Development of an in vitro cell culture gene expression technique to

Diss. ETH No. 14773
Development of an in vitro cell culture
gene expression technique
to examine coat colour genes in cattle
A dissertation submitted to the
Swiss Federal Institute of Technology Zurich
for the degree of Doctor of Natural Science
presented by
Daria Graphodatskaya
Diploma in Biology
Novosibirsk State University, Russia
born 13th of October 1974
citizen of Russia
Prof. Dr. Dr. h.c. G. Stranzinger, examiner
Prof. Dr. A.N. Eberle, co-examiner
Dr. H. Joerg, co-examiner
Zurich, 2002
Summary
I
Summary
The coat colour in mammals is determined by the relative amounts of the two pigments
eumelanin (black/brown) and pheomelanin (red/yellow) produced in melanocytes. In the
mouse, the eumelanin/pheomelanin ratio was shown to be controlled by three loci, extension
(MC1R), agouti (ASIP) and mahogany (attractin). Melanocortin 1 receptor (MC1R) is a
receptor expressed on the cell surface of melanocytes and activated by α-MSH stimulation.
Stimulated MC1R causes activation of adenylyl cyclase and subsequent increase of
intracellular cAMP, which activates tyrosinase, a rate-limiting enzyme of melanin synthesis.
High activity of tyrosinase leads to eumelanin production, whereas under basal activity of this
enzyme pheomelanin synthesis prevails. Agouti signalling protein (ASIP) acts as an antagonist
to α−MSH by binding to the MC1R. Attractin is an accessory receptor for ASIP, facilitating
ASIP-MC1R interactions.
These three bovine genes were used to create an in vitro cell culture gene expression system
for the investigation of gene function and mutations which affect gene function. MC1R was
previously sequenced in cattle, and three alleles have been characterised: E+ (wild type), ED
(dominant black) and e (recessive red). Three additional variants are described in this study:
the Ed1 and Ed2 in Brown Swiss breed (grey/brown coat colour), and the ef allele found in the
heterozygous form with the e allele in the Simmental breed (red coat colour). ED, e, Ed1, Ed2
and ef MC1R variants were cloned into a mammalian expression vector and transfected into
HEK 293 cells. cAMP was measured in the cell lines expressing MC1R variants as a response
to α-MSH stimulation. The ED and e alleles were unresponsive to the wide range of α-MSH
concentrations, and their pharmacological profile was indistinguishable. The Ed1, Ed2 and ef
responded in a dose-dependent manner, however, the stimulation curve of the ef allele was
shifted to the right, when compared to the Ed1 and Ed2 stimulation curves. Cells transfected
with the ef allele reached the same cAMP concentrations as the cells transfected with the Ed1
and Ed2 variants at more then 10 times a higher concentration of α-MSH. In conjunction with
the mode of inheritance of coat colour these results indicate that the e allele encodes for a nonfunctional allele of MC1R, the ED allele is a constitutively active receptor, the Ed1 and Ed2
MC1R variants are similar to the wild type receptor, and the ef is a partial loss-of-function
allele.
No differences were found in the coding sequence of ASIP between the Holstein (black),
Brown Swiss (grey/brown), Red Holstein and Simmental (red) cattle breeds. Incubation of the
cells expressing bovine ASIP together with the cells expressing the Ed1 or Ed2 MC1R variants
caused a significant decrease of cAMP production, indicating the presence of functional ASIP
in cattle.
The coding sequence of bovine attractin was amplified using cross-species PCR and 5' RACE,
and subsequently sequenced. For sequencing of the 5' end of the gene, a BAC clone was used.
However, it was not possible to amplify the complete coding sequence of the bovine attractin.
Investigation of the influence of mutations on gene function can be performed by expressing a
gene (alleles of a gene) in the in vitro cultured cells, followed by measuring biochemical
processes which are affected by an expressed gene. Interaction of the genes can be studied by
expressing several genes simultaneously. Using this approach is of general interest in livestock
genetics, as it has lower costs and is less time consuming when compared with breeding
experiments or production of transgenic animals.
