ANALYSEN Leukozytentypisierung (Durchflusszytometrie, FACS

ANALYSEN
Leukozytentypisierung (Durchflusszytometrie, FACSAnalyse):
B-Lymphompanel (NHL-Panel)
Das Auffinden einer monoklonalen B-Zellpopulation ist der wichtigste Befund für die
Diagnose einer malignen reifen B-Zellerkrankung. Die Durchflusszytometrie ist eine
sehr sensitive Methode zum Nachweis von monoklonalen B-Zellpopulationen, selbst
wenn es sich um sehr kleine Populationen handelt. In manchen Fällen kann man
durch das Vorliegen eines typischen Markerprofils der pathologischen Population
die Entität genau benennen. In anderen Fällen, in denen kein typisches Markerprofil
vorliegt, hilft die Untersuchung gewisse Entitäten auszuschließen.
CD-Nomenklatur
Die in der Durchflusszytometrie verwendeten Marker richten sich sowohl gegen
membrangebundene Moleküle an der Zelloberfläche als auch gegen Moleküle im
Zytoplasma, die nach der Cluster of Differentiation (CD)-Nomenklatur eingeteilt
werden. Die Analyse des Expressionsmusters von CD-Molekülen spielt eine große
Rolle bei der Diagnose und Klassifikation von Leukämien und Lymphomen.
FACS-Analyse
Der Ausdruck "FACS" ist ein registriertes Markenzeichen der Firma BectonDickinson und steht für Fluorescence Activated Cell Sorting, er hat sich aber
inzwischen als Ausdruck für Durchflusszytometrie eingebürgert.
Forward Scatter (FSC)= Vorwärtsstreulicht
Eine Zelle, die den Laserstrahl des Durchflusszytometers kreuzt, verursacht
Streulicht. Je größer eine Zelle ist und je mehr Strukturen in ihrem Inneren sind,
desto größer ist das entstehende Streulicht. Das Vorwärtsstreulicht hängt vor allem
von der Größe einer Zelle ab. Das heißt, kleine Zellen verursachen ein kleines
Vorwärtsstreulichtsignal, große Zellen ein großes.
Immunstatus
Mit Hilfe dieses Panels kann man die T-Lymphozyten quantitativ beurteilen und die
CD4/CD8-Ratio berechnen. Eine Verminderung der CD4+ T-Lymphozyten ist ein
Hinweis auf eine Immunschwäche. Daher spielt die Berechnung der CD4/CD8-Ratio
für das Monitoring Infektionen (z. B. von HIV-Infektionen) eine große Rolle.
Knochenmarkanalyse
Die Knochenmarkuntersuchung dient dem Nachweis einer malignen
Knochenmarkserkrankung bzw. eines Knochenmarksbefalls im Rahmen eines
malignen Lymphoms. Weiters dient sie der Remissionsbeurteilung inkl. Detektion
von MRD (minimal residual disease).
Für die durchflusszytometrischen Untersuchung von Knochenmark wird ein EDTAantikoaguliertes Knochenmark-Aspirat benötigt.
Kombinationspanel (Allg. Suchpanel)
Wenn keine spezifische Verdachtsdiagnose vorliegt, werden in einer
Übersichtsuntersuchung Granulozyten, unreife CD34-positive Vorstufen, B-Zellen,
T-Zellen und Plasmazellen beurteilt. Bei Verdacht auf eine pathologische Population
werden die entsprechenden genaueren Folgeuntersuchungen angeschlossen.
Leukämiepanel (lymphatisch bzw. myeloisch)
Bei Verdacht auf eine akute Leukämie (pathologisches Blutbild, Ausschwemmung
von Blasten ins periphere Blut) sollte schnellstmöglich eine durchflusszytometrische
Untersuchung durchgeführt werden. Dadurch kann man in kurzer Zeit den genauen
Blastenanteil evaluieren und zwischen myeloischer und lymphatischer Leukämie
unterscheiden. Anschließend kann sofort mit einer adäquaten Therapie begonnen
werden.
