Reaktionen der Aminogruppe
Werbung
Teil 2 Reaktivität von Aminosäuren, Nachweismethoden Reaktionen der Carboxygruppe AS sind einer säurekatalysierten Veresterung leicht zugänglich; mit EtOH und HCl führt sie zu den Ethylesterchloriden Die freien Ester sind aus den Salzen durch Einwirkung von Basen erhältlich und im Vakuum unzersetzt destillierbar. Auf der fraktionierten Destillation beruht die erste Methode zur Trennung von AS (Emil Fischer) Bildung zyklischer Dipeptide Freie AS-Ester neigen zur Bildung von zyklischen Dipeptiden bzw. offenkettigen Polypeptide Reaktionen der Aminogruppe -AcylierungAls Acylierungsmittel kommen aktivierte Säurederivate in Frage, z.B. Säurehalogenide oder Säureanhydride. N-Acetylaminosäuren als Bestandteile chemisch definierter Diäten zur Supplementierung von pflanzlichen Proteinen zur Erhöhung der biologischen Wertigkeit Zusatz freier AS zu LM die erhitzt werden nicht unproblematisch Methionin + reduzierende Zucker über Streckerreaktion Methional (Fehlaroma) Lysin und Threonin Verlust biologischer Wertigkeit Asparagin : Precursor für Acrylamidbildung Reaktionen der Aminogruppe -Acylierung Analytisch von großer Bedeutung ist die Acylierung (Dansylierung) mit 5-Dimethylamino-naphthalensulfonsäurechlorid (Dansylchlorid) Stabil gegen Säurehydrolyse Ermittlung von N-terminalen AS und von freien ε-Aminogruppen in Peptiden und Proteine Auch Dimethylaminoazobenzsulfonchlorid (DABS-Cl) und 9Fluorenmethylchlorformiat (FMOC) führen zu empfindlich nachweisbaren ASDerivaten, die für säulenchromatographische Trennung und Bestimmung geeignet sind Vorkommen von Trimethylaminosäuren (Betaine) (CH3)3N+-CHR-COO− β-Alanin γ-Amino-buttersäure Glycin Histidin β-Hydroxy- γ-aminobuttersäure 4-Hydroxyprolin Prolin Homobetain Actinin Betain Herzynin Fleischextrakt Muscheln Zuckerrübe Champignons Carnitin Muskelfleisch, Hefe, Weizenkeime, Fisch, Leber, Molke, Muscheln Jackbohne Orangenblätter, Alfalfa, Luzerne Betonicin Stachydrin Reaktionen der Aminogruppe -Alkylierung & Arylierung2,4-Dinitrophenylderivate (DNP-AS) werden durch Arylierung der Aminofunktion mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB) erzeugt (Sanger-Reagenz) DNP-AS sind gelbe, gut kristallisierbare säurestabile Verbindungen Die Reaktion ist wichtig für die Markierung von N-terminalen ASResten und freien -AS-Seitenketten in Peptiden und Proteinen NO2 O2N F + OH H2N R NO2 O2N N R H + F + H2 O Reaktionen der Aminogruppe -Alkylierung & ArylierungEbenfalls analytisch von Bedeutung ist die Reaktion mit Trinitrobenzolsulfonsäure, die zu gelben Derivaten führt photometrische Bestimmung von AS und Proteinen NO2 O2 N SO3 NO2 + H2N R pH 9.5 O2 N 25°C NO2 N R H NO2 Reaktionen der Aminogruppe -Alkylierung & Arylierung- Der Meisenheimer Komplex ist ein Additionsprodukt Zwischenprodukt bei nucleophilen aromatischen Substitutionen unter milden Bedingungen: am Benzolring auftretende negative Ladung wird durch elektronenanziehende Substituenten stabilisiert Nachweis des Komplexes Isolierung des Additionsproduktes bei der Reaktion von 2,4,6-Trinitroanisol mit Kaliumethylat Reaktionen der Aminogruppe -Alkylierung & ArylierungAnalog verläuft die Reaktion mit 1,2-Naphtochinon-4sulfonsäure (Folin-Reagenz), bei der ein roter Farbstoff entsteht Es handelt sich um eine nukleophile aromatische Substitution, die über ein Additionsprodukt (MeisenheimerKomplex) verläuft Reaktionen der Aminogruppe -Thiocarbamoylierung AS reagieren mit Isocyanaten zu Carbamoylderivaten diese zyklisieren beim Erhitzen im Sauren zu 2,4-Dioxoimidazolidinen (Hydantoinen) Durch Reaktion