Der Einfluss von Pollenlipasen auf die Tränenflüssigkeit des Auges
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Diplomarbeit Der Einfluss von Pollenlipasen auf die Tränenflüssigkeit des Auges im Rahmen des SNAK-Syndroms eingereicht von Eva Wimmer Mat.Nr.: 0533511 zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der gesamten Heilkunde (Dr. med. univ.) an der Medizinischen Universität Graz ausgeführt an der Universitäts-Augenklinik Auenbruggerplatz 4, A-8036 Graz, Austria unter der Anleitung von Univ.-Prof. Mag. Dr. phil. Otto Schmut Graz, Mai 2010 .................................... (Unterschrift) Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Graz, Mai 2010 .................................... (Unterschrift) I Vorwort Aus Gründen der leichteren Lesbarkeit – vor allem in Hinblick auf die Vermeidung einer ausufernden Verwendung von Pronomen – habe ich mich dazu entschlossen, alle geschlechtsbezogenen Wörter nur in eingeschlechtlicher Form – der deutschen Sprache gemäß zumeist die männliche – zu verwenden. Selbstredend gelten alle Bezeichnungen gleichwertig für Frauen. II Danksagungen An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Univ.-Prof. Mag. Dr. Otto Schmut für die hervorragende Betreuung sowie die sorgfältige Begutachtung meiner Diplomarbeit sehr herzlich bedanken. Weiters gilt mein Dank dem Laborteam, insbesondere BA Sieglinde Kirchengast, die mir die praktische Anwendung biochemischer Methoden näher brachte und mir mit Rat und Tat zur Seite stand. Ebenfalls danke ich Herrn Dr. Dieter Rabensteiner für die Zweitbetreuung. Herrn Dr. Harald Köfeler (Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung, Medizinische Universität Graz) danke ich für die gute Zusammenarbeit. Nicht zuletzt bin ich auch Klinikvorstand Herrn Univ.-Prof. Dr. Andreas Wedrich für die Benutzung des Labors zu Dank verpflichtet. Spezieller Dank gebührt darüber hinaus meinen Eltern, die mir mit ihrer Unterstützung nicht nur eine unbeschwerte und wunderschöne Studienzeit ermöglicht haben, sondern die mir auch immer den nötigen emotionalen Rückhalt geboten haben. Ebenso danke ich meinem Freund Martin für das aufgebrachte Verständnis während stressiger Prüfungszeiten, sowie für die liebevolle Unterstützung während meines Studiums. III Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ................................................................................. 1 1.1 Ziel und Relevanz der Arbeit ............................................................. 1 1.2 Anatomie und Physiologie der Augenoberfläche .............................. 2 1.2.1 Tunica konjunktiva (Bindehaut) ...................................................................... 2 1.2.2 Kornea (Hornhaut) .......................................................................................... 3 1.2.3 Der Tränenapparat ........................................................................................... 4 1.2.4 Der Tränenfilm ................................................................................................ 4 1.2.5 Die Meibom-Drüsen (Glandulae tarsales) ........................................................ 8 1.3 Das Trockene Auge .......................................................................... 10 1.3.1 Epidemiologie ............................................................................................... 10 1.3.2 Klassifikation ................................................................................................ 10 1.3.3 Ursachen ....................................................................................................... 11 1.3.4 Symptome und Diagnostik ............................................................................ 13 1.3.5 Therapie ........................................................................................................ 17 1.4 Pollen ................................................................................................. 18 1.4.1 Allgemeines .................................................................................................. 18 1.4.2 Pollenentwicklung ......................................................................................... 19 1.4.3 Die Aufgabe des Pollenschlauchs und seiner darin enthaltenen Enzyme im Rahmen der pflanzlichen Befruchtung ........................................................... 20 1.5 Das SNAK-Syndrom ........................................................................ 23 2 1.5.1 Ursachen ....................................................................................................... 23 1.5.2 Diagnostik ..................................................................................................... 24 1.5.3 Therapie ........................................................................................................ 