Chemische Proteinmodifikation - Im Wettbewerb

Chemische Proteinmodifikation - Im Wettbewerb mit der Natur
Universität Wien
Fakultät Chemie
Institut für Biologische Chemie
Prof. Dr. Christian Becker
Währinger Str. 38
1090 Wien, Austria
http://biologischechemie.univie.ac.at
Biological Chemistry
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Inhalt
- Was sind Proteine?
- Ribosomale Proteinsynthese
- Spezifische Modifikationen & Ihre Herausforderungen
- Chemische Proteinsynthese (Historische & Aktuelle Möglichkeiten)
- Beispielsysteme
Biological Chemistry
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Was sind Proteine?
Proteine = Eiweiße
Makromoleküle, die linear aus Aminosäuren
aufgebaut werden und unterschiedlich lang
sein können (von 2 bis zu 30.000 Aminosäuren).
Sehr viele Kombinationsmöglichkeiten:
Kettenlänge von 100 Aminosäuren = 20100 (= 10130)
Verknüpfungsmöglichkeiten
Biological Chemistry
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Funktionen von Proteinen
- Enzyme
katalysieren praktisch alle chemische Reaktionen
- Hormone
dienen als Signalstoffe
- Rezeptoren
leiten Signale in das Zellinnere weiter
- Ionenkanäle
leiten Ionen durch biologische Membranen,
- Transporter
befördern ihr Substrat über die Membran,
- Hämoglobin
transportiert Sauerstoff
- Antikörper
binden an Fremdstoffe
- Gerüstproteine
des Zytoskeletts sorgen für Form und Organisation der Zelle
- Faserproteine
verleihen Festigkeit
- Histone
verpacken die DNA
- DNA- und
RNA-bindende Proteine
(z.B. Polymerase, Transkriptionsfaktoren)
vermitteln die Replikation des Erbguts und die Expression
von Genen
Biological Chemistry
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Ribosomale Proteinsynthese
1. Transkription – Umschreiben
der DNA in mRNA durch RNA
Polymerase
2. Translation – Übersetzen der
mRNA in ein Poylpeptid mit Hilfe
der Ribosomen
(ca. 15 AS/s in Bakterien, aber nur
ca. 2 AS/s in Eukaryonten)
3. Einführung von posttranslationalen
Modifikationen, wie Glykosylierung,
Lipidierung, Acetylierung etc.
Biological Chemistry
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Proteinbiosynthese
- Proteine beliebiger Größe mit höchster Präzision
- Korrekte Faltung
- Menge pro Zelle variiert stark
Crystal Structure of Dihydrofolate
Reductase-Thymidylate Synthase
from Cryptosporidium hominis
Biological Chemistry
Modeled structure of ternary REP-1:
RabGGTase:Rab7 complex
Rap-RBD complex
Nassar et al. (1995) Nature 375, 554-560.
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Posttranslationale Modifikationen in Proteinen
Protein Chemistry
Becker, BioSpektrum 3/2011, 291-291.
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Warum chemische Proteinmodifikation & Synthese?
