost-Azië en Centraal Amerika. De omvang van deze uitbraak is met miljoenen infecties bijzonder groot. In het merendeel van de gevallen (75% - 95%) leidt infectie tot chikungunyakoorts, met symptomen zoals hoge koorts, spier- en hoofdpijn, huiduitslag en sterke gewrichtspijn. Hoewel de meeste symptomen binnen 7-10 dagen verdwijnen, kan gewrichtspijn maanden tot jaren aanhouden. Ongeveer 12%-49% van de geïnfecteerde mensen ontwikkelt langdurige gewrichtspijn. De CHIKV uitbraak van deze eeuw werd gefaciliteerd door aanpassingen van het virus die het mogelijk maakten dat het virus kon worden overgedragen door de Aedes albopictus mug, terwijl de overdrachtsroute via de Aedes aegypti mug ook stand hield. Het is aangetoond dat veranderingen in de sequentie (mutaties) van de eiwitten E1 en E2, die in de virale membraan zijn verankerd, doorslaggevend waren voor deze aanpassing. Deze membraaneiwitten bewerkstelligen het binnendringen van het virus in de cel. In een neutrale pH-omgeving schermt het E2 eiwit het E1 eiwit af, en beide eiwitten vormen een zogenaamd heterodimer. Zodra de omgeving tot een kritisch punt is aangezuurd, vinden meerdere conformationele veranderingen in de membraaneiwitten plaats. Het E2 eiwit laat het E1 eiwit los, en E1 kan zijn fusiepeptide – dat zich aan het uiteinde van het eiwit bevindt – in het doelmembraan verankeren. Vervolgens voegen zich drie E1 eiwitten samen tot een E1 trimeer. De uiteinden van E1 klappen vervolgens terug richting het virale membraan. Hierdoor wordt de membraan zo dicht bij het doelmembraan gebracht dat membraanfusie plaatsvindt. Omdat de uitbraak van CHIKV relatief recent is begonnen, was er tot kortgeleden nog maar weinig bekend over het infectieproces van dit virus. In het laatste decennium is onze kennis over dit virus echter sterk verbeterd, onder meer door de studies die in dit proefschrift beschreven staan. In hoofdstuk 4 wordt gedetailleerd op het infectieproces en het samensmelten van het virale met het endosomale membraan (virale fusie) ingegaan. In dit hoofdstuk vatten wij daarnaast actuele kennis over de virale opbouw, receptorinteractie en A 228 Appendices gastheercellen samen. Tevens wordt het voorkomen van vroege stappen van het infectieproces door middel van antivirale middelen en antistoffen beschreven. In hoofdstuk 5 is de opname van CHIKV deeltjes in levende cellen onderzocht met behulp van microscopie. Door zowel de virusdeeltjes als ook verschillende merker-eiwitten van de cel van een gekleurd label te voorzien konden wij de ingangsroute van het virus in de cel in detail bestuderen. Wij laten zien dat CHIKV snel door de gastheercel wordt opgenomen. In de meerderheid van de gevallen zagen wij voorafgaand aan de opname een co-lokalisatie van het virusdeeltje met een ‘clathrin-coated pit’, een instulping van het plasmamembraan van de gastheercel. Nadat het deeltje in deze ‘pit’ terechtkomt, snoert de instulping naar binnen af, waardoor het virus in een blaasje in de gastheercel terechtkomt. Deze route van opname wordt “clathrine-gemedieerde endocytose” genoemd, en wij stellen dat dit de hoofdroute van virusopname is. Wij bevestigen deze aanname door te laten zien dat infectie sterk gereduceerd is als remmers van clathrine-gemedieerde endocytose aan de cellen worden toegevoegd. Na opname gaat het blaasje met het virusdeeltje op in een vroeg endosoom, waar een licht zuur (lage pH) milieu aanwezig is. Het is bekend dat de lage pH ervoor zorgt dat het virale membraan fuseert met het endosomale membraan. CHIKV fuseert vanuit een zogenoemd vroeg endosoom. Zoals in de introductie staat beschreven is het waarschijnlijk dat mutaties in de membraaneiwitten ertoe hebben geleid dat CHIKV zich aan de Aedes albopictus mug heeft aangepast. Van één van deze mutaties, namelijk A226V in E1, is bekend dat het de cholesterolafhankelijkheid van infectie verandert. Cholesterol is een lipide dat voorkomt in het celmembraan en het endosomale membraan. De hoeveelheid cholesterol neemt af naarmate het endosoom rijpt van vroeg naar laat endosoom. Wij hebben aangetoond dat de aanwezigheid van cholesterol in het doelmembraan CHIKV membraanfusie stimuleert. In dit hoofdstuk laten we tevens zien dat de A226V mutatie leidt tot een hogere afhankelijkheid van membraanfusie op de cholesterolconcentratie. In hoofdstuk 6 hebben wij de lipide- en pH-afhankelijkheid van CHIKV fusie in detail onderzocht. Hiervoor hebben wij gebruik gemaakt van twee modelsystemen. Wij hebben het fusieproces onderzocht met behulp van gelabelde virusdeeltjes en liposomen. Liposomen zijn kunstmatige lipidemembranen waarvan de lipidesamenstelling naar wens veranderd kan worden. Ook de pH-afhankelijkheid kan met dit systeem worden onderzocht. Het voordeel van dit systeem is dat op een eenvoudige manier naar verschillende variabelen gekeken kan worden. Omdat een grote hoeveelheid virusdeeltjes en liposomen per meting wordt