Charakterisierung und in vitro Expression einer Protein Disulfid

Aus dem Institut für Parasitologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Charakterisierung und in vitro Expression einer
Protein Disulfid Isomerase (PDI) zur Immunisierung gegen
Dictyocaulus viviparus
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Sonja Wolken
aus Sande
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. T. Schnieder
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. T. Schnieder
2. Gutachter:
Apl.-Prof. Dr. L. Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 16. November 2006
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Sonja Wolken, Georg von Samson-Himmelstjerna, Thomas Schnieder (2005):
„Herstellung eines rekombinanten Vakzinekandidaten für Dictyocaulus viviparus“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Erkrankungen“
Potsdam, 22. – 24.06.2005
Sonja Wolken, Georg von Samson-Himmelstjerna, Thomas Schnieder (2006):
„Characterisation of Dictyocaulus viviparus protein disulfid isomerase and testing of
its immunological potential”
22. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Parasitologie (DGP)
Wien, 22. – 25.02.2006
Inhaltsverzeichnis
1
2
Einleitung.........................................................................11
Literaturübersicht.............................................................13
2.1
Die Dictyocaulose des Rindes.....................................................................13
2.1.1
Der Erreger ......................................................................................... 13
2.1.2
Entwicklungszyklus und Pathogenese ................................................ 14
2.1.3
Epidemiologie und wirtschaftliche Bedeutung ..................................... 17
2.1.4
Immunität ............................................................................................ 20
2.1.5
Diagnose ............................................................................................. 23
2.1.6
Bekämpfung ........................................................................................ 26
2.1.6.1
Weidetechnische Maßnahmen..................................................... 27
2.1.6.2
Anthelminthika ............................................................................. 27
2.1.6.3
Vakzinierung ................................................................................ 28
2.1.6.4
Biologische Bekämpfung.............................................................. 30
2.2
Antigene und Immunisierungsversuche bei D. viviparus .............................30
2.3
Die Protein Disulfid Isomerase (PDI)...........................................................36
2.3.1
Struktur der PDI und PDI-ähnlicher Enzyme ....................................... 37
2.3.2
Funktionen der PDI ............................................................................. 41
2.3.2.1
Redox-Isomerase-Funktion der PDI............................................. 41
2.3.2.2
Die PDI als Untereinheit der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase ....... 42
2.3.2.3
Chaperon-Funktion und Anti-Chaperon-Funktion der PDI ........... 43
2.3.2.4
Die PDI als Untereinheit des mikrosomalen ....................................
Triglycerid-Transfer-Proteins (MTP)............................................. 45
2.3.2.5
Funktionen des ERp57 ................................................................ 45
2.3.2.6
Weitere Funktionen der PDI......................................................... 46
2.3.3
Lokalisation der PDI außerhalb des ER .............................................. 46
2.3.4
PDIs bei Helminthen ........................................................................... 47
3
Material und Methoden....................................................54
3.1
Materialien...................................................................................................54
3.1.1
Puffer und Lösungen........................................................................... 54
3.1.2
Medien und Platten ............................................................................. 56
3.1.3
Bakterien und Vektoren....................................................................... 56
3.1.4
Reagenzien, Reaktionskits und Geräte............................................... 57
3.1.5
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien............................................. 60
3.2
Gewinnung und Aufbereitung des parasitologischen Probenmaterials .......61
3.2.1
Isolierung von Lungenwurmlarven aus dem Kot ................................. 61
3.2.2
Isolierung von adulten Lungenwürmern aus der Lunge ...................... 62
3.2.3
Herstellung von D. viviparus Rohantigen ............................................ 62
3.3
Molekularbiologische Methoden ..................................................................63
3.3.1
mRNA Isolierung ................................................................................. 63
3.3.2
Isolierung genomischer DNA............................................................... 64
3.3.3
cDNA-Synthese................................................................................... 64
3.3.3.1
cDNA-Synthese für die konventionelle PCR ................................ 64
3.3.3.2
cDNA-Synthese für die RACE-PCR ............................................. 65
3.3.4
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ............ 66
3.3.4.1
Allgemeines zur Methode............................................................. 66
3.3.4.2
PCR zur Erstamplifikation der PDI von D. viviparus..................... 67
3.3.4.3
Rapid amplification of cDNA ends (RACE PCR).......................... 69
3.3.4.4
PCR zur Selektion von Kolonien .................................................. 70
3.3.4.5
PCR zur Ermittlung der genomischen Sequenz........................... 71
3.3.4.6
PCR zur Klonierung des ORF (open reading frame) der PDI....... 72
3.3.5
Darstellung von Nucleinsäuren mittels Agarosegelelektrophorese ..... 73
3.3.6
Isolierung von PCR-Amplifikaten aus Agarosegelen........................... 74
3.3.7
Klonierung von PCR-Amplifikaten ....................................................... 74
3.3.7.1
Klonierung in pCR®4-TOPO® ..................................................... 74
3.3.7.2
Klonierung in pGEX4T-3 .............................................................. 75
3.3.8
Transformation kompetenter Zellen .................................................... 76
3.3.8.1
E. coli TOP 10.............................................................................. 76
3.3.8.2
E. coli BL 21 (DE3) ...................................................................... 77
3.3.8.3
E. coli BL 21-Codon Plus® .......................................................... 77
3.3.9
Plasmidpräparation ............................................................................. 78
3.3.9.1
Miniprep ....................................................................................... 78
3.3.9.2
Midiprep ....................................................................................... 79
3.3.10 Restriktionsenzymverdau .................................................................... 79
3.3.10.1 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) ................ 79
3.3.10.2 Darstellung des Inserts ................................................................ 80
3.3.11 Sequenzierung und Sequenzbearbeitung ........................................... 80
3.4
Proteinbiochemische Methoden ..................................................................81
3.4.1
Proteinexpression ............................................................................... 81
3.4.2
Gewinnung des Zelllysats ................................................................... 82
3.4.2.1
Zelllyse mittels MagneGST™ Protein Purification System...............
Lysispuffer (PROMEGA) ............................................................. 82
3.4.2.2
Zelllyse mittels Lysisprotokoll nach SAMBROCK (1989) ............. 82
3.4.2.3
Zelllyse mittels Lysispuffer und Ultraschall................................... 82
3.4.3
Proteinaufreinigung ............................................................................. 83
3.4.3.1
Magne GST™ Protein Purification System .................................. 83
3.4.3.2
Glutathione Sepharose™ High Performance ............................... 84
3.4.3.3
FPLC mit GSTrap™ HP Affinitätssäulen...................................... 85
3.4.4
Proteinproduktion für die Immunisierungen......................................... 86
3.4.5
Darstellung von Proteinen ................................................................... 87
3.4.5.1
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese........................................ 87
3.4.5.2
Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung von Proteinen ........................ 88
3.4.5.3
Transfer Blot ................................................................................ 88
3.4.5.4
Western-Blot ................................................................................ 89
3.4.6
Bestimmung der Proteinkonzentration ................................................ 90
3.4.6.1
Bradford ....................................................................................... 90
3.4.6.2
Agilent 2100 Bioanalyzer ............................................................. 91
3.4.7
Aufkonzentrieren der Proteinlösung .................................................... 92
3.4.8
Identifizierung der PDI mittels MALDI-TOF-MS................................... 92
3.5
Tierexperimentelle Untersuchungen............................................................92
3.5.1
Versuchsplan ...................................................................................... 92
3.5.2
Genehmigung...................................................................................... 94
3.5.3
Tiermaterial ......................................................................................... 95
3.5.4
Tierhaltung .......................................................................................... 95
3.5.5
Verwendete Adjuvantien und Zubereitung des Impfstoffs ................... 95
3.5.6
Applikation des Impfstoffs ................................................................... 96
3.5.7
Experimentelle Infektion...................................................................... 96
3.5.8
Überwachung der Tiergesundheit ....................................................... 96
3.5.9
Medikamentöse Behandlung erkrankter Tiere .................................... 97
3.5.10 Gewinnung von Probenmaterial und dessen Aufbereitung ................. 97
3.5.10.1 Blutproben.................................................................................... 97
3.5.10.2 Kotproben .................................................................................... 98
3.5.11 Sektion ................................................................................................ 98
3.5.12 Größenbestimmung der adulten Stadien ............................................ 98
3.6
Serologische Untersuchungen ....................................................................99
3.6.1
Enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) ................................... 99
3.6.2
Überprüfung der Serokonversion mittels Western-Blot ..................... 101
3.7
Quantitative real-time PCR (QRT-PCR) ....................................................101
3.7.1
Allgemeines zur Methode.................................................................. 101
3.7.2
Konstruktion der Primer und Sonden ................................................ 104
3.7.3
Gesamt-RNA Isolierung .................................................................... 104
3.7.4
DNAse-Verdau der Gesamt-RNA...................................................... 105
3.7.5
cDNA-Synthese für die quantitative real-time PCR ........................... 105
3.7.6
Absolute Quantifizierung ................................................................... 106
3.7.7
Relative Quantifizierung .................................................................... 107
3.7.8
Durchführung der QRT-PCR ............................................................. 107
4
Ergebnisse.....................................................................109
4.1
Molekularbiologische Ergebnisse ..............................................................109
4.1.1
Amplifikation der Protein Disulfid Isomerase von D. viviparus........... 109
4.1.2
Vergleich positiver Klone mittels RFLP ............................................. 110
4.1.3
RACE-PCR ....................................................................................... 110
4.1.4
Identitätsvergleiche der PDI1 und PDI2 von D. viviparus mit PDIs .........
anderer Spezies ................................................................................ 112
4.1.5
Identifizierung konservierter Domänen.............................................. 115
4.1.6
Ermittlung der genomischen Sequenz der PDI2 von D. viviparus ..... 116
4.2
Proteinbiochemische Ergebnisse ..............................................................120
4.2.1
Optimierung der Proteinaufreinigung ................................................ 120
4.2.1.1
Proteinexpression ...................................................................... 121
4.2.1.2
Vergleich unterschiedlicher Lysebedingungen........................... 122
4.2.1.3
Unterschiedliche Aufreinigungbedingungen im Magne ...................
GST™-Protokoll und mittels Sepharose™-Medium................... 123
4.2.1.4
Aufreinigung mittels FPLC ......................................................... 123
4.2.2
Proteinproduktion für die Immunisierungen....................................... 124
4.2.3
Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Analyse ......................................... 127
4.3
Tierexperimentelle Ergebnisse ..................................................................128
4.3.1
Tiergesundheit .................................................................................. 128
4.3.1.1
Allgemeinuntersuchung.............................................................. 128
4.3.1.2
Gewichtsentwicklung ................................................................. 131
4.3.1.3
Lokale Impfreaktionen................................................................ 132
4.3.1.4
Behandlung erkrankter Tiere...................................................... 134
4.3.1.5
Differentialblutbild ...................................................................... 134
4.3.2
Larvenausscheidung ......................................................................... 135
4.3.3
makroskopische Beurteilung der Lungen .......................................... 137
4.3.4
Bestimmung der Anzahl adulter D. viviparus..................................... 139
4.3.5
Bestimmung der Wurmgröße ............................................................ 141
4.4
Ergebnisse der serologischen Untersuchungen ........................................142
4.4.1
ELISA................................................................................................ 142
4.4.2
Überprüfung der Serokonversion mittels Westernblot....................... 144
4.5
Ergebnisse der quantitativen real-time PCR .............................................147
4.5.1
Absolute Quantifizierung ................................................................... 147
4.5.2
Relative Quantifizierung .................................................................... 147
5
Diskussion .....................................................................150
5.1
Identifizierung der PDI von D. viviparus ....................................................150
5.2
Expression und Aufreinigung der rekombinanten PDI...............................152
5.3
Durchführung der Immunisierungsversuche..............................................157
5.3.1
Wahl des Tiermaterials ..................................................................... 157
5.3.2
Immunisierung und experimentelle Infektion ..................................... 158
5.4
Ergebnisse der Immunisierungsversuche .................................................159
5.4.1
Befunde der täglichen Beobachtung und klinischen Untersuchung .. 159
5.4.2
Etablierung der Infektion in den Kontrollgruppen .............................. 160
5.4.3
Larvenausscheidung und Wurmbürden ............................................ 161
5.4.4
Ergebnisse der serologischen Untersuchungen................................ 164
5.4.5
Quantitative real-time PCR................................................................ 166
5.5
Zusammenfassende Beurteilung und Ausblick .........................................168
6
7
8
9
Zusammenfassung ........................................................170
Summary .......................................................................172
Literaturverzeichnis .......................................................174
Anhang ..........................................................................199
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
9.10
Vollständige cDNA-Sequenz und abgeleitete .................................................
Aminosäurensequenz der PDI1 von D. viviparus ......................................199
Vollständige cDNA-Sequenz und Aminosäurensequenz.................................
der PDI2 von D. viviparus..........................................................................200
Eosinophile Granulozyten .........................................................................203
Larvenausscheidung im I. u. II. Immunisierungsversuch...........................204
Längen und Breiten der adulten Würmer ..................................................205
Indices für verschiedene Serumantikörpertiter ..........................................206
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ..............................................208
Symbole der Aminosäuren ........................................................................211
Abbildungsverzeichnis...............................................................................212
Tabellenverzeichnis...................................................................................213
Einleitung
11
1 Einleitung
Parasitosen stellen weltweit die häufigsten und verlustreichsten Infektionskrankheiten
bei Mensch und Tier dar. Zu dieser Situation trägt wesentlich die Tatsache bei, dass
sich die Möglichkeiten zur Bekämpfung parasitärer Erkrankungen fast ausschließlich
auf
den
Einsatz
von
chemotherapeutischer
Anthelminthika
Substanzen
birgt
beschränken.
jedoch
das
Der
intensive
ständige
Risiko
Einsatz
einer
Resistenzentwicklung bei den Erregern. Aus vielen Ländern existieren bereits
Berichte über das Vorliegen von Resistenzen bei veterinärmedizinisch relevanten
Parasiten, wobei sich diese zum Teil gegen alle verfügbaren Substanzklassen
richten.
Aus diesen Gründen beschäftigen sich weltweit Forschergruppen mit der
Entwicklung von Vakzinen gegen Parasiten, wobei im Vergleich zu viralen und
bakteriellen Erregern bislang erst wenige Erfolge erzielt wurden. Gründe hierfür sind
unter anderem die komplexe Struktur und hohe genetische Organisation der
Parasiten.
Die
vorliegende
Arbeit
befasst
sich
mit
einem
Vakzinekandidaten
gegen
Dictyocaulus viviparus, dem großen Lungenwurm des Rindes. Die von D. viviparus
verursachte parasitäre Bronchitis ist eine der wichtigsten und verlustreichsten
Weideparasitosen in gemäßigten Klimazonen, wobei Rinder im ersten Weidejahr
besonders gefährdet sind. Eine in den 1950er Jahren entwickelte Lebendvakzine
kann für einige Monate eine belastbare Immunität induzieren, die jedoch durch
erneute Infektion aufgefrischt werden muss.
Lebendvakzinen haben den Nachteil, dass ihre Produktion sehr aufwendig und teuer
ist und die Handhabung aufgrund der begrenzten Haltbarkeit und Notwendigkeit zur
kühlen Lagerung eingeschränkt ist. Die aktuelle Vakzineentwicklung hat daher zum
Ziel, Impfstoffe in rekombinanter Form herzustellen. Hierdurch ist die Produktion
unabhängig von der Kultivierung des Erregers und die rekombinanten Antigene
können in großem Umfang bei gleichbleibender Reinheit und Qualität hergestellt
werden. Gegenstand dieser Arbeit ist die Protein Disulfid Isomerase (PDI). Dieses
Enzym wurde bereits bei verschiedenen Helminthen beschrieben und stellt durch
12
Einleitung
seine vielfältigen Funktionen und nachgewiesene Immunogenität einen potentiellen
Vakzinekandidaten dar. Unter anderem wird der PDI eine essentielle Bedeutung bei
der Kutikula-Synthese der Nematoden zugesprochen. Ziel dieser Arbeit ist die
Identifizierung und Charakterisierung der PDI bei D. viviparus. Weiterhin erfolgt in
Immunisierungsversuchen eine Überprüfung der Immunogenität und Protektivität des
Enzyms.
Literaturübersicht
13
2 Literaturübersicht
2.1 Die Dictyocaulose des Rindes
2.1.1 Der Erreger
Bereits 1727 wurde von RUYSCH über das Vorkommen von Lungenwürmern beim
Rind berichtet. Die Erstbeschreibung erfolgte im Jahre 1782 durch BLOCH, der
diesem Parasiten den Namen Gordius viviparus gab. Seinen endgültigen Namen
Dictyocaulus viviparus erhielt der Rinderlungenwurm 1907 durch RAILLIET und
HENRY.
Dictyocaulus viviparus, der große Lungenwurm des Rindes, gehört taxonomisch der
Ordnung
Rhabditida
und
der
Familie
der
Trichostrongylidae
an.
Die
geschlechtsreifen Stadien leben in den Bronchioli, Bronchien und der Trachea und
verursachen
eine
parasitäre
Bronchitis.
Bis
heute
beinhaltet
die
Gattung
Dictyocaulus sieben Arten, die zum Teil mehrere Wirtstierspezies befallen. Hierbei
zeigen die Parasiten eine unterschiedliche Anpassung an ihre Wirte, was sich unter
anderem in der Ausbildung einer patenten Infektion äußert. Rinder sind für D.
viviparus empfänglicher als Wildwiederkäuer (BIENIOSCHEK 1994). D. arnfieldi
parasitiert in Equiden. Esel sind häufiger befallen als Pferde, zeigen jedoch seltener
Symptome (GOTHE 1983; HASSLINGER 1989). D. filaria ist bei kleinen Haus- und
Wildwiederkäuern zu finden (ENIGK u. HILDEBRANDT 1969; GOTHE u. KANDELS
1984). Eine erstmals bei Rentieren beschriebene Art, D. eckerti (SKRJABIN 1931),
wurde aufgrund morphologischer Unstimmigkeiten lange Zeit nicht als solche
anerkannt.
Molekulargenetische
Untersuchungen
konnten
jedoch
die
Eigenständigkeit dieser Spezies beweisen (EPE et al. 1995; EPE et al. 1997;
SCHNIEDER et al. 1996b). Neben Rentieren konnten als weitere Wirte für D. eckerti
Rotwild, Elche und Moschusochsen identifiziert werden (DIVINA et al. 2002;
HÖGLUND et al. 2003). Eine experimentelle Übertragung von D. eckerti auf das Rind
ist möglich, es besteht jedoch nur eine geringe Empfänglichkeit (BIENIOSCHEK
1994).
14
Literaturübersicht
Eine neue Spezies, D. capreolus, wurde kürzlich bei Rehwild und Elchen in
Schweden beschrieben (GIBBONS u. HÖGLUND 2002; HÖGLUND et al. 1999).
Eine experimentelle Übertragung dieser Spezies aufs Rind war nicht erfolgreich
(DIVINA u. HÖGLUND 2002). Bei afrikanischen Paarhufern existieren als weitere
Arten D. cameli und D. africanus (GIBBONS u. KHALIL 1988). Des Weiteren
entdeckten DIVINA et al. (2002) ein Dictyocaulus-Isolat in Damwild, das
molekulargenetisch keiner bekannten Spezies zugeordnet werden konnte.
2.1.2 Entwicklungszyklus und Pathogenese
Mit dem Wirtstierkot werden die 390 bis 450 µm langen, unbescheideten Erstlarven
ausgeschieden, die sich in der Außenwelt unter günstigen klimatischen Bedingungen
über ein einfach bescheidetes zweites Larvenstadium zur doppelt bescheideten,
infektiösen dritten Larve entwickeln. Während dieser Entwicklungsphase nehmen die
Larven keine Nahrung auf, sondern zehren von in Granula gespeicherten
Reservestoffen (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; TAYLOR 1951). Nach URQUHART
et al. (1973) lässt sich der Krankheitsverlauf in die vier Phasen Penetrationsphase,
Präpatenz, Patenz und Postpatenz gliedern, die jede für sich eine eigene
Symptomatik aufweisen. Der Schweregrad der klinischen Erscheinungen wird von
der initial aufgenommenen Larvenmenge bestimmt. Darüber hinaus sind geringes
Alter, ein schlechter Ernährungszustand und ungünstige Witterungsbedingungen
prädisponierend für schwere Erkrankungen (TAYLOR 1951). Auch ein zusätzlich
vorhandener Befall mit Magen-Darm-Würmern kann zu einer erhöhten Anfälligkeit
führen (PFEIFFER 1971).
Die Penetrationsphase umfasst die Aufnahme der Larven bis zu ihrer Anwesenheit in
der Lunge. Nach oraler Aufnahme werden die infektiösen Larven im Dünndarm durch
den Kontakt mit Gallenflüssigkeit aktiviert (JØRGENSEN 1973) und durchdringen
unter Verlust ihrer Scheiden die Dünndarmschleimhaut des Wirtes. Die hierdurch
hervorgerufenen Läsionen führen zu einer subklinischen Enteritis. Über das
Lymphgefäßsystem erreichen die Larven die Mesenteriallymphknoten, wo die
Häutung zur vierten Larve erfolgt (JARRETT et al. 1957). Diese gelangen über den
Ductus thoracicus und die Vena cava cranialis in die rechte Herzkammer, von wo
aus sie über die Arteria pulmonalis das Kapillargebiet der Lunge erreichen. Hier
Literaturübersicht
15
überwinden die Larven die arterio-alveoläre Schranke, häuten sich in den Alveolen
zum geschlechtlich differenzierten, etwa 1 mm großen, fünften Larvenstadium und
ereichen etwa eine Woche post infectionem die Bronchioli und Bronchien
(PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Klinisch ist in dieser Phase lediglich ein leichter
Hustenreiz zu beobachten (PFEIFFER 1971). Die Präpatenzphase, auch alveolarbronchiale Phase genannt, umfasst den Zeitraum vom 8. bis etwa zum 21. Tag p.i. .
Die fünften Larven zeigen ein intensives Größenwachstum und verursachen eine
Entzündung der luftführenden Wege. In der zweiten Woche p.i. sind gelegentlicher
Husten und ein Anstieg der Atemfrequenz feststellbar (PFEIFFER u. SUPPERER
1980). Diese Symptome können wieder abklingen oder sich bei schwerem
Krankheitsverlauf verstärken, sodass Atemfrequenzen von über 70 Atemzüge pro
Minute, frequenter Husten und Dyspnoe zu beobachten sind. In Abhängigkeit von der
Schwere der Erkrankung kommt es zu einer mehr oder weniger weitreichenden
Zerstörung des Zilienbesatzes der Bronchialepithelien mit daraus resultierender
Verminderung der mukoziliären Clearence. Histologisch zeigt sich ein Ersatz des
zerstörten
Bronchialepithels
durch
hyperplastische
Basalzellen,
das
flache
Alveolarepithel wird durch kubische Typ II-Pneumozyten ersetzt. Der vermehrt
gebildete
Schleim
obstruiert
mit
Zelltrümmern
und
Entzündungszellen
die
Bronchiolen, wodurch nachgeschaltete Alveolen atelektatisch werden. Klinisch tritt
Nasenausfluss in Erscheinung (SCHNIEDER et al. 1989). Drei bis vier Wochen p.i.
liegen die ersten geschlechtsreifen Lungenwürmer vor. Männliche Adulte sind 3 bis 4
cm, weibliche 3 bis 8 cm lang (SCHNIEDER 2006). Die Eier werden embryoniert
abgelegt, gelangen über das Flimmerepithel in den Larynx und werden vom Wirtstier
abgeschluckt. Ein geringer Teil wird mit dem Sputum ausgehustet (TAYLOR 1951).
Während der Magen-Darm-Passage schlüpfen die ersten Larven und gelangen mit
dem Kot in die Außenwelt. Die Phase der Patenz ist durch eine Verschlechterung
des klinischen Bildes gezeichnet (JARRETT et al. 1957). Das Allgemeinbefinden der
Tiere ist gestört. Sie zeigen Fieber, Inappetenz und Dyspnoe. Aufgrund der
fortschreitend erschwerten Atmung nehmen die Tiere zur Entlastung eine
sägebockartige Haltung mit nach vorne gestrecktem Kopf ein (MICHEL u. SHAND
1955). Es kommt zu Hustenanfällen und der Nasenausfluss nimmt mukösen
16
Literaturübersicht
Charakter an (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Das histologische Bild zeigt Massen
von in die Alveolen eingewanderten Entzündungszellen. Makrophagen umschließen
Würmer und aspirierte Eier und fließen zu Fremdkörperriesenzellen zusammen
(JARRETT et al. 1957; SCHNIEDER et al. 1989). Aufgrund der erschwerten Atmung
werden die terminalen Bronchioli gedehnt und können reißen. Hierbei kommt es zur
Ausbildung eines interstitiellen Lungenemphysems, das sich weiter ausdehnen kann
und in schweren Fällen als subkutanes Knistern palpierbar ist (JARRETT et al.
1957).
Neben
echten
Sekundärinfektionen
können
sich
im
geschädigten
Lungengewebe auch fakultativ pathogene Keime etablieren, die bereits vor der
Infektion
mit
Lungenwurmlarven
katarrhalisch-eitrige
vorhandenen
Bronchopneumonie,
waren.
wodurch
Die
das
Folge
ist
eine
Infektionsgeschehen
verkompliziert wird (SCHNIEDER et al. 1989). Bei laktierenden Tieren sinkt die
Milchleistung und in der späten Phase der Trächtigkeit kann es zu Aborten kommen
(MICHEL u. SHAND 1955). Acht bis zehn Wochen nach der Infektion sind die
Parasiten eliminiert und die Krankheitssymptome klingen ab. In der Phase der
Postpatenz
nehmen
Ausgangsgewicht
die
zurück
Tiere
wieder
(JARRETT
et
Futter
al.
auf
1957).
und
Je
kehren
nach
zu
ihrem
Ausmaß
der
vorangegangen Schädigung können jedoch respiratorische Symptome in Form von
Husten und erhöhter Atemfrequenz auch noch mehrere Monate anhalten. Bei
massiver Larvenaufnahme durch hochempfängliche Tiere kann es zu einem so
schweren Verlauf kommen, dass die Tiere nach wenigen Tagen sterben (MICHEL u.
SHAND 1955).
Wenn Kühe plötzlich einem hohen Infektionsdruck ausgesetzt werden, z.B. durch
Grasen auf stark kontaminierten Kälberweiden, kann es zum so genannten
Reinfektionssyndrom kommen. Bei unzureichender Immunität gelangen viele Larven
in die Lunge und führen zu einer akuten, schweren Erkrankung.
Werden Larven in der Außenwelt Temperaturen unter 8°C ausgesetzt, tritt nach
Aufnahme durch den Wirt eine Entwicklungshemmung im frühen präadulten Stadium
ein (Hypobiose). Im nächsten Frühjahr wird die Entwicklung fortgesetzt und die Tiere
scheiden erneut Larven aus (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Bezüglich der
Literaturübersicht
17
Mechanismen der Hypobiose soll an dieser Stelle auf die Arbeit von STRUBE (2004)
verwiesen werden.
2.1.3 Epidemiologie und wirtschaftliche Bedeutung
Dictyocaulus viviparus ist weltweit in Gebieten verbreitet, wo es Rinder gibt und
zumindest zeitweise gemäßigte Temperaturen von 15-20°C herrschen. Die Larven
auf den Weiden sind empfindlich gegen Hitze und Trockenheit (JØRGENSEN 1980).
Feuchte Weiden und langes Gras haben einen positiven Einfluss auf die
Überlebenszeit (PFEIFFER u.
SUPPERER
1980;
TAYLOR
1951).
Höhere
Temperaturen beschleunigen die Entwicklung, sodass es bei warmer, feuchter
Witterung zu einer schnellen Anhäufung infektiöser Stadien kommt. Da Rinder es
vermeiden, in unmittelbarer Nähe von Kothaufen zu grasen, ist zur Aufrechterhaltung
der Infektionskette eine Translokation der Larven nötig. Die Larven selbst zeigen
kaum ein gerichtetes Wandervermögen, sodass dieser Prozess über belebte
Vektoren wie Käfer und Vögel oder mechanisch durch Zertreten der Kotfladen
erfolgt. Des Weiteren haben koprophile Pilzen der Gattung Pilobolus eine Bedeutung
bei der Verbreitung der Larven. Die Sporen dieser Pilze wachsen im Rinderkot zu
Hyphen aus und bilden Fruchtträger (Sporangien). Die Larven wandern auf die
Sporangien oder bohren sich basal in diese ein. Bei steigenden Temperaturen und
Lichteinfall explodieren die Sporangien und die Sporen werden mitsamt den Larven
bis zu einem Meter vom Kotfladen weggeschleudert (DONCASTER 1981).
JØRGENSEN et al. (1982) zeigten, dass bei Kälbern, die auf einer Pilobolus-freien
Weide gehalten wurden, die Larvenausscheidung reduziert war und weniger
klinische Symptome auftraten.
Wildwiederkäuer können mit D. viviparus infiziert sein und als Erregerreservoir
dienen (BIENIOSCHEK 1994). In der Regel liegen jedoch Infektionen mit D. eckerti
oder D. capreolus vor. Da Rinder für D. eckerti nur eine sehr geringe und für D.
capreolus
keine
Empfänglichkeit
zeigen,
besteht
hierin
nur
eine
geringe
Infektionsgefahr (BIENIOSCHEK 1994; DIVINA u. HÖGLUND 2002).
Berichte von Ausbrüchen und Prävalenzstudien stammen überwiegend aus den
Ländern Deutschland, Niederlande, England und Schweden. Sporadisch wird über
Ausbrüche in Nordamerika und Kanada berichtet, wobei dies nach Meinung von
18
Literaturübersicht
JOHNSTONE (1998) nicht die tatsächlichen Verhältnisse wiederspiegelt, da der
Erreger aus Unwissenheit häufig nicht diagnostiziert werde.
Grundsätzlich können alle Rinder ohne belastbare Immunität erkranken. Dies sind in
erster Linie erstsömmrige Kälber. Jedoch können auch ältere Tiere betroffen sein, da
eine erlangte Immunität nach etwa einem halben bis einem Jahr wieder verloren
geht, wenn keine Reinfektion stattfindet (DÜWEL 1971; MICHEL u. SHAND 1955).
Prävalenzstudien in Norddeutschland (SCHNIEDER et al. 1993), den Niederlanden
(PLOEGER et al. 2000) und Schweden (HÖGLUND et al. 2004b) zeigten, dass die
Seroprävalenz bei Jährlingsherden bei etwa 40% liegt. Verschiedene Autoren
berichteten in den letzten Jahren von einem vermehrten Vorkommen von
Dictyocauloseausbrüchen, wobei ungewöhnlich häufig Milchkühe betroffen waren.
So verzeichnete VIDA (Veterinary Investigation Diagnosis Analysis) im Jahr 1993
135 Dictyocauloseausbrüche in England und Wales, wobei es sich in 60% der Fälle
um erwachsene Tiere handelte (DAVID 1993). In den Folgejahren verzeichnete VIDA
einen kontinuierlichen Anstieg mit einem Peak von 543 Ausbrüchen Im Jahr 1997.
Bis 2004 schwankte die Zahl der jährlichen Ausbrüche zwischen 250 und 480
(VETERINARY LABORATORIES AGENCY 2006). Diese steigende Prävalenz wird
auf den exzessiven Einsatz von Anthelminthika statt der Vakzinierung und einer
damit verbundenen mangelhaften Immunitätsbildung zurückgeführt (PLOEGER
2002). In Schweden wird vermutet, dass die Zunahme an ökologisch arbeitenden
Betrieben mit dem damit verbundenen Verbot der prophylaktischen Behandlung zur
Erhöhung der Prävalenz in den letzten Jahren geführt hat. HÖGLUND et al. (2001)
fanden bei einer Prävalenzstudie auf Ökobetrieben in Schweden 80% seropositive
Betriebe. In einer späteren Studie konnte dies jedoch nicht bestätigt werden. Bei der
Untersuchung von zehn Herden fand sich nicht ein seropositives Tier (HÖGLUND et
al. 2004b).
Für die Aufrechterhaltung der Infektionskette sind vor allem zwei Faktoren von
Bedeutung. Zum einen können Lungenwurmlarven unter geeigneten Bedingungen
auf den Weiden überwintern (ENIGK u. DÜWEL 1962; JARRETT et al. 1955;
OAKLEY 1979) und im nächsten Frühjahr von empfänglichen Tieren aufgenommen
werden, zum anderen können ältere Tiere den Erreger im hypobiotischen Stadium
Literaturübersicht
19
über den Winter beherbergen und so als symptomlose Ausscheider fungieren, die im
nächsten Frühling die Weiden kontaminieren (MICHEL u. SHAND 1955). EYSKER et
al. (1994) fanden bei einer Pävalenzstudie in den Niederlanden im Frühling bei sechs
von 40 Kuhherden mindestens ein patentes Tier. Die Anzahl positiver Herden nahm
im Laufe der Weidesaison ab, jedoch waren auch im August noch Ausscheider
vorhanden.
Die
Rolle
von
auf
der
Infektionsgeschehen wird klimabedingt
Weide
regional
überwinterten
von
Larven
verschiedenen
im
Autoren
unterschiedlich bewertet (POUPLARD 1968). SCHNIEDER et al. (1989) stellten in
Norddeutschland fest, dass Herden, die vor dem 15.5. ausgetrieben wurden,
signifikant häufiger mit Lungenwürmern infiziert waren als die später ausgetriebenen,
was die Bedeutung der überwinterten Larven unterstreicht. Ebenso wurde aus
England, Schottland und Belgien von überwinterten Larven als Infektionsquelle
berichtet, während diese in Österreich, der Schweiz, in Dänemark, in den
Niederlanden und in Schweden kaum auftreten bzw. für das Infektionsgeschehen
keine große Bedeutung haben (EYSKER et al. 1994; HU et al. 2002; JARRETT et al.
1955; JØRGENSEN 1980; VERCRUYSSE et al. 1998). Typischerweise entwickeln
sich im Laufe einer Weideperiode drei bis vier Lungenwurmgenerationen. Besteht
anfangs ein niedriger Infektionsdruck, werden nur wenige Tiere schwach befallen
und klinische Symptome bleiben aus. Diese Tiere tragen jedoch zu einer
fortschreitenden Kontamination der Weiden bei, sodass es in den folgenden
Generationen zu massiven Infektionen und schweren klinischen Erscheinungen bei
empfänglichen Tiere kommt (DÜWEL 1971; MICHEL u. SHAND 1955). Eine hohe
Besatzdichte erhöht weiterhin den Infektionsdruck (TAYLOR 1951). Aufgrund der
Generationsfolge
werden
die
meisten
Dictyocauloseausbrüche
im
Herbst
verzeichnet.
Neuere
Erkenntnisse
zur
Epidemiologie
der
Dictyocaulose
liefern
populationsdynamische Studien. Die Bestimmung populationsgenetischer Marker in
Dictyocaulus-Isolaten von verschiedenen Farmen in Schweden zeigte, dass
innerhalb eines Isolats eine geringe genetische Vielfalt vorhanden ist, die
Populationen sich untereinander jedoch deutlich unterscheiden (HÖGLUND et al.
2004a; HÖGLUND et al. 2006; HU et al. 2002). Es konnte keine größere Ähnlichkeit
20
Literaturübersicht
zwischen Isolaten von benachbarten Farmen als zwischen Isolaten von weit
entfernten Farmen festgestellt werden. Aufgrund dieses geringen genetischen
Flusses halten die Autoren es für wahrscheinlich, dass Dictyocauloseausbrüche im
Zusammenhang mit Tiertransporten eher so interpretiert werden können, dass
empfängliche Tiere in die Herde eingebracht werden, als dass der Erreger
eingeschleppt wird. Populationsdynamische Studien haben auch Bedeutung für die
Verbreitung von Resistenzen. Aufgrund der gefundenen populationsgenetischen
Strukturen in Schweden vermuten die Autoren, dass im Falle des Auftretens einer
Anthelminthikaresistenz bei Dictyocaulus, die Ausbreitung der Resistenz verzögert
erfolgen würde (HÖGLUND et al. 2004a). Für andere Regionen liegen noch keine
populationsgenetischen Untersuchungen vor, sodass keine Aussagen über die
Allgemeingültigkeit der gefundenen Daten getroffen werden können. Es wird
vermutet, dass die geringe genetische Vielfalt innerhalb der Isolate auch mit der
schlechten Überwinterungsrate der Larven in Schweden zusammenhängt, da hieraus
ein starker Selektionsdruck resultiert (HÖGLUND et al. 2006).
Wirtschaftliche
Verluste
entstehen
durch
Todesfälle,
Lebendmasseverluste,
verringerte Milchleistung und allgemeine Beeinträchtigung der Leistungsfähigkeit
durch chronische Lungenschäden (SCHNIEDER et al. 1989). WOOLEY (1997)
kalkulierte für einen mittelschweren Ausbruch in einer Herde mit 100 Milchkühen
unter der Annahme, dass alle Tiere behandelt werden, einen Verlust von 20.000£.
Hierin einbezogen waren die Kosten für Milchverluste, reduzierte Fertilität,
Behandlung und Totalverluste von erkrankten Tieren und durch Aborte. Allerdings
erfolgte diese Kalkulation unter der Annahme, dass aufgrund der Wartezeit ein
dreitägiger Milchverlust während der Behandlung erfolgt. Da mit der Substanz
Eprinomectin (GIBB et al. 2005) inzwischen ein Präparat ohne Wartezeit zur
Verfügung steht, würde eine Kalkulation zum jetzigen Zeitpunkt moderater ausfallen.
2.1.4 Immunität
Die Ausbildung einer Immunität ist im Infektionsgeschehen der Dictyocaulose von
großer Bedeutung. Nach einer Infektion wird eine belastbare Immunität entwickelt,
deren Grad allerdings schon nach 6 Monaten wieder abnimmt, wenn es
zwischenzeitlich nicht zu einer erneuten Infektion kommt. Dies führt dazu, dass Tiere,
Literaturübersicht
21
die länger als zwölf Monate keinen Kontakt mit dem Erreger hatten, erneut an einer
Infektion erkranken. Dies geschieht unabhängig vom Alter; eine Altersresistenz
besteht nicht. MICHEL (1958) zeigte, dass nach einem Jahr reinfizierte Tiere zwar
nicht patent wurden, sich in der Schwere der klinischen Symptome aber nicht von
den erstmals exponierten Tieren unterschieden.
Die Ausbildung der Immunität verläuft phasenweise. Schon im Stadium der
Larvenwanderung, 8 bis 10 Tage nach Infektion, entwickelt sich eine frühe
Teilimmunität, die durch die Anwesenheit der adulten Stadien verstärkt wird.
PLOEGER u. EYSKER (2002) zeigten, dass die von Larven vermittelte Immunität
abhängig
von
der
aufgenommenen
Larvendosis
ist,
jedoch
die
spätere
Gesamtimmunität unabhängig von der Infektionsdosis ist. In einem früheren
Infektionsversuch konnten EYSKER et al. (2001) zeigen, dass bereits die Applikation
von 30 Larven 35 Tage vor einer Belastungsinfektion zu einer um 80% verringerten
Larvenausscheidung und einer um mehr als 70% verringerten Wurmbürde führte.
Die
genauen
Mechanismen
der
Immunitätsbildung
und
Elimination
der
Parasitenstadien aus der Lunge sind nicht bekannt. Eine Beteiligung humoraler
Komponenten an der Immunantwort wurde schon 1957 von JARRETT et al.
demonstriert. Ihnen gelang die passive Immunisierung von Rindern mit dem Serum
experimentell infizierter Tiere. Auch MCKEAND et al. (1995b) zeigten, dass die
Wurmbürden passiv immunisierter Meerschweinchen signifikant geringer waren als
die einer Kontrollgruppe.
Die Bestimmung der lokalen und peripheren Antikörperspiegel für IgG, IgG1, IgG2,
IgM und IgA in einer Langzeitstudie mit drei Infektionen (Tag 0, 65, 112) zeigte einen
Anstieg aller Antikörperklassen nach jeder Infektion in der bronchoalveolären
Lavageflüssigkeit (BALF), wobei höchste Titer nach der dritten Infektion erreicht
wurden. Im Gegensatz dazu zeigte sich, außer bei IgA, kein Anstieg der
Serumantikörper nach der dritten Infektion, sondern ein kontinuierlicher Abfall. Der
bei allen Infektionen vorhandene frühe Anstieg der schleimhautschützenden IgAAntikörper wird mit der Larvenmigration in Zusammenhang gebracht. Weiterhin
zeigte sich eine Korrelation zwischen Larvenausscheidung und IgG2a(1). Tiere mit
hohen Ausscheidungsraten hatten auch hohe IgG2a(1)-Titer, sowohl im Serum als
22
Literaturübersicht
auch in der BALF. Da die IgG2-Produktion von IFNγ und IL-2 stimuliert wird, wurde
vermutet, dass bei diesen Tieren eine Th1-Antwort vorherrscht (SCOTT et al. 1996).
Die Bedeutung von IgE bei der Immunantwort wurde von KOOYMAN et al. (2002)
demonstriert. Die Autoren zeigten, dass die gesamt IgE-Antikörperspiegel im Serum
nach Reinfektion positiv mit der Protektion gegen eine Belastungsinfektion korreliert
sind, wobei bereits zehn Tage nach Reinfektion ein Anstieg zu verzeichnen war.
Weiterhin war die Ausbildung einer Eosinophilie positiv mit dem IgE-Spiegel, jedoch
nicht mit der Protektion korreliert. Hohe IgE-Spiegel und Eosinophilie sind Ausdruck
einer Th2-Immunantwort, sodass davon auszugehen ist, dass dieser Reaktionstyp
bei der Infektion mit D. viviparus vorherrscht. Eine besondere Bedeutung wird in
diesem Zusammenhang einem Glykanantigen mit Lewisx-Epitop auf der Oberfläche
von D. viviparus beigemessen. Lewisx-Epitope sind eine Hauptkomponente der
Glykokonjugate bei Schistosomen, jedoch ist D. viviparus der einzige Nematode, bei
dem diese Struktur bislang nachgewiesen wurde. Lewisx-Strukturen fungieren als
Immunmodulatoren, indem sie die Th2-Immunantwort fördern und so möglicherweise
die zelluläre Immunantwort des Wirtes auf den Parasiten einschränken (HASLAM et
al. 2000).
Die lokale Cytokinexpression im Lungengewebe, in der Trachea und in den
Bronchiallymphknoten nach experimenteller Infektion wurde von JOHNSON et al.
(2005) untersucht. Die Autoren fanden ein gemischtes Expressionsmuster, da
sowohl die Th2-Cytokine IL-4, IL-5 und IL13, als auch die Th1-Cytokine IL-p35 und
IFNγ am Tag 15 nach der Infektion hochreguliert waren. Dies korrespondiert mit dem
Zeitpunkt der Larvenmigration durch die Lunge. Gegen Ende des Versuchs fielen die
Cytokinspiegel wieder ab und am Tag 42 zeigte sich in der Sektion, dass nur noch
wenige Lungenwürmer in der Lunge vorhanden waren, also eine Erregerelimination
stattgefunden haben musste. Die Serum-IgG1-Spiegel waren hingegen am Ende des
Versuchs am höchsten, also negativ mit der Cytokinantwort korreliert. Ob die Th1Cytokine essentiell für die Immunität sind oder die Th2-Antwort modulieren, ist noch
nicht geklärt.
HAGBERG et al. (2005) untersuchten mononukleäre Zellen in der BALF. Sowohl
nach einmaliger Infektion als auch nach Reinfektion waren γ/δ-TCR-Zellen signifikant
Literaturübersicht
23
erhöht. Dieser Zelltyp erfüllt wichtige Funktionen bei der Regulierung der T- und BZellaktivität sowie bei der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten und der
Produktion von IgE. Eosinophile Granulozyten waren sowohl in der BALF, als auch
im Blut erhöht, wobei nach Reinfektion höhere Spiegel erreicht wurden, als nach
Erstinfektion. Für CD4-, CD8-, CD14- und Ig-Zellen konnten in der BALF keine
signifikanten Unterschiede zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren festgestellt
werden.
Des Weiteren spielen individuelle Unterschiede des Wirtes bei der Antigenerkennung
eine Rolle bei der Immunantwort. BRITTON et al. (1992a) lieferten Hinweise, dass
diese Individualität bei der Antigenerkennung genetischen Ursprungs ist. Die Seren
vakzinierter oder infizierter Rinder wiesen eine deutliche Heterogenität im
Antigenerkennungsprofil
auf.
Dies
war
auch
für
einen
Meerschweinchen-
Auszuchtstamm der Fall. Der Vergleich zweier Inzuchtstämme zeigte eine deutliche
Heterogenität zwischen den Stämmen, jedoch wenig individuelle Unterschiede
innerhalb der Stämme. Ähnliche Beobachtungen konnten auch MCKEAND et al.
(1994a)
bei
Immunisierungsversuchen
mit
stämmen machen. Neben qualitativen
Antikörperrepertoire
waren
die
verschiedenen
Meerschweinchen-
und quantitativen Unterschieden im
Stämme
nach
der
Immunisierung
auch
unterschiedlich gut gegen eine Belastungsinfektion geschützt. Da die Inzuchtstämme
identisch bezüglich des MHC Klasse I Locus waren, wurde vermutet, dass die
Unterschiede auf Gene des MHC II Locus zurückzuführen sind.
2.1.5 Diagnose
Die
Symptome
der
Dictyocaulose
sind
nicht
pathognomonisch.
Leichte
respiratorische Symptome sechs bis acht Wochen nach Weideaustrieb geben zwar
einen Verdacht, erfordern aber weitere Nachweisverfahren. Dies sind zum einen
direkte Verfahren, die den Erreger selbst nachweisen, zum anderen serologische
Verfahren zum Nachweis der Immunantwort auf den Parasiten. Ein häufig
angewandtes Verfahren zum Nachweis der Dictyocaulus-Larven im Kot ist das
Trichterauswanderverfahren nach BAERMANN (1917), bei dem ein mit Kot
beladenes Sieb in einen wassergefüllten, unten verschlossenen Trichter gelegt wird.
Die aktiv aus dem Kot auswandernden Larven sammeln sich am unteren Ende des
24
Literaturübersicht
Trichterhalses und können abgelassen werden. Sensitivität und Spezifität des
Verfahrens hängen von der Art der Probennahme und der Durchführung der
Methode ab. Negativen Einfluss auf die Sensitivität haben lange Lagerung des
Kotes, feste Kotkonsistenz, hohe Temperaturen und kurze Auswanderzeiten. RODE
u. JØRGENSEN (1989) zeigten, dass nach 24stündiger Lagerung bei 20°C die
Auswanderrate im Vergleich zur sofortigen Probenverarbeitung um 60% reduziert ist.
Des Weiteren war nach zehnstündigem Ansatz erst ein sehr geringer Teil der Larven
(<10%) ausgewandert. EYSKER et al. (1994; 1997) zeigten, dass die Methode für
jüngere Tiere eine höhere Sensitivität aufweist als für ältere, da bei letzteren durch
die größere Kotmenge ein Verdünnungseffekt der Larven auftritt. Darüber hinaus
erfolgt die Larvenausscheidung intervallweise und quantitativ unterschiedlich
(BUCHWALDER 1963; DÜWEL 1971). Daher sollte zur Absicherung eines negativen
Ergebnisses die Probennahme an mehreren aufeinander folgenden Tagen
durchgeführt werden Ein erster Nachweis von Larven im Kot kann drei Wochen p.i.
erfolgen (DÜWEL 1971).
Erste serologische Nachweisverfahren wurden in den 50er Jahren entwickelt. Auf
Grundlage eines aus adulten Parasiten gewonnenen Gesamtantigens war ein
Titeranstieg komplementbindender Antikörper vier bis fünf Wochen nach Infektion zu
verzeichnen (CORNWELL 1960; JARRETT et al. 1959). Nach zweimaliger
Applikation einer Vakzine aus röntgenattenuierten Larven konnten keine oder nur
sehr geringe Titer nachgewiesen werden. Patente Infektionen lassen sich ebenfalls
im Agargelpräzipitationstest nachweisen. Allerdings zeigten PARFITT u. SINCLAIR
(1967) Kreuzreaktionen mit D. filaria. BOKHOUT et al. konnten mittels indirektem
Hämaglutinationstest einen Titeranstieg sowohl nach einer Infektion als auch nach
einer Vakzinierung zeigen (BOKHOUT et al. 1979).
Die ersten Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) für D. viviparus erwiesen
sich als sehr sensitiv. Mit dem von MARIUS et al. (1979) vorgestellten indirekten
ELISA auf Grundlage von Adultenantigen war ein Titeranstieg drei (BOON et al.
1982) bis vier (MARIUS et al. 1979) Wochen nach Infektion nachweisbar. Unter
Einsatz von somatischem Antigen aus in vitro kultivierten vierten Larven konnten
BOS u. BEEKMAN ( 1985 ) bereits zwei Wochen p.i. einen signifikanten Titeranstieg
Literaturübersicht
25
nachweisen. DE LEEUW und CORNELISSEN (1991) fanden für den RohantigenELISA Kreuzreaktionen mit Cooperia oncophora, Ostertagia ostertagi, Ascaris suum
und Fasciola hepatica. Den Autoren gelang jedoch die Isolierung eines 17 kDaAntigens aus adulten Würmern, das im ELISA und im Western-Blot nicht mit
Antiseren der genannten Spezies kreuzreagierte. Ein Titeranstieg war mit dem
17 kDa-Antigen vier Wochen p.i. nachweisbar. Der Vergleich eines RohantigenELISAs mit dem 17 kDa-ELISA und einem kompetitiven ELISA, bei dem ein gegen
das 17 kDa-Antigen gerichteter monoklonaler Antikörper eingesetzt wurde, zeigte
eine Sensitivität des Rohantigen-ELISAs von 99%, des 17 kDa-ELISAs von 97% und
der kompetitive ELISA hatte eine 73%ige Sensitivität. Die Spezifität war beim
kompetitiven und beim 17 kDa-ELISA in etwa gleich (97%), im Rohantigen-ELISA mit
67% jedoch wesentlich geringer. Die Seren vakzinierter Tiere reagierten nicht (DE
LEEUW u. CORNELISSEN 1993). Der Vergleich des 17 kDa-ELISAs mit dem
indirekten Hämagglutinationstest (IHA) zeigte für beide eine hohe Spezifität (99,2%
und 99,6%). Die Sensitivität des ELISAs war jedoch mit 100% signifikant höher als
die des IHA (78,1%). Darüber hinaus konnten mit dem ELISA bereits 28-42 Tage p.i.
Antikörper nachgewiesen werden, was mit dem IHA erst nach 42-70 Tagen möglich
war. Mit dem IHA konnten jedoch bis zum Ende des Experiments (Tag 196), mit dem
ELISA nur bis Tag 168 Antikörper nachgewiesen werden. Weiterhin wurde der ELISA
in einem Ringversuch auf seine Reproduzierbarkeit getestet. Zwischen fünf Labors
konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (CORNELISSEN et al.
1997). Die erhaltenen Ergebnisse führten dazu, dass der ELISA 1995 den bis dahin
eingesetzten IHA als Routinetest für die Tiergesundheitsdienste in den Niederlanden
ablöste. Dieser ELISA ist mittlerweile als kommerzieller Kit unter der Bezeichnung
CEDITEST erhältlich.
