“Recent trends and novel concepts in cofactor

11.02.2015
“Recent trends and novel concepts in cofactor-dependent
biotransformations”
S. Kara, J.H. Schrittwieser, F. Hollmann, M.B. Ansorge-Schumacher
Applied Mikrobiology Biotechnology, 2014, 1517-1529
Ausarbeitung zum Seminar II, Vortrag am 11.02.2015,
betreut durch Prof. Dr. Gert-Wieland Kohring
Nadja Kleisch, Matrikelnummer 2549748, 3tes Semester,
Masterstudiengang Biotechnologie, Universität des Saarlandes
1. Einleitung
Biokatalysatoren sind Biomoleküle, die biochemische Reaktionen beschleunigen, indem sie die
Aktivierungsenergie der Reaktionen herabsetzen. Sie gehen selbst unverändert aus den Reaktionen
hervor und können somit viele Reaktionszyklen hintereinander katalysieren. Oft handelt es sich bei
Biokatalysatoren um Enzyme. Biokatalysatoren werden unteranderem in der organischen Synthese
verwendet, da man unter sehr milden Reaktionsbedingungen Produkte mit hoher Reinheit herstellen
kann. Ein weiterer Vorteil von Enzymen ist, dass sie enantioselektiv, stereoselektiv und regioselektiv
sind [2].
Biokatalysatoren lassen sich unterscheiden in cofaktorunabhängige Biokatalysatoren wie Hydrolasen,
die eine Reaktion aufgrund einfacher Säure-Base Katalyse beschleunigen können und
Cofaktorabhängige.
Da
die
Seitenketten
von
Aminosäuren
nicht
dazu
geeignet
sind
Elektronenaustauschreaktionen zu katalysieren benötigen viele Enzyme Cofaktoren [8].
Cofaktor ist ein Überbegriff für verschiedene Moleküle und Molekülgruppen, die für die Funktion von
bestimmten Enzymen unerlässlich sind [8]. Sie katalysieren insbesondere eine Vielzahl von
Redoxreaktionen. Hierzu gehören alle Reaktionen die der Energiegewinnung dienen. Eine
Redoxreaktion ist eine chemische Reaktion, bei der ein Reaktionspartner Elektronen auf den anderen
überträgt. Hierbei finden eine Elektronenabgabe (Oxidation) durch einen Stoff sowie eine
Elektronenaufnahme (Reduktion) statt [12].
Die nachstehende Tabelle 1 zeigt eine Reihe von Cofaktoren sowie deren Funktionen.
Tabelle 1: Cofaktoren und ihre Funktion
[7]
Beispiele von Cofaktoren sind ATP und NADH. ATP kann durch Abspaltung eines Phosphats Energie
liefern und Phosphat auf ein Substrat übertragen. ADP nimmt im Gegensatz dazu Phosphat vom
Substrat entgegen. NAD, NADP und FAD sind Elektronen- und Protonenakzeptor also
Oxidationsmittel. NADH, NADPH und FADH2 sind Elektronen- und Protonendonator und somit
Reduktionsmittel. Flavin ist besonders, es ist sowohl oxidier- als auch reduzierbar [7].
Die Reaktionsgleichung (Abbildung 1) zeigt ein Beispiel für ein cofaktorabhängiges Enzym. Dazu
gehört unter anderem die NAD-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (ADH).
Abbildung 1: Reaktionsgleichung der Alkohol-Dehydrogenase [13]
Dieses Enzym kann ein Keton in ein Alkohol umwandeln und umgekehrt. Dazu werden zwei Protonen
aus dem Substrat entfernt und auf ein NAD+ transferiert, welches zum NADH reduziert wird [2] [13].
Ein
großer
Nachteil
von
cofaktorabhängigen
Biokatalysatoren
ist,
dass
Cofaktoren
in
stöchiometrische Mengen benötigt werden. Da diese aber sehr teuer sind ist es notwendig geeignete
Regenerationsverfahren einzusetzen.
