Dokument_1.

Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik II
der Universität Würzburg
Direktor: Professor Dr. med. Hermann Einsele
Einfluss von Mycophenolat und Everolimus auf die Immunantwort
humaner dendritischer Zellen gegen Aspergillus fumigatus
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät
der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Christian Blockhaus
aus Mönchengladbach
Würzburg, Juni 2010
Referent: Professor Dr. med. Hermann Einsele
Korreferent: Professor Dr. med. Matthias Eyrich
Dekan: Professor Dr. med. Matthias Frosch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2010
Der Promovend ist Arzt.
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung ............................................................................................. 1
1.1
Das Immunsystem ................................................................................................... 1
1.1.1 Allgemeines ................................................................................................. 1
1.1.2 Die angeborene Abwehr .............................................................................. 2
1.1.3 Toll-Like-Rezeptoren ................................................................................... 2
1.1.4 Signaltransduktion der TLR ......................................................................... 3
1.1.5 Monozyten ................................................................................................... 4
1.1.6 Dendritische Zellen ...................................................................................... 5
1.2
Zytokine ................................................................................................................... 7
1.2.1 Allgemeines ................................................................................................. 7
1.2.2 Signaltransduktion ....................................................................................... 7
1.2.3 TNF-α ........................................................................................................... 8
1.2.4 Interleukin-12 ............................................................................................... 9
1.3
Chemokine ............................................................................................................... 9
1.3.1 Allgemeines ................................................................................................. 9
1.3.2 CCL20/CXCL10 ........................................................................................... 10
1.4
Pilze ......................................................................................................................... 10
1.4.1 Allgemeines ................................................................................................. 10
1.4.2 Die Gattung Aspergillus ............................................................................... 10
1.4.3 Aspergillus fumigatus................................................................................... 11
1.4.4 Invasive Aspergillose ................................................................................... 12
1.4.5 Antimykotika ............................................................................................... 14
1.5
Verwendete Medikamente ....................................................................................... 14
1.5.1 Mycophenolat .............................................................................................. 14
1.5.2 Everolimus (RAD) ....................................................................................... 15
1.6
Zielsetzung ............................................................................................................... 16
2
Material ................................................................................................ 17
2.1
Geräte ....................................................................................................................... 17
2.2
Verbrauchsmaterialien ............................................................................................. 18
2.2.1 Labormaterialien .......................................................................................... 18
2.2.2 Kits ............................................................................................................... 18
2.2.3 Medien ......................................................................................................... 18
2.2.4 Reagenzien ................................................................................................... 19
2.2.5 Zytokine und Immunsuppressiva ................................................................. 19
2.2.6 Primer........................................................................................................... 20
2.2.7 Sonden.......................................................................................................... 20
2.2.8 Antikörper .................................................................................................... 21
3
Methoden ............................................................................................. 22
3.1
Gewinnung dendritischer Zellen .............................................................................. 22
3.1.1 Isolierung von Monozyten ........................................................................... 22
3.1.2 Reifung der dendritischen Zellen ................................................................. 24
3.1.3 Nachweis der dendritischen Zellen .............................................................. 25
3.1.4 Infektion der DCs mit A. fumigatus-Keimschläuchen ................................. 25
3.2
Untersuchung der Zytokinexpression dendritischer Zellen ..................................... 26
3.2.1 Isolierung der Total-RNA ............................................................................ 26
3.2.2 Untersuchung der RNA-Konzentration ....................................................... 26
3.2.3 Umschreibung von RNA in cDNA .............................................................. 26
3.2.4 Quantitative Real-Time PCR ....................................................................... 27
3.3
Durchflusszytometrische Untersuchungen an dendritischen Zellen ........................ 30
3.3.1 Durchflusszytometrie ................................................................................... 30
3.3.2 Vorbereitung der Zellen für die FACS-Untersuchung................................. 31
3.3.3 Untersuchte Antikörper ................................................................................ 31
3.3.4 FITC-Dextran-Assay.................................................................................... 32
3.4
Statistik .................................................................................................................... 32
4
Ergebnisse ............................................................................................ 34
4.1
Zytokinexpression dendritischer Zellen unter Wirkung von Mycophenolat ........... 34
4.1.1 Generierung und Nachweis von DCs aus Monozyten ................................. 34
4.1.2 Sechsstündiger Einfluss durch Mycophenolat ............................................. 35
4.1.3 Zweitägiger Einfluss durch Mycophenolat .................................................. 35
4.1.4 Viertägiger Einfluss durch Mycophenolat ................................................... 36
4.1.5 Gabe von Mycophenolat über die gesamte Differenzierungsdauer ............. 36
4.2
Einfluss von Mycophenolat auf die Entwicklung von DCs..................................... 39
4.2.1 FACS-Analyse unreifer DCs ....................................................................... 39
4.2.2 FACS-Analyse gereifter DCs ...................................................................... 41
4.2.3 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen ................................................. 42
4.3
Lichtmikroskopische Aufnahmen ............................................................................ 43
4.4
Einfluss von RAD auf die Zytokinexpression dendritischer Zellen ........................ 43
4.4.1 Sechsstündiger Einfluss durch RAD ............................................................ 44
4.4.2 Zweitägiger Einfluss durch RAD................................................................. 45
4.4.3 Viertägiger Einfluss durch RAD.................................................................. 45
4.4.4 Gabe von RAD über die gesamte Differenzierungsdauer............................ 46
4.5
Einfluss von RAD auf die Entwicklung dendritischer Zellen ................................. 47
4.5.1 FACS-Analyse unreifer DCs ....................................................................... 47
4.5.2 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen unter RAD .............................. 48
5
Diskussion ............................................................................................ 50
5.1
Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten und Infektion mit
A. fumigatus-Keimschläuchen ................................................................................. 52
5.2
Untersuchung des Einflusses von Mycophenolat auf DCs ...................................... 53
5.3
Untersuchung des Einflusses von RAD auf DCs .................................................... 56
5.4
Ausblick ................................................................................................................... 58
6
Zusammenfassung / Summary........................................................... 60
7
Literaturverzeichnis............................................................................ 62
8
Abkürzungen ....................................................................................... 69
1
Einleitung
1.1 Das Immunsystem
1.1.1 Allgemeines
Der Mensch ist durch äußere und innere Schutzbarrieren vor pathogenen Organismen,
denen er jeden Tag ausgesetzt ist, geschützt. Trotzdem wird dieser Schutz häufig
überwunden, was zu einer Gefährdung der Gesundheit führt. Die Auseinandersetzung
mit Eindringlingen obliegt dem Immunsystem. Dieses schützt den Menschen, indem es
Viren, Bakterien und andere Erreger erkennt und beseitigt. Es kann zwischen
körperfremden und körpereigenen Zellen und Substanzen unterscheiden. Doch auch
Fehlentwicklungen körpereigener Zellen, die sich abnorm entwickeln, werden erkannt.
Dies kann die Entstehung eines Tumors oder einer Autoimmunerkrankung verhindern.
Man unterteilt das Immunsystem in eine unspezifische, angeborene Abwehr und in eine
spezifische, erworbene Abwehr. Beide kann man noch einmal in eine zellvermittelte
und eine humorale Abwehr einteilen. Der Begriff „humoral“ bezeichnet die nichtzellulären Anteile des Immunsystems.
Die spezifische Abwehr zeichnet sich dadurch aus, dass sie sich im Laufe des Lebens
immer weiterentwickelt. Nach Auseinandersetzung mit einem Erreger bilden sich, im
Gegensatz zur unspezifischen Abwehr, Gedächtniszellen. Durch diese kann ein Erreger,
mit dem sich der Körper schon früher auseinandergesetzt hat, schnell und effektiv
bekämpft werden. Das erworbene humorale Immunsystem besteht aus den BLymphozyten, die sich zu Plasmazellen entwickeln können, welche dann Antikörper
produzieren und freisetzen.
Die T-Lymphozyten repräsentieren das zellvermittelte erworbene Immunsystem und
unterteilen sich in die CD4-positiven T-Helferzellen (Th1 und Th2) sowie die CD8positiven zytotoxischen T-Zellen. Die Abkürzung CD steht für cluster of differentiation
und bezeichnet bestimmte Oberflächenmoleküle von Zellen, die man zu ihrer
Unterteilung nutzt.
1
1.1.2 Die angeborene Abwehr
Die angeborene Abwehr ist der entwicklungsgeschichtlich ältere Teil unseres
Immunsystems. Die Reaktion auf einen Erreger erfolgt schnell und liegt zeitlich vor der
Reaktion des erworbenen Immunsystems [1]. Dafür ist sie aber unspezifisch. Eine
Gedächtnisbildung, wie sie beim erworbenen Immunsystem vorkommt, findet hier nicht
statt.
Die angeborene Abwehr schützt den Menschen von Geburt an. Zu ihren Bestandteilen
gehören Granulozyten, Makrophagen, natürliche Killerzellen und viele andere Zellen.
Über den MHC-I-Komplex, den alle kernhaltigen Zellen auf ihrer Oberfläche tragen,
können körpereigene Zellen erkannt und bei Entartung oder Infektion eliminiert werden.
Körperfremde Strukturen werden über sogenannte pathogen associated molecular
patterns (PAMP) erkannt [2]. Hierbei handelt es sich um im Laufe der Evolution hochkonservierte Muster von körperfremden Substanzen oder Mikroorganismen. Die
PAMPs sind spezifisch für bestimmte Erregergruppen, nicht für einzelne Erreger. Die
Rezeptoren auf den Abwehrzellen, welche die PAMPs erkennen, nennt man pattern
recognition receptors (PRR). PRRs werden je nach Funktion in verschiedene Gruppen
eingeteilt.
1.1.3 Toll-Like-Rezeptoren
Toll-Like-Rezeptoren (TLR) gehören zu einer der Untergruppen von PRRs, den
signaltransferierenden PRRs. Sie wurden in den 1980er Jahren zuerst bei der
Fruchtfliege Drosophila melanogaster und später beim Menschen entdeckt [3].
TLRs binden, teilweise mit Hilfe von anderen Rezeptoren, zum Beispiel CD14, das
fremde Pattern [4]. Diese Bindung führt über die Aktivierung des NF-κB-Pathways zur
Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen und somit zu einer Immunantwort
(s. 1.1.4) [2].
Heutzutage sind dreizehn TLRs bekannt. Zehn davon konnten beim Menschen
nachgewiesen werden. TLR 11-13 wurden bei Mäusen nachgewiesen [5]. Jeder TLR
kann ein oder mehrere bestimmte Pattern erkennen. Diese Spezifität konnte
nachgewiesen werden [6, 7].
2
Rezeptor
TLR 1
Ligand
Herkunft des Liganden
Triacyl-Lipopeptide
Bakterien
lösliche Faktoren
Neisseria meningitidis
Lipoprotein
verschiedene Pathogene
Peptidoglycane
gram-positive Bakterien
Lipoteichonsäure
gram-positive Bakterien
Zymosan
Pilze
TLR 3
Doppelstrang-DNA
Viren
TLR 4
LPS
gram-negative Bakterien
Fusionsproteine
RSV
TLR 5
Flagellin
Bakterien
TLR 6
Lipoteichonsäure
gram-positive Bakterien
Zymosan
Pilze
TLR 7
Einzelstrang-DNA
Viren
TLR 8
Einzelstrang-DNA
Viren
TLR 9
CpG-haltige DNA
Bakterien und Viren
TLR 10
Noch unbekannt
Noch unbekannt
TLR 2
Tab. 1.1: Toll-Like-Rezeptoren und Liganden, Tab. nach Akira (modifiziert) [8].
Aspergillus fumigatus aktiviert über TLR 2 und 4 die Immunzellen [9, 10].
1.1.4 Signaltransduktion der TLR
Die Signaltransduktion, also der Transport eines Signals von außerhalb der Zelle in den
Zellkern, wird am Beispiel des bakteriellen LPS, eines sehr potenten Bakterientoxins,
erläutert [4, 8, 11]: Die Zelle bindet das LPS-Molekül mit Hilfe des Oberflächenmarkers CD14 an seinen TLR 4 (andere Antigene können auch direkt an den
TLR binden). Daraufhin bindet die intrazelluläre TIR-Domäne (Toll/Interleukin-1Rezeptor) des TLR 4 an das Protein MyD88 (myeloid differentiation factor 88). Dieses
aktiviert über IRAK4 IRAK1. IRAK steht für IL-1-Rezeptor-assoziierte Proteinkinase.
3
An das aktivierte IRAK1 lagert sich TRAF6 an.
TLR
Dieser Komplex, bestehend aus IRAK1 und
TRAF6, löst sich von IRAK4 ab, um mit einem
weiteren Komplex, bestehend aus TAB und
TAK1,
IRAK4
IRAK1
MyD88
UEV1A
UBC13
zu
interagieren.
Dies
führt
zur
Aktivierung zweier κ-Kinasen und zur Bildung
eines Kinasendimers. Letzteres phosphorylliert
TRAF6
TAB2
TAK1
das Protein IκB. Nach seiner Phosphoryllierung
TAB1
löst sich das inhibierende IκB von NFκB. Durch
diese
Freisetzung
wird
die
Inhibition
IKK-γ
IKK-α IKK-β
MAP-Kinasen
aufgehoben,
was
dem
Transkriptionsfaktor
NFκB erlaubt, in den Nukleus vorzudringen, um
IκB
p50 p65
NFκB
dort die Genexpression zu modulieren.
Dieser Signalweg dient nur zur Erklärung. Es
wurden mittlerweile weitere Varianten entdeckt.
NFκB-Bindungs-Sequenz
Zellkernmembran
Abb. 1.1: Die Signaltransduktion der Toll-LikeRezeptoren, Abb. nach Akira (modifiziert) [12]
1.1.5 Monozyten
Monozyten machen ungefähr 2-8% der gesamten Leukozyten aus und entwickeln sich
aus hämatopoietischen Stammzellen aus dem Knochenmark. Sie gehören zu den Zellen
des angeborenen Immunsystems. Monozyten haben einen großen Durchmesser und
einen nierenförmigen Kern. Mit einer Größe bis zu 20 µm sind sie die größten Zellen
unter den Leukozyten [13]. Nach einer kurzen, 1-3tägigen Zirkulationszeit im Blut
wandern die Zellen in die verschiedenen Gewebe aus, wo sie sich zu Makrophagen
differenzieren [14]. Diese interagieren sowohl mit dem angeborenen als auch mit dem
erworbenen Immunsystem. Bei Infektionen werden vermehrt Monozyten produziert
(Monozytose), die Zytokine ausschütten und über die Blutzirkulation zum Ort der
Infektion gelangen [15]. Eine Monozytose kann aber auch Hinweise auf andere,
beispielsweise hämato-onkologische Erkrankungen geben. Eine Reduzierung der
Monozytenanzahl (Monozytopenie) tritt unter anderem bei der aplastischen Anämie auf.
4
Monozyten werden in verschiedene Subtypen unterteilt. Diese Einteilung richtet sich
nach
der
Oberflächenstruktur
der
Zellen.
Der
für
Monozyten
typische
Oberflächenmarker ist CD14, ein anderer für die Unterscheidung wichtiger Marker ist
CD16. Je nach Untergruppe haben Monozyten verschiedene Eigenschaften. Die Zellen
haben die Möglichkeit, in andere Zellen zu differenzieren; so können CD14+CD16-Monozyten zu dendritischen Zellen reifen [14]. Diese Tatsache wurde in der
vorliegenden Arbeit genutzt, indem Monozyten aus Blutproben isoliert und durch
Zugabe bestimmter Zytokine in unreife DCs umgewandelt wurden.
1.1.6 Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DCs) wurden 1973 von Steinmann beschrieben [16]. Er benannte
sie nach ihren baumähnlichen Ausläufern (griech. το δενδρον, dendron). Es handelt sich
bei DCs um antigenpräsentierende Zellen (APCs). Sie entstehen aus plasmazytoiden
oder myeloischen Vorläuferzellen [17]. Von diesen ausgehend differenzieren sie zu
unreifen interstitiellen DCs, Langerhans-Zellen und anderen Zellen, welche vor allem
auf Schleimhäuten, aber auch in der Haut zu finden sind. In dieser Arbeit wurden aus
Monozyten entwickelte DCs (moDCs) untersucht. Durch ihren Einfluss auf andere
Abwehrzellen übernehmen DCs eine wichtige Aufgabe in der Kontrolle des
Immunsystems [18]. Sie spielen eine Rolle in der Verbindung von angeborenem und
erworbenem Immunsystem. DCs sind in der Lage, große Mengen Flüssigkeit zu
absorbieren; so können sie innerhalb einer Stunde ein Volumen ihrer eigenen Größe
aufnehmen [19].
Zunächst liegen DCs in der Peripherie als unreife Zellen (iDCs) vor. Sie sind noch nicht
vollständig in der Lage, T-Zellen zu stimulieren. Das ändert sich nach Antigenkontakt.
Dieser wird über TLRs hergestellt und führt dazu, dass die Zelle Zytokine sezerniert,
die autokrin, also auf die Zelle selbst wirken und so zu einer Reifung der DCs führen
[20]. Eine reife DC (mDC) ist in der Lage, mit Zellen der erworbenen Abwehr zu
kommunizieren. Sie verliert allerdings damit ihre Eigenschaft, Antigene aufzunehmen
[21]. mDCs exprimieren, wie alle antigenpräsentierenden Zellen, MHC-II-Komplexe.
Diese werden zur Interaktion mit T-Zellen benötigt. Außerdem finden sich auf der
Oberfläche der DCs MHC-I-Komplexe, Adhäsionsmoleküle und die wichtigen
kostimulatorischen Moleküle [17].