TENTER et al. (1993) etablierten einen ELISA auf Grundlage von Adultenantigen,
der sich als sehr geeignet für den Einsatz bei epidemiologischen Fragestellungen
erwies. Die Kalkulation von Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem
prädiktivem Wert lieferte die sichersten Ergebnisse für einen Untersuchungszeitraum
von 13 bis 17 Wochen nach Weideauftrieb.
26
Literaturübersicht
Den ersten Einsatz eines rekombinanten Antigens in einem Dictyocaulus-ELISA
beschrieb SCHNIEDER (1992). Hierbei handelte es sich um ein adultenspezifisches
18 kDa Antigen, das als GST-Fusionsprotein exprimiert wurde. Nach experimenteller
Infektion hatte der ELISA sowohl mit Fusionsprotein (DvGST3-14) als auch mit
Thrombin-geschnittenem Protein (Dv3-14) eine Spezifität von >99%. Die Sensitivität
lag bei 93% (DvGST3-14) und 91% (Dv3-14). Bei Feldseren lagen Spezifität und
Sensitivität bei 90 und 85% (DvGST3-14) bzw. >99 und 70% (Dv3-14). Eine
Serokonversion wurde 30 Tage p.i. festgestellt. Auf Basis des rekombinanten
Antigens wurde ein Diagnostik-Schnelltest entwickelt. Grundlage dieses DipstickAssays ist ein optimierter, verkürzter Immunoblot, der bereits nach 90 Minuten ein
Ergebnis liefert. Das Dv3-14-Antigen ist hierbei an Filterpapierstreifen gebunden, die
mit Serum oder auch mit Vollblut beprobt werden. Nach experimenteller Infektion
zeigte der Test eine Spezifität und Sensitivität von mehr als 99% zwischen Tag 30
und 85 p.i.. Die mit Antigen beladenen Filterpapierstreifen zeigten nach
zwölfmonatiger Lagerung bei –20°C bzw. sechswöchiger Lagerung bei 4°C keinen
Verlust
der
Sensitivität
(SCHNIEDER
1993a).
Der
dem
Dipstick-Assay
zugrundeliegende Immunoblot wird in der Routinediagnostik des Instituts für
Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover eingesetzt.
In der Bestimmung der akute Phase Proteine (APP) Haptoglobin, Serum Amyloid A
und Fibrinogen sehen GANHEIM et al. (2004) ein mögliches diagnostisches
Instrument. In Infektionsversuchen wurde gezeigt, dass der durch die Parasiten
verursachte Gewebsschaden in der Lunge zu einem signifikanten Anstieg der APP
führt. Bei gleichzeitigem Vorliegen einer Eosinophilie sehen die Autoren hierin einen
Indikator für das Vorliegen einer Infektion mit Lungenwürmern. Allerdings ist der
Anstieg der APP dosisabhängig und niedrige Spiegel bei gleichzeitiger Eosinophilie
schließen die Infektion nicht aus.
2.1.6 Bekämpfung
Die Bekämpfung der Dictyocaulose kann durch weidetechnische Maßnahmen,
Vakzinierung
und
den
Einsatz
von
Anthelminthika
erfolgen
(ROMMEL
u.
SCHNIEDER 1989). Da eine vollständige Unterbindung der Infektion kaum möglich
ist (SELMAN 1984), besteht das Ziel in der Vermeidung wirtschaftlicher Verluste.
Literaturübersicht
27
Grundsätzlich und besonders in enzootischen Gebieten sollte die Ausbildung einer
protektiven Immunität bei erstsömmrigen Rindern angestrebt werden.
2.1.6.1 Weidetechnische Maßnahmen
Ein später Weideauftrieb kann das Infektionsrisiko signifikant senken, da
überwinterte Larven absterben. Durch Mähen des ersten Aufwuchses zur Heu- oder
Silageverarbeitung
kann
die
Anzahl
vorhandener
Larven
reduziert
werden
(SCHNIEDER u. BELLMER 1993). Da Feuchtigkeit für das Überleben der Larven
notwendig ist, sollten Jungrinderweiden möglichst trocken sein. Die Tiere sollten über
künstliche Tränken versorgt werden, da eine Verbreitung der Larven über
Grabenwasser möglich ist (PFEIFFER 1971). Eine zu hohe Besatzdichte fördert das
Grasen in der Nähe von Kothaufen. Durch Zufütterung kann das Risiko gesenkt
werden (BELLMER 1990). In Gebieten mit geringer Inzidenz kann versucht werden,
die Infektion durch Austrieb auf lungenwurmfreie Weiden zu verhindern. Ein
gemeinsames Weiden von Kälbern und älteren Tieren, die als Ausscheider fungieren
können, sollte grundsätzlich vermieden werden. Auch sollten Kälber nicht auf Weiden
getrieben werden, die vorher von Ausscheidern beweidet wurden. Die in der Literatur
angegebenen Wartezeiten reichen von fünf Wochen bis zu einem Jahr und sind stark
klimaabhängig. Da die ersten Larven mindestens vier Tage brauchen, um
Infektionsreife zu erlangen, kann ein Weidewechsel im Abstand von vier Tagen
massiven
Infektionen
empfängliche
Tiere
vorbeugen
täglich
(POUPLARD
kontrolliert
werden,
1968).
um
Grundsätzlich
beim
ersten
sollten
Auftreten
respiratorischer Symptome eingreifen zu können. Bei gesicherter Diagnose sollte die
ganze Herde behandelt werden (SCHNIEDER et al. 1993).
2.1.6.2 Anthelminthika
Für den pro- und metaphylaktischen Einsatz bei der Bekämpfung der Dictyocaulose
stehen verschiedene Breitbandanthelminthika zur Verfügung. Größte Bedeutung hat
hierbei die Substanzklasse der makrozyklischen Laktone mit den Vertretern
Ivermectin, Doramectin, Moxidectin und Eprinomectin. Injektions- und Pour-onPräparate bewirken eine mindestens 99%ige Reduktion der Wurmbürde für etwa vier
bis sechs Wochen. (EDDI et al. 1993; EPE et al. 1999; GOUDIE et al. 1993;
28
Literaturübersicht
HUBERT et al. 1997; STROMBERG et al. 1999; VERCRUYSSE et al. 1997;
WEATHERLEY et al. 1993; WHELAN et al. 1995). Intraruminale Boli geben den
Wirkstoff kontinuierlich oder intervallweise ab, wodurch die Wirkungsdauer auf etwa
drei bis vier Monate verlängert wird. (SCHNIEDER et al. 1996a). Ein intensiver
Anthelminthikaeinsatz wird von verschiedenen Autoren als Ursache für ein seit den
1990er Jahren vermehrtes Auftreten von Dictyocaulosefällen bei älteren Tieren
genannt (CONNAN 1993; DAVID 1993). Studien zur Immunitätsentwicklung unter
Anthelminthikaeinsatz
führten
zu
gegensätzlichen
Ergebnissen,
wobei
eine
Abhängigkeit vom herrschenden Infektionsdruck vorhanden zu sein scheint. Werden
große Larvenmengen aufgenommen, erhöht sich die Chance, dass einzelne Larven
die Darmwand durchdringen und die Immunitätsbildung stimulieren bevor sie
abgetötet
werden
(PLOEGER
2002).
Bei
geringem
Antigenstimulus
unter
Langzeitbehandlung wird jedoch möglicherweise keine ausreichende Immunität
ausgebildet, sodass starke Infektionen zu einem späten Zeitpunkt zu massiven
Erkrankungen führen können (SCHNIEDER et al. 1998).
2.1.6.3 Vakzinierung
Die
Grundlagen
der
Immunisierung
von
Kälbern
gegen
den
Befall
mit
Lungenwürmern wurden von JARRETT et al. (1957) erarbeitet. Hierauf basierend
wurde eine Lebendvakzine entwickelt, die 1959 auf den Markt kam. Dieser Impfstoff
besteht aus dritten Larven, deren Virulenz durch Röntgenbestrahlung mit 400 Gy
abgeschwächt ist. Das antigene Potential ist erhalten, sodass für einige Monate eine
belastbare Immunität induziert wird (ECKERT 1972). Vor allem in endemischen
Gebieten wird die Impfung erstsömmriger Kälber und älterer Tiere, die länger keinen
Lungenwurmkontakt hatten empfohlen (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Eine
Impfdosis enthält etwa 1000 Larven. Die Verabreichung erfolgt oral zweimal im
Abstand von vier Wochen. Alle Tiere einer Weidegruppe sollten immunisiert werden.
Zum Zeitpunkt der ersten Vakzinierung sollten die Kälber mindestens acht Wochen
alt und gesund sein. Zwischen den Impfungen und drei bis vier Wochen danach
sollten die Tiere aufgestallt bleiben (DÜWEL 1963). Die Vakzine ist für die Tiere
weitgehend unschädlich. Da allerdings ein großer Teil der Larven in die Lunge
einwandert und sich zum Teil zum fünften Stadium entwickelt bevor sie absterben,
Literaturübersicht
29
können sieben bis zwölf Tage nach der Vakzinierung leichter Husten und eine
Erhöhung der Atemfrequenz auftreten (ECKERT 1972). Die Impfung schützt die
Tiere bei einer Reinfektion vor dem Auftreten klinischer Symptome, erzielt aber keine
sterile Immunität. Ein Teil der Tiere scheidet in geringem Maße Larven aus, wodurch
eine gewisse Weidekontamination stattfindet. Dies ist notwendig, da die durch die
Impfung erlangte Immunität durch natürliche Infektionen aufgefrischt werden muss.
Ohne diesen Boostereffekt würde die Immunität lediglich drei bis fünf Monate
anhalten (MICHEL u. MACKENZIE 1965). Die Vakzine ist bei 2 bis 4°C zehn bis
vierzehn Tage haltbar. Fehlerhafte Aufbewahrung und Verwendung überalteter
Vakzine, aber auch die Impfung zu junger Tiere und ein zu langer Abstand zwischen
Vakzinierung und Austrieb können zum Versagen der Impfung führen. Erkrankungen
wie infektiöse Pneumonien anderer Genese oder ein starker Befall mit Magen-DarmStrongyliden können zu Störungen der Immunitätsbildung oder zu einem
Impfdurchbruch führen. Deshalb sollte eine Bekämpfung der Magen-Darm-Parasiten
immer mit einbezogen werden (ECKERT 1972).
Im Zuge der Problematik des vermehrten Auftretens von Dictyocaulosefällen bei
erwachsenen Tieren (siehe Punkt 2.1.6.2) wurde der Einsatz der Vakzine bei
Rindern während der ersten Trächtigkeit und Laktation untersucht. HOLZHAUER et
al. (2005) konnten keinen negativen Einfluss der Vakzine auf die Trächtigkeit und
Milchproduktion feststellen. Die Larvenvakzine kann also auch bei Jungrindern sicher
angewendet werden, wenn deren Immunitätsstatus fragwürdig ist und in einem
Problembestand Erkrankungsfälle bei adulten Tieren aufgetreten sind.
Eine Studie zum Einsatz der Larvenvakzine bei Rotwild in Neuseeland zeigte, dass
bei dieser Spezies keine zufriedenstellende Effektivität gegeben ist. Weder bei den
mit D. viviparus, noch den mit D. eckerti infizierte Tieren zeigten die vakzinierten
Tiere eine signifikant niedrigere Larvenausscheidung. Eine gewisse Protektivität war
gegeben, da die vakzinierten Tiere signifikant weniger Würmer in den Lungen
aufwiesen (JOHNSON et al. 2003).
Die Lungenwurmvakzine wird von der Firma Schering Plough Animal Health unter
dem Handelsnamen Dictol® und von Intervet unter der Bezeichnung Bovilis®
vertrieben. Zur Zeit hat die Vakzine keine Zulassung in Deutschland.
30
Literaturübersicht
2.1.6.4 Biologische Bekämpfung
Ein mögliches Instrument zur biologischen Bekämpfung stellt der nematophage Pilz
Duddingtonia flagrans dar. Dieser Pilz wurde aus Rinderkot isoliert und ist in der
Lage, Nematodenlarven in einem Hyphennetz zu immobilisieren und zu zerstören
(LARSEN 1999). HENRIKSEN et al. (1997) fanden nach Zusatz von 50.000
Chlamydosporen/g Kot eine Reduktion der D. viviparus-Larven um durchschnittlich
86%. Nach LARSEN (1999) könnte der Pilz als Futterzusatzstoff oder in Form von
Lecksteinen eingesetzt werden und durch Reduktion der infektiösen Larven auf der
Weide klinische Erkrankungen vermeiden.
Auf Neuseeländischen Wildfarmen wurde die Beobachtung gemacht, dass Tiere,
denen Chicoree gefüttert wurde, weniger wurmbelastet waren als Tiere auf
normalem Grasland. Als hierfür verantwortliche Substanzen wurden kondensierte
Tannine und Sesquiterpen Lakton identifiziert. Diese Stoffe haben durch einen noch
nicht bekannten Mechanismus hemmenden Einfluss auf die Motilität der larvalen
Stadien. Im Larven-Migrations-Inhibitions-Test führten Konzentrationen, wie sie auch
bei der Fütterung erreicht werden, bis zu einer 73%igen Inhibition (MOLAN et al.
2003).
2.2 Antigene und Immunisierungsversuche bei D. viviparus
Die ersten näher bei D. viviparus untersuchten Enzyme waren Proteasen. REGE et
al. (1989) identifizierten in Extrakten von adulten D. viviparus eine Cysteinprotease
mit der in vitro Fähigkeit Typ I-Kollagen und Hämoglobin zu lysieren. Es wurde
vermutet, dass das Enzym eine Rolle bei der Nahrungsaufnahme des Parasiten
spielt und eventuell am Pathomechanismus der Infektion beteiligt ist. In von BOS et
al. (1989) durchgeführten Immunisierungsversuchen wurden Meerschweinchen
zweimal im Abstand von vier Wochen mit je 100 µg aufgereinigter Cysteinprotease
bzw. Wurmextrakt und Freund’s inkompletem Adjuvans (FIA) intramuskulär
immunisiert. Zwei Wochen nach der Boosterimpfung erfolgte die Belastungsinfektion.
Die Cysteinprotease-immunisierten Tiere zeigten eine signifikante Reduktion der
Wurmbürde um 42%. Bei den Wurmextrakt-immunisierten Tieren war eine Reduktion
um 66% vorhanden. In einem Rinderimmunisierungsversuch war dieser Effekt nicht
Literaturübersicht
31
konstant reproduzierbar. BRITTON et al. (1992b) untersuchten Extrakte von dritten
Larven und Adulten und lösliche Komponenten, die vom Parasiten an die Umgebung
abgegeben werden (excretory-secretory-products, ES-Produkte) auf proteolytische
Aktivitäten. Mit Hilfe spezifischer Inhibitoren identifizierten sie Serin-, Cystein- und
Metalloproteasen, wobei die ES-Produkte eine höhere proteolytische Aktivität
aufwiesen. In den Adulten-ES-Produkten wurden die Enzyme von Serum IgGAntikörpern vakzinierter oder infizierter Rinder erkannt und inhibiert, jedoch nicht in
den Wurmhomogenaten. In den Larvenextrakten reagierten nur Serum IgGAntikörper vakzinierter Tiere. Dies spricht dafür, dass die somatischen Proteasen
normalerweise nicht für das Immunsystem zugänglich sind, jedoch bei der
Immunisierung frei werden, da attenuierte Larven vermehrt absterben.
MCKEAND et al. (1995b) führten Meerschweinchenimmunisierungsversuche mit
Extrakten aus adulten D. viviparus und dritten Larven sowie mit ES-Produkten von
Adulten durch. Es zeigte sich, dass nur die mit Adulten-ES-Produkten immunisierten
Tiere
signifikant
besser
geschützt
waren
als
die
Kontrollgruppe.
Die
Meerschweinchen wurden zweimal im Abstand von vier Wochen subkutan
immunisiert. In der ersten Immunisierung wurden 60 µg Protein mit einem
equivalenten Volumen Freund’s komplettem Adjuvans (FCA) eingesetzt. Die zweite
Vakzinedosis bestand aus 100 µg Protein mit FIA. Vier Wochen nach der zweiten
Impfung erfolgte die Belastungsinfektion mit 3000 L3. Sechs Tage später wurden die
Tiere seziert. In der mit ES-Produkten immunisierten Gruppe war die Anzahl fünfter
Larven
um
85,5%
reduziert.
In
einer
zweiten
Versuchsreihe
wurden
Meerschweinchen passiv immunisiert, um die protektive Rolle von Antikörpern bei
der
Immunantwort
zu
untersuchen.
Hierzu
wurde
von
mit
ES-Produkten
immunisierten oder mit dritten Larven infizierten Meerschweinchen Serum gewonnen
und anderen Meerschweinchen intraperitoneal appliziert. Eine Stunde nach der
Seruminjektion wurden die Tiere mit 6000 L3 infiziert. Bei der Sektion war sowohl in
der Gruppe, die das Anti-L3-Serum erhalten hatte, als auch in der Anti-ES-Gruppe
die Wurmbürde signifikant reduziert. Im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die Serum
nicht immunisierter und nicht infizierter Tiere erhalten hatte, war eine Reduktion von
79,7% bzw. 64,6% vorhanden.
32
Literaturübersicht
Ein Enzym, das bereits in den ES-Produkten diverser parasitischer Nematoden
nachgewiesen wurde und dem große Bedeutung bei der Immunabwehr des Wirtes
beigemessen wird, ist die Acetylcholinesterase (AChE). Es konnte gezeigt werden,
dass AChEs von Nematoden sezerniert werden, jedoch konnte die biologische
Bedeutung der sezernierten Formen noch nicht vollständig geklärt werden. Es wird
davon ausgegangen, dass durch die Hydrolyse des wirtseigenen Acetycholins
Funktionen blockiert werden, die zur Parasitenabwehr beitragen. Hierzu zählen
Darmperistaltik und Schleimsekretion, aber auch Effekte des Acetylcholins auf Zellen
des
Immunsystems
wie
Neutrophilenchemotaxis,
Mastzelldegranulation
und
Lymphozytenproliferation (MCKEAND et al. 1994b; MCKEAND et al. 1995a).
MCKEAND et al. (1994b) konnten in Extrakten und ES-Produkten adulter D.
viviparus Acetylcholinesteraseaktivität nachweisen, wobei in ES-Produkten eine
200fach höhere Aktivität vorhanden war als in den Extrakten. Hieran zeigte sich,
dass es sich bei der Acetylcholinesterase (AChE) um ein von D. viviparus
sezerniertes Enzym handelt. Vergleiche mit dritten und vierten Larven wiesen darauf
hin, dass das Protein erst in einem späten Entwicklungsstadium produziert wird. Bei
dritten Larven konnte keine, bei vierten Larven nur eine geringe AChE-Aktivität
nachgewiesen werden. Nach gelelektrophoretischer Trennung und Färbung der
Extrakte und ES-Produkte wurden fünf Isoformen des Enzyms identifiziert, die alle
mit Serum IgG von natürlich und experimentell infizierten Rindern reagierten,
wodurch ihre Antigenität demonstriert wurde. Das Enzym reagierte jedoch nicht mit
dem Serum von mit röntgenattenuierten Larven vakzinierten Kälbern, was die
Autoren darauf zurückführten, dass nicht genügend Larven ein Entwicklungsstadium
erreichen, in dem ausreichend AChE produziert wird, um eine Immunantwort
hervorzurufen. Dass es sich bei den fünf Isoformen um Produkte verschiedener
Gene handelt, konnten Sequenzanalysen und Aktivitätsessays für zwei Formen
bestätigen (LAZARI et al. 2003; SELKIRK et al. 2005). Weiterhin wurde eine
gewebsständige Form der AChE identifiziert (LAZARI et al. 2004). Das protektive
Potential der AChE wurde in einem Immunisierungsversuch überprüft (MCKEAND et
al. 1995a). Meerschweinchen wurden mit einer AChE-angereicherten Fraktion der
adulten ES-Produkte immunisiert. Eine weitere Gruppe erhielt nicht angereichertes
Literaturübersicht
33
ES-Produkt. Die Impfdosen enthielten 80 µg Protein beim nicht angereicherten ESProdukt und 20 µg bei der angereicherten Fraktion sowie FIA bei der ersten und FCA
bei der zweiten Immunisierung. Acht Wochen nach der zweiten Impfung wurden die
Tiere mit 6000 L3 infiziert. Die mit der AChE-angereicherten Fraktion immunisierte
Gruppe wies eine signifikante Reduktion der Wurmbürde im Vergleich zur AdjuvansKontrollgruppe auf (-64,8%). Im Gegensatz zum vorangegangen Immunisierungsversuch mit ES-Produkten (MCKEAND et al. 1995b) zeigte jedoch die mit nichtangereicherten ES-Produkten immunisierte Gruppe keine signifikante Reduktion der
Wurmbürde (-43,4%). Die Autoren führten dies auf das veränderte Versuchsprotokoll
zurück. Da nicht ausreichend Larven zur Verfügung standen, erfolgte die Infektion
acht
statt
vier
Wochen
nach
der
zweiten
Immunisierung.
In
einem
Rinderimmunisierungsversuch mit rekombinanter AChE und Adulten-ES-Produkten
konnte das protektive Potential der AChE nicht bestätigt werden (MATTHEWS et al.
2001). Für diesen Versuch wurde eine 10% kürzere Teilsequenz der AChE in einen
Expressionsvektor kloniert und als His-getagtes Fusionsprotein in E. coli exprimiert.
Die Immunogenität des rekombinanten Proteins wurde durch die Reaktion mit dem
Serum Dictyocaulus-infizierter Rinder und mit dem Serum von mit ES-Produkten
immunisierten Meerschweinchen bestätigt. Die rekombinante AChE wies jedoch
keine AChE-Aktivität auf. Im Immunisierungsversuch erhielt eine Gruppe zweimal im
Abstand von vier Wochen 100 µg des aufgereinigten Fusionsproteins mit FIA. Eine
weitere Gruppe Kälber wurde mit ES-Produkten immunisiert. Die Challengeinfektion
erfolgte acht Wochen nach der zweiten Impfung. Obwohl die Tiere AChE-spezifische
Antikörper bildeten, zeigte keine der beiden Immunisierungsgruppen eine Reduktion
der Wurmbürde im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Fusionsprotein-immunisierte
Gruppe hatte mit 97 Würmern sogar eine höhere mittlere Wurmbürde als die
Kontrolltiere, bei denen im Durchschnitt 80 Würmer vorhanden waren. Mögliche
Ursachen
für
den
fehlgeschlagenen
Versuch
sehen
die
Autoren
in
der
Versuchsdurchführung, aber auch im Enzym selbst. Rechtliche Grundlagen machten
es notwendig, statt FCA wie in den vorhergegangen Versuchen, FIA als Adjuvans
einzusetzten. Andere Autoren hatten bei einem Wechsel von FCA zu FIA ebenfalls
einen Verlust des protektiven Potentials beobachtet. Weiterhin führten die Autoren
34
Literaturübersicht
auf, dass es sich bei der rekombinant hergestellten AChE nicht um ein vollständiges
Transkript handelte und dass die Expression in E. coli aufgrund inkorrekter Faltung
zu einem Verlust wichtiger immunogener Epitope geführt haben könnte. Insgesamt
halten die Autoren die AChE nicht für einen geeigneten Vakzinekandidaten.
Das Vorhandensein stadienspezifischer Oberflächenantigene wurde von BRITTON
et al. (1993) demonstriert. Mit dem Serum vakzinierter Rinder konnte die Oberfläche
bescheideter L3 erkannt werden, jedoch nicht die von Adulten, Eiern und ersten
Larven. Letztere Stadien wurden jedoch von Serumantikörpern patent infizierter
Rinder detektiert. Dies zeigt, dass Adulte, Eier und erste Larven Oberflächenantigene
besitzen, für die vakzinierte Tiere keine Antikörper bilden, da es hier nicht zur
Ausbildung
einer
patenten
Infektion
kommt.
Weiterhin
demonstriert
das
Vorhandensein von Antikörpern gegen Obeflächenantigene von bescheideten L3,
dass die infektiösen Stadien bei der Penetration der Darmwand ihre Scheide nicht
abstreifen bzw. dass zumindest ein ausreichender Anteil die Scheide behält und eine
Immunantwort im Wirt hervorruft. Mittels monoklonaler Antikörper identifizierten
GILLEARD et al. (1995b) ein immunodominantes Antigen auf der Oberfläche der
Scheide von dritten Larven. Dieses 29-40 kDa große Protein erwies sich als
innerhalb strongylider Nematoden konserviert, da der monoklonale Antikörper auch
Oberflächenproteine der Scheide diverser anderer Spezies detektierte. Jedoch
detektierten Seren von mit gastrointestinalen Nematoden (H. contortus, C.
oncophora, O. ostertagi) infizierten Tieren dieses Antigen nicht, was von den Autoren
darauf zurückgeführt wird, dass diese Parasiten während ihres Lebenszyklus im
Verdauungstrakt verbleiben (GILLEARD et al. 1995a). Ob dieses Antigen ein
effektives Ziel der Immunabwehr des Wirtes ist oder, da die Scheide frühzeitig
während der Migration abgestreift wird, Teil der Strategie des Parasiten ist, den
Immunmechanismen auszuweichen, konnte nicht geklärt werden.
Ein weiteres Antigen, dem eine wichtige Funktion im Infektionsgeschehen
beigemessen wird, wurde von BRITTON et al. (1994) identifiziert. Die Autoren
wiesen in ES-Produkten und Extrakten von Adulten und dritten Larven SuperoxidDismutase-Aktivität
Umwandlung
von
nach.
zwei
Superoxid-Dismutasen
Superoxidanionen
(O2-)
(SOD)
in
katalysieren
die
Wasserstoffperoxid
und
Literaturübersicht
35
molekularen Sauerstoff. Superoxidanionen werden während des „oxidatory burst“
von Phagozyten freigesetzt und schädigen Krankheiterreger durch die Oxidation von
Membranen, Proteinen und Nukleinsäuren. Es wird davon ausgegangen, dass
Parasiten SOD synthetisieren, um diese toxischen Substanzen zu neutralisieren. Bei
D. viviparus identifizierten BRITTON et al. (1994) mehrere Isoformen des Enzyms,
die alle ein Kupfer-Zink-Abhängigkeit aufwiesen. Nur eine Isoform war sowohl in den
ES-Produkten als auch in den Adulten- und Larven-Extrakten vorhanden. Eine
weitere, nur in ES-Produkten vorhandene Isoform wies darauf hin, dass die SOD
tatsächlich von D. viviparus sezerniert wird. Die SOD-Aktivität konnte durch SerumIgG von infizierten und vakzinierten Rindern inhibiert werden.
Ein immunodominantes Protein mit möglicher Rolle bei der Lungenpathologie im
Verlauf der D. viviparus Infektion wurde von BRITTON et al. (1995) in somatischen
Extrakten und ES-Produkten identifiziert und charakterisiert. Das DvA-1 (D. viviparus
Antigen-1) weist Ähnlichkeiten zum ABA-1 von A. suum auf. Von diesem ist bekannt,
dass es zu den Hauptallergenen des Parasiten gehört und eine IgE-Antwort
induziert. Ferner konnte bei Brugia malayi infizierten Patienten eine Korrelation
zwischen IgE-Reaktion auf das Allergen und der Entwicklung pathologischer
Veränderungen gezeigt werden. In einem Schafmodel zur Untersuchung der lokalen
Immunmechanismen in der Lunge nach Antigenapplikation zeigten COLLIE et al.
(2001), dass Schafe, die vorher durch systemische Applikation des rekombinanten
DvA-1 sensibilisiert worden waren, auf die lokale Applikation des Antigens mit einem
starken Anstieg an neutrophilen und eosinophilen Granulozyten in der BALF sowie
mit einer lokalen Antikörperproduktion reagierten (siehe auch Punkt 2.1.4). Dies
bestätigt die Rolle des DvA-1 im Pathomechanismus der Lungenwurminfektion. Als
Vakzinekandidat ist dieses Antigen wahrscheinlich nicht geeignet, da mit einer
Sensibilisierung gerechnet werden muss.
BRITTON u. MURRAY (2002) identifizierten bei D. viviparus eine innerhalb der
Nematoden konservierte Cathepsin L Protease. In C. elegans konnte gezeigt
werden, dass dieses Enzym essentiell für die Embryonalentwicklung ist. RNAInterferenz (RNAi) des Gens führte bei 98% der Embryonen zum Stillstand der
36
Literaturübersicht
Embryonalentwicklung in einer frühen Phase (HASHMI et al. 2002). Ob die
Cathepsin L Protease immunogenes Potential hat, wurde nicht gezeigt.
KÖHRMANN (2002) immunisierte Rinder mit in E. coli exprimiertem Major Sperm
Protein (MSP) (SCHNIEDER 1993b). Die Wurmbürde war in der immunisierten
Gruppe um 71% niedriger. Dieses Ergebnis war jedoch aufgrund der geringen
Tierzahl in der Impfgruppe (n = 3) statistisch nicht signifikant.
Um neue Vakzinekandidaten zu identifizieren, trennten MATTHEWS et al. (2004)
Adulten-ES-Produkte mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese auf und testeten
diese
im
Immunoblot.
Hierbei
wurden
Seren
von
drei
verschiedenen
Meerschweinchenstämmen eingesetzt, die nach Immunisierung mit ES-Produkten
eine Unterschiedliche Empfänglichkeit für Belastungsinfektionen gezeigt hatten.
Durch Vergleich der von den Seren im Immunoblot erkannten Spots wurden sieben
Spots identifiziert, die nur mit den Seren von Meerschweinchen reagierten, die nach
einer Immunisierung mit ES-Produkten signifikant geschützt waren. Bei der MALDITOF-Analyse dieser Spots wurde ein Protein als Major Sperm Protein, MSP;
(SCHNIEDER 1993b) identifiziert. Die Fingerprints der übrigen Proteine zeigten
keine signifikanten Ähnlichkeiten mit Sequenzen anderer Nematoden. Die Autoren
beabsichtigen Proteinsequenzierungen dieser Spots durchzuführen, um degenerierte
Primer für die Amplifikation der Kandidaten konstruieren zu können (MATTHEWS et
al. 2004).
2.3 Die Protein Disulfid Isomerase (PDI)
Die Protein Disulfid Isomerase wurde erstmals von GOLDBERGER et al. (1963) in
Rattenleberlysaten identifiziert. Nachdem die PDI auch aus Humangeweben und
diversen weiteren eukaryotischen Spezies isoliert werden konnte, wird heute davon
ausgegangen, dass es sich um ein ubiquitär vorhandenes Protein handelt. Die PDI
ist ein multifunktionales Enzym mit Hauptfunktionen bei der Ausbildung und
Modifikation von Disulfidbrückenbindungen sowie als molekulares Chaperon und
Untereinheit zweier Enzymkomplexe.
Literaturübersicht
37
2.3.1 Struktur der PDI und PDI-ähnlicher Enzyme
Neben der PDI existieren eine Reihe strukturell und funktionell ähnlicher Enzyme, die
in der Familie der Protein Disulfid Isomerasen zusammengefasst werden. Die
Enzymfamilie der humanen PDIs zählt bis heute 14 Mitglieder und drei weitere, nicht
publizierte Sequenzen sind in Datenbanken zu finden (ELLGAARD u. RUDDOCK
2005). Aufgrund der Sequenzidentität der in dieser Arbeit identifizierten PDIs soll im
folgenden Überblick in erster Linie auf die PDI selbst und auf das nahe verwandte
Enzym Erp57 intensiver eingegangen werden.
Allen Protein Disulfid Isomerasen gemeinsam ist das Vorkommen mindestens einer
Thioredoxin-ähnlichen Domäne, womit sie zur Thioredoxin-Superfamilie gehören.
Thioredoxin ist ein ubiquitär vorkommendes Protein mit einer Größe von etwa 100
Aminosäuren. Das Enzym besteht aus einer einzelnen Domäne mit einer zentralen
fünfsträngigen β-Faltblattstruktur, die von vier α-Helices umgeben ist. Die beiden
Cysteine des aktiven -Cys-Gly-Pro-Cys-Zentrums können eine intramolekulare
Disulfidbrücke ausbilden, womit das Molekül an diversen Redoxreaktionen beteiligt
ist (MARTIN 1995). Bereits die erste Sequenzierung der PDI aus Rattenleber-cDNA
durch Edman et al. (1985) führte zur Aufstellung eines Vier-Domänen-Modells. Es
wurden zwei Sequenzbereiche mit hoher Ähnlichkeit zueinander und zu Thioredoxin
identifiziert. Diese als a und a’ bezeichneten Bereiche wiesen beide die
Aminosäurenabfolge -Trp-Cys-Gly-His-Cys-Lys- auf, und es wurde vermutet, dass es
sich um die aktiven Zentren des Enzyms handelt. Des Weiteren fanden sich im
mittleren Teil des Proteins zwei Sequenzbereiche b und b’, die gewisse Ähnlichkeit
zueinander aufwiesen, für die jedoch zuerst keine Identität zu anderen Proteinen
identifiziert werden konnte. Die Autoren konnten mit ihrer Strukturanalyse nicht das
gesamte Protein abdecken. Weitere Studien führten zur Aufstellung eines SechsDomänen-Modells mit der Struktur a-e-b-b’-a’-c (FREEDMAN et al. 1994). Aufgrund
der Identität zu einer Östrogen-bindenden Domäne des humanen Östrogenrezeptors
wurde zwischen der a- und der b-Domäne eine e-Domäne vermutet. Dieses Konzept
wurde jedoch wieder verworfen und zur ursprünglichen vier-Domänen-Struktur
zurückgekehrt, wobei die Domänengrenzen allerdings anders als ursprünglich
definiert wurden (KEMMINK et al. 1997). Zusätzlich zu diesen vier Domänen findet
38
Literaturübersicht
sich am C-Terminus ein Sequenzbereich überwiegend saurer Aminosäurereste
(PIHLAJANIEMI et al. 1987). Die biologische Bedeutung dieser als c-Domäne
bezeichneten Struktur ist nicht bekannt. Am C-Terminus befindet sich weiterhin die
Sequenz
–KDEL,
(HAUGEJORDEN
bei
et
der
al.
es
sich
1991).
um
ein
Klonierung
ER-Retentionssignal
der
einzelnen
handelt
Domänen
und
Aktivitätsstudien konnten schließlich bestätigen, dass es sich bei den schon von
Edman et al. 1985 beschriebenen aktiven Zentren um eben solche handelt
(HAWKINS u. FREEDMAN 1991).
Kernresonanzspektroskopie (NMR, nuclear magnetic resonance) brachte weitere
Einblicke in die Struktur der Domänen. KEMMINK et al. lieferten 1996 ein
dreidimensionales Bild der a-Domäne, 1997 folgte die Darstellung der b-Domäne
(KEMMINK et al. 1996; KEMMINK et al. 1997). Die a-Domäne zeigt eine typische
Thioredoxin-ähnliche β-Faltblatt-α-Helix-Struktur: β-α-β-α-β-α-β-β-α. Obwohl die bDomäne keinerlei Sequenzidentitäten zu Thioredoxin aufweist, zeigt auch sie einen
diesem Molekül ähnlichen dreidimensionalen Aufbau. Aufgrund der Sequenzidentität
der a- und a’-Domänen sowie der b- und b’-Domänen ist es wahrscheinlich, dass die
PDI aus vier Thioredoxin-ähnlichen Strukturen besteht, von denen zwei katalytisch
aktive Zentren besitzen (KEMMINK et al. 1997). Die Bedeutung des Vorkommens
katalytisch inaktiver Strukturen konnte noch nicht vollständig geklärt werden, es
konnte jedoch gezeigt werden, dass sich in der b’-Domäne eine Peptidbindungsstelle
befindet. Phylogenetische Arbeiten zeigten, dass die molekulare Evolution der PDIs
von einem Enzym mit zwei Thioredoxin-Domänen ausging (KANAI et al. 1998;
MCARTHUR et al. 2001; PEDONE et al. 2004). Die vier-Domänen-Struktur
entwickelte sich möglicherweise aus internen Genverdoppelungen, die im Laufe der
Zeit ihre Homologie verloren, aber die Faltung beibehielten. Bis heute existiert kein
vollständiges dreidimensionales Bild der PDI. Die Analyse der genomischen
Sequenz zeigte, dass die humane PDI aus elf Exons und zehn Introns besteht
(TASANEN et al. 1988).
Die anderen Mitglieder der PDI-Familie unterscheiden sich von der PDI im
Vorkommen
und
der
Anzahl
katalytisch
aktiver
und
inaktiver
Domänen.
Literaturübersicht
39
Die folgende Abbildung zeigt einen Überblick aller bis heute identifizierten Mitglieder
der humanen PDI-Familie.
a
CGHC
b
b‘
a‘
CGHC
CGHC
KDEL
PDI
CGHC
CGHC
QEDL
ERp57
CGHC
CTHC
KEEL
PDIp
CGHC
CGHC
KEEL
ERp72
SKQS
SKKG
KEEL
PDILT
KVEL
ERp27
KEEL
PDIr
KEEL
ERp28
KDEL
ERdj5
KDEL
P5
EDEL
ERp18
RDEL
ERp44
KDEL
ERp46
?
TMX
KKDK
TMX2
KKKD
TMX3
?
TMX4
CSMC
CSHC
CPPC
CGPC
CGHC
CHPC
CPHC
CGPC
CGPC
CGPC
CRFS
CGHC
CGHC
CPAC
SNDC
CGHC
CPAC
Abb. 1:
CGHC
Schematische Darstellung der PDI-Familie. (Modifiziert
nach ELLGAARD u. RUDDOCK 2005).
40
Literaturübersicht
ERp57 (in älterer Literatur und bei anderen Spezies auch als ERp60 bezeichnet)
weist die größte Ähnlichkeit zur PDI auf. Die Domänenorganisation ist gleichartig
gestaltet (FERRARI u. SOLING 1999). Dabei weisen die a und a’-Domänen
ebenfalls die aktiven Zentren -CGHC- auf, ERp57 fehlt jedoch die C-terminale saure
Sequenz und die ER-Retentionssequenz weist die Variante –QEDL auf.
PDIp ist eine im Pankreas vorkommende Isoform der PDI mit 66%iger Ähnlichkeit zur
PDI auf Aminosäurenebene (DESILVA et al. 1996) und gleicher Domänenstruktur
(FERRARI u. SOLING 1999), wobei jedoch ein aktives Zentrum zu -CTHCmodifiziert ist. Weitere Unterschiede bestehen im ER-Retentionssignal, welches bei
PDIp die Sequenz –KEEL aufweist (DESILVA et al. 1996). Während in älterer
Literatur davon ausgegangen wird, dass es sich bei der PDIp um eine
pankreasspezifische Isoform handelt, konnten CONN et al. (2004) die PDIp in
dopaminergen Neuronen im menschlichen Gehirn nachweisen. Eine erhöhte PDIpExpression wird hier mit dem Auftreten von Lewy-Körperchen bei der Parkinson
Krankheit in Verbindung gebracht.
ERp72 weist am 5’-Ende eine zusätzliche a-Domäne mit gleichem -CGHC-Motiv auf.
Am N-Terminus befindet sich ein Bereich aus 42 vorwiegend sauren Aminosäuren
(FERRARI u. SOLING 1999).
ERp27 und ERp28 weisen keine a-Domänen-ähnlichen Bereiche auf. NMRStrukturanalysen zeigten für das ERp28-Homolog in der Ratte (ERp29) eine bDomänen-ähnliche Faltung am 5’-Ende und einen C-terminalen Bereich mit rein
helicaler Struktur. Im Menschen hat das ERp28 ein Molekulargewicht von 28 kDa
(LIEPINSH et al. 2001).
Die von HAYANO u. KIKUCHI 1995 identifizierte PDIr weist drei a-Domänenähnliche Strukturen auf, von denen lediglich eine die -CGHC-Sequenz der PDI
besitzt.
ERjd5 (CUNNEA et al. 2003) weist vier der a-Domäne ähnliche Bereiche auf.
Zusätzlich befindet sich N-terminal ein Sequenzbereich mit Homologie zu DnaJ.
DnaJs sind Proteine, die funktionell mit Chaperonen kooperieren.
Die übrigen Mitglieder der PDI-Familie weisen eine bis drei a-Domänen auf, wobei
die aktiven Zentren zum Teil Modifikationen aufweisen. Im ERp44 ist das C-
Literaturübersicht
41
terminale, im TMX2 das N-terminale Cystidin gegen Serin getauscht. Die zentralen
Aminosäuren werden bei ERp44 durch Arginin (R) und Phenylalanin (F), bei TMX
durch Prolin (P) und Alanin (A), bei TMX2 durch Asparagin (N) und Asparaginsäure
(D) und bei TMX4 durch Prolin (P) und Serin (S) verkörpert.
2.3.2 Funktionen der PDI
Die Erstbeschreibung durch GOLDBERGER et al. (1963) identifizierte die PDI als
den Katalysator der Disulfidbrückenbildung bei der Faltung von RNAse A. Inzwischen
wurden diverse weitere Funktionen dieses
ubiquitär
vorhandenen
Enzyms
beschrieben. Neben Oxidation, Reduktion und Isomerisation erfüllt die PDI auch
redoxunabhängige Funktionen bei der Faltung von Proteinen. Des Weiteren fungiert
sie als Untereinheit zweier Enzymkomplexe.
2.3.2.1 Redox-Isomerase-Funktion der PDI
Die Grundlage der Redoxaktivität der PDI bilden die aktiven Zentren der a- und a’Domäne. Die beiden Cysteine des -CGHC-Motivs können entweder eine
intramolekulare Disulfidbindung ausbilden (oxidierte PDI), oder als Dithiol vorliegen
(reduzierte PDI). Oxidierte PDI vermag Reduktionsäquivalente von einem Dithiol
aufzunehmen und kann somit Disulfidbrücken in ein Substratprotein einfügen.
Reduzierte PDI kann umgekehrt eine Disulfidbindung angreifen und entweder das
Disulfidsubstrat zu einem Dithiol reduzieren oder in einer Isomerisationsreaktion zu
einer intramolekularen Verschiebung der Disulfidbindung führen (HAWKINS u.
FREEDMAN 1991).
Welcher Reaktionstyp wann in vivo stattfindet, konnte noch nicht abschließend
geklärt werden (ELLGAARD u. RUDDOCK 2005), fest steht jedoch, dass diverse
Faktoren hierauf Einfluss nehmen. Zum einen spielt das Redoxpotential der
Umgebung und damit das zur Verfügungstehen von Reduktionsequivalenten eine
Rolle. Andererseits nimmt die Struktur der aktiven Seite selbst, vor allem die Identität
der beiden Aminosäuren zwischen den Cysteinen und Aminosäuren in der
unmittelbaren Umgebung der aktiven Seite, Einfluss auf das Redoxpotential des
aktiven Zentrums. Studien zeigten, dass eine Mutation der aktiven -CGPC-Seite des
Thioredoxins, das seinerseits eher als Reduktant wirkt, zur aktiven -CGHC-Seite der
42
Literaturübersicht
PDI die oxidativen Fähigkeiten des Thioredoxins zehnfach erhöht (LUNDSTROM et
al. 1992).
Mutationsstudien der a und a’ aktiven Seiten zeigten, dass jedes Aktivitätszentrum
50% der Gesamtaktivität der PDI ausmacht, was für ein unabhängiges Agieren der
beiden Zentren spricht (VUORI et al. 1992a). Es zeigte sich jedoch, dass ein
Vorhandensein aktiver Domänen nicht für das volle Reaktionsspektrum ausreicht.
Indem sie die katalytischen Aktivitäten der Einzeldomänen und von verschiedenen
Domänenkombinationen untersuchten, zeigten DARBY et al. (1998), dass einfache
Oxidationsreaktionen
nur
der
a-
und
a’-Domäne
bedürfen,
für
einfache
Isomerisationen zusätzlich die b’-Domäne benötigt wird, und Isomerisationen, die
einen
ausgeprägten
Konformationswechsel
im
Substrat
erfordern,
nur
bei
Vorhandensein aller vier Domänen vonstatten gehen.
2.3.2.2 Die PDI als Untereinheit der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase (C-P4H)
Das Enzym Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase katalysiert die für die Ausbildung der
Tripelhelixstruktur
von
Kollagenen
essentielle
Hydroxylierung
von
Prolinen
(MYLLYHARJU 2003). In Vertebraten stellt das Enzym ein Tetramer aus zwei α- und
zwei β-Untereinheiten dar. Das Gesamtmolekulargewicht des Komplexes beträgt
ca. 240 kDa, wobei auf die α-Untereinheiten je 63 kDa, auf die β-Untereinheiten je
55 kDa entfallen. In Vertebraten existieren drei verschiedene Isoformen der αUntereinheiten: α(I) , α(II) (ANNUNEN et al. 1997; HELAAKOSKI et al. 1995) und
α(III) (VAN DEN DIEPSTRATEN et al. 2003), die jeweils mit der gleichen βUntereinheit Tetramere bilden. Als Hauptform tritt in den meisten Geweben das
[α(I)]2β2-Tetramer, auch als Typ I C-P4H bezeichnet, auf, während die Typ II C-P4H,
ein [α(II)]2β2-Tetramer, nur etwa 30% ausmacht (ANNUNEN et al. 1997). 1987 wurde
herausgefunden, dass es sich bei der β-Untereinheit um PDI handelt (KOIVU et al.
1987; PIHLAJANIEMI et al. 1987). Die isolierten Untereinheiten hatten keine C-P4HAktivität, und es konnte durch Inaktivierung der aktiven Seiten der PDI gezeigt
werden, dass für eine vollständige C-P4H-Aktivität keine Redox-Isomerase-Aktivität
der PDI notwendig ist. Jedoch entfaltet die intakte PDI im C-P4H-Komplex 50% der
Wildtyp-Aktivität in der Reaktivierung von „scrambled“ RNAse (reduzierte und
denaturierte RNAse) (KOIVU et al. 1987). Dies konnte durch Inaktivierung der C-
Literaturübersicht
43
terminalen aktiven Seite der PDI verhindert werden, nicht jedoch wenn die Nterminale aktive Seite inaktiviert wurde. Dies spricht dafür, dass das N-terminale
aktive Zentrum der PDI in P4H-Komplex nicht zugänglich ist. Diese Fakten und die
Tatsache, dass die isolierten α-Untereinheiten unlösliche Aggregate bilden und
inaktiv sind (HELAAKOSKI et al. 1995; VEIJOLA et al. 1994; VUORI et al. 1992b;
VUORI et al. 1992c), sprechen dafür, dass die PDI im C-P4H-Komplex in erster Linie
die Funktion erfüllt, die α-Untereinheiten in löslicher Form zu halten. Darüber hinaus
wird vermutet, dass die PDI für das Zurückhalten der C-P4H im Endoplasmatischen
Retikulum verantwortlich ist, da die α-Untereinheiten selbst kein ER-Retentionssignal
besitzen (VUORI et al. 1992c). VEIJOLA et al. (1996b) vermuten jedoch, dass die
PDI noch weitere Aufgaben bezüglich der Struktur und Funktion der C-P4H haben
muss. Ihnen gelang mit der Koexpression der α-Untereinheiten zusammen mit dem
molekularen Chaperon BiP die Formung eines löslichen Komplexes, der aber keine
Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität
besaß.
In
diesem
Zusammenhang
zeigte
PIRNESKOSKI (2003), dass für die Bildung eines aktiven Tetramers nur die b’- und
a’-Domäne notwendig sind, eine volle Aktivität aber nur mit Konstrukten erreicht wird,
die alle Domänen beinhalten.
Die essentielle Bedeutung der PDI bei der Kollagensynthese konnte im Nematoden
Caenorhabditis elegans gezeigt werden (siehe Kapitel 2.3.4).
2.3.2.3 Chaperon-Funktion und Anti-Chaperon-Funktion der PDI
WANG u. TSOU stellten 1993 erstmals die Hypothese auf, dass die PDI neben der
Redox-Isomerase-Funktion
auch
ungefalteten
als
Proteinen
als
Chaperon
Faltungshelfer,
fungiert.
wobei
Chaperone
nur
dienen
nicht-kovalente
Wechselwirkungen beeinflusst werden. Durch das spezifische Interagieren mit
aggregationsanfälligen Proteinen wird deren Aggregation verhindert.
Die Arbeitsgruppe lieferte weitere Beweise für die Chaperon-Funktion der PDI, indem
sie den Einfluss der PDI auf die Reaktivierung zweier Proteine, die keine Disulfide
enthalten, zeigten: GAPDH (CAI et al. 1994) und Rhodanese (SONG u. WANG
1995) zeigen beide nach Denaturierung nur eine langsame, spontane Reaktivierung.
Im Beisein von PDI wird die Ausbeute an renaturiertem Protein stark erhöht.
Weiterhin zeigte die Arbeitsgruppe, dass dieser Effekt unabhängig vom aktiven
44
Literaturübersicht
Zentrum ist, indem sie die Cysteine der -CGHC-Sequenz durch Alkylierung
inaktivierten (QUAN et al. 1995). Darüber hinaus zeigten sie, dass die
Chaperonaktivität der PDI auch bei der Faltung von Proteinen, die Disulfidbindungen
enthalten, von Bedeutung ist (YAO et al. 1997).
Um die Funktion als Faltungshelfer ausführen zu können, muss die PDI in der Lage
sein, Peptide zu binden oder mit ihnen zu interagieren. Erste Berichte über eine
mögliche Peptidbindungsstelle finden sich bei NOIVA et al. (1993). Diese sollte die
letzten drei Aminosäuren der a’-Domäne und den größten Teil der c-Domäne
beinhalten. In diesem Zusammenhang demonstrierten DAI u. WANG (1997), dass
die Deletion der c-terminalen 51 Aminosäuren der PDI die Rückfaltung denaturierten
Lysozyms verhindert. Zu einem anderen Ergebnis kamen PIRNESKOSKI et al.
(2004). Hier wurde in Deletionsstudien gezeigt, dass die c-Domäne keine Rolle bei
den Funktionen der PDI als Chaperon spielt, sondern das Ende der a’-Domäne
essentiell ist. Eine zweite Peptidbindungsstelle wurde 1998 von KLAPPA et al.
identifiziert. Sie konnten zeigen, dass die b’-Domäne ausreicht, um kurze Peptide zu
binden, die Bindung langer Substrate jedoch das Vorhandensein der anderen
Domänen erfordert. Ein 28-Aminosäurenfragment konnte von einem b’-a’-c- oder ab-b’-Konstrukt , „scrambled“ RNAse jedoch nur von einem a-b-b’-a’-Konstrukt effektiv
gebunden werden.
Die Chaperon-Funktion der PDI verhindert eine Aggregation von Proteinen.
Allerdings scheint die PDI unter bestimmten Bedingungen einen gegenteiligen Effekt
zu haben. PUIG u. GILBERT (1994) demonstrierten, dass reduziertes, denaturiertes
Lysozym in der Gegenwart niedriger Konzentrationen PDI stark aggregiert, hohe
PDI-Konzentration jedoch zu einer effektiven Faltung führen. Es wird vermutet, dass
bei Proteinen, die eine Eigentendenz zur Selbstassoziation besitzen, niedrige PDIKonzentrationen die Quervernetzung fördern. Die Autoren sehen hierin eine Analogie
zur klassischen Immunopräzipitation. Bei hohen PDI-Konzentrationen - analog zum
Antikörperexzess - erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass ein ungefaltetes Protein
an ein noch freies PDI-Molekül bindet und eine Quervernetzung verhindert wird.