Mit der durchflusszytometrischen Untersuchung lässt sich die Diagnose und die
Linienzugehörigkeit einer Leukämie in kurzer Zeit durchführen. Für die endgültige
Einteilung der Leukämie sind allerdings weitere Befunde (z. B. Spezialfärbungen,
Zytogenetik, Molekularbiologie) heranzuziehen.
Liquoranalyse
Bei manchen Arten von Lymphomen bzw. Leukämien kann es notwenig sein, eine
Infiltration des Liquors festzustellen. Da man das genaue Markerprofil der
gesuchten Population aus vorigen Befunden (peripheres Blut/ Knochenmark/
Lymphknoten) kennt, lassen sich im Liquor auch schon sehr kleine Populationen
eindeutig nachweisen.
Lymphknotenpanel
Nach entsprechender Aufarbeitung kann ein Lymphknotenbiopsat auf das Vorliegen
von malignen Lymphomzellen untersucht werden.
Das Auffinden einer monoklonalen B-Zellpopulation ist der wichtigste Befund für die
Diagnose einer malignen reifen B-Zellerkrankung. Die Durchflusszytometrie ist eine
sehr sensitive Methode zum Nachweis von monoklonalen B-Zellpopulationen, selbst
wenn es sich um sehr kleine Populationen handelt.
Im Gegensatz zu den B-Zellen, wo der Nachweis der Monoklonalität im Vordergrund
steht, ist bei T-Zellen der Nachweis der abnormen Antigenexpression am
wichtigsten. T-Zell-Lymphome unterscheiden sich in ihrem Markerprofil oft nur sehr
gering von gesunden T-Lymphozyten und können daher oft nur schlecht abgegrenzt
werden.
Insgesamt ist der Nachweis eines aberranten Markerprofis im Lymphknoten der
Hinweis auf das Vorliegen einer pathologischen Population. Für die endgültige
Beurteilung eines Lymphknotenbiopsates muss der histologische Befund des
Lymphknotenpräparates herangezogen werden.
Lyse
Bevor man die Leukozyten im Durchflusszytometer analysieren kann, muss man
zuerst die „störenden“ Erythrozyten entfernen. Zu diesem Zweck gibt man ein
spezielles Lyse-Reagenz hinzu, welches die Erythrozyten zerstört. Nach der Lyse
kann man die Leukozyten der Probe ungestört messen.
MDS-Panel
Die durchflusszytometrische Untersuchung kann Hinweise auf eine Reifungsstörung
der Granulozyten und somit auf das Vorliegen eines Myelodysplastischen
Syndromes (MDS) liefern. Weiters kann man eine Vermehrung unreifer Vorstufen
eindeutig nachweisen.
Derzeit ist die durchflusszytometrische Untersuchung in der Diagnose des MDS als
Ergänzungsbefund zu werten.
MRD (Minimal residual disease, minimale Resterkrankung)
Die Beurteilung der MRD dient sowohl der Erfolgsbeurteilung der durchgeführten
Therapie, als auch der Früherkennung eines Rezidivs. Bei Lymphomen und
Leukämien mit einem eindeutig pathologischen Immunphänotyp, z. B. der CLL,
ermöglicht die durchflusszytometrische Analyse eine Verlaufsbeobachtung der
minimalen Resterkrankung mit einer Messgenauigkeit bis 10-4.
Myelompanel
Bei Verdacht auf das Vorliegen eines Multiplen Myeloms (Nachweis einer
monoklonalen Gammopathie im Blut und/oder einer Leichtkettenausscheidung im
Urin durch Serumelektrophorese oder Immunfixationselektrophorese) sollte eine
durchflusszytometrische Knochenmarksuntersuchung durchgeführt werden. Die
Infiltration mit Plamazellen und die Monoklonalität von pathologischen Plasmazellen
lassen sich dadurch eindeutig nachweisen. Weiters bietet die Analyse die
Möglichkeit der Abgrenzung von normalen zu pathologischen Plasmazellen und hilft
damit in der Differentialdiagnose zwischen reaktiver Plasmazellvermehrung und
Multiplem Myelom sowie MGUS (Monoclonal Gammopathy of unknown
significance).