Verfahren zur Cofaktor-Regeneration werden häufig eingeteilt in gekoppelte Substratprozesse,
gekoppelte Enzymprozesse, Ganzzellsysteme und elektrochemische Methoden. Die Abbildung 2 zeigt
ein Beispiel für den gekoppelten Substratprozess.
Abbildung 2: gekoppelter Substratprozess [6]
Hier wird ein prochirales Keton durch eine ADH reduziert unter Ausbildung eines chiralen Alkohols als
Produkt. Die Regeneration von NAD+ erfolgt mit demselben Enzym durch Oxidation von Isopropanol
zu Aceton. Bei diesem Cosubstrat handelt es sich um einen kostengünstigen Alkohol. In der Praxis ist
das meist Ethanol oder Iso-Propanol. Damit das thermodynamische Gleichgewicht der Reaktion zur
Produktseite geschoben wird, wird das Cosubstrat in großem Überschuss eingesetzt. Dabei ist zu
beachten, dass sowohl die hohe Konzentration des Cosubstrates als auch das entstehende
Coprodukt, zum Beispiel Aceton, einen schädigenden Einfluss auf das Enzym haben oder die Reaktion
inhibieren kann. Auch ist das Coprodukt oft Abfall und wird nach der Synthese verworfen [6].
Die folgende Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für den gekoppelten Enzymprozess, hierbei werden zwei
unterschiedliche Enzyme verwendet.
Abbildung 3: gekoppelter Enzymprozess [6]
Die Phenylalanin-Dehydrogenase katalysiert die reduktive Aminierung von Phenylpyruvat zu
Phenylalanin. Die NAD+ Regeneration erfolgt separat mit der Formiat-Dehydrogenase. Es entsteht
CO2 aus Formiat. Das Kohlendioxid wird aus der Lösung ausgast oder zu Kohlensäure abreagiert.
Durch diese Entfernung des Coproduktes wird das thermodynamische Gleichgewicht zur
Produktseite verschoben, wodurch hohe Umsätze erzielt werden [6].
Ein Beispiel für Ganzzellsysteme sind immobilisierte Alcaligenes eutrophus Zellen. Sie katalysieren die
Reduktion von oxidiertem NAD+ mit molekularem Wasserstoff [7]. Der Einsatz von Mediatoren wie
z.B. Methylviologen ist ein Beispiel für die Verwendung von der elektrochemischen Methode. Das ist
eine synthetische Verbindung die als Elektronenakzeptor fungiert und O2 im Photosystems I bei der
Photosynthese reduziert [7].
Durch intensive Forschung konnten in den letzten Jahren einige Regenerationsverfahren etabliert
werden.
Trotzdem
geht
die
Suche
nach
günstigeren
und
umweltfreundlicheren
Regenerationssystemen weiter. Der Artikel fasst die neuesten Entwicklungen in diesem Bereich
zusammen. Im Fokus stehen besondere Cosubstrate, Ganzzellsysteme, Kaskadensysteme sowie nicht
natürliche Cofaktoren.
2. Ergebnisse
2.1 Besondere Cosubstrate
2.1.1 Chloraceton
Klassisch wird in ADH katalysierten Oxidationen, NADP+ durch die Reduktion eines Cosubstrates
regeneriert. Cosubstrate wie zum Beispiel Aceton wird dazu im Überschuss eingesetzt.
Eine wesentlich effizientere Methode ist das Nutzen von thermodynamisch stabilisierten Varianten
des Coprodukts. Ein Beispiel ist die Verwendung von Chloraceton, 1,1- und 1,3-dichloroacetone oder
1,1,1-trichloroacetone anstatt von Aceton. Durch Verwendung der aktivierten Ketone muss viel
weniger Substrat eingesetzt werden, was wesentlich weniger Abfall bedeutet.
Ausprobiert wurde es bei der Biotransformation mittels lyophilisiertem Escherichia coli (E. coli) der
ADH überexprimiert (Abbildung 4).