24 Material und Methoden ........................................................ 25 2.1 Tränenflüssigkeit .............................................................................. 25 IV 2.1.1 Allgemeines .................................................................................................. 25 2.1.2 Gewinnung .................................................................................................... 25 2.2 Pollen ................................................................................................. 27 2.2.1 Sammlung ..................................................................................................... 27 2.2.2 Pollenextraktherstellung ................................................................................ 28 2.3 Vitalitätsfärbung .............................................................................. 29 2.3.1 Allgemeines .................................................................................................. 29 2.3.2 Durchführung ................................................................................................ 29 2.4 Enzymfreisetzung ............................................................................. 29 2.4.1 Allgemeines .................................................................................................. 29 2.4.2 Durchführung ................................................................................................ 30 2.5 Lipasenachweis mittels modifiziertem Olivenöl-Rhodamin B-Agar nach Kouker und Jäger.................................................................... 30 2.5.1 Allgemeines .................................................................................................. 30 2.5.2 Herstellung .................................................................................................... 31 2.5.3 Lipaseaktivitätsnachweis ............................................................................... 32 2.6 Lipidanalyse...................................................................................... 36 3 2.6.1 Allgemeines .................................................................................................. 36 2.6.2 Probenvorbereitung ....................................................................................... 36 2.6.3 Lipidextraktion .............................................................................................. 37 2.6.4 Reversed phase HPLC ................................................................................... 37 2.6.5 Auswertung ................................................................................................... 37 Ergebnisse ..............................................................................39 3.1 Vitalitätsfärbung .............................................................................. 39 3.1.1 Birkenpollen.................................................................................................. 39 3.1.2 Knäuelgras .................................................................................................... 39 3.1.3 Hasel ............................................................................................................. 40 3.1.4 Erle ............................................................................................................... 41 V 3.2 Enzymfreisetzung ............................................................................. 41 3.2.1 Rehydrierung der Pollen ................................................................................ 41 3.2.2 Pollen/Serva-Blue ......................................................................................... 42 3.2.3 Pollen/Serva-Blue/Tränenflüssigkeit.............................................................. 44 3.3 Lipasenachweis mittels modifiziertem Olivenöl-Rhodamin B-Agar nach Kouker und Jäger.................................................................... 45 3.3.1 Verdünnungsreihe ......................................................................................... 45 3.3.2 Lipaseaktivitätsnachweis - Pollen .................................................................. 49 3.3.3 Lipaseaktivitätsnachweis - Pollen/Tränen ...................................................... 51 3.4 Lipidanalyse...................................................................................... 52 4 Diskussion ..............................................................................55 4.1 Einfluss von Pollenlipasen auf den Tränenfilm .............................. 55 4.2 Antilipasen – Physiologische Schutzfaktoren ................................. 58 4.3 Therapieansätze ................................................................................ 58 5 Literaturverzeichnis ..............................................................61 6 Anhang ................................................................................... 