5
IL-10
Pathogene, Zytokine,
T-Zellen
unreife DC
reife DC
Abb. 1.2: Entwicklung einer unreifen (immature) zu einer reifen (mature) DC nach
Kontakt mit pathogenen Erregern, Zytokinen oder T-Zellen. Diese Reifung wird z. Bsp.
durch IL-10 verhindert. Abbildung in Anlehnung an Banchereau [18]
Im Lymphknoten nehmen mDCs Kontakt zu T-Zellen auf. Die Aktivierung findet in
zwei Phasen statt. Zum einen binden Adhäsionsmoleküle, zum Beispiel ICAM-1 oder
ICAM-2, an bestimmte Rezeptoren der T-Zelle. Zum anderen interagieren der MHC-IIKomplex und der T-Zell-Rezeptor miteinander. Eine wichtige Rolle bei dieser Bindung
spielen die kostimulatorischen Moleküle CD80 sowie CD86 [22]. CD83 ist der
entscheidende Marker für mDCs und sehr wichtig für die Interaktion mit der T-Zelle
[23, 24]. Es gibt aber auch Faktoren, die die Reifung von DCs hemmen, so zum Beispiel
IL-10, aber auch VEGF [25]. Dies spielt eine Rolle bei der verminderten Immunantwort
von DCs bei Tumoren [26]. Als wichtiger Rezeptor für die Erkennung von Pilzen durch
DCs wurde kürzlich Dectin-1 identifiziert [27].
In vitro ist es möglich, aus Monozyten nach Zugabe von GM-CSF und IL-4 DCs reifen
zu lassen [28]. Die Entwicklung zur mDC wird vor allem durch LPS, aber auch durch
andere Toxine gefördert. Auch Zytokine spielen hier wieder eine Rolle. TNF-α fördert
die Reifung, IL-10 hemmt diese [25].
Die Wirkung von Medikamenten auf DCs ist seit längerem Gegenstand der Forschung.
Eine Übersicht über die Wirkung verschiedener Immunsuppressiva auf DCs gibt eine
Arbeit von Abe et al. [29].
6
1.2 Zytokine
1.2.1 Allgemeines
Zytokine sind Proteine, welche diverse Funktionen im Rahmen der angeborenen und
der erworbenen Immunabwehr besitzen. Sie werden von verschiedensten Zellen
sezerniert. Zytokine nehmen Einfluss auf die Kommunikation, aber auch auf die
Differenzierung, das Wachstum und die Aktivierung von Zellen [30].
Zytokine sind sehr vielseitig. Ein Zytokin kann unterschiedliche Reaktionen auslösen
(Pleiotropie) [31]. Diese können auch gegensätzlich sein. So kann ein Zytokin sowohl
pro-inflammatorisch als auch anti-inflammatorisch wirken. Dies hängt unter anderem
von seiner Umgebung ab. Aber auch das Vorhandensein anderer Zytokine beeinflusst
die Wirkung. Für eine bestimmte Reaktion gibt es unter Umständen mehrere Zytokine
(Redundanz) [31]. Um eine optimale Wirkung zu erreichen ist oft ein Synergismus, also
das Zusammenspiel mehrerer Zytokine, vonnöten.
Zu den Zytokinen gehören die Interleukine, Tumornekrosefaktoren, Interferone, colony
stimulating factors (CSF), Wachstumsfaktoren und viele mehr.
1.2.2 Signaltransduktion
Die Signaltransduktion der Zytokine soll hier am Beispiel von IL-12 erläutert werden:
Der Zytokinrezeptor liegt in seiner inaktivierten Form als Monomer vor. Nach Bindung
von IL-12 kommt es zu einer Dimerisierung und anschließenden Phosphoryllierung des
Rezeptors. Die beiden Ketten binden im Zytoplasma je eine JAK-Kinase, im Falle von
IL-12 die beiden Kinasen JAK2 und TYK2, welche ebenfalls phosphorylliert werden.
Der nun entstandene Rezeptor-JAK-Komplex führt zur Phosphoryllierung von zwei
STAT-Molekülen (signal transducer and activator of transcription), die zu einem
Dimer aggregieren und in den Zellkern wandern, um dort die Gentranskription zu
initiieren.
7
Zytokine
γ
β
β
γ
Jak
Ser/Thr
Kinase
Jak
Y
Y-
P
- S
YP
Y PY
-
STAT
STAT
STAT
Y
P
- Y
STAT -
Y
-
P
P
-S
STAT
Y
P
P - Y
STAT
Durch Zytokine induzierbare Gene
TTCNNNGAA
TATA
Abb. 1.3: Signaltransduktion der Zytokine nach Ortmann et al.(modifiziert) [32]
1.2.3 TNF-α
Der Tumornekrosefaktor-alpha wird vor allem von Zellen des mononukleären
Phagozytosesystems (MPS), aber auch von anderen Zellen des Immunsystems
ausgeschüttet. Sein molekulares Gewicht liegt bei ca. 17 kD [2]. Das bakterielle LPS ist
der stärkste Auslöser für eine TNF-α-Ausschüttung. Die Erkennung erfolgt, wie auch
bei A. fumigatus, über TLR 2 und TLR 4. TNF-α wird membrangebunden produziert
und durch das TNF-α-Konversionsenzym in seine lösliche Form umgewandelt [30]. Es
sind zwei Rezeptoren bekannt, TNFR I und TNFR II. An diesen ruft TNF-α ähnliche
Effekte hervor. Seine Ausschüttung ermöglicht zum Beispiel Granulozyten den Austritt
aus den Blutgefäßen in Richtung einer Entzündung. Die Expression der hierfür nötigen
Adhäsionsmoleküle und Selektine wird durch TNF-α erhöht [30].
8
Des Weiteren hat TNF-α Bedeutung bei der Aktivierung von neutrophilen Granulozyten
oder bei der Chemotaxis (Anlocken von Zellen). Neben der antitumorösen hat TNF-α
auch eine pro-inflammatorische Wirkung, welche bei der Sepsis, aber auch
beispielsweise beim Asthma, eine Rolle spielt [30, 33].
1.2.4 Interleukin-12
Wie andere Zytokine auch, wird Interleukin-12 (IL-12) von verschiedenen Zellen
ausgeschüttet, so zum Beispiel von B-Zellen und DCs. Es gibt zwei Untereinheiten, p40
und p35 [30].
Zu den diversen Funktionen von IL-12 gehören neben der Beeinflussung von NKZellen, welche es aktiviert und zur Proliferation stimuliert, die Beeinflussung von
Lymphozyten sowie die Entwicklung von T-Helfer-Zellen nach Antigenkontakt [34].
Außerdem spielt es eine Rolle bei allergischen Erkrankungen.
1.3 Chemokine
1.3.1 Allgemeines
Chemokine sind Peptide, deren Hauptaufgabe die Chemotaxis, also das Anlocken von
Leukozyten und anderen Zellen ist. Produzenten sind vor allem Zellen des MPS und
APCs [35]. Sie zeichnen sich durch Cysteinreste aus, an deren Stellung sich die
Klassifizierung der Chemokine orientiert. Bekannt sind vier Hauptgruppen:
Bei der C-X-C-Untergruppe ist der mittlere Cysteinrest durch eine beliebige
Aminosäure ersetzt. Chemokine, bei denen zwei Reste nebeneinander liegen, gehören
zur C-C-Untergruppe. Die beiden genannten Gruppen machen den Hauptteil der
Chemokine aus. Außerdem existieren noch eine C-Gruppe mit nur einem Cysteinrest
und eine CX3C-Untergruppe, bei der die beiden Reste durch drei Aminosäuren getrennt
werden.
Die
Chemokinrezeptoren
können
durch
die
Interaktion
mit
verschiedenen
Untereinheiten der G-Proteine und auch anderen Rezeptoren unterschiedliche
Signalkaskaden auslösen [36].
9
1.3.2 CCL20/CXCL10
Das in dieser Arbeit auf seine Expression hin getestete CCL20 (Mip-3-α) bindet an den
Chemokinrezeptor CCR6 und spielt eine Rolle bei inflammatorischen und
homöostatischen Prozessen. In einem Mausmodell wurde kürzlich die Bedeutung von
CCR6 bei der Abwehr der invasiven Aspergillose beschrieben [37].
Mezger et al. zeigten, dass CXCL10-Polymorphismen eine Bedeutung bei der
Erkennung einer entstehenden invasiven Aspergillose (IA) haben könnten [38].
1.4 Pilze
1.4.1 Allgemeines
Pilze (Fungi) werden zu den Eukaryonten gezählt. Sie besitzen ein Zytoskelett sowie
einen Zellkern und sind höher entwickelt als Bakterien. Pilze leben saprotroph, das
heißt, sie leben von den sich zersetzenden organischen Stoffen ihrer Umgebung. Sie
gehören damit neben den Bakterien zu den wichtigsten Destruenten. Die Symbiose
zwischen einem Pilz und einer Pflanze bezeichnet man als Mykorrhiza: Der Pilz wächst
an der Wurzel; er liefert der Pflanze wichtige Nährstoffe und wird selber von dieser
ernährt. Pilze spielen eine wichtige Rolle sowohl in der Medizin als auch im
alltäglichen Leben. So wird aus Penicillium notatum das Penicillin gewonnen, aus
Penicillium camemberti hingehen der französische Camembert. Hefepilze finden
Verwendung in der Bier- und Weinherstellung. Vergiftungen mit dem bekannten
„Fliegenpilz“ Amanita muscaria enden oft tödlich. Hautpilze, die Dermatophyten, sind
in der Form von Fußpilz eine der häufigsten Erkrankungen durch Pilze beim Menschen.
Weitere Bedeutung haben Pilze als Halluzinogene und, wie weiter unten beschrieben,
als Krankheitserreger bei immunsupprimierten Menschen.
1.4.2 Die Gattung Aspergillus
Die Gattung Aspergillus gehört zu den Schimmelpilzen. Von ihr sind mehrere hundert
Arten bekannt. Aspergillen kommen ubiquitär vor. Sie sind sogenannte opportunistische
Erreger, das heißt, dass sie für den immunkompetenten Menschen zumeist nicht
10
gefährlich sind. Dies kann sich jedoch bei Störungen des Immunsystems ändern.
Aspergillen können Infektionen und Allergien auslösen. Es können aber auch
Krebserkrankungen wie das Leberzellkarzinom ausgelöst werden. Letzteres entwickelt
sich durch das von A. flavus produzierte Aflatoxin. Der für den immunsupprimierten
Menschen wichtigste Auslöser von invasiven Pilzkrankheiten nach Candida spp., einem
Hefepilz, ist der Schimmelpilz A. fumigatus.
1.4.3 Aspergillus fumigatus
Die Gattung Aspergillus wurde zum ersten Mal 1729 von Micheli beschrieben, die Art
A. fumigatus von Fresenius im Jahr 1863 [39]. A. fumigatus ist ein saprophytischer,
thermophiler Schimmelpilz und spielt eine Rolle bei der Zersetzung von Kohlenstoffen.
Sexuelle Vermehrungsformen sind nicht bekannt; die Verbreitung findet über Konidien
statt, welche durch die Luft transportiert werden [40]. Konidien haben einen
Durchmesser von 2-3 µm und können deshalb über die Atemwege bis in die Alveolen
eindringen.
Abb. 1.4: A. fumigatus-Konidien [41]
11
Abb. 1.5: sporulierende Konidie, entnommen von Latgé [40]
Jeder Mensch atmet mehrere hundert Konidien am Tag ein, welche normalerweise
durch das angeborene Immunsystem
Immuns
eliminiert werden [42].. Bei sehr starker Inhalation
können
allergische
Reaktionen
bis
hin
zur
allergischen
bronchopulmonalen
Aspergillose auftreten [43].
[43] Eine weitere Manifestationsform
tationsform ist das Aspergillom. Bei
immunsupprimierten Patienten kann es durch Ausbreitung der Konidien zum schweren
Krankheitsbild der invasiven Aspergillose kommen. Diese wird in mehr als 90% der
Fälle von A. fumigatus ausgelöst [40]. Ein großes Problem stellt
lt das Vorkommen von
Pilzen in Krankenhäusern dar. Sogar auf Intensivstationen kann A. fumigatus
nachgewiesen werden [44]..
1.4.4 Invasive Aspergillose
Die IA ist eine lebensbedrohliche, schwer zu behandelnde opportunistische Erkrankung.
Sie tritt vor allem bei Patienten
atienten nach Transplantationen und bei TumorTumor sowie HIVPatienten auf,, also bei Menschen, deren Abwehr geschwächt ist [45, 46]. Die
eingeatmeten
Konidien
bilden
in
der
Lunge
ein
Myzel
und
lösen
eine
Aspergilluspneumonie aus. Durch hämatogene Streuung in Niere, ZNS, Herz und
andere Organe breitet sich die IA aus. Die stetige Weiterentwicklung
Weiterentwicklung und häufige Gabe
von Immunsuppressiva hat bis heute die Inzidenz und die Prävalenz der IA stark erhöht
und es ist auch weiterhin damit zu rechnen, dass sich dieser Trend
Tren fortsetzt. Die
Patienten sind einem
em unterschiedlich hohen Erkrankungsrisiko ausgesetzt. Die
Mortalität der IA ist in allen
en Fällen sehr hoch (s. Tab. 1.2).
12
Organ
Inzidenz
Mortalität
Leber
1-8%
87%
Lunge
3-14%
68%
Herz
1-15%
78%
Niere
0-4%
77%
Tab. 1.2: Inzidenz und Mortalität der IA in verschiedenen Organen, Tab. nach Singh
[47]
Trat die IA früher vor allem innerhalb der ersten 90 Tage nach Transplantation auf
(early-onset), wird heute vermehrt von später einsetzenden Infektionen berichtet (lateonset). Dies hängt neben unterschiedlicher Medikation auch vom transplantierten Organ
ab [48]. Solé et al. wiesen einen Zusammenhang zwischen der IA und der Abstoßung
von Lungentransplantaten nach [49]. Bei Stammzelltransplantierten konnte durch den
Einsatz von Wachstumsfaktoren die Dauer der Neutropenie verkürzt werden, so dass
man bei diesen Patienten eine Zunahme von late-onset-IA aufgrund von GvHD und
deren Therapie mit Glucokortikoiden beobachten kann [50]. Das IA-Erkrankungsrisiko
korreliert mit der Dauer der Therapie und der Höhe der täglich verabreichten
Medikamentendosis [51]. Des Weiteren wurde eine starke Zunahme von Aspergillosen
durch andere Pilze als A. fumigatus beobachtet [50].
Entscheidend für eine günstige Prognose der IA ist der schnelle Nachweis von A.
fumigatus. Dieser gestaltet sich jedoch oftmals als sehr schwierig. Antikörpersuchtests
sind erhältlich, aber in ihrer Durchführung problematisch, da das Immunsystem nicht
adäquat funktioniert und somit auch weniger Antikörper gebildet werden können. Eine
neuere Methode der Aspergillusdetektion ist der seit einigen Jahren in Europa
zugelassene Galactomannan-Antigen-Test, dessen klinische Anwendung allerdings
limitiert ist [52, 53]. Ein anderer Ansatz, der seit einigen Jahren erprobt wird, ist der
Nachweis von Pilzgenom durch die quantitative real-time Polymerase Kettenreaktion
(qtPCR). Eine standardisierte, zuverlässige Methode, A. fumigatus nachzuweisen, ist
dringend erforderlich. Einen Überblick über die aktuellen Möglichkeiten und zukünftige
Verfahren geben Einsele et al. [54].
13
1.4.5 Antimykotika
Zur Behandlung der IA stehen nur wenige Medikamente zur Verfügung. Die
Behandlung ist schwierig, langwierig und kostenintensiv. Ein Problem besteht in der
Tatsache, dass die IA meistens erst sehr spät entdeckt wird. Ein bekanntes Medikament
ist das seit langem eingesetzte Amphotericin B, welches an das Ergosterin in der
Pilzwand bindet und diese auflöst. Aufgrund der Ähnlichkeit mit menschlichen
Proteinen ist die Behandlung mit Amphotericin B sehr nebenwirkungsreich [55, 56].
Die Therapie spricht je nach Grunderkrankung außerdem sehr unterschiedlich an [57].
Eine andere Wirkstoffgruppe sind die Azole, welche über eine Synthesehemmung des
Ergosterins den Pilz schädigen. Als Beispiel seien hier Voriconazol und Posaconazol
genannt [58, 59]. Aus der Gruppe der Echinokandine kann auf Caspofungin
zurückgegriffen werden. Da es die Pilze an anderer Stelle angreift, kann es gut mit
Azolen kombiniert werden [60]. Die bei der Behandlung bakteriell verursachter
Krankheiten gefürchtete Entwicklung von Resistenzen ist bei Pilzkrankheiten nicht so
häufig.
1.5 Verwendete Medikamente
1.5.1 Mycophenolat
MMF
MPA
Abb. 1.6: Strukturformeln von Mycophenolatmofetil (MMF) und
Mycophenolsäure (MPA) [61]
14
Mycophenolsäure
(MPA,
C17H20O6;
Mr
=
320,3)
wurde
ursprünglich
aus
Penicilliumarten gewonnen und war als Antibiotikum gedacht. Erst später entdeckte
man seine immunsupprimierende Wirkung [62]. Um die Bioverfügbarkeit im Körper zu
erhöhen, wird MPA als Mycophenolatmofetil (MMF), eine sogenannte Prodrug,
verabreicht [63]. MMF wird relativ rasch im Körper zu MPA umgewandelt. MPA ist
ein reversibler, selektiver und nicht-kompetitiver Hemmer der InosinmonophosphatDehydrogenase (IMPDH) [64]. Diese Hemmung führt zu einer Verminderung der denovo-Purin-Synthese, auf welche vor allem Lymphozyten angewiesen sind [63]. Purine
sind DNA-Bausteine und damit für die Lymphozyten überlebenswichtig. Dies erklärt
die Hemmung der Lymphozyten. Der Patient ist in der Folge immunsupprimiert. So
lässt sich die Rate an Abstoßungen nach Organtransplantationen senken, da das
Immunsystem das fremde Organ nicht als fremd erkennt. Der Patient ist aber aufgrund
seiner reduzierten Abwehr anfällig für Infektionen. MMF wird vor allem nach Nieren-,
Herz- und Lebertransplantation in Kombination mit anderen Immunsuppressiva, wie
zum Beispiel Ciclosporin, gegeben. Es findet aber auch in der Behandlung von
Hautkrankheiten Verwendung [65, 66].
Bekannte Nebenwirkungen sind Durchfälle, Übelkeit, Blutbildungsstörungen und das
Auftreten opportunistischer Erkrankungen, wie der invasiven Aspergillose [64]. Es
wurde jedoch auch beschrieben, dass MMF inflammatorische Syndrome auslösen kann,
die allerdings nach Absetzen des Medikaments wieder sistieren [67].
