Zusammenfassung - Ruhr

Zusammenfassung
P-typ ATPasen sind integrale Membranproteine, die den aktiven Transport
von Kationen durch biologische Membranen, getrieben durch ATP-Hydrolyse,
ermöglichen. Schwermetall translozierende ATPases bilden eine Unterfamilie (PIB)
die in Archaeen, Eubakterien und Eukaryonten vorkommen. Diese, wegen eines
konservierten Sequenzmotives in ihrem sechsten Transmembrandurchgang auch
als CPx-ATPasen bezeichneten Ionenpumpen, erfüllen durch ihre Import oder
Exportfunktion eine entscheidende Rolle bei der Schwermetall Homöostase.
Einige prokaryotische CPx-ATPasen wurden in dem Escherichia coli Stamm BL21
(DE3) C41 [3] exprimiert, mit der Zielsetzung deren Struktur und Reaktionsmechanismus zu untersuchen. Hierfür wurden ortholologe Proteine sowohl von
mesophilen Eubakterien als auch von thermophilen Archaeen ausgewählt, da
Proteine von thermophilen Organismen, aufgrund ihrer hohen strukturellen Stabilität
und ihrer geringen thermischen Flexibilität als vorteilhaft für die Kristallisation gelten.
Die heterolog exprimierten Proteine sind Membran lokalisiert und katalytisch aktiv.
Das etablierte Aufreinigungsprotokoll ermöglicht homogene Protein-Präparationen.
Den höchsten Reinheitsgrad erzielt der Einsatz einer twin-tag Strategie, welche auf
Verwendung von Fusionsproteinen mit N- und C-terminalen Affinitäts-tags beruht.
Während für die meisten rekombinanten CPx-ATPasen die Substratspezifität vorhersagbar ist, schließt ein Sequenzmotiv innerhalb der Transmembrandomäne von
CopB aus Sulfolobus solfataricus eine Vorhersage des transportierten Kations aus.
Gereinigtes CopB weist eine ortho-Vanadat sensitive, Kobalt abhängige ATPase
Aktivität mit einem Temperaturoptimum von 70°C, welche die Rekonstitution in
Phospholipide oder aus Archaeen isolierte Lipide bedingt. Die Ausbildung des
Phosphoenzym-Intermediats wird ebenfalls durch die Gegenwart von Kobalt aktiviert.
In Membranvesikeln aus CopB-exprimierenden Escherichia coli Zellen kommt es zur
ATP-abhängigen
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Co Akkumulation, was aufgrund deren inside-out Konfiguration
eine in vivo Export-Funktion von CopB anzeigt.
Der Kobalt Exporter CopB könnte eine neuartige Untergruppe der P-typ-ATPasen
repräsentieren.
Kristallisationsversuche nach der vapor diffusion Methode ergaben initiale Kristalle,
die den Röngenstrahl nicht beugen. Diese konnten bisher nicht eindeutig als
Proteinkristalle identifiziert werden, obwohl sich die Gegenwart des Detergens
Octaethyleneglycol-dodecyl-monoether und des Nukleotid Analogons AMPPNP als
essentiell für die Kristallausbildung erwies.
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