65 7 Curriculum vitae ................................................................... 70 VI Abkürzungen Aqua bidest. Aqua bidestillata °C Grad Celsius Ca2+ Calciumionen CHCl3 Chloroform cm Zentimeter g Gramm HPLC High Pressure Liquid Chromatography MeOH Methanol mg Milligramm ml Milliliter mm Millimeter nkat Nanokatal nm Nanometer U/L Units per liter U/min Umdrehungen pro Minute μl Mikroliter μm Mikrometer VII Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Dreischichtiger Aufbau des Tränenfilms ...................................................... 5 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 2: Produktionsstätten der einzelnen Schichten des Tränenfilms ...................... 7 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 3: Augenlid........................................................................................................ 8 aus: Hartmann M, Pabst MA, Schmied R, Caluba HC, Dohr G. Zytologie, Histologie und Mikroskopische Anatomie. 4th ed. Wien: Facultas Verlags- und Buchhandels AG 2008. Abbildung 4: Spaltlampe .................................................................................................... 13 fotografiert von Eva Wimmer. Abbildung 5: F-BUT........................................................................................................... 14 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 6: Bengalrosa .................................................................................................... 15 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 7: Lissamingrün ................................................................................................ 15 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. VIII Abbildung 8: Fluoreszein ................................................................................................... 15 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 9: Schirmer Test ................................................................................................ 16 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 10: Männlicher und weiblicher Blütenstand eines Haselstrauchs .................... 19 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 11: Pollen im Elektronenmikroskop ................................................................. 20 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 12: Schematische Darstellung des Befruchtungsvorgangs ............................... 21 gestaltet von Katharina Meditz. Abbildung 13: Stark gerötetes, rinnendes Auge ................................................................. 23 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 14: Tränenabnahme an freiwilliger Probandin ................................................ 25 aus: Wedrich A, Schmut O, Rabensteiner DF. Trockenes Auge - Alles zum Sicca-Syndrom. Wien: Verlagshaus der Ärzte GmbH 2009. Abbildung 15: Olivenöl-Rhodamin B-Agar ........................................................................ 32 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. IX Abbildung 16: Vitalitätsfärbung – Birke ............................................................................ 39 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 17: Vitalitätsfärbung – Knäuelgras ................................................................... 40 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 18: Vitalitätsfärbung – Hasel ............................................................................ 40 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 19: Vitalitätsfärbung – Erle .............................................................................. 41 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 20: rehydrierte Pollenkörner ............................................................................. 42 fotografiert von Eva Wimmer. Abbildung 21: dehydrierte Pollenkörner ............................................................................ 42 fotografiert von Eva Wimmer. Abbildung 22: Enzymfreisetzung – Haselpollen ................................................................. 43 fotografiert von Eva Wimmer. Abbildung 23: Enzymfreisetzung – Knäuelgraspollen........................................................ 43 fotografiert von Eva Wimmer. Abbildung 24: Zellwandzerstörung aufgrund Enzymfreisetzung ....................................... 44 fotografiert von Eva Wimmer. X Abbildung 25: Enzymfreisetzung in der Tränenflüssigkeit ................................................ 45 fotografiert von Eva Wimmer. Abbildung 26: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragener Serum-Verdünnungsreihe .................................................................................................. 