30.09.2015
FACULTY OF SCIENCE
Pasteurisierung von Spendermilch
Lukas Christen, PhD
Bioaktivität versus Mikroorganismen
Perth, die isolierteste
Metropole der Welt
2‘104km bis Adelaide
3‘291km bis Sydney
The University of Western Australia
1
30.09.2015
The University of Western Australia
The University of Western Australia
2
30.09.2015
Forschungsort „Australien“
Ursäuger (Eierlegende Säugetiere)
Beuteltier
„Frühgeborene“ als Standard
The University of Western Australia
Beuteltier
The University of Western Australia
3
30.09.2015
Spendermilch
Donor milk
The University of Western Australia
WHO Empfehlung
1. Stillen
2. Abgepumpe Muttermilch
3. Spendermilch
4. Muttermilchersatz-Nahrung
The University of Western Australia
4
30.09.2015
Milchbank
Sicherheit für den Empfänger von Spendermilch hat die höchste Priorität in
Milchbanken
Pasteurisierung ist einer der wichtigsten Schritte um die Sicherheit zu
gewährleisten
Landers & Hartmann, 2013
The University of Western Australia
Milchbanken-Richtlinien in Australien
Spender Screening
HIV, HTLV, Hepatitis B und C, Syphilis
Bakteriologische Analyse vor der Pasteurisierung
Gesamtzahl der Bakterien <100'000 KBE/ml (koloniebildende Einheit / ml)
Keine hitzebeständige Enterotoxin bildende Pathogene
Pasteurisierung (Holder Methode)
Bakteriologische Analyse nach der Pasteurisierung
Gesamtzahl der Bakterien <5 CFU/ml
Dokumentation
Nachverfolgbarkeit vom Spender bis Empfänger
Dokumentation von allen Lagerung- und Behandlungsparametern
Hartmann et al. 2007
The University of Western Australia
5
30.09.2015
Erfindung der Pasteurisierung
The University of Western Australia
Pasteurisation von Milch
1117
Wärmebehandlung von Wein (China)
1568
Erhitzen von Milchprodukten (Japan)
1864
Luis Pasteur erfindet den modernen Pasteurisierungs-Prozess
1886
Franz von Soxhlet schlägt die Pasteurisierung von Kuhmilch vor
1909
Deutsche Physiker behandeln Menschenmilch mit Wasserstoffperoxid
1920s
Erfolgreiche Gefriertrocknung von Kuhmilch in grossen Mengen
1922
Walzentrockner für Menschenmilch am Boston Floating Hospital
1924
Erste Beschreibung der Holder-Methode (142°F / 61.1°C für 30 Minuten)
1938
Wilmers beschreibt “Eine einfache Methode um Menschenmilch haltbar
zu machen” (Behandlung bei 79°C für 30min, wiederholen nach 24 und 48 Stunden)
The University of Western Australia
6
30.09.2015
Aktuelle Pasteurisierungs Methode
Holder Pasteurisierung wird in den meisten Milchbanken angewendet
Wärmebehandlung im Wasserbad (62.5°C für 30 min)
The University of Western Australia
Holder Pasteurisierung
The University of Western Australia
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30.09.2015
BAL in Menschenmilch
Pankreaslipase
Hydrolysiert das Triglyceride in ein Monoglyceride und 2 freie Fettsäuren
Gallensalz-aktivierte Lipase (BAL)
Hydrolysiert das Triglyceride in ein Glycerin und 3 freie Fettsäuren
Hernell & Blackberg, 1982
The University of Western Australia
Fett Absorption
Frühgebohrene Babies ernährt mit pasteurisierter Menschenmilch haben eine
reduzierte Wachstumsrate verglichen mit denen ernährt mit unbehandelter
Menschenmilch.
