Identifizierung immundominanter Proteine bei chronischen
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Universität Ulm Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Ärztliche Direktor: Prof. Dr. med. S. Stenger Identifizierung immundominanter Proteine bei chronischen Chlamydia trachomatis Infektionen mittels Immunoblot-Verfahren Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Vorgelegt von Sandra Kottke Aus Berlin-Lichtenberg 2009 Amtierender Dekan: Prof. Dr. rer. Nat. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Andreas Essig 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Thomas Mertens Tag der Promotion: 28.10.2010 Inhaltsverzeichnis 1 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS ...................................................................................................... 1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................ 3 1 EINLEITUNG .................................................................................................................. 6 1.1 Chlamydien ................................................................................................................ 6 1.2 Humanpathogene Chlamydien und ihre Klinik .......................................................... 8 1.2.1 Chlamydia trachomatis ...................................................................................... 8 1.2.2 Chlamydia pneumoniae .................................................................................... 11 1.2.3 Chlamydia psittaci............................................................................................ 11 1.3 1.3.1 Direkte Nachweismethoden ............................................................................. 12 1.3.2 Indirekte Nachweismethoden ........................................................................... 14 1.4 2 3 Diagnostik von Chlamydia trachomatis Infektionen ............................................... 12 Zielsetzung dieser Arbeit ......................................................................................... 16 MATERIAL .................................................................................................................... 18 2.1 Chemikalien und Reagenzien ................................................................................... 18 2.2 Enzyme ..................................................................................................................... 19 2.3 Antikörper ................................................................................................................ 19 2.4 Bakterienstämme und Zellen .................................................................................... 19 2.5 Flüssigmedien........................................................................................................... 19 2.6 Lösungen und Puffer ................................................................................................ 20 2.7 Geräte und Verbrauchsmaterialien ........................................................................... 21 METHODEN .................................................................................................................. 23 3.1 Zellkultur .................................................................................................................. 23 3.1.1 Kultur der Wirtszellen ...................................................................................... 23 3.1.2 Kultur von Chlamydien .................................................................................... 23 3.1.3 Reinigung der Chlamydien............................................................................... 25 3.2 Bestimmung der Chlamydien-Konzentration........................................................... 26 3.3 Lyophilisieren von Zellen ........................................................................................ 26 3.4 Immunoblot .............................................................................................................. 27 3.4.1 Herstellung der Gele......................................................................................... 27 3.4.2 Probenvorbereitung und Füllschema ................................................................ 28 3.4.3 Elektrophorese .................................................................................................. 28 Inhaltsverzeichnis 2 3.4.4 Semi-dry Elektroblotting .................................................................................. 28 3.4.5 Vorbereitung der Patientenseren ...................................................................... 29 3.4.6 Färben der Blotting-Membran .......................................................................... 29 3.5 Erhebung der Patientendaten .................................................................................... 30 3.5.1 Mikrobiologische und klinische Charakterisierung Patienten mit komplizierter C.trachomatis Infektion ................................................................................... 31 3.5.2 Patienten ohne mikrobiologischen und klinischen Nachweis von Chlamydien .......................................................................................................................... 33 3.5.3 Mikrobiologische und klinische Charakterisierung Patienten mit einem niedrigen C.pneumoniae Antikörper-Titer ....................................................... 33 3.6 Immunoblot Auswertung mit dem Gelscan 5.1 Professional Programm der Firma BioSciTec ................................................................................................................. 36 3.7 4 Statistische Auswertung ........................................................................................... 37 ERGEBNISSE ................................................................................................................ 39 4.1 Seren von Patienten mit chronisch aufsteigender C.trachomatis Infektion erkennen eine Vielzahl von Chlamydien-Antigenen ............................................................... 39 4.1.1 Identifizierung chlamydien-spezifischer Banden mit Kontrolle durch HeLaZellen................................................................................................................ 45 4.1.2 Chlamydien-spezifische Banden finden sich in allen Molekulargewichtsbereichen ........................................................................... 45 4.1.3 Die Berechnung von Banden mit hohem Molekulargewicht ist unpräzise ...... 46 4.1.4 Chlamydien-spezifische Banden zeigen in der Regel eine stärkere Bandenintensität als kreuzreagierende Banden ................................................ 46 4.1.5 Seren von Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion zeigen im Immunoblot ein charakteristisches Bandenmuster........................................... 49 4.1.6 Bei Seren mit relativ geringen C.trachomatis Antikörper-Titer finden sich weniger spezifische Banden ............................................................................. 52 4.2 Seren von Patienten mit zurückliegender C.pneumoniae Infektion erkennen auch C.trachomatis Proteine............................................................................................. 54 4.2.1 Durch gleiche Familienzugehörigkeit gibt es viele homologe Proteine zwischen C.trachomatis und C.pneumoniae .................................................... 56 4.3 Diagnostische Aussagekraft der Banden in Abhängigkeit des Kontrollkollektivs .. 59 5 DISKUSSION ................................................................................................................. 63 6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................... 82 7 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................... 84 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ATP Adenosintriphosphat ATCC American Type Culture Collection APS Ammoniumperoxidasesulfat CPAF chlamydialer Proteasome-like Activity factor C.t. Chlamydia trachomatis CML chronisch myeloische Leukämie DNA Desoxyribonukleinsäure EK Elementarkörper ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EIA Enzymimmunoassays EDTA Ethylendiamintetraacetat FCU first catch urine FITC Fluorescein Isothiocyanat °C Grad Celsius gw grenzwertig GTP Guanintriphosphat HSP Heat Shock Protein HSV Herpes Simplex Virus HLA-B27 Human Leukozyt Antigen B27 IgA Immunglobulin A IgM Immunglobulin M IgG Immunglobulin G IFU Inclusion forming units IfSG Infektionsschutzgesetzes cIAP-2 Inhibitor Apoptose Protein-2 IL-1ß Interleukin-1beta IL-6 Interleukin-6 pI Isoelektrischer Punkt KDO Keto-desoxy-oktonat kDa Kilo Dalton KBR Komplementbindungsreaktion LCR Ligase Chain Reaction 3 Abkürzungsverzeichnis LPS Lipopolysaccharid m männlich MIP macrophage infectivity potentiator MHC Major Histocompatibility Complex MOMP Major outer membrane Protein MS Massenspektronomie MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight μg Mikrogramm MIF Mikroimmunofluoreszenztest μm Mikrometer ml Milliliter min Minute M Molar nm Nanometer NaCl Natriumchlorid neg negativ NF-κB Nuclear factor-kappa B NAT Nukleinsäureamplifikationsverfahren ORF open reading frame OMP2 Outer membrane Protein PID Pelvic inflammatory disease PBS Phosphat buffered saline pgp plasmid protein PCR Polymerase Chain Reaction pmp poly membrane protein pos positiv p.i. post infektionem RK Retikularkörper RFX-5 MHC II promoter X box regulatory factor 5 deficiency RNA Ribonukleinsäure rpm Rotation per minute SU Schwangerschaftsuntersuchung sek. Sekundär STD sexuell transmitted disease 4 Abkürzungsverzeichnis SDS Sodiumdodecylsulfat ssp. subspecies h Stunde SDA Strand Displacement Amplification SPG PBS Puffer mit Saccharose Tab. Tabelle TMA Transcription-mediated Amplification TARP translocated actin recruiting phosphoprotein Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TNF-α Tumor Nekrose Faktor-alpha USF-1 upstream stimulation factor 1 u.U. unter Umständen UTP Uridintriphosphat V Volt VD variable Domäne VS variables Segment w weiblich WHO World Health Organisation xg Zentrifugalbeschleunigung 5 1 6 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Chlamydien Chlamydien sind 0,2-1 μm große, obligat intrazelluläre Erreger, die einen charakteristischen Vermehrungszyklus aufweisen. Nach der bisherigen Taxonomie ist Chlamydia die einzige Gattung der Familie der Chlamydiaceae. Bisher wurden die 3 humanpathogenen Spezies Chlamydia (C.) pneumoniae, C. trachomatis und C. psittaci voneinander abgegrenzt. 1999 wurde eine neue taxonomische Einteilung vorgeschlagen, wonach die Familie der Chlamydiaceae die Gattungen Chlamydia, Chlamydophila, Simkania und Parachlamydia umfasst. Diese Einteilung ist noch in Diskussion (55). Der Aufbau der Zellwand von Chlamydien ist dem der gramnegativen Bakterien ähnlich; es fehlt jedoch, die bei gramnegativen und grampositiven Bakterien in unterschiedlichem Ausmaß vorhandene Peptidoglykanschicht. Chlamydien sind auf eine eukaryonte Wirtszelle als Energiedonor angewiesen, um fehlenden Enzyme für die Synthese energiereicher Nukleotide wie ATP, GTP und UTP zu ersetzen. Früher wurden Chlamydien auch als Energieparasiten bezeichnet. Unabdingbar für das Verständnis der Diagnostik, Pathogenese und Therapie von Chlamydieninfektionen ist ihr einzigartiger intrazellulärer Entwicklungszyklus. Chlamydien liegen in einer extrazellulären infektiösen Form, den Elementarkörpern (EK) und in einer intrazellulären, stoffwechselaktiven Form, den Retikularkörpern (RK) vor (Abb.1). Die sogenannten Elementarkörper sind in der Lage durch Rezeptor-vermittelte Endozytose an die Wirtszellmembran zu adhärieren. EK besitzen kaum metabolische Aktivität; ihre Aufgabe besteht darin, in der extrazellulären Umgebung zu überleben, um dann die Wirtszelle zu infizieren. Im Zytosol der Zelle befinden sich die Chlamydien in einer Vakuole, die man auch Einschlusskörper nennt (Abb.1); die Fusion mit Lysosomen unterbleibt. Nach etwa 1-2 h post infektionem (pi) entwickeln sich die intrazellulär lokalisierten Elementarkörper zu metabolisch aktiven Retikularkörpern, die sich innerhalb der Vakuole durch Zweiteilung vermehren können. Nach ca. 18 Stunden beginnen sich die RK wieder in EK umzuwandeln, so dass innerhalb eines Einschlusskörpers Chlamydien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien vorliegen können. Nach 36 bis 72 Stunden, abhängig von Chlamydienstamm und -spezies, rupturiert die Wirtszelle und die entstandenen Elementarkörper werden freigesetzt und können wiederum andere Zellen infizieren (30). Die 1 7 Einleitung diesem Entwicklungszyklus zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen sind bis jetzt nur im Ansatz verstanden. Elementarkörper Elementarkörper Elementarkörper Retikularkörper Nukleus Einschlusskörper Abb.1: Intrazellulärer Entwicklungszyklus der Chlamydien: Rezeptor-vermittelte Endozytose des EK, Umwandlung zum RK, Entstehung des Einschlusskörpers mit Chlamydien in verschiedenen Entwicklungsstadien und Ruptur der Wirtszelle mit Freisetzung der Chlamydien. Quelle: Dtsch. Med. Wschr. 122 (1997), 971 – 975 © Georg Thieme Verlag Stuttgart Weitestgehend ungeklärt ist wie Chlamydien ihr intrazelluläres Überleben sichern. In vitro Experimente zeigen, dass Chlamydien Einfluss auf die Wirtszellapoptose nehmen, um ihren Vermehrungszyklus zu beenden. Diskutiert wird, ob die Modulation der Wirtszellapoptose eher durch chlamydiale Faktoren oder durch die Aktivierung eukaryonter Transkriptionsfaktoren wie Nuclear factor-kappa B (NF-κB) erfolgt. Es wurde nachgewiesen, dass Chlamydien eine erhöhte Freisetzung von Zytokinen wie Tumor Nekrose Faktor-alpha (TNF-α), Interleukin-1beta (IL-1ß) und Interleukin-6 (IL-6) induzieren, die alle durch NF-κB reguliert werden (73). Die Zelle muss aus Sicht der Chlamydien mindestens so lange am Leben erhalten werden, bis der Entwicklungszyklus abgeschlossen ist. Der eukaryonte Apoptose-Inhibitor (cIAP-2), dessen Expression durch Chlamydien experimentell induziert werden kann, scheint bei der Auslösung der NF-κB abhängigen Inhibition der Wirtszellapoptose maßgeblich beteiligt zu sein (72). 1 Einleitung 8 In vitro wurde gezeigt, dass alle Chlamydienspezies durch Zytokine, Antibiotika und Nährstoffentzug in ein so genanntes Stadium der Persistenz getrieben werden können, in dem sich ihre Morphologie, metabolische Aktivität sowie Antigen- und Genexpression ändert. Persistierende Formen sind möglicherweise der Wirtszellabwehr und Antibiotikatherapie nur schwer zugänglich, so dass sich dadurch leichter chronische und rezidivierende Infektionen ausbilden könnten. Die klinische Relevanz persistierender Formen ist jedoch umstritten, da keine diagnostischen Verfahren zum Nachweis dieser persistierenden Chlamydienformen im Patientenmaterial zur Verfügung stehen (46). 1.2 Humanpathogene Chlamydien und ihre Klinik 1.2.1 Chlamydia trachomatis C.trachomatis ist ein weltweit verbreiteter Erreger okulogenitaler Erkrankungen. Aufgrund der antigenen Eigenschaften der Zellwandoberfläche bzw. Sequenzunterschiede des korrespondierenden ompA-Genes wird C.trachomatis in derzeit 19 Serovare bzw. Genotypen eingeteilt. Die C.trachomatis-Serovare A, B, Ba und C sind für das Trachom, eine der häufigsten Ursachen für vermeidbare Erblindung in den Tropen und Subtropen, verantwortlich. Die Erkrankung breitet sich in Gebieten, in denen extrem ungünstige Hygienebedingungen herrschen, bevorzugt aus. Die am stärksten betroffenen Regionen befinden sich in Nordafrika, dem mittlere Osten und den nördlichen Teil Indiens; prävalent ist die Erkrankung außerdem in der Sub-Sahara, Australien und Lateinamerika. Bei der Erstinfektion entwickelt sich eine follikuläre Konjunktivitis, die nach ödematöser Schwellung meist folgenlos abheilt. Reinfektionen, die Jahre später erfolgen können, führen zu einer follikulären Vernarbung, Liddeformierung und Trichiasis. Durch mechanische Irritation kommt es zur Progression; Pannusbildung und Cornea-Vernarbung sind die Folgen. In Gebieten, in denen diese Serovare endemisch sind, ist das Konjunktiva-Epithel von Kindern meist die Haupterregerquelle. Die Bakterien werden durch direkten Kontakt oder durch Fliegen von Auge zu Auge übertragen (20). Die C.trachomatis-Serovare D-K gehören in den Industrieländern zu den häufigsten sexuell übertragbaren Erregern. Es kommt zu schätzungsweise 100.000 Neuerkrankungen jährlich in der Bundesrepublik Deutschland. Die WHO schätzt die Neuerkrankungszahl auf 90 Millionen Fälle pro Jahr weltweit. Mit 5 bis 10 % ist die Prävalenz im Bereich der 15 - 29 Jährigen am höchsten. 1 Einleitung 9 Eine 2004 durchgeführte Studie an Berliner Schulen konnte zeigen, dass bereits 3,6 % der bis 15 jährigen und 10 % der 17 jährigen Mädchen mit C.trachomatis infiziert sind. Der C.trachomatis Nachweis erfolgte mittels PCR eines Zervix-Abstriches. Die Mehrzahl der betroffenen Mädchen (75 %) gaben keine Beschwerden durch die Infektion an (35). Asymptomatisch verlaufende Chlamydien Infektionen sind heutzutage die häufigste Ursache der infektionsbedingten Sterilität. Zwischen 85 % und 90 % der Infektionen bei Männern und Frauen verlaufen asymptomatisch. Asymptomatische Infektionen können monatelang persistieren und aufsteigen (69). Es wird vermutet, dass bereits heute 100.000 Frauen in Deutschland durch eine chronische aufsteigende C.trachomatis Infektion keine Kinder auf natürliche Weise bekommen können (51). Fertilitätsdiagnostik und Infertilitätsbehandlung verursachen hohe Kosten. Neben einer Tubenfaktorinfertilität verursacht C.trachomatis eine ganze Reihe weitere Erkrankungen. Bei der Frau sind dies u. a. Zervicitis (Abb.2), Periappendizitis, Perihepatitis und Pelvic Inflammatory Disease (PID) mit Endometritis, Salpingitis (Abb.3) und Peritonitis (76,79). Infektionen während der Schwangerschaft erschweren die Nidation und erhöhen das Risiko einer Frühgeburt, einer ektopen Schwangerschaft oder auch einer Totgeburt. Ein besonderes Problem stellt die Chlamydienzervicitis (Abb.2) in der Schwangerschaft dar. Das Neugeborene infiziert sich unter der Geburt, weist dann oft unmittelbar danach eine Bindehautentzündung (sog. Einschlusskonjunktivitis) auf und kann im weiteren Verlauf durch Erregerausbreitung an einer atypischen Pneumonie erkranken. Es wird angenommen, dass 12,5 % aller im Krankenhaus aufgenommenen Pneumonien bei Säuglingen unter 3 Monaten durch C.trachomatis ausgelöst werden (12). Die Einschlusskonjunktivitis beim Erwachsenen ist selten, selbstlimitierend und häufig mit einer urogenitalen C.trachomatis Infektion assoziiert. 