1.5.2 Everolimus (RAD)
Abb. 1.7: Strukturformel von RAD [68]
15
Everolimus (M: 958,25, C53H83NO14 ) ist ein Derivat von Rapamycin (RAPA), das von
der Actinomyces-Art Streptomyces hygroscopicus produziert wird [69]. Everolimus hat
im
Vergleich
Bioverfügbarkeit
zu
RAPA
eine
bessere
Pharmakokinetik
[70]. Beide Medikamente
inhibieren
und
den
eine
erhöhte
mTOR-Signalweg
(mammalian Target Of Rapamycin) [71]. Dieser Signalweg spielt eine wichtige Rolle
bei der Regulation des Zellzyklus‘. Die Aktivierung von mTOR führt die Zelle von der
G1- in die S-Phase [72]. RAD inhibiert diesen Signalweg. Dies führt zu einer
Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung. Everolimus wird – ebenso wie MMF - zur
Vermeidung von Organabstoßungen vor allem nach Nieren- und Herztransplantation
zusammen mit anderen Immunsuppressiva eingesetzt [73]. Die Nebenwirkungen sind
ähnlich denen des MMF.
1.6 Zielsetzung
Seit einigen Jahren gibt es Bestrebungen, DCs als Impfstoffe gegen diverse
Erkrankungen, darunter auch die IA, einzusetzen. Hierbei muss jedoch gewährleistet
sein, dass diese Zellen auch unter einer immunsuppressiven Therapie des Patienten im
Stande sind, eine Immunantwort auszulösen. Mit Hinblick auf diese Problematik und
auf die Tatsache, dass noch immer wenig über die Wirkung von Medikamenten auf DCs
bekannt ist, war das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von MPA und RAD auf DCs
bezüglich
ihrer
Differenzierung
aus
Monozyten
sowie
ihrer
Reifung
und
Zytokinantwort nach Kontakt mit A. fumigatus zu untersuchen.
Hierfür sollte zum einen die Zytokinexpression von DCs untersucht werden, nachdem
diese über verschiedene Zeiträume mit dem Medikament kultiviert und im Anschluss
daran durch den Zusatz von A. fumigatus-Keimschläuchen stimuliert wurden. Zum
anderen sollten mittels durchflusszytometrischer Experimente Effekte auf die
Entwicklung und Reifung der Zellen untersucht werden, indem iDCs und mDCs gezielt
auf bestimmte Oberflächenmarker hin untersucht wurden.
16
2
Der
Material
folgende
Abschnitt
enthält
eine
Auflistung
der
verwendeten
Geräte,
Labormaterialien, Kits, Reagenzien, Lösungen, Medien, Immunsuppressiva, Primer,
Sonden und Antikörper.
2.1 Geräte
Gerät
Bezeichnung
Hersteller
Brutschrank
Heraeus BBD 6220
Thermo/Kendro
FACS-Gerät
FACS Calibur
Becton Dickinson
Gefrierschränke
-20 °C / -80 °C
Liebherr / Heraeus
LightCycler Instrument
Light Cycler 1.5
Roche GmbH
MACS Magnete
Separation Columns LS
Miltenyi Biotec
Mikroskope
Eclipse 50i und TS100
Nikon
Pipetten
Reference
Eppendorf
(2,5 µl, 10 µl, 100 µl, 1000 µl)
Pipettierhilfe
Pipetus-Akku
Hirschmann
Präzisionswaage
GF-200
A & D Instruments
Sterilbank
Herasafe HS18
Thermo/Kendro
Ultrazentrifuge
Sorvall Discovery 90 SE
Sorvall
Vortexer
MS1 Minishaker
IKA-Works, Inc.
Wasserbad
Memmert WB7
Memmert
Zentrifuge
Centrifuge 5415D und 5415R
Eppendorf Thermo/
Multifuge 3S und 3S-R
Kendro
Tab. 2.1: Geräteliste
17
2.2 Verbrauchsmaterialien
2.2.1 Labormaterialien
Labormaterial
Kennzeichen
Hersteller
FACS-Röhrchen
5 ml, 12 x 75 mm
Becton Dickinson
LightCycler Glaskapillaren
Roche GmbH
MACS-Trennsäulen
LS
Miltenyi Biotec
MT-Platten
6 Well / 24 Well / 96 Well
Hartenstein
Objektträger
Hartenstein
Pasteurpipetten
einzeln steril verpackt
Hartenstein
Pipettenspitzen
10 µl, 100 µl, 1000 µl
Zentrallager
Reaktionsgefäße
0,5 ml / 1,5 ml / 2 ml Tubes
Hartenstein
15 ml / 50 ml Falcontubes
25 cm2, 75 cm2, 175 cm2
Zellkulturflaschen
Hartenstein
Tab. 2.2: Liste der verwendeten Labormaterialien
2.2.2 Kits
Kit
Hersteller
Light Cycler FastStart DNA Master Hybridization Probes
Roche GmbH
QIAshredder
QIAGEN
Quantitect Reverse Transcription Kit
QIAGEN
RNeasy Mini Kit
QIAGEN
Tab. 2.3: Auflistung der eingesetzten Kits
2.2.3 Medien
Medium
Einzelkomponenten
RPMI-Medium (komplett)
500 ml RPMI 1640, 10% FCS
1,5 ml Refobacin
Tab. 2.4: Verwendete Medien
18
2.2.4 Reagenzien
Reagenz
Hersteller
Dextran
Sigma
EDTA
Sigma
Ethanol 100 %
Roth
Ethidiumbromid
Sigma
FACS-Flow
Becton Dickinson
FACS-Rinse
Becton Dickinson
FACS-Safe
Becton Dickinson
FCS
Sigma
FICOLL
Biochrom AG
FITC
Sigma
Gentamycinsulfat (Refobacin® 80 mg)
Merck
HBSS Hanks’ Balanced Salt (1x)
GIBCO, Invitrogen Corp.
LPS (ultrarein)
Sigma / Invivogen
PBS (10x)
Sigma
RPMI 1640 Medium (+ Glutamaxx)
GIBCO, Invitrogen Corp.
Trypanblau 0,4 %
Sigma
β-Mercaptoethanol
Sigma
Tab. 2.5: Reagenzienliste
2.2.5 Zytokine und Immunsuppressiva
Klinische Immunsuppressiva/ Zytokine
Stammlösung
Hersteller
GM-CSF (Leukine)
250 µg/ml Hanks
Berlex
Interleukin 4
10 µg/ml Hanks
R&D Systems
Mycophenolat
1 mg/ml Hanks
Novartis
1 mg/ml 100% Ethanol
Novartis
Everolimus , (RAD 40-O-(2hydroxyethyl-9-rapamycin)
Tab. 2.6: Zytokin- und Immunsuppressivaliste
19
2.2.6 Primer
Gen
Primer
Sequenz (5’-3’)
IL-12p40
IL-12 F
CTC GTG GCC ATA TGG GAA C
IL-12 R
TGG CCA GCA TCT CCA AAC T
SCYB10 F
ACG TGT TGA GAT CAT TGC TAC AA
SCYB10 R
GAT TTT GCT CCC CTC TGG T
TNF-α F
GGC GTT TGG GAA GGT TGG AT
TNF-α R
CTC TGG CCC AGG CAG TCA GA
h-Alas F
AAT GAG TCG CCA CCC ACG
h-Alas R
CAG CTC CCG CTC TAA GTC CA
MIP-3α F
CTG TCT TGG ATA CAC AGA CCG TA
MIP-3α R
GGT TCT TTC TGT TCT TGG GCT A
IFN-γ F
GCA TCC AAA AGA GTG TGG AG
IFN-γ R
GCA GGC AGG ACA ACC ATT AC
SCYB10
TNF-α
h-Alas
MIP-3α
IFN-γ
Tab. 2.7: Primer der Fa. TIB MOLBIOL (Berlin)
2.2.7 Sonden
Gen
Sonde
Sequenz (5’-3’)
IL-12p40
IL-12 FL
GGT CCT CAC CTG TGA CAC CCC TGA
IL-12 LC
AAG ATG GTA TCA CCT GGA CCT TGG ACC
SCYB10 FL
AGT AAA TTC TTG ATG GCC TTC GAT TCT
SCYB10 LC
GAT TCA GAC ATC TCT TCT CAC CCT TCT
SCYB10
TTT
TNF-α
h-Alas
MIP-3α
IFN-γ
TNF-α FL
GCA TTG GCC CGG CGG TTC
TNF-α LC
CCA CTG GAG CTG CCC CTC AGC T
h-Alas FL
CCT GCC CCA GCA CCA TGT TGT TTC
h-Alas LC
GTG TCC ATA ACT GCC CCA CAC ACC
MIP-3α FL
GTT GTC TGT GTG CGC AAA TCC AAA
MIP-3α LC
CAG ACT TGG GTG AAA TAT ATT GTG CGT C
IFN-γ FL
TCC AAC GCA AAG CAA TAC ATG AAC TC
IFN-γ LC
TCC AAG TGA TGG CTG AAC TGT CG
Tab. 2.8.: Sonden der Fa. TIB MOLBIOL (Berlin)
20
2.2.8 Antikörper
FACS Antikörper
Konjugation
Herkunft
Verdünnung
IgG1 Isotypkontrolle
PE
Maus
2,5 µl / 1x106
(Becton Dickinson)
Zellen
IgG2a Isotypkontrolle
FITC
(Becton Dickinson)
IgG2a Isotypkontrolle
PE
(Becton Dickinson)
α-CD1a IgG2a (DakoCytomation)
FITC
α-CD14 IgG2a (Becton Dickinson)
FITC
α-CD40 IgG1 (Immunotech)
PE
α-CD80 IgG1 (Becton Dickinson)
PE
α-CD83 IgG1 (Becton Dickinson)
PE
α-CD86 IgG1 (Becton Dickinson)
PE
Primäre Antikörper
α-CD14 (Miltenyi)
Konjugation
Herkunft
Verdünnung
Microbeads
Maus
100 µl / 1x108 PBMCs
Tab. 2.9: Auflistung der verwendeten Antikörper unter Angabe der Konjugation, der
Herkunft und der eingesetzten Verdünnung
21
3
Methoden
3.1 Gewinnung dendritischer Zellen
Die beschriebenen Zellen wurden bei 37,0 °C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit im
Brutschrank inkubiert.
3.1.1 Isolierung von Monozyten
Zur Gewinnung mononukleärer Zellen, sogenannter peripheral blood mononuclear cells
(PBMCs), wurden Buffy Coats der Blutbank Frankfurt genutzt. Die Zellen für den
Phagozytoseassay wurden aus sogenannten „Zapfen“ gewonnen, die vom Institut für
Klinische Transfusionsmedizin und Hämotherapie des Universitätsklinikums Würzburg
bezogen wurden. Hierbei handelt es sich um leukoreduction system chambers (LRSC)
– Leukozytenreduktionssysteme –, mit deren Hilfe Leukozyten aus dem Blut gefiltert
werden. Das Blutprodukt wurde in einem 200 ml Zellkulturgefäß mit HBSS auf 150 ml
aufgefüllt und vermischt. Je 25 ml davon wurden vorsichtig auf mit 20 ml Ficolllösung
befüllte 50 ml-Falconröhrchen geschichtet und 20 min bei 2000 rpm ohne Bremse
zentrifugiert. Durch den Dichtegradienten wanderten Erythrozyten und andere Zellen
zum Boden des Gefäßes und in der Interphase sammelten sich die PBMCs. Diese
wurden dann mittels einer Pasteurpipette abpipettiert und in einem neuen 50 mlFalconröhrchen gesammelt, auf 50 ml mit HBSS aufgefüllt und für 10 min bei 1300
rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, das Pellet aufgeschüttelt und mit
HBSS auf 20 ml aufgefüllt. Nach gründlichem Mischen wurden die Zellen im
Verhältnis 1:20 verdünnt und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt (s. Abb. 3.1).
Nach einer weiteren zehnminütigen Zentrifugation bei 1300 rpm wurde das Pellet mit
HBSS aufgefüllt und so auf neue Falconröhrchen verteilt, dass sich in jedem Röhrchen
nach Zugabe von 850 µl Suspension 1,5 x 108 Zellen befanden.
Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte mittels einer Neubauer-Zählkammer. Auf diesem
Objektträger sind 9 mm² große Zählnetze eingraviert. Jedes Netz ist in neun 1 x 1 mm
große Quadrate unterteilt. Jedes dieser Quadrate ist wiederum aus sechzehn
22
0,25 x 0,25 mm großen Quadraten zusammengesetzt. Dies ermöglicht einen einfacheren
Zählvorgang unter dem Mikroskop.
Um nur lebende Zellen zu erfassen,
erfassen wurde Trypanblau verwendet. Dieser Stoff wird von
lebenden Zellen nicht aufgenommen und zeigt somit nur abgestorbene Zellen an.
Die Zellen wurden in einer 1:20 Verdünnung gezählt. Zu diesem Zweck musste
zunächst der Zellaliquot mit HBSS
H
1:10 und anschließend 1:2 mit Trypanblau verdünnt
werden.
Die Gesamtzellzahl errechnet sich aus der gezählten Zellzahl, der Gesamtzellzahl
Gesamtzellza der
Zellsuspension, der 1:20-Verdünnung
Verdünnung sowie der Kammertiefe. Die Kammertiefe beträgt
0,1 mm. Somit ergibt sich bei einem 1 x 1 mm großen Quadrat ein Volumen von
1/104 ml. Also lautet die Formel für die Gesamtzellzahl:
Gesamtzahl = Zellzahl x 104 x Gesamtvolumen x 20
Abb. 3.1: Neubauer – Zählkammer [74]
Zur Isolierung von Monozyten wurden CD14-selektive
CD14 selektive Microbeads benutzt. Es handelt
sich dabei um Antikörper, die das für Monozyten charakteristische CD14CD14
Oberflächenmolekül binden. Die Antikörper
Antikörper sind mit kleinen Metallelementen, den
Microbeads, konjugiert. Durch Filterung in einer magnetischen MACS-Trennsäule,
MACS
an
der die Microbeads – mit den an ihnen gebundenen Zellen – haften bleiben, sollen die
antikörperbehafteten Monozyten von den anderen
anderen Zellen getrennt werden.
23
Nach Zugabe von 150 µl CD14-selektiven Microbeads zu den 850 µl Zellsuspension
und
einer
fünfzehnminütigen
Inkubationszeit
im
Kühlschrank
wurden
die
Falconröhrchen mit HBSS/FCS/EDTA auf 20 ml aufgefüllt und 10 min bei 1300 rpm
zentrifugiert. Währenddessen wurden die magnetischen Trennsäulen aufgebaut und mit
3 ml HBSS/FCS/EDTA vorgespült.
Die Pellets wurden in je 2 ml HBSS/FCS/EDTA gelöst, auf die Säulen gegeben und je
dreimal mit 3 ml HBSS/FCS/EDTA gespült. Im Anschluss daran wurden die
Trennsäulen aus dem Magneten genommen und der Inhalt mit je 2 ml
HBSS/FCS/EDTA in ein 20 ml-Falconröhrchen gepresst.
Es folgte eine Zählung der Zellen bei 1:20-Verdünnung und eine weitere zehnminütige
Zentrifugation bei 1300 rpm. In einem weiteren Arbeitsschritt wurden dann je 2,5 x 106
Zellen pro Well auf 6-Well-Mikrotiterplatten pipettiert. Als Lösung diente RPMI, das
mit Refobacin und 10 % FCS angereichert war.
3.1.2 Reifung der dendritischen Zellen
Die Möglichkeit, mit Hilfe bestimmter Zytokine Monozyten zu DCs differenzieren zu
lassen, wurde von verschiedenen Autoren beschrieben [24, 75].
Als Wachstumsfaktoren wurden 6 µl IL-4/Well und 1,2 µl GM-CSF/Well hinzugefügt.
Je nach Versuchsaufbau wurden den Zellen die Immunsuppressiva Mycophenolat
(MPA) oder Everolimus (RAD) hinzugefügt. Da RAD in Ethanol gelöst ist, musste bei
den RAD-Versuchen den Zellen ohne Medikament Ethanol in derselben Konzentration
wie RAD gegeben werden, um einen Einfluss des Ethanols auszuschließen.
Danach wurden die Wellplatten in den Brutschrank gestellt. Um den Verbrauch der
Zellen an Medium und Zytokinen auszugleichen, wurde nach zwei bzw. fünf Tagen je
ein Milliliter Medium pro Well entfernt und im Anschluss zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert. Daraufhin wurde das Pellet mit frischem Medium und - je nach
Versuchsaufbau - frischem Immunsuppressivum vermischt und wieder in die Wells
gegeben. Außerdem wurde die Zytokinkonzentration erhöht, indem zu dem einen
Milliliter neuen Mediums die Zytokinkonzentration für drei Milliliter hinzugefügt
wurde.
24
3.1.3 Nachweis der dendritischen Zellen
Zum Nachweis, dass es sich bei den Versuchen tatsächlich um DCs handelte, wurde
eine
FACS-Analyse
gemacht,
mit
dem
Ziel,
die
Zellen
auf
spezifische
Oberflächenmarker hin zu untersuchen (s. 4.2.1).
3.1.4 Infektion der DCs mit A. fumigatus-Keimschläuchen
Am Tag der RNA-Isolation wurden die Zellen von den 6-Well-Platten mit Hilfe eines
Zellschabers geerntet. Um möglichst viele Zellen zu gewinnen, wurden die Wells mit
HBSS ausgespült. Nach Zentrifugation (10 min, 1300 rpm) wurden die Zellen bei 1:2Verdünnung (mit Trypanblau) in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Auf eine 24-WellPlatte wurden nun in jedes Well 1 x 106 in 1 ml RPMI/FCS gelöste Zellen pipettiert.