Andersson et al. 2007
The University of Western Australia
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30.09.2015
BAL nach der Holder Pasteurisierung
Gallensalz-aktivierte Lipase
inaktiviert
Es ist wahrscheinlich dass die Inaktivation von BAL durch die
Wärmebehandlung verantwortlich für die unterschiedlichen Wachstumsraten in
Andersson’s Studie ist.
Czank et al. (2009), Tully et al. (2001), Henderson et al. (1998)
The University of Western Australia
Inaktivation von BAL
Wardell (1984)
The University of Western Australia
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30.09.2015
Lactoferrin
Eisenbindendes Protein
(verlangsamt Vermehrung von Eisenabhängigen Bakterien und Pilzen)
Hemmt das Anhaften und Eindringen von Bakterien in Säugetier Zellen
Anti-Virus Aktivitäten (wird noch nicht komplett verstanden)
Hemmt Eisenabhängige Lipidperoxidation
Anti-Tumor Aktivitäten
Freisetzung von Lactoferricin (Peptid)
- antimikrobielle, antivirale und antifungale Aktivitäten
- Stimuliert das Immunsystem
- Neutralisiert Endotoxine
Schützender Effekt gegen mehrere Arten von Infektionen
The University of Western Australia
Lysozym
Konzentration 3000mal höher als in Kuhmilch
Lysis der meisten gram-positiven Bakterien
Bakterizid gegen gram-negative Bakterien in Synergie mit Lactoferrin
Aktivitäten gegen HIV (in vitro)
- agiert gegen den freien Virus und am zellgebunden Virus
Aktivitäten gegen Amöben
The University of Western Australia
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30.09.2015
sIgA
Antikörper
Resistent gegen Proteolyse im Magen-Darm-Trakt
Neutralisiert Gifte
Fördert die Immunabwehr des Kindes
The University of Western Australia
Spätsepsis und invasive Pilzinfektion
Spätsepsis (LOS)
Sepsis nach den ersten 48 Stunden nach der Geburt
Erworben um den Geburtszeitpunk oder während dem Krankenhausaufenthalt
(Bakterien, Viren oder Pilze)
Risikofaktoren
- langer Krankenhausaufenthalt
- intravenöser Katheter, Endotrachealschlauch etc.
- Infektionen durch Personal und Eltern
Invasive Pilzinfektion (IFI)
Hauptsächlich verursacht durch Candida spp
Kolonisierung findet bei über 46% von VLBW
10–30% der Kolonisierung entwickeln sich zu einer systemischen Infektion
The University of Western Australia
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30.09.2015
NEC
Nekrotisierende Enterokolitis
Vorkommen bei VLBW: ~10%
Mortalitätsrate: 30%
Ursache: nicht zweifellos geklärt
Prävention: wird nicht komplett verstanden
- Probiotische Bakterien
- sIgA
- Epidermale Wachstumsfaktoren
- Interleukine und Cytokine
- Mikrobiom
- Menschenmilch
The University of Western Australia
Spätsepsis
Vorkommnis bei sehr kleinen Frühgeborenen (VLBW) wenn ernährt mit:
Muttermilch
Pasteurisierte Menschenmilch
Muttermilchersatz
23%
29%
30%
(16/70)
(23/78)
(26/88)
Schanler et al. 2005
The University of Western Australia
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30.09.2015
Lactoferrin in vivo Studie
Muttermilch
(MM)
MM + 100mg/d
bovine Lactoferrin
Gesamt Spätsepsis
17.3% (29/168)
5.9% (9/153)
gram-positive bakterielle LOS
7.7% (13/168)
1.3% (2/153)
gram-negative bakterielle LOS
10.1% (17/168)
4.6% (7/153)
Pilz Kolonialisierung
18.5% (31/168)
17.6% (27/153)
Invasive Pilzinfektion
7.7% (13/168)
0.7% (1/153)
NEC – 2nd Stage
5.4% (14/258)
2% (5/247)
Manzoni et al. 2009; Manzoni et al. 2012; Manzoni et al. 2014
The University of Western Australia
Konzentration nach der Holder Pasteurisierung
Gallensalz-aktivierte Lipase (BAL)