Literaturübersicht
45
2.3.2.4 Die PDI als Untereinheit des mikrosomalen Triglycerid-TransferProteins (MTP)
WETTERAU et al. (1990) identifizierten die kleinere Untereinheit des mikrosomalen
Triglycerid-Transfer-Proteins (MTP) als PDI. Das MTP ist ein αβ-Heterodimer mit
Funktionen im Triglyceridtransport zwischen Membranen.
Wie bei der C-P4H scheint die PDI auch hier den Komplex in Lösung zu halten, denn
Studien
mit
den
isolierten
Untereinheiten
zeigten,
dass
die
PDI
keine
Lipidtransferaktivität besitzt und die α-Untereinheit allein funktionslos ist und
unlösliche Aggregate bildet (WETTERAU et al. 1991). LAMBERG et al. (1996)
zeigten fernerhin, dass die Aktivität des MTP-Dimers unabhängig von der RedoxFunktion der PDI ist, indem sie die aktiven Seiten der PDI zu -SGHC- modifizierten.
Die Koexpression dieser redoxinaktivierten PDI und der α-Untereinheit resultierte in
einem aktiven Dimer. Bezüglich der Rolle der PDI bei der Assoziation der beiden
Untereinheiten zeigten RICCI et al. (1995), dass die C-terminalen 30 Aminosäuren
essentiell für die Interaktion sind. Zusätzlich fanden WETTERAU et al. (1990)
heraus, dass die PDI im MTP nur sehr wenig Redox-Isomerase-Aktivität bei der
Reaktivierung reduzierter, denaturierter RNAse entfaltet. Dies könnte darauf
hindeuten, dass die aktiven Zentren der PDI im MTP-Komplex nicht zugänglich sind.
2.3.2.5 Funktionen des ERp57
Trotz hoher Ähnlichkeiten zur PDI, konnte gezeigt werden, dass ERp57 nicht in der
Lage ist, die PDI im C-P4H-Komplex strukturell oder funktionell zu ersetzen
(KOIVUNEN et al. 1996). OLIVER et al. zeigten, dass ERp57 eine Rolle bei der
Faltung von Glycoproteinen spielt. (OLIVER et al. 1997). Ein in den Nematoden C.
elegans (NATSUKA et al. 2001) und Dirofilaria immitis (CHANDRASHEKAR et al.
1998) identifiziertes ERp57-Homolog weist neben der PDI-Aktivität noch eine
Transglutaminaseaktivität auf. Transglutaminasen katalysieren die Quervernetzung
von
Glutamin-
und
Lysinresten,
(ESCHENLAUER u. PAGE 2003).
was
zur
Gewebestabilisierung
beiträgt
46
Literaturübersicht
2.3.2.6 Weitere Funktionen der PDI
YAMAUCHI et al. (1987) fanden heraus, dass ein von CHENG et al. (1986)
identifiziertes Trijodthyronin-bindendes Protein (THBP) identisch mit der PDI ist. Die
physiologische Bedeutung dieser Entdeckung ist unklar.
Weiterhin zeigt die PDI ein hohes Kalziumbindungsvermögen (MACER u. KOCH
1988). KRISHNA RAO u. HAUSMAN (1993) zeigten, dass die PDI identisch mit
Retina-Cognin ist, einem Protein, das in die Zellerkennung und neuronale
Differenzierung der embryonalen Retina involviert ist.
2.3.3 Lokalisation der PDI außerhalb des ER
Trotz des vorhandenen ER-Retentionssignals wurden die PDIs PDI, ERp57 und
ERp72 auch in nicht-ER-Lokalisationen identifiziert. Für die PDI wurde eine Sekretion
aus Hepatozyten (TERADA et al. 1995), exokrinen Pankreaszellen (YOSHIMORI et
al. 1990), Endothellzellen (HOTCHKISS et al. 1998) und Blutplättchen (CHEN et al.
1992), für ERp72 und ERp57 von Zellkulturen bei Überexpression beschrieben
(DORNER et al. 1990; HIRANO et al. 1995). Wie die PDIs trotz des
Retentionssignals aus dem ER entweichen können, ist nicht bekannt. Verschiedene
Mechanismen werden diskutiert, wie z.B. Übersättigung des Rückhalteapparates,
Entfernung der KDEL-Sequenz oder Sekretion durch Komplexbildung mit anderen
Molekülen (JOHNSON et al. 2001). Des Weiteren wurden PDIs bei verschiedenen
Zellen auf der Zelloberfläche detektiert. TERADA et al. (1995) vermuten, dass die
PDI nach Sekretion durch elektrostatische Interaktionen an die Zelloberfläche bindet.
Grundsätzlich scheinen die Thioredoxindomänen auf der Zelloberfläche reduzierende
Aktivität zu entfalten, so dass Disulfidbrücken in Molekülen, die auf der
Zelloberfläche vorhanden sind oder mit dieser in Kontakt kommen, reduziert oder
isomerisiert werden (MANDEL et al. 1993). Obwohl die Rolle des daraus
resultierenden vermehrten Vorkommens an Thiolen an der Zelloberfläche nicht
geklärt ist, konnte ihre Bedeutung bei verschiedenen physiologischen und
pathologischen Mechanismen beschrieben werden. So ist z.B. die Aktivierung von
Blutplättchen von einem Auftreten von Thiolgruppen abhängig (BURGESS et al.
2000). Eine pathologische Bedeutung konnte beim Zellinvasionsmechanismus des
Literaturübersicht
47
HIV-Virus gezeigt werden. Dieser ist von der Reduktion von Disulfidbrücken eines
viralen Hüllglycoproteins abhängig und die PDI konnte bei dieser Reaktion als
reduzierendes Agens identifiziert werden (FENOUILLET et al. 2001). Des Weiteren
konnte ERp72 auf der Neutrophilenoberfläche (WEISBART 1992) und ERp57 auf der
Spermienmembran (BOHRING et al. 2001) lokalisiert werden. Außerdem wurden für
die PDI und ERp57 Lokalisationen im Cytosol und im Nucleus beschrieben
(TURANO et al. 2002).
2.3.4 PDIs bei Helminthen
Die erste Beschreibung einer PDI bei Nematoden findet sich bei WILSON et al.
(1994). Die Autoren isolierten beim Durchmustern einer Onchocerca volvulus cDNABank mit L3-Antiserum aus Kaninchen einen Klon mit hoher Ähnlichkeit zur PDI
anderer Spezies. Der offene Leserahmen hat eine Länge von 1491 bp und es
konnten die bei anderen PDIs beschriebenen aktiven Regionen mit der Sequenz
-CGHC- identifiziert werden. Die Aminosäurensequenz zeigt eine hydrophobe
Signalsequenz, jedoch kein KDEL-ER-Retentionssignal. Auf Aminosäureebene hat
die O. volvulus-PDI eine 50%ige Identität zur humanen PDI. Aufgrund der bei
anderen Spezies beschriebenen Rolle der PDI bei der Kollagensynthese vermuten
die Autoren, dass die PDI bei O. volvulus eine Hauptfunktion in der Biosynthese der
Kutikula besitzt. Die Kutikula der Nematoden besteht aus einem Netzwerk von
Kollagenmolekülen, das über intramolekulare Disulfidbrücken stabilisiert wird (COX
1992). Passend zur aufgestellten Hypothese konnten WILSON et al. (1994) mittels In
situ Hybridisierung hohe mRNA-Spiegel in sich entwickelnden Mikrofilarien
detektieren, wobei das Signal mit zunehmender Reifung der Mikrofilarien schwächer
wurde. In adulten Weibchen konnten Signale nur in der Hypodermis, dem
Syntheseort der Kutikulabestandteile, detektiert werden. Der Nachweis der PDIExpression mittels Immunhistochemie korrespondierte mit den Ergebnissen der In
situ Hybridisierung. Weiterhin konnten die Autoren bei 16% von 108 patent O.
volvulus infizierten Patienten Antikörper gegen PDI detektieren. Aufgrund des
fehlenden ER-Retentionssignals vermuten die Autoren, dass eine weitere ERständige PDI bei O. volvulus vorkommt, bzw. räumen ein, dass möglicherweise ein
anderer ER-Retentionsmechanismus vorliegt.
48
Literaturübersicht
EPE et al. (1998) identifizierten mittels Immunoscreening ein Fragment der PDI aus
A. caninum. Das rekombinant hergestellte Protein hatte ein Molekulargewicht von
etwa 38 kDa und reagierte im Western-Blot mit dem Antiserum experimentell mit
A. caninum L3 infizierter Kaninchen und mit Antikörpern gegen hydrophile Proteine
des Darms, der Zephal- und der Zervikaldrüsen adulter Würmer. Antiserum von mit
1000 L3 perkutan infizierten Hunden zeigte keine Reaktion im Western Blot, jedoch
gelang eine Detektion mit Antiserum von mit 100.000 L3 infizierten Hunden. Die
Aminosäuresequenz des identifizierten Klones zeigte eine 82%ige Identität mit einem
334 Aminosäuren-Segment der PDI aus C. elegans und eine 73%ige Identität mit
einem 334 Aminosäuren großen Abschnitt der PDI aus O. volvulus. Die Autoren
vermuten, dass die PDI während der Hautpenetration und der Gewebsinvasion
freigesetzt wird. Die von EPE et al. (1998) identifizierte Teilsequenz wurde von POHL
(2006) vervollständigt. Dabei ergab sich eine 1784 bp lange Sequenz. Der offene
Leserahmen codiert für ein Protein aus 493 Aminosäuren, das zwei hochkonservierte
Thioredoxin-Domänen aufweist und ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa besitzt.
Auf Aminosäuren-Ebene zeigt die PDI eine 92%ige Identität zur PDI2 von Ostertagia
ostertagi, eine 82%ige Identität zur PDI2 von C. elegans und eine 74%ige Identität
zur PDI von Brugia malayi. Die genomische Sequenz beinhaltet vier Introns der
Längen 431 bp 104 bp, 425 bp und 170 bp. Das C-terminale Ende der PDI von
A. caninum weist eine HTEL-Sequenz auf, wobei es sich um eine Modifikation des
Standard-ER-Retentionssignals KDEL handelt, welches als ebenso effektiv bei der
Zurückhaltung eines Proteins im ER gilt (ANDRES et al. 1990). Aufgrund der hohen
Identität der PDI von A. caninum zur PDI2 von O. ostertagi und diverser außerhalb
des ER nachgewiesener Proteine mit KDEL-Signal, hält POHL es jedoch für
wahrscheinlich, dass die PDI von A. caninum ebenfalls sezerniert wird (POHL 2006).
Eine
von
CHANDRASHEKAR
et
al.
(1998)
bei
D.
immitis
identfizierte
Transglutaminase (TGase) zeigte keine Homologie zu anderen TGasen, aber zeigte
eine 43-52%ige Identität mit ERp60 (=ERp57) von verschiedenen Spezies. Mit
Serum von mit rekombinanter Transglutaminase immunisierten Kaninchen konnten
die Autoren das Protein in Extrakten von dritten und vierten Larven, von Adulten und
in ES-Produkten von Larven und Adulten mittels Immunoblot nachweisen. Darüber
Literaturübersicht
49
hinaus konnte die Bedeutung des Enzyms für die Kutikulasynthese demonstriert
werden (CHANDRASHEKAR et al. 2002). Durch den Einsatz von TGase-Inhibitoren
wurde der Schlupf von dritten zu vierten Larven verhindert. Weiterhin zeigten die
Autoren mittels Immunhistochemie die Lokalisation der TGase in der Hypodermis, im
Darmepithel, in Muskelzellen und in Embryonen.
VERCAUTEREN et al. (2003) identifizierten eine Protein Disulfid Isomerase beim
Durchmustern einer cDNA-Bank des Trichostrongyliden Ostertagia ostertagi. Diese
zeigt auf Aminosäurenebene eine 88%ige Identität zur PDI von S. mansoni. Eine
weitere PDI bei O. ostertagi, als PDI2 bezeichnet, wurde von GELDHOF (2003)
identifiziert. Die Sequenz zeigt ebenfalls zwei Thioredoxin-Domänen mit der aktiven
Seite –WCGHCK-. Am N-Terminus konnte eine Signalsequenz identifiziert werden,
und der C-Terminus weist das modifizierte ER-Retentionssignal -HTEL auf. Auf
Aminosäureebene zeigt sich eine höchste Identität zur PDI2 von C. elegans (78%).
Im Western Blot konnte das Protein mit Kaninchen-Antiserum gegen L4- und
Adultenantigen im Extrakt von L3, L4 und Adulten nachgewiesen werden. Darüber
hinaus konnte die PDI im exkretorisch-sekretorischen (ES) Material adulter Würmer
und vierter Larven identifiziert werden. Ebenso gelang die Detektion mit dem Serum
O. ostertagi infizierter Kälber. Mittels Immunhistochemie konnte die PDI in Teilen der
Hypodermis, des Darms und des Pharynx adulter Parasiten und vierter Larven
nachgewiesen werden. Bei dritten Larven konzentrierte sich die Färbung auf die
Darmzellen. Darüber hinaus testeten die Autoren affinitätsaufgereinigte O. ostertagi
PDI2-Antikörper auf Kreuzreaktion an Extrakten und ES-Material von adulten
Cooperia oncophora Würmern. Im Western-Blot zeigte sich eine etwa 56 kDa große
Bande im Extrakt, jedoch nicht im ES-Material dieses nahe verwandten Parasiten. In
der Immunhistochemie wurden ähnliche Lokalisationen identifiziert wie bei O.
ostertagi. Aufgrund der hypodermalen Lokalisation der PDI in Ostertagia vermuten
die Autoren eine ähnliche Bedeutung bei der Kutikulasynthese wie diese bei C.
elegans demonstriert werden konnte (WINTER u. PAGE 2000). Die Bedeutung der
PDI im Darm konnte nicht geklärt werden. Es wird vermutet, dass auch Nematoden
ein dem MTP ähnliches Lipidtransportsystem im Darm besitzen, bei dem die PDI
eine Rolle spielt. Unterstützt wird diese Hypothese durch die Identifikation eines
50
Literaturübersicht
Proteins in C. elegans mit Homologie zum humanen MTP (GELDHOF 2003).
Aufgrund der Detektion der PDI in ES-Material spekuliert der Autor über eine
mögliche Sekretion der PDI trotz des vorhandenen ER-Retentionssignals und räumt
ein, dass die PDI möglicherweise für eine immunologische Kontrolle der Ostertagiose
geeignet sei. Allerdings gelang es ihm nicht, ausreichend PDI für einen
Immunisierungsversuch aufzureinigen.
VEIJOLA et al. (1996a) exprimierten zwei PDIs in C. elegans und zeigten deren
funktionelle Unterschiede. Die erste PDI (als PDI/β bezeichnet) wies eine 61%ige,
die zweite (als PDI Isoform bezeichnet) eine 44%ige Identität mit der humanen PDI
(PDI/β) auf. Die beiden identifizierten PDIs untereinander waren zu 48% identisch.
Hauptunterschiede waren in der c-Domäne zu finden, sowohl im Vergleich mit der
humanen
PDI
als
auch
zwischen
den
beiden
C.
elegans
PDIs.
In
Koexpressionsstudien der humanen und der C. elegans PDI/β mit der humanen bzw.
C. elegans α(I)-Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase zeigte sich, dass sowohl die
humane PDI/β als auch die C. elegans PDI/ β mit der humanen α(I)-Untereinheit ein
aktives α2β2-Tetramer, mit der C. elegans α-Untereinheit jedoch ein aktives αβ-Dimer
bildet. Der Grund für Tetramer- oder Dimerbildung wurde daher in der
C. elegans α-Untereinheit vermutet. Das Entfernen eines nur bei C. elegans
vorhandenen C-terminalen Extensionsbereiches der α-Untereinheit führte zur
vollständigen Aufhebung der Dimerbildung, allerdings wurde mit dieser verkürzten αUntereinheit auch kein Tetramer gebildet. Dies spricht dafür, dass der C-terminale
Bereich zwar in die Dimerbildung involviert ist, aber noch andere strukturelle
Unterschiede in der α-Untereinheit bestehen müssen, die über eine Dimer- oder
Tetramerbildung entscheiden. Außerdem wurde gezeigt, dass die Prolyl-4Hydroxylasebildung mit der humanen PDI/β sehr viel katalytisch effektiver ist als mit
der C. elegans PDI/β. Der Grund hierfür wurde in den unterschiedlichen c-Domänen
vermutet. Die Konstruktion eines PDI/β-Hybrids, bestehend aus dem vorderen
C. elegans Abschnitt und der humanen c-Domäne, führte zu einer Steigerung der
Prolyl-4-Hydroxylasebildung im Vergleich zur reinen C. elegans PDI/β. Umgekehrt
führte der Austausch der c-Domäne der humanen PDI/β gegen die C. elegans
c-Domäne zu einer verringerten Prolyl-4-Hydroxylaseformation. Allerdings konnte die
Literaturübersicht
51
Anwesenheit der humanen c-Domäne in der C. elegans PDI/β die C-P4H-Formation
nicht zu einem Maß steigern, wie es mit der unmodifizierten humanen PDI/β
beobachtet wurde. Bezüglich der zweiten identifizierten PDI (PDI Isoform) zeigten die
Autoren, dass diese zwar gleiche Redox-Isomerase-Aktivität wie die humane PDI/β
besitzt, jedoch weder mit der humanen, noch mit der C. elegans α-Untereinheit CP4H bildet. Darüber hinaus besitzt diese PDI in der aktiven Seite der a-Domäne die
unübliche Sequenz -CVHC-. Die als PDI/β bezeichnete Form wird in GenBank und
späterer Literatur als PDI2, die hier als Isoform bezeichnete PDI als PDI1
weitergeführt. Nach der Identifikation eines zweiten für die C-P4H-α-Untereinheit
kodierenden Gens (phy-2) konnte gezeigt werden, dass die C-P4H auch bei
C. elegans überwiegend als Tetramer vorkommt. Allerdings handelt es sich hierbei
um ein, im Gegensatz zu Vertebraten, gemischtes Tetramer der Form PHY-1/PHY2/(PDI2)2. Daneben existieren Dimere der PDI2 mit beiden α-Untereinheiten
(MYLLYHARJU et al. 2002). Die essentielle Bedeutung der PDI2 im C-P4H-Komplex
für die Viabilität von C. elegans konnte von WINTER u. PAGE (2000) demonstriert
werden. Mittels RNA-Interferenz zeigten die Autoren, dass das Ausschalten des
PDI2-Gens zu embryonaler Mortalität führt. Die Embryonen entwickelten sich normal
bis zur Ausbildung der ersten Kutikula. Hierbei verloren sie ihre normale Morphologie
und starben. Die Autoren zeigten weiterhin, dass die Expression der PDI2 in den
hypodermalen Zellen wellenförmig verläuft, wobei die vier Expressionsspitzen
während der Entwicklung mit der Ausbildung der vier Scheiden korrespondierten. Ein
weiterer Expressionspeak war bei Adulten vorhanden, was möglicherweise für eine
zusätzliche Funktion der PDI2 bei Adulten spricht, da dieser Expressionspeak nicht
bei der α-Untereinheit der C-P4H vorhanden war und somit wahrscheinlich nicht mit
der Kutikulasynthese in Verbindung gebracht werden kann.
Ein weiteres von NATSUKA et al. (2001) identifiziertes PDI-ähnliches Enzym mit
Homologie zu ERp57 zeigte neben der Redox-Isomeraseaktivität ebenfalls
Transglutaminaseaktivität. ESCHENLAUER u. PAGE (2003) zeigten für das von
ihnen als PDI3 bezeichnete ERp57-Homolog eine vergleichbare Lokalisation wie bei
D. immitis. RNAi hatte auf den C. elegans Wildtyp keinen Effekt, bei Mutanten mit
instabiler
Kutikula
konnten
jedoch
massive
morphologische
Veränderungen
52
Literaturübersicht
hervorgerufen werden. Dies lässt vermuten, dass die Transglutaminaseaktivität der
PDI3 zur Stabilisierung der Kutikula beiträgt. Weiterhin konnten die Autoren auch für
die
beiden
anderen
C.
elegans
PDIs
und
für
die
humane
PDI
eine
Transglutaminaseaktivität feststellen. Es wird vermutet, dass es sich um eine
allgemeine Funktion der PDIs handelt.
Im humanpathogenen Trematoden S. mansoni identifizierten FINKEN et al. (1994)
eine PDI, die das Produkt eines single copy Gens zu sein scheint. Der offene
Leserahmen der identifizierten Sequenz hat eine Länge von 482 Aminosäuren und
weist die zwei charakteristischen Thioredoxin-ähnlichen Sequenzbereiche mit den
aktiven
Seiten
-CGHC-
sowie
eine
C-terminale
KDEL-Sequenz
auf.
Die
Schistosomen-PDI zeigte eine 48%ige Identität mit der humanen PDI. Die
evolutionäre Konservierung dieses Gens zeigt sich auch in der Struktur der
genomischen Sequenz. Die sieben identifizierten Introns befinden sich an exakt den
gleichen Positionen wie im humanen PDI-Gen. Mittels Immunhistochemie und In situ
Hybridisierung identifizierten die Autoren die Gastrodermis, die Wandzellen der
Protonephridia und die Sustentaculumzellen
im
Hoden
als
Orte
höchster
Genexpression. Es wird vermutet, dass das konzentrierte Auftreten der PDI in diesen
Geweben mit deren sekretorischer Aktivität korreliert, wie dies für die PDI der
Vertebraten (FREEDMAN 1989) gezeigt werden konnte.
SALAZAR-CALDERON et al. (2003) identifizierten eine PDI des Trematoden F.
hepatica beim Durchmustern einer adulten cDNA-Expressionsbank mit KaninchenAntiserum gegen exkretorisch-sekretorisches Material. Der offene Leserahmen der
cDNA codiert für ein 489 AS großes Protein mit einem Molekulargewicht von 55 kDa.
Im Immunoblot mit Antiserum gegen das rekombinante Protein zeigte sich eine
Bande ähnlicher Größe im exkretorisch-sekretorischen Material adulter Parasiten. Im
ELISA mit rekombinanter PDI als Antigen zeigten experimentell mit F. hepatica
infizierte Kaninchen PDI-spezifische Antikörper zwischen Tag 21 und Tag 28 p.i..
Maximale Antikörperkonzentrationen wurden bis Tag 35 erreicht. Da die PDI von F.
hepatica im ES-Material identifiziert wurde, vermuten die Autoren eine extrazelluläre
Lokalisation des Proteins trotz des vorhandenen ER-Retentionssignals HEEL. Es
Literaturübersicht
53
wird darüber spekuliert, dass die PDI eine Rolle im Verteidigungskonzept gegen den
oxidativen Stress, den dieser Parasit in seinem Lebensraum Wirtsleber erfährt, spielt.
54
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Puffer und Lösungen
AP-Puffer:
100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 x 6 H20,
100 mM Tris-HCl, pH 9,5 in A. bidest.
BCIP-Stocklösung:
50 mg/ml 5-Brom-4-Chloro-3-Indolylphosphat in 100%igem Dimethylformamid
Blotpuffer für Westernblot:
24 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol
in A. bidest.
Coomassie-Blue Stammlösung:
0,1% Brilliant blue R 250
Coomassie-Fixier-Färbelösung:
40%
Methanol,
10%
Eisessig,
10%
0,01%-ige Coomassie-Blue Stammlösung,
40% A. bidest.
Coomassie-Entfärbelösung:
10% Eisessig, 90% A. bidest.
DEPC-Bidest:
0,1% Diethylpyrocarbonat in A. bidest.
ELISA-Substrat:
12,5 ml A. bidest., 6,075 ml Zitratpuffer,
6,425 ml Phosphatpuffer, 10 mg OPD,
10 µl H2O2 (30%ig)
Elutionspuffer, FPLC:
50 mM Tris-HCl, 10 mM red. Glutathion,
pH 8,0 in A. bidest.
Geltrocknungslösung:
40% Methanol, 10% Glycerol, 7,5% Eisessig, 42,5% A. bidest.
GIT-Puffer:
4 M Guanidinium, 0,1 M Tris (pH 7,5),
1% β-Mercaptoethanol in A. bidest.
Glycerol für Stocks:
65%
Glycerol,
100
mM
MgSO4,
25 mM Tris-HCl (pH 8,0)
Laufpuffer für SDS-PAGE, 10X:
25mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS
Material und Methoden
55
(pH 8,5) in A. bidest.
Ladungspuffer, 6x für Agarosegele:
0,25% Bromphenolblau, 40% Saccharose
in A. bidest.
NBT-Stocklösung:
50 mg/ml Nitro-Tetrazolium-Chlorid in
70%igem Dimethylformamid
PBS, 1x:
150 mM NaCl, 16 mM Na2HPO4 x 7 H2O,
4 mM NaH2PO4 x 2 H2O in A. bidest.
PBS-Tween:
1x PBS, 0,05% Tween 20
Phosphatpuffer für ELISA:
0,2 M Na2HPO4 in A. bidest.
SDS-Sammelgel, 5%ig (4 ml):
2,7 ml A. bidest., 0,67 ml Acrylamidmix
(30%ig), 0,5 ml 1 M Tris (pH 6,8), 40 µl
SDS
(10%ig),
40
µl
APS
(10%ig),
4 µl TEMED
SDS-Probenpuffer (9 ml)
5,4 ml A. bidest., 2 ml SDS (10%ig), 1 ml
Glycerol, 0,5 ml Tris (1 M, pH 6,8) 0,1 ml
Bromphenolblau (Stocklösung
5 mg/100 µl), kurz vor Gebrauch 10% 1 M
DTT zugeben
SDS-Trenngel, 10%ig (10 ml):
4 ml A. bidest., 3,3 ml Acrylamidmix
(30%ig), 2,5 ml 1,4 M Tris (pH 8,8), 100 µl
SDS (10%ig), 100 µl Ammoniumpersulfat
(10%ig), 4 µl TEMED
Stoplösung für ELISA:
2,5 M H2SO4 in A. bidest.
TAE-Puffer, 1x:
40 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0
TBS, 1x:
140 mM NaCl, 10 mM Tris-Base (pH 7,3)
TBS-Tween:
1x TBS, 0,05% Tween 20
Westernblot-Färbelösung:
50 ml AP-Puffer, 660 µl NBT-Stocklösung,
330 µl BCIP-Stocklösung
Zitratpuffer:
0,1 M C6H6O7 in A. bidest.
56
Material und Methoden
Alle Puffer und Lösungen wurden, soweit möglich, autoklaviert oder aus
autoklavierten Stammlösungen hergestellt.
3.1.2 Medien und Platten
LB-Medium (ROTH):
25 g/l (entspricht 10 g/l Trypton, 5 g/l
Hefeextrakt, 10 g/l NaCl; (pH 7,0 ± 0,2)
LB-Agarplatten:
LB-Medium mit 1,5% Agar (w/v)
Alle Nährmedien wurden autoklaviert. Vor Verwendung wurden 100 µg Ampicillin pro
ml Medium bzw. Agar zugesetzt.
3.1.3 Bakterien und Vektoren
Escherichia coli One Shot ™ TOP 10 F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacX
(INVITROGEN)
Z∆M15 ∆lacX74 recA1 araD139 ∆(araleu)
7697 galU galK rpsL (StrR) end A1 nupG
Escherichia coli One Shot™ BL21
(DE3)
F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)
(INVITROGEN)
Escherichia coli BL 21-Codon Plus®
E. coli B F- ompT hsdSB (rB-mB-) dcm+ Tetr
(DE3)-RIPL
gal λ(DE3) endA Hte [argU proL Camr]
(STRATAGENE)
[argU ileY leuW Strep/Specr]
pCR®4-TOPO®
TA-Klonierungsvektor, lac Promoter, LacZα-
(INVITROGEN)
ccdB Genfusion, Topoisomerase I kovalent
gebunden,
Kanamycin-
und
Ampicillin-
Resistenz
pGEX4T
Expressionsvektor,
Proteinexpression
als
(AMERSHAM BIOSCIENCES)
Fusionsprotein mit GST aus Schistosoma
japonicum, tac Promoter (IPTG-induziert),
Ampicillin-Resistenz
Material und Methoden
57
3.1.4 Reagenzien, Reaktionskits und Geräte
AGILENT TECHNOLOGIES, Waldbronn
2100 Bioanalyzer, Protein 200 PLUS Chip
AMERSHAM BIOSCIENCES, Freiburg
Spektralphotometer Gene Quant pro, Ultraspec 2000, QuickPrep micro mRNA
Purification Kit; Glutathione Sepharose™ High Performance; GSTrap™ HP columns,
1 ml; ÄKTA FPLC
BD CLONTECH, Heidelberg
SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit; SMART™ RACE cDNA Amplification Kit,
Advantage™ 2 Polymerase Mix
BECKMAN COULTER GMBH, Krefeld
J2-21 MIE Centrifuge
BIOMETRA, Göttingen
Standard Power Pack P25, UNO Thermoblock
BIOMOL GMBH, Hamburg
Maus-anti-PDI, monoklonal
BIO-RAD, München
Quick Start™ Bradford Protein Assay, Mini Protean II™, Power Supply Modell
1000/500
BIO TEK, Bad Friedrichshall
ELISA Reader Elx800™
BIOZYM, Hessisch Oldendorf
MJ Research Multicycler PTC 200, Gel Star®
58
Material und Methoden
COLORA MESSTECHNIK GMBH, Lorch
Magnetrührer Magnetomix®
EFLAB, Helsinki, Finnland
Mehrkanalpipette Titertek®
EPPENDORF, Hamburg
Centrifuge 5415, Pipetten Eppendorf Research (10 µl, 100 µl, 1000 µl, 5000 µl),
elektrische Pipetten Eppendorf Research Pro (10 µl, 100 µl, 1000 µl)
FRESENIUS, Bad Homburg
Ampuwa
FRÖBEL LABORTECHNIK, Lindau
Schütteltisch Rocky®
GERBU BIOTECHNIK GMBH, Gaiberg
Alhydrogel Adjuvant (Aluminiumhydroxid Gel 2,0% Suspension), Saponin QuilA
GFL, Burgwedel
Inkubationsschrank 3033, Wasserbad 1083, Überkopfschüttler 3025
HERAEUS, Osterode
MinifugeT, Omnifuge 2.0 RS, Biofuge pico, Inkubationsschrank B 5042 E
INTAS, Göttingen
UV-Tisch TF-M 20 x 40 cm, 312 nm; Video-Geldokumentations-Anlage
Material und Methoden
59
INVITROGEN, Karlsruhe
TRIZOL® Reagent; TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing; 250 bp DNA Ladder;
Low DNA MASS™ Ladder; SeeBlue® Prestained Standard, SuperScript ™ III
Reverse Transkriptase, Primer
JOUAN, Unterhaching
Zentrifuge BR4i
MACKEREY-NAGEL, Düren
NucleoSpin® Plasmid; Nucleobond® AX 100, NucleoSpin™ Tissue Kit, porablot
NCL, Blotting Papier MN 440B
MSE SCIENTIFIC INSTRUMENTS, Sussex, Großbritannien
Ultraschallgerät PK 1653
NUNC, Wiesbaden
Nunc Immobilizer™ Amino, nunc-Immuno™ wash 12
OLYMPUS, Hamburg
Stereolupe 1x4x VMT, Digitalkamera C5050 mit Software
PHARMACIA LKB, Bromma, Schweden
Multidrive XL 2303
PROMEGA, Mannheim
MagneGST™ Protein Purification System, RNAsin™ Ribonuclease Inhibitor, DNAseI
(RQ1 Rnase-Free Dnase), Stop-Lösung (20 mM EGTA), Gel Drying Film
QIAGEN, Hilden
Taq DNA Polymerase
60
Material und Methoden
RENNER GMBH, Dannstadt
Sterilfilter 0,2 µm Celluloseacetate Membrane
ROCHE, Grenzach-Wylen
Complete mini, RsaI
ROTH, Karlsruhe
Agarose NEEO Ultra Qualität Rotiagarose™, Roti®-Block, Roti®-Mark Prestained,
Rotiphorese® NF-Acrylamid/BIS Lösung 30%
SARTORIUS, Göttingen
Elektronische Präzisionswaage L610D, Vivaspin 4 Konzentratoren (VIVASCIENCE)
SEROTEC, Düsseldorf
Schaf-anti-Rind IgG:HRP, IgG1:HRP, IgG2:HRP, IgA:HRP, IgM:HRP
SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen
Maus-anti-GST, Ziege-anti-Maus:AP, Maus-anti-Rind:AP
STRATAGENE, Amsterdam, Niederlande
MX 4000® Multiplex Quantitative PCR System, Brilliant® QPCR Master Mix
ZEISS, Jena
Mikroskop 473011-9901
3.1.5 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
Alle nicht im einzelnen aufgeführten Chemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden
von den Firmen Merck (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Deisenhofen) und Roth
(Karlsruhe) erworben. Als Reaktionsgefäße wurden 0,5 ml Safe-Lock-Gefäße der
Firma Eppendorf (Hamburg), 1,5 ml und 2 ml Gefäße sowie 1,5 ml und 2 ml DEPCGefäße der Firma Biozym (Hessisch Oldendorf) verwendet. Des Weiteren kamen 11
Material und Methoden
61
ml und 50 ml Gefäße der Firma Sarstedt (Nürnberg) zum Einsatz. In der
quantitativen real-time PCR dienten 8x strip tubes (0,2 ml) mit optischen Deckeln (8x
strip
optical
cap)
der
Firma
Stratagene
(Amsterdam/Niederlande)
als
Reaktionsgefäße. Beim Umgang mit RNA und in der PCR-Vorbereitung wurden
gestopfte Pipettenspitzen (Biosphere® Filter tips) der Firma Sarstedt eingesetzt. Das
Beladen von SDS-Gelen erfolgte mit ausgezogenen Pipettenspitzen (Multiflex®) der
Firma Roth. In allen anderen Fällen wurden 10 µl und 100 µl Pipettenspitzen der
Firma Sarstedt und 1000 µl Pipettenspitzen der Firma Ratiolab GmbH (Dreieich)
eingesetzt. Die Blutentnahme erfolgte mittels Serum- und EDTA-Monovette®
(Sarstedt).
3.2 Gewinnung
und
Aufbereitung
des
parasitologischen
Probenmaterials
3.2.1 Isolierung von Lungenwurmlarven aus dem Kot
Die für RNA-Isolierungen und experimentelle Infektionen benötigten D. viviparus
Larven wurden von Stammhaltungsrindern des Instituts für Parasitologie gewonnen.
Hierzu
wurde
der
rektal
entnommene
Kot
entsprechend
des
Trichter-
Auswanderverfahrens (BAERMANN 1917) auf Siebe verteilt und diese wiederum auf
wassergefüllte, unten mit einem Quetschhahn nach MOHR verschlossene Trichter
gegeben. Nach Übernachtinkubation konnten die aktiv aus dem Kot ausgewanderten
ersten Larven aus dem Trichter abgelassen werden. Um die Larven weiter
aufzureinigen, wurde die entnommene Larvensuspension in 500 ml Standzylindern
über Nacht sedimentiert, der Überstand abgenommen und die Larven einem zweiten
Auswanderverfahren unterzogen. Hierbei wurden Siebe mit einer Maschenweite von
50 µm eingesetzt und diese noch zusätzlich mit drei Lagen Zellstoff ausgeschlagen.
Die
so
gewonnenen
Larven
wurden
in
mit
Leitungswasser
gefüllten
Erlenmeyerkolben bei Raumtemperatur inkubiert. Nach frühestens sechs Tagen
hatten sie sich zum doppelt bescheideten, infektiösen dritten Larvenstadium (L3)
entwickelt und konnten für experimentelle Infektionen verwendet, bzw. für
weitergehende Untersuchungen behandelt werden.
62
Material und Methoden
Zur Lagerung für spätere RNA-Isolierungen wurden die Larven zunächst entscheidet.
Hierzu wurden Portionen von etwa 100.000 Larven in 5 ml DEPC-Bidest unter
Zugabe von 250 µl Natriumhypochlorid (NaOCl) für 15 Minuten bei 37°C unter
ständigem Schütteln (GFL) inkubiert. Mit einem Mikroskop (ZEISS) wurde die
Entscheidung kontrolliert. Zur Entfernung des Natriumhypochlorids schlossen sich
drei Waschschritte mit 10 ml DEPC-Bidest an. Zwischen den Waschschritten wurden
die Larven bei 600 g (HERAEUS) für zehn Minuten pelletiert. Zum Schluss wurde
das Larvenpellet in 500 µl GIT-Puffer resuspendiert und in einem 1,5 ml DEPCGefäß bei –80°C gelagert.
3.2.2 Isolierung von adulten Lungenwürmern aus der Lunge
Nach der Sektion der experimentell infizierten Tiere (siehe Abschnitt 3.5.11) wurden
die adulten Lungenwürmer aus den exenterierten Lungen gewonnen. Hierzu wurden
ausgehend von der Trachea alle Bronchen bis in die kleinen Brochioli mit einer
Schere eröffnet und die Lungenwürmer mit einer Pinzette gesammelt. Bis zur
Weiterverarbeitung wurden die Lungenwürmer in Bechergläsern in eiskalter,
0,9%iger NaCl-Lösung verwahrt. Die Geschlechtsdifferenzierung erfolgte mithilfe
eines Stereomikroskops (ZEISS). Die für die quantitative real-time PCR bestimmten
Würmer wurden zur Reinigung mehrfach in DEPC-Bidest geschwenkt und
anschließend einzeln in DEPC-Gefäßen mit 500 µl GIT-Puffer bei –80°C gelagert.
3.2.3 Herstellung von D. viviparus Rohantigen
Zur Herstellung von Rohantigen wurden ca. 50 adulte D. viviparus (Männchen und
Weibchen gemischt) in einen Glashomogenisator gefüllt und durch drehende
Bewegung des geschliffenen Kolbens manuell zerkleinert. Nach etwa zwei Minuten
wies
der
Wurmbrei
eine
homogene
Konsistenz
auf.
Zum
vollständigen
Gewebeaufschluss wurde das Wurmhomogenisat mit 0,5 ml PBS in einen 13 mlFalkon überführt und einer Ultraschallbehandlung (MSE) ausgesetzt. Hierbei wurden
die Ultraschalimpulse über 3 min verabreicht (15 sec an/aus). Während der
Behandlung erfolgte eine Kühlung im Eiswasserbad. Anschließend erfolgte eine
Überführung in 1,5 ml-Reaktionsgefäße und eine 30minütige Zentrifugation bei
Material und Methoden
63
13000 g und 4°C (EPPENDORF). Der proteinhaltige Überstand wurde abgenommen
und in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen bei –80°C gelagert.
3.3 Molekularbiologische Methoden
3.3.1 mRNA Isolierung
Zum Einsatz in der cDNA-Synthese für die konventionelle und die RACE-PCR wurde
messenger RNA aus entscheideten 3. D. viviparus-Larven gewonnen. Zunächst
wurden ca. 400.000 Larven unter flüssigem Stickstoff gründlich zermörsert, um einen
möglichst vollständigen Aufschluss des Gewebes zu erreichen. Das zerkleinerte
Larvenmaterial wurde in ein 1,5 ml DEPC-Gefäß überführt und die mRNA mithilfe
des Quick Prep™ Micro mRNA Purification Kits (AMERSHAM BIOSCIENCES) nach
Angaben des Herstellers aufgereinigt. Bei diesem Kit erfolgt die Isolierung der mRNA
über die den meisten eukaryotischen mRNAs eigene Poly-Adenin-Sequenz am 3’Ende. Diese hybridisiert mit einer kovalent an Zellulose gebundenen Poly-ThymidinKette.
Zunächst
erfolgt
Extraktionspuffers
durch
ein
Zugabe
weiterer
des
Guanidium-Thiocyanat-(GTC)-haltigen
Aufschluss
des
Larvenmaterials
und
eine
Inaktivierung endogener RNAsen. Das anschließende Zufügen von Elutionspuffer
bewirkt ein erstes Ausfällen von Proteinen und reduziert die GTC-Konzentration, um
die Anlagerung der Poly-A-Sequenzen an die Oligo(dT)-Zellulose zu ermöglichen.
Nach Anlagerung der mRNA an die Zellulose werden in mehreren Waschschritten
mit Hoch- und Niedrigsalzpuffern DNA und andere Zellbestandteile entfernt.
Abschließend erfolgt die Gewinnung der mRNA mittels eines Elutionspuffers.
Die Präzipitation der mRNA erfolgte über Nacht bei –80°C unter Zugabe von
Glycogen, Kaliumacetat und 95%igem Ethanol. Am Folgetag wurde die mRNA durch
einstündige Zentrifugation bei 13000 g und 4°C (JOUAN) pelletiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol vorsichtig gewaschen,
ohne es vollständig zu resuspendieren. Nach erneuter Zentrifugation für 30 min bei
13000 g und 4°C wurde der Überstand verworfen und das Pellet einige Minuten bei
Raumtemperatur getrocknet. Eventuell vorhandene Flüssigkeitsreste wurden mit
64
Material und Methoden
einer ausgezogenen Pasteurpipette entfernt. Anschließend wurde das mRNA-Pellet
in 11 µl DEPC-Bidest resuspendiert.
3.3.2 Isolierung genomischer DNA
Die Präparation von genomischer DNA erfolgte mit dem NucleoSpin™ Tissue Kit
(MACKEREY & NAGEL) nach Angaben des Herstellers. Hierbei fand eine
Aufreinigung von DNA durch selektive Bindung an eine Silica-Membran statt.
Ein adulter D. viviparus wurde mittels einer Proteinase K/SDS Lösung lysiert und auf
eine Schleudersäule verbracht. Mittels eines Guanidium-Hydrochlorid-haltigen
Puffers wurden Proteine und sonstige Kontaminanten ausgewaschen. Anschließend
wurde die genomische DNA mit auf 70°C vorgewärmtem A. bidest. eluiert. Die
Lagerung erfolgte bei –20°C.
3.3.3 cDNA-Synthese
Um das Ausgangsmaterial für die PCR zu erhalten, wurde die isolierte RNA in cDNA
(complementary DNA) umgeschrieben. Hierbei wird die Fähigkeit der Reversen
Transkriptase (RT), RNA in einzelsträngige DNA umzuschreiben genutzt. Abhängig
von
der
Weiterverwendung
der
cDNA
wurden
unterschiedliche
Verfahren
angewendet.
3.3.3.1 cDNA-Synthese für die konventionelle PCR
Der Vorgang der reversen Transkription ist unter normalen Umständen oftmals nicht
vollständig. Bei besonders langen mRNAs oder vorhandenen Sekundärstrukturen
erreicht die Reverse Transkriptase häufig nicht das 5’-Ende, sodass dieser
Genbereich in einer cDNA-Population unterrepräsentiert sein kann. Um für die Suche
nach der PDI-Gensequenz einen möglichst vollständigen cDNA-Pool zu erhalten,
wurde das SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit der Firma BD CLONTECH
eingesetzt. Die SMART™-Methode (Switching Mechanism At 5’-End of RNA
Template) nutzt eine besondere Fähigkeit der MMLV (moloney murine leukemia
virus) Reversen Transkriptase: Sobald die Erststrangsynthese das 5’-Ende der
mRNA erreicht hat, sorgt die terminale Transferase-Aktivität der RT dafür, dass
Material und Methoden
65
einige zusätzliche Nukleotide an das 3’-Ende der cDNA gehängt werden. Dies sind
vor allem Desoxycytidine, sodass hierbei vom „d(C)-tailing“ gesprochen wird. Mit
dieser Oligo(dC)-Struktur hybridisiert die am 3’-Ende des zugefügten SMART™ II
Oligonukleotids lokalisierte Oligo(dG)-Sequenz. Die Reverse Transkriptase wechselt
das Template und verlängert die cDNA komplementär zum SMART™ II
Oligonukleotid. Die terminale Transferaseaktivität ist nur am Ende des Templates
optimal, sodass der template switch hauptsächlich nur bei vollständigen cDNA-RNAHybriden stattfindet. In der sich anschließenden long distance
PCR zur
Zweitstrangsynthese werden Primer eingesetzt, die Sequenzen komplementär zum
SMART™ II Oligonukleotid und zum CDS-Primer aufweisen (Ankersequenz). Dies
hat zur Folge, dass nur cDNAs amplifiziert und angereichert werden, die in voller
Länge vorliegen. Der gesamte Prozess der cDNA-Synthese erfolgte entsprechend
den Herstellerangaben.
3.3.3.2 cDNA-Synthese für die RACE-PCR
Die Herstellung von cDNA zum Einsatz in der RACE-PCR (Rapid Amplification of
cDNA Ends) erfolgte mit dem BD SMART™RACE cDNA Amplification Kit der Firma
BD CLONTECH. Das Grundprinzip der cDNA-Synthese mittels reverser Transkription
entspricht dem unter 3.3.3.1 beschriebenen. Allerdings werden für die RACE zwei
verschiedene
cDNA
Populationen
generiert,
und
es
erfolgt
keine
Zweitstrangsynthese mittels long distance PCR, sondern das RNA/DNA-Hybrid wird
direkt in der RACE-PCR eingesetzt.
Für die 5’-RACE-cDNA-Synthese wurde ein Oligo(dT)-Primer (5’-CDS-Primer) und
das BD SMART II™ A Oligonukleotid eingesetzt. Wie unter 3.3.3.1 beschrieben,
erfolgte am 5’-Ende der cDNA ein „d(C)-tailing“, Anlagerung des SMART II™ A
Oligonukleotids, template switch der MMLV RT und Verlängerung des 5’-Endes um
die Sequenz des Oligonukleotids. Für die Synthese der 3’-RACE-cDNA wird nur ein
Oligo(dT)-Primer (3’-CDS-Primer) eingesetzt. Allerdings enthält dieser neben der
Poly-Thymidinsequenz zusätzlich einen Sequenzbereich des SMART II™ A
Oligonukleotids am 5’-Ende. Dies hat den Vorteil, dass sowohl in der 5’-RACE-PCR
als auch in der 3’-RACE-PCR der gleiche Universalprimer eingesetzt werden kann.
66
Material und Methoden
Die gesamte RACE-cDNA-Synthese erfolgte entsprechend den Herstellerangaben.
Es wurden jeweils etwa 0,7 µg mRNA eingesetzt.
3.3.4 Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)
3.3.4.1 Allgemeines zur Methode
Mithilfe der Polymerasekettenreaktion lässt sich ein beliebiger Abschnitt eines DNAMoleküls (template) selektiv vervielfältigen. Voraussetzung hierfür ist, dass
Sequenzen bekannt sind, die den gewünschten Bereich flankieren. Anhand dieser
Sequenzen werden kurze Oligonukleotide (Primer) konstruiert, die während der
DNA-Synthesereaktion
als
Startpunkt
für
die
DNA-Polymerase
dienen.
Im
Allgemeinen besteht eine PCR aus den drei Reaktionsschritten Denaturierung,
Annealing (Anlagerung) und Elongation (Verlängerung). Im Denaturierungsschritt
führen hohe Temperaturen zu einem Auseinanderweichen der beiden TemplateDNA-Stränge. Das anschließende Absenken der Temperatur in der Annealing-Phase
ermöglicht den Primern, an den ihnen komplementären Bereichen zu hybridisieren.
Im Elongationsschritt wird die Temperatur auf das Arbeitsoptimum der Polymerase
erhöht. Das Enzym synthetisiert ausgehend von den Primern den Zweitstrang und
damit den gewünschten DNA-Bereich. Diese drei Schritte werden in mehreren
Zyklen wiederholt. Da von einem Zyklus zum nächsten die DNA-Menge annähernd
verdoppelt wird, kommt es zu einer selektiven Anreicherung des gewünschten DNAAbschnitts.
Für eine erfolgreiche Amplifikation ist die Primerauswahl von entscheidender
Bedeutung. Hierbei sind gewisse Grundregeln zu beachten. Primer sollten eine
Länge von 18-30 Basen und einen Guanidin- und Cytosinanteil von 40 – 60%
aufweisen. Mit der Plazierung von ein bis zwei G oder C am 3’-Ende kann eine
bessere Bindung und Elongation erreicht werden. Um Fehlhybridisierungen und
Leserasterverschiebungen zu vermeiden, sollten nicht mehr als vier gleiche Basen
nacheinander und nicht mehr als drei G oder C am 3’-Ende vorhanden sein. Durch
hohe
Annealingtemperaturen
wird
die
Spezifität
erhöht,
daher
sollte
die
Schmelztemperatur der Primer auch entsprechend hoch sein. Idealerweise sollten
Vorwärts- und Rückwärtsprimer den gleichen Schmelzpunkt aufweisen. Des
Material und Methoden
67
Weiteren sollten die Primer keine internen Sekundärstrukturen bilden und nicht
miteinander
hybridisieren.
Mit
Ausnahme
der
degenerierten
Primer
zur
Erstamplifikation der PDI, deren Erstellung manuell erfolgte, wurden alle PCR-Primer
mithilfe des Programms Primer Select (DNA STAR Version 5.06) konstruiert.
3.3.4.2 PCR zur Erstamplifikation der PDI von D. viviparus
Zur Erstamplifikation der Protein Disulfid Isomerase von D. viviparus wurden anhand
bekannter PDI-Sequenzen anderer Nematodenspezies Primer konstruiert. Mithilfe
des DNA Star Alignment Programms MegAlign™ konnten zwei hochkonservierte
Bereiche identifiziert werden, die hierfür geeignet erschienen. Neben der Beachtung
der allgemeinen Regeln zum Primerdesign wurde miteinbezogen, dass die
Sequenzen der verschiedenen Spezies an einigen Positionen unterschiedliche
Basen aufweisen. Durch die Angabe der Platzhalter Y-W-D-R erfolgt bei der
Primersynthese die Generierung einer Primerpopulation, die an den entsprechenden
Stellen verschiedene Basen aufwiesen (degenerierte Primer). Hierdurch erhöht sich
die
Wahrscheinlichkeit
des
Vorhandenseins
Sequenzähnlichkeit mit der unbekannten
entsprechenden Bereiche zu hybridisieren.
von
Sequenz
Primern,
die
aufweisen,
ausreichend
um
an
die
68
Material und Methoden
O.v. PDI
A.c. PDI
C.e. PDI2
C.e. PDI1
C.e.PDI3
O.o. PDI1
O.o. PDI2
5-TTYTAYGCWCCDTGGTG-3
degenerierter Vorwärtsprimer
DVPDID F
O.v. PDI
A.c. PDI
C.e. PDI2
C.e. PDI1
C.e.PDI3
O.o. PDI1
O.o. PDI2
3’-TGGTGRGGDCARTGRAA-5’
degenerierter Rückwärtsprimer
DVPDID R
Abb. 2:
Y = C oder T
W = A oder T
D = A, T oder G
R = A oder T
Konstruktion degenerierter Primer.
(O.v.: Onchocerca volvulus, A.c.: Ancylostoma caninum, C.e.:
Caenorhabditis elegans, O.o. Ostertagia ostertagi)
Für eine erfolgreiche Amplifikation war es erforderlich, die PCR zu optimieren.