1 10 Einleitung Abb.2: Zervicitis bei einer Frau mit C.trachomatis Infektion Abb.3: Ein operativ entfernter Eierstock mit mit Salpingitis ausgelöst durch eine chronische C.trachomatis Infektion Primär verursacht C.trachomatis beim Mann Entzündungen der akzessorischen Sexualdrüsen (Epididymitis, Prostatitis). Das klinische Bild einer Urethritis tritt nach einer Inkubationszeit von 5 - 14 Tagen ein (42). Die Zielzellen von C.trachomatis sind oberflächliche Zylinderepithelien wie sie in der Endocervix, Urethra, Nebenhoden, Endometrium, Eileiter, Konjunktiva, Nasopharynx und im unteren Respirationstrakt vorkommen. Es ist nicht bekannt, dass andere Zellen oder tiefer liegende Schichten infiziert werden. Ein erhöhtes Risiko eine C.trachomatis Infektion zu erwerben haben v.a. junge Frauen im Alter zwischen 15 und 25 Jahren. Neben der beginnenden Sexualität, wechselnde Geschlechtspartner spielt auch der erhöhte Östrogenspiegel in den ersten fertilen Jahren bei einer Frau eine Rolle. Durch den Östrogenspiegel und einer ausgeprägten Portioektopie können Mikroorganismen leichter in den Zervikalkanal eindringen. Zusätzlich ist das genitale Immunsystem noch nicht vollständig ausgebildet. Diese Faktoren können zu einer erhöhten Infektanfälligkeit bei jungen Frauen führen (77). Durch die vielen asymptomatischen Infektionen und schwerwiegenden Folgen für Frauen, stellt sich die Frage nach einer Screening-Untersuchung für C.trachomatis. Durch mehrere Studien wurde gezeigt, dass ein Screening nur in einer Hochrisikogruppe effektiv gegenüber Nutzen, Kosten und Aufwand ist. Die Risikogruppe enthält junge sexuell aktive Frauen unter 25 Jahre, Personen mit neuem oder mehreren Sexualpartnern, Patientinnen mit Zervixektopie und Personen mit einer sexuell übertragbaren Erkrankung in der Vorgeschichte (53). Ein Screening bei asymptomatischen Personen wird nicht empfohlen. In Deutschland gibt es 1 Einleitung 11 keine allgemeine Screening-Untersuchung für C.trachomatis Serovar D-K und es besteht keine Meldepflicht. Eine typische Komplikation der C.trachomatis Infektion neben den aufsteigenden Infektionen ist die posturethritische Arthritis, die bei 1 % bis 3 % aller chlamydieninfizierten Patienten oder häufig bei HLA-B27-positiven Patienten auftritt. Seltener und für beide Geschlechter gleichermaßen zutreffend ist der Morbus Reiter, der auch durch andere Bakterien verursacht werden kann und mit einer Symptomtrias aus Urethritis, Konjunktivitis und Arthritis einhergeht (42). Die C.trachomatis-Serovare L1, L2, L2a und L3 verursachen das Lymphogranuloma venereum, eine meldepflichtige Geschlechtskrankheit. Im Unterschied zu den anderen Serovaren kann lymphatisches und subepitheliales Gewebe infiziert werden. Die Erkrankung kommt noch v.a. in Afrika, Zentral-Amerika und in den tropischen Gebieten Asiens vor; in den westlichen Industrieländern treten nur noch vereinzelte, überwiegend importierte Fälle auf. Klinisch zeigt sich das Bild eines Genitalulcus oder einer Genitalpapel. Meistens ist die Erkrankung mit einer inguinalen Lymphadenopathie, Fieber, Myalgien, Kopfschmerzen und einer Leukozytose assoziiert. Trotzdem sollte man bei unklaren Genitalulzera und geschwollenen Inguinallymphknoten an diese Erkrankung auch hier zu Lande denken (57). 1.2.2 Chlamydia pneumoniae C.pneumoniae ist ein weit verbreiteter Erreger von Infektionen des Respirationstraktes wie Sinusitis, Pharyngitis, Bronchitis bis hin zur Pneumonie (63). Retrospektive serologische Studien zeigen, dass sich 6 % bis 10 % der ambulant-erworbenen Pneumonien auf C.pneumoniae zurückführen lassen. Durch seroepidemiologische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass man mit einer Durchseuchung der Bevölkerung in Deutschland von über 50 % rechnen kann, weltweit geht man davon aus, dass 60 % der erwachsenen Bevölkerung eine Exposition durchgemacht hat. Die meisten Infektionen erfolgen im Kindes- und Jugendalter durch Tröpfcheninfektionen. Viele Hinweise haben sich angehäuft, dass dieser Organismus auch in der Entwicklung von extrapulmonalen Erkrankungen, u.a. der Arterosklerose eine Rolle spielen könnte (66). Allerdings sind die Ergebnisse vieler Studien durch die Verwendung mangelhaft evaluierter diagnostischer Verfahren belastet (21). 1.2.3 Chlamydia psittaci C.psittaci ist der Erreger der Ornithose oder auch Papageienkrankheit. Die Häufigkeit der Ornithose in Deutschland ist mit 40 Fällen im Jahre 2002 laut Robert-Koch-Institut sehr 1 12 Einleitung niedrig. Es handelt sich, um eine Zooanthroponose, die hauptsächlich bei Personen, die berufsbedingt oder in ihrer Freizeit mit Vögeln Kontakt haben, auftritt. Infizierte Vögel scheiden die Chlamydien mit respiratorischen Sekreten oder Fäkalien aus. Die Hauptmanifestation der Infektion ist eine atypische Pneumonie, die mit einer schweren systemischen Symptomatik einhergehen kann (37). Unbehandelt kann die Infektion tödlich verlaufen. Übertragungen von Mensch zu Mensch spielen praktisch keine Rolle. Der Erreger ist hoch kontagiös und wird nach der Biostoffverordnung in die Laborsicherheitsstufe 3 eingestuft (30). Seit dem 1.1.2001 mit in Krafttreten des Infektionsschutzgesetzes (IfSG) besteht namentliche Meldepflicht bei direkten oder indirekten labordiagnostischem Nachweis von C.psittaci. 1.3 Diagnostik von Chlamydia trachomatis Infektionen Angesichts der hohen Prävalenz von C.trachomatis Infektionen in der sexuell aktiven Bevölkerung sowie der Gefahr von chronisch aufsteigenden Infektionen mit schwerwiegenden Folgeerkrankungen, ist eine schnelle, sensitiven und spezifischen Labordiagnostik für diesen Erreger von erheblicher klinischer Relevanz für eine adäquate Therapie. Dabei stehen direkte und indirekte Nachweisverfahren zum Nachweis von urogenitalen C.trachomatis Infektionen zur Verfügung. 1.3.1 Direkte Nachweismethoden Bei den direkten Nachweisverfahren galt jahrelang der kulturelle Erregernachweis als Goldstandard (65). Im Laufe der Zeit wurde dieses Verfahren zunehmend durch sensitivere und besser standardisierbarere, kommerziell verfügbare Verfahren, die entweder auf einen Antigen- oder Nukleinsäurenachweis beruhen, abgelöst. Die Kultur wird insbesondere für forensische, wissenschaftliche Resistenzprüfungen bei und unklarem bestimmte klinische Therapieversagen oder Fragestellungen z.B. Neugeboreneninfektion durchgeführt. Das zu untersuchende Material wird auf Cycloheximid behandelte Epithelzellen gebracht und mit einem monoklonalen Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-markierten murinen Antikörper, der sich in der Regel gegen das speziesspezifische Lipopolysaccharid (LPS)Antigen richtet, gefärbt. Sofern sich viable, infektiöse Chlamydien Elementarkörper in der Probe befinden, werden diese nach frühsten 48 Stunden als grün-fluoreszierende Einschlusskörper sichtbar. Die Besonderheiten der Kultur liegen in der Empfindlichkeit des Erregers, der außerhalb seines natürlichen Habitats nur bedingt überleben kann. Die richtige Probenentnahme, ein 1 13 Einleitung richtiger Probentransport in speziellen Transportmedien und Probenlagerung sowie eine richtige Probenkonservierung ist deshalb wichtig, um so die Erreger kulturell nachweisen zu können. Bei der Probenentnahme muss auf zellreiches Material mit möglichst wenig Begleitflora geachtet werden. Die Probe muss sofort nach der Entnahme in ein spezielles Transportmedium gebracht werden und gekühlt weitergeleitet werden. Als Probenmaterial eignen sich bei C.trachomatis Zervikalabstriche, Ureter-/Urethra-Abstriche oder Konjunktivalabstriche. Schließlich setzt dieses Verfahren ein hohes Maß an technischer und personeller Expertise voraus (8). Den Goldstandard für den Nachweis akuter C.trachomatis Infektionen stellen inzwischen die Nukleinsäureamplifikationsverfahren (NAT), deren Zielsequenzen auf dem ompA-Gen, dem kryptischen 7,5 kDa Plasmid oder der 23S-RNA von C.trachomatis liegen, dar. Dabei handelt es sich um Polymerase Chain Reaction (PCR), Ligase Chain Reaction (LCR), Strand Displacement Amplification (SDA) und Transcription-mediated Amplification (TMA) Verfahren. Die Ansprüche an Probentransport und Probenentnahme sind gering, da die Durchführung dieser Verfahren nicht unbedingt an die Präsenz viabler Erreger gebunden ist. Theoretisch lässt sich ein einzelnes Elementarkörperchen nachweisen. Ein weiterer Vorteil gegenüber der Kultur liegt in der um den Faktor 10 bis 1000fach erhöhten analytischen Sensitivität (8). Bei diesen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren (NAT) wird ein kleiner Abschnitt der chlamydialen DNA innerhalb kurzer Zeit millionenfach vervielfältigt, um dann enzymatisch/photometrisch nachgewiesen zu werden. Als Materialien für die NAT eignen sich First catch urin (FCU) ein effizientes, bequemes und kosten-vorteilhaftes ScreeningMaterial sowie so genannte self-collected vaginal swabs (34,64). Es scheint dabei keine Rolle zu spielen, ob die Patientinnen selbst oder der behandelnde Arzt den Abstrich entnehmen. Viele Studien beweisen die Zuverlässigkeit dieser Untersuchungsmaterialien beim Einsatz von NAT (18,45,67). Nachteilig ist der noch relativ kostenintensive und technische Aufwand. Auch birgt die hohe Sensitivität die Gefahr von Kreuzkontaminationen in sich, resultierend in falsch-positiven Ergebnissen. Umgekehrt können Enzyminhibitoren in den Proben zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Es ist daher im besonderen Maße auf die Einhaltung interner und externer Qualitätskontrollen zu achten. Kommerzielle, standardisierte Tests sind bisher nur für C. pneumoniae verfügbar. 1 Einleitung 14 Ein bisher ungeklärtes Problem des PCR-Verfahren ist die Frage der DNA-Persistenz. Man geht davon aus, dass sich erregerspezifische DNA auch nach überstandener Infektion oder erfolgreich abgeschlossener Behandlung unter Umständen noch wochenlang nachweisen lässt (44). Somit eignen sich NATs nicht, eine Aussage zum Therapieverlauf zu machen. Ungeklärt ist auch inwieweit sich aufsteigende, chronische Infektionen durch nicht-invasive Probenentnahme mittels NAT nachweisen lassen. 1.3.2 Indirekte Nachweismethoden Bei der Diagnostik der Chlamydien Infektionen führt der direkte Erregernachweis häufig nicht zum Ziel. Eine zeitgemäße Chlamydiendiagnostik macht daher parallele serologische Untersuchungen unabdingbar. Die serologische Bestätigung einer Infektion verhindert falschnegative Ergebnisse. Häufig sind die Keime bereits kurze Zeit nach der Infektion an den Eintrittspforten nicht mehr nachweisbar. Sie sind in tiefere Bereiche des Urogenital- oder Respirationstrakts vorgedrungen und entziehen sich so dem Direktnachweis. Die Erregernachweise werden falsch-negativ. Mit diesen so genannten serologischen Verfahren wird nachgewiesen, ob im Rahmen der Infektionsabwehr spezifische Antikörper gegen Chlamydien gebildet wurden. Die Bindung humaner Antikörper an erregerspezifische Antigene wird durch farbstoff-markierte Fluoreszenz beim Mikroimmunoflureszenstest (MIF) oder durch enzym-markierte Sekundärantikörper (Konjugate) wie bei Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Enzymimmunoassays (EIA) sichtbar gemacht. Generell ist die Serologie u. U. der einzige Zugang zur Erfassung persistierender Infektionen, bei denen der Antigennachweis versagt. Auch bei der Kontrolle einer antibiotischen Therapie liefert die Serologie wertvolle Informationen. So belegt ein deutlicher Abfall eines Antikörpertiters den Erfolg einer Behandlung. Bei den indirekten Nachweismethoden war früher die Komplementbindungsreaktion (KBR), die auf dem gattungsspezifischen LPS beruht, weit verbreitet. Die KBR eignet sich v.a. im Nachweis frischer Infektionen, d.h. zum Nachweis von IgM-Antikörpern. Bei einer Ornithose und akuten C.pneumoniae Infektionen kann es wegen Kreuzreaktionen aufgrund des gattungsgemeinsamen LPS-Antigens ebenfalls zum positiven Reaktionsausfall kommen. Dieses Verfahren wird deswegen trotz geringen Kosten heutzutage nur noch in seltenen Fällen bei Verdacht auf Ornithose genutzt (32). Gattungsspezifische ELISAs arbeiteten zunächst mit chlamydialen Vollantigenen, entweder in infizierten Zellen oder partiell aufgereinigt. Eine Differenzierung zwischen IgM-, IgA- und IgG-Antikörpern ist möglich. Es folgten Tests mit chemisch definierten, hochspezifischen 1 15 Einleitung Antigenen an der festen Phase. Gute diagnostische Ergebnisse wurden und werden mit einem ELISA erzielt (41), der unter Nutzung gentechnischer Verfahren rekombinant-hergestelltes Chlamydien-spezifisches LPS als Antigen einsetzt (Chlamydien IgG-, IgA-, IgM- rELISA). Die Unterscheidung speziesspezifischer Antikörper war dann zuerst mit dem Mikroimmunfluoreszenztest möglich, der in den frühen 70er Jahren von Wang und Grayston entwickelt wurde. Der Test gilt noch heute als „Goldstandard“ der Chlamydienserologie. Aufgereinigte Elementarkörperchen der einzelnen Chlamydienspezies werden nebeneinander auf einem Objektträger aufgetragen. Die Antigen-Antikörper Reaktion wird fluoreszenzmikroskopisch sichtbar gemacht (Abb.4). Der MIF-Test kann sowohl IgG- als auch IgM-Antikörper detektieren und daher bei der Unterscheidung zwischen kürzlich durchgemachten oder länger zurückliegenden Infektionen hilfreich sein. Entwickelt wurde der Test, um hauptsächlich C.trachomatis in Serotypen zu klassifizieren; er ist inzwischen das serologische Verfahren der Wahl zum Nachweis einer C.trachomatis Pneumonie bei Säuglingen, die mit einem erhöhten IgM-Antikörper Titer einhergeht (8). Die Ergebnisse für andere Chlamydienspezies sind deshalb immer unter Vorbehalt zu interpretieren (9,50). Abb.4: MIF 40-fach erhöhter IgG-Antikörper Titer für C.pneumoniae, leuchtend grüne Einschlusskörper Abb.5: MIF unspezifische Reaktion Der MIF-Test ist jedoch aufwändig, nicht automatisierbar und anfällig für subjektive Fehler. Zusätzlich ist der Test nicht frei von Kreuzreaktivitäten. Die mikroskopische Testbeurteilung erfordert ein äußerst geschultes Personal (Abb.4). Es stehen keine zusätzlich definierten Kontrollseren zur Verfügung. Der Test ist lediglich semi-quantitativ. Bemühungen um eine Standardisierung waren bisher wenig erfolgreich. 1 Einleitung 16 Um die Probleme mit dem MIF-Test zu minimieren, wurden so genannte EIAs entwickelt. Sie ermöglichen einen mehr automatisierten Arbeitsablauf und dadurch ein objektiveres Ergebnis. Der Test basiert auf einem synthetisch hergestellten Peptid aus der variablen Domäne (VD) IV des C.trachomatis major outer membrane Protein (MOMP). Man hat herausgefunden, dass die VD IV C.trachomatis spezifisch für IgG- und IgA-Antikörper ist. Ein positiver Antikörpernachweis mittels EIAs kann einen serologischen Anhalt für eine aktive oder durchgemachte Infektion darstellen, es ist aber immer zusätzlich auf das klinische Bild, Anamnese und Alter des Patienten zu achten. Über die Dauer der Persistenz von C.trachomatis IgG-Antikörpern nach durchgemachter bzw. behandelter Infektion ist wenig bekannt. Man geht davon aus, dass sich spezifische IgG-Antikörper noch viele Monate nach Infektion nachweisen lassen (54). Der Test ist somit nicht zur Therapiekontrolle geeignet. 1.4 Zielsetzung dieser Arbeit Der C.trachomatis Infektionszeitpunkt ist mit serologischen Verfahren oft nur schwer bestimmbar, deswegen ist die Interpretation, ob die Antikörperantwort nur eine Folge einer früher durchgemachten und jetzt abgeheilten Infektion ist oder ob noch eine aktive Infektion besteht, schwierig. Dies gilt besonders für die Chlamydien Antikörper der Klasse IgG, deswegen geben die indirekten Nachweisverfahren keine genaue Sicherheit bei der Interpretation einer C.trachomatis Infektion. Eine weitere Möglichkeit, Chlamydien Antikörper speziesspezifisch zu differenzieren, bietet der Immunoblot. Zudem ermöglicht dieses Verfahren, das mit chromatographisch aufgetrennten chlamydialen Antigenen arbeitet, genauer zu bestimmen, gegen welche Antigene die Patientenantikörper im Einzelnen gerichtet sind. Die diagnostisch relevanten C.trachomatis Antigene/Proteine sind momentan zum Teil noch schlecht charakterisiert. Aus diesen Gründen wurde die vorliegende Studie zur Charakterisierung immundomianter Proteine mittels Immunoblot Verfahren bei chronischer C.trachomatis Infektion durchgeführt. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Identifikation chlamydialer Proteine, die sich aufgrund ihrer Reaktivität und Speziesspezifität für den Einsatz in diagnostische Verfahren qualifizieren, um den zukünftigen Weg für einen sicheren Screening-Test zu ebnen. Für die Darstellung der immunreaktiven C.trachomatis Proteine wird als zweites Ziel ein Immunoblot-Verfahren etabliert. Aus diesem Verfahren kann man immundominante Chlamydienproteine bei Patienten mit chronischer C.trachomatis Infektion in Bezug auf ihr Molekulargewicht charakterisieren. 1 Einleitung 17 Das dritte Ziel lietg in dem Erkennen eines diagnostischen Musters bei Patientinnen mit einer komplizierten chronischen, d.h. aufsteigenden genitalen C.trachomatis Infektion. Es soll gezeigt werden, gegen welche Proteine bei einer chronisch aufsteigenden C.trachomatis Infektion Antikörper gebildet werden. Zusätzlich soll untersucht werden, ob sich dieses Bandenmuster eben nur bei chronischen C.trachomatis Infektionen erkennen lässt, nicht jedoch in anderen Kontrollgruppen (Patienten ohne Chlamydienkontakt, Patienten mit C.pneumoniae Infektion). Dadurch soll eine möglichst hohe diagnostische Spezifität und Sensitivität erreicht werden. 2 18 Material 2 Material 2.1 Chemikalien und Reagenzien Chemikalien und Reagenzien Bezugsquelle Ammoniumperoxidasesulfat (APS) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD Aqua Spüllösung Select Delta-Pharm, Pfullingen, BRD Bradford Protein Assay Quick Start Standard Set mit Bovine Serum Albumin Bio-Rad Laboratories, USA Ethanol Rotilabo Spritzflasche Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD Glyzin Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD High Range Rainbow Molecular Weight Marker Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiberg, BRD Hydrogen Peroxid (Wasserstoffperoxid) Mallinckrodt Baker B.V., Deventer Holland Isopropanol Rotilabo Spritzflasche Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD Methanol 100 % Fluka BioChemika, Buchs, Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Schweiz Nonfat-dried milk Bovine Steinheim, BRD Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (TWEEN 20) Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Steinheim, BRD Rotisilon C/D Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD SDS (Sodiumdodecylsulfat) Sigma Diagnostics, USA Tetramethylethylenediamine TEMED Fluka BioChemika, Buchs, Schweiz Tris Puffer Sigma Diagnostics, USA 2 19 Material Trypsin/ EDTA Biochrom, Berlin, BRD Tween 20 Merck KG, Darmstadt, BRD 2.2 Enzyme 3’3-Diaminobenzodine Tabletten a 10 mg, Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Steinheim, BRD 2.3 Antikörper Pathfinder-Antikörper: Fluoreszeinisothiocyanat gekoppelter monoklonaler Antikörper gegen chlamydienspezifisches Lipopolysaccharid, Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation System, Bio-Rad Laboratories USA 2.4 Anti-Human IgG (γ-chain specific), Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Steinheim, BRD Bakterienstämme und Zellen Stamm-Bezeichnung C.trachomatis Klinische Herkunft Bezugsquelle/ Referenz Zervixabstrich ATCC 887-VR UW-31/Cx Serovar K Washington Research Foundation, Seattle, USA C.pneumoniae Konjunktivalabstrich TW 183 ATCC 2282-VR Washington Research Foundation, Seattle, USA HeLa-Zellen 229 Zelllinie aus einem ATCC CCL2.1 Humanen Epitheloidzell- Rockville MD, USA Carcinom Cervix uteri 2.5 Flüssigmedien Zellkulturmedium: Quantum 101 HeLa-Zellkultur-Komplettmedium, PAA Laboratories GmbH, Cölbe, BRD Infektionsmedium für C.trachomatis: Quantum 101 Komplettmedium mit 5 mg/ml Glucose, 40 μg/ml Cycloheximid, 50 μg/ml Vancomycin, 20 μg/ml Gentamicin und 5 mM Hepes 2 2.6 20 Material Lösungen und Puffer Anode1-Puffer 36,3 g Tris, 200 ml Methanol mit Aqua bidest ad 1 Liter Anode2-Puffer 3,03 g Tris, 200 ml Methanol mit Aqua bidest ad 1 Liter Kathode-Puffer 5,2 g 6-Aminohexansäure, 0,1 g SDS mit Aqua bidest ad 1 Liter Ladepuffer (2fach) 25 ml Sammelgelpuffer, 20 ml Glyzin, 4 g SDS, 1 mg Bromphenolblau mit Aqua bidest ad 1 Liter Laufpuffer (10fach) 30,2 g Tris, 144 g Glyzin, 10 g SDS mit Aqua bidest ad 1 Liter Laufpuffer (1fach) 100 ml 10x Laufpuffer, 900 ml Aqua bidest PBS-Puffer 2 g KCl, 2 g KH2PO4, 80 g NaCl, 21,6 g Na2HPO4 x 7 H2O, pH 7,2-7,4 einstellen, mit Aqua bidest ad 1 Liter autoklavieren Sammelgelpuffer 6,05g Tris, 40ml Aqua bidest, 0,4g SDS, pH 6,8 mit Aqua bidest ad 1 Liter SPG-Puffer 75 g Sucrose, 0,52 g KH2HPO4, 2,3 g Na2HPO4 x 7 H2O TBS (10fach) Puffer 88 g NaCl, 12 g Tris, 680 mg NaN3, pH 8 mit Aqua bidest ad 1 Liter TBST (1fach) Puffer 100 ml 10x TBS, 900 ml Aqua bidest, 500 μl Tween 20 Trenngelpuffer 91 g Tris, 300 ml Aqua bidest, 2 g SDS, pH 8,8 mit Aqua bidest ad 1 Liter 2 2.7 21 Material Geräte und Verbrauchsmaterialien Geräte Bezugsquelle Blotting Kammer Multiphor II Pharmacia, Ratingen, BRD Brutschrank/ Inkubator Haereus, Hanau, BRD Electrophoresis Power Supply-EPS 600 Pharmacia Hoefer, USA Gel 14 x 12, 2 Spacer Mates, Glass Plates, Hoefer Scientific instruments, USA clamps Kühlschränke Haereus, Hanau, BRD Liebherr, BRD Lyophilisator vacuum concentrator Bachofer, USA Mikroskope: Axioplan Zeiss, Oberkochen, BRD ID 30 Zeiss, Oberkochen, BRD Inverses-Fluoreszenz IMT-2 Olympus, Hamburg, BRD Pipetboy plus INTEGRA Biosciences, Fernwald, BRD Power Supply Model 200/2.0 Bio-Rad, USA Roller Mixer SRT1 Stuart Scientific, Heidolph, UK Sicherheitswerkbank, Klasse 2 Haereus, Hanau, BRD Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, BRD Ultraschall ultra sonics Gen Probe, USA Vortex Genie 2 Scientific Industries, USA Waage AG 204 Mettler, Toledo, USA Zentrifugen: Mini Spin Eppendorf, Hamburg, BRD Varifuge 3.0R Haereus, Hanau, BRD Biofuge 13 Haereus, Hanau, BRD 2 22 Material Avanti Centrifuge J-25 Beckmann Instruments GmbH, München, BRD Verbrauchsmaterialien Bezugsquelle Blue Max (Bluecap-Behältnisse) 15 ml, 50 ml Falcon, Becton Dickison Labware, Heidelberg, BRD Chromatographiepapier (Electrode Paper Novablot) Amersham Biosciences, Schweden Einmal-Pipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml Corning-Costar, Bodenheim, BRD Eppendorf 1,5 ml Eppendorf, Deutschland Immobilon-P Transfermembranes Milipore Corporation, USA Zellkulturflasche 50 ml mit Schräghals, blauer Falcon, Becton Dickison Labware, Gasaustauschkappe Heidelberg, BRD Zellkulturplatte, 6 Vertiefungen, Flachboden Falcon, Becton Dickison Labware, mit Deckel Heidelberg, BRD 3 Methoden 3 Methoden 3.1 Zellkultur 23 Als Antigen für die Durchführung der Immunoblot Untersuchungen sollen aufgereinigte Chlamydien Elementarkörper Präparationen eingesetzt werden. Dafür müssen zunächst die Bakterien in ausreichenden Mengen angezüchtet werden. Die Kultivierung von C.trachomatis und C.pneumoniae erfolgt in HeLa 229-Zellen. Die Arbeiten werden alle unter einer Klasse II Sicherheitswerkbank unter Laminar Air Flow Bedingungen verrichtet. 