gebruikt, is de informatie over het verlopen van het proces, de kinetiek, echter beperkt. Daarom hebben wij ook ervoor gekozen om het fusieproces van enkele virusdeeltjes te observeren met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Met behulp van deze twee technieken hebben wij vastgesteld dat fusie strikt afhankelijk is van lage pH. De virusdeeltjes fuseren zodra de pH-waarde 6.2 of lager is, en de pH A 229 Appendices voor optimale fusie-efficiëntie bleek 5.6 of lager. Onder optimale omstandigheden fuseert de helft van alle fuserende deeltjes binnen 2 seconden nadat de pH omlaag is gebracht. Verder zagen wij dat de aanwezigheid van cholesterol en sfingomyeline in het doelmembraan (van het liposoom) de fusie-efficiëntie sterk verbetert. Met behulp van fluorescentiemicroscopie hebben wij bepaald hoe lang het duurt tot een deeltje fuseert nadat de omgeving is aangezuurd. Door een groot aantal van deze metingen uit te voeren, konden wij afleiden aan hoeveel kinetische stappen het membraanfusieproces onderhevig is. Dit bleken onafhankelijk van de gemeten pH drie stappen te zijn. Een mogelijke verklaring van deze stappen is het gelijktijdige terugvouwen van drie E1 trimeren tegen het virusoppervlak aan. Het toedienen van neutraliserende antistoffen is een veelbelovende aanpak om CHIKV infecties te voorkomen of te behandelen. Kennis van het neutralisatiemechanisme kan hierbij de ontwikkeling van een vaccin of virusremmer verder ondersteunen. In hoofdstuk 7 beschrijven wij de productie en karakterisering van een groot aantal antistoffen tegen CHIKV. In deze studie zijn 36 antistoffen gevonden die drie verschillende CHIKV stammen effectief neutraliseren. Een gedeelte van deze antistoffen werd getest in muizen die gevoelig zijn voor CHIKV infectie. Als de antistoffen als profylaxe worden gegeven, dat wil zeggen vóór het blootstellen aan het virus, is het merendeel van de muizen gedeeltelijk beschermd tegen infectie. De vier meest effectieve antistoffen uit deze profylaxestudies werden vervolgens aangeboden als combinatietherapie. Hierbij werden reeds geïnfecteerde muizen behandeld met combinaties van twee verschillende antistoffen. Bij bepaalde combinaties werden de muizen met succes behandeld, mits de therapie niet te lang na infectie plaatsvond. Neutralisatie van infectie door toediening van antistof CHK-152 vindt vermoedelijk plaats door inhibitie van membraanfusie. Ook andere antistoffen uit deze studie voorkomen membraanfusie, hetgeen laat zien dat het remmen van fusie een efficiënte manier is om infectie te voorkomen. Omdat wij verder geïnteresseerd waren in het mechanisme van neutralisatie door antistoffen, hebben wij in hoofdstuk 8 de werkwijze van vier antistoffen van het vorige hoofdstuk nader onderzocht. Drie antistoffen binden aan het E2 eiwit en één antistof bindt aan E1. Wij laten in dit hoofdstuk zien dat alle onderzochte antistoffen infectie inhiberen als deze vóór, maar ook als deze ná binding van het virusdeeltje aan het celoppervlak worden toegevoegd. Dit wijst erop dat neutralisatie tenminste gedeeltelijk moet plaatsvinden nadat het virus is opgenomen door de cel. Met behulp van het liposomale modelsysteem tonen wij inderdaad aan dat alle vier antistoffen fusie inhiberen, waarbij de drie E2 antistoffen efficiënter en effectiever werken dan het E1 antistof. Door nog 14 andere antistoffen te testen laten we bovendien zien dat fusie-inhibitie een veel voorkomend mechanisme van neutralisatie is – twee derde van de onderzochte antistoffen vertoonde gemiddelde tot sterke inhibitie van fusie in het liposomale modelsysteem. A 230 Appendices Vervolgens hebben wij verder ingezoomd op de verschillende stappen van het fusieproces. Wij laten zien dat antistof CHK-152 de door lage pH geactiveerde binding van virusdeeltjes aan liposomen vrijwel compleet remt, terwijl de andere drie antistoffen binding gedeeltelijk voorkomen. Dit wijst erop dat het mechanisme van neutralisatie onderling verschilt. Ook tonen wij aan dat drie van de vier antistoffen gedeeltelijk de formatie van het E1 trimeer voorkomen. Met behulp van TIRF microscopie zoals beschreven in hoofdstuk 6 hebben wij verder gekeken naar de kinetiek van fusie-inhibitie. Omdat virusdeeltjes die antistoffen hebben gebonden nog maar slecht aan het doelmembraan binden, zijn alleen lage antistofconcentraties onderzocht. Binding door het antistof CHK-152 resulteert in een langer tijdsinterval tussen het verlagen van de pH en de virale fusie. Dit zou kunnen betekenen dat de antistof-gebonden virale eiwitten niet de vereiste veranderingen kunnen ondergaan die nodig zijn voor membraanfusie, waardoor het langer duurt tot er genoeg actieve E1 trimeren beschikbaar zijn die fusie kunnen bewerkstelligen. Behalve neutralisatie vroeg in het infectieproces hebben wij nog een aanvullend mechanisme van antistof-gemedieerde neutralisatie geïdentificeerd: Alle vier geteste