Folgende Parameter wurden getestet (jeweils im 25 µl-Ansatz):
•
Annealing-Temperatur (Gradienten-PCR mit 48°C bis 56°C)
•
MgCl2-Konzentration (1,5 mM, 2,5 mM, 3,5 mM, 4,5 mM, 5,5 mM)
•
cDNA (18 Zyklen, 21 Zyklen, 24 Zyklen der Zweitstrangsynthese)
Material und Methoden
69
•
eingesetzte cDNA-Menge (1 – 8 µl; 1:10, 1:100 Verdünnungen)
•
Primermenge (25-500 pmol)
•
Polymerase (Taq Polymerase, Amplitaq Gold Polymerase)
Eine erfolgreiche Amplifikation gelang mit folgendem Ansatz:
2,5 µl
10X PCR-Puffer (QIAGEN)
1,0 µl
dNTP Mix (10 mM, PROMEGA)
2,0 µl
MgCl2 (25 mM, QIAGEN)
0,5 µl
DVPDID R (50 µM)
0,5 µl
DVPDID F (50 µM)
0,2 µl
Taq DNA Polymerase (QIAGEN)
4,0 µl
Template (21 Zyklen cDNA)
14,3 µl
Temperaturprofil
95°C 1 min
40 Zyklen
95°C 30 sec
50°C 30 sec
72°C 1 min
72°C 6 min
AMPUWA
3.3.4.3 Rapid amplification of cDNA ends (RACE PCR)
Zur Ermittlung der 5’- und 3’-Gensequenzen wurden anhand des bei der
Erstamplifikation der PDI erhaltenen Fragments genspezifische Primer (PDIDV2RC5
und PDIDV2RC3) entworfen, die zusammen mit dem Universalprimer aus dem BD
SMART™ RACE cDNA Amplification Kit in der PCR eingesetzt wurden. Um im Falle
einer problematischen Amplifikation eine nested PCR durchführen zu können,
wurden des Weiteren die Primer PDIDV2RCN5 und PDIDV2RCN3 konstruiert. Für
die Ermittlung der 5’- und 3’-Gensequenzen eines zweiten PDI-Gens wurden ferner
die Primer PDIDV1RC5, PDIDV1RC3, PDIDV1RCN5 und PDIDV1RCN3 konstruiert.
RACE Primer
PDIDV2RC5
PDIDV2RCN5
PDIDV2RC3
PDIDV2RCN3
PDIDV1RC5
PDIDV1RCN5
PDIDV1RC3
PDIDV1RCN3
Tab. 1:
RACE Primer
Sequenz 5’-3’
TAGCAACATCGCCATGAACGGTAG
CTGTGAGGCAGCTTTGGCATATTCC
CCTGAAGATTGGGATAAAGCACCTGT
GAACTTCGACCAAGTAGCACTGGAC
CCAGCTTGCCCACGCATATACTTGACG
AGGTCCCTCATATGCCTGAGCTTCCG
CCGTCGGAATGGCTGGGATTCGCAC
CGTTGCAGCTGTGACAAATGAAGGC
70
Material und Methoden
5’-RACE
3’-RACE
RC3
RCN3
5’ 3’ -
A A A A A - 3’
T T T T T - 5’
RCN5
RC5
Mittels degenerierter Primer
amplifiziertes Fragment
Unbekannter Genbereich
Abb. 3:
Schema der RACE-PCR
Die 50 µl-Ansätze enthielten folgende Komponenten:
5’-RACE
3’-RACE
5 µl 10X BD Advantage 2 PCR-Puffer
1 µl dNTP Mix (je 10 mM)
2,5 µl 5’-RACE-Ready cDNA
2,5 µl 3’-RACE-Ready cDNA
5 µl 10X Universal Primer A Mix
1 µl PDIDV2RC5 bzw.
1 µl PDIDV2RC3 bzw.
1 µl PDIDV2RCN5
1 µl PDIDV2RCN3
1 µl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix
41,5 µl AMPUWA
3.3.4.4 PCR zur Selektion von Kolonien
Um eine große Anzahl von Kolonien auf das Vorhandensein von Inserts der richtigen
Größe zu überprüfen, wurden Einzelkolonien in 25 µl LB-Medium für drei bis vier
Stunden bei 37°C inkubiert (GFL) und dann direkt in der PCR als Template
eingesetzt. Als Primer dienten die M13 Vorwärts- und Rückwärts-Primer aus dem
TOPO TA Cloning® Kit (INVITROGEN).
Material und Methoden
71
Reaktionskomponenten der 25 µl-Ansätze:
2,5 µl
10X PCR-Puffer (QIAGEN)
1,0 µl
dNTPs (10 mM) (PROMEGA)
1,0 µl
MgCl2 (25 mM) (QIAGEN)
0,5 µl
M13 Forward (50 µM)
0,5 µl
M13 Reverse (50 µM)
0,2 µl
Taq DNA Polymerase (QIAGEN)
5,0 µl
Zellen
14,3 µl
Temperaturprofil
95°C 5 min
35 Zyklen
95°C 30 sec
55°C 30 sec
72°C 1 min
72°C 6 min
AMPUWA
3.3.4.5 PCR zur Ermittlung der genomischen Sequenz
Um die genomische Sequenz der PDI von D. viviparus zu ermitteln, wurde die
erhaltene D. viviparus cDNA-Sequenz mit der bereits bekannten genomischen
Sequenz der PDI von Ancylostoma caninum (GenBank AY582129) verglichen. Da
die Sequenzen schon auf cDNA Ebene hohe Ähnlichkeiten aufwiesen, wurde
vermutet, dass auch die Lage der Introns ähnlich sein könnte. Die Primerpaare
wurden so gewählt, dass die amplifizierten Sequenzbereiche bei der PDI von A.
caninum Introns überspannt hätten.
Intron Vorwärtsprimer:
PDI2G1: 5’-CGGTGTGTCGGAGTGCTCTCTT-3’
1 u. 2 Rückwärtsprimer: PDI2G2: 5’-CATCTTCAGAGGTGATTCCAAATGG-3’
Intron Vorwärtsprimer:
3
Rückwärtsprimer: PDI2G4: 5’-CTGAAGATTGGGATAAAGCACTGTA-3’
Intron Vorwärtsprimer:
4
Tab. 2:
PDI2G3: 5’-CTGTATTCACTCGGCTTCCACTG-3’
PDI2G5: 5’-AATATGCCAAAGCTGCCACACA-3’
Rückwärtsprimer: PDI2G6: 5’-TCACCATCACTTATCAACGATCACAAT-3’
Sequenzen der Primer zur Amplifikation der genomischen DNA
72
Material und Methoden
Reaktionskomponenten der 25 µl-Ansätze:
Temperaturprofil
2,5 µl
10x PCR-Puffer (QIAGEN)
1,0 µl
dNTPs (10 mM, PROMEGA)
2,0 µl
MgCl2 (25 mM, QIAGEN))
0,5 µl
Vorwärtsprimer (50 µM)
0,5 µl
Rückwärtsprimer (50 µM)
0,2 µl
Taq DNA Polymerase (QIAGEN)
16,3 µl
94°C 3 min
25 Zyklen
94°C 1 min
65°C 30 sec
72°C 1 min
72°C 6 min
AMPUWA
3.3.4.6 PCR zur Klonierung des ORF (open reading frame) der PDI
Um für die Genexpression den offenen Leserahmen der Protein Disulfid Isomerase
zu erhalten, wurden Primer anhand der Start- und Stopsequenzen konstruiert.
Zusätzlich wurden an die Primer Zielsequenzen für Restriktionsenzyme angefügt.
Dies ermöglichte eine direkte Klonierung des PCR-Produkts ohne Verschiebung des
Leserahmens. Um geeignete Zielsequenzen zu finden, wurden die Schnittstellen der
cloning site des Expressionsvektors pGEX4T mit der PDI-Sequenz verglichen. Für
das 5’-Ende wurde eine Sal I-Schnittstelle, für das 3’-Ende eine Not I-Schnittstelle
gewählt. Da die PDI im pGEX4T-Vektor als Fusionsprotein mit GST exprimiert
werden sollte, wurde bei der Primerkonstruktion zusätzlich ein Basentausch am
Startcodon vorgenommen. A wurde gegen C getauscht, um an dieser Stelle keinen
Transkriptionsstart zu ermöglichen.
Material und Methoden
Vorwärtsprimer
PDIDV2FLFOR:
73
SalISchnittstelle
PDI-Sequenz
5’-ATAGTCGACCTGTTCAAACTCGCCTGC-3’
Modifiziertes
Startcodon
Rückwärtsprimer
PDIDV2FLREV:
NotISchnittstelle
PDI-Sequenz
5’ATAGCGGCCGCTTACAGCTCAGTATGACC-3’
Stopcodon
Abb. 4:
Konstruktion der Full length-Primer
3.3.5 Darstellung von Nucleinsäuren mittels Agarosegelelektrophorese
Mittels Agarosegelelektrophorese können DNA-Stränge ihrer Größe nach getrennt
werden. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes werden die negativ geladenen
DNA-Moleküle durch das Gel gezogen, das hierbei wie ein Sieb wirkt: Kleinere
Moleküle wandern schneller, wobei die Trennschärfe von der Agarosekonzentration
abhängig ist.
Für die Herstellung wurde Agarose (Agarose NEEO Ultra Qualität Rotiagarose™,
ROTH) in einer Konzentration von 0,5 bis 2% in 1x TAE-Puffer durch Aufkochen
gelöst und anschließend auf ca. 52°C abgekühlt. Die noch flüssige Agarose wurde
mit dem Farbstoff GelStar® (BIOZYM) versetzt (0,01% (v/v)) und in Flachbettformen
gegossen. Durch den Einsatz von Kämmen wurden während des Polymerisierens
Geltaschen zur Aufnahme der Proben erzeugt. Nach einer Polymerisationszeit von
30 bis 60 min wurde das Gel in eine mit TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer
(HOEFER) verbracht und mit den zu untersuchenden Proben sowie einem
Größenstandard beladen. Zum Beschweren und um die Lauffront kontrollieren zu
können, wurden die Proben vorher mit einer entsprechenden Menge 6x
74
Material und Methoden
Ladungspuffer versetzt. Dieser enthält Sacharose, um ein Absinken der Proben in
den Geltaschen zu ermöglichen und den Farbstoff Bromphenolblau.
Mit einer Spannungsquelle (BIOMETRA) wurde je nach Größe und Konzentration der
Gele für 45 bis 90 min eine Spannung von 85 bis 120 Volt angelegt. Während des
Laufs interkalierte der Farbstoff Gelstar® mit der DNA und ermöglichte deren
Sichtbarmachung durch Fluoreszenz auf einem UV-Leuchttisch (312 nm, INTAS).
Die Dokumentation der Gele erfolgte über eine Kamera (Video-Dokumentationsanlage, INTAS).
3.3.6 Isolierung von PCR-Amplifikaten aus Agarosegelen
Die zu klonierenden Banden wurden unter UV-Kontrolle mit einer sterilen
Skalpellklinge aus dem Agarosegel herausgeschnitten. Eine gestopfte 100 µl
Pipettenspitze wurde zu einem Filter umfunktioniert. Hierzu wurde das untere Drittel
abgeschnitten und diese dann in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß verbracht. Das
ausgeschnittene Gelstück wurde in den Konus der Pipettenspitze gegeben und das
Reaktionsgefäß anschließend für 1 min bei Raumtemperatur und 13000 U/min
zentrifugiert (HEREAUS). Die so eluierten PCR-Produkte wurden für Klonierungen
eingesetzt.
3.3.7 Klonierung von PCR-Amplifikaten
3.3.7.1 Klonierung in pCR®4-TOPO®
Alle zu klonierenden Amplifikate wurden im ersten Schritt in den pCR®4-TOPO®
Vektor aus dem TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (INVITROGEN) kloniert. Der
linearisierte
Vektor
besitzt
an
den
3´-Enden
einen
überhängenden
Desoxythymidinrest. Durch die nicht templateabhängige Terminale TransferaseAktivität der bei der PCR eingesetzen Taq DNA-Polymerase, wird an den 3´-Enden
des Amplifikationsprodukts ein Desoxyadenosinrest angehängt. Dieser kann mit dem
Desoxythymidinrest des Vektors hybridisieren. Die Religation des Vektors wird von
der Topoisomerase I des Vaccinia Virus kathalysiert. Dieses Enzym bindet
doppelsträngige DNA und spaltet in einem Strang das Phosphodiester-Rückgrat
nach der Sequenz 5´-CCCTT. Die dabei freiwerdende Energie wird in einer
Material und Methoden
75
kovalenten Bindung zwischen einem Tyrosyl-Rest der Topoisomerase I und dem 3´Phosphat des geschnittenen Stranges gespeichert. Diese Bindung kann wiederum
von der 5´-OH-Gruppe des geschnittenen Stranges angegriffen werden. Dadurch
wird die Spaltungsreaktion rückgängig gemacht und die Topoisomerase I freigesetzt.
Im pCR®4-TOPO®-Vektor wird diese Reaktion zur Insertion eines PCR-Produkts
genutzt, indem sich die 5´-CCCTT-Sequenz komplementär an den 3´-Enden mit dem
angehängten A-Rest befindet.
Des Weiteren enthält der Vektor Gene für Ampicillin- und Kanamycinresistenz.
Hierdurch wird eine selektive Anzucht der Wirtszellen ermöglicht. Damit nur Zellen
wachsen, die Vektoren enthalten, welche das Insert tragen, befindet sich auf dem
Vektor das letale E. coli control of cell death B (ccdB)-Gen. Dieses ist mit dem CTerminus des LacZα-Fragments fusioniert. Da sich die Insertionsstelle innerhalb des
LacZα-Fragments befindet, unterbricht die Ligation eines Inserts die Expression des
LacZα-ccdB-Fusionsgens und ermöglicht so ein Wachstum der Wirtszelle.
Der Ligationsansatz enthielt 2 µl PCR-Produkt, 1 µl Salzlösung, 2 µl A. bidest. und 1
µl des pCR®4-TOPO®-Vektors. Dieser Ansatz wurde 5 min bei Raumtemperatur
inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Die Transformation erfolgte in E. coli
TOP 10 Zellen (siehe Abschnitt 3.3.8.1)
3.3.7.2 Klonierung in pGEX4T-3
Für die Proteinexpression wurde die Sequenz des open reading frame der PDI in den
Expressionsvektor pGEX4T-3 kloniert. In diesem Vektor wird das Zielprotein als
Fusionsprotein mit GST (Glutathion-S-Transferase) aus Schistosoma japonicum
exprimiert. Die Expression steht unter der Kontrolle des tac Promoters, welcher
durch IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactosid) induziert wird. Der GST-Anhang (tag)
ermöglicht die Aufreinigung des Fusionsproteins über ein Affinitätsmedium.
Nach erfolgreicher T/A-Klonierung in den pCR®4-TOPO®-Vektor, Transformation in
TOP 10 Zellen und Anzucht erfolgte eine Plasmidpräparation mittels Miniprep (siehe
Abschnitt 3.3.9.1). Anschließend wurden sowohl die Plasmide als auch der pGEX
4T-3-Vektor einem Restriktionsverdau mit den Enzymen Sal I und Not I unterzogen:
76
Material und Methoden
PCR®4-TOPO®-Verdau
8 µl Plasmid-Miniprep
8 µl autokl. A. bidest.
PGEX4T-Verdau
2 µl pGEX4T-3
14 µl autokl. A. bidest.
2 µl Puffer O (FERMENTAS)
2 µl Puffer O
1 µl Sal I (10 U, FERMENTAS)
1 µl Sal I
1 µl Not I (10 U, FERMENTAS)
1 µl Not I
Beide Ansätze wurden für 4 h bei 37°C inkubiert und dann auf ein 1%iges
Agarosegel geladen. Anschließend wurde die Bande des geschnittenen pGEXVektors und die Insertbande des TOPO-Vektors mit einer sterilen Skalpellklinge aus
dem Gel ausgeschnitten und die DNA, wie unter Abschnitt 3.3.6 beschrieben, eluiert.
Daraufhin erfolgte die Ligation des PDI-Inserts mit dem pGEX4T-Vektor. Der
Ligationsansatz enthielt folgende Komponenten:
3 µl
pGEX4T, geschnitten
6 µl
PDI2 Insert
7 µl
autoklav. A. bidest.
2 µl
Ligase Puffer (FERMENTAS)
2 µl
T4-Ligase(1 U/µl, FERMENTAS)
Inkubation bei 14°C über Nacht
Die Transformation des pGEX4T-PDI-Expressionsplasmids erfolgte in die E. coliStämme TOP 10, BL 21 (DE 3) und BL 21-Codon Plus®(DE 3)-RIPL.
3.3.8 Transformation kompetenter Zellen
3.3.8.1 E. coli TOP 10
Die Vermehrung des pCR®4-TOPO®-Vektors für Sequenzierungen und die
Langzeitlagerung des pGEX4T-PDI-Expressionsplasmids erfolgte in E. coli TOP 10Zellen (One Shot® TOP 10, INVITROGEN). Für die Transformation wurden 2 µl des
Ligationsansatzes aus 3.3.7.1 oder 2 µl einer Plasmidpräparation (3.3.9) zu den auf
Eis aufgetauten, chemisch kompetenten TOP 10-Zellen gegeben und diese für
30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte ein Hitzeschock im 42°C Wasserbad
Material und Methoden
77
für 30 sec und darauffolgend wieder eine Kühlung auf Eis. Durch starke
Temperaturschwankungen sollte die Permeabilität der Bakterienzellmembran erhöht
werden, um das Einschleusen des Vektors zu erleichtern. Nach Zugabe von 250 µl
S.O.C.-Medium (INVITROGEN) wurde die Bakteriensuspension für eine erste
Zellvermehrung und Expression der Resistenzgene bei 37°C und 200 rpm für eine
Stunde inkubiert (GFL). Die Anzucht erfolgte auf mit Ampicillin (100 µg/ml Agar)
versetzten LB-Agar-Nährböden. Hierzu wurden zwei verschiedene Volumina der
Bakteriensuspension (i.A. 50 und 100 µl) mit einem sterilen Drigalskispatel
ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert (HEREAUS).
3.3.8.2 E. coli BL 21 (DE3)
Zur Expression wurde der E. coli BL 21 (DE3)-Stamm eingesetzt.
Dieser enthält das λDE3 Lysogen für die T7 RNA Polymerase unter der Kontrolle des
lacUV5 Promoters. Die Expression der T7 RNA Polymerase wird durch IPTG
induziert. Der Stamm ist lon Protease und outer membrane Protease (OmpT)
defizient, wodurch die Degradation heterologer Proteine reduziert wird.
Für die Transformation wurden 5 µl des Ligationsansatzes aus 3.3.7.2 zu 50 µl One
Shot® BL 21 (DE3)-Zellen (INVITROGEN) gegeben. Das weitere Vorgehen
entsprach dem Transformationsprotokoll für One Shot ®TOP 10-Zellen (3.3.8.1).
3.3.8.3 E. coli BL 21-Codon Plus®
Für Optimierungsversuche der Proteinexpression erfolgte eine Transformation des
pGEX4T-PDI-Expressionsplasmids
in
den
Wirtszellstamm
E.
coli
BL
21-
CodonPlus®(DE3)-RIPL. CodonPlus®-Zellen enthalten zusätzliche Genkopien für
tRNAs, die in E. coli selten vorkommen, aber oftmals bei der Expression heterologer
Proteine in größerer Anzahl benötigt werden. Der RIPL-Stamm enthält die tRNAGene argU (AGA, AGG), ileY (AUA), proL (CCC) und leuW (CUA) und kann dadurch
die Expression heterologer Proteine von Organismen mit AT- oder GC-reichen
Genomen verbessern.
Der Transformationsprozess entsprach im Wesentlichen der Transformation in den
E. coli TOP 10-Stamm. 2 µl einer Miniprep wurden zu 75 µl Zellen gegeben und 30
78
Material und Methoden
min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock bei 42°C war auf 20 sec verkürzt. Das weitere
Vorgehen entsprach dem unter 3.3.8.1 beschriebenen.
3.3.9 Plasmidpräparation
3.3.9.1 Miniprep
Von den LB-Agarplatten (3.3.8.1) wurden gut separiert gewachsene Klone nach dem
Zufallsprinzip ausgewählt. Diese wurden mit einer Pipettenspitze abgenommen und
in 5 ml LB-Ampicillin-Medium überführt. Die Anzucht der Flüssigkultur erfolgte bei
37°C und ständigem Schütteln (200 rpm, GFL) über Nacht.
Vor der Plasmidpräparation wurden 600 µl der Flüssigkultur abgenommen, mit 600 µl
Glycerol für Glycerolstocks versetzt und bei –20°C gelagert.
Die restliche Flüssigkultur wurde für eine Plamidpräparation im kleinen Maßstab
(Miniprep) im NucleoSpin® Plasmid-Kit (MACHEREY & NAGEL) eingesetzt. Hierzu
wurde die Bakteriensuspension für 20 min bei 4000 g (HERAEUS) zentrifugiert und
der Überstand sorgfältig entfernt. Das zurückbleibende Zellpellet wurde in einem
RNAse A-haltigen Puffer vollständig resuspendiert. Anschließend erfolgte mittels
eines NaOH/SDS-haltigen Puffers eine Denaturierung der Proteine. Durch Zugabe
eines Neutralisationspuffers wurden die erforderlichen Bedingungen für die Bindung
der Plasmid-DNA an eine Silicamembran geschaffen und die denaturierten Proteine
gefällt. Zelltrümmer und SDS-Präzipitate wurden anschließend mittels Zentrifugation
entfernt und der geklärte Überstand auf eine Silica-Schleudersäule verbracht. Nach
einem Waschschritt mit ethanolhaltigem Puffer erfolgte die Elution der Plasmid-DNA
von der Silica-Membran. Bis auf den Elutionsschritt, der mit autoklaviertem A. bidest.
statt des im Kit enthaltenen Elutionspuffers durchgeführt wurde, fanden alle
Arbeitsschritte dem Herstellerprotokoll entsprechend statt.
Die gewonnene Plasmid-DNA wurde bei ausreichender Menge für Sequenzierungen
eingesetzt oder als Reserve für Transformationen bei –20°C gelagert.
Material und Methoden
79
3.3.9.2 Midiprep
Wurde für Sequenzierungen oder Klonierungen eine größere Menge Plasmid-DNA
benötigt, erfolgte die Isolierung mit dem NucleoBond® AX 100 Midi-Kit (MACKEREY
& NAGEL) aus einer 50 ml Flüssigkultur.
100 µl Glycerolstock wurden in 50 ml LB-Medium über Nacht bei 37°C unter
ständigem
Schütteln
(200
rpm,
GFL)
angezüchtet.
Durch
dreißigminütige
Zentrifugation wurden die Zellen pelletiert und entsprechend des Herstellerprotokolls
weiterverarbeitet. Hierbei erfolgte die Zelllyse und erste Reinigung des Zelllysats
analog zur Miniprep. Im Weiteren jedoch erfolgte die Separation der Plasmid-DNA
über eine Anionenaustauschersäule. Das negativ geladene Phosphat-Rückgrad der
Plasmid-DNA bindet hierbei an eine funktionelle Gruppe des Silica-Betts. Durch
schrittweise Erhöhung der Salzkonzentration werden Verunreinigungen und kleinere
Nucleinsäuremoleküle ausgewaschen.
Die eluierte Plasmid-DNA wurde durch Zugabe von 100% Isopropanol präzipitiert
und das Pellet mit 70%igem Ethanol gewaschen. Mittels ausgezogener Glaspipette
erfolgte eine weitestgehende Entfernung der Alkoholverunreinigungen. Anschließend
wurde das Pellet in 50 µl A. bidest. resuspendiert und bei –20°C gelagert.
3.3.10
Restriktionsenzymverdau
3.3.10.1
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)
Um Klone der Erstamplifikation der PDI ohne Sequenzierung zu vergleichen, wurden
diese nach der PCR zur Selektion von Kolonien einem Verdau mit RsaI unterzogen.
RsaI ist ein 4-base cutter, d.h. das Enzym schneidet statistisch alle 44 = 256
Basenpaare
die
Zielsequenz
GT↓AC.
Für
sichtbare
Unterschiede
in
den
Laufeigenschaften der Fragmente müssen die Sequenzen allerdings relativ große
Unterschiede aufweisen. Daher erhält man mit dieser Methode nur einen groben
Vergleich der Sequenzen.
Für den Verdau wurden 15 µl PCR-Produkt mit 2 µl Puffer L (ROCHE), 0,3 µl RsaI
(10 U/µl, ROCHE) und 2,7 µl AMPUWA versetzt und für 2 h bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurden 15 µl auf einem 1%igen Agarosegel überprüft.
80
Material und Methoden
3.3.10.2
Darstellung des Inserts
In wenigen Fällen führt beim TOPO TA Cloning® Kit eine Leserahmenverschiebung
zur
Unterbrechung
des
LacZα-ccdB-Leserahmens
und
ermöglicht
damit
transformierten Kolonien ein Wachstum, die Vektoren ohne Inserts tragen. Um einen
schnellen Überblick zu erhalten, ob der bearbeitete Klon ein Insert der erwarteten
Größe enthält, kann dieses mittels Restriktionsenzymverdau dargestellt werden. Im
pCR®4-TOPO®-Vektor wird das Insert von zwei EcoRI-Schnittstellen flankiert. In
einem 20 µl-Ansatz wurden 8 µl einer Miniprep bzw. 2 µl einer Midiprep mit 2 µl 10XReaktionspuffer und 1 µl EcoRI (1 U/µl, LIFE TECHNOLOGIES) versetzt und eine
Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der gesamte Ansatz zur Überprüfung
auf ein 1%iges Agarosegel geladen.
3.3.11
Sequenzierung und Sequenzbearbeitung
Die Sequenzierung zu untersuchender Proben wurde von der Firma SEQUENCE
LABORATORIES, Göttingen durchgeführt.
Nach Erhalt der Sequenzen auf elektronischem Weg wurden diese mit dem
Datenverarbeitungsprogramm Align™ Plus (Sequence Alignment Program Version
4.0, S & E SOFTWARE) bearbeitet. Mit diesem Programm erfolgte das Auffinden von
Primersequenzen, Übersetzung in die entsprechenden Aminosäuresequenzen und
der Identitätsvergleich zwischen verschiedenen Klonen bzw. der Identitätsvergleich
mit Sequenzen anderer Spezies. Alignments der PDI-Sequenzen verschiedener
Spezies wurden ferner mit dem Programm MegAlign™(DNA Star) durchgeführt.
Erhaltene Sequenzen wurden im Internet mit bereits publizierten Sequenzen anderer
Organismen verglichen. Hierzu wurde das „basic local alignment search tool“
(BLAST) (NCBI, USA) genutzt. Im BLASTN werden eingespeiste Sequenzen auf
Nukleinsäureebene, mit dem BLASTP auf Proteinebene mit bereits in GenBank
(NCBI, USA) vorhandenen Daten verglichen. Mit dem RPSBLAST erfolgte die Suche
nach konservierten Domänen in der Aminosäuresequenz.
Bei Unstimmigkeiten zwischen Vorwärts- und Rückwärtssequenzen oder nicht
eindeutig
detektierten
Basen,
wurden
die
mit
den
Sequenzen
erhaltenen
Material und Methoden
Elektropherogramme
81
mithilfe
des
Programms
CHROMAS
(Version
2.31,
Technelysium Pty Ltd.) überprüft.
3.4 Proteinbiochemische Methoden
3.4.1 Proteinexpression
Die Expression des GST-PDI-Fusionsproteins erfolgte in E. coli BL 21(DE3) und BL
21(DE3) Codon Plus® Zellen.
100 µl Glycerolstock wurden in 50 ml LB/Ampicillin-Medium bei 37°C und 200 rpm
(GFL) über Nacht zu einer Vorkultur herangezüchtet. Mit dieser Vorkultur wurde
frisches LB/Ampicillin-Medium auf eine OD600 von 0,1 bis 0,15 (AMERSHAM
BIOSCIENCES) eingestellt. Hierzu war ca. 1/10 Volumen Vorkultur nötig. Diese
Hauptkultur wurde bis zu einer OD600 von 0,5 bis 0,6 weitergezüchtet. Dies war nach
ca. 2 Stunden erreicht. Um zu überprüfen, ob eine basale Expression stattfindet,
wurde ein 1 ml Aliquot von der Kultur entnommen, welches später parallel mit der
induzierten Kultur lysiert und mittels SDS-PAGE (3.4.5.1) untersucht wurde. Die
Hauptkultur wurde mit IPTG induziert und weiter bei 37°C und 200 rpm inkubiert.
Zur Optimierung wurde mit 50 ml Kulturen gearbeitet. Folgende Parameter wurden
bei der Expression in E. coli BL 21 (DE3) getestet:
•
Anzucht bei 37°C, 30°C, Raumtemperatur
•
Induktion bei OD600 ca. 0,25 und 0,5
•
Induktion mit 0,2 mM IPTG und 1,0 mM IPTG
•
Expression für 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h und über Nacht
Die Anzucht des E. coli BL 21 (DE3) Codon Plus® Stammes erfolgte bei 37°C. Die
Induktion erfolgte mit 1 mM IPTG bei einer OD600 von 0,5. Die Kultur wurde für 5 h
inkubiert.
Im Anschluss an die Expression wurden die Zellen für 20 Minuten bei 4000 g
(HEREAUS) abzentrifugiert, der Mediumüberstand entfernt und die Zellpellets bei
-80°C eingefroren.
82
Material und Methoden
3.4.2 Gewinnung des Zelllysats
3.4.2.1 Zelllyse mittels MagneGST™ Protein Purification System Lysispuffer
(PROMEGA)
Ein Zellpellet aus einer 50 ml-Kultur wurde in 2 ml MagneGST™ Lysispuffer
(PROMEGA) resuspendiert und in einem 10 ml Gefäß für 30 Minuten rotierend
inkubiert (GFL). Der unlösliche Zelldebris wurde durch Zentrifugation bei 13000 g
und 4°C für 30 Minuten (EPPENDORF) entfernt. Das geklärte Zelllysat wurde in der
Proteinaufreinigung mittels des MagneGST™ Protein Purification System-Kits
(PROMEGA) eingesetzt.
3.4.2.2 Zelllyse mittels Lysisprotokoll nach SAMBROCK (1989)
Zellpellets wurden mit 3 ml Lysispuffer (SAMBROCK 1989) pro Gramm Zellen
resuspendiert. Es erfolgte die Zugabe von 25 µl 40X Complete-Lösung (ROCHE), 25
µl DNAse (1 mg/ml) und 200 µl Lysozym (10 mg/ml) pro Milliliter Lysispuffer. Nach
einer zwanzigminütigen Inkubation auf Eis auf einem Schwenktisch erfolgte die
Zugabe von 4 mg Desoxycholsäure pro Milliliter Lysispuffer und eine Inkubation bei
37°C für zehn Minuten (GFL). Anschließend wurden 25 µl DNAse (1 mg/ml) pro
Milliliter Lysispuffer hinzupipettiert und der Ansatz für 15 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Abschließend wurden unlösliche Zellbestandteile durch dreißigminütige
Zentrifugation bei 13000 g und 4°C abgetrennt. Das geklärte Lysat wurde im
MagneGST™ Protein Purification System-Kit eingesetzt.
3.4.2.3 Zelllyse mittels Lysispuffer und Ultraschall
Zellpellets wurden in 2 ml Lysispuffer (SAMBROCK oder MagneGST™-Kit) pro 50 ml
ursprünglicher Zellkultur resuspendiert und mittels Ultraschallsonde (MSE) lysiert.
Die Behandlung erfolgte im Eiswasserbad und die Ultraschallimpulse wurden
stoßweise verabreicht (15 sec an/15 sec aus). Die Intensität wurde nur so hoch
geregelt, dass es zu keiner Schaumbildung kam. Zwischenzeitlich wurde die
Zellsuspension aufgeschüttelt. Die Impulse wurden so lange verabreicht, bis eine
deutliche Klärung der Zellsuspension und Abnahme der Viskosität zu erkennen war.
Dies war in der Regel bei einem 50 ml-Pellet nach etwa 3 min der Fall. Das Zelllysat
Material und Methoden
83
wurde durch dreißigminütige Zentrifugation bei 13000 g und 4°C geklärt und mittels
MagneGST™-Kit,
Glutathione
Sepharose™
High
Performance
(AMERSHAM
BIOSCIENCES) und FPLC aufgereinigt.
3.4.3 Proteinaufreinigung
3.4.3.1 Magne GST™ Protein Purification System
Das Magne GST™ Protein Purification System (PROMEGA) ermöglicht die
Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen über magnetische Partikel. An die
Oberfläche der magnetischen Partikel ist reduziertes Glutathion kovalent gebunden.
Hieran kann die GST des Fusionsproteins binden. Die Aufreinigung erfolgt in drei
Schritten. Im ersten Schritt werden die magnetischen Partikel zum Zelllysat gegeben.
Nach einer Inkubationszeit werden die Partikel mittels eines von außen an das Gefäß
gehaltenen Magneten fixiert und der Überstand abgenommen. Im zweiten Schritt
erfolgt die Zugabe eines Waschpuffers, um nicht gebundene Verunreinigungen von
den Partikeln zu waschen. Anschließend werden die Partikel wieder fixiert, um den
Waschpuffer zu entfernen. Im letzen Schritt wird das Fusionsprotein mittels eines
Glutathion-haltigen Elutionspuffers von den Partikeln eluiert.
Pro 2 ml Zelllysat wurden ca. 400 µl der Partikelsuspension eingesetzt. Die Elution
erfolgte mit 400 µl Elutionspuffer für 15 min. Zur Optimierung der Aufreinigung
wurden folgende Parameter variiert:
Anlagerung:
•
Inkubationszeit: 15 min, 30 min, 1 h
•
Temperatur: Raumtemperatur, 4°C
84
Material und Methoden
Waschen
•
Anzahl der Waschschritte: 3, 5, 10
•
Volumen des Waschpuffers: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml
•
Dauer der Waschschritte: 5 min, 20 min, 30 min
•
Zusatz von NaCl zum Waschpuffer (500 mM)
•
Zusatz von
-
50% Glycerol
-
2% Triton
-
2% Tween 20
-
20 mM β-Mercaptoethanol
-
6 M Guanidium HCl
-
8 M Urea
-
3 M DTT
Elution
•
Original-Elutionspuffer mit 50 mM Glutathion und 50 mM Tris-HCl
•
Glutathion-Konzentration: 100 mM, 50 mM, 25 mM, 12,5 mM, 6,25 mM
3.4.3.2 Glutathione Sepharose™ High Performance
Bei der Proteinaufreinigung mittels Glutathione Sepharose™-Medium (AMERSHAM
BIOSCIENCES) erfolgt die Isolierung eines GST-Fusionsproteins aus einem Zelllysat
ebenfalls durch Bindung der GST an Glutathion. Das Glutathion ist hierbei an
quervernetzte
Agarosepartikel
gebunden.
Analog
zu
dem
unter
3.4.3.1
beschriebenen Prozess besteht auch hier der Aufreinigungsvorgang aus den drei
Schritten Anlagerung des Fusionsproteins, Auswaschen von Verunreinigungen und
Elution des gebundenen Proteins. Um die Sepharose™-Partikel von den zugefügten
Flüssigkeiten zu trennen, werden die Partikel mittels Zentrifugation sedimentiert, und
der flüssige Überstand wird abpipettiert.
500 µl der 60%igen Glutathione Sepharose™ Suspension wurden entsprechend den
Herstellerangaben equilibriert und mit 200 µl Zelllysat versetzt. Es folgte eine
dreißigminütige Inkubation auf einem Überkopf-Schüttelinkubator (GFL). Durch
Material und Methoden
85
Zentrifugation für fünf min bei 500 g und Raumtemperatur (HERAEUS) wurde die
Sepharose™
sedimentiert
und
der
Zelllysatüberstand
wurde
abpipettiert.
Anschließend wurden die Partikel durch Zugabe von 5 ml PBS und Inkubation für
10 min auf einem Schüttelinkubator gewaschen und darauffolgend wieder
sedimentiert. Die Waschlösung wurde abpipettiert und der Waschvorgang zweimal
wiederholt. Abschließend erfolgte eine zweimalige Elution für 30 min durch Zugabe
von je 250 µl Elutionspuffer. Die Eluate wurden bei –80°C gelagert.
3.4.3.3 FPLC mit GSTrap™ HP Affinitätssäulen
Mittels FPLC (Fast pressure liquid chromatography) lässt sich der unter 3.4.3.2
beschriebene Aufreinigungsprozess automatisieren. Hierzu wurde das Gerät ÄKTA
FPLC (AMERSHAM BIOSCIENCES) eingesetzt. Die Anlage wird vom Computer
mittels der zugehörigen Unicorn Software gesteuert. Das Affinitätsmedium
Glutathione Sepharose™ befindet sich dicht gepackt in einer Säule, die einen Zuund Abfluss besitzt. Über einen zuführenden Schlauch wird das Zelllysat mittels einer
Pumpe automatisch durch die Säule gepumpt. Anschließend führt die Pumpe den
Waschpuffer zu. Für die Elution tritt eine zweite Pumpe in Kraft, die den
Elutionspuffer über die Säule befördert. Der Säulendurchfluss passiert eine UVLampe, deren Signale an die Steuereinheit weitergegeben und auf einem Bildschirm
als UV-Kurve ausgegeben werden. Durch Kontrolle der OD lässt sich der
Aufreinigungsprozess verfolgen und z.B. feststellen, wann der Waschdurchfluss
keine Verunreinigungen mehr enthält oder nach welchem Elutionsvolumen das
Protein
vollständig
eluiert
wurde.
Mittels
des
zum
System
gehörenden
Fraktionssammlers kann das eluierte Protein in beliebig großen Fraktionen
automatisch gesammelt werden.
Es wurden GSTrap™ HP- Säulen (AMERSHAM BIOSCIENCES) mit einem Volumen
von 1 ml eingesetzt. Das verwendete Zelllysat wurde durch einen 0,2 µm Filter
(RENNER) sterilfiltriert. Die eingesetzten Puffer wurden, soweit möglich, autoklaviert
und ansonsten mittels Magnetrührer (COLORA MESSTECHNIK) entgast. Mit der
Unicorn
Software
wurden
unterschiedliche
Programme
kreiert,
Aufreinigungsprozess zu optimieren. Folgende Parameter wurden getestet:
um
den
86
Material und Methoden
1. Beladen der Säule mit Zelllysat
•
unterschiedliche Volumina reinen Zelllysats
•
unterschiedliche Volumina einer 1:5 Verdünnung des Zelllysats mit PBS
•
Flussgeschwindigkeit beim Beladen: 1 ml/min, 0,5 ml/min, 0,2 ml/min
2. Waschen der Säule
•
Flussgeschwindigkeit: 1 ml/min, 0,2 ml/min
•
Waschvolumen: Es wurde so lange gewaschen, bis die UV-Kurve wieder
konstant auf der Basislinie war
3. Elution
•
Elution mit Standardelutionspuffer (10 mM Glutathion)
•
Elution mittels Puffergradienten (0-100% Elutionspuffer, 10 mM Glutathion)
Das Eluat wurde in Fraktionen von 1 ml gesammelt und bei –80°C gelagert.
3.4.4 Proteinproduktion für die Immunisierungen
Aus den oben beschriebenen Vorversuchen zur Expression und Aufreinigung ergab
sich das Protokoll für die Herstellung großer Fusionsproteinmengen für die
Immunisierungen. Es wurde der BL 21(DE3)-Stamm verwendet. 500 ml Kulturen
wurden bei einer OD600 von ca. 0,5 mit 500 µl IPTG (1 M) für 5 h induziert. Die
Zellsuspension wurde für 1 h bei 4000 g und 4° C (BECKMAN COULTER GMBH)
zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 15 ml Sambrock-Lysispuffer resuspendiert und
mit 300 µl 40x Complete-Lösung versetzt. Hiervon wurden 5 ml-Fraktionen über
5 min mittels Ultraschall lysiert (30 sec an/15 sec aus). Das Zelllysat wurde durch
dreißigminütige Zentrifugation bei 13000 g und 4°C geklärt und durch einen 0,2 µm
Filter sterilfiltriert. Das so vorbereitete Zelllysat wurde 1:5 mit PBS verdünnt und in
der Aufreinigung mittels FPLC eingesetzt. 10 ml des verdünnten Zelllysats wurden
mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,2 ml/min auf die Säule geladen. Anschließend
wurde die Säule mit 30 ml Waschpuffer bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min
gewaschen. Die darauffolgende Elution fand mit 10 ml Elutionspuffer (10 mM
Glutathion) bei einer Flussrate von 0,5 ml/min statt. Das eluierte Protein wurde in 1
ml-Fraktionen gesammelt und bei –80°C gelagert.
Material und Methoden
87
3.4.5 Darstellung von Proteinen
3.4.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die SDS-Page nach LÄMMLI (1970) ermöglicht die Auftrennung von Proteinen nach
ihrem Molekulargewicht. Natriumdodecylsulfat (sodiumdodecylsulfate, SDS) ist ein
anionisches, amphipatisches Detergenz. Durch Bindung an die kationischen Reste
von Proteinen erhalten diese eine negative Gesamtladung und können so im
elektrischen Feld wandern. Des Weiteren wird die zu untersuchende Probe durch die
Zugabe von DTT (Dithiothreitol) und Erhitzen denaturiert, wodurch die native
Oberflächenstruktur keinen Einfluss mehr auf die Wanderungseigenschaften der
Proteine hat. Unter diesen Bedingungen ist die elektrophoretische Beweglichkeit der
meisten
Proteine
Trägermedium
dem
dienen
Logarithmus
ihrer
Polyacrylamidgele.
Masse
Bei
der
direkt
proportional.
Polymerisation
Als
entstehen
abhängig von den Konzentrationen an Acrylamid und dem quervernetzenden
Reagenz Bisacrylamid unterschiedlich große Poren, die wie ein Sieb wirken. Kleinere
Moleküle vermögen die Netzstruktur schneller zu durchwandern als große, wobei
eine hohe Trennschärfe erreicht wird. Auf das eigentliche Trenngel wird ein
großporiges Sammelgel gegossen. Dieses wird von den Proteinen schnell
durchwandert und die Proben sammeln sich in einem engen Bereich an der Grenze
zum Trenngel. Hierdurch erhalten alle die gleiche Ausgansposition, wodurch die
Trennschärfe nochmals erhöht wird.
Es wurde die vertikale Elektrophoresekammer Mini Protean II™ der Firma BIO-RAD
eingesetzt. Alle selbstgegossenen Gele hatten eine Konzentration von 10%
Acrylamid und eine Dicke von 1 mm. Das Trenngel wurde mit A. bidest.
überschichtet,
um
eine
gerade
Oberkante
zu
erhalten.
Nach
einer
Polymerisationszeit von einer Stunde wurde das Wasser entfernt und das Trenngel
mit einem 5%igen Sammelgel überschichtet. In dieses wurden 10- oder 15-wellKämme zu Erzeugung von Probentaschen eingesetzt. Nach einer halbstündigen
Polymerisationszeit wurden die Kämme entfernt, zwei Gelkassetten in den
Elektrophoreseständer
eingespannt
und
die
innere
Pufferkammer
mit
1x
Elektrophoresepuffer gefüllt. Die Proben wurden 1:2 mit SDS-Probenpuffer versetzt
und für fünf Minuten bei 99°C erhitzt. Dem SDS-Probenpuffer wurde vorher 10%
88
Material und Methoden
frisch aufgetautes DTT (1 M) zugesetzt. Die Proben wurden mit ausgezogenen
Pipettenspitzen (ROTH) in die Probentaschen verbracht. Zur Ermittlung der
Molekulargewichte wurde in einer Spur ein Proteingrößenstandard aufgetragen. Zum
Einsatz kam entweder der Marker Roti®-Mark Prestained (ROTH) oder der
SeeBlue® Prestained Standard (INVITROGEN). Die Elektrophoresekammer wurde
in den mit 1x Elektrophoresepuffer gefüllten Puffertank eingesetzt. Für das Passieren
des Sammelgels wurde anfangs für 20 Minuten eine Spannung von 70 V angelegt,
die anschließend auf 120 V erhöht wurde. Nach 70 – 90 Minuten hatte die Lauffront
die untere Gelkante erreicht, und die Elektrophorese wurde beendet.
3.4.5.2 Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung von Proteinen
Zur direkten Sichtbarmachung der Proteine wurde das Gel im Anschluss an die
Elektrophorese für eine Stunde in Coomassie-Brilliant-Blue-Färbelösung eingelegt
und auf einem Wipptisch (FRÖBEL) geschwenkt. Der Farbstoff bindet unspezifisch
an Proteine, wobei die Detektionsgrenze ca. 0,1 µg pro Bande beträgt. Um
überschüssige Hintergrundfärbung zu entfernen, wurde das Gel unter ständigem
Schwenken
in
Entfärbelösung
für
mehrere
Stunden
bis
zur
deutlichen
Sichtbarwerdung der Proteinbanden entfärbt.
Für die Langzeitlagerung wurden die Gele zwischen zwei mit Geltrocknungslösung
befeuchteten Membranen (Gel Drying Film, PROMEGA) in einen Rahmen gespannt
und über mehrere Tage getrocknet.
3.4.5.3 Transfer Blot
Statt einer direkten Färbung im Gel können Proteine im Anschluss an die
Gelelektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mittels WesternBlot spezifisch nachgewiesen werden. Bei der Übertragung macht man sich
wiederum die negative Ladung der SDS-beladenen Proteine zunutze. Das Gel wird
nach der Elektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran verbracht. Durch Anlegen
einer Spannung senkrecht zur ursprünglichen Laufrichtung verlassen die Proteine
das Gel und werden an die Membran gebunden.
Die Übertragung erfolgte in einer Semi-Phor™-Blotkammer (HOEFER) nach dem
Semi-Dry-Verfahren. Drei mit Blotpuffer getränkte Filterpapiere (MACKEREY-
Material und Methoden
89
NAGEL) wurden auf den Boden (Anode) der Blotkammer gelegt. Auf die Filterpapiere
wurde
luftblasenfrei
die
zuvor
einige
Minuten
in
Blotpuffer
equilibrierte
Nitrocellulosemembran (porablot NCL, MACKEREY-NAGEL) verbracht. Auf die
Membran wurde das Gel gelegt und mit drei blotpuffergetränkten Filterpapieren
abgedeckt. Der Proteintransfer erfolgte bei einer konstanten Stromstärke von 100
mA für 90 min (BIO-RAD).
3.4.5.4 Western-Blot
Im Western-Blot können Proteine mithilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion
spezifisch detektiert werden. Hierfür wird die Membran mit den daran gebundenen
Proteinen in einer Lösung inkubiert, die für das nachzuweisende Protein spezifische
Antikörper (Primärantikörper) enthält. Diese binden an das entsprechende Protein
und fungieren im zweiten Schritt selbst als Antigen. Durch Zugabe eines zweiten, an
Epitope des Primärantikörpers bindenden Antikörpers (Sekundärantikörper oder
Konjugat), erfolgt die Detektion. Der Sekundärantikörper ist mit einem Enzym
gekoppelt, das eine Farbreaktion katalysiert. Hierdurch werden Proteinbanden
spezifisch sichtbar gemacht. Bei den hier eingesetzten Konjugaten handelt es sich
um Alkalische Phosphatase gekoppelte Antikörper. Als Substrat dienen die beiden
Farbstoffe
NBT
(Nitroblau
Tetrazolium)
und
BCIP
(5-Brom-4-Chlor-3-
Indolylphosphat). Die Alkalische Phosphatase (AP) spaltet die Phospatgruppe des
BCIP ab und reduziert NBT. Dephosporyliertes BCIP erscheint blau und reduziertes
NBT bildet einen violetten, schwerlöslichen Niederschlag. So entsteht in den
Bereichen, in denen AP-gekoppelte Antikörper gebunden wurden, aus beiden
Farbstoffen ein blauviolettes Präzipitat und die Proteinbanden werden sichtbar.
Alle Schritte des Western-Blots wurden auf einem Schwenktisch (FRÖBEL)
durchgeführt. Nach erfolgtem Proteintransfer wurde die Membran für fünf Minuten in
TBS-Puffer geschwenkt. Daraufhin erfolgte die Blockierung freier Bindungsstellen
durch eine einstündige Inkubation in Roti®-Block (ROTH). Für eine 5,5 cm x 9 cm
große Membran wurden 50 ml einer 1:10 Verdünnung des Reagenz eingesetzt.
Anschließend wurde die Membran dreimal für fünf Minuten mit ca. 50 ml TBSTween-Puffer gewaschen. Im nächsten Schritt erfolgte eine einstündige Inkubation
mit dem Primärantikörper und darauffolgend erneut drei Waschschritte mit TBS-
90
Material und Methoden
Tween-Puffer. Nach Zugabe des Konjugats und einstündiger Inkubation wurde die
Membran einmal für fünf Minuten mit TBS-Tween und zweimal mit TBS gewaschen.
Anschließend wurde die Westernblot-Substratlösung zugegeben und bis zur
deutlichen Sichtbarwerdung der Proteinbanden inkubiert. Die Reaktion wurde mit A.
bidest. abgestoppt.
Folgende Primärantikörper und Konjugate wurden eingesetzt:
Primärantikörper
Konjugat
Maus-anti-PDI (BIOMOL)
Ziege-anti-Maus IgG (SIGMA)
Maus-anti-GST IgG (SIGMA)
Ziege-anti-Maus IgG (SIGMA)
3.4.6 Bestimmung der Proteinkonzentration
3.4.6.1 Bradford
Der Bradford Assay nutzt die Eigenschaft des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G250 abhängig von den Reaktionsbedingungen, in verschiedenen Formen vorzuliegen
(BRADFORD 1976). Unter sauren Bedingungen liegt der Farbstoff überwiegend als
protoniertes Kation mit braunroter Farbe und einem Absorptionsmaximum bei 470
nm vor. Durch Bindung an Proteine nimmt der Farbstoff eine stabile, unprotonierte
Form ein. Diese Reaktion führt zu einem blauen Farbumschlag und damit zu einer
Verschiebung des Absorptionsmaximums zu 595 nm. Die Absorption bei 595 nm
korreliert dabei direkt mit der Proteinmenge und ermöglicht so eine Quantifizierung.
Es wurde der Quick Start™ Bradford Protein Assay (BIORAD) entsprechend den
Herstellerangaben für den 1 ml-Küvettenansatz durchgeführt. Mittels des zum Kit
gehörigen BSA-Standards wurde eine Standardverdünnungsreihe erstellt. Die
Einstellung „Protein 595 nm Assay“ des Photometers (AMERSHAM BIOSCIENCES)
berechnete aus den Absorptionswerten der eingegebenen Verdünnungsstufen eine
Eichgrade, anhand derer die Proteinkonzentration der unbekannten Lösung
automatisch ermittelt wurde.