3.1.1 Kultur der Wirtszellen Die HeLa 229-Zellinie ist eine permanente, adhärente Zellinie, die ursprünglich aus dem Zervixkarzinom einer 31 Jahre alten Amerikanerin isoliert wurde. Die HeLa 229-Zellen werden unter möglichst keimarmen Bedingungen als MonolayerKulturen kultiviert. Zweimal pro Woche werden sie zur Subkultivierung passagiert, d.h. die Zellen werden mit Hilfe von 5 ml Trypsin/EDTA-Lösung für 3-5 Minuten bei 37 °C vom Boden des Kulturgefäßes abgelöst. Die gelösten Zellen werden in neues Medium aufgenommen und bei 1000 rpm (ca. 200 xg) für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit neuem Medium resuspendiert und in ein neues Kulturgefäß überführt. Die restliche Zellsuspension wird 1:60 mit Kulturmedium verdünnt und auf eine 6-Lochplatte verteilt. Nach 3 Tagen Inkubation bildet sich auch hier ein konfluenter Zellrasen, der dann mit Chlamydien infiziert werden kann. Die HeLa 229-Zellen werden in einer Konzentration von 105 Zellen/ml in ihr Kulturmedium eingesät, pro Kulturflasche werden 30 ml Kulturmedium verwendet. Ein Teil der HeLa-Zellen wird als reine Zellsuspension bei -20 °C eingefroren, um später zelluläre Proteine von Chlamydienproteinen als Kontrolle beim Immunoblot unterscheiden zu können. 3.1.2 Kultur von Chlamydien Zur Vorbereitung einer Chlamydienkultur ist es erforderlich, die Zelldichte so einzustellen, dass am Tag der Chlamydieninokulation ein dichter Zellrasen (Monolayer) vorliegt. Nach lichtmikroskopischer Kontrolle, ob ein konfluenter Zellrasen in einer 6-Lochplatte vorliegt, werden 3 ml einer Chlamydien-Stocksuspension (Konzentration: ca. 108-109 Inclusion forming units (IFU)) in je eine Vertiefung pipettiert. Die Lochplatte wird 1 h bei 3 Methoden 24 1000 rpm zentrifugiert, anschließend für 1 h bei 37 °C im Brutschrank inkubiert und danach das Medium gewechselt. Das Chlamydienkultur-Infektionsmedium ist ein Flüssigmedium, das zur Optimierung der Anzucht von Chlamydien auf HeLa-Zellen verwendet wird. Es enthält 3 ml Vancomycin, 3 ml Gentamycin, 7,5 ml Amphotericin B, 1 ml Cycloheximid, 2,5 ml Glucose und 2,5 ml HEPES-Puffer in 500 ml Quantum 101-Medium. Das Cycloheximid soll den Metabolismus der Wirtszelle inhibitorisch beeinflussen und das Wachstum der Chlamydien verbessern. Die Antibiotikazugabe schützt vor Kontamination durch Pilze und andere Bakterien. Nach 48 Stunden bei C.trachomatis und 72 Stunden bei C.pneumoniae wird, abhängig von der Konzentration des Inokulums, eine Infektionsrate von 90 % erreicht. Die Kontrolle der Infektionsrate wird anhand einer in der Zellkulturflasche mitgeführten Deckglaskultur bestimmt. Das Deckglas wird mit einem FITC-konjugiertem monoklonalen Antikörper, der gegen das Chlamydien LPS gerichtet ist, angefärbt. Die Chlamydien Einschlusskörper erscheinen unter Fluoreszenz grün-leuchtend. Die Zellen werden zur besseren Darstellung des Hintergrundes mit dem Farbstoff Evans blue gegengeführt und erscheinen rot im Fluoreszenzmikroskop (Abb.6). Abb.6: Chlamydien-Einschlusskörper in unterschiedlicher Größe in HeLa 229-Zellen; 48 Stunden pi; Vergrößerung 600x 3 Methoden 25 Der infizierte Zellrasen wird mit einem Zellschaber abgelöst und die Chlamydien durch 2 minütiges durchmischen mit sterilen Glasperlen auf einem Vortexer aus den HeLa-Zellen freigesetzt. Das Chlamydiengemisch mit den Glasperlen wird bei -70 °C bis zur weiteren Aufbereitung gelagert. 3.1.3 Reinigung der Chlamydien Um für die Elektrophorese eine möglichst reine Chlamydien Elementarkörper Suspension (Abb.7) zu erhalten, müssen durch verschiedene Zentrifugationsschritte HeLa-Zelltrümmern entfernt werden. Durch Ultraschallbehandlung werden ca. 800 - 1200 ml einer Suspension Chlamydien infizierter HeLa-Zellen 3 mal 10 Sekunden aufgebrochen, um dadurch die intrazelluläre Chlamydien freizusetzen. Der Zelldetritus wird anschließend 10 min abzentrifugiert bei 2000 rpm und 4 °C. Der Überstand wird weiter 90 min bei 10.000 rpm zentrifugiert, um die darin enthaltenen EK zu pelletieren. Dadurch setzen sich die Chlamydien im Pellet ab. Dieses gewonnene Pellet wird mit SPG-Puffer resuspendiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 10.000 rpm und Resuspension des Pellets mit SPG-Puffer werden die gereinigten Chlamydien Elementarkörperchen in 1,5 ml Eppendorf Behältnisse aliquotiert und bei -70 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.. Abb.7: Chlamydien Elementarkörperchen nach Reinigung Darstellung mit FITC-konjugierten anti-LPS Antikörper Vergrößerung: 630x 3 3.2 26 Methoden Bestimmung der Chlamydien-Konzentration Um später bei der elektrophoretischen Auftrennung der Antigene sowohl von C.trachomatis, C.pneumoniae und HeLa-Zellen jeweils in gleicher Proteinmenge (10 μg) auf das Gel aufzutragen, wird zuerst in den Suspensionen die Proteinkonzentration bestimmt. Dafür wird der Bradford-Test, wegen seiner Unempfindlichkeit gegenüber störenden Ionen und Reduktionsmitteln, eingesetzt. Bei der Bindung von Coomassie brilliant blue G-250 an Proteine im sauren Milieu verschiebt sich das Absorptionsmaximum des Stoffes (465 nm ohne Protein, 595 nm mit Protein). Die Zunahme der Absorption bei 595 nm ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung. Die fertige Stammlösung bestehend aus Farbstoff, Ethanol und Phosphorsäure wird 1:5 mit Aqua bidest verdünnt, jeweils 1000 μl in die Küvetten abgefüllt und 20 μl Probenlösung oder Standardlösung hinzu pipettiert. Nach 10 min bei Raumtemperatur wird die Absorption bei 595 nm mit dem Spektralphotometer gemessen. Um anhand der gemessenen Absorptionswerte die Proteinmenge zu bestimmen, werden die Werte mit einer Eichgerade verglichen. 3.3 Lyophilisieren von Zellen Trotz Reinigung der EK-Suspension mittels Ultraschallbehandlung enthält die Suspension noch einen geringen Anteil an eukaryonte Wirtszellproteine, deshalb nutzt man lyophilisierte d.h. gefrier-getrocknete Zellen. Durch diese Methode werden kreuzreagierende Antikörper gegen eukaryonte Zellbestandteile aus den Patientenseren entfernt und chlamydienspezifische Antikörperreaktionen können elektrophoretisch sichtbar gemacht werden. Zur Herstellung lyophilisierter Zellpräparationen werden aus einer mit einem konfluenten HeLa-Monolayer bedeckte Zellkulturflasche durch Hinzugeben eines PBS-Puffer der Zellrasen gelöst und mit einem Zellschaber vollständig entfernt. Die Zellen werden bei 4 °C 5 min bei 3000 rpm zentrifugiert, das entstandene Pellet resuspendiert und der Zentrifugationsschritt wiederholt. Das gewonnene Pellet wird dann gewogen und pro Gramm Pellet 2 ml 0,1 M NaCl und die 4 fache Menge an eisgekühltem Aceton dazugegeben. Die Menge wird notiert und die Mischung 1 h auf Eis gekühlt. Danach wird die Suspension gemischt und jeweils 350 μl in einen Eppendorf Behältnis pipettiert. Diese Behältnisse werden für 5 min bei 4 °C bei 13000 rpm zentrifugiert, der Überstand mit einer Pumpe abgesaugt und mit der notierten Menge Aceton aufgefüllt. Damit sich das Pellet im Aceton lösen kann, wird es für 5 sek im Ultraschallbad behandelt. Nach 10 minütiger Lagerung auf 3 Methoden 27 Eis, wird noch einmal für 5 min bei 13000 rpm und 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Pellets für 1 h in den Lyophilisator, der die letzte Flüssigkeit aus den Zellen entzieht, gestellt. Die lyophilisierten Zellen werden bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. 3.4 Immunoblot Beim Immunoblot werden Proteingemische, die durch Gelelektrophorese in separate Banden aufgetrennt werden, auf eine Membran transferiert und dort mit Hilfe von Primär- und Konjugat-gekoppelten Sekundärantikörpern nach Substratzugabe durch enzymatische Reaktionen sichtbargemacht. 3.4.1 Herstellung der Gele Zur Trennung der Proteinproben werden zunächst Acrylamid haltige Gele gegossen. Es wird mit einem 10 % igen (Prozentzahlen richten sich nach der Acrylamidmenge) Trenngel, in dem die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt werden und ein Sammelgel mit Taschen, um die Proben einzufüllen, gearbeitet (Abb.8). Abb.8: Trenn- und Sammelgel für Immunoblot Das Trenngel wird aus 10 ml Acrylamid 30 %, 7,5 ml Trenngelpuffer, 12,5 ml Aqua bidest, 1 ml 10 % APS und 0,02 ml TEMED hergestellt. Das Sammelgel enthielt 1,3 ml Acrylamid 30 %, 2,5 ml Sammelgelpuffer, 6,1 ml Aqua bidest, 0,05 ml APS 10 % und 0,01 ml TEMED. Das Gel wird zur vollständigen Härtung 24 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. 3 Methoden 28 3.4.2 Probenvorbereitung und Füllschema Aus der Proteinbestimmung nach Bradford ergab sich eine Menge von 9 μl HeLa-Zellen, von 12 μl C.pneumoniae und von 18 μl C.trachomatis, die dieselbe Menge an Protein (10 μg) enthalten. Damit die Chlamydiensuspensionen und die HeLa-Zellsuspension optimal im Gel aufgetrennt werden, wird zu jeder Probe die gleiche Menge an Probenpuffer pipettiert, daraus ergeben sich folgende Mengen: 18 μl HeLa-Zellen, 20 μl Rainbowmarker, 24 μl C.pneumoniae-Lösung und 36 μl C.trachomatis-Lösung. Die Proben werden zunächst bei 95 °C gekocht und dann 1 min bei 13.400 rpm zentrifugiert. Danach können die Proben aufgetragen werden, dabei wird folgendes Schema eingehalten: die ersten beiden Taschen enthielten nur Probenpuffer, die nächste HeLa-Zellen, dann C.trachomatis, C.pneumoniae, Rainbowmarker, HeLa-Zellen, C.trachomatis, C.pneumoniae, Rainbowmarker, HeLa-Zellen, C.trachomatis, C.pneumoniae und die letzten beiden Taschen wieder nur Probenpuffer. Mit diesem Laufschema lassen sich pro Gel jeweils 3 Patientenseren untersuchen. Neben den aufzutrennenden Proben wird ein vorgefärbter Molekulargewichtsmarker (Rainbowmarker) in das Trenngel gefüllt. Dieser Marker gewährleistet eine schnelle, abschätzende Molekulargewichtsbestimmung der auftretenden Proteinbanden. Dieser Marker zeigt bei 220 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa und 14,3 kDa farbige Banden mit dem angegebenen Molekulargewicht an. 3.4.3 Elektrophorese Nachdem die Proben in die Geltaschen gefüllt wurden, kann die elektrophoretische Auftrennung beginnen. Zunächst wird das Gerät auf 180 V und 24 Watt eingestellt und läuft für 30 min. Diese Einstellung garantiert, dass die Proben gleichmäßig aus den Taschen in das Sammelgel fließen können. Nachdem alle Proben im Sammelgel erkennbar sind, kann das Gerät auf 600 V und 48 Watt hochgestellt werden. Die Auftrennung der Proben kann mit Hilfe der Lauffront (durch blaue Pufferfärbung) nachvollzogen werden. 3.4.4 Semi-dry Elektroblotting Der Transfer der aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf eine Membran erfolgt nach dem “Semi-Dry-Verfahren“. Dazu werden Chromatographiepapier und Membran in einem Blotting-Puffer mindestens 10 min äqulibriert und mit dem Polyacrylamidgel folgendermaßen geschichtet: Die Membran wird anodisch auf zwei Lagen Chromatographiepapier gelegt, darauf folgt das Polyacrylamidgel, zwei weitere Lagen Chromatographiepapier und abschließend als oberste Schicht die Kathode (Abb.9). Die Blotdauer betrug 1,3 h bei 20 V. 3 29 Methoden Im Anschluß wird die Membran mit Magermilch in TBST-Puffer zur Absättigung der freien Bindungsstellen 2 h inkubiert. Es wird die Immobilon-P Transfermembranes der Firma Milipore verwendet, die eine hohe Bindekapazität für Proteine hat. Abb.9: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Blotting-Kammer Nach der Absättigung mit Magermilch und einem Waschgang mit TBST-Puffer wird die Membran in C.trachomatis 3 Streifen geschnitten, Vollzell-Lysatproteinen, die jeweils C.pneumoniae eine Spur von aufgetrennten Vollzell-Lysatproteinen, HeLa- Vollzell-Lysatproteinen und ein sichtbarer Teil des Rainbowmarkers enthalten. Die Membran wird in verschiedene Glasschalen getrennt, damit auf jeden Streifen ein Patientenserum aufgetragen werden kann. 3.4.5 Vorbereitung der Patientenseren Bevor das Patientenserum mit den aufgetrennten Proteinen auf der Membran reagieren kann, werden die Seren 24 h bei 4 °C mit lyophilisierten Zellen präabsorbiert, damit Antikörperreaktionen, die nicht gegen Chlamydienproteine sondern gegen eukaryonte Proteine gerichtet sind, entfernt werden können. Die Patientenseren mit den lyophilisierten Zellen werden bei 20.000 rpm 5 min abzentrifugiert und 100 μl des Patientenserum ohne lyophilisierte Zellen mit 10 ml TBST verdünnt (Verdünnung 1:100). Dann kann jeweils ein Membranstreifen mit einem Patientenserum (1.Antikörper) für 24 h bei 4 °C inkubieren. 3.4.6 Färben der Blotting-Membran Nach der Inkubation des 1. Antikörpers für 24 Stunden, wird der flüssige Überstand verworfen und der Membranstreifen 3 mal 10 min mit TBST-Puffer gewaschen. Danach wird der 2. Antikörper humanes IgG-Konjugat (50 μl IgG in 100 ml TBST-Puffer) jeweils 15 ml 3 Methoden 30 pro Membranstreifen 2 Stunden inkubieren. Nach erneutem 3 maligem Waschen mit TBSTPuffer wird der Immunkomplex mit Hilfe eines Enzymkonjugates sichtbar gemacht. Da die Antikörper nicht direkt markiert zur Verfügung stehen, erfolgt die Detektion indirekt über markierte Dritt-Antikörper, die gegen den im Immunkomplex gebundenen Zweit-Antikörper gerichtet sind. Die Visualisierung erfolgt durch eine enzymkatalysierte Farbreaktion mit 3’3Diaminobenzodin-Tabletten, die jeweils in 15 ml TBS-Puffer pH 7,6 gelöst und mit 12 μl Wasserstoffperoxid aktiviert werden. Das wasserunlösliche, gefärbte Produkt fällt sofort aus und markiert die Lage des Immunkomplexes auf der Membran. Die Reaktion wird nach 30 sek mit Leitungswasser abgestoppt, damit keine künstlich verstärkte Reaktion der Bandenintensitäten bei unterschiedlichen Patientenseren provoziert werden kann. Der Membranstreifen wird vor der Lufttrocknung kurz mit destilliertem Wasser gewaschen. 3.5 Erhebung der Patientendaten Mit Hilfe der vorgestellten Immunoblot-Technik sollen anhand der Seren von Patienten mit C.trachomatis Infektionen, die immundominanten C.trachomatis Antigene herausgearbeitet werden. Die Auswahl der Seren erfolgt mit Hilfe einer Serumbank des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität Ulm. Die Seren stammen ausnahmslos von Patienten des Universitätsklinikum Ulm, die im Zeitraum von März 1998 bis Oktober 2004 in der Mikrobiologischen Diagnostik des Universitätsklinikums Ulm angefordert wurden. Die Anforderungen zur Bestimmung spezifischer Antikörper gegen C.trachomatis bzw. C.pneumoniae wurden aufgrund klinischer Symptome gestellt. Es werden 21 Seren von Patientinnen mit positiven Erregernachweis (PCR) und/oder Seren mit auffällig erhöhtem C.trachomatis Antikörper-Titer (mind. IgG Antikörper-Titer von 1:128) im MIF ausgewählt. Es stehen lediglich 2 Seren mit einer definierten akuten C.trachomatis Infektion zur Verfügung. Als Kontrollgruppen werden 10 Patientenseren die einen negativen Chlamydiennachweis im MIF haben und 20 Patientenseren mit einem niedrigen IgG Antikörper-Titer 1:64 im MIF für C.pneumoniae ausgewählt. Die letzte Patientengruppe mit einem niedrigen IgG Antikörper-Titer für C.pneumoniae wurde ausgewählt, um die durchschnittlich 70-80 % ige Durchseuchung der Bevölkerung mit diesem Erreger zu repräsentieren. Da bei Frauen C.trachomatis ein wesentlich größeres Gesundheitsproblem (sekundäre Sterilität etc.) darstellt als bei Männern, werden Patientinnen mit komplizierten C.trachomatis Infektionen wie Adnexitis, Salpingitis, Sactosalpinx, Ovarialzysten oder Tuboovarialabszeß 3 Methoden 31 mikrobiologisch und klinisch charakterisiert. Diese Patientinnen bilden die Hauptgruppe der vorliegenden Studie. Es werden zusätzlich weitere Kontrollgruppen gebildet. Vergleichend zu den komplizierten Infektionen werden 2 Patienten mit akuter unkomplizierter C.trachomatis Infektion untersucht. Eine weitere Kontrollgruppe besteht aus Patienten, die serologisch noch keinen Chlamydienkontakt hatten. Die 3. Gruppe umfasst Personen, die einen niedrigen Antikörper-Titer für C.pneumoniae aufweisen, um die Durchseuchung der Bevölkerung mit diesem Erreger zu repräsentieren. Zur Untersuchung immundominanter Proteine in humanen Seren werden also insgesamt 53 Patientenseren, untersucht. Ein diesbezüglich positives Votum der Ethikkommission der Universität Ulm liegt vor. 3.5.1 Mikrobiologische und klinische Charakterisierung Patienten mit komplizierter C.trachomatis Infektion Die Hauptgruppe (chronische C.trachomatis Infektion) umfasst 21 Frauen zwischen 22 und 54 Jahren; 3 Frauen haben einen Tuboovarialabszeß, 3 Frauen eine Adnexitis, 3 Frauen einen Sactosalpinx, 2 Frauen rezidivierende Ovarialzysten, eine Frau einen Tubenverschluß. Die Patientenseren 14H bis 21H stammen von afrikanischen Frauen aus einer in Ghana durchgeführten epidemiologischen Studie, daher können keine näheren Angaben zum Alter gemacht werden. Bei der in Ghana durchgeführten Studie wurden die Frauen lediglich nach einer bestehenden Schwangerschaft befragt. Die Antworte notiert und den Frauen Blut abgenommen. Aus dieser Befragung und Untersuchung ergab sich, dass 2 der Frauen der Ghana Studie schwanger waren (SU: Schwangerschaftsuntersuchung). Die anderen 6 Frauen konnten keine Kinder bekommen, somit lag bei ihnen am ehesten eine sekundäre Sterilität vor. Die Antikörper-Titer für IgG bei C.trachomatis liegen in der vorliegenden Studie zwischen 1:64 bis 1:1024. 