antistoffen verstoorden de afsnoering van nieuw gevormde virusdeeltjes in geïnfecteerde gastheercellen. Dit mechanisme is vooral van belang later in de infectie, als reeds geïnfecteerde cellen aanwezig zijn. De studies van dit proefschrift hebben bijgedragen aan het begrijpen van het infectieproces van DENV en CHIKV en brengen nieuwe inzichten over de invloed van antistoffen op virale infectiviteit. In hoofdstuk 9 worden de resultaten uit het proefschrift samengevat, bediscussieerd en in een bredere context geplaatst. A 231 Appendices A 232 Appendices Deutsche Zusammenfassung Dengue- und Chikungunyavirus: Eintrittsmechanismen in die Zelle und der Einfluss von Antikörpern auf Infektiosität Immer mehr Menschen werden mit dem Dengue Virus (DENV) und dem Chikungunya Virus (CHIKV) infiziert. Infektionen finden vor allem in den tropischen und subtropischen Gebieten statt. Sowohl DENV als auch CHIKV werden durch Mückenstiche übertragen. Wichtige Mücken sind hierbei Aedes aegypti (auch Gelbfiebermücke, Denguemücke oder Ägyptische Tigermücke genannt) und Aedes albopictus (auch Asiatische Tigermucke genannt). Eine DENV-Infektion führt meist zu Dengue-Fieber; eine CHIKV-Infektion führt zu Chikungunya-Fieber. Die Symptome beider Krankheiten sind einander sehr ähnlich und umfassen unter anderem Fieber, Kopf- und Gliederschmerzen, Gelenkschmerzen und Hautausschlag. Weder für DENV noch für CHIKV steht ein spezialisiertes Medikament oder Impfstoff zur Verfügung. Die Behandlung beruht daher auf Symptombehandlung. Um die Entwicklung eines Medikamentes oder Impfstoffes zu unterstützen ist es wichtig, das Zusammenspiel zwischen dem Virus und dem Wirt während der Virusvermehrung besser zu verstehen. Sowohl DENV als auch CHIKV besitzen ein einzelnes RNA-Molekül das von Kapsidproteinen umgeben ist. Dies wird das Nukleokapsid genannt. Das Nukleokapsid ist von einer Lipiddoppelschicht umgeben, der Membran. In dieser Membran befinden sich virale Membranproteine, die für das Eindringen in die Wirtszelle wichtig sind. Beide Viren werden mithilfe von rezeptovermittelter Endozytose in die Wirtszelle aufgenommen. Danach wird das Viruspartikel zu angesäuerten Bläschen, den Endosomen, transportiert. Durch das saure Milieu finden Veränderungen in den viralen Membranproteinen statt, die zum Zusammenschmelzen der Virusmembran mit der Endosommembran führen. Dieser Prozess wird virale Fusion genannt. Nachdem der Fusionsprozess stattgefunden hat, gelangt die virale RNA in die Wirtszelle, woraufhin die Produktion neuer Viruspartikel beginnt. In dieser Doktorarbeit haben wir die viralen Eintrittsmechanismen in die Wirtszelle untersucht. Außerdem haben wir erforscht wie Antikörper gegen das Virus die virale Infektiosität beeinflussen. DENV-Struktur und Infektiosität – der Einfluss von Antikörpern und des Rezeptormoleküls DC-SIGN DENV ist mit geschätzten 390 Millionen Infektionen pro Jahr die meistvorkommende von Mücken übertragene virale Krankheit in der Welt. Diese Infektionen führen in 100 Millionen Fällen zu Krankheitssymptomen. Es gibt vier Serotypen von DENV (DENV-1 bis 4), und jeder dieser Serotypen kann A 233 Appendices Krankheitserscheinungen verursachen. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat diese in drei Kategorien unterteilt: „Dengue-Fieber ohne Warnzeichen“, „DengueFieber mit Warnzeichen“ und „Schweres Dengue-Fieber“. Am häufigsten ist DengueFieber mit Symptomen wie Fieber, Hautausschlag, Gelenk- und Gliederschmerzen und Übelkeit milder Art. Dies wird in Deutschland umgangssprachlich auch als Knochenbrecherfieber bezeichnet. Hinzukommende Symptome (Warnzeichen) umfassen Erbrechen, Lethargie, Blutungen, Bauchschmerzen, Lebervergrößerung und ein abweichendes Blutbild. Schweres Dengue-Fieber ist gekennzeichnet von Plasmaleckage, Blutungen und einer Verschlechterung der Organfunktionen. Wenn schweres Dengue-Fieber nicht adäquat behandelt wird, können Patienten das Dengue-Schock-Syndrom entwickeln, dass lebensgefährlich sein kann. Jedes Jahr werden ungefähr eine halbe Million Patienten mit Dengue im Krankenhaus aufgenommen, und ungefähr 25.000 Patienten sterben an den Folgen einer DENVInfektion. Patienten sind nach einer überstandenen DENV-Infektion durch die erworbene Immunität lebenslang vor einer Infektion mit dem gleichen Serotypen geschützt. Jedoch wird schweres Dengue-Fieber beinahe ausschließlich bei Patienten mit einer wiederholten Infektion mit einem anderen Serotypen (sekundäre heterologe Infektion) sowie in Säuglingen, von denen die Mutter zur Zeit der Geburt Antikörper gegen DENV besitzt, festgestellt. Diese Beobachtungen haben zur Theorie der infektionsverstärkenden Antikörper geführt, im Englischen auch „Antibodydependent enhancement of disease“ (ADE) genannt. Es wird angenommen, dass bestehende, kreuzreagierende Antikörper Viruspartikel nicht neutralisieren, sondern verstärken. Bei ADE werden antikörpergebundene Viruspartikel