3. Enzymkatalyse - Online Media Server

3. Enzymkatalyse
3.1 Allgemeines
Enzyme katalysieren biochemische Reaktionen. Sie sind Unschlagbar in den drei
entscheidenden Parametern der Katalyse:
1.
Geschwindigkeit
2.
Spezifität
3.
Selektivität
Enzyme katalysieren Reaktionen mit gewaltigen Ratenbeschleunigungen. So sind
Werte von kcat/kuncat von 106-1014 keine Seltenheit. Das Beispiel der Spaltung einer
glykosidischen Bindung (Abb. 1) soll das verdeutlichen. Bereits in Lösung befindliche
Säure katalysiert die Spaltung der glykosidischen Bindung. Eine interne Säuregruppe
beschleunigt die Reaktion noch weiter, da hier das Proton an „Ort und Stelle“ ist.
Enzyme wie die β-Galaktosidase, hingegen sind in der Ratenbeschleunigung
unschlagbar (kcat/kuncat = 2.5x107).
Abb. 1 Raten der Hydrolyse einer glykosidischen Bindung mit unterschiedlichen Katalysevatrianten.
1
Die Selektivität der Enzyme hängt mit der selektiven molekularen Erkennung der
Substrate durch die chirale aktive Tasche zusammen. Hierhinein passen nur
bestimmte Substrate. Die Spezifität von Enzymen wird durch die präzise Anordnung
der katalytisch aktiven Reste erreicht. Diese werden an eine bestimmte Stelle im
Substrat gebracht, so dass nur dort die Reaktion ablaufen kann. Daraus folgt eine
hohe Regio- und Stereoselektivität. Selektivität bezieht sich also auf die Auswahl des
Substrates. Spezifität beschreibt wie Chemo-, Regio-, und Stereoselektiv die
Reaktion abläuft.
3.1 Das thermodynamische Modell
Ein Katalysator beschleunigt eine Reaktion, geht aber selber unverändert aus der
Reaktion hervor. Ein Katalysator reduziert also Aktivierungsenergien. Hierbei kann
entweder der Übergangszustand stabilisiert werden oder das Enzym ermöglicht
einen anderen Reaktionsweg, der über energetisch niedrigere Übergangszustände
verläuft.
Abb. 2 Energieprofile enzymatischer Katalyse.
2
Im Beispiel a) (Abb. 2) wird verdeutlicht, dass bereits eine Protonierung zu einer
leichteren Reaktion führen kann. Das Enzym protoniert sowohl das Substrat S als
auch das Produkt und beschleunigt so die Reaktion. Allgemein gilt für
Reaktionsgeschwindigkeiten die Arrhenius-Gleichung: k = A e
Ratenbeschleunigung ergibt sich daraus: kcat/kuncat = e
(-Eact/RT)
. Für die
(Euncat-Ecat/RT)
. In diesen
Gleichungen ist T die Reaktionstemperatur in K und R die universelle Gaskonstante
mit 8.314 JK-1mol-1.
Wenn man also den Übergangszustand um 10kJ/mol stabilisiert, so ergibt sich bei
25°C eine Ratenbeschleunigung von 55. Eine Stabilisierung von 20kJ/mol ergibt
schon eine Ratenbeschleunigung von 3000 und 40kJ/mol erbringen die oft
beobachten 107-fachen Beschleunigungen. Eine low-barrier H-bond (bis zu 100
kJ/mol), die den ÜZ stabilisiert, reicht also aus, um diese hohen Ratenbeschleunigungen zu realisieren.
Wie in Abb. 2b gezeigt ist, verlaufen die enzymkatalysierten Reaktionen oft über viele
einzelne Schritte. So wird oft ein kovalentes Enzym-Substrat-Intermediat gebildet,
welches zum Enzym-Produkt-Intermediat umgesetzt wird. In jedem Fall wird aber der
Übergangszustand stabilisiert. Einer der wichtigsten Faktoren hierbei ist der
Proximitätseffekt. So wird aus einer intermolekularen Reaktion eine intramolekulare.