Abbildung 4: Biotransformation mittels ADH exprimierenden lyophilisiertem Escherichia coli und dem Cosubstrat
Chloracetat [7]
Es konnten bis zu 90% des Substrats umgesetzt werden, was einer gewonnen Konzentration von 30
g/l entspricht. Dabei wurde von Chloracetat nur das 1,5fache als Cosubstrat eingesetzt.
2.1.2
1,4-Butandiol
Die in situ Regeneration von reduzierten Nicotinamid-Cofaktoren, wie sie z.B. von der ADH
verwendet werden, benötigt eine große Menge an Elektronen Donoren, wie Ethanol oder
Isopropanol.
Kürzlich wurde ein neues Substrat zur NADPH Regeneration entdeckt. Es wurde gezeigt, dass sich 1,4
Butandiol als Cosubstrat für NADH-abhängige Biotransformation eignet, siehe Abbildung 5.
Abbildung 5: Butandiol als Cosubstrat für NADH-abhängige Biotransformation zusammen mit Enzymen wie ADH/Enoat
Reduktase oder Monoaysgenase zu der Reduktion von C=C oder C=O Doppelbindung [7]
Es kann zum Beispiel zusammen mit Enzymen wie der Alkohol-Dehydrogenase, Enoat Reduktase oder
Monoaysgenase zu der Reduktion von C=C oder C=O Doppelbindung eingesetzt werden.
Während der Reaktion wird das Cosubstrat 1,4 Butandiol mithilfe der ADH zu γ-Butyrolactone
umgewandelt, dabei entstehen 2 NADH, was zur Reduktion von C=C oder C=O Doppelbindung
eingesetzt werden kann. γ-Butyrolactone ist thermodynamisch stabil und eine Rückreaktion ist somit
fast nicht möglich. Dadurch ist der Bedarf an Cosubstrat extrem gering, es kann viel NADH zur
Verfügung gestellt werden und schnelle Reaktionszeiten sind möglich.
2.1 Biotransformation mittels Ganzzellsysteme
Eine andere Möglichkeit um Kosten für Cofaktoren zu sparen, ist der Einsatz von Ganzzellsystemen.
Die Cofaktorregeneration findet dabei innerhalb der Zelle statt. Des Weiteren muss das Enzym nicht
extern produziert und aufgereinigt werden. Es ist außerdem geschützt gegen externe Stressfaktoren,
wie Scherkräfte oder organische Lösungsmittel.
Ein Nachteil der Ganzzellsysteme ist, dass sie nicht dieselbe spezifische Aktivität und Selektivität
erreichen wie isolierte Enzyme, da die Zellen eine ganze Reihe von Nebenprodukten produzieren.
Aber diese Probleme lassen sich durch Metabolic Engineering ausmerzen.
Eine Möglichkeit um eine effiziente Biotransformation mit hohen Substratkonzentrationen
durchzuführen, ist der Einsatz von Designer Zellen. Designer Zellen werden so angepasst, dass sie alle
nötigen Enzyme für die Biotransformation exprimieren. Unnötige Stoffwechselwege z.B. zur
Produktion von Nebenprodukte werden ausgeschalten.
Da Enzyme in organischen Systemen eher schlecht löslich sind und zur Denaturierung neigen, ist
meistens der Einsatz von Lösungsmitteln notwendig. Die folgende Methode mithilfe von
Ganzzellsystemen, die in Abbildung 6 dargestellt ist, ermöglicht die Reduktion von Acetophenon in
einem lösungsmittelfreien System.
Abbildung 6: Reduktion von Acetophenon in einem Lösungsmittelfreien System mithilfe von einem Ganzzellsystem [7]
Dazu wird ein E. coli-Stamm verwendet der die Carbonyl-Reduktase aus Candida parapsilasis über
exprimiert. Sie reduziert Acetophenon zu 1-Phenylethanol.
Die Cofaktor-Regeneration findet über die Oxidation von Isopropanol statt. Die Besonderheit hierbei
ist, dass das Medium nur aus Acetophenon und Isopropanol im Verhältnis 30:70 v/v besteht.