von Aminogruppen mit Phenylisothiocyanat ist ein stufenweiser Abbau von Peptiden (Edman-Abbau) möglich für Sequenzanalyse von großer Bedeutung Reaktion mit Phenylisothiocyanat (Edmanabbau) Anilinothiazolinon Phenylthiocarbamoylaminosäure Reaktionen der Aminogruppe -Edman-AbbauBeim Edman-Abbau addiert sich die endständige Aminogruppe an das Reagenz, wobei ein Thioharnstoffderivat entsteht. Beim Behandeln mit einer schwachen Säure unter Bedingungen, unter denen die Peptidbindungen nicht hydrolysiert werden, spaltet das Molekül die markierte Aminosäure als Phenylthiohydantoin ab, der Rest des Polypeptids bleibt unverändert : Automatisierter Edmanabbau meist automatisiert an Proteinen oder Peptiden vollzogen, die über die C-terminale Carboxylgruppe an einen Aminogruppen-haltigen Träger gebunden N-Terminus C-Terminus sind PITC H2N-a1-a2-a3- - -an-COOH Polypeptid Kupplung Identifizierung durch HPLC oder TLC PITC -HN-a1-a2-a3- - -an-COOH PTC-Peptid Spaltung Umwandlung PHT-AS H PITC a1 Thiazolinon H2N-a2-a3- - -an-COOH Wdh. Reaktionen mit Carbonylverbindungen Strecker-Abbau Reaktion mit Dicarbonyl-Verbindungen aus Maillard-Reaktion (siehe Kohlenhydrate) Aus Dicarbonyl-Verbindungen entstehen zahlreiche Folgeprodukte, z.B. Alkyl- u. Methoxypyrazine als Aromastoffe und braune Melanoidine Reaktionen mit Carbonylverbindungen -Ninhydrinreaktion- Ein Spezialfall des Strecker-Abbaus ist die Ninhydrinreaktion, die für quantitative photometrische Bestimmung (Ruhmanns Violett) von AS von großer Bedeutung ist. Die Nachweisgrenze liegt bei ~ 500 pmol. Formolzahl nach Sörensen Bestimmung freier AS durch Titration mit 0,1 N NaOH bei pH 8,1, wobei die Basizität der Aminogruppe durch Formaldehyd zurückgedrängt wird Erfasst werden: Aminogruppen, NH3, prim. Amine (vollständig), sek. Aminogruppen und phenolische Hydroxygruppen (teilweise). Nicht erfasst werden: tert. Amine, Thiol-Gruppen und aliphatische Hydroxygruppen. Kennzahl zur Charakterisierung mancher Fruchtsäfte Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd (OPA) HPLC-Trennung der Isoindolderivate und Fluoreszenzdetektion: ex= 330 nm; em= 455 nm Nachweisgrenze: 1 pmol Aminosäure-Analytik Klassisch werden AS mittels Ionenaustauschchromatographie getrennt und durch Farbreaktion (Ninhydrin oder Phthalaldehyd) nachgewiesen. Zunehmend findet heute die HPLC Anwendung, wobei die AS zuvor mit OPA in Gegenwart einer Thiolverbindung zu fluoreszieren den Derivaten umgesetzt werden. Beide Methoden erlauben keine Differenzierung zwischen D- und L-AS, die jedoch nach geeigneter Derivatisierung mit GC oder HPLC möglich ist Ninhydrin-Reaktion Formolzahl nach Sörensen Gasvolumetrisch nach Sylke Umsetzung mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol zu N-2,4-Dinitrophenyl-AS Derivatisierung mit O-Phthalaldehyd Entstehung von Hydrazinen beim Abbau von Proteinen nach Akabori Bildung von Dansylderivaten Reaktion mit Folin-Reagenz Reaktion mit Trinitrobenzosulfonsäure Peptid/Protein-Analytik Hydrolyse (0,1n – 1n HCl) Enzymatische Hydrolyse Edman-Abbau Arylierung mit Sanger-Reagenz Western-Blot Biologische Wertigkeit Biologische Wertigkeit limitiert durch: Lysin: Defizit in Getreide- und anderen Pflanzenproteine Methionin: Defizit in Kuhmilch- und Fleischproteine Threonin: Defizit bei Weizen und Roggen Tryptophan: Defizit bei Casein, Mais und Roggen Beispiele Rice-Fortification (Japan, Thailand und Tunesien) Zusatz von LLysin und L-Threonin Supplementierung von Soja und Erdnuß mit Methionin in Japan Bestandteile chemisch definierter Diäten (CDD) z.B. bei Astronautenkost + Therapie von