Zusammenfassung
III
Zusammenfassung
In Säugetieren wird die Fellfarbe durch das Verhältnis der Pigmente Eumelanin
(schwarz/braun) und Pheomelanin (rot/gelb) bestimmt. Diese Pigmente werden in den
Melanozyten synthetisiert. In der Maus ist bekannt, dass das Verhältnis von
Eumelanin/Pheomelanin durch drei verschiedene Loci bestimmt wird: Extension (MC1R),
Agouti (ASIP) und Mahogany (attractin). MC1R ist ein Rezeptor, der auf der Zelloberfläche
der Melanozyten ausgebildet wird. Die Stimulation des Rezeptor geschieht durch α-MSH und
löst eine ganze Kaskade aus. Adenylatzyklase wird aktiviert, was zur Folge hat, dass das
intrazelluläre cAMP ansteigt. cAMP aktiviert die Tyrosinase, welche das limitierende Enzym
der Melaninsynthese ist. Der Grad der Aktivität der Tyrosinase bestimmt welcher Farbstoff
synthetisiert wird. Hohe Tyrosinaseaktivität führt zur Eumelaninproduktion und niedere
Aktivität zur Pheomelaninsynthese. ASIP wirkt als ein Antagonist zu MC1R. ASIP bindet an
den Rezeptor und verhindert so die Interaktion von MC1R und α-MSH. Attractin ist ein
zusätzlicher Rezeptor für ASIP, welcher die Bindung zwischen ASIP und MC1R ermöglicht.
Es wurde ein in vitro System mit diesen drei Genen des Rindes erstellt, um mehr über die
Genexpression und die Auswirkung von Mutationen auf die Funktion herauszufinden. Das
Gen MC1R des Rindes ist bereits bekannt und die drei folgenden Allele wurden beschrieben:
E+ (Wildtyp), ED (dominant schwarz) und e (rezessiv rot). Drei zusätzliche Allele wurden in
dieser Arbeit beschrieben: die Allele Ed1 und Ed2, welche in der Rasse Braunvieh (grau/braune
Fellfarbe) und das Allel ef, welches bis jetzt nur in der heterozygoten Form mit dem e Allel in
der Rasse Simmental (rote Fellfarbe) gefunden wurde. Die Allele von MC1R : ED, e, Ed1, Ed2
und ef wurden in einen Säugetierexpressionsvektor kloniert und in HEK 293 Zellen
transfektiert. Die Zelllinien wurden mit α-MSH stimuliert und anschliessend cAMP gemessen.
Die ED und e Allele reagierten nicht auf die unterschiedliche α-MSH Konzentrationen. Die
Allele Ed1, Ed2 und ef reagierten dosisabhängig. Der ef Rezeptor reagierte erst mit höhere αMSH Konzentration im Vergleichung zu der Ed1 und Ed2 Rezeptoren. Durch der Art der
Vererbung der Fellfarbe und den Resultaten dieser Arbeit wird klar, dass das e Allel für einen
nicht funktionellen Rezeptor kodiert, das ED Allel kodiert für eine konstitutiv aktiven
Rezeptor, und die Allele Ed1 und Ed2 des Gens MC1R sind sehr ähnlich wie der
Wildtyprezeptor und das Allel ef steht für einen schwach funktionierenden Rezeptor.
Es wurde kein Unterschied gefunden in der kodierenden Sequenz von ASIP zwischen den
Rassen Holstein (schwarz), Braunvieh (grau/braun), Red Holstein und Simmental (rot). Zellen,
welche ASIP exprimieren wurden zusammen mit Zellen die entweder Ed1 oder Ed2 Rezeptor
expremieren, inkubiert. Das hat bewirkt, dass die cAMP Konzentration stark reduziert war.
Dies gilt als Beweis, dass ASIP auch beim Rind als Antagonist zu MC1R wirkt.
Die kodierende Sequenz von Attractin im Rind wurde amplifiziert und sequenziert anhand der
cross-species PCR und 5' RACE. Für das Sequenzieren des 5' Ende des Gens wurde ein BAC–
Klon verwendet. Es war jedoch nicht möglich die ganze kodierende Sequenz von Attractin zu
amplifizieren.
In in vitro Zellsystemen kann man durch Messen der veränderten biochemischen Aktivitäten
die Auswirkung von Mutationen erforschen. Die Interaktion von Genen können durch
gleichzeitige Expression von verschieden Genen in einem in vitro System beobachtet werden.
Genexpression in in vitro Systemen ist für die Nutztierzucht eine interessante Methode, weil
sie ökonomischer und weniger zeitaufwendig ist als Zuchtexperimente oder die Herstellung
von transgenen Tieren.