2.1 Kaskaden-Reaktionssysteme
Der Nachteil an den Regenerationsmethoden ist, dass sowohl bei der Enzym-gekoppelten Reaktion
als auch bei der Substrat-gekoppelten Reaktion eine stöchiometrische Menge Cosubstrat zugesetzt
werden muss. Oft hat die Produktion des Coprodukts keinen wirklichen Nutzen und wird als Abfall
entsorgt. Kaskaden-Reaktionssysteme können dieses Problem lösen.
Indem entweder „wertvolle“ Coprodukten hergestellt werden (Paralleles Kaskadensystem). Oder
zwei Enzymen mit unterschiedlichem Cofaktorverbrauch, kombiniert werden, deren Einsatz aus
synthetischer Sicht sinnvoll ist, sodass kein unnützes Nebenprodukt entsteht.
Ein Beispiel für solch ein System ist die Transformation von razemischem Lactat in L-Alanin, über die
Produktion der Zwischenprodukts Pyruvat. Die folgende Abbildung 7 zeigt diese Transformation.
Abbildung 7: Transformation von razemischem Lactat in L-Alanin, über die Produktion der Zwischenprodukts Pyruvat [7]
Bei dieser Methode wird eine Kombination aus D und L Lactatdehydrogenasen verwendet um unter
NADH-Produktion Pyruvat zu erzeugen. In einem zweiten Schritt wird Pyruvat unter NADH-Verbrauch
von Alanin-Dehydrogenase in L-Alanin umgewandelt.
In diesem Enzym-System findet die NADH-Regeneration ohne die Produktion eines Coproduktes
statt. Dadurch entsteht weniger Müll und das Coprodukt muss nicht aufwendig abgetrennt werden.
Dieses Verfahren wurde in einem Membran-Reaktor für einen Monat getestet und es wurde eine
Raum-Zeitausbeute von 134 g/l pro Tag erzielt.
2.1 Nicht natürliche Cofaktoren
Neben verschiedensten Regenerationsmethoden, gibt es auch die Möglichkeit Cofaktor-Analoga
einzusetzen, deren Produktion wesentlich günstiger ist.
Cofaktoren spielen wichtige Rolle bei vielen Redoxreaktionen, sind aber teuer zu produzieren und
empfindlich gegenüber Hydrolyse. Die Verwendung von Analoga kann dieses Problem lösen.
Ein Beispiel sind NAD(P)H Analoga. Der reaktive Teil des NAD(P)Hs ist relativ kostengünstig zu
produzieren. Es gibt eine Reihe von synthetischen NAD(P)H-Analoga, unterschiedlicher Komplexität.
Allerdings haben sie das Problem, dass sie aufgrund der strukturellen Änderung keine Bindung mit
dem Enzym eingehen können. Daher sind viele Reaktionen nicht katalysierbar.
Sie finden trotzdem Anwendung bei der Reduktion von prothetischen Gruppen wie Flavin. Dafür ist
der synthetischer Cofaktor 1 a (Abbildung 8) ein Beispiel, dieser kann bis zu 40 mal schneller als das
normale NADH den Cofaktor FAD regenerieren.
Abbildung 8: Beispiel für ein synthetisches NAD(P)H-Analoga [7]
Ein zweites Beispiel sind Flavin-Analoga. Sie haben verschiedene Substituenten am Isoalloxazin-Ring.
Sie werden zur Oxidationen in der Organokatalyse verwendet und haben einen großen Einfluss auf
katalytische Aktivität der Enzyme.
Beispielsweise haben Massay und Coworkers geschafft die Desaturase Aktivität auf das „old yellow
enzyme“ aus der Hefe übertragen, indem sie den synthetischen Cofaktors 8-cyano-8-demethyl-FMN
(Abbildung 9) in Reaktion verwendet haben.