zu Zellen mit FcRezeptor geleitet. Diese Zellen sind imstande das Virus zu vermehren. Die Aufnahme des Virus findet durch Bindung des Antikörpers an den Fc-Rezeptor statt. Im Falle einer sekundären heterologen Infektion werden außerdem Gedächtnis-T und B-Zellen aktiviert. Dies resultiert in einer noch höheren Anzahl kreuzreagierender Antikörper und ineffektiver T-Zellen. Zusammen führen ADE und das ineffiziente Entfernen infizierter Zellen zu einer großen Anzahl infizierter Zellen und Viruspartikel im Blut. Hierdurch werden infektionsstimulierende Moleküle (Zytokine) produziert, was letztendlich Plasmaleckage und Blutungen zur Folge hat. In den vergangenen Jahren haben wir den Einfluss des viralen prM Proteins auf DENV-Infektion und Krankheit untersucht. prM ist eines von zwei viralen Membranproteinen. Das weitere Membranprotein (genannt E) wird von prM während der Produktion neuer Viruspartikel stabilisiert und beschützt. Das E-Protein ist das virale Fusionsprotein. Dies bedeutet, dass das Protein das Zusammenschmelzen der viralen Membran mit der Endosommembran herbeiführt. Um jedoch zu verhindern, dass dieser Prozess schon während der Virusproduktion stattfindet, werden neue Viruspartikel in unreifer Form produziert, wobei das pr-Segment des prM-Proteins das E-Protein abschirmt. Während des Transportes zur Zelloberfläche durchlaufen die Viruspartikel mehrere Zellkompartimente, in denen die Umgebung stets saurer A 234 Appendices wird. Durch das saure Milieu verändert sich die Form des prM-Proteins, wodurch dieses von der zellulären Protease Furin in das pr-Peptid und das M-Protein gespaltet wird. Nach dem Zellaustritt der Partikel befindet sich das Virus in einem neutralen, nicht mehr sauren Milieu, wodurch sich das pr-Peptid ablöst und das Viruspartikel infektiös wird. Dieser Reifungsprozess ist nicht sehr effizient – Viruspräparte die in Mückenzellen produziert werden bestehen aus einer Mischung von reifen, teilweise reifen (mindestens 40%) und vollständig unreifen (mindestens 3%) Partikeln. In Kapitel 2 dieser Doktorarbeit wird ein Überblick über die Struktur, den Lebenszyklus und die Pathogenese von DENV gegeben. Wie bereits beschrieben, scheiden infizierte Zellen Viruspartikel mit einer variablen Menge prM in der Membran aus. Wir und andere Wissenschaftler haben zuvor nachgewiesen, dass vollständig unreife DENV-Partikel in verschiedenen Wirtszelltypen kaum infektiös sind. Die allgemeine Gültigkeit dieser Entdeckung wurde jedoch infrage gestellt, als nachgewiesen wurde, dass das Rezeptormolekül DC-SIGN – das sich auch auf den natürlichen Wirtszellen von DENV befindet – die Infektiosität von reifen und unreifen West-Nil-Virus-Partikeln verstärkt. Das West-Nil-Virus ist stark mit DENV verwandt. Mit diesen Grundlagen haben wir uns entschieden in Kapitel 3 die Infektiosität von verschiedenen DENV-Serotypen und Reifegraden auf Zellen mit und ohne dem Rezeptormolekül DC-SIGN zu untersuchen. Wir weisen erst nach, dass nebst unreifen Viruspartikeln von DENV-2 auch unreife Viruspartikel von anderen DENV-Serotypen nicht in der Lage sind Makrophagen oder Endothelzellen zu infizieren. Unreife dendritische Zellen, die über viel DC-SIGN verfügen, können jedoch durchaus von unreifen DENV-Partikeln verschiedener Serotypen infiziert werden, sei es im Vergleich mit reifen und teilweise unreifen Partikeln mit einer niedrigeren Effizienz. Des Weiteren zeigen wir, dass die Infektiosität unreifer Partikel in der Tat von DC-SIGN abhängt und dass Furinaktivität für die Infektion notwendig ist. Diese Resultate deuten daraufhin, dass das prM-Protein nach Virusaufnahme in das pr-Peptid und das M-Protein gespalten wird. Es ist bekannt, dass antikörpergebundende unreife DENV-Partikel Zellen mit Fc-Rezeptoren infizieren können. Es wird vermutet, dass unreife Viren so zu der hohen Anzahl der infizierten Zellen während einer sekundären heterologen Infektion beitragen. Unreife dendritische Zellen tragen sowohl DC-SIGN als auch Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Wir haben untersucht ob Serum (in dem sich Antikörper befinden) eines DENV-2-immunen Patienten die Infektiosität von verschiedenen DENV-Serotypen verstärken kann. Wir weisen in dieser Doktorarbeit nach, dass dies nicht der Fall ist. In makrophagähnlichen Zellen beobachteten wir jedoch eine starke Infektiositätszunahme von unreifen Viruspartikeln nachdem diese mit demselben Serum inkubiert worden waren. Die Befunde in Kapitel 3 zeigen, dass unreifes DENV unreife dendritische Zellen über die Interaktion mit DC-SIGN infizieren kann. Dies ist ein Hinweis darauf, dass auch unreife und teils unreife Partikel zu einer Erstinfektion beitragen A 235 Appendices können, sei es im Vergleich mit reifen Viren in geringerem Umfang. Des Weiteren wurde die Infektiosität von unreifen DENV in unreifen dendritischen Zellen nicht von Antikörpern verstärkt. Anscheinend ist die Infektion dieser