4 Frauen haben zusätzlichen einen positiven Titer für den Antikörper IgM, 3 von ihnen ein IgM von 1:32 und 1 Frau ein IgM 1:16. 20 Patientinnen haben ein positives Ergebnis im C.trachomatis spezifischen IgG-EIA, nur 1 Patientin ist in der Untersuchung negativ. 2 Frauen haben einen positiven C.trachomatis DNA Nachweis in der PCR, 2 andere einen positiven DNA-Nachweis durch die LCR. Eine Frau hat eine negative LCR und eine andere einen grenzwertigen Befund in der LCR. Der Antikörper-Titer IgG für C.pneumoniae ist bei 15 Patientinnen zusätzlich zu C.trachomatis positiv mit Werten zwischen 1:64 bis 1:256. Der IgM-Titer für C.pneumoniae war bei allen Patientinnen negativ (siehe Tab.1). 3 32 Methoden Tabelle 1: Mikrobiologische und klinische Charakterisierung der Hauptgruppe MIF-Titer Patient Alter* Diagnose C.trachomatis IgM Tuben- C.t.1 C.pneumoniae IgG IgM IgG IgG- NAT EIA Ne g <1:16 pos 1:128 neg <1:16 pos 1:64 pos Sactosalpinx Ne g <1:16 pos 1:256 neg <1:16 neg <1:32 pos 31 Rez. Ovarialzysten Ne g <1:16 pos 1:256 neg <1:16 pos 1:128 pos 4H 39 Sactosalpinx pos 1:32 pos 1:256 neg <1:16 neg <1:64 pos 5H 21 Tuboovarialabszeß pos 1:32 pos 1:1024 neg <1:16 neg <1:32 pos 6H 27 Sactosalpinx Ne g <1:16 pos 1:1024 neg <1:16 pos 1:64 pos + 7H 27 Rez. Ovarialzysten pos 1:32 pos 1:1024 neg <1:16 pos 1:256 pos + 8H 54 Tuboovarialabszeß Ne g <1:16 pos 1:512 neg <1:16 pos 1:32 pos 9H 34 Adnexitis neg <1:16 pos 1:128 neg <1:16 neg <1:64 pos 10H 30 Adnexitis neg <1:16 pos 1:512 neg <1:16 pos 1:64 pos 11H 23 Adnexitis pos 1:16 pos 1:1024 neg <1:16 pos 1:128 pos Gw 12H 24 Tuboovarialabszeß neg <1:16 pos 1:1024 neg <1:16 pos 1:256 neg + 13H 28 Sactosalpinx neg <1:20 pos 1:64 neg <1:16 neg <1:64 pos + 14H ? SU neg <1:16 pos 1:512 neg <1:16 pos 1:64 pos 15H ? SU neg <1:16 pos 1:512 neg <1:16 pos 1:64 pos 16H 32 sek. Sterilität neg <1:16 pos 1:256 neg <1:16 pos 1:256 pos 17H 26 sek. Sterilität neg <1:16 pos 1:256 neg <1:16 pos 1:32 pos 18H 34 sek. Sterilität neg <1:16 pos 1:512 neg <1:16 pos 1:256 pos 19H 32 sek. Sterilität neg <1:16 pos 1:128 neg <1:16 neg <1:32 pos 20H 30 sek. Sterilität neg <1:16 pos 1:256 pos 21H 28 neg <1:16 pos 1:128 pos 1H 39 2H 22 3H verschluß sek. Sterilität 1 neg <1:16 pos 1:256 *Alter in Jahren; C.t. = Chlamydia trachomatis IgG EIA; SU = Schwangerschaftsuntersuchung _ 3 33 Methoden 3.5.2 Patienten ohne mikrobiologischen und klinischen Nachweis von Chlamydien Die seronegative Kontrollgruppe umfasst 10 Personen, 5 weibliche und 5 männliche, zwischen dem 1. bis zum 71. Lebensjahr. Der Hauptteil dieser Gruppe sind Kinder. 2 Personen werden aufgrund eines Asthmas bronchiale serologisch untersucht, 3 Patienten weisen eine Pneumonie oder Infekte der oberen Luftwege auf, 3 Kinder haben entweder eine nekrotisierende Enterokolitis, Mukoviszidose oder eine Mittelohrentzündung. Eine Patientin hat eine chronisch myeloische Leukämie. Ein Patient hat eine Sepsis nach einer KorneaOperation. Alle diese Patienten werden serologisch auf Chlamydien-Antikörper getestet und haben ein negatives Ergebnis für Chlamydien im MIF. Aus diesem Grund wird auf die Darstellung der MIF-Ergebnisse verzichtet (siehe Tab.2). Tabelle 2: Klinische Charakterisierung der Kontrollgruppe Patient Alter/Geschlecht* Diagnose 1N 5 Tage, m nekrotisierende Enterokolitis 2N 5, w Pneumonie 3N 3, w Infekt der oberen Luftwege 4N 1, m Asthma bronchiale 5N 3, m Asthma bronchiale 6N 71, m Sepsis nach Kornea-OP 7N 29, m Pneumonie 8N 5, w Otitis media 9N 53, w CML 10N 7, w Mukoviszidose * Alter in Jahren; Geschlecht w = weiblich m = männlich 3.5.3 Mikrobiologische und klinische Charakterisierung Patienten mit einem niedrigen C.pneumoniae Antikörper-Titer Bis zu 70 % der Erwachsenen weisen IgG Antikörper gegen C.pneumoniae auf. 20 Seren von Patienten mit einem niedrigen Antikörper-Titer gegen C.pneumoniae werden, um Kreuzreaktionen dieser Antikörper mit C.trachomatis Antigenen zu erfassen, mittels Immunoblot untersucht. 3 34 Methoden Diese Gruppe umfasst 20 Personen, 9 Frauen und 11 Männer, im Alter zwischen 4 und 76 Jahren. Alle Patienten weisen einen MIF-IgG Antikörper-Titer für C.pneumoniae von 1:64 auf, keinen IgM Antikörper-Titer für Chlamydien generell und keinen IgG Antikörper-Titer für C.trachomatis. 3 Patienten weisen Erkrankungen, die zusammengefasst zu den malignen Lymphomen zählen, auf. Zusätzlich hat eine Person eine akute Leukämie und eine andere eine Panmyelopathie. 3 Personen haben einen fieberhaften Infekt bzw. Fieber unklarer Genese. Erkrankungen der Atemwege wie Bronchitis, Staphylococcus aureus Pneumonie, Bronchopneumonie und Pneumonie ohne Erregernachweis haben 4 Patienten. 2 Patienten weisen psychosomatische Störungen wie rezidivierende Synkopen und Tic-Störungen auf. Ein metabolisches Syndrom hat ein weiterer Patient, sowie ein Patient mit einer Herpes Simplex Virus (HSV) Primärinfektion. Eine weitere Person weist linksseitige Bauchschmerzen auf. Einer hat eine Augenerkrankung Uveitis. Von einem Patient ist die Diagnose aufgrund mangelnder Information in den Patientenakten nicht bekannt (siehe Tab.4). Bei 12 Patienten liegt ein negativer Nachweis des C.trachomatis IgG-EIA vor, d.h. ein negativer Antikörper-Nachweis gegen eine spezifische Domäne des MOMPs von C.trachomatis. Bei den anderen 8 Personen wurde ein IgG-EIA für C.trachomatis nicht durchgeführt. Tabelle 3: Mikrobiologische und klinische Charakterisierung der Patienten mit einem Durchseuchungstiter für C.pneumoniae MIF-Titer Patient Alter/ Geschlecht* Diagnose C.trachomatis IgM C.t.1 C.pneumoniae IgG IgM IgG- IgG EIA 1D 19, w Fieber unklarer Genese neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 2D 36, w Non-HodkinLymphom neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ 3D 49, w Chronisch myeloische Leukämie neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ 4D 70, w Metabolisches Syndrom neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ 5D 28, w Bronchitis neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 6D 39, w Non-HodkinLymphom neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ 3 35 Methoden MIF-Titer Patient Alter/ Geschlecht* Diagnose C.trachomatis IgM 7D 45, w 8D 76, w 9D 33, w 10D 61, m 11D 13, m Rezidivierende Synkopen Staph. aureus Bakteriämie HSV Primärinfektion Fieberhafter Infekt Tic-Störung C.t.1 C.pneumoniae IgG IgM IgG- IgG EIA neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 _ neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 neg <1:16 neg <1:16 neg <1:16 pos 1:64 Akute 12D 47, m myeloische Leukämie 13D 61, m Staph. aureus Pneumonie Limksseitige 14D 61, m Unterbauchschmerzen 15D 38, m 16D 56, m 17D 43, m 18D 53, m 19D 37, m 20D 4, m Fieberhafter Infekt Bronchopneumonie Uveitis Pneumonie, Pericarditis Panmyelopathie _ * Alter in Jahren; Geschlecht w = weiblich m = männlich 1 C.t. = Chlamydia trachomatis IgG EIA=IgG ELISA 3 3.6 36 Methoden Immunoblot Auswertung mit dem Gelscan 5.1 Professional Programm der Firma BioSciTec Nachdem für alle oben beschriebenen Patientenseren Immunoblots gefertigt waren, ist die nächste Aufgabe die Immunoblots auszuwerten, in dem man jeder Proteinbande ein Molekulargewicht zuordnet. Einen Grauintensitätsstandard definiert, der angibt welche Bande als spezifische Bande gewertet wird oder welche aufgrund einer zu schwachen Grauintensität nicht mehr als Bande gewertet werden soll. Jedes Immunoblot Bild wird mit Hilfe der Software Gelscan 5.1 Professional eingescannt und ausgewertet. Die Bandenmolekulargewichte der einzelnen Banden werden durch den mitgelaufenen Proteinmarker Rainbow marker high Standard definiert. Als zusätzlicher Referenzpunkt zur Berechnung der Molekulargewichte muss das C.trachomatis MOMP ein Molekulargewicht zwischen 40,5 kDa und 41,5 kDa aufweisen, somit soll eine möglichst genaue und vergleichbare Übereinstimmung innerhalb der Bilder hergestellt werden. Damit eine Bande als Bande erkannt wird, wird ein cut off der Grauintensität bei 50 festgelegt. Diese Festlegung soll verhindern, dass schwache und damit schlecht reproduzierbare Reaktivitäten als positiv bewertet werden. Nun werden alle Banden mit einem Grauwert über 50 in einer Tabelle zusammengefasst und über die Molekulargewichte miteinander verglichen. Da die Proteinauftrennung nicht in allen Gelen durch die Elektrophorese gleich läuft, kommt es zu Abweichungen in der Molekulargewichtsberechnung der einzelnen Immunoblots. Ais diesem Grund werden alle Gelbilder zusätzlich visuell ausgewertet, um gleiche Banden, die aufgrund der Softwareberechnung unterschiedliche Molekulargewichte zugeordnet werden, zu identifizieren. Kommastellen die aufgrund der Softwareberechnung zustande kommen, werden aufgerundet. Die Graphik in Abb.10 zeigt als Beispiel die Grauintensität aller C.trachomatis Banden von Patient 10H. Die einzelnen Banden sind von 1 bis 29 durchnummeriert und durch eckige Klammern jeweils begrenzt. Alle Banden liegen über dem festgelegten cut off von 50. Die Distanz auf der x-Achse zeigt an, auf welcher Höhe des Streifens sich die Bande befindet. Alle Immunoblots werden mit dem Programm Gelscan 5.1 Professional auf diese Weise ausgewertet. 3 37 Methoden Patient: 10H, weiblich 30 Jahre Diagnose: Adnexitis MIF-Titer C.trachomatis: IgM 1:20 IgG 1:256 Cut off Abb.10: Darstellung der Grau-Intensitäten einzelner Banden: eine Bande ist durch eine Zahl dargestellt und in eckigen Klammern abgegrenzt; x-Achse Grau-Intensitäten aufsteigend, y-Achse Höhe der Bande auf dem Blot-Streifen; die grüne Linie stellt den Cut off dar. 3.7 Statistische Auswertung Sensitivität, Spezifität, positiv prädiktiver und negativ prädiktiver Wert sind in der Medizin häufig verwendete Maße, um die Güte von diagnostischen Verfahren zu beurteilen. Die Güte wird dabei durch den Anteil richtig klassifizierter Befunde bestimmt. Je größer dieser Anteil, d. h. je näher er an 100 % herankommt, desto treffsicherer ist der verwendete diagnostische Test. Mit Hilfe einer 4-Felder Tafel kann man die Sensitivität, Spezifität, positiv und negativ prädiktiven Wert bestimmen (siehe Tab. 4). 3 Tabelle 4: Darstellung einer 4-Felder Tafel Bande vorhanden Bande nicht vorhanden 38 Methoden Infektion positiv Keine Infektion Richtig positiv (A) Falsch positiv (B) Test Positive (A+B) Falsch negativ (C) Richtig negativ (D) Test Negative (C+D) Erkrankte (A+C) Gesunde (B+D) Die Sensitivität ist ein Maß dafür, wie viele richtige positive Befunde ein Test liefert verglichen mit der Anzahl aller Erkrankten: Sensitivität: A / (A+C) Die Spezifität gibt an, wie viele Patienten vom Test als richtig gesund erkannt werden gemessen an der Anzahl aller Gesunden: Spezifität: D / (B+D) Der positive prädiktive Wert gibt an, wie wahrscheinlich die Infektion vorliegt. Gegenteilig gibt dann der negative prädiktive Wert an, wie wahrscheinlich die Infektion nicht vorliegt. Positiver prädiktiver Wert: A / (A+B) Negativer prädiktiver Wert: D / (D+C) 4 39 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Seren von Patienten mit chronisch aufsteigender C.trachomatis Infektion erkennen eine Vielzahl von Chlamydien-Antigenen Bei allen Immunoblot Untersuchungen mit den Seren der Patientengruppe zeigen sich eine Vielzahl reaktiver Banden. Diese Banden finden sich in allen Molekulargewichtsbereichen. Klare, scharfe Banden finden sich insbesondere in dem Bereich über 80 kDa, während im niedermolekularen Bereich unter 30 kDa weniger und eher verschwommene Banden sichtbar sind. Die stärksten Bandenintensitäten finden sich in einem Bereich zwischen 30 kDa und 70 kDa. Dabei imponieren quantitativ insbesondere die Banden mit einem Molekulargewicht zwischen 40 kDa und 70 kDa. Dabei handelt es sich bei der Bande mit einem Molekulargewicht von 41 kDa am ehesten um das relativ gut charakterisierte Chlamydienprotein MOMP sowie bei der Bande mit einem Molekulargewicht von 60 kDa und 57 kDa um das cysteinreiche OMP2 bzw. um das HSP60. Diese beiden Banden lassen sich aufgrund ihres ähnlichen Molekulargewichts nur schwer im SDS-Gel von einander abgrenzen (Abb.11-15). Am unteren Ende der Immunoblots findet sich relativ häufig eine etwas verschwommene Bande, die aufgrund des Molekulargewichts am ehesten das charakteristische chlamydiale LPS (Lipopolysaccharid 8 – 15 kDa) darstellen könnte. Im Folgenden sind exemplarisch 5 charakteristische Immunoblot Bilder dargestellt, diese werden mit sämtlichen Proteinbanden, die sich bei einer chronischen aufsteigenden C.trachomatis Infektion finden lassen, gezeigt (Abb.11-15). Rot dargestellt ist das durch die Gelauswertesoftware Molekulargewicht der Banden. GelScan 5.1 berechnete 4 40 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton A 220 B MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 190 kDa 150 kDa 97 66 45 97 70 kDa 60 kDa 57 kDa 48 kDa 66 45 41 kDa 35,5 kDa 30 30 kDa 30 28 kDa 20,1 20,1 20 kDa 15 kDa 1 2 1 2 1 C.trachomatis 1 C.trachomatis 2 HeLa-Zellen 2 HeLa-Zellen Abb. 11: A) Immunoblot-Untersuchung von Serum 2H, Klinische Diagnose: Sactosalpinx links, C.trachomatis IgG (Immunglobulin G) Antikörper-Titer 1:256. Aufgetragen wurde ein Vollzelllysat von gereinigten C.trachomatis Elementarkörperchen (1) und als Kontrollantigen ein Zelllysat von HeLa-229 Wirtszellen (2) blaue Pfeile markieren dabei unspezifische Reaktionen der HeLa-229 Wirtszellen. B) Darstellung der Molekulargewichtsberechnung der Banden mittels GelScan 5.1, reaktive Banden durch schwarze Pfeile markiert. 4 41 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker A MolekulargewichtsMarker B Einheit: kDa= Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 Kilo Dalton 220 190 kDa 97 150 kDa 97 66 70 kDa 66 45 60 kDa 57 kDa 48 kDa 45 41 kDa 35,5 kDa 30 kDa 30 30 28 kDa 20,1 14,3 1 20,1 20 kDa 15 kDa 14,3 2 1 2 1 C.trachomatis 1 C.trachomatis 2 HeLa-Zellen 2 HeLa-Zellen Abb. 12: A) Immunoblot-Untersuchung von Serum 5H, Klinische Diagnose: Tuboovarialabszeß, C.trachomatis IgG (Immunglobulin G) Antikörper-Titer 1:1024. Aufgetragen wurde ein Vollzelllysat von gereinigten C.trachomatis Elementarkörperchen (1) und als Kontrollantigen ein Zelllysat von HeLa 229 Wirtszellen (2) blaue Pfeile markieren dabei unspezifische Reaktionen der HeLa-229 Wirtszellen. B) Darstellung der Molekulargewichtsberechnung der Banden mittels GelScan 5.1, reaktive Banden durch schwarze Pfeile markiert. 4 42 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker A MolekulargewichtsMarker B Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 190 kDa 150 kDa 97 66 45 97 70 kDa 60 kDa 57 kDa 48 kDa 66 45 41 kDa 35,5 kDa 30 30 kDa 30 28 kDa 1 20,1 20 kDa 14,3 15 kDa 20,1 14,3 2 1 2 1 C.trachomatis 1 C.trachomatis 2 HeLa-Zellen 2 HeLa-Zellen Abb. 13: A) Immunoblot-Untersuchung von Serum 10H, Klinische Diagnose: Adnexitis, C.trachomatis IgG (Immunglobulin G ) Antikörper-Titer 1:512. Aufgetragen wurde ein Vollzelllysat von gereinigten C.trachomatis Elementarkörperchen (1) und als Kontrollantigen ein Zelllysat von HeLa 229 Wirtszellen (2) blaue Pfeile markieren dabei unspezifische Reaktionen der HeLa-229 Wirtszellen. B) Darstellung der Molekulargewichtsberechnung der Banden mittels GelScan 5.1, reaktive Banden durch schwarze Pfeile markiert. 4 43 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker A MolekulargewichtsMarker B Einheit: kDa= Kilo Dalton Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 220 190 kDa 150 kDa 97 97 70 kDa 66 66 60 kDa 57 kDa 48 kDa 45 45 41 kDa 35,5 kDa 30 kDa 30 30 28 kDa 20,1 20,1 20 kDa 14,3 1 14,3 15 kDa 2 1 2 1 C.trachomatis 1 C.trachomatis 2 HeLa-Zellen 2 HeLa-Zellen Abb. 14: A) Immunoblot-Untersuchung von Serum 11H, Klinische Diagnose: Adnexitis, C.trachomatis IgG (Immunglobulin G) Antikörper-Titer 1:1024. Aufgetragen wurde ein Vollzelllysat von gereinigten C.trachomatis Elementarkörperchen (1) und als Kontrollantigen ein Zelllysat von HeLa 229 Wirtszellen (2) blaue Pfeile markieren dabei unspezifische Reaktionen der HeLa-229 Wirtszellen. B) Darstellung der Molekulargewichtsberechnung der Banden mittels GelScan 5.1, reaktive Banden durch schwarze Pfeile markiert. 4 44 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker A B Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 190 kDa 97 150 kDa 97 66 70 kDa 66 60 kDa 45 57 kDa 48 kDa 45 41 kDa 35,5 kDa 30 20,1 14,3 1 30 30 kDa 28 kDa 20,1 20 kDa 14,3 15 kDa 2 1 2 1 C.trachomatis 1 C.trachomatis 2 HeLa-Zellen 2 HeLa-Zellen Abb. 15: A) Immunoblot-Untersuchung von Serum 12H, Klinische Diagnose: Tuboovarialabszeß, C.trachomatis IgG (Immunglobulin G) Antikörper-Titer 1:1024. Aufgetragen wurde ein Vollzelllysat von gereinigten C.trachomatis Elementarkörperchen (1) und als Kontrollantigen ein Zelllysat von HeLa 229 Wirtszellen (2) blaue Pfeile markieren dabei unspezifische Reaktionen der HeLa-229 Wirtszellen. B) Darstellung der Molekulargewichtsberechnung der Banden mittels GelScan 5.1, reaktive Banden durch schwarze Pfeile markiert. 4 4.1.1 45 Ergebnisse Identifizierung chlamydien-spezifischer Banden mit Kontrolle durch HeLa-Zellen Aufgrund ihres Molekulargewichts und ihrer prominenten Immunreaktion sind das MOMP, HSP60, das cysteinreiche OMP2 und das LPS auf dem Immunoblot relativ leicht zu lokalisieren. Zusätzlich bleibt jedoch eine Vielzahl reaktiver Banden, die bisher kaum charakterisiert wurden. Um zu klären, ob es sich dabei überhaupt um chlamydien-spezifische Proteine handelt, wurde für jedes Patientenserum ein Kontrollantigen eingesetzt. Dieses besteht aus einem HeLa-229 Zelllysat und soll dazu dienen, mögliche unspezifische Bindungen an die Wirtszellproteine, die noch in den Chlamydienantigenpräparationen enthalten sein können, auszuschalten. Reaktive Banden wurden demnach als chlamydien-spezifisch bewertet, sofern mit dem HeLa-229 Antigen auf Höhe des entsprechenden Molekulargewichts keine korrespondierende Bande erkennbar ist (Abb.11-15). Beispiele für unspezifische HeLa-229 Wirtszellreaktionen sind in den Abb. 11-15 durch blaue Pfeile markiert. 4.1.2 Chlamydien-spezifische Banden finden sich in allen Molekulargewichtsbereichen Reaktiven Banden wurde mittels einer speziell dafür vorgesehenen Software GelScan 5.1 ein Molekulargewicht zugeordnet. Dafür wurde in jedem Lauf ein Molekulargewichtsmarker mitgeführt, dessen Banden bei 220 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa und 14,3 kDa sichtbar wurden (Abb.11-15). Darüber hinaus wurde zur Berechnung der Molekulargewichte noch das MOMP mit einem Molekulargewicht von 41 kDa als Referenzpunkt in die Berechnung der Gelauswertesoftware einbezogen. Das MOMP ist in jedem Serum aus der Patientengruppe mit einer aufsteigenden C.trachomatis Infektion reaktiv. Häufig vorkommende chlamydien-spezifische Banden zeigen sich nach der computerbasierten Auswertungen in jedem Serum bei 190 kDa, 150 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 57 kDa, 48 kDa, 41 kDa, 35,5 kDa, 30 kDa, 28 kDa, 20 kDa und 15 kDa. Weniger häufig aber dennoch chlamydien-spezifisch zeigen sich Banden mit einem Molekulargewicht von 85 kDa und zwischen 40 kDa bis 37 kDa. Da diese Banden aber nicht in jedem Serum mit aufsteigender C.trachomatis Infektion vorkamen, wird auf diese Banden im Folgenden nicht weitereingegangen. 