Humoral Immune Response to the Intracellular - ETH E

DISS. ETH NO. 17950
Humoral Immune Response to the Intracellular Pathogen Legionella
pneumophila
A dissertation submitted to the
Swiss Federal Institute of Technology Zurich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Nicole Christine Joller
Dipl. Natw. ETH
born 29.08.1978
citizen of Dallenwil (NW)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Annette Oxenius, examiner
Prof. Dr. Manfred Kopf, co-examiner
Zurich, 2008
Summary
Legionella pneumophila (Lpn) are gram-negative bacteria that, when inhaled, infect
and replicate within alveolar macrophages and can, particularly in immunocompromised people, cause a severe pneumonia known as Legionnaires’ disease.
By effector mechanisms triggered by the bacterial Dot/Icm type IV secretion system
(T4SS), Lpn evade phagolysosomal fusion within macrophages, which allows them
to replicate inside the host cell. Although primary infection with Lpn is largely
controlled by innate immune mechanisms, in particular by NK cell-derived IFNγ,
adaptive immune responses are necessary for protection against secondary
challenge. In this thesis we demonstrate that humoral immunity is entirely
responsible for this protection.
Using A/J mice as a model we have characterized the Lpn-specific B cell response
after systemic as well as in intranasal (i.n.) Lpn infection and our results demonstrate
that i.v. as well as i.n. infection with Lpn leads to a strong Lpn-specific B cell
response, which is accelerated and strongly increased in secondary infection. A
functional T4SS is essential for induction of a B cell response in an i.n. infection, as it
is essential for the induction of an inflammatory response which in turn seems to be
required for the generation of both Lpn-specific IgM and isotype-switched antibody
(Ab) responses at mucosal sites such as the lung. We have investigated the role of
the Ab response in protection from re-infection with Lpn and shown that the bacterial
burden is strongly reduced when mice are infected with Lpn which have been
opsonized with polyclonal Abs. This reduction in bacterial titers could be definitively
attributed to antibodies as immunized B cell-deficient (JHT) mice were not protected.
Furthermore, we demonstrated that the function of Abs in this context was neither to
activate complement nor to block the function of the T4SS as Abs were protective in
the absence of the central complement component C3 and the T4SS was functional
in opsonized bacteria. In vitro and in vivo experiments revealed that the protective
effect was mediated by antibody-dependent targeting of the bacteria to lysosomal
compartments within the host cell, resulting in an inhibition of intracellular replication.
Targeting of Lpn for degradation was dependent on the Fc moiety of the Abs and on
the presence of Fc receptors, suggesting that Fc receptor engagement and
III
subsequent signaling events impede the strategies by which Lpn evades
phagolysosomal fusion.
We further showed that Ab-mediated protection is effective across Lpn serogroups,
indicating that Abs specific for conserved protein Ags are sufficient to mediate
protection against Lpn. We could identify 30 of these protein Ags by using two
independent methods, namely the screening of a phage library constructed from the
Lpn genome and 2-dimensional gel electrophoresis followed by Western blot analysis
and mass spectronomy-based protein identification. These Lpn B cell Ags are
predominantly located in or associated with the bacterial membrane, where they are
accessible for Abs and therefore likely to be relevant for Ab-mediated protection
against Lpn.
IV
Zusammenfassung
Der bakterielle, Gram-negative Krankheitserreger Legionella pneumophila (Lpn)
kann, besonders bei Personen mit einem geschwächten Immunsystem, nach
Inhalation
alveoläre
Makrophagen
infizieren
und
dadurch
eine
schwere
Lungenentzündung (Legionärskrankheit) auslösen. Mit Hilfe des Dot/Icm Typ IV
Sekretionssytems (T4SS) entziehen sich die Bakterien dem lysosomalen Abbau
durch die Wirtszelle und können sich so in den Alveolarmakrophagen vermehren. Die
primäre Lpn-Infektion wird durch das angeborene Immunsystem, insbesondere durch
die Sekretion von IFN-γ durch NK Zellen kontrolliert. Für einen Schutz vor
sekundären Infektionen ist hingegen eine adaptive Immunantwort nötig. In dieser
Arbeit zeigen wir, dass dieser Schutz gänzlich durch die humorale Immunantwort
vermittelt wird.
Mit Hilfe des A/J-Mausmodells haben wir die Lpn-spezifische B Zellantwort nach
systemischer und intranasaler (i.n.) Infektion charakterisiert und unsere Ergebnisse
zeigen, dass beide Infektionen eine starke B Zellantwort auslösen, welche in
Sekundärantworten noch weiter verstärkt ist. Des Weiteren stellte sich heraus, dass
die
Anwesenheit
eines
funktionellen
T4SS
und
die
davon
abhängige
Entzündungsreaktion für die Induktion einer mukosalen IgM Antwort, sowie für die
Entstehung von Antikörpern (Ak) des IgG und IgA Isotypes, essentiell ist.
In einem weiteren Schritt haben wir die Rolle der Ak beim Schutz gegen sekundäre
Infektionen
analysiert
und
konnten
zeigen,
dass
die
Bakterienlast
durch
Opsonisierung von Lpn mit polyklonalen Ak stark reduziert werden kann. Diese
Reduktion konnte eindeutig der Funktion von Ak zugeordnet werden, da immunisierte
B Zell-defiziente Mäuse (JHT) keinen Schutz aufwiesen. Wir konnten ausserdem
zeigen,
dass
Ak
diese
Schutzfunktion
nicht
durch
Aktivierung
des
Komplememtsystems oder Blockierung des T4SS ausüben, denn auch in
Abwesenheit von C3, einer zentralen Einheit des Komplementsystems, wirken sie
schützend. Hinzu kommt, dass das T4SS auch in opsonisierten Lpn funktionell war.
In vitro und in vivo Experimente zeigten, dass die schützende Wirkung der Ak auf
deren Fähigkeit zurückzuführen ist, die Bakterien in das Lysosom der Wirtszelle zu
zwingen und damit deren Replikation zu verhindern. Für diesen Prozess sind der Fc-
V
Teil des Ak sowie Fc Rezeptoren absolut notwendig. Dies deutet darauf hin, dass die
Bindung der Ak an Fc Rezeptoren und die damit verbundene Signaltransduktion den
Mechanismen, die Lpn anwenden um dem lysosomalen Abbau durch die Wirtszelle
zu entkommen, entgegenwirken.
Ausserdem konnten wir zeigen, dass Ak, mit grösster Wahrscheinlichkeit diejenigen
mit Spezifität für konservierte Proteine, auch über verschiedene Serogruppen hinweg
Schutz vor der Lpn Infektion vermitteln können. Dreissig dieser Proteinantigene
konnten mit Hilfe zweier unabhängiger Methoden (Screen einer Phagenbibliothek
and zweidimensionale Gelelektrophorese mit anschliessender Westernblot Analyse
und massenspektrometrischer Proteinidentifikation) identifiziert werden. Diese B
Zellantigene befinden sich hauptsächlich in der Bakterienmembran oder sind
zumindest damit assoziiert. Dies gewährleistet die Zugänglichkeit dieser Antigene für
Ak und lässt vermuten, dass diese auch im Schutz vor Lpn Infektionen eine Rolle
spielen.
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