Zellen bereits so effizient, dass diese nicht weiter von Antikörpern verstärkt werden kann. Deswegen schlussfolgern wir, dass vor allem Makrophagen und Monozyten zu der höheren Virenzahl während einer sekundären Infektion mit einem neuen Serotypen beitragen. Frühe Ereignisse in der CHIKV-Infektion – Infektionsmechanismus und Neutralisation durch Antikörper Der jüngste und derzeit noch andauernde CHIKV-Ausbruch begann 2004 und hat sich seitdem in über 45 Ländern in Südeuropa, Afrika, Südostasien und Zentralamerika verbreitet. Der Umfang dieses Ausbruches ist mit Millionen Infektionen besonders groß. In den meisten Fällen (75%-95%) führt eine Infektion zu Chikungunya-Fieber, mit Symptomen wie hohes Fieber, Muskel- und Kopfschmerzen, Hautausschlag und starke Gelenkschmerzen. Obwohl die meisten Symptome innerhalb von 7-10 Tagen nachlassen, können die Gelenkschmerzen in ungefähr 12%-49% der Fälle Monate bis Jahre anhalten. Der heutzutage herrschende CHIKV-Ausbruch wurde durch Anpassungen des Virus erleichtert, die eine Übertragung von der Asiatischen Tigermücke möglich machte, während der Infektionsweg über die Ägyptische Tigermücke instand hielt. Es ist nachgewiesen, dass Veränderungen in der Sequenz (Mutationen) in den Membranproteinen E1 und E2 ausschlaggebend für diese Anpassung waren. Die Membranproteine E1 und E2 führen den Zelleintritt des Virus herbei. In einer neutralen pH-Umgebung schirmt das E2-Protein das E1-Protein ab, und beide Proteine formen ein sogenanntes Heterodimer. Sobald das Milieu zu einem kritischen Punkt angesäuert ist, finden mehrere konformationale Veränderungen in den Membranproteinen statt. Das E2-Protein löst sich vom E1-Protein, und E1 kann sein Fusionspeptid – das sich am äußeren Ende des Proteins befindet – in der Zielmembran verankern. Anschließend fügen sich drei E1-Proteine zu einem sogenannten E1-Trimer zusammen. Die äußeren Enden von E1 klappen dann in der Richtung der viralen Membran zurück. Hierdurch werden beide Membranen so dicht zueinander gebracht dass sie zusammenschmelzen – die Membranfusion. Da der letzte CHIKV-Ausbruch rezent begonnen ist, war bisher relativ wenig über den Infektionsprozess bekannt. Im letzten Jahrzehnt ist unser Wissen über das Virus jedoch stark gestiegen, unter anderem durch die Studien die in dieser Doktorarbeit behandelt werden. In Kapitel 4 werden der Infektionsprozess und die virale Membranfusion im Detail beschrieben. In diesem Kapitel wird außerdem der aktuelle Wissenstand über Virusaufbau, Rezeptorinteraktion und Wirtzellen zusammengefasst. Ebenfalls werden die Möglichkeiten, den viralen Eintritt zu verhindern, beschrieben. A 236 Appendices In Kapitel 5 ist die Aufnahme von CHIKV-Partikeln in lebenden Zellen mithilfe von Mikroskopie untersucht. Durch Markierung sowohl der Viren als auch verschiedener kennzeichnender Zellproteine mit einem Farbstoff konnten wir den Zelleintrittsweg im Detail erforschen. Wir zeigen, dass CHIKV schnell von der Wirtszelle aufgenommen wird. In der Mehrzahl der Fälle sahen wir vor dem Eintritt eine Kolokalisation des Viruspartikels mit einem „clathrin-coated pit“, einer Einstülpung in der Plasmamembran der Wirtszelle. Nachdem das Virus in einen solchen ‚pit‘ gelangte, schnürte die Einstülpung nach innen ab, wodurch das Virus in ein Bläschen in der Zelle gelangt. Dieser Eintrittsweg wird clathrinvermittelte Endozytose genannt, und wir nehmen an, dass dies der Hauptweg des Viruseintritts ist. Wir bestätigen diese Annahme, indem wir zeigen, dass Infektionen nach der Gabe von Blockern dieses Weges stark reduziert sind. Nachdem das Virus in die Zelle aufgenommen worden ist, fügt sich das Bläschen inklusive des Virus mit einem frühen Endosom zusammen, in dem sich ein leicht saures (niedriger pH-Wert) Milieu befindet. Es ist bekannt, dass der niedrige pH-Wert dafür sorgt, dass die virale Membran mit der Endosommembran verschmilzt. Wir zeigen, dass CHIKV bereits mit der Membran des frühen Endosoms verschmilzt. So wie bereits in der Einleitung beschrieben, ist es wahrscheinlich, dass Mutationen in den Membranproteinen dazu geführt haben, dass CHIKV sich an die Asiatische Tigermücke angepasst hat. Von einer dieser Mutationen, genannt A226V, ist bekannt, dass sie die Cholesterinabhängigkeit der Infektion verändert. Cholesterin ist ein Lipidbestandteil der Zellmembran und Endosommembran. Die Cholesterinmenge nimmt mit der Reifung des frühen Endosoms zum späten Endosom ab. Wir haben nachgewiesen, dass Cholesterin in der Zielmembran die Membranfusion stimuliert. In diesem Kapitel zeigen wir außerdem, dass die A226VMutation zu einer höheren Cholesterinabhängigkeit der Membranfusion führt. In Kapitel 6 haben wir die Lipid- und pH-Abhängigkeit der CHIKVFusion im Detail erforscht. Hierfür haben wir zwei Modelsysteme benutzt. Wir haben den Fusionsprozess mithilfe von mit Farbstoffen sichtbar gemachten Viruspartikeln und Liposomen untersucht. Liposome