Elektrophoresen

Elektrophoresen
Was ist das?
Wozu dient es?
Wie wird’s gemacht?
Welche Aussage
erhalten wir?
Was ist Elektrophorese?
„
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„
„
Definition: Labortechnik, bei der Gemische von Stoffen oder Teilchen
aufgetrennt werden, weil sie in einem elektrischen Feld unterschiedlich
schnell wandern
Geschichte:ca. 1930 vom Schweden Arne Tiselius eingeführt -> „TiseliusSystem“
Name: -phor= griechisch= „tragen“, „Elektro-“Æ Methode funktioniert durch
Anlegen eines elektrischen Feldes
Medizinische Anwendungen:
„ Serum-Eiweiß-Elektrophorese -> Serumproteine
„ Serum-Immunelektrophorese -> Immunglobuline
„ Serum-/Urin- Immunfixationselektrophorese -> Imm.glob.
„ Urin-LDS-Elektrophorese („Disk-Elpho“) -> Urinproteine
„ Lipoprotein-Elektrophorese („Lipid-Elpho“) -> „Blutfette“
„ Hämoglobin-Elektrophorese -> Hämoglobinketten
„ Erbsubstanz -> Blotting
Das Prinzip (allgemein)
„
Verschiedene Stoffe wandern im elektrischen Feld
verschieden schnell. Das ist die Grundlage der Auftrennung
von Stoffen bei der Elektrophorese.
Allgemeines
Im elektrischen Feld wandern bewegliche, elektrisch geladene
Teilchen zum entgegengesetzt geladenen Pol. Positiv-geladene
Teilchen (Kationen) wandern zum Minus-Pol (Kathode), negativgeladene Teilchen (Anionen) wandern zum Plus-Pol (Anode).
Aber verschiedene Teilchen wandern verschieden schnell. Und es
sind besonders zwei Eigenschaften eines Teilchens, die seine
Wanderungsgeschwindigkeit bestimmen:
Je größer die Ladung, desto schneller die
Wanderung
Die Ladung
Stoffe mit größerer negativer Ladung wandern schneller
zum Plus-Pol als die schwächer geladenen: Am Ende der
Elektrophorese sind die stärker geladenen Teilchen weiter
gewandert.
Je kleiner das Teilchen, desto schneller
ist die Wanderung
Größe
Kleinere Teilchen wandern schneller als größere: Am
Ende der Elektrophorese ist das kleinere Teilchen weiter
gewandert.
Völlig verschiedene Stoffe können in der
Elektrophorese gleich schnell wandern:
Da sowohl die Ladung als auch die Größe eines Stoffes
Einfluss auf die Wanderungsgeschwindigkeit haben, kann
man bei zwei gleich schnell wandernden Stoffen nicht
sicher sagen kann, ob sie einander sehr ähnlich sind, oder
ob sie sich in Sachen Größe und Ladung stark aber
gegenläufig unterscheiden. So kann z.B ein großer stark
geladener Stoffe genauso schnell wandern wie ein kleiner
aber nur schwach geladener.
Wozu dient die SerumeiweißElektrophorese?
•Erkennung und Beobachtung des Verlaufs von "abnormen„
Proteinen (Paraproteinen)
•Erkennung und Beobachtung von Eiweißverlusten
Eiweiß kann z.B. über die Niere, über den Darmtrakt oder über
die Haut verloren gehen. Das Muster der im Blut verbleibenden
Eiweißstoffe, kann Hinweise auf die Ursache des Eiweißverlusts
liefern.
•Erkennung und Beobachtung von Entzündungen
Akute (=plötzliche, kurz dauernde) und chronische (=lang
dauernde Entzündungen) zeigen bestimmte Muster in der
Serumeiweiß-Elektrophorese
•Abklärung auffälliger Laborbefunde
Das Prinzip der SerumeiweißElektrophorese
„
„
Bei der Serumeiweiß-Elektrophorese versucht man, die
verschiedenen Eiweißstoffe (Proteine) der Blutflüssigkeit durch
ein elektrisches Feld aufzutrennen.
Die Proteine müssen dazu elektrisch geladen sein
Damit eine Auftrennung funktioniert, muss man dafür sorgen,
dass alle Proteine im geladenen Zustand vorliegen. Das hängt
davon ab, wie der pH-Wert der Lösung ist.