3.2.1 Der Proximitätseffekt
Allgemein gilt das intramolekulare Reaktionen im Vergleich zu den intermolekularen
sehr viel schneller und milder ablaufen. Das Konzept dahinter ist das der effektiven
Konzentration. Diese erhält man durch den direkten Vergleich einer Reaktion
einerseits als inter- und andererseits als intramolekulare Variante. Die effektive
Konzentration ist die Konzentration, in der man das Reagenz in der intermolekularen
Variante zugeben muss, damit man die gleiche Rate erhält wie in der
intramolekularen Reaktion.
Untersucht man die Hydrolyse von Phenylestern (Abb. 3), die eine interne Base in
unterschiedlichen Positionen zur reaktiven Stelle aufweisen, so wird die Stärke des
Proximitätseffektes deutlich. Referenz ist die Hydrolysereaktion in Gegenwart von
Acetat als Base. Die im Molekül vorhandenen „Acetate“ bilden hierbei zunächst ein
Anhydrid durch Angriff des Phenylesters durch das Carboxylat. In der intramolekularen Variante erfolgt dieser Schritt sehr viel schneller. Am schnellsten geht
die Reaktion, wenn sich ein fünfgliederiges Intermediat bilden kann, gefolgt vom
3
sechsgliederigen Intermediat. Durch Vergleich mit der intermolekularen Reaktion
lassen sich die effektiven Konzentrationen berechnen (k = v [Acetat] [S]).
Abb. 3 Veranschaulichung des Konzepts der effektiven Konzentration am Beispiel der
Hydrolyse von Phenylestern.
Diese effektiven Konzentrationen sind so hoch, dass selbst eine intermolekulare
Reaktion bei der das Substrat von Acetaten in Lösung umringt ist, langsamer
verlaufen würde. Je besser das System in der intramolekularen Variante
präorganisiert ist, umso schneller verläuft die Reaktion, weil die Wahrscheinlichkeit
der
Reaktion
Präorganisation.
wesentlich
gesteigert
Thermodynamisch
wird.
Enzyme
bedeutet
dies,
sind
dass
also
Meister
der
Aktivierungsentropie
wesentlich erniedrigt wird. Ein Übergangszustand ist hoch geordnet. ΔS ist daher
positiv, was ΔG positiver und damit ungünstiger macht. Erfolgt eine Präorganisation,
muss dieser Entropieverlust nicht mehr aufgebracht werden. In der aktiven Tasche
der Enzyme sind Substrate, Cofaktoren und reaktive Gruppe bereits so vororganisiert, dass kein Entropieverlust auftritt, wenn sich die Reaktion vom EnzymSubstrat-Komplex zum Übergangszustand bewegt.
4
3.2.2 Die thermodynamische Stabilisierung des Übergangszustandes
Enzyme binden zunächst das Substrat, um dann einen Enzym-Substrat Komplex zu
bilden. Hierbei ist entscheidend, dass das Substrat nicht zu fest gebunden wird, da
andernfalls die Aktivierungsenergie angehoben und nicht abgesenkt wird. Dieser
Zusammenhang wird in Abb. 4 verdeutlicht.
Abb. 4 Einfluss der thermodynamischen Stabilität des Enzym-Substrat-Komplexes (ES) auf
die Aktivierungsenergie (roter Pfeil).
Der Ausgangszustand E + S ist immer der gleiche. Wird das Substrat zu fest
gebunden, so erhöht sich die Energiebarriere bis zum Übergangszustand (c). Die
gleichzeitige feste Bindung des Substrates S und des Übergangszustandes (ÜZ)
senkt die Energie des ÜZ nicht ab (b). Das Enzym muss versuchen nur den ÜZ stark
zu binden (d). Gleichzeitig ist es von Vorteil, wenn das Substrat nur schwach
gebunden wird. Natürlich muss dabei die effiziente molekulare Erkennung gewährleistet bleiben. Tatsächlich beobachtet man, dass die meisten Enzyme die Substrate
nur mit milli- bis micromolarer Affinität binden. Die Michaelis-Konstanten, die in erster
grober Nährung der Bindungskonstante entsprechen liegen typischerweise bei KM =
10-3-10-6M. Antikörper hingegen, die darauf optimiert sind Grundzustände zu binden
5
haben Assoziationskonstanten im Bereich Kass = 10-9-10-12M. Hieraus erklärt sich das
Projekt der katalytischen Antikörper. Man synthetisiert Verbindungen, die die Struktur
von
Übergangszuständen
möglichst
genau
nachstellen
(Übergangszustands-
analoga). Erzeugt man gegen diese Antikörper, so erhält man Proteine, die in der Tat
die Reaktion katalysieren. Bis heute, sind die erhaltenen katalytischen Antikörper
jedoch wesentlich schlechter als die natürlichen Enzyme.