sind künstliche Membranen, von denen die Lipidzusammenstellung nach Wunsch verändert werden kann. Auch die pH-Abhängigkeit kann mit diesem System untersucht werden. Der Vorteil des Liposomsystems ist, dass auf einfache Art und Weise verschiedenen Variablen untersucht werden können. Da eine große Menge Viren und Liposomen pro Messung verwendet wird, ist die erlangte Information über den Verlauf des Prozesses, die Kinetik, jedoch beschränkt. Daher haben wir uns entschieden, den Fusionsprozess von einzelnen Viruspartikeln mithilfe von interner Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF-Mikroskopie) zu beobachten. Mit diesen zwei Techniken haben wir festgestellt, dass Fusion strikt von niedrigen pH-Werten abhängt. Die Viruspartikel schmelzen mit den Liposomen zusammen, sobald der pH-Wert 6.2 oder niedriger ist. Der optimale pH für den Fusionsprozess stellte sich als 5.6 oder niedriger heraus. Unter optimalen Umständen schmilzt die Hälfte aller letztendlich aktiven Partikel A 237 Appendices innerhalb von 2 Sekunden nachdem der pH gesenkt wurde mit den Zielmembranen zusammen. Des Weiteren beobachteten wir, dass Cholesterin und Sphingomyelin (ein weiteres Lipid) in der Zielmembran die Fusioneffizienz stark verbesserten. Mithilfe der TIRF-Mikroskopie haben wir festgestellt wie lange es dauert bis ein Partikel mit der Zielmembran verschmilzt nachdem der pH gesenkt wurde. Durch mehrfache Ausführung dieser Messungen konnten wir ableiten wie viele kinetische Schritte dem Membranfusionsprozess unterliegen. Dies waren, unabhängig vom gemessenen pH, drei Schritte. Eine mögliche Erklärung dieser Schritte ist das gleichzeitige Zurückklappen von drei E1-Trimeren zur Virusoberfläche. Das Verabreichen von neutralisierenden Antikörpern ist eine vielversprechende Vorgehensweise um CHIKV-Infektion vorzubeugen oder zu behandeln. Mehr Kenntnis über den Neutralisationsmechanismus kann die Entwicklung eines Virusblockers oder Impfstoffes weiter unterstützen. In Kapitel 7 beschreiben wir die Produktion und Charakterisierung einer großen Zahl von Antikörpern gegen CHIKV. In dieser Studie sind 36 Antikörper gefunden worden, die verschiedene CHIKV-Stämme effektiv neutralisieren. Ein Teil diese Antikörper wurde in CHIKV-empfindlichen Mäusen getestet. Wenn die Antikörper als vorbeugend gegeben wurden, ist die Mehrzahl der Mäuse teilweise vor der Infektion geschützt. Die vier effektivsten Antikörper aus dieser Vorbeugungsstudie wurden anschließend zur Kombinationstherapie verwendet. Hierbei werden bereits infizierte Mäuse mit einer Kombination aus zwei verschiedenen Antikörpern behandelt. Bei einigen Kombinationen wurden die Mäuse mit Erfolg behandelt, vorausgesetzt die Therapie fand nicht zu spät nach der Infektion statt. Neutralisation der Infektion durch einen der Antikörper, CHK-152, findet vermutlich durch das Hemmen der Membranfusion statt. Auch andere Antikörper aus dieser Studie verhindern die Membranfusion. Dies zeigt, dass das Blockieren der Fusion ein effizienter Weg ist um der Infektion vorzubeugen. Da wir interessiert waren, den Mechanismus von Neutralisation durch Antikörper weiter zu erforschen, haben wir in Kapitel 8 die Funktionsweise von vier Antikörpern aus dem vorhergehendem Kapitel untersucht. Drei dieser Antikörper binden an das E2-Protein, eines bindet an das E1-Protein. Wir zeigen in diesem Kapitel, dass alle untersuchten Antikörper die Infektion verhindern wenn sie vor, aber auch wenn sie nach der Bindung der Viruspartikel an die Zelloberfläche zugegeben werden. Dies weist darauf hin, dass Neutralisation zumindest teilweise stattfindet, nachdem das Virus von der Zelle aufgenommen worden ist. Mithilfe des Liposomsystems zeigen wir in der Tat, dass alle vier Antikörper die Fusion hemmen, wobei die drei E2-Antikörper effizienter und effektiver wirken als der E1Antikörper. Durch Testung 14 weitere Antikörper weisen wir außerdem nach, dass Fusionshemmung ein vielvorkommender Neutralisationsmechanismus ist – zwei Drittel der untersuchten Antikörper zeigten mittlere bis starke Fusionshemmung in dem Liposomsystem. A 238 Appendices Anschließend haben wir uns näher mit den verschiedenen Schritten des Fusionsprozesses befasst. Wir zeigen, dass der Antikörper CHK-152 die durch den niedrigen pH aktivierte Bindung von Viruspartikeln an Liposome nahezu komplett verhindert, während die drei weiteren Antikörper die Bindung nur teilweise verhindern. Dies weist darauf hin, dass sich der Neutralisationsmechanismus dieser Antikörper voneinander unterscheidet. Auch zeigen wir, dass drei der vier Antikörper die Formung des E1-Trimeres teilweise hemmen. Mithilfe der TIRF-Mikroskopie, die bereits in Kapitel 6 beschrieben wurde, haben wir die Kinetik der Fusionshemmung weiter untersucht. Da Viren, die Antikörper gebunden haben, nur schlecht an die Zielmembran binden, haben wir nur niedrige Antikörperkonzentrationen untersucht. Bindung