Zusätzlich wurden Zytokine und Immunsuppressiva hinzugefügt. Der Versuchsaufbau
war so gewählt worden, dass eine dreifache Bestimmung jedes Ansatzes möglich war:
kein Zusatz
MPA/RAD
A.fumigatus-KS
MPA/RAD
+ A.fumigatus-KS
Abb. 3.2: Versuchsaufbau
Nachdem den entsprechenden Wells je 1 x 106 A. fumigatus-Keimschläuche zugefügt
worden waren, wurden sie für sechs Stunden im Brutschrank inkubiert. Danach wurden
die zwölf Zellsuspensionen in je ein Eppendorf-Falcon pipettiert und bei 5400 rpm für 5
min zentrifugiert. Der Überstand konnte nun abpipettiert und zur weiteren Analyse bei
-20 °C eingefroren werden.
25
3.2 Untersuchung
der
Zytokinexpression
dendritischer
Zellen
3.2.1 Isolierung der Total-RNA
Die Isolierung der Total-RNA erfolgte unter Verwendung der Kits QIAshredder und
RNeasy der Fa. QIAGEN.
Die Zellen wurden in Tubes aufgenommen und bei 5400 rpm für 5 min zentrifugiert.
Der Überstand wurde eingefroren, das Pellet in 350 µl RLT-Puffer gelöst und mit dem
Vortex vermischt, in die QIAshredder-Tubes (lila) überführt und 2 min bei 13200 rpm
zentrifugiert. Dieser Schritt wird benötigt um die Zellen zu lysieren. Dem Überstand
wurden 350 µl Ethanol (70%) beigemengt, die Mischung in die RNeasy-Tubes (rosa)
pipettiert und 15 sec bei 10000 rpm zentrifugiert. Hierbei lagert sich die RNA in den
rosa Tubes ab und muss danach gewaschen werden. Dies erfolgte durch Zugabe von
700 µl RW-1 und 500 µl RPE, jeweils gefolgt von einer Zentrifugation bei 10000 rpm
für 15 sec. Nach einer weiteren Spülung mit 500 µl RPE wurden die Tubes bei 10000
rpm für eine Minute zentrifugiert. Die Eluierung der RNA in ein neues Tube erfolgte
durch Zugabe von 35 µl Wasser und einminütiges Zentrifugieren bei 10000 rpm. Die
RNA wurde entweder sofort auf ihre Konzentration untersucht oder zunächst bei -80 °C
eingefroren.
3.2.2 Untersuchung der RNA-Konzentration
Die RNA wurde im NanoDrop Spectrophotometer untersucht. RNA hat ein
Absorptionsmaximum von 260 nm. Zur Konzentrationsbestimmung wurden 2 µl RNA
je zweimal bestimmt und für die weitere Verwendung die Mittelwerte errechnet.
3.2.3 Umschreibung von RNA in cDNA
Die weitere Analyse der Genexpression erfolgte anhand von DNA. Deshalb musste die
entstandene RNA mittels des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) in cDNA (copy
DNA) umgeschrieben werden. Hierfür wurde das QuantiTect Reverse Transcription Kit
von QIAGEN verwendet. Neben dem Enzym enthält dieses auch Primer und
Nukleotide. Die Primer lagern sich der RNA an und dienen der RT als Startsequenzen.
26
Unter Verwendung der DNA-Nukleotide wird doppelsträngige cDNA gebildet. Um
sicherzugehen, dass vor dem Umschreibevorgang alle genomische DNA eliminiert
wird, muss man einen sogenannten DNA-Verdau durchführen. Den 500 ng RNA in 12
µl Wasser wurden 2 µl gDNA Wipeout Buffer hinzugefügt und das Ganze für 4 min bei
42 °C inkubiert. Die in dem Wipeout Buffer enthaltene DNase verdaut die noch
vorhandene DNA. Nach der Inkubationszeit wurde der Mastermix pipettiert und für 25
min bei 42 °C inkubiert.
Reagenz
Volumen
Quantiscript Reverse Transcriptase
1 µl
Quantiscript RT Buffer
4 µl
RT Primer Mix
1 µl
Tab. 3.1: Mastermix
Durch Erhitzen auf 95 °C für 3 min wurde die RT inaktiviert. Die cDNA wurde bei
-20 °C gelagert.
Als Negativkontrolle diente ein Tube, dem H2O statt der RT zugefügt wurde.
3.2.4 Quantitative Real-Time PCR
Diese relativ neue Technik erlaubt die rasche Quantifizierung von DNA-Produkten. Sie
beruht auf der von K. B. Mullis 1983 entwickelten Polymerase-Kettenreaktion
(polymerase chain reaction, PCR). Diese erlaubt die künstliche Vervielfältigung von
DNA in mehreren Zyklen durch Verwendung der thermostabilen Taq-Polymerase
(Thermus aquaticus). Mit der qrt-PCR kann man durch Messen der Fluoreszenz
während jedes Zyklus’ – daher der Name real-time (Echtzeit) – die DNA quantitativ
bestimmen. Je höher die detektierte Fluoreszenz, desto mehr DNA-Produkt liegt vor.
Zur Messung der Fluoreszenz gibt es verschiedene Möglichkeiten. Hier wurden der
LightCycler der Fa. Roche und die dafür erforderlichen LightCycler-Sonden verwendet.
Je zwei für das zu untersuchende DNA-Produkt spezifische Sonden werden mit
Fluorescein und LC Red 640 gefärbt. Nur wenn beide Sonden in einem bestimmten
Abstand voneinander, nämlich ein bis fünf Nukleotide, an das DNA-Amplifikat binden,
27
kommt es zum sogenannten fluorescence resonance energy transfer (FRET).
Fluorescein wird angeregt und transferiert die Energie über den FRET auf LC Red 640.
Hierbei emittiert LC Red 640 ein rotes Licht, welches einmal pro Zyklus vom Gerät
detektiert wird. Dies geschieht in der Phase des Annealings, in der sich die Primer an
die DNA-Sequenzen anlagern. Primer und ungebundene Sonden werden nicht erfasst.
Annealing
Detektion
470 nm
5 bp
Einzelstrang-DNA
Anregung
470 nm
Detektion
Fluorescein
LC-Red
5 bp
Einzelstrang-DNA
470 nm
Elongation
Fluorescein
Taq-Pol
Detektion
5 bp
Einzelstrang-DNA
Abb. 3.3: Vorgang des FRET bei der qrt-PCR, nach [76], (modifiziert)
Die PCR wurde mit dem LightCycler FastStart DNA Master HybrProbe Kit der Fa.
Roche durchgeführt. Die hierin enthaltene Taq-Polymerase wurde vor ihrer
Verwendung mit 60 µl Reaktionspuffer aktiviert. In den Kapillaren wurden jeweils
18 µl Mastermix mit 2 µl Proben-cDNA bzw. 2 µl H2O als Negativkontrolle gemischt.
Reagenz
Volumen
H2O (PCR-grade)
11,6 µl
MgCl2
2,4 µl
je Primer
0,5 µl
je Sonde
0,5 µl
Taq-Polymerase
2,0 µl
Tab. 3.2: Mastermix für die qRT-PCR im LightCycler
28
Die Kapillaren wurden für 5 sec bei 2000 rpm zentrifugiert und in das LightCyclerKarussel gesetzt. Anschließend lief die PCR unter folgenden Bedingungen ab:
Schritt
Zyklen
Temperatur
Zeit
Denaturierung
1
95 °C
10 min
Amplifikation
55
95 °C
9 sec
54 °C
15 sec
72 °C
20 sec
40 °C
5 sec
Kühlen
1
Tab. 3.3: PCR-Bedingungen für die qRT-PCR
Um die Ergebnisse vergleichbar zu machen, wurde das housekeeping-Gen h-Alas
verwendet. h-Alas kodiert für die δ-Aminolaevulinsäure und wird unabhängig von
Zelltyp und äußeren Einflüssen exprimiert. Gleichzeitig sagen die h-Alas-Werte auch
etwas über die Qualität der Experimente aus. Sie sollten bei allen Proben den gleichen
Wert haben (Abb. 3.4).
Crossing Points h-Alas
100
10
I
II
III
IV
Abb. 3.4: Crossing Points von h-Alas (hier aus einem Versuch mit MPA)
Um die Ergebnisse zu normalisieren wurden Crossing Points (Cp) errechnet. Diese
zeigen an, wann das Fluoreszenzsignal signifikant steigt, und geben somit Auskunft
über die ursprüngliche DNA-Menge.
29
44
42
40
38
Cycle Number
36
34
32
30
28
26
24
22
20
-1
0
1
2
3
4
5
6
Log Concentration
Abb. 3.5: Zusammenhang zwischen Crossing Points und Konzentration [77]
Die Normalisierung erfolgte mit folgender Formel nach Johnson und Krauter [78, 79]:
Normalisierter Wert = 2 (CP h-Alas – CP Zielgen)
Dieser Wert wurde mit 100% festgelegt, um Vergleiche mit anderen Werten zu
ermöglichen.
3.3 Durchflusszytometrische Untersuchungen an
dendritischen Zellen
3.3.1 Durchflusszytometrie
Dieses Verfahren, auch FACS (fluorescence activated cell sorting) genannt, wurde
1976 von Herzenberg beschrieben [80]. Es erlaubt das rasche Bestimmen verschiedener
Zellen und ihrer Oberflächenmarker. Die Zellen werden, durch eine Kapillare fließend,
einzeln von einem Laserstrahl erfasst. Dieser misst das Vorwärtsstreulicht (forward
scatter) und das Seitwärtsstreulicht (sideward scatter) der Zelle. Ersteres erlaubt die
Auftrennung nach Zellgröße, Letzteres nach Zellgranularität, also dem Zellinhalt.
Zusätzlich kann man verschiedene Antikörper gegen CD-Oberflächenmarker mit
Farbstoffen anfärben. Diese werden dann, soweit auf der Zelle vorhanden, von anderen
Lasern erfasst. Dies erlaubt eine weitere Klassifizierung der untersuchten Zelle.
30
Abb. 3.6: Prinzip der Durchflusszytometrie, nach [81], (modifiziert)
3.3.2 Vorbereitung der Zellen für die FACS-Untersuchung
Die Zellsuspension wurde aus den 6-Well-Platten in je ein FACS-Röhrchen pipettiert
und 10 min bei 1300 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Nach der
Zugabe von 500 µl HBSS/FCS wurde das Gemisch auf vier weitere FACS-Röhrchen
verteilt, so dass nun fünf Röhrchen à 100 µl vorlagen. In diese wurden je 1,5 µl
Antikörper pipettiert. Danach wurde der Inhalt gevortext und 20 min auf Eis gestellt. In
einem weiteren Spülschritt wurde nach Zugabe von 1 ml HBSS/FCS erneut wie oben
beschrieben zentrifugiert. Nach Abpipettierung des Überstandes wurden wiederum
250 µl HBSS/FCS pro Röhrchen zugegeben. Anschließend erfolgte die Untersuchung
im FACS.
3.3.3 Untersuchte Antikörper
Die zu untersuchenden Antikörper waren mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) oder PE
(Phycoerythrin) konjugiert. Untersucht wurden folgende Antikörper:
CD1a (FITC), CD83 (PE),
CD14 (FITC), CD80 (PE),
CD40 (PE), CD86 (PE).
Die Isotypenkontrolle erfolgte mit 2aFITC und 1PE.
31
3.3.4 FITC-Dextran-Assay
Die Zellen wurden auf sechs Ansätze verteilt und über sieben Tage gereift:
1.
ohne Zusatz
2.
mit Ethanol
3.
10 µM MPA
4.
1 µM MPA
5.
0,1 µM RAD
6.
0,01 µM RAD
Im Anschluss wurden die DCs geerntet, in sterilen FACS-Tubes gewaschen, in einem
Milliliter resuspendiert und gezählt. Die sechs Ansätze wurden jeweils wieder in drei
Ansätze unterteilt:
I.
negative Kontrolle bei 37 °C im Brutschrank, 5% CO2
II.
Inkubation bei 4 °C
III.
Inkubation bei 37 °C im Brutschrank, 5% CO2
Jedem FACS-Tube wurden 1 x 105 DCs zugefügt und diese mit je 100 µl des zuvor
aufgehobenen Mediums aufgefüllt. Um die erforderlichen Temperaturen der einzelnen
Ansätze zu garantieren, wurden die Ansätze I und III im Brutschrank und der Ansatz II
bei 4 °C im Kühlschrank für 1,5 Stunden vorinkubiert. Den Ansätzen II und III wurden
im Anschluss daran je 4 µM FITC-Dextran zupipettiert. Daran schloss sich eine weitere
einstündige Inkubation an. Es folgten drei Waschschritte und die anschließende FACSAnalyse der in 150 µl HBSS gelösten Zellen. Die Waschschritte erfolgten unter
Wahrung der erforderlichen Temperaturen.
3.4 Statistik
Die Versuche mit Mycophenolat und RAD über 6 Stunden, zwei Tage und über vier
Tage wurden mit zwei Spendern durchgeführt, ebenso die FACS-Analysen ohne
Pilzzusatz. Sowohl die Versuche mit Mycophenolat über sieben Tage als auch die
32
FACS-Analysen mit A. fumigatus und die FITC-Dextran-Assays wurden mit je drei
Spendern durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen errechneten sich aus
den bekannten Formeln. Jeder Einzelversuch wurde dreifach bestimmt und der
Mittelwert aus zwei von drei Ergebnissen errechnet. Jeder Versuch wird in Kapitel 4
exemplarisch anhand der Grafik eines Spenders oder als Diagramm nach Errechnung
der Mittelwerte aller drei Spender dargestellt.
33
4
Ergebnisse
Da die Expression einzelner Zytokine von Spender zu Spender stark variiert, werden im
folgenden Abschnitt jeweils exemplarisch Abbildungen einzelner Versuche gezeigt.
Aus diesem Grund beziehen sich Durchschnittswerte auf prozentuale und nicht auf
absolute Werte.
4.1 Zytokinexpression dendritischer Zellen unter der
Wirkung von Mycophenolat
Zur Generierung der erforderlichen Monozyten wurde jeweils ein Buffy Coat der
Blutbank Frankfurt bestellt. Nach Separation durch Ficoll-Gradienten konnten mit Hilfe
von CD14-Microbeads und einer Magnetsäule Monozyten selektiert und in ein Medium
überführt werden. Durch anschließende Gabe von GM-CSF und IL-4 in steigender
Konzentration wurden die Monozyten über sieben Tage zu DCs differenziert und im
Anschluss für sechs Stunden mit A. fumigatus-Keimschläuchen stimuliert. Um den
zeitlichen Einfluss von MPA auf die Differenzierung der Zellen untersuchen zu können,
wurde das Medikament zu vier verschiedenen Zeitpunkten hinzugefügt: zeitgleich mit
der Pilzstimulation, zwei Tage und vier Tage vorher sowie über den gesamten
Differenzierungszeitraum von sieben Tagen.
4.1.1 Generierung und Nachweis von DCs aus Monozyten
DCs wurden sieben Tage lang generiert und daraufhin sechs Stunden lang mit A.
fumigatus-Keimschläuchen stimuliert. Im Anschluss wurde die RNA extrahiert und der
Hälfte der Zellen ebenfalls über sechs Stunden MPA in der Konzentration 30 µM
hinzugegeben.
Die Versuchsansätze erhielten die im Folgenden aufgelisteten Nummern (dies gilt für
alle im Abschnitt 4.1 erläuterten Versuche):
I=
unstimulierte Zellen
III =
stimulierte Zellen
II =
unstimulierte Zellen + MPA
IV =
stimulierte Zellen + MPA
34
4.1.2 Sechsstündiger Einfluss durch Mycophenolat
Die Versuche mit sechsstündiger MPA-Exposition wurden vor Beginn dieser
Dissertation
durchgeführt
und
sind
hier
nicht
abgebildet.
Die
untersuchte
Zytokinausschüttung von TNF-α, IL-12, CCL20 sowie CXCL10 war nach Stimulation
mit A. fumigatus stark erhöht. Im Vergleich zum Versuchsansatz ohne MPA zeigte sich
beim Versuch mit MPA keine reduzierte Expression (Markus Mezger, persönliche
Mitteilung).
4.1.3 Zweitägiger Einfluss von Mycophenolat
Bei diesem Versuch wurde MPA in der Konzentration 30 µM am fünften Tag, also zwei
Tage vor der RNA-Extraktion, beigegeben.
TNF-α
IL-12
1000,00
1000,00
relative Expression
10000,00
relative Expression
10000,00
100,00
10,00
1,00
100,00
10,00
1,00
0,10
0,10
I
II
III
IV
I
II
III
IV
III
IV
CXCL10
CCL20
1000000,00
1000,00
relative Expression
relative Expression
100000,00
10000,00
1000,00
100,00
10,00
100,00
10,00
1,00
1,00
0,10
0,10
I
II
III
I
IV
II
Abb. 4.1: Zytokinexpression der DCs nach zweitägigem Einfluss von MPA
(exemplarisch)
In
allen vier Diagrammen zeigt sich, dass nach der Pilzstimulation die
Zytokinexpression stark ansteigt, im TNF-α-Diagramm zum Beispiel um den Faktor
1000. Bei Behandlung mit MPA zeigt sich keine nennenswerte Verringerung von TNFα. Auch IL-12, CCL20 und CXCL10 sind unter MPA nicht verringert.
35
4.1.4 Viertägiger Einfluss von Mycophenolat
In diesem Versuch wurde einem Teil der Zellen vier Tage vor der sechsstündigen
Pilzstimulation MPA in der Konzentration 30 µM beigefügt. Der bei der Auffrischung
des Mediums verlorene MPA-Anteil wurde ersetzt.
TNF-α
IL-12
1000,00
relative Expression
relative Expression
1000,00
100,00
10,00
1,00
0,10
100,00
10,00
1,00
0,10
I
II
III
IV
I
II
III
IV
III
IV
CCL20
CXCL10
10000,00
1000,00
100,00
100,00
relative Expression
relative Expression
1000,00
10,00
1,00
0,10
I
II
III
10,00
1,00
0,10
I
IV
II
Abb. 4.2: Diagramme der vier untersuchten Zytokine nach Pilzstimulation und Gabe
von MPA (30 µM) vier Tage zuvor (exemplarisch)
Die Expression von TNF-α und IL-12 zeigt sich nicht verringert. Gleiches wurde bei
CCL20 und CXCL10 beobachtet. Mycophenolat scheint über den genannten Zeitraum
von vier Tagen keinen negativen Einfluss auf die Zytokinsekretion der DCs zu nehmen.