4 46 Ergebnisse 4.1.3 Die Berechnung von Banden mit hohem Molekulargewicht ist unpräzise Die Auftrennung der Proteine ist abhängig von der Porengröße des Gels. Je höher der SDSGehalt, umso feinmaschiger ist das Gel, desto besser ist die Auftrennung der Proteine im hochmolekularen Bereich. Dafür wurden zusätzlich 8% SDS-Gele gegossen. Der entsprechende Molekularbereich bekommt dementsprechend eine längere Wegstrecke, das Computerprogramm hat dadurch Möglichkeit mit besseren Berechnungspunkten, die Molekulargewichtsberechnung genauer zu gestalten (Abb. 16). MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton 19H 2H Berechnung der 8%-Gele mit GelScan 5.1 3H 220 Große Distanz des MolekulargewichtsMarkers im oberen Bereich 190 kDa 130 kDa 97 anstatt vorher 150 kDa 66 45 30 Abb. 16: Um eine bessere Auftrennung der Proteine im hochmolekularen Bereich zwischen 220 kDa (Kilo Dalton) und 97 kDa zu erreichen wurden 8 % SDS-Gele verwendet. Dadurch ergibt sich ein anderes berechnetes Molekulargewicht. Die 150 kDa Bande in den ImmunoblotUntersuchungen der Seren 2H, 3H und 19H liegt wahrscheinlich eher bei einem Molekulargewicht von 130 kDa. 4.1.4 Chlamydien-spezifische Banden zeigen in der Regel eine stärkere Bandenintensität als kreuzreagierende Banden Die Intensität einer reaktiven Bande wird durch die Immunogenität des Proteins und der aufgetragene Proteinmenge bestimmt. Unspezifische Bindungen sollten durch Präabsorbtion mit Zelllysaten durch HeLa-229 Zellen reduziert werden. Dennoch muss mit Reaktivitäten 4 47 Ergebnisse sowohl an spezifische als auch unspezifische Proteine, aufgrund des hochempfindlichen Detektionssystems gerechnet werden. Dies belegen Versuche mit so genannten seronegativen Patienten d.h. Patienten, die im Mikroimmunofluoreszenztest keinerlei Antikörper gegen Chlamydien spp. aufweisen. Diese Gruppe umfasst 10 Probanden. Aus den Immunoblots dieser Gruppe lässt sich erkennen, dass dennoch schwache Reaktionen mit den Chlamydien-Antigenen erkennbar sind, insbesondere mit dem MOMP (Abb. 17). Trotzdem ist klar ein Unterschied in den Reaktionen zwischen den Gruppen mit aufsteigender C.trachomatis Infektion und keinem Chlamydiennachweis zu erkennen. MolekulargewichtsMarker Banden- Proteine muster Einheit: kDa = kilo Dalton 190kDa 150kDa 220 97 70kDa 60kDa 57kDa 48kDa 66 45 41kDa 35,5kDa 30 30kDa 28kDa 20,1 20kDa 15kDa 14,3 2N 3N 4N 5N 6N 8N 9N 10N Abb. 17: Beispiele der Bandenmuster seronegativen Patienten mit Darstellung der C.trachomatis Streifen und Markierung des C.trachomatis MOMP durch schwarze Pfeile. Die häufigsten reaktiven Banden einer aufsteigenden C.trachomatis Infektion sind im schwarzen Kasten dargestellt. Mittels GelScan 5.1 Software sollte die Beurteilung der Bandenintensität objektiviert werden. Dabei ist bei gleichen Entwicklungszeiten der Immunoblots die gemessene Graustufe der Banden das Maß für die Bandenintensität und kann gemäß Abb. 18 mit einer Skala von 0 – 100 bewertet werden. 4 48 Ergebnisse Grauwerte 0 25 50 Weiß 100 Schwarz Abb. 18: Darstellung der Graustufen zwischen Grauwert 0 bis Grauwert 100 Patienten, die seronegativ sind und demnach bisher keine Chlamydieninfektion durchgemacht haben, zeigen im Immunoblot trotzdem reaktive Banden, allerdings nicht in der Vielzahl und der Intensivität wie es die Patienten, die eine Chlamydieninfektion durchgemacht haben, zeigen (Abb. 11 – 15). Um ein Maß zur Unterscheidung zwischen positiven und negativen Reaktionsausfall einer Bande zu setzen, wurde zunächst ein Grauwert von 50 als cut-off festgelegt. Dadurch werden nur Proteine mit einer relativ starken Immunogenität in die Auswertung miteinbezogen. Trotzdem finden sich auch bei diesem Schwellenwert, vereinzelt positive Reaktionen, obwohl keine Infektion vorlag. Tabelle 5 zeigt die reaktiven Banden, die bei den seronegativen Patienten beobachtet wurden. Tabelle 5: Schematische Darstellung der Reaktionsergebnisse der Proteinbanden seronegativer Patienten ohne Chlamydienkontakt Patienten Bezeich- 190 150 70 60 57 48 41 35,5 30 28 20 15 kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa nung 1N 2N 3N 4N 5N 6N 7N 8N 9N 10N positiv > cut-off 50 reaktiv < cut-off 50 negativ unterhalb der Nachweisgrenze 4 Ergebnisse 49 Die 150 kDa Bande, die 30 kDa Bande und die 20 kDa Bande waren bei den seronegativen Patienten negativ oder unterhalb des cut-off von 50. Die 190 kDa Bande, die 48 kDa Bande, die 28 kDa Bande und die 15 kDa Bande waren in 10 % der Fälle positiv. Die 35,5 kDa Bande stellt sich in 20 % der Fälle über den cut-off dar. Die 70 kDa Bande und die 57 kDa Bande waren in 30 % der Fälle positiv. In 50 % der Fälle war die 60 kDa Bande und in 60 % der Fälle wird die MOMP Bande positiv. Man kann bei den seronegativen Seren erkennen, dass die Hauptreaktionen im mittleren Molekulargewichtsbereich, v.a. im Bereich des OMP2 bei 60 kDa und des MOMP bei 40 kDa liegen. Im hoch- und niedrigmolekularen Bereich zeigen sich kaum falsch positive Reaktionen. 4.1.5 Seren von Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion zeigen im Immunoblot ein charakteristisches Bandenmuster Bei oberflächlicher Betrachtung der Immunoblots von Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion fällt bereits eine Ähnlichkeit der Bandenmuster auf. Da bei jedem Gel die Laufbedingungen leicht variieren, wurde jeder Immunoblot separat analysiert. Berücksichtigt wurden dabei die Bandenintensität, das berechnete Molekulargewicht der Bande, sowie die Lage der Bande im Vergleich zu Immunoblots von anderen Patienten. Es ergab sich nach systematischer Auswertung ein charakteristisches Bandenmuster der Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion (Abb.19). 4 50 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker Banden- Proteine muster Einheit: kDa = kilo Dalton 220 190kDa 150kDa 97 70kDa 66 60kDa 57kDa 48kDa 45 41kDa 35,5kDa 30 30kDa 28kDa 20,1 20kDa 15kDa 14,3 5H 6H 7H 10H 16H 17H 18H 20H Abb. 19: Darstellung von repräsentativer Immunoblots Patienten mit C.trachomatis Infektion. Die Pfeile markieren die häufigsten reaktiven Banden. In den Kästen sind die reaktiven Banden schematisch dargestellt, wobei jeder Bande ein Molekulargewicht zugeordnet wurde. So waren Banden bei 190 kDa, 150 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 57 kDa, 48 kDa, 41 kDa, 35,5 kDa, 30 kDa, 28 kDa, 20 kDa und 15 kDa nahezu bei allen Seren von Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion nachweisbar (siehe Tabelle 6). Aus Tabelle 6 lassen sich nun folgende Häufigkeiten der nachgewiesenen Banden bestimmen: Eine 190 kDa Bande und die 150 kDa Bande kommt jeweils in 90,5 % der Fälle, die 70 kDa Bande in 95,2 %, 60 kDa Bande in 100 %, 57 kDa Bande in 100 %, 48 kDa Bande in 95,2 %, die 40,5 kDa Bande in 90,5 %, die 35,5 kDa Bande in 95,2 %, die 30 kDa Bande in 90 %, die 28 kDa Bande in 85,7 %, die 20 kDa Bande in 85,7 % und die 15 kDa Bande kommt in 85,7 % der Fälle vor. 4 51 Ergebnisse Tabelle 6: Schematische Darstellung der Reaktionsergebnisse der Proteinbanden Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion Patienten Bezeichnung 190 150 70 60 57 48 41 35,5 30 28 20 15 kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa 1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H 8H 9H 10H 11H 12H 13H 14H 15H 16H 17H 18H 19H 20H 21H positiv > cut-off 50 reaktiv < cut-off 50 negativ unterhalb der Nachweisgrenze Nur in Ausnahmefällen (Serum 1H, 9H und 13H rot gekenzeichnet) konnte mehr als eine der genannten Banden überhaupt nicht bzw. unterhalb des kritischen cut-off Wertes nachgewiesen werden. 4 52 Ergebnisse 4.1.6 Bei Seren mit relativ geringen C.trachomatis Antikörper-Titer finden sich weniger spezifische Banden Die Patientenseren 1H, 9H und 13H haben einen relativ niedrigen C.trachomatis IgG Antikörper-Titer zwischen 1:64 und 1:128 im Vergleich zu den anderen Patientenseren. Aus Tabelle 6 ist zu erkennen, dass nicht alle Proteinbanden dieser Seren über dem cut-off liegen. Durch eine geringere Verdünnung des Patientenserums im Immunoblot sollte versucht werden die Banden deutlicher darzustellen. Durch die geringere Serumverdünnung von 1:50 lassen sich mit dem Serum 1H alle C.trachomatis Proteinbanden darstellen. Die 30 kDa Bande, das MOMP und die 57 kDa Bande sind durch eine Serumverdünnung von 1:100 bei einem IgG Antikörper-Titer von 1:128 nicht über dem cut-off darstellbar. Bei einer Verdünnung von 1:50 ist die Farbintensität stark genug, um über dem cut-off von 50 zu liegen (Abb. 20). MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton 220 190kDa 150kDa 97 70kDa 60kDa 57kDa 66 48kDa 45 Banden- Patienten- Patienten- muster beschreibung serum MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton weiblich 190kDa 39 Jahre 150kDa 97 Diagnose: 70kDa 60kDa 57kDa 48kDa Tubenverschluß 41kDa 35,5kDa MIF-Titer: C.trachomatis IgG 30 30kDa 28kDa 20,1 220 Verdünnung 66 45 41kDa 1:50 35,5kDa 1:128 30kDa 28kDa 30 20kDa 20,1 20kDa 15kDa 14,3 15kDa 1H 14,3 1H Abb. 20: Vergleichende Darstellung zweier Immunoblots bei einer Serumverdünnung von 1:100 und 1:50. Rote Zahlen und Pfeile markieren, dass diese Bande mit einer Serumverdünnung von 1:100 unter dem cut-off lag. Mit höherer Konzentration des Patientenserums lagen alle Banden über dem cut-off, diese sind durch schwarze Pfeile markiert. MIF-Titer: Mikroimmunofluoreszenztest Antikörper-Titer IgG: Immunglobulin G 4 53 Ergebnisse Das Serum 13H hat einen C.trachomatis IgG Titer von 1:64 und einem positiven LCR Nachweis. Bei einer Serumverdünnung von 1:100 im Immunoblot ließen sich die Proteinbanden 150 kDa, 30 kDa, 28 kDa und 20 kDa nicht darstellen und die 190 kDa Bande, 35,5 kDa und 15 kDa Bande nur unter dem cut-off Wert von 50. Auch mit einer höheren Serumkonzentration im Immunoblot ließen sich die Banden 30 kDa und 20 kDa nicht darstellen. Die 190 kDa, 150 kDa, 35,5 kDa, 28 kDa und 15 kDa Bande sind farbintensiv stärker dargestellt, liegen aber dennoch unter dem festgelegten cut-off Wertes von 50 (Abb. 21). MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton Banden- Patienten- Patienten- muster beschreibung serum MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Kilo Dalton weiblich 220 190kDa 150kDa 220 28 Jahre 190kDa 150kDa 97 70kDa 60kDa 57kDa 48kDa 66 45 Sactosalpinx MIF-Titer: 41kDa 35,5kDa 30kDa 28kDa 30 20,1 14,3 13H 97 Diagnose: C.trachomatis IgG 70kDa 60kDa 57kDa 48kDa Verdünnung 66 45 1:50 41kDa 1:64 35,5kDa LCR positiv 30kDa 28kDa 30 20kDa 20kDa 20,1 15kDa 15kDa 14,3 13H Abb. 21: Um zu zeigen, dass das Serum 13H mit niedrigem C.trachomatis IgG Antikörper-Titer 1:64 und einem positiven LCR-Nachweis auch alle Banden aufweist, wurde ein weiterer Immunoblot mit einer Serumverdünnung von 1:50 hergestellt. Dabei markieren rote Zahlen und Pfeile, dass diese Banden mit einer Serumverdünnung von 1:100 unter dem cut-off liegen. MIF-Titer: Mikroimmunofluoreszenztest Antikörper-Titer IgG: Immunglobulin G LCR: Ligase Chain Reaction 4 4.2 54 Ergebnisse Seren von Patienten mit zurückliegender C.pneumoniae Infektion erkennen auch C.trachomatis Proteine Zur Beurteilung der Speziesspezifität der identifizierten Banden wurden ImmunoblotUntersuchungen mit Seren von Patienten mit zurückliegender C.pneumoniae Infektion durchgeführt. Diese Seren sind üblicherweise dadurch charakterisiert, dass sie im Mikroimmunofluoreszenztest schwache bis mittlere IgG Antikörper-Titer von 1:16 bis 1:256 aufweisen. Daher wurden von 20 Patienten, deren Seren durch den Mikroimmunofluoreszenztest charakterisiert waren und bei denen kein Anhalt für eine C.trachomatis Infektion vorlag, geprüft, ob die bereits als chlamydien-spezifisch identifizierte Banden von diesen Seren erkannt werden. Aus Abb. 24 und Tabelle 8 kann man erkennen, dass auch eine Reihe der C.trachomatis Proteine durch C.pneumoniae erkannt werden. Insbesondere kommt es bei der 60 kDa und 57 kDa Bande zur Kreuzreaktion. In diesem Bereich liegt das gattungsspezifische HSP60, dass bei allen Chlamydienspezies Homologien aufweist. Ebenfalls zeigt das C.trachomatis MOMP bei diesen Seren in fast allen Fällen eine Mitreaktion, die aber weniger stark ausgeprägt ist wie bei einer C.trachomatis Infektion. Zusätzlich eine häufige Kreuzreaktion zeigt das 35,5 kDa Protein sowie das gattungsspezifische LPS bei 15 kDa. Im hochmolekularen und niedrigmolekularen Bereich werden von verschiedenen Seren immer wieder verschiedene Proteinbanden von C.trachomatis erkannt. In keinem der Fälle kommt es durch ein Serum mit einem Durchseuchungstiter für C.pneumoniae zur Reaktion mit allen Proteinbanden, die für C.trachomatis festgelegt wurden. 4 55 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker Reaktive ProteinBanden Einheit: kDa= Kilo Dalton Bandenmuster 220 190kDa 150kDa 97 66 70kDa 60kDa 57kDa 48kDa 45 41kDa 35,5kDa 30 30kDa 28kDa 20,1 20kDa 15kDa 14,3 3D 4D 7D 9D 10D 11D 14D 15D 17D Abb. 24 : Ausgewählte Immunoblots von Patienten mit zurückliegender C.pneumoniae Infektion. Aufgetragen wurde ein Vollzelllysat mit gereinigten C.trachomatis Elementarkörperchen. Die Pfeile markieren, die über den cut-off liegenden Banden der einzelnen Seren. In den Kästen sind die gefundenen reaktiven Banden für eine C.trachomatis Infektion schematisch dargestellt. Die Tabelle 8 zeigt, dass die 190 kDa Bande von C.trachomatis lediglich in 10 % der Fälle durch Seren mit zurückliegender C.pneumoniae Infektion erkannt wird. Die 150 kDa, 30 kDa und 20 kDa Bande wurden in jeweils 15 % als positiv bewertet. Die 48 kDa Bande ist in 20 % der Fälle falsch positiv und das HSP60 bei 57 kDa und 28 kDa Bande jeweils in 30 % der Fälle falsch positiv über dem cut-off. Die 70 kDa Bande wird in 35 % der Fälle als positiv angezeigt. In 55 % der Fälle ist die 35,5 kDa Bande falsch positiv. Sehr häufig in 65 % der Fälle zeigt die 15 kDa Bande LPS eine gattungsgemeinsame Reaktion. Am häufigsten mit 80 % und 90 % der Fälle zeigen das MOMP und das OMP2 bei 60 kDa positive Reaktionen auch bei einer durchgemachten C.pneumoniae Infektion. 4 56 Ergebnisse Tabelle 7: Schematische Darstellung der Reaktionsergebnisse der Proteinbanden Patienten mit zurückliegender C.pneumoniae Infektion Patienten Bezeichnung 190 150 70 60 57 48 41 35,5 30 28 20 15 kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa 1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D 8D 9D 10D 11D 12D 13D 14D 15D 16D 17D 18D 19D 20D positiv > cut-off 50 4.2.1 reaktiv < cut-off 50 negativ unterhalb der Nachweisgrenze Durch gleiche Familienzugehörigkeit gibt es viele homologe Proteine zwischen C.trachomatis und C.pneumoniae Aufgrund ihrer engen Verwandtschaft gibt es eine Vielzahl homologer Proteine bei C.trachomatis und C.pneumoniae, die ein vergleichbares Molekulargewicht aufweisen und bei denen, daher Kreuzreaktionen zu erwarten sind. Um diese zuerkennen, ist auf dem Immunoblot sowohl das Vollantigen von C.trachomatis als auch von C.pneumoniae nebeneinander aufgetragen. Aus der Abb. 25 ist zu erkennen, dass die 70 kDa Bande mit gleicher Intensität auf beiden Chlamydienstreifen reagiert. Diese Bande, die am wahrscheinlichsten dem HSP70 entspricht, kann dementsprechend nicht die einzelnen Chlamydienspezies, aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit innerhalb der Familie, unterscheiden, sondern ist ein homologes Protein der Chlamydienfamilie. 4 57 Ergebnisse Im Bereich von 60 kDa liegen zwei Proteine, die nicht nur schwer voneinander zu unterscheiden sind, sondern auch unterschiedliche Reaktionen bei den einzelnen Chlamydienspezies zeigen. Die eine Bande bei 60 kDa wird dem OMP2 zu geschrieben und kommt wie in Abb. 25 erkennbar auf beiden Chlamydienstreifen vor, ist dementsprechend ein homloges Protein innerhalb der Chlamydienfamilie. Die andere Bande 57 kDa wird dem HSP60 zu geschrieben. Dieses Protein besitzt zwischen den einzelnen Chlamydienspezies unterschiedliche strukturelle Eigenschaften und ist dementsprechend deutlich nur auf dem C.trachomatis Streifen zu finden. Eine aufsteigende C.trachomatis Infektion zeigt eine ausgeprägte Reaktion des MOMP, eines der Hauptimmunogene. Die Proteinkomplexe der äußeren Membran sind allen Chlamydienspezies ähnlich, so dass es, wie in Abb. 25 erkennbar, zu einer Mitreaktion des korrespondierenden C.pneumoniae MOMP auf dem C.pneumoniae Streifen kommt. Das LPS kommt ebenfalls bei beiden Spezies vor und zeigt ähnliche Reaktionen auf beiden Chlamydienstreifen. Die am Ende jedes Immunoblot auslaufende fahnenähnliche Bande wird der 15 kDa Bande dem LPS zu geschrieben (Abb. 25). Das LPS Molekulargewicht ist bei allen Chlamydiengattungen relativ gleich und zeigt somit ähnliche Reaktionen auf den Chlamydienstreifen. 4 58 Ergebnisse MolekulargewichtsMarker MolekulargewichtsMarker Einheit: kDa= Einheit: kDa= Kilo Dalton Kilo Dalton 4H 10 H 220 220 97 97 70 kDa 60 kDa 57 kDa 66 66 45 45 MOMP 30 30 20,1 20,1 LPS 14,3 14,3 1 2 1 2 1 C.pneumoniae 2 C.trachomatis Abb. 25: Darstellung Immunoblots von 2 Patientenseren mit aufsteigender C.trachomatis Infektion. Aufgetragen wurden ein Vollzelllysat von gereinigten C.pneumoniae Elementarkörperchen (1) und ein Vollzelllysat von gereinigten C.trachomatis Elementarkörperchen (2), um auf Homologien zwischen den Proteinen der beiden Gattungen zu verweisen. Das 70 kDa Protein und das 60 kDa Protein zeigen bei beiden Spezies eine ähnliche Reaktion. Die 57 kDa Bande zeigt sich nur im C.trachomatis Streifen. Das MOMP (schwarz umrundet) zeigt eine ausgeprägte Reaktion auf dem C.trachomatis Streifen und eine versetzte verschwommene Mitreaktion auf dem C.pneumoniae Streifen. Das LPS bei 15 kDa zeigt ähnliche Reaktionen auf beiden Chlamydienstreifen. 4 59 Ergebnisse 4.3 Diagnostische Aussagekraft der Banden in Abhängigkeit des Kontrollkollektivs Die Sensitivität, Spezifität sowie die Vorhersagewerte wurden mittels der Vier-Felder-Tafel berechnet: Die Gruppe der Patienten mit aufsteigender C.trachomatis Infektion umfasst 21 Personen. Die Kontrollgruppe besteht aus 20 Patienten mit einem niedrigen Antikörper-Titer für C.pneumoniae wie er sich bei 70 – 80 % der gesunden Bevölkerung wieder findet. Eine weitere Kontrollgruppe besteht aus 10 seronegativen Patienten, d.h. Patienten die aufgrund des negativen Nachweises im Mikroimmunofluoreszenztest vermutlich noch keinen Chlamydienkontakt hatten. Im Einzelnen berechnen sich die Sensitivitäten und Spezifitäten wie folgt zwischen der Gruppe der aufsteigenden C.trachomatis Infektionen und der Gruppe der seronegativen Personen: Tabelle 8: Spezifität, Sensitivität, positive und negative Korrektheit reaktiver C.trachomatis Banden in Bezug auf seronegative Patienten Sensitivität* 150 70 60 57 48 41 35,5 30 28 20 15 kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa 90,5 90,5 95,2 100 95,2 95,2 90,5 95,2 81 81 85,7 85,7 Spezifität* 90 100 70 50 70 90 40 80 100 90 100 90 Positive 95 100 87 80,7 87 95,2 76 91 100 94,4 100 94,7 100 87,5 90 Korrektheit* Negative Korrektheit * 190 81,8 83,3 87,5 66,7 88,9 71,4 69,2 76,9 75 * in Prozent Aus der Tabelle 9 sind folgende Ergebnisse ersichtlich: Die Banden mit den höchsten Sensitivitäten, d.h. diese Bande wird von Patienten mit einer chronischen C.trachomatis Infektion erkannt, und den höchsten Spezifitäten, d.h. diese Bande wird nicht von Gesunden erkannt liegen im hoch- und niedrigmolekularen Bereich. Im hochmolekularen Bereich sind das zum einen die 190 kDa Bande, die in 10 % der Fälle auch von gesunden Personen erkannt wird und damit nur eine Spezifität von 90 % hat. Die Sensitivität dieser Bande liegt bei 90,5 %. Zum anderen die 150 kDa Bande, die nicht von gesunden Personen erkannt wird und somit eine Spezifität von 100 % hat. Die Sensitivität dieser Bande beträgt ebenfalls 90,5 %. 