3.2.3 Säure/Base-Katalyse
Viele enzymatische Katalyseprozesse beruhen auf Säure/Base-Reaktionen. Die
Substrate oder Intermediate werden protoniert oder deprotoniert. Hierbei arbeiten
Enzyme unter physiologischen Bedingungen. Unter genereller Säurekatalyse
versteht man, wenn das Substrat durch einen katalytisch aktiven Rest protoniert wird.
Da die Enzymgruppe ein Proton verliert, muss der Rest zunächst protoniert vorliegen. Der pKa-Wert der Gruppe muss also knapp über 7 (7-10) liegen. Läge der
pKa-Wert über 10, würde der Protonentransfer thermodynamisch ungünstig.
Generelle Basekatalyse tritt auf, wenn entweder das Substrat oder Wasser
deprotoniert wird, bevor das Substrat angegriffen wird. Hierzu muss der aktive Rest
in der Enzymtasche deprotoniert sein. Der pKa-Wert der Gruppe muss daher knapp
unter 7 (4-7) liegen. Der Imidazolring des Histidins kann mit einem pKa-Wert von ca.
7 sowohl als Säure als auch als Base fungieren.
Abb. 5 Prinzipieller Mechanismus der enzymatischen Säure- (oben) und Base-Katalyse
(unten).
6
Die unterschiedlichen Seitenketten der Aminosäuren liegen exakt im geforderten
Bereich. In Abb. 6 sind die pKa-Werte einiger Aminosäureseitenketten aufgeführt. Die
pKa-Werte können jedoch durch die Mikroumgebung im Protein stark verändert
werden. Abb. 6 zeigt, über welchen Bereich die pKa-Werte verschoben sein können.
So bewirkt eine protonierte Lysin-Seitenkette, dass der pKa-Wert eines benachbarten
Lysins von 9 auf 5.9 verschoben wird.
Abb. 6 pKa-Werte einiger Aminosäureseitenketten.
Einen weiteren entscheidenden Punktgewinn verzeichnen Enzyme durch bifunctional
catalysis. So findet an der einen Stelle eine Protonierung, an der anderen eine
Deprotonierung statt. Ein Beispiel ist die Ketosteroid-Isomerase (Abb. 7). Asp38
fungiert hier als Base während Tyr14 gleichzeitig die Funktion einer Säure
übernimmt.
Diese bifunktionelle Katalyse ermöglicht auch die Deprotonierung in Fällen, wo das
offensichtlich thermodynamisch eigentlich nicht möglich ist. So hat das H neben der
Carbonylgruppe einen pKa-Wert von 18-20. Eine Deprotonierung findet statt mit einer
Gruppe, die einen pKa-Wert von 3.7 hat. Nur durch die gleichzeitige O-Protonierung
des Enolates wird diese Reaktion thermodynamisch möglich. In solchen Enzymen
fungieren auch oft Metalle wie das Zn2+ als Lewissäuren (Elektronenpaarakzeptoren).
7
Abb. 7 Bifunktionelle Katalyse im Fall der Ketosteroid-Isomerase.
Prinzipiell lassen sich bei der Säure/Base-Katalyse zwei Fälle unterscheiden:
spezifische und generelle Säure/Base-Katalyse.
Abb. 8 Spezifische (a) und generelle (b) Säure/Base-Katalyse.