4.1.5 Gabe von Mycophenolat über die gesamte Differenzierungsdauer
Bei dieser Versuchsreihe wurde unmittelbar nach der Monozytenisolierung MPA in der
Konzentration 30 µM auf die Zellen gegeben. Nach sieben Tagen wurden die Zellen,
wie in den anderen Versuchen auch, über sechs Stunden mit A. fumigatusKeimschläuchen stimuliert und untersucht. Es zeigte sich, dass die hier verwendete
Konzentration von MPA über diesen längeren Zeitraum zu toxisch ist und aufgrund der
36
vielen abgestorbenen Zellen, trotz mehrfacher Wiederholungen, keine für die
Folgeuntersuchungen ausreichende RNA-Menge gewonnen werden konnte. Aus diesem
Grund wurde in Anlehnung an eine Arbeit von Čolić et al. die MPA-Konzentration auf
10 µM gesenkt [82]. Diese Konzentration entspricht laut Dubsky et al. auch derjenigen
MPA-Plasma-Konzentration bei Verabreichung von 2 g MMF pro Tag (bis 10 µM)
[83].
Abb. 4.3: Vergleich der DC-Population mit (rechts) und ohne (links) MPA
Die Abb. 4.3 zeigt den Einfluss von MPA (hier mit 10 µM) auf DCs. Im linken Bild ist
die DC-Population mit einem Kreis markiert. Die Zellen wurden nicht mit MPA
behandelt. Die zweite Subpopulation links unten im selben Bild besteht aus
abgestorbenen Zellen. Das rechte Bild zeigt die mit MPA behandelten Zellen. Man sieht
deutlich die stark vermehrte Subpopulation an toten Zellen im linken unteren Teil des
Bildes.
Die oben beschriebenen Versuche mit siebentägiger MPA-Exposition wurden nun mit
der Konzentration (10 µM) wiederholt. Hier verliefen die Versuche zufriedenstellend
und ermöglichten eine Analyse der Ergebnisse.
Die Diagramme in Abb. 4.4 demonstrieren exemplarisch das Ergebnis eines Versuches.
In Abb. 4.5 sind die durchschnittlichen Werte (in Prozent) und Standardabweichungen
der drei Versuche angegeben.
37
TNF-a
IL-12
1000,00
relative Expression
relative Expression
1000,00
100,00
10,00
1,00
100,00
10,00
1,00
0,10
0,10
0,01
I
II
III
IV
I
II
IV
III
IV
CXCL10
CCL20
10000,00
1000,00
1000,00
relative Expression
relative Expression
III
100,00
10,00
1,00
100,00
10,00
0,10
1,00
0,10
I
II
III
IV
I
II
Abb. 4.4: Die untersuchten Zytokine nach siebentägigem MPA-Einfluss (exemplarisch)
TNF-α zeigte im Durchschnitt eine Reduktion von 52% ± 21% im Vergleich der MPAbehandelten Zellen mit den unbehandelten Zellen. Die IL-12-Expression unter MPA
nach Pilzstimulation sank um 94% ± 2%. Nicht ganz so ausgeprägt zeigte sich die
Reduktion von CCL20. Sie betrug 63% ± 25 %. Die CXCL10-Sekretion von Zellen
unter MPA nach Pilzstimulation verringerte sich durchschnittlich um 92% ± 10% im
Vergleich zu den stimulierten Zellen ohne MPA.
0,00
I
II
III
IV
-20,00
-40,00
-60,00
-80,00
-100,00
-120,00
Abb. 4.5: Durchschnittliche Reduktion der Zytokine TNF-α (I), IL-12 (II), CCL20 (III),
CXCL10 (IV)
38
4.2 Einfluss von Mycophenolat auf die Entwicklung von
DCs
4.2.1 FACS-Analyse unreifer DCs
In diesem Versuch sollte überprüft werden, ob die mit GM-CSF und IL-4 stimulierten
Monozyten nach sieben Tagen in iDCs differenziert waren.
Hierzu wurde der Hälfte der zu untersuchenden Zellen ab dem ersten Tag MPA in der
Konzentration 30 µM beigefügt. Beim Wechsel des Mediums wurde auch der Verlust
an MPA ausgeglichen. Am siebten Tag wurden die Zellen für das FACS vorbereitet und
das Gate (nur Zellen im Gate werden untersucht) auf die vermutete DC-Population
gelegt.
Abb. 4.6: Gaten einer DC-Population bei einer Isotypenkontrolle
Die Zellen exprimierten den für iDCs spezifischen Oberflächenmarker CD1a, außerdem
CD40 sowie die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Der für Monozyten
charakteristische CD14-Marker fehlte. Dies zeigte zunächst, dass es sich bei den Zellen
um DCs handelte. Da darüber hinaus auch der Reifemarker CD83 nicht vorhanden war,
handelte es sich um iDCs. Die unter dem Einfluss von MPA generierten Zellen zeigten
im Vergleich zu den unbehandelten Zellen eine Besonderheit: Die Oberflächenmarker
vom Typ CD1a, CD40 und CD80 waren zwar vorhanden, in ihrer Expression aber
vermindert.
39
CD83
CD1a
CD14
CD80
CD40
CD86
Abb. 4.7: Oberflächenmarkerexpression mit (rosa) und ohne (grün) MPA
nach sieben Tagen
40
4.2.2 FACS-Analyse gereifter DCs
In einer weiteren Versuchsreihe sollte herausgefunden werden, wie sich die
Oberflächenmarkerexpression von mDCs unter MPA ändert. Die zu diesem Zweck
gewonnenen Monozyten reiften in zwei 6-Well-Platten über sieben Tage zu iDCs. Einer
Platte wurde ab dem ersten Tag MPA in der Konzentration 10 µM zugefügt. Am fünften
Versuchstag wurden einem Drittel der Zellen bakterielles LPS, einem zweiten Drittel
mit Ethanol inaktivierte A. fumigatus-Keimschläuche hinzugefügt. Das letzte Drittel
diente als Kontrolle. Die FACS-Analyse erfolgte nach dem o. g. Schema am siebten
Tag. Ziel dieses Versuches war es, herauszufinden, wie sich die verschiedenen
Oberflächenmarker unter MPA nach Stimulation mit A. fumigatus-Keimschläuchen
verändern. Um nachzuweisen, dass die Zellen adäquat auf Stimuli reagieren, diente LPS
als Positivkontrolle.
Im Gegensatz zur Untersuchung von iDCs konnte eine Hochregulierung von CD83
beobachtet werden, was dafür spricht, dass sich die DCs nach Antigenkontakt zu mDCs
entwickeln. In den mit drei Spendern durchgeführten Versuchen konnte nachgewiesen
werden, dass es bei allen untersuchten Oberflächenmarkern zu signifikanten
Reduktionen unter MPA kam. CD1a war um 68,8% ± 12% reduziert, CD40 verringerte
sich um 39,3% ± 5,8%. Auch CD80 (46,7% ± 1,3 %), CD83 (21,1% ± 6,3%) sowie
CD86 (43,8% ± 2,5 %) waren weniger exprimiert.
90
80
Reduktion in %
70
60
50
40
30
20
10
0
CD1a
CD40
CD80
CD83
CD86
Abb. 4.8: Reduktion der einzelnen Oberflächenmarker unter MPA nach Stimulation mit
A. fumigatus-Keimschläuchen im Vergleich zu der Kontrolle ohne MPA
41
4.2.3 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen
Monozyten wurden auf drei verschiedene Ansätze verteilt:
1.
ohne Zusatz von MPA
2.
mit 10 µM MPA
3.
mit 1 µM MPA
Nach Reifung über sieben Tage wurden die Zellen in drei weitere Gruppen unterteilt:
eine Negativkontrolle bei 37 °C, einen Ansatz mit FITC-Dextran bei 37 °C sowie als
weitere Kontrolle einen Ansatz mit FITC-Dextran bei 4 °C, da Zellen bei dieser
Temperatur nicht phagozytieren. Dieser Versuch diente dazu nachzuweisen, ob MPA
die Phagozytose von iDCs hemmt.
Abb. 4.9: FITC-Dextran FACS-Analyse, unbehandelte Zellen (grün), MPA 10 µM
(blau), MPA 1 µM (orange) und Negativkontrolle (rosa)
In Abb. 4.9 sind exemplarisch die FACS-Ergebnisse eines Versuchs dargestellt. Man
erkennt eine Reduktion der Phagozytose unter 10 µM MPA und eine etwa
gleichbleibende Aktivität unter 1 µM MPA.
Wie in Abb. 4.10 zu sehen ist – die Abbildung entstand durch Mittelung der
Versuchsergebnisse –, zeigten die mit 10 µM MPA behandelten Zellen eine um
45% (± 19%) niedrigere Phagozytoseaktivität, also eine deutliche Reduktion. Im
Gegensatz dazu konnte bei Zellen unter 1 µM MPA nur eine leichte mittlere Reduktion
bei relativ großer Standardabweichung beobachtet werden.
42
0,0
I
II
-10,0
mittlere Reduktion
-20,0
-30,0
-40,0
-50,0
-60,0
-70,0
Abb. 4.10: FITC-Dextran-Versuch, mittlere Reduktion der Phagozytoseaktivität bei
10 µM MPA (I) und 1 µM MPA (II)
4.3 Lichtmikroskopische Aufnahmen
Nach ihrer Entwicklung aus Monozyten wurden iDCs mit Hilfe des Lichtmikroskops
untersucht. In Abb. 4.11 erkennt man in der linken Aufnahme zwei homogene Zellen
und ihre baumähnlichen Ausläufer. Die Differenzierung der Zelle in der rechten
Aufnahme erfolgte unter dem Einfluss von MPA. Man erkennt die inhomogene
Struktur.
Abb. 4.11: iDCs im Lichtmikroskop
4.4 Einfluss
von
RAD
auf
die
Zytokinexpression
dendritischer Zellen
Monozyten wurden mittels GM-CSF und IL-4 über sieben Tage zur Differenzierung in
DCs angeregt. Im Anschluss daran folgte eine sechsstündige Stimulierung der Zellen
43
mit A. fumigatus-Keimschläuchen. RAD (1 µM) wurde analog zu den MPA-Versuchen
zu den schon genannten Zeitpunkten hinzugefügt. Da RAD in Ethanol gelöst ist, wurde
den unbehandelten Zellen in gleicher Verdünnung Ethanol zugegeben. So sollten
eventuelle Einflüsse des Ethanols auf die Ergebnisse ausgeschlossen werden.
Legende für die Diagramme im Abschnitt 4.4:
I=
unstimulierte Zellen
II =
unstimulierte Zellen + RAD (1 µM)
III =
stimulierte Zellen
IV =
stimulierte Zellen + RAD (1 µM)
4.4.1 Sechsstündiger Einfluss durch RAD
Bei diesem Versuch wurde RAD gleichzeitig mit der Pilzstimulation hinzugegeben.
Wie in Abb. 4.12 zu sehen ist, zeigte die Sekretion von TNF-α keine nennenswerte
Reduktion. Auch für IL-12, CCL20 und CXCL10 konnte keine Veränderung festgestellt
werden.
TNF-α
IL-12
100,00
relative Expression
relative Expression
100,00
10,00
1,00
10,00
1,00
0,10
0,10
I
II
III
I
IV
CCL20
III
IV
III
IV
CXCL10
1000,00
100,00
relative Expression
relative Expression
II
100,00
10,00
1,00
10,00
1,00
0,10
0,10
I
II
III
I
IV
II
Abb. 4.12: Zytokinexpression der Zellen nach sechsstündiger Stimulation und
gleichzeitiger RAD-Gabe
44
4.4.2 Zweitägiger Einfluss durch RAD
Bei diesem Versuch wurde DCs zwei Tage vor Ablauf der Differenzierungszeit RAD
(1 µM) bzw. Ethanol beigefügt. Im Anschluss an die Stimulation und die RNAExtraktion erfolgte die Untersuchung der Zytokinexpression.
Bei den untersuchten Zytokinen TNF-α, IL-12, CCL20 und CXCL10 konnten keine
Unterschiede zwischen unbehandelten und mit RAD behandelten Zellen beobachtet
werden. Dies galt sowohl für unstimulierte als auch für stimulierte Zellen (s. Abb. 4.13).
TNF-α
Il-12
10000,00
relative Expression
relative Expression
100,00
10,00
1,00
0,10
1000,00
100,00
10,00
1,00
0,10
I
II
III
IV
I
CCL20
III
IV
CXCL10
10000,00
100,00
relative Expression
1000,00
relative Expression
II
100,00
10,00
1,00
10,00
1,00
0,10
0,10
I
II
III
I
IV
II
III
IV
Abb. 4.13: Zytokinexpression nach sechsstündiger Pilzstimulation, RAD-Gabe zwei
Tage zuvor
4.4.3 Viertägiger Einfluss durch RAD
In diesem Experiment wurde der Hälfte der Zellen vier Tage vor der anschließenden
Stimulation RAD in der Konzentration 1 µM, der anderen Hälfte Ethanol beigefügt.
Wie im Methodenteil beschrieben, erfolgte beim Wechsel des Mediums (nach zwei und
vier Tagen sowie vor der Pilzstimulation) ein anteiliger Ersatz an Wachstumsfaktoren
sowie RAD bzw. Ethanol. Auch hier konnte für die vier untersuchten Zytokine TNF-α,
IL-12, CCL20 und CXCL10 keine nennenswerte Änderung ihrer Expression erkannt
werden.
45
TNF-α
IL-12
1000,00
relative Expression
relative Expression
100,00
10,00
1,00
0,10
100,00
10,00
1,00
0,10
I
II
III
IV
I
III
IV
III
IV
CXCL10
CCL20
100,00
relative Expression
1000,00
relative Expression
II
100,00
10,00
1,00
0,10
10,00
1,00
0,10
I
II
III
I
IV
II
Abb. 4.14: Expression der vier untersuchten Zytokine nach sechsstündiger
Pilzstimulation und RAD-Gabe (1 µM) vier Tage zuvor
4.4.4 Gabe von RAD über die gesamte Differenzierungsdauer
Die verwendeten Monozyten wurden wie bei den anderen Versuchen auch über sieben
Tage mit GM-CSF und IL-4 zu DCs gereift. Hier wurde ab dem ersten Tag der Hälfte
der Zellen RAD in der Konzentration 1 µM hinzugefügt und bei jedem Mediumwechsel
anteilig ersetzt. Da RAD in Ethanol gelöst ist, musste den Zellen ohne RAD Ethanol in
der gleichen Verdünnung hinzugefügt werden, um einen Einfluss von Ethanol auf das
Messergebnis auszuschließen. Nach sieben Tagen Reifung wurden die iDCs über sechs
Stunden mit A. fumigatus-Keimschläuchen stimuliert. Wie schon bei den Versuchen mit
MPA zeigte sich auch bei den RAD-Versuchen über sieben Tage, dass die verwendete
Konzentration über einen solchen Zeitraum zu toxisch für die Zellen ist. Nach sieben
Tagen war der Anteil an untergegangenen Zellen so groß, dass trotz mehrfacher
Wiederholung dieses Experiments keine adäquate Analyse der Zytokinexpression
möglich war. Die sich anschließenden Experimente mit RAD wurden in der
Forschungsgruppe weitergeführt. Hier zeigte sich bei Verwendung von 0,01 µM RAD
eine Reduktion von TNF-α, IL-12 sowie CCL20 [84].
46
4.5 Einfluss von RAD auf die Entwicklung dendritischer
Zellen
4.5.1 FACS-Analyse unreifer DCs
Wie schon bei der MPA-Versuchsreihe sollten hier die Oberflächenmarker der Zellen
untersucht werden; erstens, um festzustellen, ob es sich bei den untersuchten Zellen
tatsächlich um DCs handelte, und zweitens, ob RAD einen Einfluss auf die
Oberflächenmarkerstruktur der Zellen hat. Monozyten wurden über sieben Tage zu
iDCs generiert. Der einen Hälfte der Zellen wurde über die gesamte Zeit RAD in der
Konzentration 1 µM verabreicht und bei Mediumwechsel ersetzt. Der anderen Hälfte
wurde in derselben Verdünnung Ethanol beigefügt. Nach sieben Tagen erfolgte die
Untersuchung der Zellen am FACS auf ihre Oberflächenmarker. Alle Zellen
exprimierten den für iDCs typischen Marker CD1a, außerdem CD40 und die
kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Der Monozytenmarker CD14 und der
Marker für mDCs, CD83, wurden nicht exprimiert.
Die mit RAD behandelten Zellen zeigten eine verminderte Expression von CD40.
Außerdem waren CD80 und auch CD86, also beide kostimulatorischen Moleküle,
verringert (Abb. 4.15). Weitergehende Forschungen der Arbeitsgruppe konnten diese
Ergebnisse auch für RAD mit der Konzentration 0,01 µM bestätigen [84].
47
CD1a
CD83
CD80
CD14
CD86
CD40
Abb. 4.15: FACS-Analyse der Oberflächenmarker nach sieben Tagen unter RAD 1 µM
(rot) und ohne RAD (grün)
4.5.2 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen unter RAD
Monozyten wurden auf drei verschiedene Ansätze verteilt:
1.
mit Ethanol
2.
mit 0,1 µM RAD
3.
mit 0,01 µM RAD
48
Ein vierter Ansatz ohne Zusätze diente als Kontrolle. Nach Reifung über sieben Tage
wurden die Zellen auf drei weitere Ansätze verteilt: auf eine Negativkontrolle bei 37 °C,
einen Ansatz mit FITC-Dextran bei 37 °C sowie auf einen Ansatz mit FITC-Dextran bei
4 °C, da Zellen bei dieser Temperatur nicht phagozytieren.
Abb. 4.16: FACS-Analyse des FITC-Dextran-Assays: RAD 0,1 µM (blau), RAD
0,01µM (orange), unbehandelte Zellen (grün), Negativkontrolle (rosa)
In Abb. 4.16 ist die Analyse eines Versuchs exemplarisch dargestellt. Man sieht, dass
die unter RAD entwickelten Zellen (blau, orange) deutlich weniger Dextran
phagozytieren als die unbehandelten Zellen (grün).
