Fluoreszenzmikroskopie - Uni
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Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenz Emission eines Photons beim Übergang eines Elektrons von einem höheren in ein tieferes Energieniveau eines Moleküls nach Absorption von Licht kurzer Wellenlänge (innerhalb von wenigen Nanosekunden) Prinzipien der Fluoreszenz 1. Absorption von kurzwelligem Licht 2. Emission von Licht größerer Wellenlänge Differenz zwischen Wellenlängen: Stokes- Differenz 1. Absorption • • Erregung (Excitation) Elektronen der fluoreszierenden Moleküle absorbieren Photonen (durch Anregungslicht) und gelangen auf höheres Energieniveau Elektron erreicht höheres Orbital, befindet sich in „excited state“ 2. Emission • • • Ausstrahlung Elektronen können sich nicht lange auf Energieniveau halten Fallen auf ursprüngliches Energieniveau zurück Energie wird freigesetzt Æ Emission Fluoreszenzlicht Fluoreszenz Einzelne Stadien: S0, S1, S2 Æ unterschiedliche Spins Molekül in Singulettzustand Phosphoreszenz: Elektronen in metastabilem Energieniveau Æ gleiche Spins Molekül in Triplettzustand Verweildauer: Millisekunden bis Stunden • Energie wird nicht nur als Licht freigesetzt Æ Energieverlust • Emittiertes Licht energieärmer als Anregungslicht Energieärmer Lichtstrahlung besitzt größere Wellenlänge Andere Lichtfarbe als energiereiche Lichtstrahlung Emittiertes Licht besitzt 20-50nm größere Wellenlängen als Anregungslicht Stokes- Differenz Mit Filtern kann das helle Anregungslicht und das schwache Fluoreszenzlicht im Strahlengang des Mikroskops getrennt werden: Nur die fluoreszierenden Objekte werden noch betrachtet Fluoreszenzmikroskop • Licht aus Xenon- oder Quecksilberdampflampe • Anregungsfilter • Dichromischer Spiegel • Emissionsfilter Anregungsfilter • Filtert die für die Anregung des Fluorochroms geeignete Wellenlänge heraus Dichromatischer Spiegel • • Reflektiert Licht auf Präparat Besitzt kritische Wellenlänge: 1. Licht mit geringer Wellenlänge wird reflektiert Licht mit großer Wellenlänge wird durchgelassen 2. kurzwelliges Licht gelangt zum Präparat langwelliges Licht gelangt zum Auge starkes Beleuchtungslicht kann von Fluoreszenzlicht getrennt werden Emissionsfilter • Transmittiert das Fluoreszenzlicht Bleaching • • • • • • • • Genereller Begriff für alle Prozesse, die Abnahme von Fluoreszenzsignal fördern Möglichkeit zu fluoreszieren wird inaktiviert/heruntergesetzt Fluoreszenzsignal ist nicht so hell wie erwartet (erhofft) Übergang in den Triplett-Zustand Triplett-Zustand kann unter Phosphoreszenz verlassen werden Dies dauert lange, in der Zwischenzeit können Triplett-Triplett Übergänge erfolgen In dieser Zeit findet keine Licht-Emission statt Photochemische Reaktionen können zu Phototoxizität führen Vermeidung Bleaching: • • Nicht mehr Licht als absolut notwendig benutzen Fluoreszenzien bei Nichtgebrauch in Dunkelheit aufbewahren Fluoreszierende Moleküle • Aromatische Ringsysteme mit delokalisierten Elektronen in bindenden π Orbitalen Immunfluoresszenz GFP Zurzeit am gebräuchlichsten bei der Proteinmarkierung GFP G F reen P luorescent • Aequorea victoria – bereits 1962 isoliert – 1992 erste Klonierung – 1994 Einsatz als Reporter-Gen • wandelt das blaue Licht der Aequoporine (Chemolumineszenz) in grün fluoreszierendes Licht um (Biolumineszenz) rotein Struktur • 25-30kDa Polypeptid • Absorption: 396nm und 475nm (ΔE!) – Anregung durch blaues Licht • Emissionsmaximum bei 508nm • Eigentliches Fluorophor bildet Tripeptidsequenz Ser65-Tyr66-Gly67 Æeingekapselt in der sog. „β-Can“ (auch wichtig für Fluoreszenz) Im Gegensatz zu anderen natürlichen fluoreszierenden Proteinen benötigt GFP keine