- Einführen komplexer Modifikationen / Zugang zu homogenen Proteinpräparationen
- Direkter Zugang zu Proteinen für biophysikalische und strukturelle Untersuchungen
- Freie Variation der Polypeptidkette / Proteine mit neuen Eigenschaften
- Ortspezifische Markierung von Proteinen / Active Site Modifikationen
- Entwicklung von Medikamenten auf Peptid- und Proteinbasis
- Verknüpfung von Proteinen mit anderen (Bio-) Polymeren
Biological Chemistry
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Recombinante
Expression
Chemische
Synthese
Recombinante Expression
Chemische Synthese
- Molekularbiologie
- Proteinreinugung
- Selektive Modifikation
- Synthese von Bausteinen
- Automatische Peptidsynthese
- Bioaktive Peptide
Funktionale Proteine
Analyse
Massenspektrometrie
in vitro Analyse
(CD, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Kalorimetrie)
Zell-basierte Assays
Biological Chemistry
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Festphasensynthese von Peptiden (SPPS)
- Peptide mit bis zu ~100 Aminosäuren
- Chemische Synthese vom C- zum N-Terminus
O
Linker
O
NH2
O
H
N
HO
R1
O
Kopplungsreagenz
Linker
Boc
O
O
Entfernen
der Boc-Gruppe
Linker
O
R2
H
N
NH2
Reinigung,
Waschen &
Filtrieren
R1 O
O
Linker
R2 O
H
N
O
R1 O
Abspaltung +
Seitenkettenentschützung
Biological Chemistry
N
H
H
N
N
H
R1 O
R2
O
Reinigung,
Waschen &
Filtrieren
R2
H
N
Boc
Reinigung,
Waschen &
Filtrieren
Entfernen
der Boc-Gruppe
HO
H
N
Boc
Boc
R3
Kopplungsreagenz
Wiederholen
R3
Aufreinigung
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Durchführung der Festphasensynthese
Flüssigkeiten
Stickstoff
Vakuum
Flüssigkeiten
Manuell
Biological Chemistry
Automatisch
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Reaktionseffizienz und Ausbeute
Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 99%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren:
61%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren:
37%
Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 98%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren:
37%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren:
13,5%
Typische Ausbeute bei modernen Kopplungsmethoden: >99,9%
Biological Chemistry
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Größenlimitierung der Peptidsynthese
Proteingröße
Durchschnittliche Größe
von Proteinen
Proteindomänen
Chemische
Ligation
Biological Chemistry
Kent, S. B. H.; Dawson, P. Annu. Rev. Biochem 2000, 69: 925-962.
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Wie es begann?
My entire yearning is directed
towards the first synthetic enzyme.
1905
(Letter to Adolf v. Baeyer, 1905)
Emil Fischer (1852-1919)
Nobel Prize in Chemistry 1902
Synthesis of Oxytocin
1953
H-CYIQNCPLG-NH2
Vincent du Vigneaud (1901-1978)
Nobel Prize in Chemistry 1955
Biological Chemistry
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Wie es begann?
Helmut Zahn (1916-2004)
First Chemical Protein Synthesis
Panayotis Katsoyannis
Synthesis of Insulin (51 aa) in 1963
1963
Biological Chemistry
Meienhofer et al., Zeitschrift für Naturforschung, 18b,1963.
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Wie es begann?
The first synthetic enzyme:
Ribonuclease A (124 aa)
Bruce Merrifield (1921-2006)
Nobel Prize in Chemistry 1984
Biological Chemistry
1971
Ralph Hirschmann (1922-2009)
Gutte & Merrifield, JBC, 246, 1922-1941, 1971.
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Synthetische HIV Protease (99 AS)
1988
Steve Kent
Biological Chemistry
Schneider & Kent, Cell 1988, 54, 363-368.
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Green Fluorescent Protein (GFP, 238 AS)
Shumpei Sakakibara
1998
Biological Chemistry
Nichiuchi et al. (1998) PNAS, 95:13549 18
Größenlimitierung der chemischen Proteinsynthese
- Ligationsreaktionen nicht beliebig oft nacheinander anwendbar
- Problematische Aufreinigung
- Ausbeuteverluste
- Synthese wird „unrentabel“
- Bisher keine Synthese von nicht-repeptitiven Proteinen > 250 Aminosäuren
Lösung:
Kombination von chemischer Protein- / Peptidsynthese
mit Biosynthese von Proteinen (z.B. in E. coli).