Da sich mit der Methode nach Bradford nur der Gesamtproteingehalt einer Lösung
bestimmen läßt, die Proteinaufreinigung aber kein 100%ig reines Fusionsprotein
Material und Methoden
91
lieferte, diente dieser Assay nur als grobe Richtlinie zur Abschätzung der bei den
Aufreinigungen gewonnenen Proteinmenge. Um genauere Aussagen über den Anteil
des Fusionsproteins an der Gesamtproteinlösung zu erhalten, wurde der Agilent
2100 Bioanalyzer eingesetzt.
3.4.6.2 Agilent 2100 Bioanalyzer
Die „Lab on a chip“-Technologie des Agilent 2100 Bioanalyzers (AGILENT
TECHNOLOGIES) ermöglicht es, unterschiedliche Fraktionen einer Proteinlösung
quantitativ zu bestimmen. Das Grundprinzip des Bioanalyzers beruht auf der
klassischen Gelelektrophorese, die auf ein Chipformat verkleinert wurde. Ermöglicht
wird dies durch die Technologie der Mikrofluidik, der Steuerung winziger
Flüssigkeitsmengen in miniaturisierten Systemen. Hierdurch wird die Trennzeit und
die Menge des einzusetzenden Probenmaterials stark reduziert. Im Inneren eines
Glaschips befinden sich winzige, eingeätzte Mikrokapillaren, die auf der Oberseite
des Chips in größeren Öffnungen zum Einfüllen des Probenmaterials münden. Die
Trennmatrix besteht wie bei der klassischen Gelelektrophorese aus einem gelartigen
Polymer. Dieses wird zunächst zusammen mit einem Fluoreszenzfarbstoff in die
Mikrokapillaren gefüllt. Anschließend werden die zu untersuchenden Proben und der
Größenstandard in die entsprechenden Öffnungen pipettiert. Der so vorbereitete
Chip wird in das Messgerät eingelegt. Von diesem Punkt an ist der ganze Prozess
vollkommen automatisiert. Die Proben werden automatisch nacheinander aus den
Probenkapillaren in den Trennkanal injiziert und durch den Siebeffekt des Polymers
elektrophoretisch aufgetrennt. Durch laserinduzierte Fluoreszenz werden die
Proteine detektiert, und die erhaltenen Daten als Elektropherogramme (Peaks) und
Gelbanden-ähnliche Bilder ausgegeben. Die Größenbestimmung erfolgt mittels einer
Standardkurve, die das Programm anhand der gemessenen Daten für die Proteine
des Größenstandards berechnet.
Die Probenbehandlung erfolgte entsprechend den Angaben des Herstellers für den
PROTEIN 200 PLUS Chip (AGILENT TECHNOLOGIES). Um möglichst genaue
Messwerte zu erhalten, wurden mehrere Messungen auf mehreren Chips
vorgenommen und die erhaltenen Konzentrationen gemittelt.
92
Material und Methoden
3.4.7 Aufkonzentrieren der Proteinlösung
Um ein applikables Injektionsvolumen für die Immunisierung zu erhalten, war es
notwendig, das aufgereinigte Protein zu konzentrieren. Hierzu wurden VivaSpin 4Säulen (SARTORIUS) mit einem MWCO (molecular weight cut off) von 50 kDa
eingesetzt. Die Säulen wurden so lange bei 4000 g zentrifugiert, bis das Volumen auf
ca. 1/10 reduziert war.
3.4.8 Identifizierung der PDI mittels MALDI-TOF-MS
Aus einem Coomassie-gefärbten SDS-Gel wurde die Fusionsproteinbande mit einer
sterilen Skalpellklinge ausgeschnitten und an die Firma TOPLAB, Martinsried, zur
Analyse
geschickt.
Bei
der
MALDI-TOF-MS
(Matrix-Assisted-Laser-
Desorption/Ionisation-Time-Of Flight-Mass-Spectrometry / Matrix-unterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie)
werden
Proteine
anhand
charakteristischer Peptidmassen identifiziert. Hierzu wird eine Gelbande mit Trypsin
verdaut und das entstehende Peptidgemisch auf einem Probenteller mit einer Matrix
kokristallisiert. Durch Laserbeschuss werden Protonen von der Matrix auf die Peptide
übertragen. Die protonierten Peptide desorbieren von der Oberfläche und werden in
einem elektrischen Feld beschleunigt. Dann erfolgt die Messung der Flugzeit auf
einer Driftstrecke im feldfreien Raum. Anhand der Flugzeit der Teilchen lässt sich
ihre Masse berechnen. Da bei dem Verdau eines Proteins charakteristische Peptide
entstehen, ist es möglich, durch den Vergleich der gemessenen Peptidmassen einer
Probe mit den theoretisch verdauten Massen einer Proteindatenbank ein Protein zu
identifizieren.
3.5 Tierexperimentelle Untersuchungen
3.5.1 Versuchsplan
Es fanden zwei Immunisierungsversuche nach identischem Schema statt. Der erste
Immunisierungsversuch wurde vom 05.04.2005 bis zum 29.07.2005, der zweite vom
01.09.2005 bis zum 16.12.2005 durchgeführt. Am Tag 0 erhielten die Rinder die
erste Impfung. Drei und sechs Wochen später erfolgten die erste und zweite
Material und Methoden
93
Boosterimpfung. Wiederum drei Wochen später fand die experimentelle Infektion der
Rinder mit Lungenwurmlarven statt. Am Tag 98 bzw.99 wurden die Tiere seziert.
Kotproben
Beobachtung
Untersuchung
0
21
42
I.
II.
III.
Impfung
Abb. 5:
63 70
84
98/99
Tage
Infektion
Sektion
Schematische Darstellung des Versuchsablauf
Parallel zur Protein Disulfid Isomerase und in Kombination mit dieser wurden weitere
Vakzinekandidaten
getestet.
Immunisierungsversuch
zwei
Darüber
verschiedene
Gruppeneinteilung gestaltete sich wie folgt:
hinaus
wurden
Adjuvantien
im
eingesetzt.
ersten
Die
94
Material und Methoden
I. Immunisierungsversuch
II. Immunisierungsversuch
Tierzahl
Protein(e)
Adjuvans
Tierzahl
Protein(e)
Adjuvans
4
- (Kontrolle)
Al(OH)3
6
- (Kontrolle)
Quil A
4
PDI
Al(OH)3
4
ACE
Quil A
4
PDI
Quil A
4
PARA
Quil A
4
PNMT
Al(OH)3
4
PNMT
Quil A
4
PNMT
Quil A
4
4
Tab. 3:
PDI + PNMT +
MSP
PDI + PNMT +
MSP
Al(OH)3
PDI + ACE +
6
PARA + PNMT +
Quil A
MSP
Quil A
Gruppeneinteilung der Immunisierungsversuche
Die vorliegende Arbeit stellt nur die die Protein Disulfid Isomerase betreffenden
Ergebnisse dar. Bezüglich der anderen Proteine sei auf folgende Arbeiten verwiesen:
MSP (Major Sperm Protein): (VON HOLTUM 2006)
PNMT (Phenylethanolamin-N- Methyltransferase): (STRUBE et al. 2006)
PARA (Paramyosin): (STRUBE et al. 2006)
ACE (Acetylcholinesterase): (nicht veröffentlicht)
3.5.2 Genehmigung
Der für die hier beschriebenen tierexperimentellen Untersuchungen erforderliche
Antrag auf Genehmigung eines Tierversuchsvorhabens wurde von Herrn Prof. Dr. T.
Schnieder bei der Bezirksregierung Hannover gestellt und am 13.09.2004 unter dem
Aktenzeichen 04/853 genehmigt.
Material und Methoden
95
3.5.3 Tiermaterial
Es wurden männliche Kälber der Rasse Holstein-Frisian eingesetzt. Diese hatten zu
Versuchsbeginn ein Alter von vier bis fünf Monaten und wogen zwischen 99 und
178 kg. Die Tiere wurden von der Dücker GbR, Misselwarden bezogen.
Bei der Einstallung wurden die Tiere gewogen und in vier Gewichtsklassen eingeteilt.
Anschließend erfolgte die Randomisierung in die verschiedenen Gruppen.
3.5.4 Tierhaltung
Die Rinder wurden im Tierhaus des Instituts für Parasitologie gehalten. Hierbei
handelt es sich um Einstreuställe mit Zugang zu betonierten Ausläufen. Die Ställe
wurden täglich gemistet. Um Einschleppungen zu verhindern, war jeder Stall mit
einer Desinfektionswanne am Eingang und stalleigenen Reinigungsgerätschaften
ausgestattet. Die Fütterung erfolgte mit Heu und Kraftfutter. Leitungswasser stand
den Tieren aus Selbsttränken ad libitum zur Verfügung. Die Versorgung der Tiere
wurde vom Tierpflegerpersonal durchgeführt.
3.5.5 Verwendete Adjuvantien und Zubereitung des Impfstoffs
Im ersten Immunisierungsversuch wurden Aluminiumhydroxid (Al(OH)3) (GERBU)
und Quil A (GERBU) als Adjuvantien eingesetzt. Al(OH)3 wurde in einer Dosierung
von 400 µl (entsprechen 4 mg Aluminium) eingesetzt. Vom Quil A wurden 75 µl einer
1%igen Lösung pro Impfdosis eingesetzt (entsprechen 750 µg). Pro Impfdosis
wurden 200 µg Protein eingesetzt. Im zweiten Immunisierungsversuch wurde
ausschließlich Quil A als Adjuvans eingesetzt. Die Proteindosis betrug bei diesem
Versuchsdurchgang 100 µg pro Impfung. Die Impfdosen wurden mit Trispuffer auf
ein Volumen von 1,5 ml (Al(OH)3) bzw 1,0 ml (Quil A) aufgefüllt. Die Injektionen für
die Kontrollgruppen enthielten den Elutionspuffer aus der Proteinaufreinigung (50
mM Tris-HCl, 10 mM Glutathion, pH 8,0). Das hiervon eingesetzte Volumen
berechnete
sich
aus
dem
Mittelwert
der
Volumina
aller
eingesetzten
Impfproteinlösungen. Die Impfdosen wurden jeweils frisch vor der Applikation
angemischt und für 90 min auf einem Schwenktisch inkubiert.
96
Material und Methoden
I. Immunisierungsversuch
610 µl Elutionspuffer
Al(OH)3
Kontrollgruppe
Quil A
400 µl Al(OH)3
Kontrollgruppe
490 µl Trispuffer
604 µl PDI
Al(OH)3
Quil A
400 µl Al(OH)3
Impfgruppe
Impfgruppe
496 µl Trispuffer
422 µl Elutionspuffer
75 µl Quil A
503 µl Trispuffer
258 µl PDI (387,9 µg/ml)
75 µl Quil A
667 µl Trispuffer
604 µl PDI (331,5 µg/ml)
Quil A
75 µl Quil A
Impfgruppe
Tab. 4:
II. Immunisierungsversuch
321 µl Trispuffer
Zusammensetzung der Impfdosen
3.5.6 Applikation des Impfstoffs
Die Applikation des Impfstoffs bzw. der Kontrollsubstanz erfolgte intramuskulär in die
seitliche Halsmuskulatur. Um eventuell auftretende lokale Impfreaktionen besser
beurteilen zu können, wurde an der Applikationsstelle ein ca. 6 cm x 6 cm großes
Hautareal frei geschoren. Bei den Kombinationsgruppen erfolgte die Applikation der
verschiedenen Proteine einzeln. Um lokale Impfreaktionen voneinander abgrenzen
zu können, wurde zwischen den freigeschorenen Hautarealen ein Abstand von
mindestens fünf Zentimetern eingehalten.
3.5.7 Experimentelle Infektion
An den Tagen 63, 64 und 65 erfolgte die experimentelle Infektion mit jeweils 1100
infektiösen
D.
viviparus
L3,
die,
wie
unter
3.2.1
beschrieben,
von
Stammhaltungsrindern gewonnen worden waren. Hierzu wurde die Larvendosis in
Leitungswasser mit einer 50 ml Spritze aufgenommen und über den Zungengrund
oral appliziert.
3.5.8 Überwachung der Tiergesundheit
Während des gesamten Versuchs erfolgte eine tägliche Beobachtung der Tiere, die
ab Tag 70 zu einer täglichen Untersuchung erweitert wurde. Die tägliche
Beobachtung beinhaltete die Beurteilung des Allgemeinbefindens, des Auftretens
von Husten und Nasenausfluss sowie lokaler Reaktionen an der Injektionsstelle. Ab
Material und Methoden
97
Tag 70 wurden zusätzlich täglich Atem- und Herzfrequenz, Atemcharakter und
Körpertemperatur bestimmt. Darüber hinaus
wurden die Rinder am Tag der
Einstallung (-7), an den drei Impfterminen (0, 21, 42), bei der ersten Infektion (63)
und am Tag der Schlachtung (98/99) einer ausführlichen Allgemeinuntersuchung
unterzogen und gewogen.
3.5.9 Medikamentöse Behandlung erkrankter Tiere
Tiere, die im Versuchsverlauf deutliche Störungen des Allgemeinbefindens mit oder
ohne Auftreten von Fieber zeigten, wurden medikamentös behandelt. Folgende
Präparate kamen zum Einsatz:
•
Baytril® 10%, BAYER, Leverkusen
Wirkstoff: Enrofloxacin 100 mg/ml; Dosierung: 5 ml/100 kg/p.d., i.v., 5 Tage
•
Finadyne® RPS, ESSEX TIERARZNEI, München
Wirkstoff: Flunixin-Meglumin 50 mg/ml; Dosierung: 2,2 ml/50 kg/p.d., i.v.
•
Draxxin®, PFIZER, Karlsruhe
Wirkstoff: Tulathromycin 100 mg/ml; Dosierung: einmalig 1 ml/40 kg, s.c.
3.5.10
Gewinnung von Probenmaterial und dessen Aufbereitung
3.5.10.1
Blutproben
An den Tagen –7 und 0 und darauffolgend zweimal wöchentlich (Tag 4, 7, 11, 14
etc.) erfolgte die Entnahme von Blutproben. Nach Punktion der Vena jugularis mittels
Strauss Kanüle (DISPOMED) wurden ca. 8 ml Blut in Serum-Röhrchen (Monovette®
Serum, SARSTEDT) entnommen. Nach Inkubation über Nacht im Kühlschrank
wurden die Blutproben für 20 Minuten bei 3000 g (HERAEUS) zentrifugiert, der
Serumüberstand mit einer Pasteurpipette in ein 12 ml Gefäß überführt und bei –20°C
gelagert.
An den Tagen 0 (erste Immunisierung), 63 (Infektion), 84 (21 dpi), 91 (28 dpi) und
98/99
(Sektion)
wurden
zusätzlich
EDTA-Blutproben
(Monovette®
EDTA,
SARSTEDT) gewonnen. Diese wurden umgehend an die Klinik für kleine Klauentiere
98
Material und Methoden
der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Bestimmung des Differentialblutbildes
übergeben.
3.5.10.2
Kotproben
An drei Tagen vor der ersten Immunisierung sowie an den drei Immunisierungstagen
und am ersten Tag der experimentellen Infektion wurden zur Verifizierung der
Lungenwurmfreiheit der Versuchsrinder Kotproben untersucht. Ab Tag 84 erfolgte
eine tägliche Überprüfung der Larvenausscheidung. Der rektal entnommene Kot
wurde gründlich vermengt und zwei mal zehn Gramm (Doppelansatz) von jedem Tier
dem Trichterauswanderverfahren nach BAERMANN unterzogen. Hierbei wurden die
eingesetzten Siebe noch mit einer einzelnen Lage Zellstoff ausgekleidet, um
möglichst wenig Kotpartikel im abgelassenen Larvenmaterial zu erhalten, da diese
das Auszählen der Larven erheblich erschweren. Am darauffolgenden Tag wurden
die Larven in Zählkammern abgelassen und unter dem Mikroskop (ZEISS)
ausgezählt.
3.5.11
Sektion
Am Tag 98 bzw 99 (35/36 dpi) wurden die Rinder im Institut für Pathologie der
Tierärztlichen
Hochschule
Tierschutzschlachtverordnung
Hannover
erfolgte
eine
getötet.
Betäubung
Entsprechend
der
Tiere
der
mittels
Bolzenschuß, gefolgt von einem Ausbluten durch Eröffnen beider Vv. jugularia. Die
Lungen wurden einschließlich der Trachea entnommen und einer makroskopischen
Beurteilung unterzogen. Die pathologischen Veränderungen wurden für jeden
Lungenlappen nach Art und Ausdehnung beschrieben.
3.5.12
Größenbestimmung der adulten Stadien
Aus den exenterierten Lungen wurden die adulten D. viviparus-Stadien wie unter
3.2.2 beschrieben gewonnen. Pro Versuchstier wurden 25 männliche und 25
weibliche Würmer mit einer Digitalkamera (OLYMPUS) fotografiert. Mithilfe der
Olympus Software 5050 wurden die Länge und Breite der Würmer bestimmt.
Material und Methoden
99
3.6 Serologische Untersuchungen
3.6.1 Enzyme linked immunosorbant assay (ELISA)
Mittels ELISA wurden die Seren der Versuchtiere auf PDI-spezifische Antikörper
untersucht. Das Prinzip des hier eingesetzten ELISAs ist eine Antigen-AntikörperBindung,
die
mit
einem
enzymgekoppelten
Sekundärantikörper
(Konjugat)
nachgewiesen wird. Der enzymatische Umsatz eines zugegebenen Substrats führt
zu einer Farbreaktion, die photometrisch quantifiziert werden kann. Bei den hier
eingesetzten Konjugaten handelte es sich um Horseradish Peroxidase (HRP)gekoppelte Anti-Rind-Antikörper. HRP setzt das Substrat ortho-Phenylendiamin
(OPD) zu einem orangefarbenen Produkt um, dessen Absorption bei 490 nm
gemessen wird.
Als Antigen wurde das für den zweiten Immunisierungdurchgang aufgereinigte GSTPDI-Fusionsprotein eingesetzt. In Vorversuchen wurden durch Schachbretttitrationen
geeignete Verdünnungsstufen für Antigen, Serum und Konjugat ermittelt. Hierbei
wurden folgende Verdünnungen überprüft:
•
PDI: zweifach Verdünnungen von 10 µg/well bis 0,039 µg/well
•
Serum: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80
•
Konjugat: 1:5000, 1.10000, 1:20000
Als Mikrotiterplatten wurden Nunc Immobilizer™ Amino (NUNC) 96-well-Platten
eingesetzt. Die Platten wurden mit 100 µl der Protein-PBS-Verdünnung (entsprechen
0,31 µg Protein) pro Vertiefung beschichtet, mit einer selbstklebenden Folie
abgedeckt und über Nacht (mind. 16 h) bei 4°C inkubiert. Am darauffolgenden Tag
wurde die Proteinlösung abgeschüttet und die Wells mit PBS-Tween dreimal für fünf
Minuten mit einem Mehrkanal-ELISA-Washer (nunc-Immuno™ wash 12; NUNC)
gewaschen. Durch den Einsatz von Tween in der Waschlösung konnte bei diesen
Platten auf einen Blockierungsschritt verzichtet werden. Nach dem Waschen wurden
die Mikrotiterplatten durch Ausschlagen auf einem sauberen Handtuch getrocknet.
Anschließend wurden die zu untersuchenden Seren 1:10 mit PBS-Tween verdünnt
100
Material und Methoden
und hiervon 100 µl/Well im Doppelansatz aufgetragen. Auf jeder Platte wurden ein
Plattenleerwert, eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle mitgeführt. Der
Plattenleerwert wurde hierbei über Wells definiert, die zwar mit Protein, jedoch nicht
mit Serum und Konjugat beschichtet wurden. Die Negativkontrolle lieferten Wells, die
mit Serum von D. viviparus-Stammhaltungsrindern vor der Infektion beschichtet
wurden. Da kein geeignetes externes Positivserum zur Verfügung stand, wurde die
Positivkontrolle vom gepoolten Serum der PDI-immunisierten Rinder am Tag 21
verkörpert. Die mit Folie abgedeckten Platten wurden für eine Stunde bei 37°C
(HEREAUS)
im
Glasperlenwasserbad
inkubiert.
Nach
Abschütten
der
Serumverdünnung und dreimaligem Waschen mit PBS-Tween wurden die Platten mit
einer 1:5000 Verdünnung der Konjugate (100 µl/Well) beschichtet und wiederum für
eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Eingesetzte Konjugate
IgG1:HRP
IgG2:HRP
IgG:HRP
IgA:HRP
IgM:HRP
Schaf-anti-Rind (SEROTEC)
Nach Entfernen der Konjugatlösung und erneutem Waschen mit PBS-Tween,
wurden 50 µl der Substratlösung in jede Vertiefung pipettiert und die Mikrotiterplatte
für 10 min unter Lichtabschluss bei Raumtemperatur inkubiert. Nach exakt 10 min
wurde die Reaktion mit 50 µl 2,5 M Schwefelsäure pro Vertiefung abgestoppt, und
die Platten unmittelbar im ELISA-Reader (BIO TEK) bei einer Wellenlänge von
490 nm eingelesen.
Zur
Auswertung
der
ELISAs
wurden,
um
tages-
und
materialabhängige
Schwankungen zu verringern, aus den Rohdaten Indexwerte gebildet, die nach
folgender Formel berechnet wurden:
INDEX =
Mittelwert Probe – Mittelwert Leerwert
Mittelwert Positivkontrolle – Mittelwert Leerwert
Material und Methoden
101
3.6.2 Überprüfung der Serokonversion mittels Western-Blot
Da
es
nicht
gelang,
rekombinante
PDI
ohne
GST
und
ohne
E.
coli-
Proteinverunreinigungen zu gewinnen, wurde die Serokonversion zusätzlich im
Western-Blot überprüft, um auszuschließen, dass die im ELISA ermittelten Anstiege
der OD ausschließlich auf einer Reaktion auf GST bzw. E. coli-Kontaminanten
beruhten.
Hierzu wurde eine SDS-Page mit D. viviparus-Rohantigen wie unter 3.4.5.1
durchgeführt. Es wurde ein Probenkamm eingesetzt, der eine Probentasche über die
gesamte Breite des Gels erzeugte. Nach erfolgter Gelelektrophorese wurden die
Proteine wie unter 3.4.5.3 beschrieben auf eine Nitrocellulosemembran geblottet.
Anschließend wurde die Membran in 4 mm breite Streifen geschnitten. Im WesternBlot wurden die Streifen mit den Seren der PDI-immunisierten Tiere und der
Kontrollgruppe aus dem I. Immunisierungsversuch vom Tag 0, Tag 63 und Tag 98
sowie mit einem Positiv- und einem Negativserumpool geprüft. Die Seren wurden in
einer Verdünnung von 1:20 mit TBS-Tween eingesetzt und als Konjugat diente ein
AP-gekoppelter Maus-Anti-Rind-Antikörper (SIGMA) in einer Verdünnung von
1:30000.
3.7 Quantitative real-time PCR (QRT-PCR)
Die quantitative real-time PCR (QRT-PCR) wurde eingesetzt, um zu überprüfen, ob
die Immunisierung der Rinder mit PDI Einfluss auf die Expression der PDI in den
Würmern hatte. Hierzu wurden je fünf männliche und weibliche Würmer der sechs
Kontroll- und Kombitiere des zweiten Immunisierungsversuchs untersucht.
3.7.1 Allgemeines zur Methode
Mithilfe der quantitativen real-time PCR lassen sich PCR-Produkte in „Echtzeit“ (realtime) während der laufenden PCR detektieren und anschließend quantifizieren. Dies
ermöglicht einen Rückschluss auf die Menge an Ausgangs-DNA und damit auch auf
die Transkriptionsrate eines bestimmten Gens. In der QRT-PCR werden neben
Primern fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt. Hierbei handelt es sich um DNASonden, die zu einem internen Bereich des Amplifikats komplementär sind. Die
102
Material und Methoden
Sonden sind an beiden Enden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Der sogenannte
Reporterfarbstoff
am
5’-Ende
besitzt
eine
Emissionswellenlänge,
die
der
Anregungswellenlänge des als Quencher bezeichneten Farbstoffs am 3’-Ende
entspricht. Bei intakter Sonde befinden sich die beiden Farbstoffe in enger räumlicher
Nähe und es kommt zu einem als Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)
bezeichneten Mechanismus. Der Quencherfarbstoff nimmt die Emissionsenergie des
Reporterfarbstoffs auf, wodurch dessen Lichtemission unterdrückt wird. Die in der
QRT-PCR eingesetzte Thermus aquaticus (Taq)-DNA Polymerase besitzt eine 3’→
5’-Exonukleaseaktivität. Hierdurch werden während der Extensionsphase vom 5’Ende doppelsträngiger DNA Nukleotide abgespalten. Erreicht die Taq-Polymerase
die Sonde, wird diese hydrolysiert und die räumliche Nähe zwischen Reporter und
Quencher aufgehoben. Hierdurch kann der Quencher den Reporter nicht mehr
unterdrücken und dieser sendet Lichtenergie aus, die detektiert werden kann. Die
Höhe des Fluoreszenzsignals ist hierbei direkt proportional zur Anzahl hydrolysierter
Sondenmoleküle, wodurch auf die in der Probe vorhandene DNA-Menge des
untersuchten Gens geschlossen werden kann. Da es einerseits in der frühen Phase
der
Reaktion
einige
Zyklen
braucht,
bis
ein
sich
deutlich
von
der
Hintergrundfluoreszenz abhebendes Signal entsteht und es andererseits gegen Ende
der Reaktion durch Abnahme der Reaktionskomponenten oder Funktionsverlust der
Polymerase
zu
einer
Verlangsamung
der
Reaktion
kommt,
hat
der
Fluoreszenzanstieg nur dazwischen exponentiellen Charakter und nur dieser
Zeitpunkt der Reaktion kann zur Quantifizierung herangezogen werden. Als
Bezugsgröße für die Quantifizierung dient ein Reaktionszyklus an dem das
Fluoreszenzsignal
den
Schwellenwert
(threshold)
der
Hintergrundfluoreszenz
konstant überschreitet. An diesem als Ct (cycle-threshold) bezeichneten Zyklus
befindet sich in allen Reaktionsgefäßen die gleiche Menge an synthetisierter DNA
und über die Höhe des Ct kann auf die Ausgangsmenge an DNA geschlossen
werden. Befindet sich in einer Probe viel Ausgangsmaterial, wird der Schwellenwert
bei einer niedrigen Zyklenzahl überschritten, also ein niedriger Ct erreicht und
umgekehrt. Da die Hintergrundfluoreszenz in verschiedenen Proben unterschiedlich
Material und Methoden
103
sein kann, wird den Proben ein Referenzfarbstoff zugesetzt und dessen Fluoreszenz
zur Ermittlung des Schwellenwertes herangezogen.
Reporter
Quencher
hν
Sonde
Vorwärtsprimer
Denaturierung
hν
Annealing
hν
Extension
Abb. 6:
Taq
Prinzip der QRT-PCR mit TaqMan™-Sonden
Um verschiedene Proben vergleichen zu können, wird die Expression eines Zielgens
in Relation zu einem zweiten Gen dargestellt. Dieses als „Housekeeping Gen“ (HKG)
bezeichnete Referenzgen unterliegt nicht der Regulation, sondern wird homogen
exprimiert. Als HKG wurde die 18S-rRNA gewählt.
104
Material und Methoden
3.7.2 Konstruktion der Primer und Sonden
Das Design der Sonde und der zugehörigen Primer erfolgte mit der Primer
Express™-Software der Firma APPLIED BIOSYSTEMS. Hierbei wurde der
Sequenzbereich zur Positionierung von Primern und Sonde auf einen Intronüberspannenden Bereich eingeengt. Dies sollte verhindern, dass eine Amplifikation
an eventuell vorhandenen Verunreinigungen mit genomischer DNA stattfindet. Für
die PDI-Sonde konnte eine passende Primer-Sonden-Kombination im Bereich des
ersten Introns identifiziert werden. Hierbei lagen der Vorwärtsprimer und die Sonde in
5’-3’-Richtung vor dem Intron und der Rückwärtsprimer über der Introngrenze.
Als Reporterfarbstoff wurde FAM (6-Carboxy-Fluorescein), als Quencherfarbstoff
TAMRA (6-Carboxy-Tetramethylrhodamin) gewählt. Die Primersynthese erfolgte bei
der Firma INVITROGEN. Die Synthese der Sonden wurde bei der Firma APPLIED
BIOSYSTEMS in Auftrag gegeben.
Bezeichnung
Sequenz 5’→ 3’
Tm
PDI QPCR for
CTTGCCGAATTTTATGCTCCTT
58°C
PDI QPCR rev
GTGTGGCAGCTTTGGCATATT
59°C
PDI-Sonde:
6-FAM-CGGTCACTGTAAGGCACTTGCTCCG-TAMRA
68°C
18S QPCR for
CGTCATTGCTGCGGTTAAAA
58°C
18S QPCR rev
CGCCAAAGGCGAATCG
58°C
18S-Sonde:
6-FAM-CGTAGTTGGATCTGAGTTACATGCAA-TAMRA 68°C
Tab. 5:
In der QRT-PCR verwendete Primer und Sonden
3.7.3 Gesamt-RNA Isolierung
Zum Einsatz in der cDNA-Synthese für die quantitative real-time PCR wurde RNA
von den aus den Lungen der Versuchsrinder isolierten adulten Lungenwürmern
gewonnen. Da ribosomale RNA keine Poly-A-Sequenz am 3’-Ende aufweist, über die
eine Aufreinigung wie unter 3.3.1 möglich wäre, war es erforderlich, Gesamt-RNA zu
isolieren. Dies erfolgte mit dem Trizol®-Reagenz (INVITROGEN) nach Angaben des
Material und Methoden
Herstellers.
Es
handelt
105
sich
hierbei
um
eine
Modifikation
der
sauren
Guanidinisothiozianat-Phenol-Chloroform-Extraktion (CHOMCZYNSKI u. SACCHI
1987).
Das
Reagenz
enthält
Guanidinisothiozianat
und
Phenol
in
einer
monophasischen Lösung.
Die in 500 µl GIT-Puffer gelagerten Würmer wurden bei Raumtemperatur aufgetaut
und mehrfach homogenisiert. Nach Zugabe von 1 ml Trizol®, 200 µl Chloroform und
dreiminütiger
Inkubation
bei
Raumtemperatur
folgte
ein
fünfzehnminütiger
Zentrifugationsschritt bei 12000 g und 4°C (EPPENDORF). Hierdurch erfolgte eine
Phasenseparation in eine obere wässrige, RNA-haltige Phase, eine DNA-haltige
Interphase und eine untere organische, proteinhaltige Phase. Die wässrige Phase
wurde in ein neues 2 ml DEPC-Gefäß überführt. Durch Zugabe von 500 µl
Isopropylalkohol erfolgte die Fällung der RNA. Nach zehnminütiger Inkubation bei
Raumtemperatur wurde die RNA durch Zentrifugieren bei 12000 g und 4°C über
zehn Minuten pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und das RNA-Pellet mit 1 ml
75%igem Ethanol/DEPC-Bidest gewaschen. Nach fünfminütiger Zentrifugation bei
7500 g und 4°C und Entfernen des Alkohols, wurde das RNA-Pellet in 9 µl DEPCBidest resuspendiert und zum Schutz vor Abbau durch RNAsen mit 1 µl (40 U)
RNAsin™ Ribonuclease Inhibitor (PROMEGA) versetzt.
3.7.4 DNAse-Verdau der Gesamt-RNA
Um eventuell vorhandene DNA-Verunreinigungen der Gesamt-RNA zu entfernen,
schloss sich an die RNA-Isolierung ein DNAse-Verdau an. Hierzu wurde die
resuspendierte Gesamt-RNA mit 1 µl DNAse I (RQ1 Rnase-Free Dnase, PROMEGA)
und 1 µl des zugehörigen 10x-Puffers versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert.
Anschließend erfolgte die Zugabe von 1 µl Stop-Lösung (20 mM EGTA, PROMEGA)
und eine zehnminütige Inkubation bei 65°C (BIOMETRA), um die DNAse zu
inaktivieren. Von diesem Ansatz wurden 2 µl für die Konzentrationsbestimmung
entnommen.
3.7.5 cDNA-Synthese für die quantitative real-time PCR
Die hergestellte cDNA sollte für die Quantifizierung der PDI und eines weiteren, in
einer anderen Arbeit untersuchten Gens, dem Major Sperm Protein (MSP) eingesetzt
106
Material und Methoden
werden. Da ribosomale RNA keine Poly-A-Sequenz am 3’-Ende aufweist, war es
nicht möglich, in der reversen Transkription ausschließlich einen Oligo(dT)-Primer
einzusetzten.
Deshalb
wurden
neben
einem
Oligo(dT)-Primer
zusätzlich
genspezifische Rückwärtsprimer eingesetzt, die später auch in der quantitativen realtime PCR Anwendung fanden.
In einem 0,2 µl PCR-Gefäß wurden 8 µl Gesamt-RNA mit je 1 µl Oligo(dT)-Primer
(50 µM, INVITROGEN), PDI QPCRrev-Primer (50 µM), MSP QPCRrev-Primer (50
µM), 18S QPCRrev-Primer (50 µM) und 1 µl dNTPs (10 mM) versetzt und für 7
Minuten bei 70°C inkubiert (Uno Thermoblock, BIOMETRA). Anschließend wurde der
Ansatz sofort für 2 min auf Eis gekühlt und für einige Sekunden herunter zentrifugiert.
Daraufhin erfolgte die Zugabe von 4 µl 5x Erststrang-Puffer, 1 µl DTT (10 mM), 1 µl
SuperScript™ III Reverse Transkriptase und 1 µl DEPC-Bidest. Dieser 20 µl-Ansatz
wurde für 60 Minuten bei 55°C inkubiert. Zur Inaktivierung der Reversen
Transkriptase erfolgte ein abschließender Inkubationsschritt bei 72°C für 10 Minuten.
Die cDNA wurde bei –20°C gelagert.
3.7.6 Absolute Quantifizierung
Bei der absoluten Quantifizierung werden die am Ct vorliegenden Kopienzahlen des
Zielgens anhand einer Standardreihe bestimmt. Hierzu wurden die in der QRT-PCR
als Template dienenden Sequenzbereiche der PDI und der 18S-rRNA in einer
konventionellen PCR amplifiziert:
50 µl Ansatz:
5,0 µl
10X PCR-Puffer (QIAGEN)
2,0 µl
dNTPs (2 mM) (PROMEGA)
3,0 µl
MgCl2 (25 mM) (QIAGEN)
1,0 µl
Vorwärtsprimer (50µM)
1,0 µl
Rückwärtsprimer (50µM)
0,1 µl
Taq DNA Polymerase (QIAGEN)
36,9 µl
1,0 µl
AMPUWA
cDNA
Temperaturprofil
95°C 15 min
35 Zyklen
95°C 1 min
61°C 1 min
72°C 1 min
72°C 10 min
Material und Methoden
107
Nach Klonierung in den pCR®4-TOPO®-Vektor (3.3.7.1), Transformation in E. coli
TOP 10-Zellen (3.3.8.1), Anzucht und Midiprep (3.3.9.2) wurde die Konzentration der
Plasmid-DNA photometrisch bestimmt und eine Verdünnungsreihe mit 100 bis 107
Kopien/µl erstellt. Die Verdünnungsreihe wurde in der QRT-PCR eingesetzt. Aus den
Cts der Verdünnungsstufen wurde eine Kalibrierungskurve erstellt, anhand derer die
Kopienzahl einer Probe über den Ct der Probe bestimmt werden konnte.
3.7.7 Relative Quantifizierung
Bei der relativen Quantifizierung werden keine Kopienzahlen bestimmt, sondern die
Expression des Zielgens in einer Probe wird auf eine Standardprobe (Kalibrator)
bezogen. Der in der untersuchten Probe ermittelte Ct für das Zielgen wird über den
Ct des Referenzgen in der Probe normalisiert und unter Einbeziehung der PCREffizienz der beiden Gene auf den normalisierten Ct des Kalibrators bezogen. Als
Kalibrator wurde ein männlicher Wurm aus der Kontrollgruppe willkürlich gewählt. Die
relative Quantifizierung wurde mit dem „Comparative Quantitation“ Programm des
Mx4000®, sowie mit der Effizienz-korrigierten Formel nach PFAFFL (2001)
durchgeführt.
Für die Ermittlung der QRT-PCR-Effizienz wurde von zehn Einzel-cDNAs der
Würmer je 1 µl entnommen und zusammengeführt. Von diesem cDNA-Mix wurde
eine
5fach-2fach-Verdünnungsreihe
von
1:100
bis
1:100.000
erstellt.
Eine
Konzentrationsbestimmung war hierfür nicht nötig, da für die Berechnung der
Effizienz die Ct-Werte herangezogen werden.
3.7.8 Durchführung der QRT-PCR
Die quantitative real-time PCR wurde im Mx® 4000 Multiplex Quantitative PCR
System der Firma STRATAGENE durchgeführt. Für die Durchführung der absoluten
Quantifizierung wurde die Einstellung „Quantitative PCR“ gewählt. Die relative
Quantifizierung erfolgte mit dem Programm „Comparative Quantitation“. Für die
Reaktionsansätze wurde der Brilliant® QPCR MasterMix der Firma STRATAGENE
eingesetzt. Dieser enthält bereits Polymerase, Nukleotide und MgCl2 in optimierter
Konzentration.
In
Vorversuchen
wurden
verschiedene
Primer-
und
108
Sondenkonzentrationen
Material und Methoden
getestet.
Dies
führte
zu
folgendem
optimierten
Reaktionsansatz:
25 µl Ansatz:
12,50 µl Brilliant® MasterMix
0,30 µl Vorwärtsprimer (50 µM)
0,30 µl Rückwärtsprimer (50 µM)
0,50 µl Sonde (10 µM)
0,38 µl Referenzfarbstoff ROX (1:500)
Temperaturprofil
95°C 10 min
40 Zyklen
95°C 30 sec
55°C 1 min
72°C 30 sec
10,02 µl AMPUWA
1,00 µl cDNA (1:10000)
Für die Verdünnungsreihen der Plasmid-DNA und cDNA wurden Duplikate der 25 µl
Reaktionen eingesetzt. In den QRT-PCR-Läufen für die absolute Quantifizierung
wurden die Reaktionen für die Einzel-cDNAs der Würmer als Triplikate und für die
relative Quantifizierung als Duplikate eingesetzt. Für alle Reaktionen wurden 8x strip
tubes (0,2 ml) mit optischen Deckeln (8x strip optical cap) der Firma STRATAGENE
verwendet.
Ergebnisse
109
4 Ergebnisse
4.1 Molekularbiologische Ergebnisse
4.1.1 Amplifikation der Protein Disulfid Isomerase von D. viviparus
Um die Sequenz der Protein Disulfid Isomerase bei D. viviparus zu bestimmen,
wurden degenerierte Primer in einer PCR mit cDNA als Template eingesetzt. Nach
diversen Optimierungsläufen gelang mit dem unter 3.3.4.2 beschriebenen PCRProtokoll die Amplifikation eines Produktes mit einer erwarteten Größe von
ca. 1000 bp.
2000 bp
1200 bp
800 bp
1000 bp
400 bp
Abb. 7:
M K 1 2 3 4 5
Mit degenerierten Primern erhaltenes Amplifikat.
1%iges Agarosegel. M: Low DNA Mass Ladder, K: Negativkontrolle,
1: 4 µl Template, 5 µl Q-Solution, 2: 8 µl Template, 3: 6 µl Template,
4: 4 µl Template, 5: 2 µl Template
Die Klonierung und Sequenzierung der etwa 1000 bp großen Bande lieferte eine
Sequenz mit einer Länge von 1018 bp. Im Sequenzvergleich auf Nukleinsäureebene
mittels BLASTN zeigte diese Sequenz höchste Identitäten mit der PDI2 von
Ostertagia ostertagi (Genbank AJ419174) und der PDI von Ancylostoma caninum
(GenBank AY582130).
110
Ergebnisse
4.1.2 Vergleich positiver Klone mittels RFLP
Klone, die in der PCR Inserts der erwarteten Größe von ca. 1000 bp aufwiesen,
wurden mittels RsaI-Verdau verglichen. Der überwiegende Anteil der Klone zeigte
hierbei ein identisches Bandenmuster. Allerdings konnte ein Klon identifiziert werden,
dessen Bandenmuster sich deutlich von dem der anderen unterschied.
2000 bp
1200 bp
800 bp
400 bp
M
Abb. 8:
M
Vergleich positiver Klone mittels RsaI-Verdau.
Der Pfeil zeigt einen Klon mit abweichendem Bandenmuster.
M: Low DNA Mass Ladder
Die Sequenzierung dieses Klons lieferte eine 1024 bp große Sequenz, die im
BLASTN höchste Identitäten mit der Protein Disulfid Isomerase 3 von Caenorhabditis
elegans (GenBank AAF45013) aufwies.
4.1.3 RACE-PCR
Durch den Einsatz genspezifischer Vorwärts- und Rückwärtsprimer sollte mittels
RACE-PCR die mit degenerierten Primern erhaltene Teilsequenz der PDI
vervollständigt werden. Sowohl in der 5’-RACE als auch in der 3’-RACE konnte mit
beiden eingesetzten genspezifischen Primern ein Produkt amplifiziert werden, das
sich im Agarosegel als klare Bande darstellte.
Ergebnisse
111
2000 bp
1200 bp
800 bp
400 bp
M
Abb. 9:
1
2
3
4
5
6
PCR-Produkte der RACE-PCR.
1%iges Agarosegel. M: Low DNA Mass Ladder, 1: 3’-RACE (GSP
PDIDV2RC3), 2: 3’-RACE (GSP PDIDV2RCN3), 3 und 4: Negativkontrollen, 5: 5’-RACE (GSP PDIDV2RC5), 6: 5’-RACE (GSP
PDIDV2RCN5)
Im Alignment mit der bereits bekannten Teilsequenz der PDI zeigte sich eine
vollständige Übereinstimmung der Sequenzen im Überlappungsbereich. Darüber
hinaus war am 5’-Ende ein 308 bp großer Sequenzbereich vorhanden, auf den in 5’Richtung folgend die Sequenz des SMART™-Olygonukleotids identifiziert werden
konnte. Das 3’-RACE-Produkt lieferte auf den Überlappungsbereich folgend eine
386 bp große Teilsequenz mit darauffolgendem Poly-A-Schwanz.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der bereits vorhandenen Teilsequenz im
Programm Align™Plus zusammengesetzt. Nach Übersetzung der 1796 bp großen
Gesamtnukleotidsequenz in die Aminosäuresequenz konnte an der Basenposition 62
ein Startcodon identifiziert werden, auf das ein 493 Aminosäuren großer ORF folgte.
Der offene Leserahmen endete an einem TAA-Stopcodon.
Aufgrund der Identitäten zur PDI2 von O. ostertagi und C. elegans wurde die
vollständige Sequenz als PDI2 von D. viviparus in der NCBI-Datenbank unter der
Nummer DQ 011044 veröffentlicht.
Das zweite identifizierte Gen konnte ebenfalls mittels 5’- und 3’-RACE vervollständigt
werden und wurde aufgrund der Identitäten zur PDI1 von O. ostertagi als PDI1 von
112
Ergebnisse
D. viviparus in der NCBI-Datenbank unter der Nummer DQ 011045 veröffentlicht. Die
PDI1-Sequenz besteht aus 1743 bp und weist einen offenen Leserahmen über 484
Aminosäuren
auf.
Die
vollständigen
cDNA-Sequenzen
und
abgeleiteten
Aminosäurensequenzen beider PDIs von D. viviparus finden sich in Anhang 9.1 und
9.2.
4.1.4 Identitätsvergleiche der PDI1 und PDI2 von D. viviparus mit PDIs
anderer Spezies
Das Alignment der kodierenden Sequenz der PDI2 mit in der NCBI-Datenbank
vorhandenen Sequenzen anderer Nematodenspezies und der Homo sapiens
Sequenz zeigte folgende Identitäten:
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
1
1
1
1
1
1
mfklaclcvfalsaf--aatveeeenvivltkdnfdevinghefvlaefyapwcghcka
mfklaclclfalsaf--aatveeeenvlvltkdnfdevinghefvlaefyapwcghcka
mfklacvcllalsaf--aatveeeknvivltkdnfdevinghefvlaefyapwcghcka
mfklacvcllalsaf--aatveeeknvivltkdnfdevinghefvlaefyapwcghcka
mfrlvglfflvlgas--aavieeeenvivltkdnfdevingnefilvefyapwcghcks
mlrrallcl-avaalvradapeeedhvlvlrksnfaealaahkyllvefyapwcghcka
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
58
58
58
58
58
59
lapeyakaatqlkeegstiklakldatvhgdvaskfevrgyptlklfrsg---kpseys
lapeyakaatqlkdegsaiklakldatvhgdvaskfevrgyptlklfrng---kpseyt
lapeyekaatqlkeegseiklakldatvhgdvaskfevrgyptlklfrng---kpseyt
lapeyektatqlkeegseiklakldatvhgdvaskfevrgyptlklfrng---kpseyt
lapeyakaatqlkeegsdiklgkldatvhgevsskfevrgyptlklfrng---kpqeyn
lapeyakaagklkaegseirlakvdateesdlaqqygvrgyptikffrngdtaspkeyt
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
114
114
114
114
114
118
ggrdaasiiawlkkktgpvaktlktaddvkslqeeadvvvvgyfksvegekakvfleva
ggrdaasiiawlkkktgpvaktlktaddvkslqeeadvvvvgyyknvdgekakifleva
ggrdaasivawlkkktgpvaktlktaddvkslqeeadvvvvgyfkkadgdkakvfleva
ggrdaasivawlkkktgpvaktlktaddvkslqeeadvvvvgyfkkadgdkakvfleva
ggrdhdsiiawlkkktgpvakpladadavkelqesadvvvigyfkdttsddaktfleva
agreaddivnwlkkrtgpaattlpdgaaaeslvessevavigffkdvesdsakqflqaa
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
173
173
173
173
173
177
sgvdnipfgitsedaakkqlelkeegivllkkfddgravfdekltadnlktwiqanrla
ggiddipfgitsedaakkqlelkdegivllkkfddgravfdekltadalktwiqanrlp
agiddipfgistedaakkqlelkeegivllkkfdegrdvfdekltadnlktwiqanrla
agiddipfgistedaakkqlelkeegivllkkfdegrdvfdekltadnlktwiqanrla
agiddvpfgistedavkseielkgegivlfkkfddgrvafdekltqdglktwiqanrla
eaiddipfgitsnsdvfskyqldkdgvvlfkkfdegrnnfegevtkenlldfikhnqlp
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
232
232
232
232
232
236
lvseftqetasvifggeikshnllfvskessefekletefknaarqfkgkvlfvyintd
lvseftqetasvifggeikshnllfvskessefeklesefknaakqfkgkvlfvyintd
lvseftqetasvifggeikshnllfvskessefeklekefknaakqfkgkvlfvyintd
lvseftqetasvifggeikshnllfvskessefeklekefknaakqfkgkvlfvyintd
lvseftqetasvifggeikshnllfvskessefakleqefknaakqfkgkvlfvyintd
lviefteqtapkifggeikthillflpksvsdydgklsnfktaaesfkgkilfifidsd
Ergebnisse
113
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
291
291
291
291
291
295
vednvrimeffglkntdlpavrlisleedmtkfkpdfveintesivkftqayldgtlka
vednarimeffglkkddlpavrlisleedmtkykpdfaeintenivkftqsyldgalkp
vednarimeffglkkddlpavrlisleedmtkfkpdfaeintenivkftqsyldgalkp
vednarimeffglkkddlpavrlisleedmtkfkpdfaeintenivkftqsyldgalkp
veenarimeffglkkdelpairlisleedmtkfkpdfeeitteniskftqnyldgsvkp
htdnqrileffglkkeecpavrlitleeemtkykpeseeltaeritefchrflegkikp
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
350
350
350
350
350
354
hlmseeipedwdkapvkvlvgknfdqvardntknvlvefyapwcghckqlaptwdklge
hlmseeipedwdkapvkvlvgknfdqvardntknvlvefyapwcghckqlaptwdklge
hlmseeipedwdkapvkvlvgknfeqvardntknvlvefyapwcghckqlaptwdklge
hlmseeipedwdkapvkvlvgknfeqvardntknvlvefyapwcghckqlaptwdklge
hlmsedipedwdknpvkilvgknfeqvardntknvlvefyapwcghckqlaptwdklge
hlmsqelpedwdkqpvkvlvgknfedvafdekknvfvefyapwcghckqlapiwdklge
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
409
409
409
409
409
413
kyadheniiiakmdatanevedvkvqsfptikffpagsnk-iidytgdrtlegftkfle
kyadheniiiakmdatanevedvkvqsfptikffpagsnk-vidytgdrtlegftkfle
kyadheniiiakmdatanevedvkvqsfptikffpagsnk-vidytgdrtlegftkfle
kyadheniiiakmdatanevedvkvqsfptikffpagsnk-vidytgdrtlegftkfle
kfaddesiviakmdstlnevedvkiqsfptikffpagsnk-vvdytgdrtiegftkfle
tykdheniviakmdstaneveavkvhsfptlkffpasadrtvidyngertldgfkkfle
D.
A.
T.
O.
C.
H.
v.
c.
c.
o.
e.
s.
PDI2
PDI
PDI
PDI2
PDI2
PDI
467
467
467
467
467
472
sggkegagpsddekaaeeaedeghtel---------sggkegagpsddekaaeeaeeeghtel---------sggkegagpsddekaaeeaeeevhtel---------sggkegagpsddekaaeeaeeevhtel---------tngkegagaseeekaeeeadeeghtel---------sggqdgagddddledleeaeepdmeedddqkavkdel
Abb. 10:
Alignment der Aminosäurensequenz der PDI2 von D. viviparus mit
PDIs anderer Spezies
Unterschiede in den Sequenzen sind gelb unterlegt. Die aktiven
Zentren sind rot, das ER-Retentionssignal ist grün umrandet. D. v.: D.
viviparus,
A.
c.:
Ancylostoma
caninum,
T.
c.:
Teladorsagia
circumcincta, O. o.: Ostertagia ostertagi, C. e. Caenorhabditis elegans,
H. s.: Homo sapiens.
A. caninum PDI2
T. circumcincta PDI2
O. ostertagi PDI2
C. elegans PDI2
H. sapiens PDI2
Tab. 6:
Nukleotide
80%
80%
80%
72%
59%
Aminosäuren
94%
93%
92%
81%
56%
Identitäten der PDI2 von D. viviparus mit PDIs anderer Spezies
Die Sequenz der PDI1 von D. viviparus zeigte höchste Identitäten zur PDI1 von O.
ostertagi und zur PDI3 von C. elegans:
114
Ergebnisse
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
1 ---mtfayvfavlflcasas-dvleytdaifedsikfheialvkfyapwcghckkmape
1 ---mrivcvlaalvlgisasgdvleytdsnfdeliasheva*vkfy*pwcghckklape
1 miwvqaalvasflafasagg-avleytdgnfddliqthdialvkfyapwcghckkiape
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
56 fdkastklksndppvalikvdctvekstcdkygvkgfptlkifrfgseaqayegprdad
57 fdkaatklkandppitlikvdctvekatcdkfgvkgfptlkifrngleaqsydgpread
59 yeraapklasndppvalvkvdcttektvcdkfgvkgfptlkifrngvpaqdydgprdad
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
115 givkymrgqagpsareiksinefkkaisgdenivigffenesklkdsflkvadterdrf
116 givkymrgqagpsakelktveefkkfvgg*enavvgffenesklkdsflkvadterdrf
118 givkfmrgqsgpsskelktvaefekftggdenvvigffesesklkdsylkvadterdrf
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
174 qfaytsdrsvlketgynddivvftpkqlhnkfdpnefkydgnydtdkiknflihetvgm
175 qfgyssna**l*eagytddivvytpkklhnkfdpnefkydgnydtdkiksflihdtvgm
177 sfahtsnkdiikkagysddvvvfvpkklhnkfdtnefkydgnydtdkiknflvhetvgf
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
233 agirthgnlfqfeqkplvivyynvdylkdpkgsnywrnrvlkvakdykrkvhfavsnke
234 agirtmgnlfqfe*kpl*i*yynvdylkdpkgsnyw*nrvlkvaqdykrkvhfavsnke
236 agirtqgnlfqfeqkpivivyynvdyvkdpkgsnywrnrvlkvaqnykrkvqfavsnke
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
292 efssevdqnglslrkdsdkpivaavtnegkfpmdnefsvdnlktfvedliagrlepymk
293 eftteidqnglaerkdsdkpivaavtndgkfpmddefsvenlkafvedvlagnldpymk
295 efsseietnglgerkdsdkpivailtnegkypmdqefsvdnlqqfvdevlagnaepymk
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
351 sepipentga--lkvavaknfkelvlnakkdvlvefyapwcghckalapkyeelaeklv
352 sepipenneseplkvavgrnfkelvmeadkdvlvefyapwcghckalapkye*laktar
354 sepipdeqgd--vkvavgknfkelimdadkdvliefyapwcghckslapkyeelaekln
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
408 ded-vlivkmdatandvpplfevngfptiywlpknkkgspvpysggrevddfisfiakh
411 rkk*vlivkmdatandvpplfevrgfptlywlpkktk-epvplqrgre*ndfinfiakh
411 ked-viiakmdatandvppmfevrgfptlfwlpknaksnpipynggrevkdfvsfiskh
D. v. PDI1
O. o. PDI1
C. e. PDI3
466 stdglkqysrdgkkk-kael
469 stdglkgytrdgkkk-ksel
469 stdglkgfsrdgkkkkktel
Abb. 11:
Alignment der Aminosäuresequenz der PDI1 von D. viviparus mit
PDIs anderer Spezies.