4 60 Ergebnisse Im niedrigmolekularen Bereich sind das die Banden mit 30 kDa, 28 kDa, 20 kDa und dem LPS bei 15 kDa. Diese Banden zeichnen sich v.a. durch eine hohe Spezifität, d.h. mit einer hohen Wahrscheinlichkeit nicht von gesunden Personen erkannt zu werden, aus. Die Sensitivitäten der einzelnen Banden liegen zwischen 81 und 85 %, d.h. diese Banden werden nicht in jedem Fall von Patienten mit einer chronischen C.trachomatis Infektion erkannt. Das zwar gut charakterisierte MOMP überzeugt mit einer Spezifität von 40 % nicht. Es wird sehr oft auch von gesunden erkannt. Die Sensitivität beträgt 90, 5 %. Auch die Banden 60 kDa und 57 kDa, die dem OMP2 und dem HSP60 zugeordnet werden, haben nur eine Spezifität von 50 und 70 %, zeigen aber eine hohe Sensitivität, werden dementsprechend häufig von Personen mit chronischer C.trachomatis Infektion erkannt. Im Vergleich zwischen der Gruppe der aufsteigenden C.trachomatis Infektionen mit den Seren einer durchgemachten C.pneumoniae Infektion ergeben sich folgende Ergebnisse: Tabelle 9: Spezifität, Sensitivität, positive und negative Korrektheit C.trachomatis Proteine in Bezug auf Patienten mit einem C.pneumoniae Durchseuchungstiter Sensitivität* Spezifität* Positive Korrektheit* Negative 190 150 70 60 57 48 41 35,5 30 28 20 15 kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa 90,5 90,5 95,2 100 95,2 95,2 90,5 95,2 81 81 85,7 85,7 85 70 90 85 65 10 70 80 20 45 90,5 86,4 74,1 53,8 76,9 83,3 54,3 64,5 90 89,5 92,8 100 93,3 94,1 66,7 90 85 35 85 73,9 85,7 58 81 77,8 70 85 Korrektheit* * in Prozent Die Sensitivitäten der einzelnen Proteinbanden ist im Vergleich mit den Kontrollgruppen gleich, da die Sensitivität nur abhängig von der Gruppe der Patienten mit aufsteigender C.trachomatis ist und sich diese in den einzelnen Berechnungen nicht ändert. Die Spezifitäten in Bezug auf C.trachomatis der einzelnen Banden sind jedoch generell schlechter. Im Einzelnen zeigen sich erneut die besten Ergebnisse im hochmolekularen Bereich bei der 190 kDa und der 150 kDa Bande mit Spezifitäten von 90 und 85 %. Der niedrigmolekulare Bereich erzielt in dieser Darstellung ebenfalls schlechtere Ergebnisse mit Spezifitäten für C.trachomatis von 35 bis 85 %. 4 61 Ergebnisse Das MOMP, OMP2 und HSP60 zeigen in Bezug auf die Seren mit einem niedrigen Antikörper-Titer für C.pneumoniae schlechte Spezifitäten für C.trachomatis. Diese liegen bei 10 % beim OMP2, 70 % für das HSP60 und lediglich 20 % für das MOMP. Diese Banden werden dementsprechend sehr häufig von Personen mit einer durchgemachten C.pneumoniae Infektion erkannt. Fasst man beide Kontrollgruppen zusammen (n = 30), so ergibt sich eine ähnliche Seroprävalenz für C.pneumoniae wie sie in etwa bei einer erwachsenen durchschnittlichen Bevölkerung vorherrscht. Ca. 2/3 der Bevölkerung haben bereits eine C.pneumoniae Infektion durchgemacht und werden durch die Seren mit einem niedrigen Antikörper-Titer für C.pneumoniae repräsentiert. Das andere Drittel der Bevölkerung hatte noch keinen Chlamydienkontakt und wird durch die Seren von seronegativen Personen vertreten. Daraus ergeben sich die folgenden Sensitivitäten und Spezifitäten: Tabelle 10: Spezifität, Sensitivität, positive und negative Korrektheit von C.trachomatis Proteine. Sensitivität* Positive Korrektheit* Negative Korrektheit 150 70 60 57 48 41 35,5 30 28 20 15 kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa 90,5 90,5 95,2 100 95,2 95,2 90,5 95,2 81 81 85,7 85,7 90 76,7 90 Spezifität* * 190 90 66,7 23 70 86,4 86,4 66,7 47,8 70 93,1 93,1 95,5 100 100 83,3 26,7 56,7 80 90 53,3 46,3 60,6 84,2 70,8 85,7 56,3 96,2 72,7 94,4 84,4 85,2 90 84,2 * in Prozent Auch aus der zusammenfassenden Betrachtung der Kontrollkollektive ergibt sich, dass die besten Ergebnisse im hoch- und niedrigmolekularen Bereich erzielt werden konnten. Die 190 kDa und die 150 kDa Banden erreichen eine Sensitivität für eine chronische C.trachomatis Infektion von 90,5 %. Die Spezifität der beiden Banden für C.trachomatis beträgt 90 %. Die Banden im niedrigmolekularen Bereich erreichen im Vergleich nicht ganz so gute Werten, haben aber dennoch eine Sensitivität zwischen 81 – 85 % und sind mit 76,7 – 90 % ausreichend spezifisch für C.trachomatis. Ebenfalls gute Ergebnisse erzielt die 48 kDa Bande mit einer Sensitivität von 95,2 % und einer Spezifität von 83,3 %. 4 Ergebnisse 62 Die 60 kDa Bande, die dem HSP60 zugeschrieben wird, erreicht zwar die höchste Sensitivität 100 %, hat aber aufgrund ihrer Familienhomolgien die niedrigste Spezifität (23 %) für C.trachomatis. Die 57 kDa Bande im Vergleich erreicht eine Spezifität von 70 %. Die 41 kDa Bande, das MOMP, zeigt ähnliche Tendenzen wie das HSP60 mit einer hohen Sensitivität eine Chlamydieninfektion anzuzeigen, einer aber eher niedrigen Spezifität (26,7 %) für C.trachomatis. 5 5 63 Diskussion Diskussion Infektionen mit C.trachomatis (Serogruppen D-K) gehören zu den am häufigsten sexuell übertragbaren Erkrankungen (STD engl. sexuell transmitted disease) weltweit. Es besteht in Deutschland für die Infektion mit C.trachomatis keine Meldepflicht, daher werden Daten zur Prävalenz dieser Infektion meistens auf Basis von Surveillance-Untersuchungen erhoben. Aus Sentineldaten des Robert Koch Instituts, die im Zeitraum Januar 2003 bis Juni 2005 erhoben wurden, geht hervor, dass C.trachomatis Infektionen scheinbar häufiger sind als die anderen untersuchten STD wie Gonorrhöe, Syphilis und HIV. Die Anzahl der eingesendeten Diagnosebögen betrug 4.383. Dabei wurde in 1.095 (25 %) Fällen über eine ChlamydienInfektion und in 769 (17,5 %) Fällen über eine Syphilis-Infektion berichtet (61). Im 2. und 3. Quartal des Jahres 2003 war die Anzahl der mitgeteilten Chlamydien-Diagnosen pro 1000 Patienten am höchsten und lag bei ca. 16 Erkrankte auf 1000 Patienten, bei Syphilis waren es ca. 6 Erkrankte auf 1000 Patienten. Danach gingen die Zahlen der gemeldeten Erkrankung zurück, aber seit Anfang des Jahres 2004 steigt die Anzahl der ChlamydienDiagnosen in Deutschland wieder langsam an (61). Bisherige Studien aus Deutschland zur Prävalenz von C.trachomatis zeigen, dass bei 3,6 % der unter 15-jährigen und 10 % der 17-jährigen jungen Frauen eine Chlamydien-Infektion festgestellt werden kann (35). Dabei geben 75 % der C.trachomatis positiven Frauen keine Symptome bei der Diagnosestellung an. Eine 2004 durchgeführte Studie in Berlin zeigt, dass ca. 5,5 % asymptomatischer Mädchen im Adoleszenzalter C.trachomatis positiv sind. Bei den Patientinnen mit Beschwerden werden knapp 10 % positiv auf C.trachomatis getestet (1,36). Aus diesen statistischen Daten wird ersichtlich, dass eine genitale C.trachomatis Infektion durchaus keine seltene oder exotische Erkrankung ist, dennoch fehlt der breiten Bevölkerung in Deutschland das Bewusstsein für das Problem der genitalen C.trachomatis Infektion. Nach Angaben der DSTDG (Deutsche sexuell transmitted disease Gesellschaft) sind schätzungsweise 100.000 Frauen im gebärfähigen Alter in Deutschland aufgrund einer Chlamydien-Infektion ungewollt kinderlos. Unerkannte, chronische oder unzureichend therapierte genitale Chlamydien-Infektionen können zu schwerwiegenden Folgeerkrankungen im kleinen Becken führen. Häufige klinische Manifestationsformen sind chronische Bauchbeschwerden, extrauterine Schwangerschaft und am gefürchtetsten die tubare Infertilität durch nicht erkannte Infektion. Extrauterine Schwangerschaften gelten als indirekter Indikator für die Häufigkeit von genitalen 5 64 Diskussion Chlamydien-Infektionen. Als Präventionsmaßnahmen der möglichen schwerwiegenden Folgeerscheinungen sind die frühzeitige Erkennung und Behandlung der genitalen Chlamydien-Infektionen von großer Bedeutung. Bedingt durch die unbefriedigende Labordiagnostik von Chlamydien-Infektionen, insbesondere von aufsteigenden urogenitalen C.trachomatis Infektionen in weiten Bereichen aufgrund des komplexen intrazellulären Entwicklungszyklus, ist unter anderem Ziel der vorliegenden Arbeit, neue diagnostisch verwertbare Antigene in Form von Proteinbanden mittels Immunoblot-Technik zu identifizieren. Durch den Einsatz gereinigter rekombinanter Antigene könnte dann darauf basierend ein serologisches Verfahren etabliert werden, mit dem es ohne invasive Diagnostik möglich ist chronische C.trachomatis Infektionen zu erkennen. Es stehen zurzeit keine standardisierten Methoden zur einheitlichen Diagnostik für genitale Chlamydien-Infektionen zur Verfügung. Mit der Immunoblot-Technik werden Proteine durch Gelelektrophorese nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und dort mit Hilfe von enzymkonjugierten Antikörpern unter Substratzugabe sichtbar gemacht. Durch diese Methode sollte es möglich sein, spezies- und genusspezifische immunreaktive Chlamydienproteine zu finden. Dafür wird in der vorliegenden Arbeit die Methode soweit optimiert und standardisiert, dass möglichst einheitliche und vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Mit der Standardisierung dieser Methode ergeben sich folgende Fragestellungen als Ziele für diese Arbeit: Welche Antigene erweisen sich bei chronisch genitalen C.trachomatis Infektionen als immundominant und gleichzeitig als nicht signifikant in den Kontrollgruppen? Welche Charakteristika dieser immundominanten Proteine lassen sich darüber hinaus bereits aus der Untersuchungsmethode herausfinden? Können den gefundenen Proteinen zusätzlich bekannte Proteine zugewiesen werden? Zur Erfüllung dieser Aufgabenstellungen spielen die Kontrollgruppen eine wichtige Aufgabe. Einerseits sollen die aus verschiedenen Seren bestehenden Kontrollgruppen die Sensitivität und Spezifität der einzelnen C.trachomatis Proteine ermitteln, andererseits sind für die eindeutige Zuordnung zur Gattung C.trachomatis die Antigene der C.pneumoniae und der Wirtszellen von großer Bedeutung. In der vorliegenden Studie werden 53 Patientenseren untersucht, die im Zeitraum von März 1998 bis Oktober 2004 in der Mikrobiologischen Diagnostik der Universitätsklinik Ulm gesammelt wurden. 5 65 Diskussion Die 21 Seren der Hauptgruppe stammen von Frauen, die eine klinische und mikrobiologisch gesicherte chronische C.trachomatis Infektion haben. Die typischen Diagnosen dieser Patientinnen sind Adnexitiden, Tuboovarialabszesse und Sactosalpinx. Als Kontrollkollektive fungieren 10 Seren von Personen, die keine spezifischen Antikörper gegen Chlamydien aufweisen und 20 weitere Seren von Patienten, die niedrige bis mäßig erhöhte IgG-Antikörper-Titer gegen C.pneumoniae aufweisen. Diese niedrigen IgGAntikörper-Titer stellen einen Hinweis auf eine länger zurückliegende C.pneumoniae Infektion im Sinne einer Serumnarbe dar. Die Seroprävalenz von C.pneumoniae liegt in der Erwachsenen Bevölkerung bei mehr als 60 %. Dadurch können potentiell kreuzreagiernde Antikörper gegen die engverwandte C.trachomatis über das Kontrollkollektiv erfasst werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Vielzahl immunreaktiver C.trachomatis Proteine mittels Immunoblot-Untersuchungen in der Gruppe mit gesicherter C.trachomatis darstellbar ist. Trotz der Vielzahl an Banden lässt sich nach sorgfältiger visueller Durchsicht der Immunoblots der Patientengruppe ein charakteristisches Bandenmuster erkennen. Zur Objektivierung dieses Ergebnisses wird mit Hilfe eines speziellen Computerprogramms (GelScan 5.1) jeder Bande ein Molekulargewicht zugeordnet und eine optische Dichte als Maß für die Bandengrauintensität bestimmt. Das Molekulargewicht der Bande kann zum einen durch den mitgeführten Molekulargewichtsmarker und zum anderen durch die Lage des charakteristischen MOMP (41 kDa) berechnet werden. Die Grauintensität der Bande gibt die Reaktivität des Proteins wieder. Aus Gründen der Reproduzierbarkeit werden nur klar immunogene (grauintensive) Banden in die Auswertung aufgenommen. Die optische Dichte wird mithilfe einer Analysefunktion in GelScan 5.1 bestimmt, wobei klar immunogene Banden in der vorliegenden Arbeit mindestens die Grauintensität 50 besitzen. In Vorversuchen zeigt sich, dass bei einem cut-off von 50 eine Vielzahl unspezifischer Banden eliminiert werden kann, ohne dass es zum Verlust spezifischer Banden kommt. Mit nahezu allen Seren der Patientengruppe wird ein charakteristisches Bandenmuster mit Banden bei 190 kDa, 150 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 57 kDa, 48 kDa, 41 kDa, 35,5 kDa, 30 kDa, 28 kDa, 20 kDa und 15 kDa gefunden. Sämtliche dieser Proteine weisen mit mehr als 90 % eine hohe Sensitivität auf. Allerdings reagieren einige Proteine – insbesondere die Proteine im Molekulargewichtsbereich zwischen 30 kDa und 70 kDa – auch mit Seren der Kontrollgruppen, sodass deren Spezifität als Indiz für eine chronische C.trachomatis Infektion eingeschränkt ist. Außerdem zeigt dieser Molekulargewichtsbereich zwischen 30 kDa und 5 66 Diskussion 70 kDa die grauintensivste Bandenausprägung mit folgenden immundominanten Proteine: HSP70, HSP60, OMP2 und das MOMP. Trotz hoher Sensitivität besitzen diese Proteinbanden aufgrund von ausgeprägten Kreuzreaktionen mit C.pneumoniae keine hohe Spezifität für C.trachomatis. Ein Teil dieser Proteine konnte in einer auf der vorliegenden Arbeit aufbauenden Studie mittels 2-D Gelelektrophorese und MALDI-TOF Analyse inzwischen identifiziert werden (33). Auch dort treten die stärksten immunogenen Banden im mittleren Molekulargewichtsbereich zwischen 30 kDa und 70 kDa bei der Gruppe mit einer chronischen C.trachomatis Infektion auf. Analog zur vorliegenden Arbeit sind neben den 5 Hauptbanden (MOMP, HSP60, HSP70, OMP2 und pmpD) eine Vielzahl von weniger gut charakterisierten immundominaten Proteinen mit verschiedenen Molekulargewichten aufgetreten. Eine der reaktivsten und prominentesten Banden in der vorliegenden Studie ist das C.trachomatis MOMP mit einem Molekulargewicht von ca. 41 kDa. Diese Proteinbande hat eine Sensitivität von 90,5 %, da in 2 Fällen der Patientenseren mit aufsteigender C.trachomatis Infektion diese Bande unterhalb des cut-off liegt. Die Spezifität des C.trachomatis MOMP ist sowohl bezüglich der Patientenseren ohne Clamydienkontakt (40 %), als auch für Seren mit einem niedrigen C.pneumoniae Antikörper-Titer (20 %) sehr gering. Nach Addition der Patientenseren ohne Chlamydienkontakt mit den Patientenseren mit Durchseuchungstiter für C.pneumoniae zu einer Kontrollgruppe (vergleichbar der gesamten Bevölkerung Deutschlands) errechnet sich eine Spezifität des C.trachomatis MOMP für diese Kontrollgruppe von sehr geringen 26,7 %. Bei einer Infektion mit C.trachomatis kann eine Restimulierung vorhandener Gedächtniszellen gegen C.pneumoniae MOMP eine scheinbare Antwort gegen C.trachomatis MOMP hervorrufen. Das MOMP Protein kann somit Chlamydieninfektion lediglich geben, mit aber hoher nicht Sensitivität sicher einen zwischen den Hinweis auf eine Chlamydienspezies unterscheiden. Dazu ist die Aminosäuresequenz der einzelnen MOMP Proteine zwischen den Chlamydienarten zu ähnlich. Das Protein stellt sich im Immunoblot mit einer kräftigen Hauptbande bei 41 kDa und einer darüber liegenden feineren Bande bei ca. 41,5 kDa als Doppelbande dar. Diese 41,5 kDa Bande entspricht am ehesten einer posttranslational modifizierten Form des MOMP (71). Als immunogenes Oberflächenprotein trägt das MOMP genus-, spezies-, subspezies- und serotypspezifische Epitope (11,17). Das MOMP codierende ompA-Gen ist für alle 5 67 Diskussion Chlamydienarten bekannt und enthält vier variable Segmente (VS I-IV) die für vier immunogene variable Domänen (VD) codieren (39). Es enthält jedoch auch konservierte Sequenzen zwischen den unterschiedlichen Spezies, die vermutlich für Kreuzreaktionen verantwortlich sein könnten wie sie auch in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden. Es finden sich spezifische Antikörper gegen einzelne variable Domänen des MOMP sowohl bei C.trachomatis als auch bei C.pneumoniae, sodass zukünftig wahrscheinlich mit diesen Antikörpern bereits durch das MOMP die Chlamydienspezies bestimmt werden kann. Allein der variablen Domäne IV kann eine C.trachomatis Spezifität zugeordnet werden (5,81). Dieses Wissen macht man sich bereits durch einen für die variable Domäne IV spezifischen Enzymimmunoassay mit IgG Antikörpern (IgG EIA) zunutze. Neuere Studien haben gezeigt, dass die VD II und die VD III des C.pneumoniae MOMP speziesspezifisch für C.pneumoniae sind. Es wird gezeigt, dass die VD II und VD III Fragmente nur von Seren erkannt werden, die mittels MIF und ELISA positiv auf C.pneumoniae getestet werden. Es gibt keine signifikanten Immunreaktionen bei Seren, die positiv für C.trachomatis oder seronegativ für Chlamydien sind (40). Man könnte also versuchen Kreuzreaktionen dieses Proteins zwischen den verschiedenen Chlamydienspezies zu vermeiden, indem man – wie bereits teilsweise durchgeführt – das MOMP in seine Fragmente zerlegt und spezifische Antikörper gegen jede einzelne Domäne entwickelt. Das MOMP wird während des gesamten Entwicklungszyklus von C.trachomatis exprimiert. Es macht ca. 60 % der äußeren Membran von EK und RK aus und scheint pathogenetisch bei der Infektion der Wirtszelle eine Rolle zu spielen (3). Es besitzt eine porenformende ß-Faltblatt-Struktur, sodass dem MOMP auch eine Porinfunktion zugeschrieben wird. Porine bilden eine Familie von Zellmembrankanälen, die üblicherweise in der äußeren Membran gram-negativer Bakterien gefunden werden. Dort spielen sie eine Rolle bei der Diffusion von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten des Organismus. Die porenbildende Eigenschaft des MOMP wird durch reversible Disulfidbindungen verstärkt (31). Bavoil et al. zeigten 1984, dass das Größenlimit der zu transportierenden Proteine durch die Poren im MOMP bei 850 - 2250 Da liegt (6). Das C.trachomatis MOMP ist immundominat und das Hauptantigen der einzelnen Serotypen. Im Gegensatz dazu sind die Eigenschaften des C.pneumoniae MOMP in Bezug auf Immunantigenität und Oberflächenexposition noch kaum geklärt. Vielmehr scheint das C.pneumoniae MOMP nicht auf der Oberfläche exponiert zu sein, und gilt als eher immunrezessiv (72). Trotz der vielen Gemeinsamkeiten in der Gensequenz und den 5 68 Diskussion strukturellen Ähnlichkeiten der ompA Gene beider Proteine bleibt diese Tatsache noch ein Paradoxon (80). Die Immunantwort gegen C. trachomatis verändert sich während des Verlaufs einer Infektion. Zu Beginn einer Infektion werden Antikörper gegen MOMP gebildet, während bei einer länger anhaltenden Infektion unter anderem Antikörper gegen Stressproteine sogenannte heat shock Proteine (HSP) gebildet werden. Die Doppelbande im 60 kDa Bereich wird dem HSP60 und dem OMP2 zugeordnet, dabei hat das HSP60 das Molekulargewicht von 57 kDa und das OMP2 von 60 kDa. Das HSP60 hat durch seine hohe Sensitivität von 95,2 % eine hohe diagnostische Aussagekraft eine Chlamydieninfektion zu erkennen. Durch den hohen negativen Vorhersagewert von 100 % in der vorliegenden Studie kann sogar der Schluss gezogen werden, dass bei Fehlen dieser Bande eine Infektion nahezu ausgeschlossen ist. Bei einer positiven Reaktion kann man sehr wahrscheinlich von einer schon länger bestehenden Chlamydieninfektion ausgehen. Da es aber kreuzreagierende Antikörper einerseits zu anderen Chlamydienspezies und andererseits zu humanen Antigenen gibt, hat diese Proteinbande lediglich eine Spezifität von 70 % in Abhängigkeit von den Kontrollgruppen. Die 57 kDa Bande kann nicht genau zwischen Chlamydienspezies unterscheiden, sie besitzt jedoch einen hohen Stellenwert als Indikator für eine Chlamydieninfektion. Die 57 kDa Bande zeigt sich ausschließlich auf dem C.trachomatis Streifen und nicht auf dem C.pneumoniae Streifen. Dennoch spielt dieses Protein auch bei den Seren mit einem niedrigen Antikörper-Titer für C.pneumoniae und den seronegativen Seren eine Rolle. Dieses Phänomen lässt sich dadurch erklären, dass es im Serum Antikörper gegen humane heat shock Proteine gibt. In diesen Fällen kann es zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Die Immunabwehr richtet