mit dem Antikörper CHK-152 führte zu einer längeren Zeitspanne zwischen der Senkung des pHs und der viralen Fusion. Dies kann bedeuten, dass in viralen Proteinen, welche an Antikörper gebunden haben, nicht die notwendigen Veränderungen stattfinden können die für das Zusammenschmelzen der Membranen nötig sind, wodurch es länger dauert bis genug aktive E1-Trimere verfügbar sind um die Fusion zu bewirken. Außer der Neutralisation im frühen Stadium des Infektionsprozesses haben wir noch einen weiteren Neutralisationsmechanismus identifiziert: Alle getesteten Antikörper störten die Abschnürung neu geformter Viren aus infizierten Wirtszellen. Dieser Mechanismus ist vor allem später in der Infektion wichtig. Die Studien in dieser Doktorarbeit haben zum Verständnis des Infektionsprozesses von DENV und CHIKV beigetragen, und bringen neue Einsichten über den Einfluss von Antikörpern auf die virale Infektiosität. In Kapitel 9 werden die Ergebnisse aus dieser Doktorarbeit zusammengefasst, diskutiert und in einen breiteren Zusammenhang gestellt. A 239 Appendices Contributing authors Department of Medical Microbiology, University of Groningen and University Medical Center Groningen, The Netherlands Júlia da Silva Voorham Izabela A. Rodenhuis-Zybert Silvia Torres Pedraza Tabitha E. Hoornweg Denise P.I. van de Pol Nilda V. Ayala Nuñez Jan Wilschut Jolanda M. Smit Grupo Immunovirología, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia Silvia Torres Pedraza Molecular Virology Laboratory, Department of Medical Microbiology, Leiden University Medical Center, The Netherlands Irina C. Albulescu Martijn J. van Hemert Centre for Synthetic Biology, Zernike Institute of Advanced Materials, University of Groningen, The Netherlands Department of Medicine, Washington University School of Medicine, USA Julie M. Fox James D. Brien Iris Lee Michael S. Diamond Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, St. Louis, USA Melissa A. Edeling Daved H. Fremont MacroGenics, Rockville, USA Sergey Gorlatov Syd Johnson Jelle S. Blijleven Antoine M. van Oijen School of Chemistry, University of Wollongong, Australia Wataru Akahata Gary J. Nabel Antoine M. van Oijen Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, St. Louis, USA Pankaj Pal Michael S. Diamond Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, USA Mark T. Heise 240 Kimberly A. Dowd Theodore C. Pierson Vaccine Research Center, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, USA Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine, St. Louis, USA A Viral Pathogenesis Section, Laboratory of Viral Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, USA Daved H. Fremont Michael S. Diamond Center for Human Immunology and Immunotherapy Programs, Washington University School of Medicine, USA Michael S. Diamond Appendices Curriculum Vitae Personal Information Name Mareike van Duijl, geb. Richter Date and place of birth 18th of September 1986, Emden (Germany) E-mail [email protected] Education 2011-2015 PhD, Department of Medical Microbiology, University of Groningen, The Netherlands 2009-2011 MSc, Topmaster "Medical & Pharmaceutical Drug Innovation", University of Groningen 2006-2009 BSc, Bachelor "Life Science & Technology", University of Groningen Publications 1. Fox JM, Long F, Edeling MA, Lin H, van Duijl-Richter MKS, Fong RH, Kahle KM, Smit JM, Jin J, Simmons G, Doranz BJ, Crowe JE Jr, Fremont DH, Rossmann MG, Diamond MS. Broadly Neutralizing Alphavirus Antibodies Bind an Epitope on E2 and Inhibit Entry and Egress. Cell. 2015 Nov 19;163(5):1095-107. doi: 10.1016/j.cell.2015.10.050. 2. van Duijl-Richter MKS*, Blijleven JS*, van Oijen AM, Smit JM. Chikungunya virus fusion properties elucidated by single-particle and bulk approaches. J Gen Virol. 2015;96: 2122-2132. doi: 10.1099/vir.0.000144 3. van Duijl-Richter MKS, Hoornweg TE, Rodenhuis-Zybert IA, Smit JM. Early Events in Chikungunya Virus Infection-From Virus Cell Binding to Membrane Fusion. Viruses. 2015 Jul 7;7(7):3647-74. doi: 10.3390/v7072792. 4. Richter MKS*, da Silva Voorham JM*, Torres Pedraza S, Hoornweg TE, van de Pol DPI, et al. (2014) Immature Dengue Virus Is Infectious in Human Immature Dendritic Cells via Interaction with the Receptor Molecule DC-SIGN. PLoS ONE 9(6): e98785. doi:10.1371/ journal.pone.0098785 5. Pal P, Dowd KA, Brien JD, Edeling MA, Gorlatov S, Johnson S, Lee I, Akahata W, Nabel GJ, Richter MKS, Smit JM, Fremont DH, Pierson TC, Heise MT, Diamond MS (2013) Development of a Highly Protective Combination Monoclonal Antibody Therapy against Chikungunya Virus. PLoS Pathog 9(4): e1003312. doi:10.1371/journal.ppat.1003312 6. Zaferani A, Talsma D, Richter MKS, Daha MR, Navis GJ, Seelen MA, van den Born J. (2014) Heparin/heparan sulphate interactions with complement--a possible target for reduction of renal function loss? Nephrol Dial Transplant. Mar;29(3):515-22. doi: 10.1093/ ndt/gft243 7. Kluiver