46 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 27: Eichkurve – Lipasekonzentration im Serum ............................................... 48 erstellt von Eva Wimmer. Abbildung 28: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragener Pollenextrakt-Verdünnungsreihe ....................................................................................... 49 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 29: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragenen Pollenextrakten................................................................................................................... 50 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 30: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragenen Pollenextrakten und Tränenflüssigkeit............................................................................... 51 fotografiert von Heimo Bauer, Fotolabor der Universitäts-Augenklinik Graz. Abbildung 31: Ergebnis der Lipidbestimmung, ZMF ......................................................... 54 erstellt von Dr. Harald Köfeler, Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung. XI Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Serum-Verdünnungsreihe ................................................................................. 33 erstellt von Eva Wimmer. Tabelle2: Ergebnis der Serum-Verdünnungsreihe ............................................................. 47 erstellt von Eva Wimmer. Tabelle 3: Lipide und deren Abkürzungen ......................................................................... 52 erstellt von Dr. Harald Köfeler, Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung. Tabelle 4: Ergebnis der Lipidbestimmung, ZMF................................................................ 53 erstellt von Dr. Harald Köfeler, Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung. Tabelle 5: Ergebnisvergleich - Vitalitätsfärbung/Lipaseaktivität ..................................... 56 erstellt von Eva Wimmer. XII Zusammenfassung Hintergrund: Okuläre Reizerscheinungen wie etwa gerötete, tränende und juckende Augen werden auch bei Nicht-Allergikern während der Pollenflugsaison zunehmend häufiger beobachtet. Es handelt sich jedoch hier in vielen Fällen nicht um eine allergische Reaktion, sondern um eine saisonale nicht-allergische Konjunktivitis (SNAK). In einer vorangegangen Studie wurde bereits nachgewiesen, dass die in Pollen enthaltenen Proteasen die mittlere, wässrige Schicht des Tränenfilms angreifen und deren Proteine zerstören. Folglich wird der Tränenfilm instabil. Dies kann für die Entstehung eines Trockenen Auges prädisponierend sein. Jedoch liegt die Vermutung nahe, dass nicht die Proteasen alleine Auslöser des SNAK-Syndroms sind, sondern sich unter den Pollenenzymen auch Lipasen befinden, die eine schädigende Wirkung auf die oberste lipidhältige Schicht des Tränenfilms ausüben könnten. Methoden: Verschiedene Pollenarten wurden gesammelt und für die Versuche zu Extrakten weiterverarbeitet. Weiters wurde freiwilligen Probanden Tränenflüssigkeit abgenommen. Die Pollenextrakte konnten auf einem speziell hergestellten und modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agar (Kouker und Jäger, 1987) auf ihre Lipaseaktivität getestet werden. Um den Austritt der Pollenenzyme nach Kontakt mit Tränenflüssigkeit beobachten zu können, wurden Pollen auf einem Objektträger mit Tränenflüssigkeit und Serva-Blue Farblösung, einem proteinfärbenden Farbstoff versetzt, welcher dazu diente, die Enzyme anzufärben und sichtbar zu machen. Die Analyse der Lipidzusammensetzung des Tränenfilms vor und nach der Inkubation mit Pollenextrakten erfolgte mittels reversed phase HPLC in Zusammenarbeit mit dem Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung, Medizinische Universität Graz (ZMF). Resultate: Durch den Lipaseaktivitätsnachweis mittels modifiziertem Olivenöl-Rhodamin B-Agar konnte bewiesen werden, dass sich unter den Pollenenzymen Lipasen befinden. Durch den Kontakt mit Tränenflüssigkeit quellen die Pollenkörner auf und geben ihre Enzyme frei. Die Lipasen verändern die Lipide der Tränenflüssigkeit. Diese Reaktion konnte mit Hilfe der Massenspektroskopie untersucht werden, wobei Veränderungen im Molekulargewicht feststellbar waren. XIII Schlussfolgerungen: Die lipolytische und proteolytische Wirkung der Pollenenzyme erklärt die bei Nicht-Allergikern immer häufiger auftretenden Reizerscheinungen am Auge. Doch die verschiedenen Pollenarten unterscheiden sich in ihrer Wirkung. So besitzen Knäuelgraspollen eine deutlich größere Lipaseaktivität als beispielsweise die Haselpollen. Da die durch das SNAK-Syndrom auftretenden okulären Reizerscheinungen dem einer allergischen Reaktion sehr ähnlich sind, werden die meisten Patienten fälschlicherweise mit Antiallergika behandelt. Diese Medikamente sind bei SNAK-Patienten jedoch wirkungslos, da