0%
Alkalische Phosphatase (ALP)
0%
Lactoferrin
~ 22%
Lysozym
~ 39%
Sekretorische IgA
~ 72%
Czank et al. (2009), Tully et al. (2001), Henderson et al. (1998)
The University of Western Australia
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30.09.2015
Immunologische Proteine in Menschenmilch
Zusätzliche 700 Proteine entdeckt (Total 976)
Ein Viertel hat eine immunologische Funktion
Synergetische Effekte von zahlreichen Komponenten sind noch nicht
untersucht
Molinari et al. (2012), Gao (2012)
The University of Western Australia
Wirkung von Menschenmilch auf Frühgeborene
Tiefere Mortalität
Kürzere Krankenhausaufenthalte
Tiefere Infektionsraten
Besseres Neuroentwicklung
Assoziiert mit besserer Gesundheit im Erwachsenenalter
The American Academy of Pediatrics (2012), Schanler & Atkinson (2005), Wight (2001)
The University of Western Australia
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30.09.2015
Nahrungsmittelindustrie - Pasteurisierung
The University of Western Australia
Milchindustrie vs. Milchbanken
Milchprodukte
Spendermilch
reduzieren
reduzieren
Nutritional proteins
schützen
schützen
Sensorische Qualität
schützen
---
Enzymatische Aktivität
reduzieren
schützen
Immunologische- und
entwicklungs Proteine
---
schützen
Mikrobiologische Last
The University of Western Australia
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30.09.2015
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
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30.09.2015
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
Milk cells (20 - 4µm)
Human milk
components
Filtration
Milk fat globule (15 – 0.1µm)
Casein micelle (300 - 100nm)
Proteins (10 - 3nm)
Micro-organism
Lactose (1nm)
Protozoa and fungi (100 – 10µm)
Bacteria (5 – 0.2µm)
Chlamydia (500 - 200nm)
Viruses (300 - 10nm)
Macro-Molecules (10 - 1nm)
Molecules
Atoms
1mm
1000µm
0.1mm
100µm
0.01mm 0.001mm
10µm
1µm
1000nm
0.1µm
100nm
0.01µm 0.001µm
10nm
1nm
0.1nm
0.01nm
The University of Western Australia
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30.09.2015
Baktofugation
Hohe Zentrifugalkräfte
Sporen Reduktion 95 bis 98%
Vegetative Bakterien Reduktion ~89%
(Anhaftung von Bakterien an Milchfett-Globulus)
Meistens verwendet in Kombination mit thermaler Pasteurisierung
Anwendung in Käseproduktion => Reduktion von Sporen
Stack & Sillen, 1998; Aae 1980; Torres-Anjel & Hedrick, 1971
The University of Western Australia
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
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30.09.2015
Thermale Pasteurisierung
Mechanismus der Innaktivierung
Beschädigung der Zellmembrane
Verlust von Nährstoffen und Ionen
Ribosom Aggregation
DNA-Faden Bruch
Innaktivierung von essenziellen Enzymen
Protein Koagulierung
The University of Western Australia
Holder Pasteurisierung
62.5°C für 30 Minuten
Vegetative Bakterien Reduktion von log10 5
Eliminiert CMV, HIV und HTLV
(1 von 100’000 KBE/ml überlebt)
Wills et al. 1982
62.5°C für 5 Minuten
56°C für 15 Minuten (Immunologische Proteine >90%, Bakterien log10 2)
Czank et al. 2009
57°C für 30 Minuten (Immunologische Proteine >90%, Bakterien log10 3)
BAL ist komplett Innaktiverit bei all diesen vorgeschlagenen Methoden
The University of Western Australia
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30.09.2015
Flash Pasteurisierung
High temperature short time (HTST) (Hohe Temperatur, kurze Zeit)
72°C für 15 Sekunden
Grosse Vielfalt von widersprüchlichen Daten!