Auch bei massiver Knochenmarksinfiltration lassen sich Plasmazellen im peripheren
Blut nur selten nachweisen, die Diagnose sollte daher immer aus einer
Knochenmarksprobe gestellt werden
Peripheres Blut
Bei manchen Erkrankungen kann die Diagnose bereits aus der Analyse des
peripheren Blutes erfolgen (z. B. Nachweis einer PNH, B-CLL). Bei den meisten
Erkrankungen dient die Blutanalyse allerdings der Beurteilung der Ausschwemmung
maligner Zellen aus dem Knochenmark oder aus dem Lymphknoten.
Für die durchflusszytometrischen Untersuchungen von peripherem Blut wird ein
EDTA-beschichtetes Blutröhrchen benötigt.
PNH-Panel
Bei der PNH handelt es sich um eine erworbene klonale Erkrankung von
Knochenmark-Stammzellen, die alle drei Zellreihen betrifft. Durch eine Störung des
Phosphatidyl-Inositol-Glykan-Ankers (GPI-Anker), welcher für die Anheftung von
verschiedenen Proteinen an der Zelloberfläche benötigt wird, kommt es zu einem
Membrandefekt mit nachfolgender hämolytischer Anämie.
Bei Verdacht auf eine PNH (Anämie, ggf. kombiniert mit Thrombopenie und
Neutropenie, und erhöhten Hämolyseparametern) sollte zur Diagnosesicherung die
durchflusszytometrische Analyse einer peripheren Blutprobe durchgeführt werden.
Der Nachweis mindestens zweier fehlender GPI-verankerter Proteine auf
mindestens zwei verschiedenen Zellreihen des Blutes ( Erythrozyten und
Granulozyten) gilt als beweisend für eine PNH.
Side Scatter (SSC)= Seitwärtsstreulicht
Eine Zelle, die den Laserstrahl des Durchflusszytometers kreuzt, verursacht
Streulicht. Je größer eine Zelle ist und je mehr Strukturen in ihrem Inneren sind,
desto größer ist das entstehende Streulicht. Das Seitwärtsstreulicht hängt neben
der Größe auch sehr stark von der Granularität einer Zelle ab. Ist die Zelle stark
granuliert, dann hat sie ein großes Seitwärtsstreulicht. Ist die Zelle wenig granuliert,
dann ist ihr Seitwärtsstreulicht gering.
T-Lymphompanel
Im Gegensatz zu den B-Zellen, wo der Nachweis der Monoklonalität im Vordergrund
steht, ist bei T-Zellen der Nachweis der abnormen Antigenexpression am
wichtigsten. T-Zell-Lymphome unterscheiden sich in ihrem Markerprofil oft nur sehr
gering von gesunden T-Lymphozyten und können daher oft nur schlecht abgegrenzt
werden.
ZAP-70
Der klinische Verlauf einer B-CLL ist sehr heterogen. Während bei vielen Patienten
die Krankheit unauffällig bleibt, ohne dass eine Therapie notwendig wird, ist bei
anderen ein aggressiver Krankheitsverlauf zu beobachten.
Ein prognostischer Marker für die B-CLL ist der individuelle Mutationsgrad eines
Gens, das für den variablen Teil der Immunoglobulinschwerkette (IgVH) kodiert. Die
durchflusszytometrische Bestimmung der ZAP-70- Expression, welche mit der
Expression dieses Proteins korreliert, wird routinemäßig bei allen B-CLL-Patienten
durchgeführt.
Es wird beschrieben, dass Patienten mit mutiertem IgVH-Gen und entsprechend
niedriger ZAP-70-Expression einen deutlich günstigeren Krankheitsverlauf
aufweisen, als Patienten mit unmutiertem IgVH-Gen und entsprechend hoher ZAP70-Expression.