Ungeladenes Protein
Dieser Eiweißstoff ist in der Summe
ungeladen. Er hat zwar zwei negativ
geladene Gruppen (COO-), aber durch
Anlagerung von 2 positiven H-Ionen
besitzt er auch zwei positiv geladene
Gruppen (NH3+). Dies ist für die
Elektrophorese ungünstig, weil das
Protein so nicht wandern würde.
Der Elektrophorese-Puffer
„
Der pH der Lösung muss im alkalischen Bereich liegen
„
Damit eine Elektrophorese von Proteinen gelingt, sorgt man dafür, dass
die Lösung, in der die Proteine gelöst sind und in der sie wandern sollen,
relativ knapp an H-Ionen ist, d.h. einen alkalischen pH-Wert aufweist.
Dann verlieren die Proteine ihre H-Ionen, sind daher negativ geladen und
wandern in der Elektrophorese einheitlich zum Plus-Pol.
Die Trennung von Proteinen wird bei der Elektrophorese also in einer
Lösung durchgeführt, die einen alkalischen pH haben muss. Und dieser
pH darf sich während der Elektrophorese auch nicht ändern.
„
Die Trennung der Proteine
„
Das Serum wird in der Nähe des Minus-Pols aufgetragen.
Spannung wird angelegt. Die verschiedenen Proteine wandern
unterschiedlich schnell. Nach Ende der Elektrophorese sind
verschiedene Proteingruppen voneinander getrennt.
Die Cellulose-Azetat-FolienElektrophorese
„
Nach der Auftrennung wird die Cellulose-Azetat-Folie aus dem
Elektrophorese-Apparat genommen und mit einem
Proteinfarbstoff (z.b. Ponceau-Rot) gefärbt.
So sieht eine gefärbte
Serumeiweiß-Elektrophorese
auf Cellulose-Azetat aus.
Rechts die Proteine, die am
schnellsten und daher am
weitesten gewandert sind.
Abtrennung der
wichtigsten
ProteinFraktionen
Die Elektrophoresekurve
„
Durch Abtasten der
transparent
gemachten Folie in
einem Photometer
oder einem Scanner
entsteht aus den
Unterschieden der
Färbeintensität in der
Folie eine Kurve - die
Elektrophoresekurve.
Welche Eiweißstoffe befinden sich
in den einzelnen Fraktionen? (1)
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Albuminfraktion: Wie der Name sagt, dominiert in der
Albuminfraktion das
Albumin,das den größten Teil des Serumeiweißes ausmacht
Alpha-1-Fraktion (Alpha-1-Globulin):
alpha-1-Lipoprotein (HDL)
alpha-1-Glykoprotein (=Orosomukoid)
alpha-1-Antitrypsin
Alpha-2-Fraktion (Alpha-2-Globulin):
Alpha-2-Makroglobulin
Coeruloplasmin
Haptoglobin
Welche Eiweißstoffe befinden sich
in den einzelnen Fraktionen? (2)
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Alpha-2-Fraktion bzw. Übergang von Alpha-2 zu Beta:
prä-Beta-Lipoprotein (VLDL/Triglyzeride)
Beta-Fraktion (Beta-Globulin):
Hämopexin
Transferrin
Beta-Lipoprotein (LDL)
Komplement
Am Übergang von Beta zu Gamma:
Antikörper der Klasse IgA
Fibrinogen (nur bei der Plasmaeiweiß-Elektrophorese)
Gamma-Fraktion (Gamma-Globuline):
Antikörper der Klasse IgG und IgM
Beispiele von SerumeiweißElektrophoresen (1)
„
Normale Elektrophorese
Es dominiert die
Albuminfraktion (ca. 60%).
Die Alpha-1-Globuline
machen etwa 4% aus, die
Alpha-2-Globuline 8%, die
Beta-Globuline 12% und die
Gamma-Globuline 16%.
Beispiele von SerumeiweißElektrophoresen (2)
„
Akute Entzündung
Die Alpha-1- und die Alpha2-Globuline sind im
Vergleich zur normalen
Kurve (grün) deutlich
erhöht.
Das kann bei jeder Art von
akuter Entzündung
vorkommen, besonders bei
bakterieller Entzündung.
Virale Entzündungen zeigen
geringere Veränderungen.
Auch nicht-infektiöse
Entzündungen (z.B.
Verbrennungen, Herzinfarkt)
können dieses Bild zeigen.
Beispiele von SerumeiweißElektrophoresen (3)
„
Beta-Gamma-Typ
Vom Beta-Gamma-Typ
spricht man, wenn der BetaGipfel ohne klare
Abtrennung in den GammaBereich übergeht. Der BetaGamma-Typ findet sich bei
Leberzirrhose verschiedener
Ursache.