Man spricht von spezifischer Säure/Base-Katalyse (Abb. 8a), wenn die Katalyse von
der Konzentration an H+ und OH- direkt abhängt, d.h. abhängig ist vom pH-Wert, wie
z. B. die Hydrolyse von Essigsäurethylester. Die Hydrolyse ist langsam im neutralen
8
nimmt aber im sauren (mehr H+ zur Aktivierung der C=O Gruppe) und im basischen
(mehr OH-) stark zu.
Man spricht von genereller Säure/Base-Katalyse (Abb. 8b), wenn die Rate bei
konstantem pH mit steigender Pufferkonzentration, d.h. mit zunehmender Ionenstärke zunimmt. Die Konzentrationen an H+ und OH- bleiben hier konstant. Der
Katalysator ist der Puffer(!), wie z. B. Imidazol-Puffer.
3.2.4 Nukleophile Katalyse
Hierbei handelt es sich um eine kovalente Katalyse. Eine nukleophile Gruppe greift
am Substrat an und bildet einen kovalenten Komplex mit dem Substrat. Vor allem in
unpolaren Enzymtaschen kann ein „nacktes“ Nukleophil sehr aktiv sein. Potentielle
Nukleophile sind:
-CH2-OH
Serin
Serin-Proteasen, Lipasen, Esterasen
-CH(CH3)-OH
Threonin
Phosphotransferase
-CH2-SH
Cystein
Cycstein-Protease, Acyl-Transferase
-(CH2)n-COOH
Glutamin-/Asparaginsäure
Epoxid-Hydrolase, Dehalogenase
-(CH2)4-NH2
Lysin
Aldolase class 1
Imidazol-NH
Imidazol
Phosphotransferase
Ar-OH
Tyrosoin
DNA-Topoisomerase
Schema 1 Nukleophile Katalyse am Beispiel der Acetoacetat-Decarboxylase.
9
Ein Beispiel ist die Acetoacetat-Decarboxylase (Schema 1). In diesem Enzym ist der
pKa-Wert des Lysins 5.9. Daher ist das Lysin unter physiologischen Bedingungen
deprotoniert und kann als Nukleophil fungieren.
3.2.5 Die Verwendung von Spannungsenergie
Es handelt sich um ein Phänomen, das sich nicht so einfach experimentell fassen
lässt. Manche Enzyme scheinen die Substrate in einer „verzerrten“ Konformation zu
binden. Das Substrat wird in Richtung Geometrie des Übergangszustandes verbogen. Dadurch nimmt die Energie zwischen dem gebundenen Grundzustand und
dem Übergangszustand entscheidend ab. Es wird also Bindungsenergie verwendet,
um die Aktivierungsenergie zu reduzieren. In Abb. 10 ist die Verzerrung des
Substrates im Fall des Enzyms Carboxypeptidase A gezeigt. Hier wird die Amidbindung out-of-plane verzerrt und damit für den Angriff des Nukleophils vorbereitet.
Ein Zn2+ fungiert als Lewissäure.
Abb. 10 Verzerrung der Amidbindung im Fall der Carboxypeptidase A.
3.2.6 Maximale Ratenbeschleunigung
Wie stark kann ein Enzym maximal eine Rate Beschleunigen. Gibt es eine Obergrenze? Die Antwort ist ja. Die Grenze ist erreicht, wenn die Rate diffusionskontrolliert wird.
Dieses Diffusionslimit wird von der Stosszahl bestimmt, die eine Maß für die
Wahrscheinlichkeit ist, mit der zwei Teilchen zusammen stoßen können. Sie liegt bei
ca. 108M-1s-1. Das ist gleichzeitig die maximale biomolekulare Rate, die erreichbar ist.
Für die Reaktion eines freien Enzyms mit einem frei in Lösung befindlichen Substrat
ist die bimolekulare Rate kcat/KM. Diese bimolekulare Rate nennt man auch die
katalytische Effizienz. Die meisten Enzyme habe Effizienzen zwischen 106-107 M-1s-1.