die Ursache nicht in einer allergischen Sensibilisierung des Organismus liegt, sondern in einer enzymatischen Schädigung des Tränenfilms. Schlüsselwörter: Pollenlipasen, Tränenfilm, SNAK-Syndrom XIV Abstract Background: Ocular irritations like reddened, watery and itchy eyes can be observed more and more frequently in non-allergic persons during pollen seasons. In some of these cases there is no allergic reaction behind these symptoms, the irritations are due to a seasonal nonallergic conjunctivitis (SNAC). In a previous study it was detected that pollen contain proteases, which can attack the middle, aqueous layer of the tear film and destroy the proteins. Consequently, the tear film becomes unstable which may be a predisposing factor for the development of dry eye symptom. However, it seems likely that proteases do not alone trigger the SNAC-syndrome. There might be lipases among the pollen enzymes, which could have harmful effects on the hydrophobic uppermost layer of the tear film. Methods: Different types of pollen were collected and processed to extracts. Furthermore, tear fluid was taken from volunteers. The pollen extracts were tested for lipase activity on a specially established and modified olive oil-rhodamin B-agar (Kouker and Jäger, 1987). To observe the outlet of the pollen enzymes after exposure to tear fluid, pollen were placed on a slide and tear fluid together with serva-blue staining solution was pipetted on it. The staining solution was used to make the enzymes visible. The lipid analysis of the tear film before and after incubation with pollen extracts was done by reversed phase HPLC, in cooperation with the Center for Medical Research, Medical University of Graz (ZMF). Results: By testing pollen extracts for lipase activity using the modified olive oil-rhodamin B-agar, it could be proved that there are lipases among the pollen enzymes. If pollen grains come in contact with tear fluid, they will swell and release their enzymes. Lipases alter the lipids of the tear fluid. This reaction could be observed with mass spectrometry, whereby changes in the molecular weight could be determined. Conclusion: The lipo- and proteolytic effect of the pollen enzymes explains why non-allergic people can have eye irritations during pollen season. However, there is a difference among pollen species. Thus Cock's-foot-grass pollen has a much higher lipase activity than, for XV instance, hazel pollen. As the ocular irritations caused by the SNAC-syndrome are similar to an allergic reaction, most of the patients are incorrectly medicated with antiallergica. These drugs are ineffective on SNAC-patients, because the reason for the symptoms is not an allergic sensitization of the organism but an enzymatic degradation of the tear film layer. Key words: pollen lipases, tear film, SNAC-syndrome XVI 1 Einleitung 1.1 Ziel und Relevanz der Arbeit In der Pollenflugsaison leiden viele Menschen an okulären Reizerscheinungen wie etwa geröteten, tränenden und juckenden Augen. Dies kann auch zur Entstehung einer Keratokonjunktivitis sicca führen. Diese Personen werden dann meist mit Medikamenten wie Antihistaminika behandelt. Neueste Erkenntnisse belegen, dass sich bei einigen dieser Personen gar keine allergische Reaktion hinter diesen Symptomen verbirgt, sondern eine saisonale nicht-allergische Konjunktivitis (SNAK). Die Verordnung von Antihistaminika ist in diesen Fällen wirkungslos. Der genaue Mechanismus des SNAK-Syndroms ist jedoch nicht geklärt. Ebenso ist noch unklar, wieso bei manchen Personen keinerlei Reizerscheinungen während der Pollenflugsaison auftreten. Man weiß, dass in den Pollen Proteasen enthalten sind, welche die in der wässrigen Schicht des Tränenfilms enthaltenen Proteine angreifen. Im Rahmen dieser Diplomarbeit soll geklärt werden, ob in den Pollen nicht auch Lipasen enthalten sind, welche die Lipidschicht des Tränenfilms teilweise zerstören. Bezogen auf die in-vivo Vorgänge am pollenexponierten Auge könnten diese Ergebnisse zur Entwicklung neuer Medikamente führen, die genau an diesem Mechanismus ansetzen. Somit könnte vielen Menschen geholfen werden, die am SNAK- Syndrom leiden. Um die Zusammenhänge zwischen den Pollenlipasen und dem Tränenfilm im Rahmen des SNAK-Syndroms besser zu verstehen, soll in den nächsten Seiten zuerst auf wesentliche Grundlagen eingegangen werden. 