sich zunächst gegen das chlamydiale HSP. Aufgrund vorhandener Homologien zwischen stark konservierten Epitopen des chlamydialen und humanen HSP60 kann es zu Kreuzreaktionen kommen. Humane heat shock Proteine werden insbesondere unter Stressbedingungen wie Infektionen, Entzündungen etc. von vielen Körperzellen exprimiert. Zwischen humanen heat shock Proteinen und bakteriellen heat shock Proteinen besteht eine nahezu 50 %-ige Ähnlichkeit zwischen den Gensequenzen (10). Hierin kann eine Ursache für die Entwicklung von Autoimmunreaktionen und die Entstehung von chronischentzündlichen Erkrankungen bestehen. Diese ausgeprägte Immunantwort gegen das chlamydiale HSP60 bis hin zur Autoimmunreaktion wird mit der Genese zahlreicher klinischer Manifestationen in Zusammenhang gebracht: Tubenfaktorinfertilität, 5 eingeschränkte 69 Diskussion Nidation, Spontanaborte während der Frühschwangerschaft, ektope Schwangerschaft und reaktive Arthritis (70,78). Heat shock Proteine sind unter anderem auch ein Indiz für eine lang andauernde Infektion. In mehreren Studien wurden Anhaltspunkte dafür entdeckt, dass bei entsprechender klinischer Manifestation einer C.trachomatis Infektion in den meisten Fällen Antikörper gegen das HSP60 Protein gefunden werden können. Durch diese Tatsache ist das HSP60 ein möglicher Indikator für chronisch entzündlich aszendierende Infektionen mit C.trachomatis (1,2,24). Neuere Studien zeigen auch einen möglichen Zusammenhang zwischen der Bildung von HSP60 bei chronischen C.trachomatis Infektionen und der Entstehung von neoplastischen Veränderungen im Genitaltrakt der Frau. Das chlamydiale HSP60 löst eine anti-apoptotische Wirkung auf die Wirtszelle aus, deswegen können sich bei einer viralen Zweitinfektion virale Onkoproteine und/oder Mutationen leichter verbreiten und Neoplasien hervorrufen (23). Ein anderer Vertreter der heat shock Familie ist das HSP70. Im Immunoblot stellt sich das HSP70 als prominente, sehr immundominate Bande im 70 kDa Bereich dar. Das HSP70 hat wie das HSP60 mit 95,2 % eine gute Sensitivität eine Chlamydieninfektion zu detektieren. Die diagnostische Aussagekraft dieses Proteins muss dennoch richtig einschätzen werden. Die Spezifität zum Nachweis von C.trachomatis ist mit 66,7 % nicht befriegend, da es sowohl durch humane Antikörper als auch durch Antikörper anderer Chlamydienspezies zu falsch positiven Ergebnissen kommen kann. Die unbefriedigende Spezifität dieser Proteinbande lässt sich auch an der Tatsache erkennen, dass es auf dem benachbarten C.pneumoniae Streifen ebenfalls zur Darstellung dieser immundominaten Bande kommt. Man kann also ein positives Ergebnis dieser Bande nicht sicher einer C.trachomatis Infektion zuschreiben. Das Vorhandensein dieser Bande ist jedoch analog zum HSP60 ein guter Indikator für eine Chlamydieninfektion. Raulston et al. fand 1993 heraus, dass dieses HSP70 Protein mit einem isolierten Komplex der äußeren Membran von C.trachomatis assoziiert ist. Dadurch scheint das HSP70 eine Rolle in der Anheftung der Chlamydien an die Wirtszelle zu spielen (59). Andere Studien zeigen, dass das HSP70 in einem späteren Schritt nach der initialen Adhäsion an die Wirtszelle eher in der Festigung der Membranbindung eine Rolle spielt (58,60). Das andere Protein im 60 kDa Bereich ist das outer membrane protein OMP2, ein Membranprotein der Chlamydienhülle. Das OMP2 stellt sich mit dem HSP60 als prominente Doppelbande dar. Da die strukturellen Unterschiede dieses Proteins innerhalb der Chlaymdienfamilie noch nicht genau bekannt sind, kann diese Bande lediglich mit einer sehr 5 Diskussion 70 hohen Sensitivität wie bspw. die in der vorliegenden Studie erreichten 100 % auf eine Chlamydieninfektion Hinweis geben. Die errechneten 23 % Spezifität zur Unterscheidung der Chlamydienspezies ist als mangelhaft zu bewerten. Dieses Protein reagiert sowohl auf dem C.trachomatis Streifen als auch auf dem C.pneumoniae Streifen in gleicher Weise und ist anhand der vorliegenden Ergebnisse als homologes Protein einzustufen. Da es bei einer C.trachomatis Infektion in den meisten Fällen zu einer starken Reaktion des MOMP und des OMP2 kommt (56), kann das Vorhandensein beider Banden einer C.trachomatis Infektion zugeschrieben werden. Kommt es lediglich zu einer Reaktion des OMP2 ohne klare Reaktion des C.trachomatis MOMP, spricht das für eine Infektion mit einer anderen Chlamydie. Aufgrund dieser immunologischen Eigenschaften kann dieses Protein nur als Indikator einer Chlamydieninfektion, jedoch nicht zur genaueren Unterscheidung der einzelnen Spezies dienen (4). OMP2 gehört wie das MOMP zu den äußeren Membranproteinen und ist ein cysteinreiches Protein. OMP2 gilt als eines der Hauptimmunogene bei einer Chlamydieninfektion (4). Zwischen den C.trachomatis Serovaren B und E gibt es eine ausgeprägte Sequenzhomologie, bei der vor allem die Position der Cysteine stark konserviert ist. Es wurden Unterschiede in der Gengröße und der Sequenzvariabilität innerhalb des omp2 Gens zwischen C.psittaci und C.pneumoniae aufgezeigt. Die Konservierung erklärt auch, dass das OMP2 weniger als das MOMP zur Unterscheidung in die einzelnen Spezies und Subspezies dient (74). OMP2 ist ein Teil des äußeren Membran Komplexes, die Topologie und räumliche Struktur des Proteins ist jedoch noch ungeklärt. Das Protein wird nicht an der Oberfläche des Membrankomplexes gefunden, das ein Indiz für den Verbleib des OMP2 im periplasmatischen Lumen der Zelle sein könnte. Diese strukturelle Integrität legt das OMP2 möglicherweise als ein chlamydiales Äquivalent zum Peptidoglykan fest (48). Da Antikörper gegen das OMP2 keine neutralisierenden Eigenschaften zeigen, ist das OMP2 allein nicht als Kandidat für einen Impfstoff geeignet. Es wird aber gezeigt, dass das Protein T-Helferzell-Epitope besitzt, daher könnte es als zusätzliche Impfstoffkomponente genutzt werden (48). Aus den bisher dargestellten Proteinen wird ersichtlich, dass im Molekulargewichtsbereich zwischen 40 kDa bis 70 kDa eine Vielzahl von Banden auftreten, d.h. dass dort die Seren ihre höchste Reaktivität besitzen. Interessanterweise zeigen sich sowohl im hochmolekularen als auch im niedrigmolekularen Bereich weniger Banden. Dafür treten eindeutige C.trachomatis Banden auf, die im gleichen Molekularbereich bei C.pneumoniae keine Reaktivität aufweisen. 5 71 Diskussion Im hochmolekularen Bereich zwischen 97 kDa und 220 kDa finden sich zwei klare C.trachomatis Banden: die 190 kDa Bande und die 130 kDa Bande. Bei einer Auftrennung der Proteine mit einem 10 %-igen SDS-Gel wurde die 130 kDa Bande aufgrund der schlechten Auflösung des Computerprogramms in diesem Bereich zunächst einem Molekulargewicht von 150 kDa zugeordnet und mit dieser Bezeichnung als Bande auch im Ergebnisteil dargestellt. Der hochmolekulare Bereich wurde in Stichproben mit 8 %-igen SDS Gelen detaillierter untersucht, woraufhin die 150 kDa Bande eher im Bereich von 130 kDa einzuordnen ist. Beide Banden im hochmolekularen Bereich stellen sich im Immunoblot als sehr dünne, aber klar abgrenzbare Banden dar. Mit einer Sensitivität von 90,5 % und einer Spezifität von 90 % haben beide Banden eine exzellente diagnostische Aussagekraft zur Detektion einer chronischen C.trachomatis Infektion. Bei C.pneumoniae existieren in diesem Bereich keine Proteinbanden als korrespondieren Reaktion, dass durch mitgeführte Teststreifen von C.pneumoniae belegt wird. Die 130 kDa Bande wird von den seronegativen Seren nicht erkannt. Selbst nach einer durchgemachten C.pneumoniae Infektion wird diese Bande nur in 3 Fällen erkannt, sodass die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzreaktion zu C.pneumoniae demnach gering ist. Diesen beiden klaren Banden konnten bislang nicht sicher einem C.trachomatis Protein zugeordnet werden. Die in dieser Arbeit gewonnene Erkenntnisse in Form der sehr guten Sensitivität und Spezifität der beiden hochmolekularen Banden sollten in weiterführenden Forschungsarbeiten detaillierter untersucht werden, um diese Proteine näher zu charakterisieren und damit diese Banden einem C.trachomatis Protein zuordnen zu können. Bei der 130 kDa Bande könnte es sich um das Genprodukt des pmpD (polymorphic membrane protein D) Genes handeln. Das pmpD Gen verschlüsselt ein 155 kDa Protein, das speziesspezifisch für C.trachomatis ist. Dieses Protein spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese von urogenitalen C.trachomatis Infektionen (75). Es wurde gezeigt, dass Antikörper gegen immundominante Antigene wie MOMP und LPS die Fähigkeit vom pmpD Antiserum, die Infektiosität von EK zu neutralisieren, blockieren können (19). Die pmp Genfamilie ist sehr groß und variabel. Allein für C.trachomatis sind 9 pmp Gene bekannt und für C.pneumoniae 21 pmp Gene. Allein das pmpD Gen ist spezifisch für C.trachomatis. Weiterhin wurde gezeigt, dass das pmpD proteolytisch gespalten wird und der aminoterminale Teil an die Zelloberfläche transloziert wird (11). 5 Diskussion 72 In verschiedenen Experimenten konzentrierte man sich auf ein anderes Protein im 130 kDa Bereich, das nach 5 min post infektionem durch Tyrosin Phosphorylierung aktiviert wird und sich im Verlauf der Infektion vermehrt nachweisen lässt. Man fand heraus, dass dieses Protein dem bis dahin unbekannten C.trachomatis Protein CT456, dem unphosphorylierten TARP (translocated actin recruiting phosphoprotein), gleicht. In dem phosphoryliertem Zustand nach der Infektion hat TARP ein ungefähres Molekulargewicht von 131 kDa (26). Die Anheftung der Chlamydien an die Oberfläche der Epithelzelle führt zu einer rapiden Veränderung im Zytoskelett der Zelle und gipfelt in der Endozytose der eindringenden Chlamydien. Bei der Internalisierung der EK ist die Rekrutierung von Aktin durch die Chlamydien ein wichtiger Schritt. TARP wird vermutlich durch einen Typ III Sekretionsapparat der Chlamydie in die Wirtszelle infiziert (13,14). Um die Rolle des TARP in der Initialisierung der Chlamydien an die Wirtszelle zu untersuchen, werden mit Hilfe von GST-TARP Fusionsproteinen die Interaktionen mit der Wirtszelle analysiert. TARP agiert direkt sowohl mit monomerem als auch mit filamentösem Aktin; diese Bindungen treten unabhängig vom Phosphorylierungsgrad des TARP auf. In einem Aktin-Polymerisationsassay leitet TARP rapide und dosisabhängig die AktinPolymerisation auch in Abwesenheit von zusätzlichen Wirtszellkomponenten und chlamydialen Faktoren ein. Diese Daten deuten darauf hin, dass TARP unabhängig von anderen Komponenten Polymerisationskerne für neue Aktinfilamente bilden kann (38). Im weiteren Verlauf dieser Untersuchung wird gezeigt, dass TARP Charakteristika anderer bekannter Aktin-Polymerisationsproteine teilt, jedoch an Schlüsselstellen der Polymerisation von Aktin Unterschiede in Form eines neuartigen Mechanismus aufweist, der zur Zeit noch Gegenstand der Forschung ist (38). Das TARP zeigt beträchtliche Unterschiede in seiner Gensequenz zwischen den einzelnen Serovaren von C.trachomatis, deswegen könnte dieses Protein dazu dienen als immundominates Protein zwischen den verschiedenen Serovaren von C.trachomatis zu unterscheiden. Dies ist ebenfalls Gegenstand derzeitiger Forschung (38). Durch eine Chlamydieninfektion wird sowohl die MHC Klasse I und II Antigenexpression in der infizierten Zelle unterdrückt. Diese Regression der MHC Antigenexpression korreliert mit der Degradierung der Wirtszelltranskriptionsfaktoren RFX-5 (MHC II promoter X box regulatory factor 5 deficiency) und USF-1 (upstream Stimulationsfaktor 1), dafür wird ein chlamydialer Proteasome-like Activity factor (CPAF) verantwortlich gemacht (82). CPAF spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der chlamydialen Umgehung der Wirtszellabwehr 5 73 Diskussion durch seine proteolytische Aktivität. Durch eine C.trachomatis Infektion kann eine robuste Antikörperantwort gegen das CPAF gezeigt werden. Die humanen Antikörper können die proteolytische Aktivität des CPAF neutralisieren und scheinen dadurch hilfreich für die Wirtszellabwehr gegen die Chlamydieninfektion zu sein (68). In weiteren Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl C.trachomatis als auch C.pneumoniae durch diese 70 kDa schwere Protease CPAF die Wirtszellabwehr umgehen können. Die Aktivierung des 70 kDa CPAF ist interessanterweise durch die Abspaltung eines n-terminalen 29 kDa Fragments und eines c-terminalen 35 kDa Fragments reguliert. Im unaktivierten Zustand ist dieses Protein daher im hochmolekularen Bereich zu finden (25). Alle Chlamydien, die sowohl humane als auch veterinäre Infektionen hervorrufen, scheinen die CPAF Strategie für die Umgehung der Wirtszellabwehr zu benutzen; Bei allen Chlamydienarten lassen sich Gene für CPAF finden. Die Ähnlichkeit der Gensequenzen zwischen den verschieden Chlamydienarten beträgt mindestens 46 %. Zwischen den einzelnen Serovaren einer Spezies sind die CPAF Gensequenzen mit einer Ähnlichkeit von 99 % nahezu identisch (25). Des Weiteren gibt es eine 190 kDa Bande, die noch keinem spezifischen C.trachomatis Protein zugeordnet werden kann. In diesem Bereich könnte aber die DNA-gerichtete ß-Untereinheit der RNA Polymerase von C.trachomatis liegen (27). Im niedermolekularen Bereich finden sich spezifische Proteine für C.trachomatis mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, 20 kDa, 28 kDa und 30 kDa. Im niedrigmolekularen Bereich bei den Patienten ohne Chlamydieninfektion sind die Banden 20 kDa und 30 kDa in der vorliegenden Arbeit mit einer Spezifität von 100 % überragend, d.h. wenn diese Proteine nicht erkannt werden, so ist die Person gesund. Durch diese Proteine werden die Nicht-Kranken korrekt als nicht krank identifiziert. Die Banden bei 20 kDa und die 30 kDa zeigen mit den C.pneumoniae Seren vereinzelte Reaktionen. In der Addition beider Referenzen (Patienten ohne Chlamydienkontakt und mit C.pneumoniae Durchseuchungstiter) zu einer Kontrollgruppe errechnet sich eine Spezifität von 90 %. Damit besitzen diese beiden niedermolekularen Banden eine ähnlich hohe, sehr gute Aussagekraft wie die beiden hochmolekularen Banden bei 130 kDa und 190 kDa eine C.trachomatis Infektion zu erkennen. Leider sind beide Banden bei 20 kDa und 30 kDa nicht ausnahmslos sensitiv in Bezug auf die Seren mit chronischer C.trachomatis Infektion. So gibt es nicht mit jedem Serum eine positive Reaktion diesen Proteinbanden; die Sensitivität der 20 kDa Bande liegt bei 85,7 % und die Sensitivität der 30 kDa Bande bei 81 %. Durch die hohe Spezifität beider Banden kann man 5 Diskussion 74 bei positiver Reaktion in Kombination mit anderen sehr reaktiven Banden dennoch auf eine chronische C.trachomatis Infektion schließen. Die 20 kDa Bande stellt sich im Immunoblot als reaktivste Bande im unteren Molekulargewichtsbereich dar. Auch die 30 kDa Bande ist sehr prominent, jedoch nicht so reaktiv wie die 20 kDa Bande. Alle Banden im niedrigmolekularen Bereich sind aufgrund der methodisch bedingten hier schlechteren Auflösung unscharf begrenzt. Die 28 kDa Bande ist ein weiteres Protein, das im niedrigmolekularen Bereich zu finden ist. Diese Bande stellt sich ebenfalls als sehr prominent dar, hat jedoch wie die 30 kDa Bande nur eine Spezifität von 81 %, da nicht jedes Serum mit einer chronischen C.trachomatis Infektion diese Bande über dem cut-off erkennt. Durch die vielen falsch positiven Reaktionen mit der Kontrollgruppe mit einem C.pneumoniae Durchseuchungstiter hat diese Proteinbande lediglich eine Spezifität von 76,7 %. Interessanterweise hat die Bande in Bezug auf die seronegative Gruppe noch eine Spezifität von 90 %. Daraus könnte man schließen, dass bei Fehlen einer Reaktion mit dieser Bande der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit gesund ist. Die Banden 28 kDa und 30 kDa erweisen sich als diagnostisch sehr wertvolle Banden. Möglicherweise kann einer dieser Banden dem pgp3 (C.trachomatis plasmid Protein 3) zugeordnet werden. Das pgp3 Protein wird hauptsächlich bei urogenitalen C.trachomatis Infektionen vom Gen orf3 (open reading frame 3) exprimiert und wird mit einem Molekulargewicht von 28 kDa angegeben (15). Es scheint eine wichtige Rolle in der Pathogenität genitaler C.trachomatis Infektionen zu spielen, die Funktion und die Rolle in der Zelle und im Chlamydienzyklus sind aber weiterhin unklar (16). Die 28 kDa Bande könnte dem MIP (macrophage infectivity potentiator) von C.trachomatis entsprechen. Die Angaben zum Molekulargewicht dieses Proteins schwanken zwischen 24 kDa und 28 kDa (62). Das Protein MIP scheint bei der Phagozytoseinduktion beteiligt zu sein. Dieses Protein kann sowohl in der Membran der RK als auch in der Membran der EK gefunden werden (49). Signifikante Homologien treten zwischen dem Gen des C.trachomatis MIP und dem Gen des Legionella pneumophila MIP in der Aminosäurresequenzen auf (43). Aufgrund der ähnlichen Aminosäuresequenzen dieses Proteins zwischen verschiedenen Chlamydien- und Bakterienarten kommt es zu einer niedrigen Spezifität und Sensitivität. Der 20 kDa Bande kann nicht eindeutig einem Protein zu geordnet werden. Eine Vielzahl von Proteinen liegt in diesem Bereich, z.B. das CT431 eine CLP Protease oder das CT318 ein L1 Ribosomales Protein. 5 75 Diskussion Die 15 kDa Bande kann man am ehesten dem LPS zuordnen. LPS besitzen alle gramnegativen Bakterien mit mehr oder weniger gleichem strukturellem Aufbau. Das erklärt auch die sehr niedrige Spezifität von 35 % dieser Bande in Bezug auf die Gruppe mit einem niedrigen C.pneumoniae Antikörper-Titer. Die Spezifität liegt bei den seronegativen Personen bei 90 %. Alle Personen mit gramnegativem Bakterienkontakt sollten eine positive Reaktion des LPS zeigen, sodass die Spezifität theoretisch wesentlich niedriger hätte ausfallen sollen. Eine mögliche Erklärung für die verhältnismäßig hohe Spezifität in der vorliegenden Studie liegt in der Verwendung von Seren junger Patienten (Kindern). Für beide nicht C.trachomatis infizerten Kontrollgruppen zusammengenommen beträgt die Spezifität 53,3 %. Im Gegensatz zu einer theoretisch geringen Spezifität hätte die Sensitivität von 85,7 % höher ausfallen müssen. Methodisch bedingt kann es zu einem verfrühten Ende der elektrophoretischen Auftrennung kommen, die eine Reaktion im niedermolekularen Bereich und damit eine Reaktion des LPS verhindert. Zudem hat das Computerprogramm hat Schwierigkeiten für die Molekulargewichtsberechnung Referenzpunkte zu suchen. Visuell kann man in fast allen Immunoblot-Bildern den typischen fahnenartig auslaufenden Bandenanteil des LPS erkennen. Chlamydien haben wie andere gramnegative Bakterien in ihrer äußeren Membran Lipopolysaccharide (LPS), die einen wichtigen Bestandteil und eines der Hauptoberflächenantigene dieses Mikroorganismus darstellen. Lipopolysaccharide lassen drei makromolekulare Bestandteile erkennen, von außen nach innen O-Antigen, Kernpolysaccharid und Lipid A. O-Antigene bedingen die Oberflächen-Hydrophilie der Bakterienzelle. Das Kernpolysaccharid besteht aus zwei Untereinheiten. Das innere Kernpolysaccharid enthält einen LPS-spezifischen Zucker, das Keto-desoxy-oktonat (KDO). Der Verlust des KDO ist mit dem Leben der gramnegativen Bakterienzelle nicht vereinbar. Das Kernpolysaccharid ist über das KDO mit dem Lipidanteil, dem Lipid A, des LPS verbunden. Das Lipid A ist für die meisten pathophysiologischen Wirkungen des LPS verantwortlich. Die Wirtszellantwort gegen das LPS ist ausschlaggebend für die Abwehr gegen gramnegative Bakterien. Zellen myeloischer Abstammung sind fähig LPS-Mengen im picomolaren Bereich zu erkennen und daraufhin über eine Vielfalt an Signaltransduktionskaskaden durch Ausschüttung verschiedenster proinflammatorischer Zytokine zu reagieren. Diese Reaktionen werden u.a. über die Erkennung der Lipid A Komponente des LPS vermittelt (28). 