10
Einige wenige schaffen jedoch auch das Diffusionslimit:
Triosephosphat-Isomerase
3.0 x 108 M-1s-1
Acetylcholinesterase
1.4 x 108 M-1s-1
Ketosteroid-Isomerase
1.3 x 108 M-1s-1
β-Lactamase
1.0 x 108 M-1s-1
3.3 Michaelis-Menten-Kinetik
Das Michaelis-Menten-Modell für die Enzymkatalyse nimmt an, dass die Enzymreaktion über die folgenden Stufen verläuft:
E +
S
k1
ES
k2
E
+
P
k-1
Dieses Modell beruht auf einer ganzen Reihe von (meistens nicht stimmenden)
Annahmen. So soll nach dem Modell das Enzym nur ein Substrat binden. Der ESKomplex zerfällt in einem Schritt zum Produkt. Die Produktbildung ist irreversibel. Für
die kinetische Analyse geht man nun von einem Gleichgewichtszustand aus (steadystate). Bei konstantem turn-over ist die Konzentration an ES konstant. Daraus ergibt
sich, dass die Rate der ES Bildung und die Rate für den ES Verbrauch gleich groß
sind.
k1 [E] [S] = k2 [ES] + k-1[ES]
mit [E0] = [E] + [ES]
k1 [E0] [S] - k1 [ES] [S] = k2 [ES] + k-1[ES]
[ES] =
[E0] [S]
Km + [S]
Produktbildungsrate = k2 [ES] =
k-1 + k2
mit [Km] =
k1
k2 [E0] [S]
KM + [S]
11
Misst man nun die Enzymreaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration, so
ergibt sich im Idealfall die folgende Kurve:
Aus einer solchen Messung lassen sich nun die zwei kinetischen Konstanten kcat und
KM ermitteln.
kcat ist die turn-over Konstante. Es handelt sich um eine unimolekulare
Ratenkonstante, die in min-1 oder s-1 angegeben wird. Die Konstante sagt aus, wie
viel μmol Substrat pro μmol Enzym pro Sekunde umgesetzt wird. Oder in
molekularen Worten: Die Anzahl der Moleküle, die durch ein Enzym pro Sekunde
umgesetzt werden. Typische Werte liegen zwischen 0.1-100 s-1.
KM ist die Michaelis-Konstante in (M). Der Wert gibt an bei welcher Substratkonzentration die Enzymgeschwindigkeit halbmaximal (vmax/2) ist. Der Wert ist ein
grobes Maß dafür, wie stark das Enzym das Substrat bindet. Schwach gebundene
Substrate haben einen großen KM-Wert. Stark bindende Enzyme haben ein sehr
kleines KM. KM ist jedoch nicht die tatsächliche Dissoziationskonstante! Typische
Werte liegen bei 1 μM – 1 mM.
Bei sehr hohen Substratkonzentrationen [S]>>KM reduziert sich die Ratengleichung
zu: v = kcat [E]. Man kann nun die Substratkonzentration weiter erhöhen. Der Umsatz
bleibt immer der gleiche, da das gesamte vorhandene Enzym mit Substrat gesättigt
ist.
Bei sehr niedrigen Substratkonzentrationen gilt v = (kcat/KM)[E][S]. Nun ist die Rate
proportional zur Substratkonzentration. Die beobachtete Rate ist nun wirklich
bimolekular. Diese Rate (kcat/KM) ist die katalytische Effizienz. Sie hängt davon ab,
wie stark das Enzym das Substrat bindet.
Abb. 11 verdeutlicht die beiden Regime: Bei hoher Substratkonzentration ([S]>>KM)
ist das Enzym immer gesättigt. Die Energiedifferenz zwischen ES und dem ÜZ
bestimmt nun die Reaktionsgeschwindigkeit. Am Punkt [S] = KM ist das Enzym
12
halbgesättigt. Bei niedrigen Substratkonzentrationen ([S]<<KM) liegt vorwiegend
freies Enzym vor. Nun ist die Energie zwischen dem Zustand [E] + [S] und dem [ÜZ]
Raten bestimmend.
Abb. 11 Veranschaulichung der einzelnen Grenzfälle in der Michaelis-Menten-Kinetik.
3.3.1 Reversible Enzyminhibition:
Die Enzyminhibition kann kompetitiv und nicht-kompetitiv erfolgen. Bei der
kompetitiven Inhibition konkurriert der Inhibitor mit dem Substrat um die Bindungsstelle. Nicht-kompetitive Inhibition bedeutet, dass der Inhibitor an einer andere Stelle
des Enzyms bindet und ein unproduktiver ternärer Komplex EIS gebildet wird.