Maldigestions- und Malabsorptionssyndromen. Synthese von Aminosäuren Chemisch synthetisierte AS und Derivate werden eingesetzt: Futtermittelindustrie (Zusatz zwischen 0,05 und 0,2%) Nahrungsmittelindustrie (L-Glutaminsäure als Geschmacksverstärker aber auch Methionin und Lysin) Therapeutika im pharmazeutischen Bereich Chemischen Industrie (Tenside, Polymere) Die Produktion von AS lässt sich in 4 Bereiche einteilen Chemische Synthese Problem: Enantiomerenbildung Extraktion nat. AS aus Proteinhydrolysaten Problem: zahlreiche NP durch Säure und Alkalibehandlung z.B. Bildung von Dihydroalanin oder Enantiomeren AS-Produktion durch Fermentation (mikrobiologisch Mononatrium-L-glutamat) Biotechnologie Glutamat Einsatz als „Geschmacksverstärker“ Im Zusammenhang mit Glutamat beschrieben werden: MSG (Mono Sodium Glutamate)-Symptomkomplex besser bekannt als „Chinarestaurant-Syndrom“ Übergewicht Neurodegenerative Erkrankungen (Morbus Alzheimer; Morbus Parkinson) Toxikologische Bewertung von Glutamat als Zusatzstoff John Olney (1960) Studien zur möglichen Schädigung des Gehirns durch Glutamat Subcutane Injektion (neugeborene Mäuse) Glutamatdosen von 0,5 g/kg bis 4 g/kg Körpergewicht Schädigungen des Gehirns der Nagetiere Durch die orale Gabe ähnlich hoher Glutamatdosen mit der Nahrung wurde jedoch keine Schädigung des Gehirns der Mäuse erreicht Sicherheitsbewertung von Glutamat JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) (1987) LD50 (Maus, Ratte) = 15 -18 g/kg KG Nicht teratogen oder reproduktionstoxisch aus technologisch und geschmacklich eingesetzten Mengen an Glutamat im Lebensmittel resultiert keine Gefährdung für die Gesundheit Kein ADI festgelegt SCF (1991) Kein ADI festgelegt FASEB (Federation of American Societies for Experimental Biology) im Auftrag von FDA (1995) Studien zum MSG-Symptomkomplex keinen wissenschaftlichen Beweis für nachteilige Effekte auf die meisten Menschen, die hohen MNG ausgesetzt wurden Aufnahme von Glutamat aus Lebensmitteln führt nicht zu neurodegenerativen Erkrankungen Biotechnologische Synthese von Aminosäuren -EMS-Syndrom- Tryptophan – Anwendung als Schlafmittel Rolle in der Regulation des Wach-Schlaf-Rhythmus in USA ohne Rezept als Nahrungsergänzungsmittel und Sportlernahrung 1989 in der USA mehreren hundert Menschen nach Einnahme eines Tryptophan- Präparates an EMS (Eosinophilie-Myalgie-Syndrom) erkrankt Eosinophilie, Sklerodermie, schwere Muskelschmerzen weltweit über 1500 Fälle, 38 Todesfälle Im Dezember 1988 führte Showa Denko einen neuen Stamm von B. amyloliquefaciens (Stamm V) in den Produktionsprozess ein. Gleichzeitig vereinfachte das Unternehmen das Reinigungsverfahren zur Gewinnung von L-Tryptophan (Vorstufe Serotonin) aus den Fermentationslösungen Synthese von Aminosäuren -EMS-Syndrom- Ein Filtrationsschritt wurde zeitweise umgangen. Die Menge eingesetzter Aktivkohle, die zur Entfernung unerwünschter Nebenprodukte diente, wurde auf weniger als die Hälfte der zuvor verwendeten Menge reduziert Ein Stoff, der in Verdacht steht, EMS auszulösen, ist das so genannte EBT (Ethylenbistryptophan), ein Reaktionsprodukt aus Tryptophan und Acetaldehyd, einem Nebenprodukt der Fermentation. Für die Reaktion sind tiefe Temperaturen erforderlich. Die verkürzte Tryptophanaufreinigung wurde mittels Kationenaustauscher, welche im Freien standen (Winter) durchgeführt EBT Bucherer-Methode (Methionin) + + -Methylthioethylhydantoin Aldehyde lassen sich mit Blausäure und Ammoniumcarbonat in stabile kristallisierbare Hydantoin-Derivate überführen mit Alkali unter Druck und höherer Temperatur zu αAminosäuren