0,0
-10,0
I
II
mittlere Reduktion
-20,0
-30,0
-40,0
-50,0
-60,0
-70,0
-80,0
Abb. 4.17: Phagozytoseaktivität der DCs im FITC-Dextran-Assay mit 0,1 µM RAD (I)
sowie 0,01 µM RAD (II)
Das in Abb. 4.17 gezeigte Diagramm ergibt sich aus den Mittelwerten der drei FITCDextran-Versuche. Deutlich zeigt sich eine starke Verminderung der phagozytotischen
Aktivität der Zellen sowohl unter 0,1 µM um 56,2% (± 10,1%) als auch unter 0,01 µM
RAD um 64,2% (± 9,6%).
49
5
Diskussion
Das menschliche Immunsystem ist dem ubiquitär vorkommenden Schimmelpilz A.
fumigatus ein Leben lang ausgesetzt. Jeden Tag atmet der Mensch mehrere hundert
Konidien dieses opportunistischen Erregers ein [40]. Diese Exposition führt im
Normalfall nicht zu einer Infektion, da das Immunsystem den Erreger eliminiert. Die
Abwehr von inhalierten A. fumigatus–Sporen geschieht über verschiedene Wege. Von
Seiten des angeborenen Immunsystems erfolgt als eine der ersten Abwehrmechanismen
die Abtötung des Pilzes durch Alveolarmakrophagen, welche bis zu 90% der Konidien
innerhalb weniger Stunden phagozytieren und somit deren Reifung zu Hyphen
verhindern können [85, 86]. Die dennoch in die Blutbahn gelangten Hyphen werden
unter anderem durch neutrophile Granulozyten phagozytiert und durch Produktion
reaktiver Sauerstoffspezies (oxidativer Burst) verdaut.
Des Weiteren können Pilzantigene durch unreife DCs phagozytiert werden. DCs können
sowohl Hyphen als auch Konidien phagozytieren, wobei Konidien eine längere
Überlebensdauer in DCs aufweisen und zu einer unterschiedlichen Zytokinausschüttung
führen als Hyphen [87]. Es konnte gezeigt werden, dass Dectin-1 ein wichtiger Rezeptor
dendritischer Zellen für A. fumigatus ist und die Immunantwort der Zelle beeinflusst
[27]. Der Antigenkontakt führt, wie bereits beschrieben, zur Reifung und Migration der
DCs, welche in der Folge T-Lymphozyten, also Zellen des erworbenen Immunsystems,
aktivieren. Hier helfen vor allem Th1-Zellen bei der Immunabwehr gegen den Pilz [88].
Anders ist dies bei immunsupprimierten Patienten. Für diese stellt die durch A.
fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose (IA) eine lebensbedrohliche Situation dar.
Die Tatsache, dass Pilzinfektionen in den letzten Jahren stark zugenommen haben, ist
auf verbesserte medikamentöse Therapieoptionen sowie auf die längere Überlebenszeit
der Patienten zurückzuführen. Zu den Risikofaktoren, die die Entstehung einer IA
begünstigen, gehören unter anderem eine verlängerte oder schwere Neutropenie, der
Einsatz von Glucokortikoiden und anderen Immunsuppressiva sowie eine lange
Antibiotikatherapie. Auch die häufig nach Stammzelltransplantationen auftretende
Graft-versus-Host-Disease (GvHD) führt vermehrt zu Pilzinfektionen. Es zeigt sich,
dass meistens weniger die Krankheit an sich als deren Therapie zur IA führt [88].
Gerade deshalb ist es wichtig, das Risiko einer IA zu minimieren und ihr Auftreten
50
frühzeitig zu diagnostizieren, um eine Behandlung durchführen zu können. Neuere
Forschungen zeigen auch, dass es genetische Polymorphismen zu geben scheint, die das
Risiko, nach Stammzelltransplantation an einer IA zu erkranken, erhöhen [38, 89].
Patienten mit solchen Polymorphismen könnten in Zukunft von einer individualisierten
Therapie profitieren.
Patienten nach Organtransplantation müssen lebenslang Immunsuppressiva einnehmen,
beispielsweise Mycophenolat oder RAD, die beide die Funktion von T-Lymphozyten
hemmen. Es lässt sich leicht nachvollziehen, dass durch die Beeinflussung des
erworbenen Immunsystems die Abwehr von inhalierten A. fumigatus-Konidien
beeinträchtigt wird und sich das Risiko, an einer IA zu erkranken, erhöht.
Auf der Suche nach neuen Therapiemöglichkeiten sind in den letzten Jahren auch DCs
in den Blickpunkt der Wissenschaft geraten [90-92]. DCs spielen im Immunsystem eine
sehr wichtige Rolle, da sie Immunantworten induzieren können und ein Bindeglied
zwischen angeborener und erworbener Abwehr darstellen. Aktuelle Forschungen
beschäftigen sich mit der Möglichkeit, iDCs mit Aspergillusantigenen zu beladen, um
auf diese Weise einen Impfstoff gegen A. fumigatus zu entwickeln [93].
Schon seit längerem ist bekannt, dass immunsuppressive Substanzen auch auf DCs
wirken und so unter anderem deren Fähigkeit, T-Zellen zu aktivieren, beeinflussen
können. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Glucokortikoide, wenn sie über
den gesamten Reifungszeitraum gegeben wurden, die Differenzierung von Monozyten
in DCs unterbinden [94]. Auch für MPA und RAD konnte, wie in den Abschnitten 5.1
und 5.2 noch beschrieben wird, ein Einfluss auf DCs nachgewiesen werden.
Insofern war es das Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, welche Auswirkungen der
Einsatz von MPA und RAD auf die Entwicklung und Reifung von DCs hat und
inwieweit die Immunantwort dieser antigenpräsentierenden Zellen auf A. fumigatus
beeinflusst wird.
51
5.1
Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten und Infektion
mit A. fumigatus-Keimschläuchen
Zur Gewinnung von Monozyten wurden Buffy Coats der Blutbank Frankfurt verwendet.
Die Anzahl der gewonnenen Zellen variierte von Spender zu Spender. Die Zellen für
den
FITC-Dextran-Assay
wurden
aus
„Zapfen“
(LRSC,
s.
3.3.1)
des
Universitätsklinikums Würzburg gewonnen. Diese neuere Art der Leukozytengewinnung liefert laut Dietz et al. eine höhere Anzahl an Monozyten, die dieselbe
Qualität besitzen wie die aus Buffy Coats gewonnenen Zellen [95]. Die im Rahmen
dieser Arbeit durchgeführten Experimente haben ebenfalls gezeigt, dass sowohl Buffy
Coats als auch LRSC geeignete DCs liefern. Die Anzahl scheint bei den LRSC
konstanter zu sein. Ein weiterer Vorteil sind die schnelle Verfügbarkeit und der kurze
Zeitraum zwischen Blutentnahme und Verwendung im Labor.
Zur Reifung wurden den Monozyten über einen Zeitraum von sieben Tagen die
Zytokine IL-4 und GM-CSF hinzugefügt. Diese Methode der Gewinnung humaner DCs
ist seit längerem beschrieben und wird häufig angewandt [24]. Das Medium wurde nach
zwei und vier Tagen gewechselt und die Zytokinkonzentration hierbei erhöht.
Um nachzuweisen, dass es sich nach der Reifung der Monozyten auch tatsächlich um
DCs handelte, wurde ein Teil der Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Hierbei
wurde geprüft, ob die Zellen die für DCs typischen Marker, wie zum Beispiel CD1a für
iDCs bzw. CD83 für mDCs, besitzen. Ein sehr wichtiges Kriterium war, dass die
untersuchten Zellen CD14-negativ waren, da dieses Oberflächenmolekül auf
Monozyten, nicht aber auf DCs vorkommt. Diese Voraussetzungen konnten bei den
untersuchten Zellen stets nachgewiesen werden. Die Infektion der DCs erfolgte mit A.
fumigatus über sechs Stunden vor der RNA-Isolation. Im Fall der FACS-Analyse
erfolgte die Infektion über 48 Stunden mit inaktivierten Pilzen. Diese Inaktivierung
durch Ethanol war nötig, da eine Analyse der Experimente aufgrund des starken
Pilzwachstums nach einem solchen Zeitraum nicht mehr möglich gewesen wäre. Offen
bleibt, inwiefern Ethanol die Oberflächenstruktur der Pilze und somit die
Stimulierbarkeit von DCs verändert.
Bei allen Versuchen konnte eine Reaktion der DCs auf A. fumigatus beobachtet werden.
Diese zeigte sich bei den LightCycler-Experimenten in einer Erhöhung der
52
Zytokinexpression. Bei unbehandelten Zellen stieg beispielsweise die TNF-αAusschüttung
mindestens
um
den
Faktor
100.
Die
Einzelergebnisse
der
Expressionsanalysen waren teilweise sehr unterschiedlich. Dies lag zum einen an der
Spendervariabilität, zum anderen an Schwankungen bei den LightCycler-Messungen.
Letztere wurden minimiert, indem jede Probe eines Einzelversuches dreifach im
LightCycler gemessen wurde und zwei dieser Ergebnisse gemittelt wurden. Absolute
Werte entstanden durch Mittelung der Einzelversuche. Neben TNF-α wurde noch die
Expression von IL-12, CCL20 und CXCL10 untersucht (zur Bedeutung der Zytokine in
der Immunantwort der DCs gegen A. fumigatus s. Abschnitte 1.2.3, 1.2.4, 1.3.2).
In den FACS-Analysen zeigte sich die Reaktion der DCs auf den Pilz an der
Veränderung der Oberflächenstrukturen, beispielsweise durch eine Erhöhung des
Reifemarkers CD83. Die Einzelergebnisse wiesen eine eindeutige Tendenz auf
(s. 4.2.2).
5.2
Untersuchung des Einflusses von Mycophenolat auf DCs
Das immunsuppressive Medikament MPA wird vor allem nach Transplantationen
eingesetzt. Seine Wirkung auf Lymphozyten ist seit langem bekannt: MPA hemmt die
IMPDH, was zu einer Verminderung der de-novo-Purin-Synthese führt, auf welche vor
allem Lymphozyten angewiesen sind [62]. In den letzten Jahren ist jedoch auch der
Einfluss auf DCs in den Fokus der Forschung geraten [29, 96].
Zuerst wurde der zeitliche Einfluss auf die Zytokinexpression von DCs nach
Pilzstimulation untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass MPA keinen Einfluss auf
die Zytokinexpression der DCs hat, wenn es sechs Stunden oder zwei bzw. vier Tage
vor der Stimulation hinzugefügt wird (s. 4.1.2, 4.1.3, 4.1.4). Zu diesen Zeitpunkten kann
man davon ausgehen, dass sich ein Großteil der Monozyten schon zu iDCs
ausdifferenziert hat. Nachdem erste Versuche mit 30 µM MPA durchgeführt worden
waren, stellte sich diese Konzentration über sieben Tage als zu toxisch heraus, so dass
in Anlehnung an Čolić et al. für diese Versuche die Konzentration 10 µM verwendet
wurde. Trotzdem zeigte sich, dass viele unter MPA gereifte Zellen absterben (s. Abb.
4.3). Die Normalisierung der Ergebnisse mittels h-Alas bei der LightCycler-Analyse
53
sowie das genaue Gaten der vitalen Zellpopulation bei der FACS-Analyse (s. Abb. 4.5)
sollten dazu führen, dass nur lebende Zellen in die Analyse mit einbezogen wurden. Ein
über die verschiedenen Ansätze stabiler h-Alas-Wert wurde als Beleg für eine gute
Normalisierung angesehen (s. Abb. 3.4).
Den Einfluss von MPA auf die gesamte Differenzierungszeit der DCs untersuchten
Geng et al. bei Experimenten an mit LPS gereiften murinen DCs. Sie beschreiben eine
Reduktion von TNF-α und IL-12 [97]. Einen ähnlichen Effekt für TNF-α und IL-12
beschreiben Čolić et al. für humane moDCs [82]. Auch hier wurde zum Reifen der DCs
bakterielles LPS benutzt. Sie berichten des Weiteren, dass MPA in den untersuchten
DCs den programmierten Zelltod, die sogenannte Apoptose, induziert [82]. In der
vorliegenden Arbeit konnte nun nachgewiesen werden, dass bei humanen, unter MPAEinfluss entwickelten moDCs nach Reifung durch Stimulation mit A. fumigatusKeimschläuchen sowohl TNF-α und IL-12 als auch CCL20 und CXCL10 vermindert
sind (s. 4.1.5). Die Zytokinsekretion der Zelle ist hier offenbar gestört.
In der Folge wurden Analysen der Zelloberfläche mittels Durchflusszytometrie
durchgeführt, um den genauen Einfluss von MPA auf die Differenzierung und Reifung
besser verstehen zu können. Im Jahr 2000 wurde diesbezüglich eine Reduktion von
CD40, CD80 und CD86 bei DCs von Mäusen beschrieben [96]. Čolić et al., die mit
inaktivierten und LPS-aktivierten humanen moDCs arbeiteten, wiesen bei iDCs eine
Verminderung von CD40, CD54 und CD80, und bei mDCs eine Verminderung von
CD80, CD83 und CD86 nach [82]. Wie aus Abschnitt 4.2.1 hervorgeht, konnten diese
Ergebnisse sowie eine Verringerung von CD1a für iDCs bestätigt werden. Die mit A.
fumigatus stimulierten mDCs wiesen hier jedoch eine Reduktion aller untersuchten CDMoleküle auf (s. 4.2.2).
Hier sieht man, dass nicht nur die Zytokinantwort der Zellen, sondern auch der
Reifungsprozess nach Antigenkontakt durch MPA beeinträchtigt ist.
Weitere Untersuchungen zeigten, dass MPA-beeinflusste Zellen eine verringerte
Fähigkeit besitzen, T-Zellen zu aktivieren [83]. Dies lässt sich durch die auch in dieser
Arbeit beschriebene verminderte Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80
und CD86 erklären. Außerdem konnte ermittelt werden, dass MPA – wie bei
Lymphozyten – auf das Enzym IMPDH der DCs wirkt und auch deren GTP-Haushalt
54
beeinflusst. Diese Wirkung konnte interessanterweise auch nach Zugabe von MPA nach
mehreren Tagen der Entwicklung beobachtet werden [83].
In weiteren Experimenten mittels des FITC-Dextran-Assays wurde nachgewiesen, dass
unter MPA-Einfluss differenzierte iDCs eine deutlich reduzierte Phagozytosekapazität
aufweisen (s. Abb. 4.9). Dies ist insofern interessant, als DCs ein Antigen erst durch
Phagozytose aufnehmen müssen, um es dann im Anschluss den Lymphozyten zu
präsentieren. Da dieser Versuch aufgrund der vorgeschriebenen, verschiedenen konstant
zu haltenden Temperaturen der einzelnen Ansätze störanfällig war, wurden die
Ergebnisse durch zwei Negativkontrollen (4 °C und 37 °C) abgesichert (s. 4.2.3). In
einem weiteren Schritt müsste untersucht werden, wie die Phagozytose von A.
fumigatus durch DCs unter immunsuppressiver Einwirkung beeinflusst wird.
Es wird hier also deutlich, dass die Differenzierung von moDCs unter dem Einfluss von
MPA beeinträchtigt ist, was dazu führt, dass die entstandenen DCs die ihnen zugedachte
Rolle im Immunsystem nicht wie gewünscht ausführen können. Es konnte gezeigt
werden, dass diese Wirkung zu einer veränderten Reaktion der DCs in ihrer
Immunantwort auf A. fumigatus führt. Die Erkenntnis, dass MPA die Entwicklung von
DCs beeinflusst, ist insofern von klinischer Relevanz, als im menschlichen Körper
täglich neue DCs gebildet werden. In dieser Arbeit wurden ausschließlich moDCs
untersucht, also nur einer von mehreren DC-Subtypen.
Die Verwendung von MPA scheint das Risiko, an einer IA zu erkranken, also nicht nur
durch Hemmung der Lymphozyten, sondern auch durch Hemmung der Reifung von
DCs zu erhöhen. Aber auch andere Zellen werden durch MPA beeinflusst. Hochegger et
al. berichten über ein entzündliches Syndrom mit Fieber und Oligoarthritis, welches
vermutlich durch die Wirkung von MPA auf Granulozyten ausgelöst wird und nach
Absetzen des Medikaments abklingt [67]. In Übereinstimmung mit o.g. Arbeit zeigten
die in der eigenen Forschungsgruppe durchgeführten Experimente, dass MPA die
Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies, den sogenannten oxidative burst, aus
Granulozyten erhöht [98]. Interessanterweise beeinflusste dies die Abtötungseffizienz
gegenüber Keimschläuchen nicht.
55
Hier bedarf es also weiterer Forschung, um die komplexe Wirkung von Mycophenolat
auf den Organismus besser verstehen zu können.
5.3
Untersuchung des Einflusses von RAD auf DCs
Das immunsuppressive Medikament Everolimus (RAD) ist eine Weiterentwicklung von
Rapamycin (RAPA) [99]. Beide werden unter anderem nach Transplantationen
verwendet, um das Abstoßen des Spenderorgans zu verhindern.
Wie schon bei den Experimenten mit MPA wurde auch bei RAD ein stark zytotoxischer
Effekt beobachtet. Dieser war noch ausgeprägter als bei MPA und bei den
Experimenten über sieben Tage so hoch, dass auch hier eine Reduktion der RADKonzentration angebracht war. Nach eigenen Versuchen mit 1 µM RAD wurden die
Versuche mit 0,01 µM fortgeführt. Wie in Abschnitt 5.2 beschrieben, wurde auch hier
versucht, den Einfluss abgestorbener Zellen durch Normalisierung der DC-Population
mit h-Alas und Gaten der DC-Population im FACS zu minimieren.
Ähnliche, mit dieser Arbeit vergleichbare Versuche wurden bis heute fast ausschließlich
an RAPA durchgeführt. Woltman et al. beschreiben, dass RAPA in moDCs die
Apoptose auslöst. Diese Wirkung bestehe aber nicht bei Monozyten [100]. In einer
weiteren Arbeit zeigen sie, dass DCs durch GM-CSF vor der Apoptose geschützt
werden. Diese Interaktion erfolgt über den mTOR-Pathway, der durch RAPA blockiert
wird. So wird die erhöhte Apoptoserate von DCs unter Rapamycintherapie erklärt [101].