1 1.2 Anatomie und Physiologie der Augenoberfläche 1.2.1 Tunica konjunktiva (Bindehaut) Die Bindehaut ist eine dünne, glänzende, transparente Schleimhautschicht, in der viele Blutgefäße verlaufen. Das konjunkivale Epithel zeichnet sich durch ein mehrschichtiges, nicht verhornendes Plattenepithel aus, welches viele schleimsezernierende Becherzellen enthält. Durch die Bindehaut werden das Augenlid und der Augenbulbus zu einer beweglichen Einheit verbunden [1, 2]. Die Konjunktiva hat jedoch auch zahlreiche andere Aufgaben wie etwa in der immunologischen Abwehr von entzündlichen Prozessen. So finden sich sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems, wie etwa Immunglobuline, als auch T- und B-Zellen innerhalb des Konjunktivaepithels [3]. Die Konjunktiva unterteilt man in 3 Abschnitte: · Konjunktiva tarsi · Konjunktiva fornicis · Konjunktiva bulbi Konjunktiva tarsi: Dieser Bindehautabschnitt, welcher am mukokutanen Übergang beginnt, ist der Lidinnenseite angelagert und mit dieser fest verwachsen. Diese Bindehaut besteht aus einer lockeren, gefäßreichen Bindegewebsschicht (Lamina propria) sowie einem 2-5-schichtigen Epithel. An der Lidgrenze wechselt das verhornende Plattenepithel der Haut in das nicht verhornende Plattenepithel der Konjunktiva [1, 2]. Konjunktiva fornicis: In diesem Bereich (= Fornix konjunktivae) gehen die Konjunktiva palpebralis und die Konjunktiva bulbi ineinander über. Hier findet man eine besonders hohe Zahl an Becherzellen [1]. 2 Konjunktiva bulbi: Die bulbäre Bindehaut liegt der Sklera auf und ist mit dieser nur locker verbunden [1]. Am Limbus cornea geht das Plattenepithel der Konjunktiva in das becherzelllose, nicht verhornende Plattenepithel der Hornhaut über [2]. 1.2.2 Kornea (Hornhaut) Die Hornhaut hat einen Durchmesser von ca. 11 mm und ist ca. 1 mm dick (in der Mitte 0,8-0,9 mm und am Rand 1,1-1,2 mm). Sie ist wie ein Uhrglas keilförmig in die Sklera eingesetzt und stellt ein wichtiges lichtbrechendes Medium dar, denn sie übernimmt mit 43 dpt den wesentlichen Anteil der Gesamtbrechkraft des Auges. Die konstante Dicke der Hornhaut wird unter anderem durch ein funktionsfähiges, pumpfähiges Endothel und Epithel, dem Augeninnendruck sowie der Verdunstung des präkornealen Tränenfilms gewährleistet. Die Kornea, deren Ernährung über das Kammerwasser, die Tränenflüssigkeit und über das Randschlingennetz der Bindehautgefäße erfolgt, ist transparent, zellarm und gefäßfrei. Es kann jedoch bei Entzündungen oder Infektionen zur Gefäßeinsprossung kommen [1, 2, 4]. Die Kornea besteht aus mehreren Schichten [1, 2]: · außen gelegenes Kornealepithel: wird aus einem 5-7-schichtigen nicht verhornenden Plattenepithel gebildet und sitzt einer Basallamina auf · Bowman-Membran (Lamina limitans anterior): eine azelluläre bindegewebige Schicht, die etwa 10 µm dick ist · Substantia propria: bindegewebiges gefäßfreies Stroma, macht 90 % der Hornhaut aus · Descement-Membran (Lamina limitans posterior): 5-10 µm dicke Basallamina · innen gelegenes Kornealendothel: besteht aus einer Schicht flacher kuboider Zellen 3 1.2.3 Der Tränenapparat Aufbau des Tränenapparates [4]: · Tränendrüse (Glandula lacrimalis) und akzessorische Drüsen · Tränenpunkte (Puncta lacrimalia) · Tränenkanälchen (Canaliculi lacrimales) und Ductus lacrimalis communis · Tränensack (Saccus lacrimalis) · Tränennasengang (Ductus nasolacrimalis) Die Tränendrüse unterteilt sich in einen orbitalen, dieser macht etwa 2/3 der Gesamtgröße aus, und einen palpebralen Anteil. Der kleinere palpebrale Teil der Glandula lacrimalis befindet sich oberhalb des konjunktivalen Fornix, wohingegen sich die Pars orbitalis in einer Knochenimpression in der vorderen lateral-oberen Orbita befindet. Getrennt werden diese beiden Teile von der Sehne des M. Levator palpebrae. Die über 10 Ausführungsgänge der Glandula lacrimalis münden in den oberen Fornix, wo auch die akzessorischen Tränendrüsen (Krause- und Wolfring-Drüsen) liegen [4]. Der Tränenabfluss beginnt bei den Tränenpünktchen (Punktum lacrimale), geht weiter über die Canaliculi lacrimales in den Saccus lacrimalis und von dort in den Ductus nasolacrimalis [4]. 1.2.4 Der Tränenfilm Der präokuläre Tränenfilm bedeckt die Augenoberfläche als transparenter Film und erhält somit die normale Struktur und Funktion der Oberfläche von Hornhaut und Bindehaut. Durch Glättung der Oberfläche verbessert der Tränenfilm, welcher mit jedem Lidschlag neu aufgebaut wird, die optischen Eigenschaften der Hornhaut. Darüber hinaus befeuchtet er das Bindehaut- und Hornhautepithel und ernährt letzteres. Da die Kornea selbst keine Gefäße enthält, ist sie somit auf den, in der Tränenflüssigkeit gelösten Sauerstoff angewiesen. Durch die bakteriziden Eigenschaften des Tränenfilms werden abgeschilferte Zellen, Zelltrümmer und Fremdkörper eliminiert [3, 4]. 