Mangel an Methodik
Kein Aufzeichnen der Behandlungstemperatur der Milch
Keine Verifikation (Bakterielle Last oder ALP-Aktivität)
The University of Western Australia
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
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30.09.2015
Hochdruck
Flüssigkeit wird unter Hochdruck versetzt
Kompression zerreisst Zellmembrane
Vegetative Bakterien >100 MPa (1000 bar)
E. coli ist Druckresistent (log10 2 Reduktion bei 800 MPa)
Sporen >1200 MPa
Druck denaturierte Proteine unterscheiden sich von Wärme denaturierten
Proteinen => möglicherweise mit ernährungstechnischen Konsequenzen
Nieder Temperatur Prozess (23°C Erhöhung bei 800 MPa)
Phasenwechsel bei den Lipiden
Hite, 1899; Larson, 1918; Heremens, 1995; Patterson, 1995
The University of Western Australia
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
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30.09.2015
Pulsed Electric Field
The University of Western Australia
Pulsierendes-Elektrisches-Feld
Pulse mit Hochspannung (20 – 80 kV/cm)
Elektroporation der Zellmembrane führt zur Lysis
Effektiv bei vegetativen Bakterien, Hefen und Schimmel
Enzym Reduktion in Protein-Lösungen
• Lipase Reduktion 70-85%
• Peroxidase Reduktion 30-40%
• Alkalische Phosphatase Reduktion ~5%
Gould, 2001; Wouters & Smelt, 1997; Ho et al. 1997
The University of Western Australia
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30.09.2015
Oszillierendes Magnetisches Feld
Starkes magnetisches Feld (2 – 100 T) für 25µs bis 2ms
Frequenzen zwischen 5 und 500kHz
Inaktivierungsmechanismus unbekannt
(möglicherweise wird der Ionenfluss über der Zellmembrane verändert)
Log10 2 Reduktion von S. aureus in Milch
Pothakamury et al. 1993; Hofmann, 1995
The University of Western Australia
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
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30.09.2015
Ultrasonication
Ultraschall Reinigung
20 – 40 kHz
Therapeutischer Ultraschall
250 kHz – 2 MHz
Dispensieren, Suspendieren, Emulsifieren, etc.
20 – 100 kHz
The University of Western Australia
Diagnostischer Ultraschall
5 – 10 MHz
Effect of Ultrasound
Power-Ultraschall (20 – 100 kHz) kreiert Kavitation
Kavitation: Formierung, Wachstum und Implosion von Dampfblasen
Lokale Hotspots (~5000°C, ~50MPa, wenige Mikrosekunden)
Implosion resultiert in einer Schockwelle
Schockwelle zerreisst Zellmembrane und führt zur Lysis
Suslick, 1990; Cameron et al. 2008; Allison et al. 1996
The University of Western Australia
24
30.09.2015
Effect of Cavitation
Kavitation an Schiffsschraube
Kavitation an Ultraschall-Horn
The University of Western Australia
Ultrasonication von Kuhmilch
Eliminierung von Bakterien gleich oder besser als bei thermaler
Pasteurisierung
Eliminierung von gewissen Pilzen und Viren möglich
Ultraschall–Thermal Kombinierung erhöht Effizienz
Thermosonication von Menschenmilch
• Log10 3 Reduktion von Bakterien
• Retention Lactoferrin ~77%
• Retention BAL ~45%
D’Amico et al. 2006; Piyasena et al. 2003; Sherba e al. 1991; Czank et al. 2010
The University of Western Australia
25
30.09.2015
E. Coli Reduction
The University of Western Australia
Christen et al. 2012
BSSL Retention
The University of Western Australia
Christen et al. 2012
26
30.09.2015
Schlussfolgerung
Kritische Temperatur von BAL zwischen 51 und 58°C