Abbildung 9: Beispiel für ein synthetisches Flavin-Analoga [7]
Die Desaturase- Aktivität ist die Fähigkeit Elektronen von einem Molekül auf ein anderes übertragen
zu können und dabei das Substrat zu entsättigen [3]. Eigentlich katalysiert das Old Yellow Enzym
Reaktionen wie die Umwandlung von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid oder die Umwandlung von
Nitrocyclohexen zu Nitrohexan Nitronat [9] [11]. Dabei werden Elektronen übertragen.
3. Zusammenfassung
Biokatalysatoren benötigen zum katalysieren von Redoxreaktionen Cofaktoren in stöchiometrischer
Menge. Die Produktion von Cofaktoren ist teuer, daher sind geeignete Regenerationsysteme
notwendig. Durch intensive Forschung konnten in den letzten Jahren einige Regenerationsverfahren
etabliert werden. Klassisch werden Cofaktoren über gekoppelte Substratprozesse (ein Enzym, ADH,
Coprodukt) oder gekoppelte Enzymprozesse (zweites Enzym z.B. Formiatdehydrogenase) regeneriert.
Trotzdem geht die Suche nach günstigeren und umweltfreundlicheren Regenerationssystemen
weiter. Der Artikel fasst die neuesten Entwicklungen in diesem Bereich zusammen.
Unteranderem ist die Verwendung von besonderen Cosubstraten wie Chloraceton oder 1,4 Butandiol
eine Alternative. Auch der Einsatz von Ganzzellsysteme, Kaskaden-Reaktionssysteme oder von nicht
natürlichen Cofaktoren kann sinnvoll sein um leistungsfähigere, günstigere und umweltfreundlichere
Regenerationssysteme zu etablieren.
4. Literatur
[1] U. Kragl, W. Kruse, W. Hummel, C. Wandrey;
“Enzyme engineering aspects of biocatalysis: Cofactor regeneration as example”
Biotechnology and Bioengineering, Vol. 52, 2, 309-319, 1996
[2] L. M. Berg, L. Stryer, J. L.Tymoczko,
„Stryper Biochemie“;
Spektrum Akademischer Verlag; Auflage: 6. Aufl. 2007, korr. Nachdruck 2010
[3] http://goo.gl/LJZTB7 (zuletzt überprüft am 10.02.15)
[4] http://goldbook.iupac.org/C01128.html (zuletzt überprüft am 10.02.15)
[5] Braun, Matthias, Olav Teichert, and Axel Zweck. 2006. “Biokatalyse in der industriellen Produktion.”
Zukünftige Technologien 57: 7–66.
[6] Hildebrand, Falk. 2009. “Prozessentwicklung Zur Enzymatischen Synthese Chiraler Alkohole Unter
Elektrochemischer Cofaktorregenerierung.” Dissertation.
[7] Kara, Selin, Joerg H. Schrittwieser, Frank Hollmann, and Marion B. Ansorge-Schumacher. 2014. “Recent
Trends and Novel Concepts in Cofactor-Dependent Biotransformations.” Applied Microbiology and
Biotechnology 98: 1517–29.
[8] “Kofaktoren Teil I.” Uni Marburg: 1–21.
[9] Meah, Y, and V Massey. 2000. “Old Yellow Enzyme: Stepwise Reduction of Nitro-Olefins and Catalysis of AciNitro Tautomerization.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97:
10733–38.
[10] Schroer, Kirsten, Von Der Fakultät Mathematik, and Informatik Naturwissenschaften. 2008.
“Ganzzellbiotransformationen Mit Rekombinanten Escherichia Coli Zur Synthese Chiraler Alkohole.”
Naturwissenschaften.
[11] Xu, D, R M Kohli, and V Massey. 1999. “The Role of Threonine 37 in Flavin Reactivity of the Old Yellow
Enzyme.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96(March): 3556–
61.
[12] http://de.wikipedia.org/wiki/Redoxreaktion
[13] http://www.bioc.uzh.ch/blexon/_media/a:alkoholdehydrogenase.png