4 Der Tränenfilm ist etwa 7-10 µm dick und ist aus drei Schichten aufgebaut (Abbildung 1) [3]. Abbildung 1: Dreischichtiger Aufbau des Tränenfilms Die äußerste zur Umwelt gerichtete Schicht ist die Fettschicht. Die 0,1 µm dicke Lipidschicht geht flexibel bei jedem Lidschlag mit, das heißt beim Schließen des Lids wird sie zusammengedrückt und beim Öffnen wieder gleichmäßig verteilt. Diese oberflächliche lipidhältige Schicht dient als Verdunstungsschutz für die wässrige Phase sowie zur Aufrechterhaltung der Tränenfilmstabilität [3, 4]. Gebildet wird die Fettschicht von den Meibom-Drüsen. Es ist lange bekannt, dass das Sekret der Meibom-Drüsen eine außerordentlich komplexe Mischung verschiedener Lipide darstellt. Schätzungen besagen, dass es hunderte, wenn nicht sogar tausende Lipidbestandteile sein dürften [5]. Untersuchungen aus dem Jahr 2007 zufolge sind im Meibom Sekret folgende Fette enthalten [5]: · Cholesterol · Ölsäure · Wachsester der Molekülformeln CnH2n-2O2, CnH2n-4O2 oder CnH2nO2 mit o Ölsäure o Linolsäure 5 o Stearinsäure als Säurekomponenten und Alkohol-Bausteinen Ketten von C18:0 bis C30:0 · Cholesterolester · Lipide der Diacylglycerid Familie · Ölsäureamid (weniger als 0,1 %) Dies kann möglicherweise eine Verunreinigung aus Plastik-(Eppendorf) Aufbewahrungsgefäßen darstellen [6]. Generell repräsentieren Wachsester und Cholesterolester über 60 % aller Lipide des MeibomSekrets. Eine große Anzahl von Inhaltsstoffen wird durch Hydrolyse freigesetzt. Welche Kombinationen allerdings in vivo vorkommen, ist noch nicht klar [5]. Im Gegensatz zu früheren Analysen, die oft Jahrzehnte zurückliegen und andere Methoden verwendeten, waren bei den Untersuchungen im Jahr 2007 folgende Lipide kaum nachweisbar [5]: · Phospholipide, Phosphocholin-Lipide nur in Spuren · Ceramide Probleme bei der Identifizierung gibt es aufgrund methodischer Fehler, falschem Handling der Proben, Grenzen veralteter Methoden, falscher Identifizierung, Verunreinigung der Proben (z.B.: durch Hautlipide). Ebenso bestehen Probleme bei der Analyse intakter Lipidkomplexe, da oft Hydrolyseprodukte entstehen. Einige Lipide des Meibom Sekrets finden sich in der Lipidschicht der Tränenflüssigkeit wieder. Allerdings sind zusätzlich noch Phospholipide, Ceramide und Fettsäureamide enthalten, die von anderen Quellen abstammen müssen. Auch haben Tränen ein größeres Verhältnis von freiem Cholesterol zu Cholesterolestern als Meibom-Drüsen-Sekret und weisen generell eine höhere Cholesterolkonzentration auf [5]. Einige Autoren (Tiffany, 1978) aber nicht alle (Joffre, 2008; Souchier, 2008) finden eine große Variabilität der Fettsäuren bzw. Fettalkohole von Spender zu Spender [7, 8]. Die amphiphilen (sowohl in Wasser auch als in Fetten und Ölen löslich) Lipidkomponenten [z.B.: (O-Acyl)-ω-hydroxy-Fettsäuren und Diacylglycerine] verbinden die Lipidschicht mit der darunter liegenden wässrigen Schicht. 6 Die mittlere wässrige Schicht des Tränenfilms ist 7 µm dick und macht somit über 90 % der Dicke aus. Produziert wird diese Phase von der Glandula lacrimalis und den akzessorischen Tränendrüsen. Über die Ausführungskanälchen der Haupt- und der akzessorischen Tränendrüsen gelangt dieses wässrige Sekret in den oberen Fornix und wird von dort über die Augenoberfläche verteilt. Tränenflüssigkeit von Der temporal Musculus nach orbicularis medial. oculi Aufgrund bewegt von die wässrige Verdunstung und Wiederaufnahme durch die Oberfläche der Konjunktiva geht ein Teil des Sekretes verloren, jedoch gelangt der größte Teil in der Entspannungsphase nach einem Lidschlag über die Tränenpünktchen und die Canaliculi lacrimales in den Saccus lacrimalis und folglich in den Ductus nasolacrimalis [3]. Zu den Inhaltsstoffen der wässrigen Phase zählen Salze, Glucose, Harnstoff und hunderte von Proteinen, unter ihnen Immunglobuline, Lysozym und Lactoferrin [4, 9]. Die Aufgaben der mittleren Tränenfilmschicht sind die Spülung, Benetzung und Ernährung der Augenoberfläche sowie deren Pufferung mit neutralem pH-Wert. Ebenso dienen einige in ihr enthaltenen Proteine zur Bakterienabwehr [4, 9]. Die Schleimschicht, welche der Kornea und der Konjunktiva zugewandt liegt, wird von den Becherzellen der Bindehaut gebildet. Durch sie wird ein Anhaften des Tränenfilms an der Kornea ermöglicht, da diese muzinöse Phase dem hydrophoben Kornea- und Konjunktivaepithel eine hydrophile Oberfläche gibt [4, 9]. Abbildung 2: Produktionsstätten der einzelnen Schichten des Tränenfilms 7 Die Farbcodierung in Abbildung 2 entspricht der in Abbildung 1. Somit kann man sich eine gute Übersicht verschaffen, welche Produktionsstätte welche Schicht des Tränenfilms produziert [9]. Da im Rahmen dieser Arbeit besonders die Lipidschicht des Tränenfilms von Relevanz ist, gehe ich nun auf die Meibom-Drüsen noch etwas näher ein. 1.2.5 Die Meibom-Drüsen (Glandulae tarsales) Wie bereits erwähnt, sind die Meibom-Drüsen für die Lipidproduktion verantwortlich. Diese Lipide benötigt der Tränenfilm, um die äußerste obere Schicht, die Lipidschicht, aufrechtzuerhalten [3]. Die Meibom-Drüsen sind große Talgdrüsen des Augenlids, welche in paralleler Anordnung innerhalb der ganzen Länge der Tarsalplatte von Ober- und Unterlid liegen (siehe Abbildung 3). Aus diesem Grund werden sie auch als Glandulae tarsales bezeichnet. Ihren umgangssprachlichen Namen „Meibom-Drüsen“ verdanken sie Herrn Heinrich Meibom, der