Unter diesem Level
• BAL Verlust minimal (~10%)
• Exponentielle E. coli Reduktion
Behandlungszeit erhöht Temperatur und nicht höhere Ultraschall-Leistung
Temperatur muss unter dem kritischen Level gehalten werden
• Kühlsystem
• Hohe Leistung / kurze Zeit
The University of Western Australia
Nachteile
Staphylokokken schwierig zu Eliminieren
Unbehüllte Viren schwierig zu Eliminieren
Grosse Mengen von Abwärme
The University of Western Australia
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30.09.2015
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
Mikrowellen
Nicht ionisierende Strahlung
Wärme erzeugende Strahlung => andere thermale Methode
Gleichmässige Wärmeverteilung schwierig zu erreichen
Gleicher Effekt wie die anderen thermalen Methoden
Mudgett, 1986; Villamiel et al. 1996
The University of Western Australia
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30.09.2015
Ionisierende Strahlung
Elektronen, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen
• Ionisierende Strahlung
• Hochpotent für mikrobielle Reduktion
• Kostspielig und braucht anspruchsvolle Schutzausrüstung
Schwere Schäden an ernährungstechnischer Qualität von Kuhmilch
• Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies
• Veränderung in Farbe, Geschmack und Geruch
• Reduktion von Vitamin A, C und E
Behandlung von gefrorener Milch
Starke Regulierung in der EU von Nahrungsmittel Bestrahlung
Kung et al. 1953; Wertheim, 1960; Kume et al. 2009
The University of Western Australia
Elektromagnetisches Spektrum
visible light
400 - 780nm
gamma rays
X-rays
ultraviolet
10-6m
10-8m
10-11m
Vacuum-UV
10
infrared
UV-C
200
UV-B
280
254nm
Mercury low-pressure lamp
320
microwaves
10-3m
UV-A
400 Wavelength [nm]
Germicidal effectiveness curve
The University of Western Australia
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30.09.2015
Germizidaler Effekt von UV-C
UV-C ➔ germizidale Wellenlänge ~260nm
Absorption von Photonen durchschmilzt DNA
Bildung von Thymin-Dimer unterbricht DNA-Kette
The University of Western Australia
Ultraviolet Bestrahlung
Konstante UV-C Licht oder pulsierendes Licht für wenige Zehntelsekunden
Sterilisierung von transparenten Flüssigkeiten und NahrungsmittelOberflächen ist ein übliches Verfahren
UV-C kann Gifte neutralisieren (z.B. Patulin in Apfelsaft)
Absorptions-Koeffizient bei 254nm
Milch
300 cm-1
Bier
20 cm-1
Wasser 0.1 cm-1
The University of Western Australia
30
30.09.2015
UV-C und Milch
Energy used to reduce S. epidermidis load from 100'000 to 50'000 CFU/ml / n=3
100000
Log10 Energy [J/cm2]
10000
0.4mm Layer
1000
0.6mm Layer
0.8mm Layer
100
1.2mm Layer
10
1
0
10
20
30
40
50
60
70
Fat [g/l]
The University of Western Australia
Photon zum Bakterium
The University of Western Australia
31
30.09.2015
UV-C Bestrahlung im Labor
UV-C lamp
UV-Lampe: UV-C Leistung 1.1W
Glasbecher: 400ml
Rühren: 500min-1
Glass beaker
Magnetic stirrer bar
Stirring platform
The University of Western Australia
UV-C Dosis und Bakterien in Menschenmilch
Christen et al. 2013a
The University of Western Australia
32
30.09.2015
Bakterielle Reduktion und Feststoffe in Milch
Vegetative bakterielle Reduktion von 5-log10 möglich
(E. coli, S. aureus, S. epidermidis, E. cloacae, B. cereus)
Erforderliche Dosis hängt von der Feststoff Konzentration der Milch ab