5 76 Diskussion Das LPS hat eine zum MOMP vergleichbare antigenetische Kapazität. Es wird gezeigt, dass neutralisierende Antikörper gegen das LPS Indikatoren für eine aktuell anhaltende Infektion sind und dass durch wiederholte Auseinandersetzung des Immunsystems des Wirtes mit einer Chlamydieninfektion kontinuierlich hohe Titer von anti-LPS Antikörpern erreicht werden (22). Das LPS hat in seinem Kernpolysaccharidanteil ein Antigenepitop, das bei allen Chlamydienarten gleich ist und somit die Spezifität prägt. Dennoch ist es momentan Ziel der Forschung Unterschiede in der Sequenz der einzelnen KDO Transferasen verschiedener Chlamydien zu finden. Es kann bereits durch verschiedene Antikörper gegen KDO Transferasen ein Unterschied in den Sequenzen festgestellt werden (47). KDO Transferasen sind für die Synthese des chlamydialen LPS essentiell. Demnach könnte es möglich sein, durch spezifische Antikörper gegen Bestandteile des LPS zwischen einzelnen Chlamydienarten zu unterscheiden. Im mittleren Molekularbereich finden sich neben dem MOMP noch die 35,5 kDa und die 48 kDa Bande, die als C.trachomatis spezifisch eingestuft werden. Die 48 kDa Proteinbande stellt sich in den meisten Fällen im Immunoblot – bei guter Auflösung – als prominente 3-fach Bande dar, anderenfalls erkennt man eine verschwommene Doppelbande. Die Bande wird bei 20 von 21 Seren mit einer chronischen C.trachomatis Infektion erkannt und hat damit eine Sensitivität von 95,2 % für C.trachomatis. Diese Proteinbande zeigt aber bei den seronegativen als auch bei den Seren mit einer durchgemachten C.pneumoniae Infektion einzelne Reaktionen. Aus diesem Grund liegt die Gesamtspezifität dieser Bande bei lediglich 83,3 %. Bei Abwesenheit der Bande ist eine C.trachomatis Infektion somit nahezu ausgeschlossen. Im Bereich von 48 kDa liegen z.B. das CT557 eine Lipoamide Dehydrogenase oder das bisher noch unbestimmte CT017. Die 35,5 kDa Bande verhält sich mit einer ebenfalls hohen Sensitivität für C.trachomatis und einer verhältnismäßig geringen Spezifität 56,7 % ähnlich wie die 48 kDa Bande. Analog kann auch hier eine C.trachomatis Infektion mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden, wenn die Bande nicht im Immunoblot sichtbar ist. Eine positive Reaktion lässt nur im Zusammenhang mit anderen positiven Banden eine C.trachomatis Infektion vermuten. Bei Fehlen anderer spezifischer Banden kann keine Aussage in Bezug auf eine C.trachomatis Infektion getroffen werden. Auch dieser Bande kann nicht eindeutig ein Protein zugeordnet 5 Diskussion 77 werden. In diesem Fall fällt es schwer überhaupt hypothetische Proteine zu finden, wie bspw. das in diesem Molekulargewichtsbereich liegende CT007. Derzeit können nur wenigen gefundenen Proteinbanden im Immunoblot ein spezifisches C.trachomatis Protein zugeordnet werden. Für das Verständnis des komplexen Aufbaus und Funktion der Chlamydien werden alle molekularen Details der Proteine benötigt. Hier bieten sich vielfältige Möglichkeiten und Ansätze für weitere zukünftige Studien in der Grundlagenforschung. Dennoch bleibt die Identifizierung der Proteinbanden mit bestimmten Proteinen nicht zweifelsfrei. Zum einen kann die Charakterisierung der Proteinbanden mit der Immunoblot Methode nur im 1-dimensionalen Raum stattfinden und ist dementsprechend deskriptiv. Zum anderen ist die statistische Aussagekraft in Bezug auf die geringen Fallzahlen der einzelnen Gruppen nicht ausreichend signifikant. Demnach müssen die in der vorliegenden Arbeit identifizierten Proteinbanden erst durch Studien mit höheren Fallzahlen und durch Einblick in den 2-dimensionalen Raum verifiziert werden. Bei der 2-dimensionalen Gelelektrophorese werden Proteine in einem Polyacrylamidgel, das als Trennmatrix dient, mit einem geeigneten Puffer mittels eines pH-Gradienten in einem elektrischen Feld aufgetrennt. Dabei nutzt man zwei Eigenschaften von Proteinen: Ladung und Masse. Proteine sind geladene Moleküle, deren Ladung je nach Aminosäurezusammensetzung variiert. Die Nettoladung des Proteins ändert sich, wenn der pH-Wert der Umgebung geändert wird. Der pH-Wert, an dem sich die positiven und negativen Ladungen eines Proteins aufheben und die Nettoladung Null beträgt, nennt man isoelektrischen Punkt (pI). Bei einem pH-Wert, der dem pI-Wert entspricht, wandert ein Protein in einem elektrischen Feld nicht mehr, da es keine Ladung mehr aufweist. Da jedes Protein einen charakteristischen isoelektrischen Punkt besitzt, kann man ein Proteingemisch in einem pH-Gradienten mit Hilfe eines elektrischen Feldes auftrennen. Diese Methode nennt man auch isoelektrische Fokussierung und wird bei der 2D-Gelelektrophorese zur Trennung der Proteine in der ersten Dimension verwendet. In der zweiten Dimension werden die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Peptide mit geringem Molekulargewicht wandern schneller durch die Poren des Polyacrylamidgels und daher weiter als große schwere Proteine. Auf diese Weise können in hochauflösenden 2D-Gelen bis zu 10.000 verschiedene Proteine aufgetrennt werden. Nach der 5 Diskussion 78 Auftrennung werden die Proteine im Gel mit speziellen Färbeverfahren sichtbar gemacht. Durch diese Methode kann man die Proteine noch näher charakterisieren. Aus den Ergebnissen ist ebenfalls ersichtlich, dass die Seren 1H, 9H und 13H der Hauptgruppe nicht alle Banden des Bandenmusters erkennen oder über dem cut-off liegen. Aus der mikrobiologischen Charakterisierung zeigt sich, dass diese Seren lediglich einen IgG Antikörper Titer von 1:128 und das Serum 13H einen IgG-Antikörper-Titer von 1:64 aufweisen. Daraus ergibt sich die Überlegung, ob man durch eine stärkere Konzentration des Patientenserums die fehlenden Banden des Musters bei niedrigen IgG-Antikörper-Titer sichtbar machen kann. Mit einer Serumverdünnung von 1:50 anstatt einer Verdünnung von 1:100 lassen sich bei dem Serum 1H alle Banden darstellen, die unter dem cut-off liegen und somit nicht im Bandenmuster berücksichtigt werden. Aus diesem Ergebnis kann geschlussfolgert werden, dass bei dringendem klinischen Verdacht auf eine chronische C.trachomatis Infektion und einem im MIF niedrigen Antikörper-Titer der Test bereits mit einer stärkeren Konzentration von Patientenserum durchführt werden sollte, um das korrekte Ergebnis über den Infektionsstatus zu erhalten. Das Serum 9H konnte nicht noch einmal getestet werden, da die Probe bereits vor diesen Experimenten aufgebraucht war. Im Serum 13H können auch durch eine höhere Konzentration des Patientenserums nicht alle Banden dargestellt werden. Das kann an dem frühen Stadium der Infektion liegen. Das wiederum wirft die Frage auf, ob und welche Proteinbanden sich im Anfangsstadium der Chlamydieninfektion bereits nachweisen lassen. Das es sich bei diesem Patientenserum um ein frühes Stadium der Infektion handelt, wird an dem positiven LCR-Nachweis im Serum sichtbar, sodass zu diesem Zeitpunkt wahrscheinlich noch keine aufsteigenden chronische Infektion vorlag. Interessanterweise fehlen gerade in diesem Fall die 20 kDa und 30 kDa Banden, die wie bereits diskutiert mit ihrer hohen Spezifität für eine chronische C.trachomatis Infektion sprechen. Auch die beiden Banden im hochmolekularen Bereich (150 kDa und 190 kDa) liegen zu dem Zeitpunkt der Infektion noch unter dem cut-off. Dieser Fall ist ein weiterer Hinweis für die hohe diagnostische Aussagekraft der Proteine im hoch- und niedrigmolekularen Bereich in Bezug auf die Chronifizierung der C.trachomatis Infektion. Des Weiteren könnte daraus geschlossen werden, dass es erst im Verlauf, sprich in der Chronifizierung der C.trachomatis Infektion, zur Ausbildung einer Immunantwort gegen Proteine in diesem hoch- und niedermolekularen Bereich kommt. Weitere Studien an 5 Diskussion 79 spezifischen Proteinen bei einer chronischen C.trachomatis Infektion sollten aus diesem Grund ihren Fokus auf die Charakterisierung speziell dieser vier Banden (20 kDa, 30 kDa, 150 kDa und 190 kDa) legen. Um diese Aussage weiter zu überprüfen wird eine Referenzgruppe, die mangels Verfügbarkeit zusätzlicher Patientenseren mit 2 Fällen zahlenmäßig klein ist, mit akuter C.trachomatis Infektion vergleichend zu den chronischen C.trachomatis Infektionen der Hauptgruppe gewählt. Die 2 Patientenseren mit akuter C.trachomatis Infektion stammen von einem Patient mit Keratokonjunktivitis und einem Patient mit Urethritis. Eine chronische Infektion ist eine aufsteigende Infektion, die sich Frauen bspw. als Sactosalpinx, Adnexitis oder Tuboovarialabszess und bei Männern als Epididymitis manifestiert. In beiden Beispielen kann nicht das gesamte Bandenmuster wie bei chronischen C.trachomatis Infektionen erkannt werden, da nach einer Chlamydien Infektion zunächst IgM-Antikörper gebildet werden, während die Bildung der IgG-Antikörper erst Wochen nach der Infektion stattfindet. In der vorliegenden Studie werden nur IgG-Banden sichtbar gemacht. Ebenfalls auffällig ist ein Fehlen von Banden vorwiegend im hoch- und niedrigmolekularen Bereich. Das zeigt zum einen die hohe Spezifität der Banden im hochund niedermolekularem Bereich für eine chronische länger andauernde Infektion und zum anderen, dass eine Antikörperantwort gegen MOMP, HSP60 und OMP2 im mittleren Molekulargewichtsbereich sehr früh erfolgt (52). Diese Erkenntnis stellt einmal mehr den Stellenwert der Proteinbanden im mittleren Molekulargewichtsbereich in Bezug auf die Detektion von chronischen C.trachomatis Infektionen in Frage. Darüber hinaus wirft dieses Experiment mit akuten C.trachomatis Infektionen generell die Frage des Stellenwertes von IgA-, IgM-, und IgG-Antikörpern zur serologischen Diagnostik von Chlamydieninfektionen auf. Auch die Frage der Kreuzantigenität zwischen C.pneumoniae und C.trachomatis muss in Betracht gezogen werden. Deswegen werden nicht nur C.trachomatis Antigene, sondern auch C.pneumoniae Antigene verwendet, sodass möglichst alle unspezifischen Reaktionen und Kreuzreaktionen weitestgehend erfasst werden. Die Chlamydienreinigung nach der Chlamydienanzüchtung in HeLa-Zellen ist nicht absolut frei von Zellrückständen, deswegen werden in diesem Ganz-Zell-Lysat Blot zusätzlich HeLa-Zellen aufgetrennt, um mögliche Reaktionen mit Zellbestandteilen in den Chlamydienblots sichtbar zu machen. Proteinbanden die auf allen 3 Immunoblots nach ähnlicher Wegstrecke eine Reaktion erzeugen, werden als HeLa-Zellbestandteil gewertet und nicht zu den Chlamydienbanden gezählt. 5 Diskussion 80 Proteinbanden, die auf dem C.trachomatis und dem C.pneumoniae Blotstreifen auf gleicher Molekulargewichtshöhe Reaktionen aufweisen, werden als homolog für beiden Spezies gerechnet. Dies zeigt sich bei zwei Proteinbanden: der dem HSP70 zugeordneten 70 kDa Proteinbande und der dem OMP2 zugeordneten 60 kDa Proteinbande. Beide Proteinbanden werden als homologe Proteine für beide Spezies C.trachomatis und C.pneumoniae bestimmt. Trotz der in der vorliegenden Arbeit gewonnenen exzellenten Ergebnisse ist ein weiterer Nachteil der Immunoblot Methode der hohe Zeit- und Kostenaufwand sowie eine gewisse Schwierigkeit bei der Durchführung, sodass diese Methode meist auf spezialisierte Forschungslaboratorien beschränkt bleibt (7). Aus der Vielzahl der gefundenen Banden und deren Reaktionen mit verschiedenen Patientenseren wird ersichtlich, dass man den richtigen Infektionsstatus eines Patienten nicht über ein einzelnes Protein entscheiden kann, sondern durch eine Kombination verschiedener Proteinebanden. Die Chlamydienspezies sind untereinander auf molekularer Ebene so ähnlich, dass bei einer C.pneumoniae Infektion Banden von C.trachomatis mitreagieren, die bei keinem Chlamydienkontakt negativ sind. Die vorliegende Immunoblot Studie zeigt, dass es eine Vielzahl von IgG-Reaktionen auf eine chronische C.trachomatis Infektion gibt. Es wird ein Bandenmuster von 13 verschiedenen Proteinen in allen Seren mit chronischer C.trachomatis Infektion nachgewiesen. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: Erkennt ein Serum die Banden 150 kDa und 190 kDa nicht, so hat dieser Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit keine aufsteigende C.trachomatis Infektion. Liegen diese Banden (150 kDa und 190 kDa) im Immunoblot nicht über dem in dieser Studie festgelegten cut-off, müssen mindestens 9 weitere zusätzliche Proteinbanden aus dem Bandenmuster signifikant erkennbar sein, um eine chronische C.trachomatis Infektion zu belegen. Wenn das Serum jedoch weniger Banden erkennt, kann ebenfalls eine C.pneumoniae Infektion oder eine andere gramnegative bakterielle Infektion vorliegen. Obwohl das gesamte Genom von C.trachomatis entschlüsselt ist, kann anhand der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Methode nicht allen 13 Proteinen eindeutig ein C.trachomatis Protein zugeordnet werden. Zukünftig können die aus der vorliegenden Studie gewonnenen Informationen einen Teil dazu beitragen, ein sicheres diagnostisches Verfahren zur Erkennung von akuten und chronischen C.trachomatis Infektionen mittels rekombinant hergestellter Proteine zu entwickeln. 5 81 Diskussion Neben der 2D-Gelelektrophorese stellt die MALDI-TOF Analyse eine weitere Möglichkeit zur Charakterisierung von Proteinen dar. Die Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionization Flugzeit (matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight, MALDI-TOF) Massenspektrometrie (MS) ist eine Methode zur Bestimmung der molekularen Masse von Biomolekülen. Durch die hohe molekulare Auflösung, Genauigkeit, Sensitivität und der prinzipiell hohen Durchsatzfähigkeit kann MALDI-TOF-MS sinnvoll zur Analyse molekularer Heterogenitäten eingesetzt werden. Die Chlamydienproteine können genau bestimmt werden, wodurch eine genaue Zuordnung zum Chlamydien Genom möglich ist. In Kombination dieser Methode mit der 2D-Gelelektrophorese ist ein Ausblick auf die vollständige Charakterisierung der Chlamydienproteine möglich und sollte daher in weiteren Studien untersucht werden. Damit letztendlich die richtigen C.trachomatis Proteine rekombinant hergestellt werden können, um ein sicheres diagnostisches Verfahren zur Beurteilung von akuten und chronischen C.trachomatis Infektionen zu erhalten. 6 6 82 Zusammenfassung Zusammenfassung In dieser Studie werden 21 Patientinnen mit einer chronischen C.trachomatis Infektion untersucht, um immundominante Proteine, die spezifisch für diesen Erreger sind, herauszufinden. Die Proteine werden mittels Immunoblot sichtbar gemacht und mit Hilfe des Computerprogramms GelScan 5.1 der Firma BioScienTec ausgewertet. Vergleichend zu der Gruppe mit chronischer C.trachomatis Infektion werden 2 Kontrollgruppen gewählt. Eine Gruppe besteht aus 10 Personen, die bisher keinen Chlamydienkontakt hatten. Die andere Gruppe besteht aus 20 Personen, die eine C.pneumoniae Infektion durchgemacht und somit einen niedrigen IgG-Antikörper-Titer für diesen Erreger aufweisen. Fasst man beide Kontrollgruppen zusammen, kann man den Infektionsstatus eines Großteils der Gesamtbevölkerung Deutschlands in Bezug auf Chlamydien widerspiegeln. Nach Durchsicht der Ergebnisse lassen sich aus den Immunoblot Bildern mit chronischen C.trachomatis Infektion eine Vielzahl von spezifischen und unspezifischen Banden erkennen. Diese Seren weisen insgesamt eine hohe Reaktivität auf. Um möglichst viele unspezifische oder kreuzreagierende Banden zu eliminieren, gibt es neben dem C.trachomatis Streifen immer einen C.pneumoniae Streifen und HeLa-Zellen zur Kontrolle. Zusätzlich wird ein cut-off bei einer Grauintensität von 50 festgelegt, um die Auswertung der vielen Banden übersichtlicher zu gestalten und nur gauintensive d.h. immunreaktive Banden in die Auswertung zunehmen. Somit und mit Hilfe des Computerprogramms GelScan 5.1, das jeder Bande anhand eines Molekulargewichtsmarkers und der Referenzbande MOMP bei 41 kDa ein Molekulargewicht zuordnet, lies sich folgendes Bandenmuster mit 13 Proteinbanden bei allen Seren mit chronischer C.trachomatis Infektion in der vorliegenden Studie nachweisen: 190 kDa, 150 kDa, 70 kDa, 65 kDa, 60 kDa, 57 kDa, 48 kDa, 41 kDa, 35,5 kDa, 30 kDa, 28 kDa, 20 kDa und 15 kDa. Das 65 kDa Proteinbande und Proteinbande bei 57 kDa werden als homologe bei beiden Spezies C.trachomatis und C.pneumoniae vorkommende Proteine bestimmt. Die Proteinbanden im mittleren Molekulargewichtsbreich (70 kDa – 41 kDa) können den bereits gut charakterisierten Proteinen HSP70, HSP60, OMP2 und MOMP zugeordnet werden. Die Sensitivität dieser Proteine in Bezug auf eine aufsteigende C.trachomatis Infektion ist sehr hoch während die Spezifität im Verhältnis sehr gering ausfällt. Das zeichnet diese Proteine zwar als Marker für eine Chlamydieninfektion aus, aber eine spezifische 6 Zusammenfassung 83 Unterscheidung zwischen den einzelnen Chlamydienspezies gelingt mit diesen Proteinen nicht. Im hoch- und niedrigmolekularen Bereich lassen sich interessanterweise Proteinbanden, die sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Spezifität für eine aufsteigende C.trachomatis Infektion haben, nachweisen. Im Einzelnen sind das die 190 kDa, 150 kDa, 30 kDa und 20 kDa Proteinbande. Vor allem diese 4 Banden haben eine hohe diagnostische Aussagekraft zum Nachweis einer chronisch aufsteigenden C.trachomatis Infektion. Eine genaue Zuordnung dieser Proteinbanden zu bereits charakterisierten Proteinen ist mit der Immunoblot-Methode nicht spezifisch möglich. Aus diesem Grund sollte gerade mit diesen Proteinbanden weitere Experimente und Studien unternommen werden, um eine genauere Charakterisierung zu erhalten. Aus der vorliegenden Studie wird deutlich, dass es kein einzelnes immundominantes Protein gibt, das über den Infektionsstatus einer C.trachomatis Infektion entscheiden kann, sondern immer eine Kombination sprich ein Muster an Proteinbanden. Eine mögliche Zusammenverfassung zur Interpretation des Infektionsstatus bei C.trachomatis Infektion, die sich aus der vorliegende Studie ergibt, lautet: Wenn ein unbekanntes Patientenserum die 190 kDa und/oder 150 kDa über dem cut-off erkennt, liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit eine aufsteigende C.trachomatis Infektion vor. Werden diese beiden Proteinbanden unterhalb des cut-off erkannt, müssen mindestens 9 der verbleibenden 11 Proteinbanden klar über dem cut-off nachweisbar sein, um eine aufsteigende C.trachomatis Infektion anzuzeigen. Ist das nicht der Fall, liegt am ehesten eine C.pneumoniae oder andere gramnegative Bakterieninfektion vor. Die vorliegende Studie kann jedoch aufgrund eingeschränkter methodischer Möglichkeiten und kleiner Fallzahl nur Grundrichtungen für weitere Forschungsansätze bieten. Um das in der vorliegenden Arbeit gefundene Proteinbandenmuster, genauer und noch detaillierter zu charakterisieren, bedarf es weiterer Untersuchungen und Experimente mit weiterführenden Methoden, wie es z.B. die 2-D Gelelektrophorese und die MALDI-TOF Analyse bieten können. Kurz gesagt, die vorliegende Studie bietet eine Grundrichtungen für zukünftige Forschungsansätze in Bezug auf die Charakterisierung immundominante C.trachomatis Proteine an. 7 7 Literaturverzeichnis 84 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis 1. Askienazy-Elbhar, M. and J. H. Suchet. 1999. Persistent "silent" Chlamydia trachomatis female genital tract infections. Infect.Dis.Obstet.Gynecol. 7:31-34. 2. Ault, K. A., B. D. Statland, M. M. King, D. I. Dozier, M. L. Joachims, and J. Gunter. 1998. 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