Unterschiede in der Sequenz sind gelb unterlegt. Die aktiven Zentren
sind rot, das ER-Retentionssignal ist grün umrandet. D. v.: D. viviparus,
O. o.: Ostertagia ostertagi, C. e. Caenorhabditis elegans; *nicht
eindeutig definiert
O. ostertagi PDI1
C. elegans PDI3
Tab. 7:
Nukleotide
72%
69%
Aminosäuren
77%
73%
Identitäten der PDI1 von D. viviparus mit PDIs anderer Spezies
Ergebnisse
115
Ein Alignment mittels MegAlign™ (DNA Star) nach der Clustal W-Methode zeigte
folgende phylogenetische Verwandtschaften der PDI1 und PDI2 von D. viviparus zu
PDIs anderer Spezies:
Abb. 12:
Phylogenetischer Stammbaum
4.1.5 Identifizierung konservierter Domänen
Bei der Suche nach konservierten Domänen mittels RPSBLAST in der conserved
domain database (NCBI) zeigte sowohl die PDI1 als auch die PDI2 von D. viviparus
einen Aufbau aus zwei redoxaktiven (a und a’) und zwei redoxinaktiven (b und b’)
Thioredoxin-Domänen. Während die b-Domänen der PDI2 von D. viviparus höchste
Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Domänen der humanen PDI aufweisen, zeigt
die b-Domäne der PDI1 von D. viviparus höhere Ähnlichkeiten zur b-Domäne von
ERp57 und die b’-Domäne höhere Ähnlichkeiten zur b’-Domäne von ERp72 und
ERp57.
Die Domänen erstrecken sich über folgende Sequenzbereiche:
116
Ergebnisse
PDI1 von D. viviparus
20 - 120
127 - 229
233 - 341
361 - 462
AS
364 - 462
AS
PDI2 von D. viviparus
26 - 125
Abb. 13:
133 - 228
240 - 343
Domänenstruktur der PDI1 und PDI2 von D. viviparus.
AS: Aminosäuren
4.1.6 Ermittlung der genomischen Sequenz der PDI2 von D. viviparus
Die genomische Sequenz wurde nur für die PDI2 ermittelt.
Alle Primerkombinationen zur Amplifikation der genomischen Sequenz lieferten mit
genomischer DNA als Template ein größeres Produkt als in der PCR mit cDNA. Dies
wies auf das Vorhandensein von Introns in den amplifizierten Bereichen hin. Abb. 8
zeigt die mit genomischer DNA erhaltenen Amplifikationsprodukte im Vergleich zum
cDNA-Template.
Ergebnisse
117
B
2000 bp
A
2000 bp
1200 bp
800 bp
1200 bp
800 bp
400 bp
400 bp
M
Abb. 14:
1
2
3
4
5
6
M
K
PCR zur Ermittlung der genomischen Sequenz.
1%iges Agarosegel. A: M: Low DNA Mass Ladder, K: Negativkontrolle,
1, 3, 5: Template genomische DNA; 2, 4, 6: Template cDNA;
1, 2: Primerpaar PDI2G1/PDI2G2; 3, 4: Primerpaar PDI2G3/PDI2G4;
5, 6: Primerpaar PDI2G5/PDI2G6; Die Amplifikation der genomischen
DNA mit dem Primerpaar PDI2G5/PDI2G6 (Spur 5) wurde wiederholt
und ist in Abbildung B dargestellt. M: Low DNA Mass Ladder.
Das Alignment der erhaltenen Sequenzen mit der cDNA-Sequenz der PDI2 zeigte
eine vollständige Übereinstimmung der Sequenzen im Überlappungsbereich und
lieferte vier Intronsequenzen. Insgesamt weist die genomische DNA der PDI2 von D.
viviparus eine Länge von 2649 bp auf.
78 bp
151 bp
335 bp
Abb. 15:
92 bp
306 bp
805 bp
361 bp
454 bp
67 bp
Exon-Intron-Organisation der PDI2 von D. viviparus.
Die vier Introns sind weiß, die Exons schwarz dargestellt.
118
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
Abb. 16:
Ergebnisse
ACGGTGTGTC
AATGTTCAAA
AGAAGAGGAG
ACCTGACTGA
ACTTACTCAT
AAATGTTAGC
CACAGTAGTG
CTAAGCTTAT
TTTTAGGACA
GCTCCTTGGT
TTTTTCCATC
TTGCTCCGGA
TAGCAAAACT
ACCCAACACT
CGGCATCAAT
CTGCCGATGA
AGGTATATAG
TAGGCTTGAT
TTACAAAAAC
CGAATTATAC
CTCGGAACAA
TCACATAAGT
GAGTGTCGAA
TCCATTTGGA
TATCGTGCTA
TGACAATCTC
GGAAACGGCA
CAAAGAGTCC
TAAGGGCAAA
GGAATTCTTT
GGATATGACT
CACCCAAGCG
AGATTGGGAT
GGACAATACA
ACTTGCTCCG
TGCCAAAATG
CCGAACGTTC
TCCCGACAAT
GGACTCTTGA
CAGATGATGA
TTGCTGCTAT
TTTGCTCTAC
TTTTCTCTTC
AGAACTACAC
AAAAAAAAA
GGAGTGCTCT
CTCGCCTGCC
AATGTGATCG
TCTGTCCGGG
CTGAATCTGA
AAAATTGCAA
CGTTTTATAA
TTACATTATT
ACTTTGACGA
GCGGTCACTG
AGCTAGCTAT
ATATGCCAAA
AGATGCTACC
GAAACTGTTC
CATTGCATGG
CGTCAAATCA
TGTCGTTTAC
AGTTATTTTT
CAATCCCTTA
ATTTCCCCAG
CGGTGTTCCA
AGCTATGTAT
GGGGAGAAGG
ATCACCTCTG
TTGAAGAAGT
AAAACATGGA
TCTGTCATTT
AGCGAGTTCG
GTTCTCTTTG
GGTCTTAAGA
AAATTCAAAC
TATTTGGATG
AAAGCACCTG
AAAAATGTTC
ACTTGGGACA
GACGCAACTG
AATATTTTAA
CAAGTTCTTC
GGGATTCACT
GAAGGCAGCT
CTTACTGGGG
TAATCACCCA
TTCAATTGTG
CACTGTGTTG
CTTCACGGTG
TTTGCGTCTT
TGCTTACAAA
TTTTCCGTGA
CATTATATCG
GGTTTTCGAA
CATCTAACAG
CTTTGGTCTT
AGTTATTAAC
TAAGGTTGGT
TTCATCGTTT
GCTGCCACAC
GTTCATGGCG
CGCAGTGGAA
TTGAAGAAGA
CTTCAAGAAG
GTTAAGTTAC
GGCCTTCAGC
AATTCTTAAT
CAGAAACTTA
CTATGTTAGC
TTTTTTTTCG
CGAAAGTCTT
AAGATGCTGC
TCGACGATGG
TCCAAGCCAA
TTGGTGGAGA
AAAAGTTAGA
TATACATCAA
ACACTGACTT
CTGACTTTGT
GAACTCTCAA
TAAAAGTGCT
TTGTTGAGTT
AGCTTGGAGA
CTAATGAGGT
TTTGTCGCTT
CCCGCAGGAT
AAATTCCTTG
GAAGAGGCTG
TCGTACGGTC
TGTACGAGTG
ATCGTTGATA
GAGAACTGGG
TTCTAGACAA
TGCTCTGTCG
GGTAATTGAT
AAGTTTCAAA
CATCTTTGTT
TTTGATCTAT
ATTTCTATAA
AATGTACGGT
GGTCATGAGT
CTACAAGTGC
TAATATCGAC
AGCTGAAGGA
ATGTTGCTAG
AGCCGAGTGA
AGACTGGTCC
AGGCTGATGT
GATATCGAGA
GTTATTTCTA
GTTTATGTTG
ATAAGTTTTG
TTGATGGGGT
CCATATAGTT
TTTGGAAGTT
AAAGAAGCAG
ACGCGCAGTG
CCGACTAGCC
GATTAAAAGC
AACTGAATTC
TACGGATGTT
GCCAGCAGTA
CGAGATTAAC
GGCTCACCTC
TGTAGGAAAG
CTATGCTCCA
AAAGTATGCC
GTGAAAATTG
TGAAGGTCGA
CAAATAAAAT
AAAGCGGTGG
AAGACGAGGG
TGACGACCTG
ATCTAAACAT
AGTGATGGTG
TTTAAATAAA
ATTGTCATTC
GCATTCGCCG
TGTTTATGTA
AACAATGTAC
ATATTGTACA
AATATTTGCA
ATAATTCGAA
CAATTCCTAT
TTGTGCTTGC
TTGATGTGCC
TTTTGATTGA
AGAGGGTTCA
CAAGTTCGAG
ATACAGCGGT
GGTCGCGAAG
TGTTGTCGTT
ATTTTAAGTA
ACGTACTTAG
TCTAAAAATG
TATTCATGCT
AATAATTTCC
CAATAATTTT
GCAAGTGGAG
CTAGAACTTA
TTTGATGAGA
CTTGTTTCGG
CATAACCTTC
AAAAATGCTG
GAAGACAACG
CGACTAATCT
ACAGAGAGCA
ATGTCCGAAG
AACTTCGACC
TGGTGTGGTC
GACCACGAGA
TTCATAGCTT
GGACGTAAAA
AATCGACTAC
TAAGGAAGGG
TCATACTGAG
TTGTTGTTAC
TGCCTTCCTG
AAATTTATTT
TATAACATTT
ATTGGGGCGC
CAACTGTTGA
ATTATCGCGG
TTTCCACAAC
TGTCTCTAGT
CATTTGGTTG
AATTGTTTAA
TTTGACAAAC
CGAATTTTAT
CAGTCGTTGT
TTCCAGGCAC
ACGATCAAAT
GTTCGCGGGT
GGACGCGATG
ACATTAAAAA
GGATACTTCA
GAATATTATG
TTGATCATAT
TACAGGCAAA
TGATGTATTC
CTATTGATTC
CTTTTCTTCA
TTGATAATAT
AGGAAGAAGG
AGCTCACTGC
AATTCACTCA
TTTTTGTCTC
CTAGACAATT
TTCGTATAAT
CATTAGAAGA
TTGTTAAATT
AGATTCCTGA
AAGTAGCACG
ACTGCAAGCA
ACATCATAAT
CTTCATTACG
GTGCAATCAT
ACTGGTGACA
GCTGGACCAT
CTGTAAGCAT
AGTTAATTTA
TATATGCGTT
ATTTTTGTTC
TGCCAAAAAA
Vollständige genomische DNA-Sequenz der PDI2 von D. viviparus.
Die vier Introns sind in rot dargestellt.
Ein Vergleich der genomischen Sequenz der PDI2 mit der genomischen Sequenz
der PDI von A. caninum zeigte, dass die Introns sich an den gleichen Positionen
befinden, jedoch bei der PDI2 von D. viviparus wesentlich kleiner sind.
A. caninum
D. viviparus
Ergebnisse
119
Exon 1
Intron 1
Exon 2
Intron 2
Exon 3
Intron 3
Exon 4
Intron 4
Exon 5
Tab. 8:
102 bp
431 bp
78 bp
104 bp
306 bp
425 bp
807 bp
179 bp
491 bp
151 bp
335 bp
78 bp
92 bp
306 bp
361 bp
805 bp
67 bp
454 bp
Vergleich der Exon- u. Introngrößen von A. caninum und D.
viviparus
120
Ergebnisse
4.2 Proteinbiochemische Ergebnisse
4.2.1 Optimierung der Proteinaufreinigung
Die ersten Versuche zur Aufreinigung der PDI wurden mittels des Magne GST™
Purification Systems durchgeführt. Im Coomassie-gefärbten Gel zeigten sich neben
der Fusionsproteinbande mit einer Größe von etwa 81 kDa noch diverse weitere
Banden. Die Überprüfung im Western-Blot mit GST- und PDI-Antikörpern zeigte,
dass es sich bei den Begleitbande um PDI-Bruchstücke und um Kontaminanten
handelte.
M kDa
M
M
kDa
250
250
250
98
64
98
64
98
64
50
50
36
36
30
A
Abb. 17:
30
B
M
kDa
kDa
250
98
64
50
50
36
30
36
C
30
D
Darstellung des aufgereinigten Fusionsproteins.
M: Marker Seeblue® A: Coomassie-gefärbtes SDS Gel; B: WesternBlot mit Anti-GST-Ak; C: Western-Blot mit Anti-PDI-Ak; Western-Blot
mit Serumpool von D. viviparus infizierten Rindern
In den darauffolgenden Optimierungsversuchen gelang es nicht, die Begleitbanden
vollständig zu eliminieren. Im Folgenden sind beispielhaft einige Ergebnisse der
verschiedenen Versuchsbedingungen aufgeführt.
Ergebnisse
121
4.2.1.1 Proteinexpression
Um den Einfluss der Proteinexpression auf das Aufreinigungsergebnis zu
überprüfen, wurden sowohl unterschiedliche Expressionsbedingungen im E. coli BL
21 (DE3)-Stamm getestet, als auch eine Expression im E. coli BL 21 (DE3) Codon
Plus® Stamm durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass weder mildere
Expressionsbedingungen
(Verkürzung
der
Inkubationszeit,
geringere
IPTG-
Konzentration, niedrigere Inkubationstemperatur), noch der Einsatz des BL 21 (DE3)
Codon Plus® Stammes das Aufreinigungsergebnis verbessern konnten.
kDa
M
250
98
64
50
36
30
1
Abb. 18:
2
3
4
5
6
7
8
Optimierung der Expression.
Western
Blot,
Anti-GST-Antikörper.
Aufreinigungsergebnis
nach
unterschiedlichen Expressionsbedingungen. M: Marker Seeblue®;
1, 2, 3, 4: 3 h Inkubation; 5, 6, 7, 8: 6 h Inkubation; 1, 2, 5, 6: Inkubation
bei 25°C; 3, 4, 7, 8: Inkubation bei 30°C; 1, 3, 5, 7: Induktion mit 0,2 mM
IPTG; 2, 4, 6, 8: Induktion mit 1,0 mM IPTG.
Da keine Unterschiede zwischen den Stämmen vorhanden waren, wurde für
nachfolgende Expressionen der BL 21 (DE3) Stamm verwendet. Mit einer IPTGKonzentration von 1,0 mM und einer Inkubation für 5 h bei 37°C war die Ausbeute an
122
Ergebnisse
Fusionsprotein sehr hoch, sodass die Herstellung des Fusionsproteins für die
Immunisierungen unter diesen Bedingungen erfolgte.
4.2.1.2 Vergleich unterschiedlicher Lysebedingungen
Um die Auswirkungen unterschiedlicher Lysebedingungen zu überprüfen, wurde eine
Zellsuspension in zwei Fraktionen aufgeteilt und pelletiert. Ein Pellet wurde
ausschließlich für 45 min mittels Magne GST™-Lysepuffer lysiert, das andere
zusätzlich mit Ultraschalimpulsen behandelt. Die anschließende Aufreinigung erfolgte
bei beiden Proben mittels Magne GST-Partikel nach identischem Protokoll (1 h
Anlagerung, 5 x Waschen für 10 min mit 2 ml Waschpuffer).
kDa
kDa
B
A
42
123
77
42
30
30
123
77
1
Abb. 19:
2
3 4 5 6 7
8 9
1 2
3 4 5 6 7 8 9
Western-Blot zum Vergleich der Aufreinigung nach
unterschiedlichen Lysebedingungen.
Antikörper: Anti-GST; A: Lysepuffer; B: Lysepuffer + Ultraschall;
1:
Marker
Roth;
2:
Zelllysat;
3:
Zelllysat
nach
Anlagerung;
4, 5, 6, 7: 1., 2., 3., 4. Waschschritt; 8: 1. Eluat; 9: 2. Eluat.
Es konnte gezeigt werde, dass die Zelllyse mittels Ultraschall wesentlich effektiver
ist,
das
Ergebnis
der
Aufreinigung
jedoch
nicht
beeinflusst
wird.
Die
Ultraschallbehandlung führte also nicht zu einer vermehrten Koaufreinigung
bakterieller Kontaminanten bzw. konnte hierin nicht die Ursache für das Auftreten
degradierten rekombinanten Proteins gesehen werden.
Ergebnisse
123
4.2.1.3 Unterschiedliche Aufreinigungbedingungen im Magne GST™-Protokoll
und mittels Sepharose™-Medium
Bei der Aufreinigung mittels des Magne GST™ Purification Systems wurde versucht,
durch Erhöhung der Anzahl und Länge der Waschzyklen und durch ein größeres
Waschvolumen eine Verbesserung des Aufreinigungsergebnisses zu erzielen. Dies
konnte jedoch nicht erreicht werden. Ebenso wenig führte eine Erhöhung der NaClKonzentration im Waschpuffer oder ein Zusatz der unter 3.4.3.1 aufgeführten
Substanzen zu einer Verringerung der bakteriellen Kontaminanten.
Auch der Einsatz von Glutathione Sepharose™-Medium konnte keine Verbesserung
des Aufreinigungsergebnisses erzielen.
4.2.1.4 Aufreinigung mittels FPLC
In der Aufreinigung mittels FPLC zeigten sich die gleichen Begleitbanden in
vergleichbarer Intensität wie bei den anderen Aufreinigungsmethoden. Aufgrund der
Automatisierung des Prozesses wurde dann letztendlich dieses Verfahren gewählt,
um große Mengen Fusionsprotein für die Immunisierungen aufzureinigen. Abb. 14
zeigt fünf Peak-Fraktionen eines Laufes.
1a 1b 2a 2b
Abb. 20:
3a
3b
4a 4b 5a 5b
Coomassie-gefärbtes SDS-Gel der fünf Peak Fraktionen eines
FPLC-Laufes.
a: nicht aufkonzentriert, b: mit Vivaspin aufkonzentriert.
124
Ergebnisse
4.2.2 Proteinproduktion für die Immunisierungen
Für die Immunisierungen wurde die PDI über Affinitätssäulen mittels FPLC
aufgereinigt. Aus den einzelnen FPLC-Läufen wurden die Peak-Fraktionen
zusammengeführt und mit Vivaspin-Säulen aufkonzentriert.
Da es nicht möglich war, vor dem ersten Immunisierungsdurchgang ausreichend
Protein für beide Immunisierungsversuche herzustellen, wurden die beiden Versuche
mit zwei unterschiedlichen Proteinpools durchgeführt. Die Konzentrationsmessungen
im Agilent 2100 Bioanalyzer lieferten folgende Werte:
Abs. Protein- Rel. Konz.
MW
SD
Konzentration Fusions-Protein
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
Fusions-Protein MW
(%)
(%)
SD
Chip 1: 499,3
453,1
502,5
342,2
316,6
350,2
68,5
69,9
336,3 17,6 69,7
69,4 0,8
Chip 2: 482,9
528,9
485,7
482,7
329,8
365,5
347,9
342,1
68,3
69,1
76,1
346,3 14,8 70,9
71,1 3,5
Chip 3: 470,6
445,5
425,8
482,6
406,4
MW
472,2
312,8
323,8
298,0
337,1
287,3
66,5
72,7
70,0
69,9
311,8 19,8 70,7
331,5 17,8
70,0 2,2
70,1 0,9
Tab. 9:
Agilent-Messungen des I. Proteinpools.
MW: arithmetischer Mittelwert, SD: Standardabweichung
Ergebnisse
125
Rel. Konz.
Abs. ProteinMW
Mittelwert
Fusions-Protein
Konzentration
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
433,0
564,7
408,4
521,3
493,7
539,1
536,9
464,5
516,4
Tab. 10:
497,6
339,8
441,8
314,9
397,8
379,9
405,5
419,2
366,0
425,9
SD
Fusions-Protein MW
(%)
(%)
387,9 41,7
78,5
78,2
77,1
76,3
77,0
75,2
78,1
78,8
82,5
SD
78,0 2,1
Agilent-Messungen des II. Proteinpools.
MW: arithmetischer Mittelwert, SD: Standardabweichung
Die folgende Abbildung zeigt beispielhaft die graphische Darstellung der bei der
Messung des zweiten Proteinpools erhaltenen Ergebnisse.
126
Ergebnisse
A
Fusionprotein
B
Fusionsprotein
C
P eak
2
3
4
5
6
7
8
9
M ig.Tim e(secs) Corr.Area S ize(kDa) Rel.Conc.(µg/m l) % Total Observations
19,3
169,95
9,4
System Peak
22
2,62
18
9,4
2,2
23,15
3,34
23,7
11,9
2,8
26,35
3,41
45,2
12,2
2,8
27,1
2,84
50,5
10,1
2,3
28,85
6,58
65,4
23,5
5,4
29,8
95,07
77,6
339,8
78,5
36,85
7,31
166,3
26,1
6
Total Rel Conc: 433 µg/m l
Abb. 21:
Messung des II. Proteinpools.
A: generiertes Gelbild der 9 Messungen, B: Elektropherogramm der 1.
Messung, C: ermittelte Werte für die erste Messung.
Ergebnisse
127
4.2.3 Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Analyse
Die von der Firma TOPLAB durchgeführte Datenbanksuche mit den erhaltenen
Peptidmassen identifizierte sowohl die GST aus S. japonicum als auch die Protein
Disulfid Isomerase aus A. caninum und aus O. ostertagi. Da die beiden letzteren
weitestgehend identische Peptidmassen aufwiesen, ist es (laut Mitteilung des
Labors) wahrscheinlich, dass es sich bei der eingesandten Probe um das
entsprechende Protein aus D. viviparus handelt. Die PDI aus D. viviparus konnte
nicht direkt identifiziert werden, da sich die Sequenz zum Untersuchungszeitpunkt
erst kurzfristig in der Datenbank befand. Für die GST aus S. japonicum ergab sich
eine 70%ige Übereinstimmung der Fingerprints, für die Protein Disulfid Isomerase
stimmten bei A. caninum 30% und bei O. ostertagi 32% der Fingerprints überein.
128
Ergebnisse
4.3 Tierexperimentelle Ergebnisse
4.3.1 Tiergesundheit
4.3.1.1 Allgemeinuntersuchung
Mit Ausnahme eines Tieres (Nr. 544), das aufgrund respiratorischer Symptome und
Fieber in der dritten Versuchswoche medikamentös behandelt werden musste,
wiesen alle Tiere bis zur experimentellen Infektion ein ungestörtes Allgemeinbefinden
auf. Außer einer bei den meisten Tieren vorhandenen Trichophytie konnten keine
Anzeichen einer Erkrankung beobachtet werden. Die Trichophytie war gering bis
mittelgradig ausgeprägt und führte nicht zu einer Beeinträchtigung der Tiere.
Im Verlauf der experimentellen Infektion zeigten alle Tiere mehr oder weniger
ausgeprägt Zeichen einer klinischen Dictyocaulose.
Der überwiegende Anteil der Tiere zeigte keine oder nur eine geringgradige Störung
des Allgemeinbefindens in Form von Mattigkeit. Bei einer deutlichen Störung des
Allgemeinbefindens war in den meisten Fällen auch Fieber vorhanden, sodass ein
medikamentöses Eingreifen notwendig war (siehe Abschnitt 4.3.1.4). Das Auftreten
von Nasenausfluss erwies sich als nicht konstant zu beobachtender Parameter, da
sich die Tiere den Ausfluss spontan und bei der Nahrungsaufnahme entfernten. Am
Tag der Schlachtung wurden die Tiere früh morgens vor der Fütterung untersucht,
sodass hier bei einem Großteil der Tiere mucopurulenter Nasenausfluss beobachtet
werden konnte. Alle Tiere zeigten respiratorische Symptome in Form von Husten,
Erhöhung der Atemfrequenz und Veränderung der Atmungsqualität. Z.T. waren bei
der Auskultation pathologische Atemgeräusche vernehmbar.
Ergebnisse
129
II. Immunisierungsversuch
I. Immunisierungsversuch
PDI
Quil A
PDI
Al(OH)3
Tab. 11:
Tier-
HF
KT
110
+
57
109
↑
795
++
58
112
↑
802
+
62
110
↑
805
+
60
117
↑
808
-
51
101
↑
-
814
-
68
113
-
100
↑
754
+
44
98
↑
67
106
↑
762
+
53
105
↑
-
71
93
↑
790
+
54
103
-
586
-
47
99
-
807
+
49
104
↑
597
-
59
99
-
810
+
51
104
↑
952
-
68
109
-
816
++
57
99
↑
540
-
60
111
↑
545
-
64
114
-
581
-
61
105
↑
752
-
64
110
↑
579
-
61
96
-
600
-
68
103
-
753
+
62
106
↑
948
-
59
105
-
HF
KT
588
-
55
99
-
596
-
60
103
-
598
-
54
86
-
950
+
72
108
↑
611
+
77
118
↑
749
-
66
101
757
-
62
914
-
544
Nr.
Kontrolle Quil A
AF
AF
Gruppe
Tier-
AB
AB
Kombi Quil A
Kombi
Quil A
Kombi
Al(OH)3
Kontrolle
Al(OH)3
Gruppe
Nr.
Befunde der täglichen Untersuchung ab Tag 70.
Bei den angegebenen Atem- und Herzfrequenzen handelt es sich um
arithmetische Mittelwerte der Tage 70-98 (PDI Quil A, PDI Al(OH)3),
70-99 (Kontrolle Al(OH)3, Kombi Al(OH)3, Kombi Quil A) bzw. 70-97
(II. Immunisierungsversuch); AB = Allgemeinbefinden: - nicht gestört, +
ggr. gestört, ++ deutliche Störung des Allgemeinbefindens; KT =
Körpertemperatur: ↑: Erhöhung konnte beobachtet werden, - :konstant
physiologisch (<40°C)
Ergebnisse
Atemzüge/min
130
90
80
70
60
50
40
30
20
I. Immunisierungsversuch
-7 0 21 42 63 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98
Versuchstage
Atemzüge/min
Kontrolle
KontrolleAl(OH)3
Al(OH)3
90
80
70
60
50
40
30
20
Kombi
Kombi Al(OH)3
Al(OH)3
Kombi
Kombi Quil
QuilAA
I. Immunisierungsversuch
-7 0 21 42 63 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98
Versuchstage
Atemzüge/min
Kontrolle
KontrolleAl(OH)3
Al(OH)3
90
80
70
60
50
40
30
20
PDI
PDIAl(OH)3
Al(OH)3
PDI Quil
QuilAA
II. Immunisierungsversuch
-7
0 21 42 63 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96
Versuchstage
Kontrolle
KontrolleQuil
QuilA A
Abb. 22:
Kombi
Kombi Quil
QuilAA
Veränderung der Atemfrequenzen während des Versuchsverlaufs.
Darstellung der Tagesmittelwerte je Gruppe.
Ergebnisse
131
Abb. 22 zeigt die Gruppenmittel der Atemfrequenzen über den gesamten
Versuchsverlauf. Die bei der Einstallung durch Beunruhigung der Tiere noch
erhöhten Herzfrequenzen erreichten bis zum Tag 70 physiologische Werte. Dies ist
auf eine Gewöhnung der Tiere an die Umgebung und an die Manipulationen bei der
Untersuchung zurückzuführen. Ab Tag 70 zeigte sich in allen Gruppen ein
kontinuierlicher Anstieg der mittleren Atemfrequenzen.
4.3.1.2 Gewichtsentwicklung
An den Versuchstagen 0, 21, 42, 63 und vor der Sektion wurden die Tiere gewogen.
Beim I. Immunisierungsversuch erfolgte die Wägung am Tag der Sektion (Tag 98
bzw. 99). Die Tiere waren hierbei nüchtern. Beim II. Immunisierungsversuch wurden
die Rinder am Spätnachmittag vor der Sektion (Tag 97) gewogen, sodass es sich
hierbei nicht um Nüchterngewichte handelt. Eine Vergleichbarkeit der beiden
Versuche ist daher nicht gegeben. Abbildung 25 zeigt die Gruppenmittel der
prozentualen Gewichtszunahmen von einer zur nächsten Wägung.
I. Immunisierungsversuch
II. Immunisierungsversuch
20
Tag 0 bis 21
Abb. 23:
Tag 21 bis 42
*
Tag 42 bis 63
*
Kombi
Quil A
*
Kontrolle
Quil A
-10
*
PDI
Quil A
-5
Kombi
Al(OH)3
*
0
PDI
Al(OH)3
5
Kombi
Quil A
10
Kontrolle
Al(OH)3
Gewichtzunahme (%)
15
Tag 63 bis Sektion
Gruppenmittel der prozentualen Gewichtszunahme.
Die mit * gekennzeichneten Werte wurden auf Grundlage von
Nüchterngewichten vor der Sektion bestimmt.
132
Ergebnisse
Die Bestimmung des Nüchterngewichtes beim I. Immunisierungsversuch führte zu
einem scheinbar erhöhten Gewichtsverlust post infectionem.
4.3.1.3 Lokale Impfreaktionen
An den Injektionsstellen kam es bei einem Teil der Tiere zu lokalen Reaktionen in
Form von nicht schmerzhaften Umfangsvermehrungen. Diese hatten bei fünf Tieren
an den ersten Tagen des Auftretens einen Durchmesser von 5 bis 10 cm, in den
übrigen Fällen blieben die Schwellungen kleiner als 5 cm im Durchmesser.
Spätestens 12 Tage post injectionem hatten sich die Umfangsvermehrungen
vollständig zurückgebildet.
Ergebnisse
133
Tage nach 1. Impfung
Tage nach 2. Impfung
Tage nach 3. Impfung
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1. Immunisierungsversuch
588
596
598
950
611
749
757
914
544
586
597
952
540
545
581
752
579
600
753
948
O O O O O O O O O
O O
O O O O O
O O O O O O O
O
O O O
O O O O O
O O
O O
O O O O
O
O
O
O O
O O
O
O
O
O
O O O O
O
O O
O O
O O O O O O O O
O O O O
O
O O O
O O O
O O
O
O
O O
O
O O O O O
O O
O
2. Immunisierungsversuch
110
795
802
805
808
814
754
762
O
790
O
807
810 O O
816
O
Tab. 12:
O O O
O
O O O O
O O O O
O O
O O O O O O
O
O
O O O
O O O
O O O
O
O O O O
Auftreten lokaler Impfreaktionen
Ø > 5 cm
O
Ø < 5 cm
134
Ergebnisse
4.3.1.4 Behandlung erkrankter Tiere
Bei folgenden Tieren war eine medikamentöse Behandlung notwendig:
Tier-Nummer
544
540
581
Tab. 13:
Gruppe
Versuchstag
I. Immunisierungsversuch
15–19
Kombi Quil A
88
88-92
90
PDI A
90-94
94
PDI A
94-98
II. Immunisierungsversuch
814
Kontrolle Quil A
89
805
Kontrolle Quil A
92
795
Kombi Quil A
807
Kombi Quil A
816
Kombi Quil A
810
Kombi Quil A
95-96
95-97
95
95-97
95
95-97
96
96-97
Medikamente
Baytril 2,5% oral
Finadyne, i.v.
Baytril 10%, i.v.
Finadyne, i.v.
Baytril 10%, i.v.
Finadyne, i.v.
Baytril 10%, i.v.
Finadyne, i.v.
Draxxin, s.c.
Finadyne, i.v.
Draxxin, s.c.
Finadyne, i.v.
Baytril 10%, i.v.
Finadyne, i.v.
Baytril 10%, i.v.
Finadyne, i.v.
Baytril 10%, i.v.
Finadyne, i.v.
Baytril 10%, i.v.
Behandlung erkrankter Tiere
4.3.1.5 Differentialblutbild
Die Bestimmung des Differentialblutbildes erfolgte an den Versuchstagen 0, 63, 84,
91 und bei der Sektion. Folgende Tiere wiesen eine erhöhte Leukozytenzahl auf:
950:
Tag 63 (12,9 G/l)
Tag 99 (16,5 G/l)
581:
Tag 63 (12,2 G/l)
Tag 84 (12,5 G/l)
752:
Tag 63 (13,4 G/l)
814:
Tag 0 (12,1 G/l)
754:
Tag 0 (14,1 G/l)
Tag 91 (13,2 G/l)
Ergebnisse
762:
Tag 0 (12,7 G/l)
790:
Tag 0 (12,3 G/l)
135
Tag 63 (12,1 G/l)
Eine absolute Eosinophilie (> 1,5 G/l) war bei folgenden Tieren vorhanden:
544:
Tag 91 (2,12 G/l)
952
Tag 91 (1,71 G/l)
805
Tag 91 (1,55 G/l)
810
Tag 84 (1,56 G/l)
Eine vollständige Darstellung der Ergebnisse der Eosinophilenzählung nach der
experimentellen Infektion findet sich im Anhang, Abschnitt 9.3, Tab. 18.
Es konnten keine weiteren Veränderungen des Differentialblutbildes festgestellt
werden (Normalwerte nach PLONAIT 1980).
4.3.2 Larvenausscheidung
Ab Versuchstag 84 (21 dpi) erfolgte eine tägliche Kontrolle der Larvenausscheidung
mittels des Trichterauswanderverfahrens nach BAERMANN (1917). Aus den
Larvenzahlen des 2 mal 10 g Doppelansatzes wurde der arithmetische Mittelwert
gebildet. Die folgenden Abbildungen zeigen den Verlauf der Larvenausscheidung in
den Versuchsgruppen sowie die absolute Larvenausscheidung der Einzeltiere.
136
Ergebnisse
1800
Mittelwert Larven
1600
I. Immunisierungsversuch
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
84
85
86
87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
Versuchstage
I: Kombi Al(OH)3
Al(OH)3
I: Kontrolle
KontrolleAl(OH)3
Al(OH)3
I:I: PDI
PDI Al(OH)3
Al(OH)3
I: Kombi Quil A
I: PDI Quil A
1800
Mittelwert Larven
1600
II. Immunisierungsversuch
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
84
85
86
87 88 89 90 91 92 93 94 95
Versuchstage
97
98
II: Kombi Quil A
II: Kontrolle Quil A
Abb. 24:
96
Larvenausscheidung im I. und II. Immunisierungsversuch.
Gruppenmittelwerte
Übersichtlichkeit
an
wurde
den
auf
Versuchstagen.
Angabe
der
Aus
Gründen
der
Standardabweichung
verzichtet. Diese befinden sich im Anhang, Abschnitt 9.4, Tab. 19.
Ergebnisse
137
I. Immunisierungsversuch
II. Immunisierungsversuch
20
Larven ( x1000)
16
12
8
4
Kombi
Al(OH)33
Al(OH)
Kombi
Quil A
PDI
Al(OH)3
Al(OH)3
PDI
Quil A
611
749
754
914
544
586
597
952
540
545
581
752
579
600
753
948
Kontrolle
Quil A
Kombi
Quil A
110
795
802
805
808
814
754
762
790
807
810
816
Kontrolle
Al(OH)3
Al(OH)
3
588
596
598
950
0
Tiernummern
Abb. 25:
Larvenausscheidung im I. und II. Immunisierungsversuch.
Gesamtlarvenausscheidung der Einzeltiere (Summe der Mittelwerte des
2 x 10 g Doppelansatzes).
Zwischen den immunisierten und nicht-immunisierten Gruppen konnten keine
statistisch signifikanten Unterschiede in der Larvenausscheidung festgestellt werden
(p>0,05, Zweifaktorielle Varianzanalyse für abhängige Stichproben).
Die absoluten Zahlen der Gesamtlarvenausscheidung sind in Abschnitt 4.3.4,
Tab. 11, vorzufinden.
4.3.3 makroskopische Beurteilung der Lungen
Bei der Sektion zeigten sich pathologische Veränderungen an den Lungen in Form
von multifokal vorhandenen dunkelroten, atelektatischen Bezirken unterschiedlicher
Ausdehnung. Einige Tiere zeigten eine herdförmige fibroblastische Pleuritis. Der
Charakter
der
entzündlichen
Veränderungen
führte
bei
allen
Tieren
zur
138
Ergebnisse
Verdachtsdiagnose katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie. Im Folgenden sind die
an den Lungen erhobenen pathologisch-anatomischen Befunde aufgeführt:
I. Immunisierungsversuch
Verdachtsdiagnose
Befunde
Tier-
PDI
Quil A
PDI
Al(OH)3
Kombi
Quil A
Kombi
Al(OH)3
Kontrolle
Al(OH)3
Nr.
Anteil der entzündlichen
Hyperplasie
Veränderungen
der
multifokale
Pleuritis
katarrhalischeitrige
linke
rechte
Bronchial-
Lunge
Lunge
lymphknoten
588
bis zu 35%
5%
mgr.
-
ggr.
596
5-15%
5-10%
ggr.-mgr.
-
ggr.
598
20-25%
5-10%
mgr.-hgr.
-
ggr.
950
5-10%
bis zu 40%
mgr.
ggr.
ggr.-mgr.
611
bis zu 90%
10-15%
mgr.-hgr.
-
ggr.-mgr.
749
10-15%
5-10%
mgr.
-
ggr.
757
5-15%
bis zu 60%
mgr.-hgr.
-
ggr.-mgr.
914
bis zu 40%
bis zu 90%
mgr.-hgr.
-
mgr.
544
5-15%
bis zu 60%
mgr.-hgr.
ggr.-mgr.
ggr.-mgr.
586
5-10%
5%
ggr.-mgr.
-
ggr.
597
5%
5%
ggr.-mgr.
ggr.
ggr.
952
15%
5-10%
mgr.-hgr.
-
ggr.
540
20-35%
5%
mgr.
ggr.
ggr.-mgr.
545
10-50%
5-15%
mgr.-hgr
ggr.
ggr.-mgr.
581
0-15%
5-10%
mgr.
-
ggr.-mgr.
752
5-40%
5%
mgr.
-
ggr.-mgr.
579
10-30%
5%
mgr.-hgr.
-
ggr.-mgr.
600
10-25%
5%
mgr.-hgr.
ggr.
ggr.-mgr.
753
5-70%
10-70%
mgr.-hgr.
-
mgr.
948
5-15%
5-10%
mgr.
-
ggr.-mgr.
Tab. 14:
Bronchopneumonie
Pathologisch-anatomische Befunde des I. Immunisierungsversuchs
Ergebnisse
139
II. Immunisierungsversuch
Befunde
Anteil der entzündlichen
Tier-
Kombi
Quil A
Kontrolle
Quil A
Nr.
Veränderungen
Verdachtsdiagnose
multifokale
Hyperplasie
der
Pleuritis
katarrhalischeitrige
linke
rechte
Bronchial-
Lunge
Lunge
lymphknoten
110
30%
10%
mgr.
-
mgr.
795
20%
20%
hgr.
ggr.
mgr.
802
bis zu 60%
30-40%
hgr.
-
mgr.-hgr.
805
5%
bis zu 80%
mgr.
-
mgr.
808
20-30%
20%
mgr.-hgr.
-
mgr.
814
5-10%
5%
ggr.
-
ggr.
754
5-10%
10%
ggr.
hgr.
ggr.
762
20-30%
10%
mgr.
-
ggr.-mgr.
790
15-20%
5-10%
mgr.
-
ggr.-mgr
807
20-25%
15-20%
mgr.
-
mgr.
810
20-30%
15%
mgr.
-
mgr.
816
10%
15%
mgr.
ggr.
ggr.-mgr.
Tab. 15:
Bronchopneumonie
Pathologisch-anatomische Befunde des II. Immunisierungsversuchs
4.3.4 Bestimmung der Anzahl adulter D. viviparus
Aus den exenterierten Rinderlungen wurden die adulten Lungenwürmer manuell
gewonnen und anschließend mikroskopisch geschlechtsdifferenziert. Die folgende
Tabelle zeigt die Anzahl männlicher und weiblicher Würmer pro Versuchstier sowie
die Durchschnittswerte der Versuchsgruppen. Zur Berechnung der Fekundität,
definiert als Larven pro weiblichem Wurm (Larven/w Wurm) ist die Gesamtzahl der
während des Versuchs ausgeschiedenen Larven angegeben. Diese berechnete sich
aus der Summe der Mittelwerte der 2 x 10 g Doppelansätze.
140
Ergebnisse
Gruppe Tier
AlOH3
AlOH3
Quil A
AlOH3
Quil A
Quil A
Quil A
Kontrolle
Kombi
Kombi
PDI
Kombi
Kontrolle
PDI
Nr.
Tab. 16:
Larven total
Adulte
m
w
588
596
598
950
611
749
757
914
544
586
597
952
540
545
581
752
579
600
753
948
187
105
276
349
323
44
133
80
141
189
89
90
138
319
172
344
70
231
356
107
282
159
395
474
513
82
175
152
269
261
156
217
300
471
195
490
168
387
582
178
110
795
802
805
808
447
324
77
159
142
689
474
136
294
291
814
754
762
790
807
810
816
260
179
289
199
283
192
84
391
291
476
337
489
325
145
total (Tier)
MW (Gruppe)
Tier
Gruppe
I. Immunisierungsversuch
469
5194
557
264
2816
32716
SD=243,1
671
5966
823
18740
836
14638
376
126
2078
25446
SD=315,9
308
5828
232
2902
410
2838
450
4855
353
11537
SD=93,9
245
1234
307
2610
438
5128
607
790
5884
25943
367
8015
SD=238,9
834
6916
238
817
520
618
3029
12500
SD=326,1
938
6755
285
1899
II. Immunisierungsversuch
1136
10490
798
5552
213
529
614
24310
453
2990
SD=324,7
433
3221
651
1529
470
4254
765
2096
548
536
1929
13299,5
SD=203,1
772
3769
517
961
229
292
Larven/w Wurm
Tier
18,4
17,7
15,1
39,5
28,5
25,3
33,3
19,1
10,6
18,6
7,9
12
17,1
12,5
41,1
14,1
4,9
7,8
11,6
10,7
15,2
11,7
3,9
10,2
11,1
3,9
14,6
4,4
5,7
7,7
3,0
2,0
MW (Gruppe)
22,7
SD=11,3
26,6
SD=6,0
12,3
SD=4,5
21,2
SD=13,4
8,8
SD=3,0
9,3
SD=4,5
6,2
SD=4,6
Anzahl adulter Lungenwürmer und Larvenausscheidung.
Die Unterschiede in den Wurmzahlen zwischen den Gruppen waren statistisch nicht
signifikant (p = 0,58, Kruskal-Wallis Test).
Ergebnisse
141
4.3.5 Bestimmung der Wurmgröße
Von jedem Versuchstier wurden die Länge und Breite von 25 männlichen und 25
weiblichen Würmern mithilfe der OLYMPUS-Software 5050 bestimmt.
II: Kombi Quil A
42,3
32,1
II: Kontrolle Quil A
47,3
35,3
I: PDI Quil A
44,1
35,2
I: PDI AI(OH)3
46,9
37,6
I: Kombi Quil A
46,3
34,0
I: Kombi AI(OH)3
45,3
33,2
I: Kontrolle AI(OH)3
40,5
0
10
20
30
40
50
52,7
60
70
Länge (mm)
Abb. 26:
Darstellung der mittleren Wurmlängen
und Standardabweichungen in den Versuchsgruppen.
grau: Länge der Weibchen; schraffiert: Länge der Männchen
Im Anhang, Abschnitt 9.5, Tab. 20, sind je Tier Mittelwerte und Standabweichungen
von Längen und Breiten der adulten Würmer dargestellt.
Weibliche Würmer der vakzinierten Tiere im I. Immunisierungsversuch waren
11-16,3% kürzer als die der Kontrolltiere. Bei den männlichen Würmern der
Vakzinegruppen war eine Längenreduktion von 7,2-18% vorhanden. Im II.
Vakzineversuch waren die weiblichen Würmer der Kombigruppe 10,6%, die
142
Ergebnisse
männlichen Würmer 9,1% kleiner als die der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse
waren statistisch nicht signifikant (Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test,
Kruskal-Wallis Test, p = 0,09 für weibliche Würmer; p = 0,12 für männliche Würmer).
4.4 Ergebnisse der serologischen Untersuchungen
4.4.1 ELISA
Während des Versuchsdurchgangs wurde die Bildung von Anti-PDI Antikörpern der
Tiere überprüft.
Alle immunisierten Tiere zeigten einen Titeranstieg zwischen dem vierten und elften
Versuchstag. Dieser Anstieg war bei allen untersuchten Antikörperklassen
vorhanden, wobei die höchsten ODs bei IgG2 zu verzeichnen waren. Die
Kontrollgruppen zeigten nach der experimentellen Infektion einen Titeranstieg bei
IgG und IgG1. Bis zum Ende des Versuchs wurden jedoch nicht die Werte der
Immunisierungsgruppen erreicht.
Index Gruppenmittel
Ergebnisse
143
IgG
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
Index Gruppenmittel
0
1,6
4
7
11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Tage
S
7
11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Tage
S
7
11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Tage
S
IgG1
1,2
0,8
0,4
0,0
Index Gruppenmittel
0
1,6
4
IgG2
1,2
0,8
0,4
0,0
0
4
I: Kontrolle Al(OH)3
3
I: Kombi Al(OH)33
II: Kombi Quil A
I: PDI Al(OH)3
3
I: Kombi Quil A
I: PDI Quil A
II: Kontrolle Quil A
Index Gruppenmittel
144
Ergebnisse
IgA
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
Index Gruppenmittel
0
4
7
11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Tage
S
7
11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Tage
S
IgM
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0
4
I: Kontrolle Al(OH)3
3
I: Kombi Al(OH)33
II: Kombi Quil A
Abb. 27:
I: PDI Al(OH)3
3
I: Kombi Quil A
I: PDI Quil A
II: Kontrolle Quil A
Gruppenmittelwerte der Indices für verschiedene
Serumantikörpertiter
Detaildaten incl. Standardabweichung finden sich aus Gründen der Übersichtlichkeit
im Anhang, Abschnitt 9.6, Tab. 21.
4.4.2 Überprüfung der Serokonversion mittels Westernblot
Da es nicht möglich war, rekombinante PDI ohne GST und ohne bakterielle
Kontaminanten zu gewinnen, wurde die im ELISA beobachtete Serokonversion
zusätzlich im Western-Blot überprüft. Hiermit sollte ausgeschlossen werden, dass
Ergebnisse
145
der Anstieg der OD ausschließlich auf einer Reaktion auf GST oder bakteriellen
Kontaminanten beruhte. Hierzu wurden die Seren der Kontrollgruppe und der PDIimmunisierten Tiere des I. Immunisierungsversuchs anhand von D. viviparus
Rohantigen überprüft.
Nach der dritten Immunisierung (Tag 63) zeigte sich bei den PDI-immunisierten
Tieren eine Bande auf einer Höhe von etwa 55 kDa. Dies entspricht dem
Molekulargewicht der PDI. Nach der Infektion zeigte sich auch mit den Seren der
Kontrolltiere eine Bande auf gleicher Höhe, jedoch stellte sich diese schwächer dar
als bei den immunisierten Tieren. Mit dem Serumpool D. viviparus-infizierter
Stammhaltungrinder (Positivpool) konnte ebenfalls eine Bande auf gleicher Höhe
detektiert werden, jedoch war auch hier die Reaktion schwach ausgeprägt.
146
Ergebnisse
kDa
250
98
64
50
36
30
Tag 0
Tag 63
250
98
64
50
36
30
Tag 98
Abb. 28:
588
596
598
950
540
545
581
752
579
600
753
948
Positivpool
Negativpool
250
98
64
50
36
30
Tiernummer
Kontrolle
Al(OH)3
Gruppe
PDI
Al(OH)3
PDI
Quil A
Überprüfung der Serokonversion im Western-Blot
Ergebnisse
147
4.5 Ergebnisse der quantitativen real-time PCR
4.5.1 Absolute Quantifizierung
In den ersten Versuchen zur Quantifizierung der PDI-Expression in den bei der
Sektion gewonnenen Würmern wurde versucht, eine absolute Quantifizierung
durchzuführen, wobei die Ergebnisse auf das Housekeeping-Gen 18S-rRNA
bezogen wurden. Hierbei ließen sich keine verwertbaren Ergebnisse erzielen.
Anhand der Plasmid-DNA-Verdünnungsreihen zeigte sich eine schlechte und von
Lauf zu Lauf schwankende Sensitivität der Sonden. Die PDI-Sonde detektierte nur in
einem von vier Läufen alle Verdünnungsstufen. In den übrigen Läufen konnten
lediglich 103 Kopien sicher detektiert werden. Die 18S-rRNA-Sonde erwies sich als
noch weniger sensitiv. Es konnte maximal die 103-Verdünnungsstufe detektiert
werden. Die anhand der Plasmid-DNA-Verdünnungsreihe errechnete PCR-Effizienz
lag bei der PDI-Sonde bei 76% und bei der 18S-rRNA-Sonde bei 55%. Trotz neuer
Sondencharge konnte keine besserte PCR-Effizienz erzielt werden. Daher wurden
Versuche zur Effizienz-korrigierten relativen Quantifizierung angeschlossen.
4.5.2 Relative Quantifizierung
Im ersten Schritt wurde versucht, eine Effizienz-korrigierte relative Quantifizierung
mithilfe des „Relative Quantitation“-Programms des Mx 4000® durchzuführen.