Cofaktoren, da das Chromophor obligater Bestandteil ist! Chromophor: Farbgebender, fluoreszierender Teil des Proteins mit anregbaren Elektronen Mechanismus der Chromophorbildung 1. Nucleophiler Angriff der Amidgruppe (R-C=O-NH-R) von Glycin (67) auf die Carbonylgruppe (RR-C=O) der AS an Position 65 ÆZyklisierung 2. Es folgt eine Kondensation (-H2O) 3. Deprotonierung unter aeroben Bedingungen. Mgl. Entsteht H2O2 was als starkes Zellgift wirkt Æzu hohe Expression von GFP tödlich 4. Oxidation zu einem Imidazolion (aromat. Organ. Verbindung mit zwei Stickstoffatomen) GFP mit Emission bei 510nm ► Direktes chemisches Markieren von Fusionsproteinen mit „small molecules“ o Eine „small-molecule“ Markierung besteht aus einem sehr kompakten Liganden, der an einen Rezeptor bindet o Ligand bindet spezifisch und fest an den Rezeptor o darf nicht die Funktion des Zielproteins stören o Targetprotein bindet an - Rezeptorprotein - Proteindomäne - Peptidsequenz ► Die meisten Ansätze verwenden eine spezifische, hochaffine nicht kovalente oder kovalente Interaktion, zwischen einem synthetischen Liganden und seinem korrespondierenden Rezeptor. Interaktionspaar aus biarsenischem Liganden und Tetracystein o Affinität zwischen einem kurzen Tetracysteinpeptid (CCXXCC) und FlaSH o Bei der Anwendung wird das zu untersuchende Zielprotein in Form dieses Tetracysteinmotivs exprimiert o EDT sorgt dafür, dass andere endogene Proteine mit eng gelagerten Cysteinpaaren verdrängt werden und folglich unspezifische Bindungen verhindert werden Deconvolution Konfokales Fluoreszenzmikroskop Konventionelles Fluoreszenzmikroskop konfokales Fluoreszenzmikroskop Laser-Scanning Mikroskop Konfokales Fluoreszenzmikroskop Medulla konventionelles konfokales Fluoreszenzmikroskop Muskel Getreidekorn Prinzip der Zwei-Photonen Mikroskopie - Erregung der Moleküle mit 2 Photonen halber Energie - Summierung der Energie der Photonen nur bei gleichzeitiger Absorption (innerhalb von 10^-15s) Ædiese ist nur bei hohen Intensitäten gegeben (Titan-Saphir-Laser) - Aufnahme der Photonen durch das Molekül - Abgabe eines Photons mit doppelter Energie (Laserstrahl muss dafür gepulst werden) Vergleich CLSM & TPLSM - Anregungslicht wird von einem Laser erzeugt - fokussierter Laserstrahl scannt in der Brennebene - bei TPLSM Anregung der Fluorochrome nur im Brennpunkt - keine Fluoreszenz außerhalb des Brennpunktes Æ keine konfokalen Blenden, die nur Licht aus Brennebenen durchlassen Maus-Niere TIRF total internal reflection fluorescence microscopy Measure Measure the the •• topography topography of of cell-substrate cell-substrate contacts contacts •• Membrane Membrane proximal proximal ion ion fluxes fluxes •• Endocytosis Endocytosis and and Exocytosis Exocytosis •• Membrane-associated Membrane-associated photosensitizers photosensitizers Evanescent field • • • penetration depths between 70 to 300 nm → fluorophores located within or close to the plasma membrane are detected selectively variations in the angle of incidence changes the penetration depth decreased fluorophore bleeching Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones D. ZENISEK, J. A. STEYER & W. ALMERS, Nature 406, 849 - 854 (24 August 2000) Protein-Protein Wechselwirkungen: FRET (Förster/Fluorescence resonance energy transfer ) • Angeregtes Donor-Fluorophor • Dipol-Dipol Wechselwirkung mit Akzeptor-Fluorophor • Energieübertragung ohne Photonenemission (strahlungslos) des Donors Calciummessung durch FRET zwischen CFP und YFP: Nach Ca-Bindung wird Energy vom CFP aufs YFP übertragen und man erhält grüne Fluoreszenz Stathmin reduziert die Konzentration freier Tubulin-Dimere Fluoreszenz FRET-Analyse