Wurde RAD in der Konzentration 1 µM sechs Stunden, zwei bzw. vier Tage vor der
Pilzstimulation zugefügt, konnte trotz der hohen Zytotoxizität keine Reduktion der
Zytokinexpression der DCs beobachtet werden (s. 4.4.1, 4.4.2, 4.4.3). Hier scheinen
also RAD wie auch MPA keinen Einfluss auf sich entwickelnde DCs zu nehmen.
Anders sieht dies bei den Versuchen aus, in denen RAD über die gesamte
Differenzierungszeit hinzugefügt wurde. In Versuchen an Ratten konnte nachgewiesen
werden, dass RAPA bei aus Knochenmark stammenden DCs eine Verminderung der IL18- und IL-12-Sekretion nach Stimulation mit LPS auslöst [102, 103]. Die im Anschluss
an die vorliegende Arbeit in der Forschungsgruppe durchgeführten Experimente mit
Gabe von RAD in der Konzentration 0,01 µM über sieben Tage zeigen, dass die
56
Zytokinexpression der humanen mDCs im Falle von TNF-α, IL-12 und CCL20 nach
Stimulation mit A. fumigatus vermindert ist [84].
Des Weiteren konnte auch beobachtet werden, dass die Entwicklung von iDCs aus
Monozyten durch RAD (hier 1 µM) beeinträchtigt wird. Die DCs exprimierten nicht nur
weniger
CD40;
auch
CD80
und
CD86,
also
beide
kostimulatorischen
Oberflächenmoleküle, waren verringert (s. Abb. 4.1.4).
In nachfolgenden, durch die Forschungsgruppe durchgeführten Experimenten wurden
nach Reifung durch Pilzstimulation die Oberflächenmarker der mDCs ‒ analog zu den
MPA-Versuchen – analysiert. Diese Experimente zeigten bei 0,01 µM RAD eine
verringerte Expression von CD 40 und CD83 [84].
Ähnliche Forschungen bezüglich der Differenzierung und Oberflächenmarkerstruktur
von DCs wurden von Monti et al. und Fedoric et al. mit RAPA durchgeführt. Sie
beschreiben bei unter RAPA differenzierten moDCs eine verringerte Expression
derselben Oberflächenmoleküle und zeigen, dass RAPA-DCs in geringerem Maße TZellen aktivieren können als unbehandelte Zellen [104, 105].
Da die kostimulatorischen Moleküle eine sehr wichtige Rolle in der Interaktion mit der
T-Zelle spielen, kann man schließen, dass auch für die unter RAD entwickelten DCs die
Aktivierung von T-Zellen zumindest erschwert wird. Diese Annahme müsste durch
weitergehende DC-Funktionstests speziell für RAD untersucht werden.
Wie in dieser Arbeit gezeigt, führt RAD bei iDCs in den Konzentrationen 0,1 µM und
0,01 µM zu einer starken Einschränkung der Phagozytose (s. 4.1.6). Auch hier sollte
mittels weiterer Experimente erforscht werden, wie sich die Aufnahmefähigkeit von A.
fumigatus-Konidien verändert, da die Aufnahme von Antigenen Grundvoraussetzung
ist, um diese den Lymphozyten zu präsentieren.
Der Vergleich der beiden Medikamente MPA und RAD ergibt zum einen, dass beide
eine zytotoxische Wirkung auf Monozyten und DCs ausüben. Dieser Effekt zeigte sich
bei RAD deutlich ausgeprägter als bei MPA. Beide Medikamente beeinflussen zum
anderen die Entwicklung von moDCs und deren Reifung nach Antigenkontakt. Dies
spiegelt sich sowohl in einer Reduktion der Zytokinexpression der mDCs als auch in
einer Veränderung der Oberflächenmarker von iDCs und mDCs wider. Die
beschriebene verminderte Zytokinantwort konnte weder bei MPA noch bei RAD
57
beobachtet werden, wenn die Zugabe der Medikamente auf bereits entwickelte DCs
erfolgte. Diesbezüglich sollten weitere Experimente angestrebt werden.
5.4
Ausblick
Die Tatsache, dass die beiden immunsuppressiven Substanzen MPA und RAD auch auf
DCs wirken, ist seit längerem bekannt. Die Hinwendung der Forschung in Richtung der
DCs ist insofern berechtigt, als DCs und ihre Stellung im Immunsystem noch nicht
ausreichend erforscht sind. Ahn et al. beschreiben, dass DCs anscheinend nicht nur TZellen aktivieren, sondern auch gezielt deren Immunantwort beeinflussen und
regulieren können [106]. Ein weiterer Aspekt, der DCs in der Zukunft größere
medizinische Bedeutung zukommen lassen könnte, ist die Möglichkeit, Zellen als
Impfstoffe gegen Pilze, andere Erreger und sogar Tumoren einzusetzen [91, 107, 108].
Die praktische Anwendung vakzinierter DCs im klinischen Alltag als Mittel gegen
Tumoren stellt sich jedoch, trotz vieler Studien, als schwierig heraus [109, 110].
Forschungen an Lymphozyten ergaben, dass es in vitro möglich ist, gegen A. fumigatus
gerichtete T-Helferzellen zu produzieren [111]. Bezüglich der Therapie von Infektionen
mit dem Zytomegalievirus (CMV), einem weiteren Erreger, der nach Transplantationen
häufig Probleme bereitet, hat die Verwendung von T-Zellen als Heilmittel schon Einzug
in den klinischen Alltag gehalten. In weiteren Forschungen wird an einer Verbesserung
dieser Therapiemöglichkeit gearbeitet [112-114]. Zwei Reviews von Tacken et al. geben
eine Übersicht über die Möglichkeiten und Probleme, DCs ein bestimmtes Antigen zu
präsentieren [115, 116]. Das Verfahren, die T-Zell-Aktivierung durch DCs für
therapeutische Zwecke zu beeinflussen, ist seit einigen Jahren bekannt und wird
sicherlich in naher Zukunft zu neuen Behandlungsmöglichkeiten und Impfstrategien
führen. Jedoch ist bis heute noch zu wenig über die Wirkung von immunsuppressiven
Medikamenten auf DCs bekannt. Die in dieser Arbeit und anderen Veröffentlichungen
verwendeten Medikamente MPA und RAD führen bei DCs zu einer Beeinträchtigung
ihrer Immunantwort nach Kontakt mit A. fumigatus. Hier stellt sich deshalb die Frage,
ob DCs als Vakzine gegen Pilzantigene bei immunsupprimierten Patienten ihre ihnen
zugedachte Wirkung ausüben können.
58
Um weitere Erkenntnisse über die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs zu
gewinnen, bedarf es jedoch auch eines weitergehenden Verständnisses der anderen
Komponenten. Vieles deutet darauf hin, dass MPA und RAD weit mehr auf den
menschlichen Körper wirken, als bisher bekannt. Lagaraine et al. berichten zum
Beispiel, dass DCs, denen während der Reifung von iDCs zu mDCs MPA zugesetzt
wurde, einen regulatorischen Phänotyp entwickeln und unter Umständen eine Toleranz
gegenüber einem Spenderorgan induzieren können [117]. Devyatko et al. sprechen
sogar
davon,
dass
MPA
mehr
einen
immunmodulatorischen
denn
einen
immunsuppressiven Effekt hat [118].
Ähnliches gilt für RAPA und unter Umständen auch für RAD. Sordi et al. berichten,
dass der Einfluss von RAPA zu einer Erhöhung von CCR7 auf DCs führt und diese
daraufhin in Lymphknoten migrieren [119]. Hackstein spricht darüber hinaus auch von
einer immunmodulatorischen Wirkung durch RAPA [120]. Die eingeschränkte
Funktion von DCs, welche im Falle der IA unerwünscht ist, könnte man sich jedoch
auch zunutze machen, da in Nagetierversuchen beschrieben wurde, dass zuvor mit
RAPA behandelte DCs zu erhöhter Toleranz gegenüber Transplantaten führen können
[121-123]. Aber auch andere Medikamente wie Glucokortikoide, Aspirin oder, wie
kürzlich beschrieben, Pentoxiphyllin scheinen auf DCs zu wirken [29, 124].
Selbstverständlich bedarf es auch eines besseren Verständnisses der Entwicklung und
Funktion von DCs. So scheint beispielsweise die Expression von CD1 und seinen
Subtypen durch Serumlipide beeinflusst zu werden [125]. Auch hier könnte ein
Zusammenhang zwischen Immunität und Lipidspiegel – welcher ja auch medikamentös
reguliert werden kann – bestehen [126]. Diese hier genannten Beispiele zeigen, dass es
durchaus lohnenswert erscheint, weitere Anstrengungen für ein besseres Verständnis
von DCs zu unternehmen, um ihre Anwendung als Heilmittel verbessern zu können.
59
6
Zusammenfassung
In den letzten Jahren ist die Zahl immunsupprimierter Patienten aufgrund des stetigen
Fortschritts in der Medizin stark angestiegen. Die bei diesen Patienten wegen ihrer
hohen Mortalität gefürchtete, durch A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose (IA)
hat trotz der Anwendung verbesserter Antimykotika zugenommen. Die beiden
Medikamente
Mycophenolat
(MPA)
und
Everolimus
(RAD)
werden
zur
Immunsuppression verwendet. Sie wirken durch die Inhibition von B- und T-Zellen.
Allerdings wurde auch der direkte Einfluss auf DCs beschrieben. Diese Entdeckung ist
insofern von Relevanz, als DCs eine wichtige regulatorische Rolle bei der Abwehr von
Erregern, so auch von Pilzen, spielen und als Bindeglied zwischen dem angeborenen
und erworbenen Immunsystem fungieren. DCs sind außerdem in den vergangenen
Jahren in den Fokus der Wissenschaft geraten, da sie möglicherweise als Impfstoffe
gegen verschiedenste Krankheiten, darunter auch die IA, eingesetzt werden können. Da
die IA vor allem Patienten mit geschwächtem Immunsystem trifft, ist es von Bedeutung,
die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs besser zu verstehen.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von MPA und RAD auf die Entwicklung, die
Reifung und die Immunantwort von aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) nach
Kontakt mit A. fumigatus untersucht. Hierzu wurden die Medikamente zu verschiedenen
Zeitpunkten der DC-Entwicklung hinzugefügt. Es konnte gezeigt werden, dass vor
allem der Entwicklungsprozess der DCs beeinträchtigt wird. Neben einer verminderten
Zytokinexpression von DCs nach Kontakt mit A. fumigatus wurde auch eine
Veränderung der Oberflächenmarkerstruktur sowohl bei unreifen DCs (iDC) als auch
bei reifen DCs (mDC) festgestellt. Des Weiteren wurde die Fähigkeit von DCs zur
Phagozytose durch die Medikamente vermindert. Beide Substanzen, vor allem aber
RAD, zeigten zudem eine starke Zytotoxizität gegenüber den Zellen.
Es konnte in dieser Arbeit deutlich gemacht werden, dass sowohl MPA als auch RAD
die Entwicklung und Reifung von moDCs beeinflussen, was zu einer Beeinträchtigung
ihrer Immunantwort gegen A. fumigatus führt.
60
Summary
Over the past years, there has been an increasing amount of immunosuppressed patients
due to substantial progress in medical research. Despite the development of more
effective antifungal agents, those patients often suffer from invasive aspergillosis (IA)
caused by the mold Aspergillus fumigatus. Mycophenolic acid (MPA) and Everolimus
(RAD) are both immunosuppressive agents. They act through the inhibition of B- and
T-cells. However, the direct influence on DCs has also been described which is
important as DCs play an important role in pathogen defence and by linking innate and
acquired immunity. In addition DCs have moved to the focus of science as they could
also be used as vaccines against different diseases including IA. As IA mostly occurs in
immunosuppressed
patients,
more
comprehension
about
the
impact
of
immunosuppressive agents on the functionality of DCs is needed.
Here, the impact of MPA and RAD on the differentiation, maturation and
immunresponse of human monocyte derived DCs (moDC) during interaction with A.
fumigatus was investigated. MPA and RAD were added during different times of DC
development. Both medicaments showed an influence on DC differentiation. Beside a
reduced expression of cytokines after interaction with A. fumigatus, a decreased
expression of surface markers was shown for immature DCs (iDC) and mature DCs
(mDC). Furthermore, the phagocytotic capacity of iDCs was reduced. In addition, MPA
and even more RAD showed high cytotoxic effects on DCs.
In conclusion, a direct impact of MPA and RAD on the differentiation and maturation
of moDCs and their immune response to A. fumigatus could be shown.
61
7
Literaturverzeichnis
1.
Fearon, D.T. and R.M. Locksley, The instructive role of innate immunity in the
acquired immune response. Science, 1996. 272(5258): p. 50-3.
Tosi, M.F., Innate immune responses to infection. J Allergy Clin Immunol,
2005. 116(2): p. 241-9; quiz 250.
Medzhitov, R., P. Preston-Hurlburt, and C.A. Janeway, Jr., A human homologue
of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature,
1997. 388(6640): p. 394-7.
Cohen, J., The immunopathogenesis of sepsis. Nature, 2002. 420(6917): p. 88591.
Verstak, B., P. Hertzog, and A. Mansell, Toll-like receptor signalling and the
clinical benefits that lie within. Inflamm Res, 2007. 56(1): p. 1-10.
Underhill, D.M., et al., The Toll-like receptor 2 is recruited to macrophage
phagosomes and discriminates between pathogens. Nature, 1999. 401(6755): p.
811-5.
Tabeta, K., et al., Toll-like receptors 9 and 3 as essential components of innate
immune defense against mouse cytomegalovirus infection. Proc Natl Acad Sci U
S A, 2004. 101(10): p. 3516-21.
Akira, S., S. Uematsu, and O. Takeuchi, Pathogen recognition and innate
immunity. Cell, 2006. 124(4): p. 783-801.
Braedel, S., et al., Aspergillus fumigatus antigens activate innate immune cells
via toll-like receptors 2 and 4. Br J Haematol, 2004. 125(3): p. 392-9.
Zhao, J. and X.Y. Wu, Triggering of toll-like receptors 2 and 4 by Aspergillus
fumigatus conidia in immortalized human corneal epithelial cells to induce
inflammatory cytokines. Chin Med J (Engl), 2008. 121(5): p. 450-4.
Takeda, K. and S. Akira, TLR signaling pathways. Semin Immunol, 2004. 16(1):
p. 3-9.
Akira, S. and K. Takeda, Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol, 2004.
4(7): p. 499-511.
Lüllmann-Rauch, R., Histologie. 2003, Thieme Verlag. p. 236 f.
Ziegler-Heitbrock, H.W., Definition of human blood monocytes. J Leukoc Biol,
2000. 67(5): p. 603-6.
Fahy, R.J., et al., Inflammasome mRNA expression in human monocytes during
early septic shock. Am J Respir Crit Care Med, 2008. 177(9): p. 983-8.
Steinman, R.M. and Z.A. Cohn, Identification of a novel cell type in peripheral
lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp
Med, 1973. 137(5): p. 1142-62.
Banchereau, J., et al., Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol,
2000. 18: p. 767-811.
Banchereau, J. and R.M. Steinman, Dendritic cells and the control of immunity.
Nature, 1998. 392(6673): p. 245-52.
Reid, C.D., The biology and clinical applications of dendritic cells. Transfus
Med, 1998. 8(2): p. 77-86.
Munz, C., R.M. Steinman, and S. Fujii, Dendritic cell maturation by innate
lymphocytes: coordinated stimulation of innate and adaptive immunity. J Exp
Med, 2005. 202(2): p. 203-7.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
62
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
Cella, M., F. Sallusto, and A. Lanzavecchia, Origin, maturation and antigen
presenting function of dendritic cells. Curr Opin Immunol, 1997. 9(1): p. 10-6.
Reis e Sousa, C., Toll-like receptors and dendritic cells: for whom the bug tolls.
Semin Immunol, 2004. 16(1): p. 27-34.
Prechtel, A.T. and A. Steinkasserer, CD83: an update on functions and
prospects of the maturation marker of dendritic cells. Arch Dermatol Res, 2007.
299(2): p. 59-69.
Zhou, L.J. and T.F. Tedder, CD14+ blood monocytes can differentiate into
functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996.
93(6): p. 2588-92.
Caux, C., et al., GM-CSF and TNF-alpha cooperate in the generation of
dendritic Langerhans cells. Nature, 1992. 360(6401): p. 258-61.
Schuler, G. and R.M. Steinman, Dendritic cells as adjuvants for immunemediated resistance to tumors. J Exp Med, 1997. 186(8): p. 1183-7.
Mezger, M., et al., Proinflammatory response of immature human dendritic cells
is mediated by dectin-1 after exposure to Aspergillus fumigatus germ tubes. J
Infect Dis, 2008. 197(6): p. 924-31.
Romani, N., et al., Generation of mature dendritic cells from human blood. An
improved method with special regard to clinical applicability. J Immunol
Methods, 1996. 196(2): p. 137-51.
Abe, M. and A.W. Thomson, Influence of immunosuppressive drugs on
dendritic cells. Transpl Immunol, 2003. 11(3-4): p. 357-65.
Borish, L.C. and J.W. Steinke, 2. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin
Immunol, 2003. 111(2 Suppl): p. S460-75.
Ozaki, K. and W.J. Leonard, Cytokine and cytokine receptor pleiotropy and
redundancy. J Biol Chem, 2002. 277(33): p. 29355-8.
Ortmann, R.A., et al., Janus kinases and signal transducers and activators of
transcription: their roles in cytokine signaling, development and
immunoregulation. Arthritis Res, 2000. 2(1): p. 16-32.
Lykouras, D., et al., Role and pharmacogenomics of TNF-alpha in asthma. Mini
Rev Med Chem, 2008. 8(9): p. 934-42.
Holscher, C., The power of combinatorial immunology: IL-12 and IL-12-related
dimeric cytokines in infectious diseases. Med Microbiol Immunol, 2004. 193(1):
p. 1-17.