Hierbei wird in jedem Lauf eine als Kalibrator bezeichnete Probe mitgeführt, für die
die Cts von Zielgen (PDI) und Referenzgen (18S-rRNA) bestimmt wird. Die
Expression des Zielgens in der untersuchten Probe wird auf den Kalibrators
bezogen. Der Kalibrator wurde von einem willkürlich gewählten, männlichen Wurm
der Kontrollgruppe (Tier Nr.: 795) verkörpert. Die PCR-Effizienz wurde in vorher
durchgeführten Versuchen anhand von cDNA-Verdünnungsreihen bestimmt. Hierbei
errechnete sich für die PDI-Sonde eine Effizienz von 1,704 (70,4%) und für die 18SrRNA-Sonde eine Effizienz von 1,479 (47,9%). Die extrem schlechte PCR-Effizienz
der 18S-Amplifikation führte zu hohen Schwankungen der Cts. Dies zeigte sich beim
Vergleich der für den Kalibrator in allen Läufen ermittelten Cts :
148
Ergebnisse
PCR-Lauf
1
2
3
4
5
6
7
8
9
MW
Tab. 17:
MW Ct 18S
27,20
33,67
37,08
34,05
31,94
32,28
36,07
33,65
33,09
33,23
SD
0,22
#
0,13
0,05
#
0,37
0,11
0,00
0,16
MW Ct PDI
30,10
30,00
30,10
31,08
32,05
31,12
31,10
30,48
32,10
30,90
SD
0,12
0,01
0,12
0,04
0,06
0,14
0,04
0,12
0,09
Cts des Kalibrators in verschiedenen PCR-Läufen.
MW:
Mittelwert;
SD:
Standardabweichung;
#:
ein
Duplikat
ausgeschlossen
Während bei der PDI-Amplifikation maximale Schwankungen von etwa zwei Cts
vorlagen, schwankten die Cts der 18S-rRNA-Amplifikation um fast zehn Cts. Eine
sinnvolle Auswertung war mit diesen Ergebnissen nicht möglich. Versuchsweise
wurden die Mittelwerte der in den neun Läufen erhaltenen Cts für den Kalibrator in
die Formel zur Effizienz-korrigierten relativen Quantifizierung eingesetzt und die
Ratios der 120 Würmer bestimmt.
Ratio =
Abb. 29:
(EZielgen)∆Ct Zielgen (Kontrolle – Behandlung)
(EReferenzgen)∆Ct Referenzgen (Kontrolle – Behandlung)
Ratioberechnung nach PFAFFL
E: Effizienz
Ergebnisse
149
Ratio =
Abb. 30:
(EPDI)∆Ct PDI (MW Kalibrator – Wurm X)
(E18S)∆Ct 18S (MW Kalibrator – Wurm X)
Anwendung der Formel nach PFAFFL.
(MW = arithmetischer Mittelwert; X = Wurm Nr. 1 bis 120)
Im Folgenden sind die Berechnungen der Ratios für 120 Würmer grafisch dargestellt.
2,0
Ratio
1,5
1,0
0,5
Tier-Nr.
Abb. 31:
Grafische Darstellung der Ratios für 120 Würmer
grau: männliche Würmer; weiß: weibliche Würmer
Diese Auswertung führte zu keinen sinnvollen Ergebnissen.
81
6
81
0
80
7
79
0
76
2
75
4
81
4
80
8
80
5
80
2
79
5
11
0
0,0
150
Diskussion
5 Diskussion
Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Protein Disulfid Isomerase (PDI) von D.
viviparus zu identifizieren und auf DNA-Sequenzebene zu charakterisieren. Nach
rekombinanter
Herstellung
und
Aufreinigung
des
Proteins
erfolgte
in
Immunisierungsversuchen die Überprüfung der Immunogenität und Protektivität der
PDI.
5.1 Identifizierung der PDI von D. viviparus
Durch eine PCR mit degenerierten Primern und anschließender 5’- und 3’-RACEPCR konnte anhand von cDNA eine Sequenz von 1796 bp Länge identifiziert
werden. Der Sequenzidentitätsvergleich zeigte eine 80%ige Identität der gefundenen
Sequenz zur PDI von A. caninum und T. circumcincta und zur PDI2 von O. ostertagi,
sowie eine 72%ige Identität zur PDI2 von C. elegans. Diese Übereinstimmungen auf
Nukleotidebene und eine spätere Analyse des exprimierten Proteins mittels MALDITOF-MS bestätigten, dass eine PDI von D. viviparus identifiziert worden war und
führten zur Veröffentlichung der Sequenz als PDI2 von D. viviparus in der NCBIDatenbank unter der Nummer DQ011044. Die Überprüfung der AS-Sequenz auf das
Vorliegen konservierter Domänen mittels RPSBLAST zeigte eine PDI-typische VierDomänen-Struktur mit zwei aktiven und zwei inaktiven Thioredoxin-Domänen. Die
aktiven Thioredoxin-Domänen enthalten jeweils die Sequenz -WCGHCK-, hierbei
handelt es sich um die aktiven Zentren des Enzyms. Die beiden Cysteine bilden die
Grundlage der Redoxaktivität der PDI, indem diese zwischen dem Disulfid- und
Dithiolzustand wechseln (HAWKINS u. FREEDMAN 1991). Des Weiteren erfüllt die
PDI als Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase eine essentielle Funktion bei der
Synthese von Kollagen (MYLLYHARJU 2003). Bei C. elegans konnte demonstriert
werden, dass diese Funktionen der PDI eine maßgebliche Bedeutung bei der
Synthese der Kutikula haben, wobei hier die PDI2 eine essentielle Rolle besitzt, da
die PDI1 nicht als Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase fungiert (WINTER u. PAGE
2000). Die hohen Identitäten der PDI2 von D. viviparus zur PDI2 von C. elegans
lassen für dieses Enzym ähnliche Funktionen bei der Synthese der Kutikula von D.
viviparus vermuten.
Diskussion
151
Am C-terminalen Ende der PDI2 konnte eine HTEL-Sequenz identifiziert werden, die
sich in gleicher Form bei der PDI von A. caninum und T. circumcincta sowie bei der
PDI2 von O. ostertagi und C. elegans findet. Hierbei handelt es sich um eine
modifizierte Form des Standard-ER-Retentionssignal KDEL, das unter anderem bei
der humanen PDI zu finden ist. Nach ANDRES et al. (1990) ist die HTEL-Sequenz
ebenso effektiv bei der Zurückhaltung eines Proteins im Endoplasmatischen
Reticulum wie das KDEL-Signal. Dies würde bedeuten, dass die PDI von D. viviparus
im Lumen des ER lokalisiert ist. Allerdings wurden bereits diverse, eine KDELSequenz aufweisende Proteine, außerhalb des ER lokalisiert. Dies trifft auch für die
PDI zu. So wird für die humane PDI eine Sekretion durch bestimmte Zellen und auch
eine Lokalisation auf der Zelloberfläche beschrieben. Bei Helminthen konnte die PDI
in ES-Produkten von O. ostertagi, D. immitis und F. hepatica beschrieben werden.
Diese Beobachtungen zeigen, dass das Retentionssignal allein nicht ausreichend für
eine Zurückhaltung des Proteins im ER ist und lassen eine extrazelluläre Lokalisation
der PDI2 von D. viviparus möglich erscheinen. Die Bestimmung der genomischen
Sequenz der PDI2 lieferte vier Intronsequenzen, die alle der GT/AG-Regel
entsprachen. Ein Vergleich mit der genomischen Sequenz der PDI von A. caninum
zeigte, dass sich die Introns an den gleichen Positionen befinden. Dies macht
deutlich, dass die Organisation des Gens zwischen diesen nahe verwandten Spezies
evolutionär konserviert ist.
Nach der Klonierung des mit den degenerierten Primern amplifizierten PCR-Produkts
wurden mehrere Klone verglichen. Hierbei konnte ein Klon mit von der PDI2
abweichender Sequenz identifiziert werden. Datenbankvergleiche zeigten, dass
diese Sequenz höchste Ähnlichkeit zur PDI3 von C. elegans und zur PDI1 von
O. ostertagi aufweist. Die Vervollständigung der Sequenz führte zur Beschreibung
eines zweiten PDI-Gens von D. viviparus, welches unter der Nummer DQ011045 in
der NCBI-Datenbank veröffentlicht wurde. Diese PDI weist ebenfalls die typische
Vier-Domänen-Struktur
auf,
wobei
die
b-
und
b’-Domäne
jedoch
höhere
Ähnlichkeiten zum humanen ERp57 aufweisen. Darüber hinaus liefert das Fehlen
eines C-terminalen Bereichs saurer Aminosäuren bei der PDI1 von D. viviparus
einen weiteren Hinweis auf die nähere Verwandtschaft dieser PDI zum ERp57. Die
152
Diskussion
aktiven Thioredoxin-Domänen weisen ebenfalls die Sequenz -WCGHCK- auf und
das ER-Retentionssignal hat die Form KAEL. Ob diese PDI von D. viviparus der
PDI3 von C. elegans und dem humanen Analogon ERp57 auch funktionell ähnelt
und nicht als Untereinheit der Prolyl-4-Hydroxylase fungiert, konnte aus den
erhaltenen Informationen nicht ermittelt werden.
Auch bei anderen Nematoden wurden verschiedene PDI-Gene beschrieben. So
konnten bei O. ostertagi bislang zwei PDIs identifiziert werden, und bei C. elegans
wurden drei PDIs näher charakterisiert. Ob wie bei C. elegans auch bei D. viviparus
weitere PDIs existieren, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden.
5.2 Expression und Aufreinigung der rekombinanten PDI
Nachdem die vollständige Sequenz der PDI ermittelt worden war, wurde die Sequenz
des ORF in den pGEX-4T-Expressionsvektor kloniert und als GST-Fusionsprotein in
E. coli exprimiert. Die Wahl des pGEX-Vektors bietet verschiedene Vorteile. In
diesem Vektor erfolgt die Expression des Zielproteins in Fusion mit der Glutathion-STransferase aus S. japonicum. Über die GST lässt sich das Fusionsprotein leicht mit
verschiedenen Systemen aufreinigen. Grundprinzip der Aufreinigung ist die
reversible Bindung der GST an Glutathion. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu
sowohl Glutathion-gekoppelte Sepharosekügelchen als auch magnetische Partikel
genutzt. Mit beiden Systemen gelang eine effektive Aufreinigung der rekombinant
hergestellten PDI. Neben diesem technischen Vorteil erfolgte die Wahl des
Expressionsvektors
vor
allem
auch
im
Hinblick
auf
die
geplanten
Immunisierungsversuche. Aus der Literatur ist bekannt, dass die GST selbst
immunmodulatorische Eigenschaften besitzt. GST-28 aus S. japonicum ist ein
vielversprechender Vakzinekandidat gegen Schistosomatose beim Menschen und
auch bei anderen Spezies konnte das protektive Potential dieses Enzyms
nachgewiesen werden. Beim Einsatz des Fusionsproteins als Impfprotein könnte
also die GST zur Immunogenität beitragen.
Für die Herstellung rekombinanter Proteine stehen verschiedene pro- und
eukaryotische Expressionssysteme zur Verfügung. Die Expression heterologer
Proteine in E. coli hat den Vorteil, dass dieses System technisch einfach zu
Diskussion
153
handhaben ist und das gewünschte Protein kostengünstig und in großen Mengen
hergestellt werden kann. Hauptnachteil ist die Tatsache, dass Proteine in E. coli nach
der Translation nicht in gleicher Art und Weise weiterverarbeitet werden wie in
Eukaryoten. Bakterien führen keine posttranslationalen Modifikationen wie etwa die
Abspaltung
von
Signalsequenzen
oder
die
Anheftung
von
Zuckergruppen
(Glykosilierung) an Proteine durch. Diese Abwandlungen sind allerdings häufig
notwendig, damit beispielsweise Enzyme ihre katalytische Aktivität entfalten können.
Weiterhin zeigen neuere Untersuchungen, dass gerade Kohlenhydratkomponenten
ein hohes immunogenes Potential haben und in den Prozess der Immunantwort
gegen parasitische Helminthen involviert sind (NYAME et al. 2004). Weiterhin wird
das in E. coli exprimierte Protein nicht gefaltet. Wenn Proteine nicht die korrekte
Tertiärstruktur annehmen, bleiben sie in der Regel unlöslich und bilden in den
Bakterien Einschlusskörperchen (inclusion bodies). Die Umwandlung von Proteinen
aus Einschlusskörperchen in die richtig gefaltete Form gestaltet sich in vitro äußerst
schwierig und gelingt häufig nicht. Aus der Literatur ist bekannt, dass in E. coli
exprimierte Proteine mit sehr unterschiedlichem Erfolg in Vakzinierungsversuchen
eingesetzt wurden. Der einzige zur Zeit erhältliche rekombinante Impfstoff gegen
Parasiten, Tickgard® - gegen den Schildzeckenbefall bei Rindern, wird in E. coli
produziert. Des Weiteren waren Immunisierungsversuche gegen Cestoden mit in
E.
coli
als
GST-Fusionsproteine
exprimierten
Onkosphärenantigenen
sehr
erfolgreich. Bei Taenia ovis konnte durch eine zweimalige Immunisierung mit 100 µg
des To 45W-GST unter Einsatz des Adjuvans Saponin eine Reduktion der Cysticerci
um mindestens 97% erreicht werden. Das hohe protektive Potential des Antigens
bestätigte sich auch in Feldversuchen (LAWRENCE et al. 1996). Zwei weitere
Onkosphärenantigene, To 16.17 und To 18 konnten ebenfalls eine fast vollständige
Immunität gegen experimentelle Infektionen vermitteln (HARRISON et al. 1996). Bei
Taenia saginata führte die Kombination der Proteine Tsa 9 und Tsa 18 zu einer
Protektion. Eine dreimalige Applikation von 200 µg GST-Fusionsprotein mit Quil A
resultierte in einer 94%igen Reduktion der Cysticerci (LIGHTOWLERS et al. 1996).
Auch gegen Echinococcus granulosus konnte ein Onkosphärenantigen mit hohem
protektiven Potential identifiziert werden. Immunisierungen mit dem EG 95-GST-
154
Diskussion
Fusionsprotein führten zu einer mindestens 96%igen Reduktion der Cysticerci
(LIGHTOWLERS 1996; LIGHTOWLERS et al. 1999). Gegenüber diesen positiven
Ergebnissen konnten bei Nematoden und Trematoden bislang keine Erfolge mit
rekombinanten
Proteinen
Darmoberflächenproteine
erzielt
H11,
werden.
H-gal-GP
Beispielsweise
(Haemonchus
zeigten
die
galactose-containing
glycoprotein complex) und TSBP von H. contortus in nativer Form ein hohes
protektives Potential. So konnten etwa in Immunisierungsversuchen mit H11 bis zu
99%ige Reduktionen der Eiausscheidung und bis zu 95%ige Reduktionen der
Wurmbürden erreicht werden (NEWTON et al. 1995; SMITH et al. 1993; TAVERNOR
et al. 1992). Die dreimalige Applikation von 100 µg H-gal-GP mit Quil A resultierte in
einer 93%igen Reduktion der Eiausscheidung und einer 60%igen Reduktion der
Wurmbürde (SMITH et al. 2000). Mit TSBP konnten bei dreimaliger Applikation von
200 µg 82%ige Reduktionen der Eiausscheidung und Wurmbürde erreicht werden
(KNOX et al. 1999). Alle Antigene erwiesen sich jedoch als in E. coli exprimierte
Proteine wirkungslos.
Als eukaryotische Expressionssysteme haben sich Hefen, wie Saccharomyces
cerevisae und Pichia pastoris, Insekten- und Säugerzelllinien etabliert. Diese
Systeme haben den Vorteil, dass das exprimierte Protein posttranslational modifiziert
wird und so dem Protein im Ursprungsorganismus möglicherweise stärker ähnelt.
Allerdings ist zu beachten, dass jeder Organismus ein eigenes Repertoire an
Enzymen
besitzt,
die
posttranslationale
Modifikationen
ausführen,
und
die
exprimierten Proteine nicht notwendigerweise die identischen Strukturen erhalten,
wie sie im Ursprungsorganismus vorliegen würden. Beispielsweise finden bei
S. cerevisiae Hyperglykosilierungen mit Oligosaccharidketten statt, die aus 50 bis
150 Resten bestehen. In P. pastoris werden bei N-Glykosilierungen hingegen 8 bis
14 Reste angefügt. Die in eukaryotischen Expressionssystemen durchgeführten
posttranslationalen Modifikationen führen zwar möglicherweise dazu, dass das
gewünschte Protein in katalytisch aktiver Form erhalten wird, allerdings besteht
aufgrund der Unterschiede in Glykosilierungen und anderen posttranslationalen
Diskussion
155
Modifikationen keine Garantie, dass das rekombinante Protein die gleiche
Immunogenität besitzt.
In den in dieser Arbeit durchgeführten Immunisierungsversuchen wurde in E. coli
exprimierte
PDI
eingesetzt,
da
die
Überprüfung
der
Immunogenität
des
rekombinanten Proteins im Western-Blot zeigte, dass die PDI mit dem Serum
experimentell
infizierter
Rinder
detektiert
werden
konnte,
also
antigene
Determinanten zumindest teilweise vorhanden sein mussten. Aus der Literatur war
weiterhin bekannt, dass in E. coli exprimierte PDI in der Regel katalytisch aktiv ist.
Dies bestätigen auch verschiedene Versuche, in denen demonstriert werden konnte,
dass die Koexpression von PDI die Expression heterologer Proteine in E. coli
verbessern kann. Durch ihre Funktion als Chaperon trägt die PDI dazu bei, dass die
Proteine
ihre
richtige
Konformation
erhalten
und
nicht
unlöslich
in
Einschlusskörperchen vorliegen. Auch wenn es im Rahmen dieser Arbeit nicht
gelang, einen Aktivitätstest für die PDI zu etablieren, ließ das Verhalten des Proteins
bei der Aufreinigung die Vermutung zu, dass die PDI in katalytisch aktiver Form
exprimiert wurde.
Für die Aufreinigung des GST-PDI-Fusionsproteins wurden Glutathion-gekoppelte
magnetische
Partikel
Optimierungsversuche
und
Glutathion-Sepharose
gelang
es
nicht,
die
eingesetzt.
im
Trotz
Western-Blot
diverser
sichtbaren
Begleitbanden vollständig zu entfernen. Die Proteinmessung im Agilent 2100
Bioanalyzer
zeigte
für
den
in
den
Immunisierungsversuchen
eingesetzten
Proteinpool eine Reinheit des Fusionsproteins von etwa 70% im ersten
Immunisierungsversuch bzw. 78% im zweiten Immunisierungsversuch. Laut
Herstellerangaben ist es mit beiden Medien möglich, hochreines GST-Fusionsprotein
zu gewinnen. Das Auftreten von Begleitbanden kann zum einen die Ursache haben,
dass das Fusionsprotein durch Proteasen degradiert wird, zum anderen besteht die
Möglichkeit der Koaufreinigung bakterieller Proteine. Im Western-Blot mit PDIAntikörpern zeigte sich, dass es sich bei den Begleitbanden nur zu einem geringen
Teil um PDI-Bruchstücke handelte. Durch den Einsatz des Protease-defizienten
156
Diskussion
E. coli Stammes BL21 und durch die Zugabe von Proteaseinhibitoren während der
Aufreinigung konnte eine Proteindegradation weitgehend verhindert werden.
Eine Koaufreinigung bakterieller Proteine kann verschiedene Gründe haben. So führt
eine exzessive Ultraschallbehandlung der Zellsuspension zur Aggregation von
Proteinen, die dann gemeinsam aufgereinigt werden. Dieser Grund kann im
vorliegenden Fall ausgeschlossen werden, da nach der Zelllyse mittels des
Lysisreagenz aus dem MagneGST™-Kit die gleichen Begleitbanden in der
Aufreinigung identifiziert werden konnten, wie nach Ultraschallbehandlung. Weiterhin
ist bekannt, dass es bei den verwendeten Aufreinigungmedien zu einer
Koaufreinigung der bakteriellen Chaperonproteine DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und
GroES kommen kann. Möglicherweise liegt bei der Aufreinigung der PDI ein
ähnlicher Mechanismus vor. Unter der Vorraussetzung, dass die in dieser Arbeit
rekombinant hergestellte PDI katalytisch aktiv ist, wäre es möglich, dass das Enzym
während der Expression und Aufreinigung seine Funktion als Chaperon erfüllt und
bakterielle Proteine gebunden hat, die hierdurch mit aufgereinigt wurden und erst
unter den denaturierenden Bedingungen der SDS-Page wieder frei wurden. Für das
Vorliegen eines derartigen Mechanismus spricht, dass unabhängig von den
gewählten Aufreinigungsbedingungen immer exakt die gleichen Begleitbanden
vorhanden waren. Für die Tatsache, dass die PDI in katalytisch aktiver Form
exprimiert wurde, spricht weiterhin das konstante Vorhandensein einer Bande mit
einem Molekulargewicht von etwas weniger als 250 kDa, die mit PDI-Antikörpern
nachgewiesen werden konnte. Diese Bande war nach Zusatz des Disulfidbrückenspaltenden Agens β-Mercaptoethanol im Probenpuffer für die SDS-Page nicht mehr
vorhanden (Ergebnisse nicht gezeigt). Dies könnte bedeuten, dass die PDI einen
stabilen Komplex mit E. coli Proteinen gebildet hatte.
Da es nicht möglich war, das Aufreinigungsergebnis über eine Optimierung der
Affinitäts-Chromatographie zu verbessern, wurde das Fusionsprotein mit einer
Reinheit von 70 bis 78% in den Immunisierungversuchen eingesetzt. Es wurde
darauf
verzichtet,
weitere
Aufreinigungsschritte
wie
etwa
über
Ionenaustauschersäulen oder Gelfiltrationssäulen anzuschließen, da hierdurch
möglicherweise ein Verlust der für die PDI vermuteten katalytischen Aktivität
Diskussion
157
stattgefunden hätte. Für die protektive Wirkung eines Vakzinekandidaten hat die
Reinheit des Proteins primär keine ausschlaggebende Bedeutung. DEMPSTER et al.
(1996) entwickelten ein Aufreinigungsprotokoll für die schnelle und kostengünstige
Herstellung großer Mengen an GST-45W für die Immunisierung gegen T. ovis und
erreichten mit einer Reinheit von 30-50% eine vollständige Protektion. Für die
Immunisierung ist es wichtig, dass die Vakzine keine schädlichen Bestandteile
enthält. Um die Sicherheit der in dieser Arbeit verwendeten Vakzine zu erhöhen,
wurde das aufgereinigte Protein einer Sterilfiltration unterzogen.
Bei der Entwicklung einer kommerziellen Vakzine muss ein Aufreinigungergebnis
erzielt werden, dass eine gleichbleibende Qualität und Sicherheit garantieren kann.
Für die in dieser Arbeit durchgeführten Immunisierungsversuche konnte davon
ausgegangen werden, dass die erhaltene Reinheit ausreicht, um das protektive
Potential der PDI zu überprüfen.
5.3 Durchführung der Immunisierungsversuche
5.3.1 Wahl des Tiermaterials
Die Immunisierungsversuche wurden im natürlichen Wirt von D. viviparus
durchgeführt. Das einzige Tiermodell, das bisher für D. viviparus beschrieben wurde,
ist das Meerschweinchen. Bei dieser Spezies gelangen die Larven nach
experimenteller Infektion in die Lunge, jedoch stoppt die Entwicklung im präadulten
Stadium. Bei Immunisierungsversuchen lassen sich also keine Aussagen über einen
möglichen Einfluss des Impfstoffs auf die adulten Stadien oder auf die
Geschlechtsprodukte treffen. Weiterhin ist eine Übertragbarkeit der Ergebnisse vom
Meerschweinchen auf das Rind vorsichtig zu beurteilen. Da das Meerschweinchen
kein natürlicher Wirt von D. viviparus ist, greifen bei der Infektion möglicherweise
nicht die gleichen Anpassungsmechanismen wie im Rind. Dies ist insbesondere in
Bezug auf die Immunabwehr des Wirtes von Bedeutung.
Für die Immunisierungsversuche wurden männliche Holstein Frisian Rinder mit
einem Alter von 4-5 Monaten eingesetzt. Außer der Tatsache, dass die Tiere keinen
Lungenwurm-Kontakt gehabt haben durften, war die Wahl des Tiermaterials unter
anderem von praktischen Gesichtspunkten beeinflusst. Männliche Rinder sind
158
Diskussion
einfacher zu beschaffen und kostengünstiger als weibliche Tiere. Weiterhin konnten
die Bullkälber von einem einzigen Mäster bezogen werden, der die Tiere nach dem
Absetzen aufgestallt und bis zu dem entsprechenden Alter aufgezogen hatte.
Hierdurch wurde die Variabilität im Tiermaterial herabgesetzt, da alle Tiere durch die
gemeinsame Aufzucht einen ähnlichen Immunstatus hatten. Wären weibliche Tiere
eingesetzt worden, hätten diese aus mehreren Quellen bezogen werden müssen.
Hierin hätte eine erhöhte Gefahr der Übertragung von Infektionserregern bei der
gemeinsamen Aufstallung bestanden. Für Immunisierungen ist es jedoch von
essentieller Bedeutung, dass die Tiere gesund sind. In der Literatur finden sich keine
Hinweise darauf, dass männliche und weibliche Rinder eine unterschiedliche
Empfänglichkeit für D. viviparus zeigen. Weiterhin finden sich keine Angaben
bezüglich einer Rassedisposition. Es war also davon auszugehen, dass mit dem
gewählten Tiermaterial erste Hinweise bezüglich der Wirksamkeit des Impfproteins
erhalten werden können. Aufgrund der hohen Kosten der Versuchstiere musste im
Hinblick auf die eingesetzte Tierzahl ein Kompromiss eingegangen werden. Eine
Zahl von vier Tieren pro Versuchsgruppe wie im ersten Immunisierungsversuch kann
im Zweifelsfall keine statistische Sicherheit bieten, ist jedoch geeignet, um
Tendenzen
aufzuzeigen.
Immunisierungsversuchen
Da
um
es
den
sich
bei
erstmaligen
den
hier
Einsatz
durchgeführten
der
PDI
als
Vakzinekandidaten handelt, bestand hierin das Hauptziel der Versuche.
5.3.2 Immunisierung und experimentelle Infektion
Im ersten Immunisierungsversuch wurden die Rinder dreimal im Abstand von vier
Wochen mit 200 µg PDI immunisiert. Die eingesetzte Proteinmenge orientierte sich
hierbei an den Angaben in der Literatur. LIGHTOWLERS et al. (1996) testeten
Proteinmengen von 20, 200, 500 und 1000 µg bei der Immunisierung von Rindern
gegen T. saginata mit Tsa 9 + 18 und erreichten die höchste Protektion mit einer
Proteinmenge von 200 µg.
Neben anderen Faktoren hat die Wahl des Adjuvans einen entscheidenden Einfluss
auf die Ausbildung einer protektiven Immunantwort. Adjuvantien können einerseits
dem Transport des Antigens dienen, so dass eine schnellere und bessere
Verarbeitung durch Antigen-präsentierende Zellen erfolgt, andererseits haben einige
Diskussion
159
Adjuvantien selbst einen immunstimulierenden Effekt. Darüber hinaus können
Adjuvantien die Immunantwort in eine bestimmte Richtung lenken. In den in dieser
Arbeit durchgeführten Immunisierungsversuchen wurden Al(OH)3 und Quil A
eingesetzt. Während Al(OH)3 fast ausschließlich eine Th2-Immunantwort fördert, gilt
Quil A als starkes Stimulans sowohl einer Th1- als auch einer Th2-Antwort.
Vier Wochen nach der zweiten Boosterimpfung wurden die Impf- und Kontrolltiere mit
insgesamt 3300 dritten Larven oral infiziert. Die Larvendosis wurde aufgrund von
Erfahrungswerten gewählt, die während der Haltung von Stammhaltungsrindern für
D. viviparus im Institut für Parasitologie gesammelt worden waren. Es hatte sich
gezeigt, dass die Verabreichung von 3300 Larven bei einem Rind mit einem
Körpergewicht von etwa 100 kg zur Ausbildung einer klinisch manifesten
Dictyocaulose mit deutlichen Krankheitssymptomen führt, aber in der Regel keine
Gefahr für das Tier darstellt. Mit der gewählten Larvendosis konnte also davon
ausgegangen werden, dass beurteilt werden konnte, ob die immunisierten Tiere
Unterschiede zur Kontrollgruppe bezüglich der Ausprägung klinischer Symptome
zeigten.
5.4 Ergebnisse der Immunisierungsversuche
5.4.1 Befunde der täglichen Beobachtung und klinischen Untersuchung
Bis zur Belastungsinfektion blieben alle Tiere bis auf die Nummer 544 klinisch
gesund. Dieses Tier musste aufgrund respiratorischer Symptome in der dritten
Versuchswoche medikamentös behandelt werden. An den Injektionsstellen traten bei
den Kontrolltieren des ersten Immunisierungsversuchs keine Schwellungen auf. Im
zweiten Immunisierungsversuch zeigten zwei Tiere jeweils nach einer Impfung eine
geringgradige Schwellung, die nach einem bzw. nach drei Tagen wieder
abgeklungen war. In den immunisierten Gruppen wiesen 17 von 22 Tieren nach
mindestens
einer
Impfung
eine
lokale
Umfangsvermehrung
auf,
die
z.T.
Durchmesser von mehr als fünf Zentimetern erreichte. Die Schwellungen waren nicht
schmerzhaft und spätestens 12 Tage p.i. wieder abgeklungen. Diese lokalen
Reaktionen hatten ein zumindest für Nutztiere tolerierbares Ausmaß. Da die
eingesetzten
Adjuvantien
ihrerseits
eher
selten
zum
Auftreten
lokaler
160
Diskussion
Entzündungsreaktionen führen, wie dies etwa vom Freunds Adjuvans bekannt ist,
können die aufgetretenen Schwellungen auf die Proteinbestandteile der Vakzine
zurückgeführt werden. Es konnte nicht beurteilt werden, ob die applizierte Vakzine
noch pyrogenes Material enthielt, da im Anschluss an die Impfungen keine
Temperaturmessung
erfolgte.
Da
die
Tiere
jedoch
keine
Störung
des
Allgemeinbefindens zeigten, ist davon auszugehen, dass die Impfungen keinen
negativen Einfluss hatten.
Zwei Wochen p.i. zeigten die Tiere erste Symptome einer Lungenwurminfektion.
Diese Beobachtung deckt sich mit Angaben aus der Literatur (PFEIFFER 1971).
Nachdem die Larven die Dünndarmschleimhaut des Wirtes durchdrungen und über
Ductus thoracicus, Vena cava cranialis, rechte Herzkammer und Arteria pulmonalis
die Lunge erreicht haben, finden sich etwa eine Woche p.i. die fünften Larvenstadien
in den Bronchioli und Bronchen. Die durch sie verursachte Entzündung der
luftführenden Wege äußert sich ab der zweiten Woche p.i. in klinischen Symptomen.
Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Belastungsinfektionen konnten eine
Erhöhung der Atemfrequenz und Veränderung des Atemtyps zu einer vermehrt
flachen Atmung, gelegentlicher Husten, muköser bis purulenter Nasenausfluss und
eine Erhöhung der Herzfrequenz festgestellt werden. Bei einem Großteil der Tiere
waren Lungengeräusche wahrnehmbar. Die Symptome waren sowohl in den
Kontrollgruppen, als auch in den vakzinierten Gruppen gleichermaßen vorhanden. Es
konnten keine Unterschiede bezüglich der Ausprägung der Symptome zwischen den
Gruppen festgestellt werden. Das Auftreten von Nasenausfluss erwies sich als nicht
konstant zu beobachtender Parameter, da die Tiere sich den Ausfluss spontan und
bei der Futteraufnahme entfernten. Z.T. zeigten die Tiere Fieber und waren in ihrem
Allgemeinbefinden soweit gestört, dass eine medikamentöse Behandlung notwendig
war. Hiervon waren ebenfalls sowohl Kontrolltiere als auch immunisierte Tiere
betroffen. Bezüglich der klinischen Symptomatik konnte also keine Wirksamkeit der
PDI bei dieser Infektionsdosis festgestellt werden.
5.4.2 Etablierung der Infektion in den Kontrollgruppen
An den Versuchstagen 63, 64 und 65 wurden die Rinder mit je 1100 dritten Larven
infiziert. Bei der Sektion zeigte sich, dass sich die Larven in sehr unterschiedlicher
Diskussion
161
Anzahl als Adulte in den Lungen etabliert hatten. Bei den Kontrolltieren schwankte
der Anteil reisolierter Würmer im ersten Immunisierungsversuch zwischen 8 und
24,9%; im zweiten Immunisierungsversuch konnten zwischen 6,6 und 34,3% der
3300 applizierten Larven als Adulte wiedergewonnen werden. Diese Beobachtung
deckt sich mit Angaben aus der Literatur. MATTHEWS et al. (2001) fanden bei sechs
Kontrolltieren eine Etablierung zwischen 3,1 und 24% nach einer Belastungsinfektion
mit 700 L3. Auch PFEIFFER (1971) gab an, dass die Befallsstärken von Tier zu Tier
stark schwankten. Bei sechs Tieren, die mit 40 Larven/kg infiziert worden waren,
fanden sich zwischen 2,9 und 29,9% als Adulte in den Lungen wieder. Diese
Beobachtungen machen zum einen deutlich, mit welchen großen individuellen
Schwankungen bei einem Immunisierungsversuch gerechnet werden muss, zum
anderen bestätigen die in dieser Arbeit bei den Kontrolltieren gefundenen
Befallsstärken, dass sich die Infektion in einem zu erwartenden Maß etabliert hatte.
Dies zeigt, dass die Infektiösität und Viabilität der Larven nicht herabgesetzt war.
5.4.3 Larvenausscheidung und Wurmbürden
Am Tag 84 (= 21 dpi) war bei jeweils einem Tier der Al(OH)3-Kombi-Gruppe und der
PDI-Quil-A-Gruppe jeweils eine Larve im Trichteransatz vorhanden. Am 23. Tag
nach der Infektion waren alle Tiere patent. Lediglich bei einem Rind der PDI-Quil-AGruppe setzte die Larvenausscheidung erst am 24. Tag p.i. ein. Diese Beobachtung
deckt sich mit den Angaben anderer Autoren. PFEIFFER (1971) ermittelte ein
Einsetzten der Larvenausscheidung zwischen dem 20. und 25. Tag p.i., wobei in den
meisten Fällen am Tag 23 die ersten Larven im Kot zu finden waren. In den in dieser
Arbeit durchgeführten Immunisierungsversuchen konnten keine Unterschiede
zwischen den Kontroll- und Impfgruppen bezüglich des Einsetzens der Patenz
festgestellt werden. Sowohl die tägliche als auch die Gesamtlarvenausscheidung der
Einzeltiere wies sehr hohe Standardabweichungen auf. Es konnten keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Eine
interessante Beobachtung konnte allerdings bei der Gesamtlarvenausscheidung der
Gruppen im ersten Immunisierungsversuch gemacht werden. Die Impfgruppen, in
denen jeweils das gleiche Adjuvans eingesetzt wurde, wiesen annähernd gleiche
Gesamtlarvenzahlen auf. Hierbei wurden in den Al(OH)3-Impfgruppen mit 25446 und
162
Diskussion
25943 etwa doppelt so viele Larven ausgeschieden, wie in den Quil A-Gruppen, bei
denen insgesamt 11537 bzw. 12500 Larven vorhanden waren. Die Kontrollgruppe
wies mit 32716 eine Gesamtlarvenausscheidung im Bereich der Al(OH)3Impfgruppen auf. Ob es sich bei diesen Beobachtungen um zufällige Ergebnisse
oder um den Ausdruck einer Adjuvans-abhängigen Stimulation der Immunantwort mit
unterschiedlichen Effekten auf die Fekundität der Würmer handelt, kann nicht
beurteilt werden. Möglich wäre, dass der beobachtete Effekt auf einer unspezifischen
Stimulierung des Immunsystems beruht. Diese Eigenschaft ist bei Quil A, jedoch
nicht
bei
Al(OH)3
vorhanden.
Dass
die
ermittelten
Unterschiede
in
den
Gesamtlarvenzahlen nicht auf eine unterschiedlich starke Etablierung der Würmer in
den Lungen zurückzuführen waren, zeigten die nach der Sektion ermittelten
Wurmzahlen. Hierbei zeigte sich, dass sowohl die Kombi-Gruppen, als auch die PDIGruppen untereinander ähnliche mittlere Befallsstärken aufwiesen. In den KombiGruppen waren im Mittel 376 (Al(OH)3) bzw. 353 (Quil A), in den PDI-Gruppen 607
(Al(OH)3) bzw. 520 (Quil A) Würmer vorhanden.
Insgesamt betrachtet konnten bei den Befallsstärken keine statistisch signifikanten
Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Die beiden Kombi-Gruppen
des ersten Immunisierungsversuchs zeigten mit mittleren Befallsstärken von 376 und
353 Würmern tendenziell eine geringere Wurmbürde als die Kontrollgruppe, deren
Tiere eine mittlere Wurmbürde von 557 aufwiesen. Sollte es sich hierbei um einen
Effekt der Immunisierung handeln, so ist dieser nicht auf die PDI-Komponente im
Kombi-Impfstoff zurückzuführen, da die immunisierten Gruppen, die ausschließlich
die PDI-Vakzine erhielten, mit 607 (PDI Al(OH)3) und 520 (PDI Quil A) Würmern pro
Tier Befallsstärken im Rahmen der Kontrollgruppe aufwiesen. Betrachtet man jedoch
die mittleren Wurmbürden aus Sicht der Etablierung der Infektion, so befinden sich
auch die Kombi-Gruppen mit einer Etablierungsrate von 3,8% bis 25,3% in einem
Bereich der standardmäßig bei experimentellen Infektionen erreicht wird. Weiterhin
war im zweiten Immunisierungsversuch der Unterschied in der mittleren Befallsstärke
zwischen der Kombi-Impfgruppe und der Kontrollgruppe wesentlich geringer als im
ersten Versuch. Hier waren bei der Kontrollgruppe im Mittel 614 und bei den
immunisierten Tieren 548 Würmer vorhanden. Dies zeigt, dass die im ersten Versuch
Diskussion
163
beobachteten geringeren Befallsstärken der Kombi-Impfgruppen vorsichtig zu
beurteilen sind.
Eine Beobachtung, die konstant bei allen Versuchstieren gemacht werden konnte,
war, dass grundsätzlich mehr weibliche als männliche Würmer vorhanden waren.
Das Verhältnis weiblich zu männlich schwankte hierbei zwischen 1,3:1 und 2,0:1 bei
den Kontrolltieren und zwischen 1,1:1 und 2,4:1 bei den immunisierten Tieren. Dieser
Sachverhalt wurde auch von PFEIFFER (1971) beschrieben. Hier fanden sich bei
sechs experimentell infizierten Rindern Verhältnisse von weiblichen zu männlichen
Würmern zwischen 1,1:1 und 1,4:1. Hieran zeigt sich, dass die Immunisierung keinen
unterschiedlichen Effekt auf weibliche und männliche Würmer hatte, wie dies etwa
für
Darmoberflächenantigene
bei
verschiedenen
blutsaugenden
Nematoden
beschrieben wurde. Ein derartiger Effekt war auch aufgrund der anderen Biologie
von D. viviparus und vermuteten Lokalisation des Impfproteins nicht zu erwarten.
Die Bestimmung der Wurmgröße zeigte, dass in allen immunisierten Gruppen des
ersten Versuchs sowohl weibliche als auch männliche Würmer eine geringere
Körperlänge aufwiesen als die der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse waren jedoch
nicht signifikant. Im zweiten Immunisierungsversuch waren die Würmer der KombiImpfgruppe ebenfalls kürzer als die der Kontrollgruppe, jedoch zeigte sich in diesem
Versuch, dass die Würmer grundsätzlich kleiner waren, als im ersten Versuch. So
hatten etwa die männlichen Würmer der Kontrollgruppe im zweiten Versuch etwa die
gleiche Länge wie die männlichen Würmer der PDI-Quil-A-Impfgruppe im ersten
Versuch. Insgesamt konnte beobachtet werden, dass die Wurmgrößen innerhalb
eines Versuchstieres wenig schwankten, jedoch zwischen den Rindern deutliche
Unterschiede vorhanden waren. So existierte beispielsweise in der Kontrollgruppe
des zweiten Versuchs eine Differenz der mittleren Wurmlängen von annähernd 15
mm zwischen dem Rind mit den kürzesten und dem mit den längsten weiblichen
Würmern. Es war in beiden Versuchen eine positive Korrelation zwischen der
Wurmlänge und der Wurmbürde vorhanden. Allerdings konnte kein konstanter
Zusammenhang
zwischen
Wurmlänge/Wurmbürde
und
Körpergewicht
des
Versuchstieres festgestellt werden. Während diese Parameter im ersten Versuch
negativ korreliert waren, zeigte sich im zweiten Versuch, dass die schwersten Tiere
164
Diskussion
die meisten und längsten Würmer beherbergten. Die Beobachtung einer vom
Körpergewicht unabhängigen Etablierung der Lungenwürmer wurde bereits von
PFEIFFER (1971) gemacht und zeigt auf, welche starken individuellen Unterschiede
bei einer Infektion vorhanden sind. Weiterhin konnte kein konstanter Zusammenhang
zwischen Befallsstärke und Schwere der klinischen Symptome festgestellt werden.
Sowohl Tiere mit einer hohen Wurmbürde als auch Tiere, die geringere Befallsraten
aufwiesen, zeigten ein klinisches Bild, dass einer medikamentösen Behandlung
bedurfte. Dies ist wahrscheinlich auf eine individuell unterschiedliche Empfänglichkeit
für Sekundärinfektionen, die zu einer Verkomplizierung des Krankheitsbildes führten,
zurückzuführen und spiegelte sich auch in den pathologisch-anatomischen Befunden
an den Lungen wieder. Zum Teil wiesen auch Tiere mit einer geringeren Wurmbürde
ausgedehnte Lungenveränderungen auf.
Die Bestimmung des Differentialblutbildes erwies sich als wenig aussagekräftig. Eine
absolute Eosinophilie konnte nur bei vier Tieren beobachtet werden. Da allerdings
erst drei Wochen nach der Infektion eine Bestimmung des Differentialblutbildes
erfolgte, ist möglicherweise ein vorher vorhandener Anstieg unentdeckt geblieben.
PFEIFFER (1971) beobachtete einen ersten Anstieg der eosinophilen Granulozyten
in der zweiten Woche p.i.. Danach sanken die Werte teilweise wieder ab und stiegen
erst fünf bis sechs Wochen später wieder an. Weiterhin wird von einem Fehlen der
Eosinophilie bei wenig abwehrkräftigen Tieren und von einem Absinken oder
Verschwinden der Zellen in schweren Krankheitsphasen berichtet. Welche Ursache
für eine fehlende Eosinophilie in den hier durchgeführten Versuchen zugrunde liegt,
kann aufgrund der wenigen Zeitpunkte der Bestimmung des Blutbildes nicht ermittelt
werden. Die übrigen Parameter des weißen Blutbildes zeigten keine Veränderungen,
die konstant mit der Infektion in Zusammenhang gebracht werden könnten. Eine von
PFEIFFER (1971) beobachtete Neutropenie konnte nur relativ und unregelmäßig
beobachtet werden.
5.4.4 Ergebnisse der serologischen Untersuchungen
Die Rolle der humoralen Immunität bei der Immunantwort auf eine Infektion mit D.
viviparus wurde noch nicht vollständig geklärt. Während nachgewiesen werden
konnte, dass eine passive Immunisierung mit dem Serum infizierter Rinder möglich
Diskussion
165
ist (JARRETT et al. 1957), konnten KOOYMAN et al. (2002) keinen Zusammenhang
zwischen Protektion und der Höhe an IgA, IgG1, IgG2 und IgM ermitteln. Die Autoren
fanden jedoch eine Korrelation zwischen dem Gesamt-IgE-Titer und der Protektion
bei Reinfektion.
Mittels ELISA wurde die Bildung von Anti-PDI-Antikörpern der Klassen IgG, IgG1,
IgG2, IgA und IgM untersucht. Eine Untersuchung auf IgE-Antikörper konnte nicht
durchgeführt werden, da ein Rinder Anti-IgE-Konjugat nicht kommerziell erhältlich
war. Alle Tiere zeigten zwischen dem vierten und elften Tag nach der ersten
Immunisierung einen Titeranstieg bei allen untersuchten Antikörperklassen. Die Titer
blieben während des gesamten Versuchs gleichbleibend hoch. Da es nicht gelang,
reine PDI ohne GST und bakterielle Kontaminanten zu gewinnen, wurde im ELISA
das Impfprotein eingesetzt. Es ist also nicht auszuschließen, dass ein Teil des
Titeranstiegs auf einer Serokonversion auf GST oder bakterielle Kontaminanten
beruhte.
Dass
der
Titeranstieg
nicht
ausschließlich
auf
nicht-PDI-Proteine
zurückzuführen war, wurde im Western-Blot überprüft. Anhand von D. viviparus
Rohantigen zeigte sich, dass die Seren vakzinierter Rinder spezifisch eine Bande auf
Höhe der PDI erkannten. Auf einen ELISA mit reinem GST wurde verzichtet, da ein
Vergleich mit dem Impfprotein-ELISA und eine quantitative Aussage bezüglich des
GST-Anteils am Titeranstieg nicht möglich gewesen wäre. Ein Vorhandensein GSTspezifischer Antikörper bei den Tieren der Kombigruppe wurde von VON HOLTUM
(persönliche Mitteilung) nachgewiesen. Der Nachweis PDI-spezifischer Antikörper
zeigte, dass die in E. coli rekombinant hergestellte PDI zumindest teilweise in ihrer
Konformation dem nativen Protein entsprechen muss und antigene Determinanten
vorhanden sind. Bezüglich der Höhe der Antikörperspiegel konnten keine
Unterschiede zwischen den Gruppen, die Al(OH)3 als Adjuvans und denen, die Quil
A erhalten hatten, festgestellt werden. Dies und der in allen Gruppen ähnlich frühe
Anstieg der Antikörper sprechen dafür, dass beide Adjuvantien die Immunabwehr in
gleichem
Maße
positiv
beeinflusst
haben.
Ein
Antikörperanstieg
in
den
Kontrollgruppen als Reaktion auf das natürliche Antigen nach der Infektion war
wesentlich geringer und nur bei IgG und IgG1 vorhanden. Bei IgG1 zeigten beide
Kontrollgruppen, bei IgG die Kontrollgruppe des ersten Versuchs ab Tag 91 (28 dpi)
166
Diskussion
eine Immunantwort. Bei der Kontrollgruppe des zweiten Versuchs waren bereits
sieben Tage nach der Infektion IgG-Antikörper vorhanden. Die geringen Titer an PDIspezifischen Antikörpern in den Kontrollgruppe nach der experimentellen Infektion
können unterschiedlich interpretiert werden. Möglich wäre, dass die native PDI doch
weitere Epitope besitzt, die immunogen wirken und die hierauf gebildeten Antikörper
nicht anhand des rekombinanten Proteins detektiert werden können. Dies hieße,
dass ein prokaryotisches Expressionssystem für die PDI nicht geeignet ist.
Eine andere Erklärung wäre, dass das Protein während der Infektion nicht zugänglich
ist und damit dem Immunsystem nicht präsentiert werden kann. Der Anstieg der
Antikörper in den Kontrollgruppen könnte hierbei auf das Freiwerden des Proteins
aus toten Larven oder Adulten zurückgeführt werden. Hauptgrundlage des Einsatzes
der PDI als Vakzinekandidat war die von verschiedenen Autoren bei anderen
Helminthen nachgewiesene Immunogenität und extrazelluläre Lokalisation des
Proteins. So konnte die PDI bei O. ostertagi in ES-Produkten von vierten Larven und
Adulten detektiert werden. Das Protein wurde ferner vom Serum Ostertagia-infizierter
Rinder erkannt (GELDHOF et al. 2003). Eine Lokalisation im ES-Material von Larven
und
Adulten
wurde
des
Weiteren
für
Dirofilaria
immitis
beschrieben
(CHANDRASHEKAR et al. 1998) und auch in ES-Produkten des Trematoden F.
hepatica konnte die PDI nachgewiesen werden (SALAZAR-CALDERON et al. 2003).
Da keine Möglichkeit zur Gewinnung von ES-Produkten bestand, erfolgte im Vorfeld
keine Überprüfung, ob die PDI hierin vorhanden ist, sondern es wurde lediglich
überprüft, ob das rekombinante Protein vom Serum D. viviparus-infizierter Rinder
erkannt wird. Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass die PDI von D.
viviparus nicht sezerniert wird.
5.4.5 Quantitative real-time PCR
Mithilfe der QRT-PCR sollte untersucht werden, ob eine Immunantwort auf die PDI
unter der Belastungsinfektion Einfluss auf die PDI-Transkription hatte. Dies wäre
unter der Voraussetzung, dass Immunmechanismen zur Inaktivierung des Enzyms
geführt hätten, denkbar gewesen. Möglicherweise hätte dies einen erhöhten
„Verbrauch“ des Enzyms vorgetäuscht und zu einer gesteigerten Transkriptionsrate
in den Würmern immunisierter Tiere geführt.
Diskussion
167
Als Housekeeping Gen für die Normalisierung der PDI-Transkription wurde die 18SrRNA gewählt. Grundvoraussetzung für die Funktion als Referenzgen ist, dass ein
Gen in konstanter Höhe exprimiert wird. Diese Eigenschaft wird ribosomaler RNA
zugesprochen. Verschiedene andere Gene, die häufig als Housekeeping Gen
eingesetzt werden, wie etwa Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GAPDH)
oder
β-Aktin,
können
unter
bestimmten
Voraussetzungen
unterschiedliche
Transkriptionsraten aufweisen. 18S-rRNA wird daher allgemein als sicherer Faktor
angesehen (BUSTIN 2000; BUSTIN 2002; THELLIN et al. 1999).
Bei der cDNA-Synthese erfolgte die Reverse Transkription der PDI und der 18SrRNA im gleichen Reaktionsansatz (ZHU u. ALTMANN 2005). Hierdurch wurde die
Varianz
reduziert,
da
Gewebeeffekte
wie
unterschiedliche
RNA-
Extraktionseffizienzen und Fehler bei der RT in einer Probe gleichermaßen das
Zielgen und das HKG betreffen. Bei der Durchführung der QRT-PCR zeigte sich
anhand der Plasmid- und cDNA-Verdünnungsreihen eine mangelhafte PCREffizienz, die bei der Amplifikation der 18S-rRNA besonders ausgeprägt war. Die
Effizienz
der
PCR
hat
entscheidenden
Einfluss
auf
das
Ergebnis
einer
Quantifizierung. Aufgrund des exponentiellen Charakters der Reaktion haben
geringste Unterschiede in der PCR-Effizienz extreme Auswirkungen auf die
Kopienzahl. Zielgen und Referenzgen sollten daher die gleiche PCR-Effizienz
aufweisen, oder es sollten Effizienz-korrigierte Modelle angewendet werden
(PFAFFL 2004). In der hier durchgeführten Arbeit wurde versucht, eine relative
Quantifizierung mithilfe der Effizienz-korrigierten Formel nach PFAFFL (2001)
durchzuführen. Es gelang jedoch nicht, verwertbare Ergebnisse zu erzielen. Die
Ursache hierfür wurde bei der Betrachtung der Cts des Kalibrators deutlich.
