Produktion und Charakterisierung des Tumor

Produktion des humanen,
krebsspezifischen Antikörpers H10
in CHO-Zellen
nicht nur, die Bildung von Metastasen
zu reduzieren, sondern auch komplexe
Tumore behandeln zu können.
Aufgabe
Figure 1:
MTX-based genomic amplification significantly
increases antibody yields in CHO cells.
Hintergrund
Zahlreiche rekombinant produzierte
Proteine werden in der modernen
Medizin zur Behandlung von Krankheiten wie Arthritis, Anämie, Hämophilie
und sogar Krebs eingesetzt. 70 % dieser Proteine werden allein in „Chinese
Hamster Ovary“ (CHO)-Zellen hergestellt, was auf eine Reihe von Vorteilen
dieses Expressionsorganismus zurückzuführen ist. CHO-Zellen sind nicht nur
in der Lage, Proteine in großen Mengen zu produzieren, sie bieten auch
eine hohe biologische Sicherheit. Beispielsweise können sich eine Vielzahl
humanpathogener Viren, wie HIV,
Influenza oder Polio, nicht in CHO Zellen replizieren. Zudem können CHOZellen rekombinante Proteine mit einer
humanähnlichen Glykoform herstellen,
die zum einen für seine Funktionalität
entscheidend ist und zum anderen eine
gute Verträglichkeit beim Patienten
ermöglicht.
Mehr als 25 % der auf dem Markt
befindlichen biopharmazeutischen Proteine sind Antikörper. Insbesondere im
Bereich der Krebstherapie finden sie
eine vielversprechende Anwendung.
Durch die Antikörperbindung an Krebszellen kann beispielsweise das körpereigene Immunsystem aktiviert werden,
um Tumorzellen zu zerstören. Ziel ist es
40
IME-Jahresbericht 2008
Ein Kandidat für die antikörpervermittelte Krebstherapie ist der tumor-spe­
zifische, humane Antikörper H10. Er
bindet an das „Carcinoembryonic Antigen“ (CEA), das auf der Oberfläche
von Krebszellen produziert wird und ist
damit in der Lage, spezifisch zwischen
einer gesunden und einer Krebszelle zu
unterscheiden. Um den CEA-spezifischen Antikörper H10 auf seine therapeutischen Eigenschaften zu testen,
wurde er in einer humanen Form in
CHO-Zellen produziert.
Projektbeschreibung
Für die Produktion des H10 wurde ein
polycisytronischer Vektor generiert, der
eine gekoppelte Expression der leichten
und der schweren Antikörperkette
ermöglicht. Entsprechende Signalsequenzen sorgen für die Sekretion des
H10 in das Kulturmedium, wodurch
der Antikörper im Überstand angereichert werden kann. Sein Fc-Teil wird
über den sekretorischen Weg mit einer
humanähnlichen Glykosilierung versehen, die für die Funktionalität von
Antikörpern entscheidend ist. Zusätzlich enthält der Vektor das Gen für die
Dehydrofolatreduktase (DHFR) als
Selektionsmarker. In Kombination mit
der DHFR-defizienten CHO-Zellline
DG44 und dem Einsatz von Methotrexat (MTX), einem kompetitiven Inhibitor von DHFR, ermöglicht dies die
schrittweise Selektion und Erhaltung
von Zelllinien, in denen das DHFR Gen
(und die Antikörpergene) koamplifiziert
wird. Durch diese Vorgehensweise
konnte die Akkumulation des H10-
Antikörpers im Kulturmedium um etwa
das 70-fache gesteigert werden (Fig.1).
Zur weiteren Produktionssteigerung
wurde nach hoch produzierenden Klonen gescreent und eine monoklonale
Zelllinie etabliert. Weiterhin wurden die
Kultivierungsbedingungen einschließlich diverser, proteinfreier, synthetischer
Produktionsmedien sowie verschiedene
Kultivierungsgefäße und Zusätze optimiert (Fig. 2).
Fazit
Es wurde eine monoklonale, hoch produzierende CHO-Zelllinie generiert, die
den CEA-spezifischen Antikörper H10
in das Kulturmedium sekretiert. Die
Verwendung eines proteinfreien, synthetischen Mediums ermöglicht einen
Produktionsprozess unter kontrollierten
und reproduzierbaren Bedingungen.
Erste Untersuchungen des in CHO-Zellen produzierten H10-Antikörpers
haben bereits gezeigt, dass er spezifisch an CEA-positive Krebszellen bindet (Fig. 3). Mit dieser Eigenschaft birgt
er ein großes Potenzial einen Beitrag
zur Krebstherapie zu leisten. Die CHOProduktionsplattform bietet dabei ein
pharmazeutisch relevantes Instrument
zur Herstellung großer Mengen an
Antikörpern, welche die medizinischen
Anforderungen an ein potenzielles
Medikament erfüllen.
Das Projekt wird gefördert von der
European Commision, FP6,
SAGE Project, Contract number:
LSHB-CT-2007–037241.