Verursacht wird dies durch
die Erhöhung der
Immunglobuline.
Beispiele von SerumeiweißElektrophoresen (4)
„
Paraproteinämie
Mann nennt es auch MProtein und die Zacke der
Kurve M-Gradient, wobei
das M für monoklonal steht
("1 Klon").
Paraproteine kommen vor
bei Lymphomen (Krebs der
Lymphozyten in
Lymphknoten und/oder
Blut) und beim
Plasmozytom (Krebs der
Plasmazellen; meist im
Knochenmark).
Die monoklonale Gammopathie
(Paraproteinämie)
„
„
Definition: Erhöhte Konzentration monoklonaler (= aus einem
B-Zellklon) Immunglobuline
Monoklonale Immunglobuline:bei neoplastischer Vermehrung
einer immunkompetenten B-Zelle -> bildet funktionell/strukturell
einheitliche Immunglobuline (je 2 Schwer- und Leichtketten)
„
„
„
Schwerkettentypen: IgA(α), IgG (γ), IgM (µ) , (IgE, IgD)
Leichtkettentypen: Kappa (κ), Lambda (λ)
Einteilung monoklonaler Gammopathien (MG):
„
„
„
„
„
Maligne/symptomatische MG (Plasmozytom, Immunozytom...)
Fakultativ/begleitende MG (CLL, NHL, Mamma-, Colon-Ca.)
MG unbestimmter Signifikanz (MGUS)
Passagere MG (Hepatitis, Vaskulitis, chron. Infekte...)
Kryoglobulinämie (s.o., Virusinfekte: EBV, CMV,autoimm, idiop.)
Labordiagnostik monoklonaler
Gammopathien
„
Serumeiweißelektrophorese: M-Gradient (nicht immer
nachweisbar!)
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„
„
Immunelektrophorese (Serum, qualitativ)
Immunfixationselektrophorese (Serum, qualitativ)
„
„
„
Æ Klassifizierung des monoklonalen Immunglobulins:
- > Ausschluss freier Leichtketten*:
Immunfixationselektrophorese im Urin (qualitativ)
Quantitativer Nachweis freier Leichtketten in Serum und Urin
*“Freie Leichtketten“: durch ineffektive oder gestörte
Immunglobulinsynthese werden bei einigen Gammopathien sog.
freie Leichtketten (d.h. ohne Schwerketten) produziert. Diese sind
oft Ursache einer begleitenden Amyloidose mit nachfolgenden
schweren Nieren-, Gefäß- oder Lungenerkrankungen --> Marker für
eine schlechte Prognose der Erkrankung
Ausscheidung im Urin-> BENCE-JONES-PROTEINURIE !
Immunelektrophorese
(nach Grabar):
„
Die Antigene werden zunächst im elektrischen Feld aufgrund
ihrer unterschiedlichen Ladung aufgetrennt
„
Nach Beendigung der Elektrophorese wird parallel zur
Laufstrecke in eine Rinne das Antiserum eingefüllt.
„
Während der nachfolgenden Inkubation diffundiert jedes der
vorher elektrophoretisch aufgetrennten Antigene jeweils radial
nach allen Seiten, während die Antikörper in einer parallel zur
Rinne verlaufenden Front aus der Rinne herausdiffundieren. Dort
wo die Diffusionszonen sich treffen, entstehen längliche,
halbmondförmige Präzipitatlinien.
„
Monoklonale Leicht- und Schwerketten sind an Verdickungen und
schüssel- oder löffelförmigen Deformationen der Präzipitate zu
erkennen
Immunelektrophorese
(nach Grabar):
Immunfixations-Elektrophorese
„
Man erhält Präzipitate innerhalb von
ca.1 Stunde (Immunelektrophorese
dauert mindestens 1 Tag)
„
weniger Artefakte, deutlichere
Aussage über Monoklonalität
„
Meistens 5 Antiseren verwendet
(Frage: monoklonale Gammopathie)
3 Ak gegen schwere Ketten (AntiIgG, Anti-IgA, Anti-IgM
2 Ak gegen leichte Ketten (Anti-Igkappa, Anti-Ig-lambda)
„
„
„
Erkennen freier Leichtketten im Urin
-> BENCE-JONES-PROTEINE
homogene, scharfe
Banden im diffusen
Präzipitat: sprechen für
monoklonale
Gammopathie