Biological Chemistry
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Eigene Beispielsysteme
Biological Chemistry
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Übetragbare Spongiforme Enzephalopathien (TSE)
Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are fatal neurodegenerative diseases
Prion diseases are exceptional:
Spontaneous, hereditary and transmissible forms are recognized
Bacteria
Virus
Prion
Protein-only hypotheses:
Resistant to nucleic acid inactivation
Sensitive to protein modifying procedures
10-1 µm
Size
Biological Chemistry
100-10 nm
⇒ Proteinaceous infectious particles (prion);
1982 Prusiner
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Prozessierung von PrPC und Umwandlung in PrPSc
Biological Chemistry
Tatzelt & Winklhofer, Amyloid-Journal of Protein Folding Disorders (2004) 11, 16212
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Semisynthetischer Ansatz für membrangebundenes PrPc
S
ER
octarepeats
signal
PrP90-231
S
GPI
anchor
C214
C179
N181
N197
Glycan
GPI
signal
Glycan
recombinant PrP
S
PrP90-231
S
C214
C179
N181
+
N197
lipid
anchor
Semisynthesis
S
PrP90-231
Protein Chemistry
C179
N181
S
C214
N197
lipid
anchor
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Aggregation von lipidiertem PrP
Proteinase K digestion
AFM
Thioflavin T Assay
+ liposomes
- liposomes
Membrane-associated rPrPPalm shows an
extended lag-phase.
Biological Chemistry
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Zusammenfassung
- Lipidiertes Prion Protein durch Kombination chemischer & molekularbiologischer Methoden
Homogen hergestellt werden.
- Dieses Prion Protein ermöglicht die Untersuchung der membranabhängigen Umwandlung in
eine toxische Variante des Proteins
- Komplexe Strukturen wie GPI-Anker können so in Proteine eingebracht werden und helfen
Krankheitsprozesse zu verstehen
- Nächste Schritte: In vivo Untersuchungen
Biological Chemistry
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Silaffin-induzierte Biomineralisation von Kieselsäure
 diatoms are unicellular algae
 highly elaborate, nanopatternd cell walls
consisting mainly of hydrated SiO2
 long chain polyamines and silaffin peptides
have been identified as constituents of
biosilica and to be involved in the silica
deposition process
M. Sumper, E. Brunner, ChemBioChem 2008, 9, 1187-1194.
Biological Chemistry
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Natürliche posttranslationale Modifikationen von Silaffinen
Chemical Structure of natSil-1A1
ε-N,N-dimethyllysine
O
HO
O
H 3C
P
ε-N,N,N-trimethyl-δ-hydroxylysine
HO
CH3
H 3C
N
O
O
H 2N
O
H
N
N
H
N
H
O
H
N
P
HO
O
N
H
O
O
H
N
O
O
N
O
N
H
O
H
N
O
N
H
O
H
N
N
H
O
O
O
O
P
P
P
P
HO
O
O
HO
O
O
O
HO
HO
O
HO
N CH3
O
P
H
N
O
O
H 3C N
CH3
H
N
N
H
O
OH
O
N
H
O
O
N
H
N
O
O
HO
O
O
N
H
CH3
H
N
phosphoserine
n = 4-9
H 3C N
CH3
CH3
n = 4-9
CH3
Polyamine modified lysine
(6-11 N-methylpropyleneimine units)
N. Kröger, S. Lorenz, E. Brunner, M. Sumper, Science 2002, 298, 584-586.
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Zusammenfassung
 Synthese unterschiedlich modifizierter Silaffin-Peptide
 Einfluß der Silaffin-Modifikationen auf die Silikat-Abscheidung
 Immobilisierung biotechnologisch interessanter Proteine
 Proof of Principle:
eGFP Verknüpfung mit Silaffin führt zur selektiven Verkapselung von GFP in Silikatmatrix
Biological Chemistry
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Danksagung
Uni Wien
Collaborations
Alex Kravchuk
Johannes Buchner (TU München)
Claudia Bello
Tilo Schwientek (Uni Köln)
Carolin Lechner
Firouzeh Aladini
Roger Goody (MPI Dortmund)
Manuel Brehs
Martin Engelhard (MPI Dortmund)
Nam Ky Chu
Jörg Tatzelt (LMU München)
Karine Farbiarz
Can Araman
Peter Seeberger (MPI Golm)
Financial Support
CIPSM
Former Group Members:
DFG
Wacker Chemie
Diana Olschewski
Sunanda Lahiri
…
Biological Chemistry
BMBF
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