Proteinase K A3830

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Proteinase K
Lieferform
lyophilisiert Ursprung
aus Tritirachium album Löslichkeit (20°C)
löslich (H2O) M
27000 g/mol CAS-Nr.:
39450-01-6 HS-Nr.:
35079090 EG-Nr.:
254-457-8 Lagerung:
2-8°C LGK:
10 - 13 A3830
Gefahrenpiktogramm(e)
Gefahrenhinweis(e)
H315-H319-H334-H335 Sicherheitshinweis(e)
P260-P302+P352-P304+P341-P305+P351+P338-P342+P31
1 Signalwort
Gefahr WGK:
1 Spezifikation
DNasen/RNasen
nicht nachweisbar Aktivität/mg
min. 30 mAnsonU Aussehen
weiß pH (1 %; H2O; 20°C)
6,2 - 6,8 Literatur
(1) Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995)
Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York
(2) Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition
Seite B16. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
(3) Müller, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 23108-23111 Kristallstruktur von Calcium-freier Proteinase
K mit einer 1,5 A Auflösung.
(4) Wallace, D.M. (1987) Methods Enzymol. 152, 41-48 Phenolextraktion im kleinen und großen Maßstab.
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Proteinase K
A3830
Hinweis
Proteinase K gehört zur Familie der Subtilisin-ähnlichen Serinproteasen. Sie besitzt endo- und
exoproteolytische Aktivität. Aktiviert durch Calcium (1-5 mM) verdaut das Enzym Proteine bevorzugt hinter
hydrophoben Aminosäuren (aliphatische, aromatische und andere hydrophobe Aminosäuren). Proteine werden
komplett verdaut, wenn die Inkubationszeit lang genug ist und die Protease-Konzentration hoch ist. Werden die
Calciumionen entfernt sinkt die Stabilität des Enzyms, auch wenn die proteolytische Aktivität erhalten bleibt (3).
Proteinase K hat zwei Ca2+-Bindungsstellen, die in der Nähe zum aktiven Zentrum lokalisiert sind, aber nicht direkt
in den katalytischen Mechanismus involviert sind. Beseitigung der Ca2+-Ionen reduziert die katalytische Aktivität
der Proteinase K um 80 %. Die verbleibende Aktivität reicht aus um Proteine abzubauen, die üblicherweise
Nukleinsäurepräparationen verunreinigen. Deshalb wird der Verdau mit Proteinase K für die
Nukleinsäurereinigung gewöhnlich in Gegenwart von EDTA durchgeführt (Hemmung Magnesium-abhängiger
Enzyme). Ist die Anwesenheit von Ca2+ notwendig, wird Ca2+ bis zu 1 mM zugegeben und später mit EGTA
beseitigt (pH 8,0; Endkonz. 2 mM). Das pH-Optimum liegt bei 8, das Enzym ist aber in einem weiten pH-Bereich
aktiv (pH 4,3 - 12). Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur von 37°C auf 50 - 60°C kann die Aktivität mehrfach
erhöhen, ebenfalls eine Zugabe von 0,5 - 1 % SDS. Temperaturen über 65°C, Trichloressigsäure oder die
Serinprotease-Inhibitoren AEBSF, PMSF oder DFP hemmen die Aktivität. Proteinase K wird nicht durch EDTA
(siehe Ref. 2), Harnstoff (1 - 4 M), SDS, Citrat, Iodessigsäure oder, interessanter Weise, durch andere
Serinprotease-Inhibitoren wie TLCK und TPCK gehemmt. Muss Proteinase K inaktiviert werden, ist darauf zu
achten, dass die Temperatur nicht unter 95°C liegt und die Dauer nicht 10 Minuten unterschreitet. Auch eine
TCA-Fällung ist geeignet.
Proteinase K wird für den Abbau von Proteinen in Zelllysaten (Gewebe, Zellkulturzellen) und zur Freisetzung von
Nukleinsäuren verwendet, da sie auch sehr effektiv DNasen und RNasen inaktiviert. Hier einige
Anwendungsbeispiele: Herstellung genomischer DNA aus Bakterien (Miniprep): Bakterien aus einer gesättigten
Flüssigkultur werden lysiert und Proteine durch Verdau mit 100 μg/ml Proteinase K für 1 h bei 37°C entfernt (Ref.
1 Suppl. 40 Seite 2.4.1;); Whole-Mount in situ hybridization und Nachweis von RNAs in Vertebratenembryos und
isolierten Organen: Verdau der Probe z. B. in 10 μg/ml Proteinase K für 15 Minuten bei Raumtemperatur; Die
Dauer der Behandlung und/oder die Konzentration des Enzyms muss optimiert werden (Ref. 1 Suppl. 35 Seite
14.9.3); Herstellung von DNA aus Zellen oder Gewebe für die PCR: Zellen oder Gewebe werden über Nacht bei
50°C mit 100 μg/ml Proteinase K inkubiert (Ref. 1 Suppl. 17 Seite 15.3.1); Isolierung von Vaccinia-Virus DNA:
Verdau des Virus in einer Suspension mit 2 mg/ml Proteinase K für 4 h bei 37°C (Ref. 1 Suppl. 43 Seite 16.17.8);
Vor der Phenolextraktion zur Reinigung von Nukleinsäuren kann ein Proteinase K-Verdau eingeführt werden (50 200 μg/ml Endkonzentration; 37°C für 30 Minuten in Gegenwart von SDS; Ref. 4). Die von uns empfohlene
Arbeitskonzentration liegt bei 10 - 100 μg/ml.
Stabilität: Proteinase K ist bei +4°C im lyophilisierten Zustand mindestens 12 Monate stabil. In Lösung beträgt
die Stabilität bei +4°C bis -20°C ca. 6 - 12 Monate. Als Lösungsmittel für Stammlösungen (10 - 20 mg/ml) sind zum
Beispiel 10 mM CaCl2 oder 50 mM Tris · HCl, pH 8,0; 1 mM CaCl2 oder 50 % Glycerin; 20 mM Tris · HCl, pH 7,4; 1
mM CaCl2 oder 50 % Glycerin; 50 mM Tris · HCl, pH 8,0; 1 mM CaCl2 geeignet.