Steinke, J.W. and L. Borish, 3. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin
Immunol, 2006. 117(2 Suppl Mini-Primer): p. S441-5.
Thelen, M., Dancing to the tune of chemokines. Nat Immunol, 2001. 2(2): p.
129-34.
Phadke, A.P., et al., The role of CC chemokine receptor 6 in host defense in a
model of invasive pulmonary aspergillosis. Am J Respir Crit Care Med, 2007.
175(11): p. 1165-72.
Mezger, M., et al., Polymorphisms in the chemokine (C-X-C motif) ligand 10 are
associated with invasive aspergillosis after allogeneic stem cell transplantation
and influence CXCL10 expression in monocyte-derived dendritic cells. Blood,
2007.
Denning, D.W., Invasive aspergillosis. Clin Infect Dis, 1998. 26(4): p. 781-803;
quiz 804-5.
63
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
Latge, J.P., Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin Microbiol Rev, 1999.
12(2): p. 310-50.
University-of-Adelaide. [cited 17.06.2010]; Available from:
http://www.mycology.adelaide.edu.au/gallery/hyaline_moulds/.
Latge, J.P., The pathobiology of Aspergillus fumigatus. Trends Microbiol, 2001.
9(8): p. 382-9.
Elliott, M.W. and A.J. Newman Taylor, Allergic bronchopulmonary
aspergillosis. Clin Exp Allergy, 1997. 27 Suppl 1: p. 55-9.
Gniadek, A. and A.B. Macura, Intensive care unit environment contamination
with fungi. Adv Med Sci, 2007. 52: p. 283-7.
Latge, J.P. and R. Calderone, Host-microbe interactions: fungi invasive human
fungal opportunistic infections. Curr Opin Microbiol, 2002. 5(4): p. 355-8.
Khoo, S.H. and D.W. Denning, Invasive aspergillosis in patients with AIDS.
Clin Infect Dis, 1994. 19 Suppl 1: p. S41-8.
Singh, N. and D.L. Paterson, Aspergillus infections in transplant recipients. Clin
Microbiol Rev, 2005. 18(1): p. 44-69.
Singh, N., et al., Late-onset invasive aspergillosis in organ transplant recipients
in the current era. Med Mycol, 2006. 44(5): p. 445-9.
Sole, A., et al., Aspergillus infections in lung transplant recipients: risk factors
and outcome. Clin Microbiol Infect, 2005. 11(5): p. 359-65.
Caston-Osorio, J.J., A. Rivero, and J. Torre-Cisneros, Epidemiology of invasive
fungal infection. Int J Antimicrob Agents, 2008. 32 Suppl 2: p. S103-9.
Lewis, R.E. and D.P. Kontoyiannis, Invasive aspergillosis in glucocorticoidtreated patients. Med Mycol, 2009. 47 Suppl 1: p. S271-81.
Aquino, V.R., L.Z. Goldani, and A.C. Pasqualotto, Update on the contribution
of galactomannan for the diagnosis of invasive aspergillosis. Mycopathologia,
2007. 163(4): p. 191-202.
Verdaguer, V., et al., Galactomannan antigen detection in the diagnosis of
invasive aspergillosis. Expert Rev Mol Diagn, 2007. 7(1): p. 21-32.
Einsele, H. and J. Loeffler, Contribution of new diagnostic approaches to
antifungal treatment plans in high-risk haematology patients. Clin Microbiol
Infect, 2008. 14 Suppl 4: p. 37-45.
Fluckiger, U., et al., Treatment options of invasive fungal infections in adults.
Swiss Med Wkly, 2006. 136(29-30): p. 447-63.
Patterson, T.F., Treatment of invasive aspergillosis: Polyenes, echinocandins, or
azoles? Med Mycol, 2006. 44 Suppl: p. 357-62.
Denning, D.W., Treatment of invasive aspergillosis. J Infect, 1994. 28 Suppl 1:
p. 25-33.
Kwon, D.S. and E. Mylonakis, Posaconazole: a new broad-spectrum antifungal
agent. Expert Opin Pharmacother, 2007. 8(8): p. 1167-78.
Maschmeyer, G., A. Haas, and O.A. Cornely, Invasive aspergillosis:
epidemiology, diagnosis and management in immunocompromised patients.
Drugs, 2007. 67(11): p. 1567-601.
Heinz, W.J. and H. Einsele, Caspofungin for treatment of invasive aspergillus
infections. Mycoses, 2008. 51 Suppl 1: p. 47-57.
Knapp-Ulrich, S. Einfluss von Cyclodextrinen auf die okulare Verfügbarkeit von
Antiglaukomatosa und Immunsuppressiva in vitro / in vivo, Diss., Uni Berlin.
64
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
2004 [cited 2009 05.02]; Available from: http://edoc.huberlin.de/dissertationen/knapp-ulrich-sigrid-ursula-2004-09-13/HTML/.
Allison, A.C. and E.M. Eugui, The design and development of an
immunosuppressive drug, mycophenolate mofetil. Springer Semin
Immunopathol, 1993. 14(4): p. 353-80.
Allison, A.C. and E.M. Eugui, Mechanisms of action of mycophenolate mofetil
in preventing acute and chronic allograft rejection. Transplantation, 2005. 80(2
Suppl): p. S181-90.
Karow, K. and R. Lang-Roth, Allgemeine und Spezielle Pharmakologie und
Toxikologie. 15 ed. 2007.
Zwerner, J. and D. Fiorentino, Mycophenolate mofetil. Dermatol Ther, 2007.
20(4): p. 229-38.
Haufs, M.G., et al., Psoriasis vulgaris treated successfully with mycophenolate
mofetil. Br J Dermatol, 1998. 138(1): p. 179-81.
Hochegger, K., J. Gruber, and K. Lhotta, Acute inflammatory syndrome induced
by mycophenolate mofetil in a patient following kidney transplantation. Am J
Transplant, 2006. 6(4): p. 852-4.
Land, W., Ciclosporin in der Transplantationsmedizin. 2001: Georg Thieme
Verlag.
Sehgal, S.N., H. Baker, and C. Vezina, Rapamycin (AY-22,989), a new
antifungal antibiotic. II. Fermentation, isolation and characterization. J Antibiot
(Tokyo), 1975. 28(10): p. 727-32.
Patel, J.K. and J.A. Kobashigawa, Everolimus: an immunosuppressive agent in
transplantation. Expert Opin Pharmacother, 2006. 7(10): p. 1347-55.
Dancey, J.E., Therapeutic targets: MTOR and related pathways. Cancer Biol
Ther, 2006. 5(9): p. 1065-73.
Smolewski, P., Recent developments in targeting the mammalian target of
rapamycin (mTOR) kinase pathway. Anticancer Drugs, 2006. 17(5): p. 487-94.
Dunn, C. and K.F. Croom, Everolimus: a review of its use in renal and cardiac
transplantation. Drugs, 2006. 66(4): p. 547-70.
Universität-Bern. [cited 17.06.2010]; Available from: http://elearning.studmed.unibe.ch/hemosurf_demo/Lab-Images/chambre_scheme.jpg.
Sallusto, F. and A. Lanzavecchia, Efficient presentation of soluble antigen by
cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage
colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor
necrosis factor alpha. J Exp Med, 1994. 179(4): p. 1109-18.
BGFA. Ruhr Universität Bochum. [cited 17.06.2010]; Available from:
http://www.bgfa.ruhr-uni-bochum.de/publik/info0201/pcr2.php?SD=1.
Baczynska, A., et al., Development of real-time PCR for detection of
Mycoplasma hominis. BMC Microbiol, 2004. 4: p. 35.
Krauter, J., et al., Prognostic value of minimal residual disease quantification by
real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with core
binding factor leukemias. J Clin Oncol, 2003. 21(23): p. 4413-22.
Johnson, M.R., et al., Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase
expression by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Anal
Biochem, 2000. 278(2): p. 175-84.
Herzenberg, L.A., R.G. Sweet, and L.A. Herzenberg, Fluorescence-activated
cell sorting. Sci Am, 1976. 234(3): p. 108-17.
65
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
Institut-für-Pathologie. Universität Bern. [cited 05.02.2009]; Available from:
http://www.facslab.unibe.ch/scan2.gif.
Colic, M., et al., Mycophenolate mofetil inhibits differentiation, maturation and
allostimulatory function of human monocyte-derived dendritic cells. Clin Exp
Immunol, 2003. 134(1): p. 63-9.
Dubsky, P.C., et al., Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase inhibition by
mycophenolic acid impairs maturation and function of dendritic cells. Clin
Chim Acta, 2006. 364(1-2): p. 139-47.
Bauer, R., Mezger, M., Blockhaus, C., Schmitt, A-L., Kurzai, O., Einsele, H.,
Loeffler, J., Influence of 40-0-[2-Hydroxy-ethyl] rapamycin (RAD) on Human
Dendritic Cell Function during Exposure to Aspergillus fumigatus. 2010: in
Vorbereitung.
Balloy, V. and M. Chignard, The innate immune response to Aspergillus
fumigatus. Microbes Infect, 2009. 11(12): p. 919-27.
Clemons, K.V., et al., Pathogenesis I: interactions of host cells and fungi. Med
Mycol, 2000. 38 Suppl 1: p. 99-111.
Walsh, T.J., et al., Control, immunoregulation, and expression of innate
pulmonary host defenses against Aspergillus fumigatus. Med Mycol, 2005. 43
Suppl 1: p. S165-72.
Shoham, S. and S.M. Levitz, The immune response to fungal infections. Br J
Haematol, 2005. 129(5): p. 569-82.
Ben-Ami, R., R.E. Lewis, and D.P. Kontoyiannis, Invasive mould infections in
the setting of hematopoietic cell transplantation: current trends and new
challenges. Curr Opin Infect Dis, 2009. 22(4): p. 376-84.
Perruccio, K., et al., Prospects for dendritic cell vaccination against fungal
infections in hematopoietic transplantation. Blood Cells Mol Dis, 2004. 33(3):
p. 248-55.
Brossart, P., et al., Dendritic cells in cancer vaccines. Exp Hematol, 2001.
29(11): p. 1247-55.
Hackstein, H. and A.W. Thomson, Dendritic cells: emerging pharmacological
targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol, 2004. 4(1): p. 24-34.
Bozza, S., et al., Dendritic cell-based vaccination against opportunistic fungi.
Vaccine, 2004. 22(7): p. 857-64.
Piemonti, L., et al., Glucocorticoids affect human dendritic cell differentiation
and maturation. J Immunol, 1999. 162(11): p. 6473-81.
Dietz, A.B., et al., A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells
from leukoreduction system chambers. Transfusion, 2006. 46(12): p. 2083-9.
Mehling, A., et al., Mycophenolate mofetil impairs the maturation and function
of murine dendritic cells. J Immunol, 2000. 165(5): p. 2374-81.
Geng, L., et al., Mycophenolic acid upregulates B7-DC expression on dendritic
cells, which is associated with impaired allostimulatory capacity of dendritic
cells. Transplant Proc, 2006. 38(5): p. 1622-4.
Mezger, M., et al., Impact of Mycophenolic Acid on the Functionality of Human
Polymorphonuclear Neutrophils and Dendritic Cells during Interaction with
Aspergillus fumigatus. Antimicrob Agents Chemother, 2008.
Schuler, W., et al., SDZ RAD, a new rapamycin derivative: pharmacological
properties in vitro and in vivo. Transplantation, 1997. 64(1): p. 36-42.
66
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
Woltman, A.M., et al., Rapamycin induces apoptosis in monocyte- and CD34derived dendritic cells but not in monocytes and macrophages. Blood, 2001.
98(1): p. 174-80.
Woltman, A.M., et al., Rapamycin specifically interferes with GM-CSF
signaling in human dendritic cells, leading to apoptosis via increased p27KIP1
expression. Blood, 2003. 101(4): p. 1439-45.
Ding, Y., et al., Rapamycin modulates the maturation of rat bone marrowderived dendritic cells. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2008. 28(4):
p. 391-5.
Ko, H., et al., Dentritic cell derived IL-18 production is inhibited by rapamycin
and sanglifehrin A, but not cyclosporine A. Transpl Immunol, 2008. 20(1-2): p.
99-105.
Monti, P., et al., Rapamycin impairs antigen uptake of human dendritic cells.
Transplantation, 2003. 75(1): p. 137-45.
Fedoric, B. and R. Krishnan, Rapamycin downregulates the inhibitory receptors
ILT2, ILT3, ILT4 on human dendritic cells and yet induces T cell
hyporesponsiveness independent of FoxP3 induction. Immunol Lett, 2008.
120(1-2): p. 49-56.
Ahn, J.S., D.K. Krishnadas, and B. Agrawal, Dendritic cells partially abrogate
the regulatory activity of CD4+CD25+ T cells present in the human peripheral
blood. Int Immunol, 2007. 19(3): p. 227-37.
Melief, C.J., Cancer immunotherapy by dendritic cells. Immunity, 2008. 29(3):
p. 372-83.
Zelante, T., et al., Manipulating immunity against Aspergillus fumigatus. Med
Mycol, 2006. 44 Suppl: p. 237-43.
Zhong, H., M.R. Shurin, and B. Han, Optimizing dendritic cell-based
immunotherapy for cancer. Expert Rev Vaccines, 2007. 6(3): p. 333-45.
Vulink, A., et al., Dendritic cells in cancer immunotherapy. Adv Cancer Res,
2008. 99: p. 363-407.
Beck, O., et al., Generation of highly purified and functionally active human
TH1 cells against Aspergillus fumigatus. Blood, 2006. 107(6): p. 2562-9.
Einsele, H., M. Kapp, and G.U. Grigoleit, CMV-specific T cell therapy. Blood
Cells Mol Dis, 2008. 40(1): p. 71-5.
Einsele, H., et al., Induction of CMV-specific T-cell lines using Ag-presenting
cells pulsed with CMV protein or peptide. Cytotherapy, 2002. 4(1): p. 49-54.
Einsele, H., et al., Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the
treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood,
2002. 99(11): p. 3916-22.
Tacken, P.J., R. Torensma, and C.G. Figdor, Targeting antigens to dendritic
cells in vivo. Immunobiology, 2006. 211(6-8): p. 599-608.
Tacken, P.J., et al., Dendritic-cell immunotherapy: from ex vivo loading to in
vivo targeting. Nat Rev Immunol, 2007. 7(10): p. 790-802.
Lagaraine, C., et al., Induction of human CD4+ regulatory T cells by
mycophenolic acid-treated dendritic cells. J Leukoc Biol, 2008. 84(4): p. 105764.
Devyatko, E., et al., Lymphocyte activation and correlation with IMPDH activity
under therapy with mycophenolate mofetil. Clin Chim Acta, 2008.
67
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
Sordi, V., et al., Differential effects of immunosuppressive drugs on chemokine
receptor CCR7 in human monocyte-derived dendritic cells: selective
upregulation by rapamycin. Transplantation, 2006. 82(6): p. 826-34.
Hackstein, H., Rapamycin and dendritic cells: keep on movin'. Transplantation,
2006. 82(6): p. 739-40.
Turnquist, H.R., et al., Rapamycin-conditioned dendritic cells are poor
stimulators of allogeneic CD4+ T cells, but enrich for antigen-specific Foxp3+
T regulatory cells and promote organ transplant tolerance. J Immunol, 2007.
178(11): p. 7018-31.
Turnquist, H.R. and A.W. Thomson, Taming the lions: manipulating dendritic
cells for use as negative cellular vaccines in organ transplantation. Curr Opin
Organ Transplant, 2008. 13(4): p. 350-7.
Taner, T., et al., Rapamycin-treated, alloantigen-pulsed host dendritic cells
induce ag-specific T cell regulation and prolong graft survival. Am J
Transplant, 2005. 5(2): p. 228-36.
Vukanic, Z.S., M. Colic, and M. Dimitrijevic, Effect of pentoxifylline on
differentiation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells in
vitro. Int Immunopharmacol, 2007. 7(2): p. 167-74.
Leslie, D.S., et al., Serum lipids regulate dendritic cell CD1 expression and
function. Immunology, 2008.
Gogolak, P., et al., Differentiation of CD1a- and CD1a+ monocyte-derived
dendritic cells is biased by lipid environment and PPARgamma. Blood, 2007.
109(2): p. 643-52.
68
8
Abkürzungen
APC
antigenpräsentierende Zelle
bp
base pairs (Basenpaare)
CD
cluster of differentiation
cDNA
copy DNA
Cp
Crossing Points
DC
dendritische Zelle
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
Fa.
Firma
FACS
fluorescence activated cell sorting (Durchflusszytometrie)
FCS
fetal calf serum (fetales Kälberserum)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FRET
fluorescence resonance energy transfer
GM-CSF
granulocyte macrophage colony stimulating factor
GTP
Guanosintriphosphat
GvHD
Graft-versus-Host-Disease (Transplantat-Wirt-Reaktion)
HBSS
Hanks' Balanced Salt Solution
IA
invasive Aspergillose
iDC
immature DC (unreife dendritische Zelle)
IL
Interleukin
IMPDH
Inosinmonophosphat-Dehydrogenase
kD
Kilodalton
l
Liter
LC
LightCycler
LPS
Lipopolysaccharid
M
Molar
MACS
magnetic cell sorting (magnetische Trennsäule)
mDC
mature DC (reife DC)
MgCl
Magnesiumchlorid
MHC
major histocompatibility complex
min
Minute
69
ml
Milliliter
mm
Millimeter
MMF
Mycophenolat-Mofetil
moDC
monocyte derived DC (aus Monozyten gereifte DC)
MPA
Mycophenolsäure
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
mRNA
messenger (=Boten-) Ribonukleinsäure
PAMP
pathogen associated molecular pattern
PBMC
peripheral blood mononuclear cell
PCR
polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PE
Phycoerythrin
PRR
pattern recognition receptor
qRT-PCR
quantitative Real-Time-PCR
RAD
40-0-[2-Hydroxy-ethyl] rapamycin
RAPA
Rapamycin
RNA
Ribonukleinsäure
rpm
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
RT
Reverse Transkriptase
sec
Sekunde
TLR
Toll-Like-Rezeptor
TNF
Tumornekrosefaktor
VEGF
vascular endothelian growth factor
ZNS
Zentrales Nervensystem
70