J, Gibcus JH, Hettinga C, Adema A, Richter MKS, Halsema N, SlezakProchazka I, Ding Y, Kroesen BJ, van den Berg A. (2012) Rapid Generation of MicroRNA Sponges for MicroRNA Inhibition. PLoS ONE 7(1): e29275. doi:10.1371/journal.pone.0029275 8. J. Lo Ten Foe, M. Richter, H.G.M. Niesters. (2011) Hepatitis C virus. Book chapter in: Molecular Detection of Human Viral Pathogens, CRC Press. A 241 Appendices Dankwoord ~ Acknowledgements ~ Danksagung Na vier jaar promotieonderzoek, en zelfs bijna vijf jaar op de afdeling Moleculaire Virologie en later Experimentele Virologie, is nu de tijd gekomen om afscheid te nemen, maar vooral een woord van dank uit te spreken aan de mensen zonder wie dit boekje niet tot stand was gekomen. Ik kon me tijdens mijn promotie gelukkig prijzen twee geweldige, enthousiaste promotoren te hebben. Als eerste wil ik mijn eerste promotor Jolanda bedanken. Jolanda, een promotietraject is niet alleen vier jaar lang onderzoek doen, maar ook een leertraject. Je hebt me ontzettend veel geholpen me tot de onderzoeker te ontwikkelen die ik nu ben. Bedankt voor je begeleiding, je eerlijke en nuttige feedback, je optimisme en het feit dat je deur altijd voor me open stond. Mijn tweede promotor Antoine, ongeveer een jaar nadat ik was begonnen met mijn onderzoek maakten we met elkaar kennis en begonnen wij aan ons gezamenlijke fusieproject. Samen vanuit totaal verschillende benaderingen één onderzoeksvraag oplossen vond ik erg leuk, want waar voor mij als microbioloog iets vanzelfsprekend is, zie jij als biofysicus nieuwe mogelijkheden en andersom. Ook jou wil ik bedanken voor de goede begeleiding in de afgelopen jaren. Many thanks to the Virology & Immunology Research group, formerly known as Molecular Virology. I’d like to thank all members of the group for their critical questions and valuable input during the work discussions, as well as for their highly appreciated help in the lab. Hierbij wil ik Jan Wilschut nog in het bijzonder bedanken voor de begeleiding in het eerste jaar van mijn promotie, maar ook voor advies in de tijd daarna. Jolanda O., ook jij bedankt voor je inzet en hulp de afgelopen jaren. It was very nice to be a member of the Experimental Virology group! Thank you for the countless hours in the ML-3 lab together, nice chats, resolving small and big lab issues, and of course for your help with my project. Work becomes much more fun when the line between colleagues and friends is fading. A big thank you to my fellow PhD-students, of course for your help in the lab, but especially for many hours of shared dinners, drinks, get-togethers and fun activities. Most of us have spread to all parts of the world (even as far as Leiden!), but I hope we’ll stay in contact and keep each other updated on what life will bring. To my paranymphs Stephanie and Mariana, thank you for your friendship and for standing beside me on this special day. A 242 Appendices Thank you, officemates of room 0657. The secret coffee machine, Christmas and soccer decorations, the chocolate drawer but most of all lots of chats and cheerful words at times that research didn’t look so much fun made it wonderful to share the office. A special thanks to the whole Single Molecule Biophysics group for helping me out at your lab, and also for your input during work discussions. Michiel Punter, bedankt voor het oplossen van al mijn computerproblemen! Antoine heb ik al genoemd, maar mijn proefschrift zou niet in deze vorm tot stand zijn gekomen zonder de hulp van Jelle Blijleven. Jelle, het was erg leuk om met je samen te werken! Ook al waren sommige proeven technisch moeilijk of bleken ze zelfs onhaalbaar, je bleef altijd positief en toegewijd, waardoor we uiteindelijk twee mooie papers konden schrijven. Veel succes met het afronden van jouw promotie! Many thanks to the contributing authors for sharing their work, viruses, and antibodies with us. I would also like to thank the members of the reading committee for reading and assessing my thesis. Mijn vrienden van PL en van biologie, bedankt voor alle gezelligheid de afgelopen jaren! Noch ein paar Worte auf Deutsch, ein großer Dank an Mama, Papa, Michi und Oma für eure Unterstützung. Ihr hattet immer ein offenes Ohr und ich bin dankbar, eine so liebevolle Familie zu haben. Danke auch an meine Freunde von Borkum, wir sind zusammen groß geworden und es ist immer wieder schön euch zu sehen. Rena, danke, dass Du dir die Mühe gemacht hast, um :) die deutsche Zusammenfassung zu kontrollieren. Tot slot, lieve Jerem, het afgelopen jaar was met twee woonplaatsen, het opstarten van jouw promotie en het schrijven van mijn proefschrift pittig. Je hebt ontzettend veel voor me betekend in deze periode. Bedankt voor je liefde, eindeloze geduld, ontelbare kopjes thee, elk opbeurend woord, maar natuurlijk vooral voor al de leuke momenten samen. Ik houd van je! Mareike December 2015 A 243 Appendices A 244