Theoretisch hätte der Kalibrator in allen Läufen gleiche oder zumindest sehr ähnliche
Cts aufweisen müssen. Während die Cts der PDI noch in einem vergleichsweise
engen Rahmen von zwei Cts schwankten, waren bei den Cts der 18S-rRNA
Unterschiede von bis zu zehn Cts vorhanden. Hierdurch war keine konstante
Vergleichsgröße gegeben und es konnten keine auswertbaren Ergebnisse erzielt
werden.
168
Diskussion
Eine mangelhafte PCR-Effizienz kann diverse Gründe haben. Hierzu gehören u. a.
die Länge des Amplifikats, Spezifität der Primer, GC-Gehalt des Templates,
Sekundärstrukturen, Qualität der Sonde und PCR-Inhibitoren (BUSTIN 2004). Da die
Konstruktion der Primer und Sonden mit dem Primer Express Programm erfolgte,
erscheint ein suboptimales Primer/Sonden-Design als Ursache für die unzureichende
PCR-Effizienz eher unwahrscheinlich. Weiterhin wurde die Spezifität der PCR durch
Darstellung der PCR-Produkte im Agarosegel überprüft. Da sowohl für die PDI- als
auch für die 18S-rRNA-Amplifikationen der gleiche cDNA-Pool und Mastermix
verwendet wurde, scheint auch ein Vorhandensein von PCR-Inhibitoren nicht
Hauptursache
zu
sein.
Am
problematischsten
erscheint
bei
der
Versuchsdurchführung die Wahl der Primer für die Reverse Transkription. Da 18SrRNA nicht über eine Poly-A-Sequenz am 3’-Ende verfügt, war es notwendig, einen
genspezifischen Primer einzusetzten. Hierbei wurde der gleiche Rückwärtsprimer
verwendet wie für die Amplifikation in der real-time PCR. Das heißt, dass die zu
amplifizierende Sequenz sich am äußersten 3’-Ende der cDNA befand. Dies stellt
eine ungünstige Position für eine korrekte und effektive Primerbindung dar und
könnte die Ursache für die mangelhafte PCR-Effizienz der 18S-rRNA-Amlifikation
sein.
5.5 Zusammenfassende Beurteilung und Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit konnten die cDNA-Sequenzen zweier PDI Gene von D.
viviparus identifiziert werden. Für das als PDI2 bezeichnete Gen erfolgte ferner die
Bestimmung der genomischen Sequenz sowie eine Expression als GSTFusionsprotein in E. coli. Sequenzidentitätsvergleiche und eine MALDI-TOF-MSAnalyse des exprimierten Proteins konnten die Identität der PDI bestätigen. Die
hohen Ähnlichkeiten der hier identifizierten PDI2 zur PDI2 von C. elegans lassen für
dieses Enzym bei D. viviparus eine ähnlich essentielle Bedeutung bei der Synthese
der Kutikula vermuten.
Im Western-Blot konnte die rekombinante PDI mit dem Serum D. viviparus infizierter
Rinder detektiert werden, wodurch die Immunogenität des Proteins bestätigt wurde.
In darauffolgenden Immunisierungsversuchen an Rindern zeigte das GST-
Diskussion
169
Fusionsprotein kein protektives Potential. Obwohl bei den immunisierten Tieren PDIspezifische Antikörper detektiert werden konnten, waren diese nicht in der Lage,
einen Schutz gegen eine experimentelle Infektion zu vermitteln. Es konnte weder
eine statistisch signifikante verminderte Larvenausscheidung noch eine Reduktion
der Wurmbürde im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden. Eine konstant
zu beobachtende Reduktion der Wurmlänge bei den immunisierten Tieren erreichte
aufgrund großer Schwankungen zwischen den Versuchstieren keine statistische
Signifikanz. Die geringe serologische Reaktion der Kontrolltiere auf das GSTFusionsprotein nach der experimentellen Infektion ließen die extrazelluläre
Lokalisation des Proteins bei D. viviparus fraglich erscheinen. Möglicherweise war
die Detektion der PDI jedoch auch aufgrund fehlender Epitope in Folge der
prokaryotischen Expression eingeschränkt. Bevor die PDI als Vakzinekandidat
aufgegeben wird, sollten diese beiden Punkte überprüft werden. Sofern die PDI sich
in ES-Material von D. viviparus nachweisen lässt und das native Protein eine höhere
Immunogenität als die in E. coli exprimierte PDI besitzt, könnten Immunisierungen
mit in eukaryotischen Expressionssystemen hergestellter PDI versucht werden.
Weiterhin wäre es aufschlussreich, die Lokalisation der PDI im Wurm, beispielsweise
mittels Immunhistochemie, zu bestimmen.
170
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Sonja Wolken (2006):
Charakterisierung und in vitro Expression einer Protein Disulfid Isomerase
(PDI) zur Immunisierung gegen Dictyocaulus viviparus
Die
Dictyocaulose
ist
eine
der
wirtschaftlich
bedeutsamsten
parasitären
Erkrankungen der Weiderinder. Die im natürlichen Infektionsgeschehen vorhandene
Ausbildung einer protektiven Immunität und Erfolge mit einer Larvenvakzine lassen
die Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffs möglich erscheinen.
Als Vakzinekandidat wurde das Enzym Protein Disulfid Isomerase gewählt, dessen
immunogene Eigenschaften bereits bei anderen Helminthen beschrieben worden
waren. Mittels degenerierter Primer konnte ein zentraler Abschnitt der PDI-Sequenz
bei Dictyocaulus viviparus identifiziert werden, welcher durch 5’- und 3’-Rapid
Amplifikation of cDNA Ends (RACE) vervollständigt wurde. Die hieraus resultierende
Sequenz weist einen offenen Leserahmen über 1482 bp auf und zeigt eine 80%ige
Identität zur PDI von Ancylostoma caninum und Teladorsagia circumcincta sowie zur
PDI2 von Ostertagia ostertagi und eine 72%ige Identität zur PDI2 von Caenorhabditis
elegans. Diese Identitäten resultierten in der Beschreibung der identifizierten PDI als
PDI2 von D. viviparus. Die Aminosäurensequenz weist zwei Thioredoxin-Domänen
auf, wobei es sich um hochkonservierte Bereiche handelt, in denen die katalytisch
aktiven Zentren des Enzyms lokalisiert sind. Die genomische Sequenz der PDI2 hat
eine Größe von 2649 bp und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Die Positionen
der Introns im Gen stellen sich im Vergleich mit der A. caninum-Sequenz als
vollständig konserviert dar.
Die degenerierten Primer identifizierten eine zweite PDI bei D. viviparus mit höchsten
Identitäten zur PDI1 von O. ostertagi und zur PDI3 von C. elegans.
Die PDI2 wurde als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und mittels AffinitätsChromatographie aufgereinigt. Die Immunogenität des rekombinanten Proteins
konnte im Western-Blot anhand von Serum experimentell mit D. viviparus infizierter
Zusammenfassung
171
Rinder nachgewiesen werden. In zwei verschiedenen Immunisierungsversuchen
erfolgte an insgesamt 22 Rindern die Überprüfung des protektiven Potentials des
GST-PDI-Fusionsproteins in Kombination mit den Adjuvantien Al(OH)3 und Quil A.
Trotz des Vorhandenseins PDI-spezifischer Antikörper bei allen immunisierten Tieren
konnte durch die Impfung kein Schutz gegen eine experimentelle Infektion vermittelt
werden. Weder in der Larvenausscheidung noch in Bezug auf die Wurmbürde konnte
eine statistisch signifikante Reduktion festgestellt werden. Tendenziell zeigten Tiere,
die das Adjuvans Quil A erhalten hatten, eine geringere Larvenausscheidung, wobei
unklar ist, ob es sich hierbei um eine spezifische Immunreaktion handelte. Weiterhin
war bei allen immunisierten Tieren eine Reduktion der Wurmgröße zwischen 7,2 und
18% im Vergleich zur Kontrollgruppe zu beobachten, die jedoch ebenfalls keine
statistische Signifikanz erreichte.
172
Summary
7 Summary
Sonja Wolken (2006):
Characterisation and in vitro expression of a protein disulfide isomerase (PDI)
for the immunisation against Dictyocaulus viviparus
Dictyocaulosis is one of the most important parasitic diseases in grazing cattle with
high economic impact. Since natural infections stimulate a protective immunity and
good results were optained with an attenuated live vaccine, development of a
recombinant vaccine seems to be feasible.
Protein disulfide isomerase, an enzyme whose immunogenicity has been discribed in
other helminths, was choosen as a vaccine candidate. Using degenerate primers, a
central part of the PDI sequence in Dictyocaulus viviparus was identified. To
complete the sequence, 5’- and 3’-rapid amplification of cDNA ends (RACE) was
used. The full length sequence contains an open reading frame of 1482 bp and
presents 80% identity to PDI of Ancylostoma caninum and Teladorsagia circumcincta
as well as to PDI2 of Ostertagia ostertagi and 72% identity to PDI2 of Caenorhabditis
elegans. Therefore the identified PDI was described as PDI2 of D. viviparus. The
amino acid sequence shows two thioredoxin domains. These highly conserved
regions contain the active sites for the enzyme activity. The genomic sequence of the
PDI2 has a length of 2649 bp and consists of five exons and four introns, the introns
being located at exactly the same positions as in the A. caninum sequence. This
demonstrates the conserved organization of this gene.
When using degenerate primers, a second PDI sequence of D. viviparus was
identified. This PDI shows highest identities to PDI1 of O. ostertagi and to PDI3 of
C. elegans.
The PDI2 was expressed as GST fusion protein in E. coli and purified via affinity
chromatography. The immunogenicity of the recombinant protein was demonstrated
in western-blots using sera of cattle experimentally infected with D. viviparus. In two
Summary
173
immunization trials the protective potential of the fusion protein in combination with
the adjuvants Al(OH)3 and Quil A was tested in a total of 22 cattle. Despite the
existence of PDI specific antibodies in all vaccinated cattle, the recombinant protein
failed to induce protection against challenge. Neither in larvae counts nor in worm
burdens a statistical significance in reduction was seen. Calves that had received
Quil A showed a tendency to have lower total larvae counts, but it was not clear
whether this effect was due to a specific immunresponse. Furthermore all immunized
calves harboured worms that were 7,2% to 18% shorter than those of the control
group. But again this was not statistical significant.
174
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mRNA and 18S-RNA coapplication-reverse transkription for quantitative gene
expression analysis
Anal. Biochem. 345, 102-105
Anhang
199
9 Anhang
9.1 Vollständige cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäurensequenz der PDI1 von D. viviparus
1 gtttaattac ccaagtttga gggtgcaccg
1
46 tat gtt ttt gct gtg tta ttt ctg
5
y
v
f
a
v
l
f
l
85 gat gtg tta gag tac acc gat gct
18
d
v
l
e
y
t
d
a
124 atc aag ttc cat gaa atc gct ttg
31
i
k
f
h
e
i
a
l
163 ccg tgg tgt ggc cac tgt aag aaa
44
p
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c
g
h
c
k
k
202 gac aaa gct tca act aag ctg aaa
57
d
k
a
s
t
k
l
k
241 gtc gct tta att aag gtt gat tgc
70
v
a
l
i
k
v
d
c
280 aca tgt gac aaa tat ggc gtc aaa
83
t
c
d
k
y
g
v
k
319 aaa atc ttt cgc ttt gga tcg gaa
96
k
i
f
r
f
g
s
e
358 gga cct cgt gat gcg gac ggt atc
109
g
p
r
d
a
d
g
i
397 ggg caa gct ggt cct tct gcc aga
122
g
q
a
g
p
s
a
r
436 aac gag ttc aag aaa gct atc agt
135
n
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f
k
k
a
i
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475 gtt att ggc ttc ttc gag aat gag
148
v
i
g
f
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n
e
514 tca ttc ctc aaa gtt gct gac act
161
s
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l
k
v
a
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t
553 cag ttt gca tac act tct gat cgt
174
q
f
a
y
t
s
d
r
592 acg gga tat aac gat gat atc gtt
187
t
g
y
n
d
d
i
v
631 cag ctc cat aat aag ttt gat cct
200
q
l
h
n
k
f
d
p
670 gat ggc aac tat gat acg gac aaa
213
d
g
n
y
d
t
d
k
709 att cat gaa acc gtc gga atg gct
226
i
h
e
t
v
g
m
a
748 gga aat ttg ttc caa ttt gaa cag
239
g
n
l
f
q
f
e
q
787 gta tat tac aat gtc gac tat ttg
252
v
y
y
n
v
d
y
l
826 tcg aat tat tgg cgt aat cgt gta
265
s
n
y
w
r
n
r
v
865 gat tac aag cgc aag gtt cat ttt
278
d
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k
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k
v
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cgg atg
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c
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aag
k
tat
y
ctc
l
cat
h
att
i
ggt
g
aaa
k
aaa
k
200
Anhang
904
291
943
304
982
317
1021
330
1060
343
1099
356
1138
369
1177
382
1216
395
1255
408
1294
421
1333
434
1372
447
1411
460
1450
473
1489
1529
1569
1609
1649
1689
1729
gaa gaa ttt tca tca gaa gtt gat caa aat gga
e
e
f
s
s
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v
d
q
n
g
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l
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t
n
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d
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gta gaa ttt tac gct ccg tgg tgc gga cac tgc
v
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c
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l
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a
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k
gat gaa gat gtt ctc att gta aaa atg gat gcc
d
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l
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a
aat gat gta cct ccc ttg ttt gaa gtc aat gga
n
d
v
p
p
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f
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n
g
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i
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w
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n
k
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g
gtt cct tac agt ggt ggc cga gaa gtg gac gac
v
p
y
s
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v
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tcc ttc ata gct aag cac tca acc gat ggc ctc
s
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i
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k
h
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t
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l
tat tca cgt gat gga aag aag aag aag gca gag
y
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k
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k
a
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ttttgtaagc gttcattgtt gaagaagctt ttgcatggtg
tttacaagaa catcattaat atgatacaat gcaacatttg
cacttttttc cactgttatt tattatttcg aagggtggtc
ttcacggttg tttgttgtta cataggctta tgatgtgcct
tttatggttt tcacataatt ttattgtagc aagtatttat
cagaagtcaa taaatcgttg tttctgttaa aaaaaaaaaa
aaaaaaaaaa aaaaa
Abb. 32:
ctt
l
gct
a
ttc
f
att
i
att
i
aag
k
gtt
v
aag
k
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gct
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cct
p
aat
n
ctt
l
gcg
a
gta
v
gct
a
cct
p
cca
p
atc
i
caa
q
taa
-
cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäurensequenz der PDI1.
Start- und Stopcodon sind fett gedruckt.
9.2 Vollständige cDNA-Sequenz und Aminosäurensequenz der
PDI2 von D. viviparus
1
41
1
83
8
122
21
161
acggtgtgtc ggagtgctct cttcacggtg ttctagacaa
attgtcattc attggggcgc a atg ttc aaa ctc gcc
m
f
k
l
a
tgc gtc ttt gct ctg tcg gca ttc gcc gca act
c
v
f
a
l
s
a
f
a
a
t
gaa gag gag aat gtg atc gtg ctt aca aag gac
e
e
e
n
v
i
v
l
t
k
d
gac gaa gtt att aac ggt cat gag ttt gtg ctt
tgc
c
gtt
v
aac
n
gcc
ctt
l
gaa
e
ttt
f
gaa
Anhang
34
200
47
239
60
278
73
317
86
356
99
395
112
434
125
473
138
512
151
551
164
590
177
629
190
668
203
707
216
746
229
785
242
824
255
863
268
902
281
941
294
980
307
1019
320
1058
333
1097
346
1136
359
1175
372
1214
201
d
ttt
f
ccg
p
ggt
g
cat
h
cca
p
tac
y
ttg
l
act
t
gtt
v
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g
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d
act
t
gat
d
aca
t
gga
g
gaa
e
aag
k
gtt
v
aag
202
385
1253
398
1292
411
1331
424
1370
437
1409
450
1448
463
1487
476
1526
489
1564
1604
1644
1684
1724
1764
Anhang
l
v
e
f
y
a
p
w
c
g
h
c
caa ctt gct ccg act tgg gac aag ctt gga gaa aag
q
l
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p
t
w
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k
l
g
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k
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t
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v
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v
q
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ccg aca atc aag ttc ttc ccc gca gga tca aat aaa
p
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p
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k
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i
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l
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k
f
l
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s
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g
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g
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g
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s
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d
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k
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a
e
e
a
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g
h
t
e
l
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acattgcctt cctgtatatg cgttttttct cttcttcaat
tgtgatcgtt gataagtgat ggtgaaattt atttattttt
gttcagaact acaccactgt gttggagaac tgggtttaaa
taaatataac attttgccaa aaaaaaaaaa aaa
Abb. 33:
k
tat
y
gca
a
ttc
f
ata
i
act
t
cca
p
gag
e
cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäurensequenz der PDI2.
Start- und Stopcodon sind fett gedruckt.
Anhang
203
9.3 Eosinophile Granulozyten
Kombi
Quil A
Kontrolle
Quil A
PDI
Quil A
PDI
Al(OH)3
Kombi
Quil A
Kombi
Al(OH)3
Kontrolle
Al(OH)3
Gruppe
Tab. 18:
Tier-Nr.
588
596
598
950
611
749
757
914
544
586
597
952
540
545
581
752
579
600
753
948
110
795
802
805
808
814
754
762
790
807
810
816
Eosinophile Granulozyten
%
G/l
%
G/l
%
G/l
I. Immunisierungsversuch
Tag 84
Tag 91
Sektion
11,5
1,36
4,5
0,41
5,5
0,51
2,0
0,13
4,0
0,30
3,0
0,21
8,0
0,86
3,0
0,25
6,0
0,58
4,5
0,41
2,5
0,15
4,0
0,66
10,0
0,82
11,0
1,06
5,0
0,50
5,5
0,49
2,0
0,17
8,0
0,61
4,5
0,48
3,0
0,33
4,0
0,33
11,5
1,12
10,5
0,72
17,5
1,30
1,5
0,13
18,0
2,12
2,0
0,18
10,5
0,58
5,0
0,27
3,0
0,14
4,0
0,35
5,0
0,43
4,0
0,32
10,5
1,00
16,0
1,71
5,5
0,43
1,0
0,07
1,5
0,11
2,5
0,15
3,0
0,31
3,5
0,38
2,5
0,23
4,0
0,50
5,5
0,73
6,5
0,76
10,0
0,80
5,5
0,48
5,0
0,40
8,0
0,82
3,5
0,31
4,5
0,38
7,0
0,53
1,0
0,08
1,5
0,09
10,0
0,86
9,5
0,81
4,5
0,35
21,5
2,06
11,5
0,84
6,0
0,43
II. Immunisierungsversuch
Tag 84
Tag 91
Sektion
10,5
0,83
14,0
0,99
2,5
0,15
13,5
1,15
8,0
0,57
7,5
0,52
12,5
1,13
13,0
1,24
9,0
0,70
7,5
0,71
15,5
1,55
8,0
0,93
8,0
0,96
6,0
0,59
2,0
0,20
5,0
0,44
9,0
0,95
8,0
0,85
4,0
0,29
11,0
0,87
3,5
0,24
4,0
0,34
3,5
0,34
2,0
0,16
15,5
1,13
11,0
0,96
5,0
0,49
6,0
0,54
10,0
1,08
2,0
0,17
17,5
1,56
5,0
0,39
6,5
0,35
14,0
0,99
12,5
0,91
2,0
0,11
Eosinophile Granulozyten
204
Anhang
9.4 Larvenausscheidung im I. u. II. Immunisierungsversuch
Kontrolle
Al(OH)3
Tag
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
Tab. 19:
I. Immunisierungsversuch
Kombi
Kombi
PDI
Quil A
Al(OH)3
Al(OH)3
PDI
Quil A
II. Immunisierungsversuch
Kontrolle
Kombi
Quil A
Quil A
Mittelwert Anzahl Larven und Standardabweichung SD
0,0
0,3
0,0
0,0
0,3
0,0
0,0
0,4
0,0
0,0
0,4
0,0
5,3
11,5
5,0
2,3
1,8
4,2
4,9
10,7
7,5
1,8
1,8
6,5
35,8
38,3
9,8
11,5
7,5
12,3
42,0
40,3
14,1
5,0
4,7
9,4
93,0
63,0
31,5
37,8
26,0
27,7
93,3
55,6
44,2
14,5
23,3
33,7
169,3
183,8
64,3
185,0
27,8
101,3
249,0
113,7
65,8
61,9
17,5
75,5
211,8
137,3
82,0
242,8
39,8
90,5
270,5
67,2
93,5
97,2
16,8
65,6
365,3
296,8
26,8
288,3
112,3
325,5
456,2
254,4
10,8
154,0
67,4
156,2
312,8
572,0
166,8
329,3
95,8
390,6
191,8
393,5
136,2
119,9
47,5
325,9
505,0
599,8
300,8
438,5
183,3
456,8
325,4
499,4
190,5
250,8
126,5
384,0
802,0
751,0
175,0
365,0
425,5
576,4
644,1
627,5
49,3
126,1
389,5
419,2
1233,0
355,0
401,3
968,5
415,5
437,3
545,7
140,7
240,3
237,3
314,8
535,0
992,0
848,0
720,8
915,0
632,3
396,4
604,6
615,2
395,9
505,6
383,0
317,7
1708,0
1069,0
425,0
1647,0
594,0
592,4
1313,6
1186,9
135,8
627,3
471,0
756,1
687,0
824,0
191,0
546,0
167,0
640,3
445,1
769,3
111,8
144,7
86,2
965,6
1059,0
612,0
284,5
509,0
396,5
1301,7
511,9
148,6
179,9
395,8
0,0
0,0
1,0
1,0
16,2
17,9
47,4
40,9
66,3
32,4
90,1
59,6
198,4
155,1
211,2
161,1
257,8
286,5
244,3
222,6
181,8
150,5
353,1
242,4
325,7
220,3
223,5
164,8
Larvenausscheidung im I. u. II. Immunisierungsversuch.
Arithmetischer Mittelwerte (∅) der Gruppen mit Standardabweichungen an den
Versuchstagen.
Anhang
205
9.5 Längen und Breiten der adulten Würmer
Tier
Nr.
38,4
36,7
40,2
46,8
40,5
40,4
29,1
34,7
28,6
33,2
32,8
37,7
32,7
32,8
34,0
34,2
39,2
38,0
39,0
37,6
27,7
38,5
42,9
31,9
35,2
110
795
802
805
808
814
∅ (Gruppe)
754
762
790
807
810
816
∅ (Gruppe)
40,3
36,7
29,9
34,0
35,4
35,4
35,3
33,7
31,7
30,6
34,2
34,6
27,6
32,1
Al(OH)3
Kombi
∅
Kombi
Quil A
∅
Al(OH)3
PDI
∅
PDI
Quil A
∅
Kombi
Quil A
Kontrolle
Quil A
∅
Tab. 20:
m
588
596
598
950
(Gruppe)
611
749
757
914
(Gruppe)
544
586
597
952
(Gruppe)
540
545
581
752
(Gruppe)
579
600
753
948
(Gruppe)
Al(OH)3
Kontrolle
Gruppe
Länge (m m )
SD
w
SD
m
I. Immunisie rungsv e rsuch
3,5
51,5
4,1
0,42
4,5
48,6
7,0
0,40
3,9
52,0
4,2
0,40
3,3
58,7
3,6
0,44
5,4
52,7
6,2
0,42
4,0
56,9
5,3
0,42
3,2
40,1
4,2
0,34
3,6
46,4
4,5
0,37
2,2
37,8
3,2
0,29
5,9
45,3
8,6
0,36
5,1
47,6
3,6
0,31
3,9
49,0
4,1
0,36
5,3
47,5
5,0
0,29
3,8
41,1
4,7
0,31
5,1
46,3
5,4
0,32
4,6
42,3
5,1
0,33
3,9
47,7
4,2
0,36
3,5
49,1
5,4
0,34
3,6
48,5
4,6
0,36
4,4
46,9
5,5
0,35
3,3
37,0
4,8
0,31
2,8
45,7
4,4
0,36
4,5
52,8
5,0
0,40
3,1
40,7
4,4
0,31
6,8
44,1
7,5
0,35
II. Immunisie rungsv e rsuch
4,7
55,5
5,0
0,43
2,8
47,2
4,8
0,41
2,6
40,6
5,3
0,30
3,2
48,0
4,4
0,36
3,6
46,1
4,7
0,38
4,9
46,5
6,8
0,35
3,2
47,3
5,1
0,37
3,6
42,8
4,3
0,34
3,4
44,3
4,8
0,33
3,1
42,4
4,0
0,32
3,1
42,6
5,0
0,34
3,5
44,9
5,0
0,38
3,5
37,2
3,5
0,28
4,2
42,3
5,3
0,33
B reite (m m )
SD
w
SD
0,05
0,06
0,05
0,05
0,06
0,05
0,06
0,05
0,03
0,07
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,04
0,05
0,06
0,05
0,05
0,05
0,06
0,04
0,05
0,06
0,42
0,39
0,43
0,45
0,42
0,47
0,36
0,42
0,35
0,40
0,41
0,41
0,42
0,36
0,40
0,45
0,47
0,44
0,47
0,46
0,42
0,48
0,49
0,43
0,45
0,05
0,05
0,05
0,04
0,05
0,06
0,05
0,06
0,05
0,07
0,05
0,06
0,05
0,04
0,05
0,04
0,08
0,07
0,05
0,06
0,07
0,05
0,06
0,06
0,07
0,06
0,04
0,05
0,05
0,04
0,06
0,04
0,05
0,04
0,04
0,05
0,06
0,04
0,05
0,47
0,43
0,34
0,44
0,41
0,41
0,42
0,36
0,36
0,34
0,33
0,37
0,29
0,34
0,06
0,06
0,06
0,04
0,05
0,07
0,04
0,04
0,06
0,04
0,05
0,05
0,04
0,06
Länge und Breite der adulten Würmer.
Mittelwerte von 25 weiblichen (w) und 25 männlichen (m) Würmern pro Versuchstier.
∅: arithmetischer Mittelwert der Gruppe, SD: Standardabweichung.
206
Anhang
9.6 Indices für verschiedene Serumantikörpertiter
Gruppe
0
4
7
11
PDI
Quil A
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
0,28
0,06
0,28
0,05
0,35
0,09
0,25
0,04
0,30
0,03
0,27
0,04
0,38
0,13
0,49
0,11
0,43
0,09
0,44
0,05
0,25
0,03
0,41
0,16
0,82
0,09
0,32
0,10
0,77
0,16
0,33
0,04
0,97
0,24
0,95
0,10
1,17
0,04
0,95
0,07
Kontrolle
Quil A
Kombi
Quil A
∅
SD
∅
SD
0,47
0,11
0,41
0,09
0,43
0,09
0,48
0,07
0,39
0,06
0,88
0,07
0,46
0,09
1,10
0,08
Kontrolle
Al(OH)3
Kombi
Al(OH)3
PDI
Quil A
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
0,37
0,10
0,28
0,07
0,35
0,06
0,34
0,06
0,37
0,10
0,31
0,08
0,29
0,06
0,36
0,06
0,29
0,04
0,32
0,08
0,25
0,06
0,33
0,08
0,64
0,11
0,30
0,08
0,58
0,12
0,35
0,09
0,80
0,16
0,77
0,08
0,97
0,05
0,81
0,07
Kontrolle
Quil A
Kombi
Quil A
∅
SD
∅
SD
0,34
0,07
0,40
0,07
0,35
0,07
0,38
0,07
0,36
0,06
0,70
0,10
0,34
0,07
0,91
0,06
Kontrolle
Al(OH)3
Kombi
Al(OH)3
PDI
Quil A
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
0,12
0,04
0,14
0,11
0,16
0,10
0,40
0,24
0,18
0,08
0,10
0,03
0,23
0,23
0,21
0,12
0,39
0,21
0,18
0,06
0,08
0,02
0,14
0,08
0,39
0,16
0,26
0,09
0,36
0,19
0,11
0,02
1,04
0,35
0,88
0,23
1,47
0,18
0,91
0,08
Kontrolle
Quil A
Kombi
Quil A
∅
SD
∅
SD
0,25
0,19
0,21
0,04
0,25
0,19
0,21
0,04
0,26
0,18
0,46
0,23
0,25
0,18
1,07
0,26
IgG
Kontrolle
Al(OH)3
Kombi
Al(OH)3
Kombi
Quil A
PDI
Al(OH)3
Tag
14
21
28
35
42
49
98
91 99
56
63
70
77
84
0,38
0,07
1,18
0,05
1,15
0,02
1,22
0,06
1,10
0,06
0,37
0,04
1,22
0,04
1,18
0,02
1,14
0,03
1,03
0,06
0,34
0,04
1,21
0,05
1,18
0,02
1,30
0,07
1,17
0,03
0,36
0,05
1,21
0,03
1,29
0,08
1,20
0,04
1,08
0,06
0,38
0,04
1,21
0,03
1,15
0,02
1,31
0,05
1,18
0,03
0,47
0,13
1,23
0,03
1,18
0,03
1,17
0,02
1,08
0,04
0,83
0,25
1,25
0,04
1,20
0,04
1,31
0,03
1,13
0,06
0,38
0,06
1,08
0,03
0,40
0,06
1,13
0,03
0,54
0,07
1,27
0,05
0,58
0,16
1,28
0,04
0,60
0,13
1,30
0,04
0,71
0,21
1,25
0,04
0,74
0,22
1,15
0,03
0,37
0,06
1,05
0,02
1,02
0,01
1,10
0,02
1,07
0,02
0,34
0,05
1,01
0,02
1,01
0,00
1,06
0,02
1,04
0,02
0,37
0,06
1,03
0,02
1,00
0,02
1,07
0,01
1,03
0,02
0,33
0,06
1,02
0,03
1,03
0,03
1,06
0,01
1,04
0,02
0,39
0,05
1,05
0,03
1,03
0,02
1,06
0,02
1,05
0,02
0,52
0,17
1,03
0,03
0,99
0,01
1,03
0,03
1,02
0,02
0,78
0,20
1,04
0,03
1,00
0,02
1,08
0,02
1,03
0,01
0,32
0,04
1,04
0,01
0,37
0,05
1,03
0,02
0,46
0,04
1,02
0,01
0,41
0,03
1,01
0,02
0,43
0,04
1,03
0,02
0,58
0,19
1,04
0,01
0,61
0,22
1,06
0,02
0,11
0,02
1,08
0,33
1,33
0,10
1,32
0,31
1,38
0,10
0,11
0,03
1,09
0,33
1,38
0,11
1,17
0,26
1,17
0,16
0,12
0,03
1,08
0,35
1,40
0,12
1,55
0,32
1,50
0,15
0,10
0,03
1,17
0,35
1,50
0,12
1,26
0,25
1,26
0,12
0,13
0,03
1,28
0,35
1,64
0,11
1,48
0,29
1,52
0,16
0,16
0,08
1,28
0,31
1,56
0,14
1,23
0,26
1,33
0,14
0,22
0,08
1,49
0,14
1,66
0,15
1,58
0,22
1,45
0,19
0,34
0,20
1,29
0,08
0,36
0,20
1,30
0,08
0,48
0,17
1,36
0,13
0,43
0,20
1,37
0,11
0,44
0,18
1,39
0,08
0,45
0,18
1,39
0,06
0,37
0,17
1,32
0,09
I. Immunisierungsversuch
0,41
0,07
1,01
0,09
1,08
0,11
1,20
0,04
1,13
0,07
0,19
0,02
1,00
0,09
1,06
0,10
1,04
0,06
1,04
0,08
0,39
0,03
1,10
0,03
1,13
0,04
1,12
0,04
0,99
0,06
0,22
0,06
1,10
0,05
1,14
0,04
1,05
0,03
0,96
0,05
0,43
0,05
1,13
0,03
1,15
0,04
1,20
0,04
1,01
0,04
0,22
0,03
1,22
0,11
1,09
0,03
1,01
0,05
0,95
0,03
IgG1
II. Immunisierungsversuch
Kombi
Quil A
PDI
Al(OH)3
0,43
0,10
1,10
0,09
0,43
0,09
1,12
0,10
0,41
0,09
1,05
0,02
0,46
0,11
1,07
0,03
0,39
0,07
1,02
0,02
0,35
0,06
1,04
0,04
I. Immunisierungsversuch
0,46
0,14
0,92
0,06
0,90
0,05
1,06
0,02
1,04
0,02
0,30
0,06
0,93
0,06
0,91
0,04
0,96
0,02
0,96
0,03
0,44
0,05
1,01
0,03
1,04
0,02
1,07
0,01
1,02
0,03
0,29
0,03
1,01
0,03
1,01
0,02
0,98
0,03
0,97
0,03
0,42
0,03
1,00
0,02
1,03
0,02
1,07
0,01
1,01
0,03
0,26
0,03
1,04
0,03
1,01
0,02
0,99
0,02
0,98
0,01
IgG2
II. Immunisierungsversuch
Kombi
Quil A
PDI
Al(OH)3
0,37
0,07
0,96
0,06
0,36
0,08
0,95
0,04
0,36
0,07
1,02
0,02
0,40
0,10
1,03
0,01
0,35
0,07
1,03
0,01
0,31
0,06
0,98
0,03
I. Immunisierungsversuch
0,14
0,03
1,32
0,19
1,37
0,32
1,68
0,15
1,47
0,04
0,08
0,02
1,38
0,23
1,45
0,29
1,39
0,15
1,22
0,08
0,13
0,03
0,98
0,37
1,24
0,06
1,29
0,24
0,87
0,13
0,08
0,01
1,08
0,48
1,24
0,08
1,07
0,18
0,85
0,10
0,14
0,01
1,06
0,40
1,26
0,07
1,43
0,26
0,96
0,04
0,08
0,02
1,06
0,35
1,25
0,11
0,99
0,29
0,95
0,03
II. Immunisierungsversuch
0,26
0,19
1,31
0,34
0,27
0,19
1,33
0,31
0,23
0,14
0,98
0,23
0,25
0,13
1,02
0,14
0,36
0,21
1,22
0,19
0,34
0,20
1,19
0,10
Anhang
Gruppe
0
4
7
11
PDI
Quil A
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
0,27
0,04
0,24
0,06
0,26
0,14
0,33
0,11
0,28
0,07
0,21
0,02
0,28
0,07
0,35
0,13
0,30
0,08
0,35
0,06
0,16
0,02
0,38
0,19
0,90
0,17
0,23
0,05
0,72
0,28
0,27
0,03
0,87
0,19
1,00
0,24
1,10
0,28
1,03
0,20
Kontrolle
Quil A
Kombi
Quil A
∅
SD
∅
SD
0,39
0,15
0,43
0,15
0,34
0,08
0,40
0,11
0,34
0,07
0,99
0,16
0,33
0,06
1,14
0,12
PDI
Quil A
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
∅
SD
0,53
0,11
0,38
0,10
0,31
0,06
0,54
0,11
0,49
0,04
0,48
0,17
0,42
0,11
0,48
0,08
0,47
0,09
0,59
0,14
0,44
0,24
0,61
0,26
1,08
0,09
0,41
0,06
1,11
0,17
0,52
0,20
0,94
0,16
1,07
0,14
1,04
0,18
1,16
0,14
Kontrolle
Quil A
Kombi
Quil A
∅
SD
∅
SD
0,66
0,13
0,64
0,15
0,59
0,08
0,65
0,11
0,62
0,07
1,12
0,07
0,63
0,08
1,12
0,10
Kontrolle
Al(OH)3
Kombi
Al(OH)3
IgA
207
Kombi
Quil A
PDI
Al(OH)3
Tag
14
21
28
35
42
49
98
91 99
56
63
70
77
84
0,52
0,42
1,19
0,11
1,29
0,05
0,97
0,15
1,02
0,06
0,47
0,26
1,17
0,10
1,26
0,03
1,07
0,18
1,13
0,10
0,58
0,34
1,18
0,10
1,24
0,02
1,14
0,17
1,12
0,10
0,41
0,22
1,20
0,12
1,37
0,05
1,10
0,21
1,14
0,11
0,46
0,22
1,18
0,11
1,28
0,06
1,15
0,21
1,17
0,10
0,40
0,14
1,17
0,13
1,28
0,04
1,08
0,28
1,19
0,07
0,54
0,17
1,27
0,15
1,32
0,06
1,35
0,16
1,26
0,03
0,28
0,14
1,10
0,08
0,28
0,11
1,12
0,06
0,33
0,09
1,25
0,16
0,38
0,22
1,24
0,13
0,45
0,28
1,26
0,12
0,51
0,27
1,26
0,09
0,43
0,18
1,20
0,10
0,61
0,14
0,98
0,21
1,21
0,03
0,85
0,12
1,05
0,04
0,48
0,03
0,99
0,19
1,20
0,03
0,92
0,13
1,09
0,04
0,58
0,04
0,96
0,17
1,15
0,04
1,03
0,14
1,16
0,08
0,43
0,05
0,99
0,18
1,27
0,03
0,98
0,17
1,10
0,05
0,59
0,07
0,99
0,27
1,30
0,04
1,10
0,16
1,18
0,06
0,48
0,03
0,96
0,29
1,29
0,04
1,00
0,19
1,14
0,03
0,65
0,07
1,07
0,23
1,31
0,05
1,22
0,11
1,21
0,04
0,50
0,08
1,09
0,07
0,52
0,08
1,11
0,02
0,51
0,06
1,24
0,12
0,57
0,23
1,23
0,10
0,58
0,24
1,22
0,09
0,61
0,22
1,23
0,06
0,62
0,13
1,23
0,08
I. Immunisierungsversuch
0,39
0,07
1,01
0,15
1,11
0,30
1,38
0,20
1,34
0,15
0,16
0,01
0,96
0,13
1,03
0,28
1,01
0,21
0,98
0,21
0,29
0,03
1,17
0,09
1,26
0,11
1,07
0,15
1,24
0,13
0,17
0,06
1,19
0,16
1,19
0,07
0,90
0,12
0,98
0,09
0,35
0,17
1,17
0,14
1,24
0,08
1,14
0,15
0,99
0,02
0,31
0,26
1,21
0,15
1,18
0,06
0,92
0,14
0,97
0,07
II. Immunisierungsversuch
IgM
Kontrolle
Al(OH)3
Kombi
Al(OH)3
Kombi
Quil A
PDI
Al(OH)3
0,33
0,05
1,12
0,14
0,27
0,07
0,96
0,18
0,27
0,07
1,05
0,04
0,33
0,09
1,08
0,05
0,29
0,10
1,18
0,14
0,30
0,15
1,12
0,09
I. Immunisierungsversuch
0,60
0,16
0,97
0,12
1,06
0,19
1,20
0,14
1,22
0,12
0,46
0,08
0,85
0,17
0,95
0,22
1,10
0,16
1,06
0,13
0,51
0,05
1,03
0,10
1,19
0,10
0,98
0,12
1,24
0,09
0,34
0,05
0,97
0,26
1,17
0,06
0,78
0,16
0,98
0,11
0,51
0,05
0,94
0,27
1,14
0,04
1,01
0,13
0,95
0,12
0,35
0,05
0,96
0,26
1,13
0,04
0,77
0,13
0,94
0,12
II. Immunisierungsversuch
Tab. 21:
0,60
0,04
1,11
0,09
0,55
0,06
0,97
0,13
0,51
0,05
0,94
0,11
0,49
0,05
0,93
0,11
0,54
0,06
1,11
0,08
0,51
0,10
1,09
0,07
Indices für verschiedene Serumantikörpertiter.
∅: arithmetischer Mittelwert der Gruppe, SD: Standardabweichung.
208
Anhang
9.7 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
A
Adenin
Abb.
Abbildung
A. bidest
zweifach destilliertes Wasser (lat.: aqua bidestillata)
AP
Alkalische Phosphatase
APS
Ammoniumpersulfat
BCIP
5-Brom-4-Chloro-3-Indolylphosphat
BLASTN/P
basic local alignment search tool nucleotide/protein
bp
Basenpaare
bzw.
beziehungsweise
C
Cytosin
Ct
Cycle threshold
°C
Grad Celsius
ca.
circa
cDNA
komplementäre DNA (engl.: complementary DNA, copy DNA)
cm
Zentimeter
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DNA
Desoxyribonukleinsäure (engl.: deoxyribonucleic asid)
DNTP
Desoxynucleosidtriphosphat
dpi
Tage nach der Infektion (engl.: days post infectionem)
DTT
Dithiothreitol
E
Effizienz
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
Enzym gekoppelter Immunabsorptionsassay (engl.: enzyme-linked
immunosorbent assay)
ER
Endoplasmatisches Retikulum
ES
exkretorisch-sekretorisch
et al.
lat.: et alii
FPLC
Fast Pressure Liquid Chromatography
g
Gravitationskonstante
Anhang
209
g
Gramm
G
Guanin
GIT
Guanidin-Isothiocanat
GST
Glutathion-S-Transferase
HRP
Meerrettich-Peroxidase (engl.: horseradish peroxidase)
i. A.
im Allgemeinen
i. m.
intramuskulär
i. v.
intravenös
IgA
Immunglobulin A
IgG
Immunglobulin G
IgM
Immunglobulin M
IPTG
Isopropylthiogalactosid
kDa
Kilodalton
kg
Kilogramm
l
Liter
LB
Luria-Bertani
L3
dritte Larven
M
molar (Mol/Liter)
mA
Milliampere
mg
Milligramm
µg
Mikrogramm
min
Minute
ml
Milliliter
µl
Mikroliter
mm
Millimeter
mM
millimolar
µM
mikromolar
MW
Mittelwert
mRNA
Boten-RNA (engl.: messenger RNA)
NaCl
Natriumchlorid
NCBI
National Centre for Biotechnology Information
210
Anhang
NBT
Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
nm
Nanometer
OD
optische Dichte
OPD
ortho-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
ORF
Offener Leserahmen (engl.: open reading frame)
PCR
Polymerase Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction)
p.d.
pro Tag (engl.: per day)
PDI
Protein Disulfid Isomerase
pH
negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionen-Konzentration
RACE
Rapid Amplification of cDNA Ends
RNA
Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid)
ROX
5-Carboxy-X-Rhodamin
rpm
Umdrehung pro Minute (engl. rounds per minute)
rRNA
ribosomale RNA
RT
Reverse Transkriptase
s.c.
subcutan
SD
Standardabweichung
SDS
Natriumdodecylsulfat (engl.: sodiumdodecylsulfate)
sec.
Sekunde
T
Thymin
Tab.
Tabelle
TAE
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
Taq
Thermus aquaticus
TBS
Tris-gepufferte Natriumchlorid-Lösung (engl.: tris-buffered saline)
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylendiamin
Tm
Schmelztemperatur
U
Enzymeinheiten (engl.: unit)
UV
ultraviolett
V
Volt
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
Gewicht pro Volumen (engl.: weight per volumen)
Anhang
211
9.8 Symbole der Aminosäuren
a
Alanin
b
Asparagin oder Asparaginsäure
c
Cystein
d
Asparaginsäure
e
Glutaminsäure
f
Phenylalanin
g
Glycin
h
Histidin
i
Isoleucin
k
Lysin
l
Leucin
m
Methionin
n
Asparagin
p
Prolin
q
Glutamin
r
Arginin
s
Serin
t
Threonin
v
Valin
w
Tryptophan
y
Tyrosin
z
Glutamin oder Glutaminsäure
212
Anhang
9.9 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Abb. 2:
Abb. 3:
Abb. 4:
Abb. 5:
Abb. 6:
Abb. 7:
Abb. 8:
Abb. 9:
Abb. 10:
Abb. 11:
Abb. 12:
Abb. 13:
Abb. 14:
Abb. 15:
Abb. 16:
Abb. 17:
Abb. 18:
Abb. 19:
Abb. 20:
Abb. 21:
Abb. 22:
Abb. 23:
Abb. 24:
Abb. 25:
Abb. 26:
Abb. 27:
Abb. 28:
Abb. 29:
Abb. 30:
Abb. 31:
Abb. 32:
Abb. 33:
Schematische Darstellung der PDI-Familie ............................................ 39
Konstruktion degenerierter Primer. ......................................................... 68
Schema der RACE-PCR......................................................................... 70
Konstruktion der Full length-Primer ........................................................ 73
Schematische Darstellung des Versuchsablauf...................................... 93
Prinzip der QRT-PCR mit TaqMan™-Sonden ...................................... 103
Mit degenerierten Primern erhaltenes Amplifikat. ................................. 109
Vergleich positiver Klone mittels RsaI-Verdau. ..................................... 110
PCR-Produkte der RACE-PCR............................................................. 111
Alignment der Aminosäurensequenz der PDI2 von
D. viviparus mit PDIs anderer Spezies ................................................. 112
Alignment der Aminosäuresequenz der PDI1 von
D. viviparus mit PDIs anderer Spezies. ................................................ 114
Phylogenetischer Stammbaum ............................................................. 115
Domänenstruktur der PDI1 und PDI2 von D. viviparus. ........................ 116
PCR zur Ermittlung der genomischen Sequenz.................................... 117
Exon-Intron-Organisation der PDI2 von D. viviparus. ........................... 117
Vollständige genomische DNA-Sequenz der PDI2 von D. viviparus..... 118
Darstellung des aufgereinigten Fusionsproteins. .................................. 120
Optimierung der Expression. ................................................................ 121
Western-Blot zum Vergleich der Aufreinigung nach unterschiedlichen
Lysebedingungen. ................................................................................ 122
Coomassie-gefärbtes SDS-Gel der fünf Peak Fraktionen eines
FPLC-Laufes......................................................................................... 123
Messung des II. Proteinpools................................................................ 126
Veränderung der Atemfrequenzen während des Versuchsverlaufs...... 130
Gruppenmittel der prozentualen Gewichtszunahme. ............................ 131
Larvenausscheidung im I. und II. Immunisierungsversuch. .................. 136
Larvenausscheidung im I. und II. Immunisierungsversuch. .................. 137
Darstellung der mittleren Wurmlängen ................................................. 141
Gruppenmittelwerte der Indices für verschiedene Serumantikörpertiter 144
Überprüfung der Serokonversion im Western-Blot ............................... 146
Ratioberechnung nach PFAFFL ........................................................... 148
Anwendung der Formel nach PFAFFL. ................................................ 149
Grafische Darstellung der Ratios für 120 Würmer ................................ 149
cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäurensequenz der PDI1. ........ 200
cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäurensequenz der PDI2. ........ 202
Anhang
213
9.10 Tabellenverzeichnis
Tab. 1:
Tab. 2:
Tab. 3:
Tab. 4:
Tab. 5:
Tab. 6:
Tab. 7:
Tab. 8:
Tab. 9:
Tab. 10:
Tab. 11:
Tab. 12:
Tab. 13:
Tab. 14:
Tab. 15:
Tab. 16:
Tab. 17:
Tab. 18:
Tab. 19:
Tab. 20:
Tab. 21:
RACE Primer .......................................................................................... 69
Sequenzen der Primer zur Amplifikation der genomischen DNA............ 71
Gruppeneinteilung der Immunisierungsversuche.................................... 94
Zusammensetzung der Impfdosen ......................................................... 96
In der QRT-PCR verwendete Primer und Sonden ................................ 104
Identitäten der PDI2 von D. viviparus mit PDIs anderer Spezies .......... 113
Identitäten der PDI1 von D. viviparus mit PDIs anderer Soezies .......... 114
Vergleich der Exon- u. Introngrößen von A. caninum und D. viviparus. 119
Agilent-Messungen des I. Proteinpools. ............................................... 124
Agilent-Messungen des II. Proteinpools. .............................................. 125
Befunde der täglichen Untersuchung ab Tag 70................................... 129
Auftreten lokaler Impfreaktionen ........................................................... 133
Behandlung erkrankter Tiere ................................................................ 134
Pathologisch-anatomische Befunde des I. Immunisierungs-versuchs .. 138
Pathologisch-anatomische Befunde des II. Immunisierungs-versuchs . 139
Anzahl adulter Lungenwürmer und Larvenausscheidung. .................... 140
Cts des Kalibrators in verschiedenen PCR-Läufen............................... 148
Eosinophile Granulozyten..................................................................... 203
Larvenausscheidung im I. u. II. Immunisierungsversuch. ..................... 204
Länge und Breite der adulten Würmer.................................................. 205
Indices für verschiedene Serumantikörpertiter...................................... 207
Erklärung nach § 3 Abs. 2 Nr. 7, Promotionsordnung vom
28.08.2000
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel
„Charakterisierung und in vitro Expression einer Protein Disulfid Isomerase
(PDI) zur Immunisierung gegen Dictyocaulus viviparus“
selbstständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Es wurden Materialien und Geräte des Instituts für Parasitologie sowie des Instituts
für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in Anspruch genommen. Die
Bestimmung von Differentialblutbildern erfolgte durch die Klinik für kleine Klauentiere
und forensische Medizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsstellen
(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgender Institution angefertigt:
Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Sonja Wolken
DANKSAGUNG
Herrn Prof. Dr. Thomas Schnieder danke ich für die Überlassung des interessanten
und abwechslungsreichen Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die
freundliche Beratung während der Anfertigung dieser Dissertation. Weiterhin möchte
ich mich dafür bedanken, dass mir die Teilnahme an verschiedenen Kongressen
ermöglicht wurde. Dies war eine sehr große fachliche und persönliche Bereicherung
für mich.
Herrn Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna sei vielmals für alle fachlichen
Diskussionen und Hilfestellungen gedankt.
I thank Mr. Ph.D. M.Sc.William Blackhall for showing me all his little tricks when
dealing with DNA.
Frau Ph.D. Christina Strube danke ich für viele persönliche und fachliche Gespräche.
Meinem Mitdoktoranden Christian von Holtum danke ich ganz herzlich für die
freundschaftliche und konstruktive Zusammenarbeit. Danke CvH!
Allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern, Doktoranden und Praktikanten, die beim
„Picken“ der Lungenwürmer geholfen haben und mir ansonsten mit Rat und Tat zur
Seite standen, sei ganz herzlich gedankt. Ohne die vielen fleißigen Hände wäre
diese Arbeit nicht möglich gewesen. Ulla Küttler sei hierbei vielmals für die
Unterstützung beim Larvenzählen gedankt.
Ganz besonderer Dank geht an Sandra Buschbaum, die mit ihrem guten Geist alles
zusammenhält, Ricarda Hüsken, Claudia Welz und Nina Fischer. Eure Freundschaft
und euer Vertrauen haben meine Doktorandenzeit zu etwas ganz Besonderem
gemacht.
Den Tierpflegern Norbert Schulze, Adam Rosalski, Ivonne Strickrodt, Sandra
Horchler und Eileen Winkler danke ich für die gute Zusammenarbeit im Stall und
diverse lebensrettende Sofortmassnahmen in Form von Kaffee und Tee. Norbert und
Adam sei besonders für ihre Hilfe bei der Sektion gedankt.
Den Laboranten der Klinik für kleine Klauentiere danke ich für die Erstellung der
Differentialblutbilder.
Frau Ph.D. Ilse Jacobsen danke ich ganz besonders für ihre Freundschaft und die
fachlichen Diskussionen in diversen Lokalitäten.
Meiner Familie gilt besonderer Dank für die Unterstützung während meines Studiums
und der Anfertigung dieser Dissertation.
Der größte Dank geht an meinen Partner und Seelengefährten Jörg Giere. Danke
Jörg, für die viele Hilfe und all das, was nicht in Worte zu fassen ist.