hydrolysierbar Industriell modifizierte Strecker-Methode Herstellung von Methionin aus Acrolein. Peptide -Allgemeines & Nomenklatur Peptide entstehen durch Verknüpfung von AS über Säureamidbindungen. Hydrolyse von Peptiden führt zurück zu den AS. Je nach Anzahl der AS-Reste unterscheidet man Di-, Tri-, und Tetrapeptide und fasst diese bis ca. 10 Resten als Oligopeptide zusammen Höhere Peptide werden als Polypeptide bezeichnet, wobei der Übergang zu den Proteinen fließend ist (Grenze MG = 10.000 Da, ca. 100 AS). Peptide werden als acylierte AS aufgefasst (Alanyl-seryl-glycin = AlaSer-Gly oder ASG). D-AS werden durch vorgesetztes D gekennzeichnet Bindungen an denen funktionelle Gruppen der Seitenketten beteiligt sind, werden durch senkrechte Bindestriche wiedergegeben Glu Cys Gly Beispiel Tripeptid: Glutathion (γ-Glutamyl-cysteinyl-glycin) Peptide -physikalische & sensorische Eigenschaften Gegenüber den entsprechenden AS ist die Acidität der freien Carboxylgruppe und die Basizität der freien Aminogruppe bei den Peptiden geringer. Die Sequenz hat darauf Einfluss. Während bei den AS eine Abhängigkeit der Geschmacksqualität von der Konfiguration vorhanden ist Peptiden unabhängig Die Intensität des Geschmacks hängt wie von der Hydrophobizität der Seitenketten ab. Bittergeschmack bei Käse als Folge von Fehlreifung. Deswegen auch kein Einsatz proteolytischer Enzyme zur Modifizierung von Nahrungsproteinen. L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (Aspartam) ist süß, wie einige andere Dipeptidester der L-Aminomalonsäure. Bei ihnen haben die Carboxylgruppe, Aminogruppe und die Seitenkette R die Anordnung für den süßen Geschmack. Einzelne Peptide -GlutathionEs ist in tierischen Organismen, in Pflanzen und Mikroorganismen weit verbreitet Bindung der Glutaminsäure über die γ-Carboxylgruppe Einzelne Peptide -Glutathion & LebensmitteltechnologieBedeutende Getreideenzyme: Peroxidasen, Katalasen & Glutathion-Dehydrogenasen Durch Glutathion-Dehydrogenase wird die Oxidation von Glutathion (mit Dehydroascorbinsäure als H-Akzeptor) katalysiert In Verbindung mit Ascorbinsäure Verbesserung rheologischer Eigenschaften von Weizenteig: Abbau von Disulfidbrücken, der zu Depolymerisation von Kleberproteinen führt, wird gebremst 2 GSH Dehydroascorbinsäure H2O GlutathionDehydrogenase GSSG Ascorbinsäure ½ O2 Einzelne Peptide -Glutathion & biolog. Eigenschaften Glutathion spielt eine Schlüsselrolle bei der Entgiftung (Phase II Reaktion) Abfangen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) Glutathiongehalt von Säugerzellen ~ 5 mM Schützt die Zellen vor oxidativer Schädigung Sulfhydryl Puffer Wirkung Zyklus zwischen reduzierter Thiolform (GSH) und oxidierter Form (GSSG) GSSG wird reduziert durch Glutathion Reduktase: Flavoprotein, welchem NADPH als Elektronenquelle dient Die Umsetzung von GSH GSSG ist um ein 500 faches größer 2 GSH + RO-OH GSSG + H2O + ROH Einzelne Peptide -Glutathion-Peroxidase Glutathion-Peroxidase katalysiert folgende Reaktion 2 GSH + RO-OH GSSG + H2O + ROH Enzym besitzt ein Selenocystein-Rest im aktiven Zentrum Die Selenolat-Form (E-Se-) reduziert das Peroxid zum Alkohol und geht dabei selbst in die selenische Säure über (E-SeOH) Unter Oxidation eines Glutathion entsteht ein Selenosulfid Addukt (E-Se-S-G) Ein weiteres Molekül Glutathion regeneriert dann die aktive Form des Enzyms, unter Bildung von GSSG ROOH + H+ E-SeSelenolat GSSG + H+ GSH ROH E-SeOH Selenische Säure GSH E-Se-S-G Selensulfid H2O Einzelne Peptide -Carnosin, Anserin, Balenin Dipeptide der β-Alanins mit L-Histidin (Carnosin) bzw. 1-Methyl-L-Histidin (Anserin) oder 3-Methyl-L-Histidin (Balenin) Carnosin Anserin Vorkommen: Muskeln von Wirbeltieren Charakterisierung der Herkunft von Fleischextrakten: Carnosin Rindermuskel Anserin Hühnerfleisch Balenin Walfleisch Physiologische Rolle noch nicht völlig klar, Bedeutung haben: Pufferung im pH-Bereich 6-8 Beteiligung an Wiederherstellung der Erregbarkeit und Kontraktionsfähigkeit des ermüdeten Skelettmuskels für Carnosin: Wirkung als Neurotransmitter des Geruchsnervs Einzelne Peptide -Nisin- Wird von einigen Stämmen des Lactobacillus lactis gebildet Enthält Dehydroalanin, Dehydro-β-methylalanin, Lanthionin und β-Methyllanthionin über 5 Thioetherbrücken In einigen Ländern als Zusatzstoff zugelassen: E-Nummer: 234 Klasse: Konservierungsmittel Verwendung zur Konservierung von: Grieß- und Tapiokapudding und ähnlichen Erzeugnissen (max. 3 mg/kg) Gereiftem Käse, Schmelzkäse (max. 12,5 mg/kg) Clotted cream (max. 10 mg/kg) Infolge der EU-Harmonisierung gehört Nisin zu den zugelassenen Konservierungsstoffen Einzelne Peptide -Nisin- Wirkung: Tötet gram-positive Bakterien (Bacillus, Clostridium, Listeria): Der Angriff erfolgt durch Porenbildung in der Cytoplasmamembran unmittelbar nach dem Auskeimen der Sporen Gram-negative Bakterien (Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, Yersinia) werden nicht abgetötet. Sicherheit: keine schädlichen Wirkungen für Menschen bekannt wird im menschlichen Verdauungstrakt schnell abgebaut Kommt natürlicherweise in Milch und Käse vor, auch in der humanen Darmflora kann Nisin durch Streptokokken gebildet werden ADI-Wert: 0-13 mg/kg Einzelne Peptide -Aspartam- Aspartam (Dipeptid,Süßstoff) relative Süßkraft 100-200 durch Kochen, lange Lagerung und Metabolisierung wird Phenylalanin freigesetzt bedenklich für Phenylketonuriekranke verliert an Süßkraft durch hydrolytische Spaltung zum Kochen ungeeignet O O O H C C H2 + NH3 O OMe N CH H CH2 Aspartam (L-Aspartylphenylalaninmethylester) Abbauweg für Phenylalanin Tetrahydrobiopterin O2 Dihydrobiopterin H2O alpha-Ketoglutarat COO - + NH3 Glutamat COO Phenylalanin-Hydroxylase + NH3 HO Phenylalanin COO Aminotransferase Tyrosin O HO p-Hydroxyphenylpyruvat Ascorbat + O 2 p-HydroxyphenylpyruvatDioxygenase Dihydroascorbat + H2O + CO 2 -OOC H H H2O Fumarylacetoacetase H + H COO - Fumarat H3C COO - H MaleylacetoacetatO O Isomerase 4 - Fumarylacetoacetat - OOC OH COO - COO - H O2 COO - COO - O Acetoacetat O O Homogentisat-Dioxygenase 4 - Maleylacetoacetat OH Homogentisat Phenylketonurie angeborene Intoleranzreaktion durch Defizit an Phenylalaninhydroxylase Tyrosin ↓ Phenylalanin im Blut ↑ Brenztraubensäure im Harn ↑ schwere geistige Schäden Opioide Peptide körpereigene psychoaktive Peptide (Endorphine, Enkephaline, Dynorphine) In Gluten und Casein (Weizenund Milchprodukte) Abbauprodukte bei Käsereifung Rufen Effekte hervor, die denen des Morphins ähneln und durch bekannte Morphin-Antagonisten reversibel sind Beeinflussen über spezifische Rezeptoren (Opioidrezeptoren) die Schmerzleitung und verarbeitung Lange Eliminationszeiten, physische Abhängigkeit Opioide Proteine - -Casomorphinekurzkettige Peptide aus β-Casein der Kuhmilch zeigen opiatartige Wirkung wirken bei Kleinkindern reduzierend auf die Darmbewegung β-Casomorphine-7 Heptapeptide alternierende Prolinreste in der Sequenz bedingen hohe Resistenz gegenüber Proteasen (im Gegensatz zu eigenen Endorphinen) entstehen im Gastrointestinaltrakt beim Abbau des Caseins und werden dort vom Enzymsystem kaum angegriffen Modifizierung von Casomorphinen Einbau von D- statt L-AS kann zum Aktivitätsanstieg führen