3.3.2 Irreversible Enzyminhibition:
Eine zweite Möglichkeit der Enzyminhibition stellt die irreversible Inhibition dar. Hier
bindet der Inhibitor in der aktiven Tasche und bildet dann eine kovalente Bindung mit
dem Enzym aus (E-I). Hierdurch wird die aktive Tasche vollständig und irreversibel
blockiert.
13
Die meisten Enzymkinetiken werden unter steady-state Bedingungen durchgeführt.
Eine Enzymkinetik wird in diesem Fall über 1 – 10 min gemessen. Kann man Raten
vor der Einnahme des steady-state messen, so erhält man Informationen über
einzelne Enzymschritte. Man spricht von pre-steady-state Kinetik. Ist kcat = 10 s-1 so
wird unter Sättigungsbedingungen ein Molekül Substrat pro 0.1 s umgesetzt. Um nun
einen Umsatz verfolgen zu können muss man im Bereich 0-100 ms messen. Das
wird in der Regel mit stopped-flow Apparaturen durchgeführt (Abb. 12). Die
Zeitauflösung einer solchen Apparatur liegt im Bereich Mikrosekunden/Millisekunden.
Abb.12 Schematische Darstellung einer stopped-flow Anlage.
3.4 Stereochemische Aspekte
Enzymreaktionen
sind
in
der
Regel
stereoselektiv
und
stereospezifisch.
Stereoselektiv heißt, Enzyme setzen aus einem Isomerengemisch nur ein Isomer
um. Enantioselektiv heißt, dass aus einem Razemat nur ein Enantiomer als Substrat
akzeptiert wird. Stereospezifisch bedeutet, dass ein spezifischer Reaktionsweg
beschritten wird, um nur ein Produktisomer zu generieren. Die Grundlage hierfür ist,
dass die Reaktion in einer chiralen Enzymkavität ausgeführt wird. Als Beispiel ist in
Schema 3 die Fructose-1,6-diphosphat-Aldolase gezeigt. Die Aldolase katalysiert
eine Aldolreaktion bei der nur ein Stereoisomer entsteht.
Schema 3 Katalysierte Reaktion der Fructose-1,6.diphosphat-Aldolase.
14
Enzyme sind auch in der Lage pro-chirale Atome zu unterscheiden. So sind die zwei
H-Atome der CH2-Gruppe im Ethanol pro-chiral, d. h. ersetzt man ein H durch ein D
so entsteht eine chirale Substanz. Das H, bei dessen Ersatz die
R-Verbindung
entsteht, nennt man pro-R, dasjenige nach dessen Ersatz das s-Isomer entstehen
würde, nennt man pro-S. Diese Differenzierung ist wieder nur möglich, weil das
Substratmolekül in der Enzymtasche fest eingebunden vorliegt. Der Angriff erfolgt
dann entweder von oben oder von unten. Entscheidend ist die Fixierung in einer
chiralen Umgebung. Um die pro-Chiralitätselektivität zu ermitteln, müssen Substrate
verwendet werden, in denen einer der pro-chiralen Atome durch ein Isotop ersetzt ist.
Wichtige Isotope sind:
H: 1H, 2H, 3H
C: 12C, 13C, 14C
N: 14N, 15N
O: 16O, 17O, 18O
Entfernt das Enzym ein H-Atom von einer Methylgruppe, so kann erneut nur
entschieden werden, ob das stereoselektiv erfolgt, wenn entsprechend gelabelt wird.
Hierzu muss eine Methylgruppe hergestellt werden, die ein H, ein D und ein T enthält. Man muss das Produkt anschließend auf die chirale Essigsäure zurückführen.
Für diese Verbindung hat D. Arigoni und J. W. Cornforth eine Methode zu Bestimmung, ob die Essigsäure R oder S konfiguriert ist, entwickelt (Schema 4).
Schema 4 Bestimmung der Stereokonfiguration von chiraler Essigsäure nach D. Arigoni und
J. W. Cornforth.
15