125 g/L
135 g/L
145 g/L
1200
Decimal reduction dosage [J/l]
1100
2574
3443.96
4607.95
14.82
19.83
26.53
0
0
0
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
105
110
115
120
125
130
135
140
145
150
Total solids [g/l]
Christen et al. 2013a
The University of Western Australia
UV-C Bestrahlung vs. Holder Pasteurisierung
UV-C Bestrahlung: 4863 J/l (Dosis für 5-log10 Reduktion bei 146g/l Feststoffen)
Holder Pasteurisierung: 62.5ºC für 30 Minuten
Bestandteil
UV-Bestrahlung
Holder
Lipase
~100%
0%
Alkalische Phosphatase
~100%
0%
Lysozym
~75%
~31%
sIgA
~89%
~73%
Lactoferrin
~87%
~22%
Konzentraion nach Behandlung
Christen et al. 2013a; Christen et al. 2013b
The University of Western Australia
33
30.09.2015
65
70
75
80
p<0.001
60
Lysozyme retention [%]
85
Lysozym Retention
110
120
130
140
Total solids concentration [g/l]
Christen et al. 2013b
The University of Western Australia
Fettsäuren
Christen et al. 2013a
The University of Western Australia
34
30.09.2015
Bakterielles Wachstum
7.5
5.0
2.5
untreated
UV
Holder
NB
Christen et al. 2013b
The University of Western Australia
Geschwindigkeit des Rührens ist wichtig
Tiefe Rührgeschwindigkeit verhindert Beschädigung von Milchfett aber erhöht die
Bestrahlungszeit welches die Proteine beschädigt.
Mild damage (creates butter oil)
Severe damage (creates butter)
Christen et al. 2013a
The University of Western Australia
35
30.09.2015
Schlussfolgerung UV-C Bestrahlung
Menschenmilch muss um UV-C Quelle fliessen wegen der hohen
Photonenabsorption der Menschenmilch
Mikroorganismen können erfolgreich Reduziert werden in Menschenmilch
- Vegetative Bakterien (Christen et al. 2013a)
- Cytomegalovirus (CMV) (Marchant, Christen et al. 2011; Jayaraman, Christen et al. 2012)
Retention von Proteinen ist besser als mit Holder Pasteurisierung
(Christen et al. 2013b)
Retention der bakteriostatischen Eigenschaften besser als mit Holder
Pasteurisierung. (Christen et al. 2013b)
The University of Western Australia
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)
Reaktives Moleküle mit Sauerstoff (z.B. Sauerstoffionen, Peroxide)
Hochreaktiv
Wichtige Rolle bei Zellroll-Signalfunktion
Stress (UV, Temperatur) kann ROS erhöhen
Oxidativer Stress kann Zellstrukturen zerstören
Kann Proteine und Lipide beschädigen
Oxidiert Vitamin A, C und E
The University of Western Australia
36
30.09.2015
H2O2 in Menschenmilch
40000
35000
Fluorescence
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
The University of Western Australia
H2O2 in UV-C Bestrahlter Menschenmilch
25000
Fluorescence
20000
15000
10000
5000
0
-10
0
The University of Western Australia
10
20
30
40
50
Time in [min]
37
30.09.2015
ROS Schlussfolgerung
Unbehandelte Menschenmilch reguliert Peroxid Level
Temperatur pasteurisierte Menschenmilch verliert Regulierungs-Mechanismus
UV-C bestrahlte Menschenmilch behält Regulierungs-Mechanismus
Offene Frage
Was reguliert den Peroxid Level
The University of Western Australia
Pasteurization Methods
The University of Western Australia
38
30.09.2015
~ 100 Jahre
The University of Western Australia
School of Chemistry and Biochemistry
Acknowledgements
Hartmann Human Lactation Research Group 2013
The University of Western Australia
39
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Pasteurisierung von Spendermilch (Dr. Lukas Christen)