diese Drüsen Ende des 17. Jahrhunderts beschrieb [10]. Meibomdrüsen Abbildung 3: Augenlid 8 Die Anzahl der Meibom-Drüsen ist je nach Region unterschiedlich. So finden sich im Oberlid im Mittel etwa 31 einzelne Drüsenstränge, wohingegen es im Unterlid insgesamt nur etwa 26 Drüsenstränge gibt. Ebenso variiert die Länge der einzelnen Drüsenstränge von Ober- und Unterlid. Zusammenfassend kann man festhalten, dass die Unterschiede in Länge und auch Volumen (Oberlid: 26 µl, Unterlid: 13 µl) der Meibom-Drüsen unterschiedliche Sekretionsmengen zur Folge haben. Somit ergibt sich eine unterschiedliche Wertigkeit der beiden Lider für die Aufrechterhaltung einer intakten Lipidschicht [10]. Innerviert werden die Glandulae tarsales, sowie auch die Tränendrüse, primär parasympathisch. Jedoch spielt die Regulation durch Hormone, v.a. Geschlechtshormone, ebenso eine wesentliche Rolle. Es lassen sich Rezeptoren für Androgen und Östrogen in den Meibom-Drüsen nachweisen. Androgene fördern die Funktion der Drüsen, wohingegen Östrogene eine negative Auswirkung auf die Drüsenfunktion haben. Demzufolge haben Männer im Durchschnitt eine höhere Ausschüttung von Lipiden [10]. Das klare Sekret der Glandulae tarsales ist ein Lipidgemisch, welches sich bei Körpertemperatur verflüssigt und daher auch als Öl bezeichnet wird [11]. Das Meibomöl wir in Drüsenendstücken durch einen holokrinen (d. h. die ganze Zelle wird zur Sekretbildung abgegeben und geht damit zugrunde) Sekretionsmodus produziert und über die Öffnungen der Meibom-Drüsen auf dem freien Lidrand abgegeben. Diese Öffnungen befinden sich noch innerhalb der Epidermis nahe der inneren Lidkante [10]. Das ausgeschüttete Öl breitet sich als Streifen entlang des Lidrandes über alle Meibom-Öffnungen aus und wird als „marginales Reservoir“ bezeichnet [11]. Bei der Öffnung des Auges findet eine Aufwärtsbewegung des Oberlids statt, bei der Lipide aus dem Reservoir in die Lipidschicht aufgesogen und folglich auf dem Tränenfilm verteilt werden. Während des Lidschlusses vereinigt sich das Öl des Lidrandreservoirs von Ober- und Unterlid kurzzeitig und es findet ein Ausgleich der unterschiedlichen Sekretionsmengen statt [11]. Das Meibomöl entlang des Lidrandes dient aber nicht nur zur Erhaltung der Lipidschicht, sondern es stellt auch eine Barriere dar. Es soll verhindert werden, dass der Tränenfilm mit dem Sebum der Haut kontaminiert wird. Dies würde einen Zusammenbruch des Tränenfilms zur Folge haben. Ebenso hat das marginale Reservoir die Aufgabe, das Überlaufen des normalen wässrigen Tränenflusses zu verhindern. Die wesentlichste Funktion des Meibomöls ist jedoch, wie bereits erwähnt, die Verdunstung der wässrigen Phase des Tränenfilms zu 9 reduzieren. Aus der Fülle dieser Aufgaben lässt sich erkennen, dass eine Funktionsstörung der Glandulae tarsales bedeutsam für verschiedene Erkrankungen der Augenoberfläche, v. a. für die Entstehung des Trockenen Auges ist [11]. 1.3 Das Trockene Auge 1.3.1 Epidemiologie Die Keratokonjunktivitis sicca ist ein Krankheitsbild, dessen Inzidenz und Prävalenz seit Jahren zunimmt. Jeder zweite bis dritte Patient, der einen Augenarzt aufsucht, leidet mittlerweile unter dem Sicca-Syndrom. Betroffen sind vor allem Frauen zwischen dem 40. und 70. Lebensjahr. Es wird vermutet, dass das Hormon Östrogen für das Auftreten des Trockenen Auges von großer Bedeutung ist. Daher sind auch zwei Drittel der Patienten, die an dem Trockenen Auge leiden, Frauen [9]. 1.3.2 Klassifikation Eingeteilt wird das Trockene Auge, hinsichtlich der vorliegenden Krankheitsursache, in zwei große Gruppen [3, 9]: 1. Tränenfilmdefizit 1.1. bei Sjögren-Syndrom 1.2. Non-Sjögren Tränendefizit 2. vermehrte Tränenverdunstung 2.1. durch interne Einflüsse 2.2. durch externe Einflüsse Bei der ersten Gruppe spricht man von einem hypovolämisch bedingten Trockenen Auge, d. h. es herrscht ein Tränenflüssigkeitsmangel. Das Tränenfilmdefizit kann im Rahmen eines Sjögren-Syndroms (Autoimmunerkrankung, bei der die Immunzellen die Speichel- und 10 Tränendrüsen angreifen) oder aufgrund anderer Ursachen wie etwa Hormonen, Nachlassens der Tränenproduktion mit zunehmendem Alter etc. entstehen (siehe Kapitel 1.3.3) [9]. In Gruppe zwei werden genug Tränen produziert und die Tränenflüssigkeitssekretion kann auch (ggf. exzessiv) gesteigert sein. Aufgrund der Zusammensetzung der Tränenflüssigkeit, Augenoberflächenveränderungen, Lidfunktionsstörungen etc. (siehe Kapitel 1.3.3) verdunstet der Tränenfilm zu rasch, daher spricht man auch von einem hyperevaporativ bedingten Trockenen Auge [9]. 1.3.3 Ursachen Das Trockene Auge kann auf zahlreiche Ursachen zurückzuführen sein. Wie bereits in Kapitel 1.3.2 erwähnt, tritt die Keratokonjunktivitis sicca auch im Rahmen des Sjögren-Syndroms auf. Durch die zunehmende Insuffizienz der Glandula lacrimalis im Rahmen dieser Autoimmunerkrankung kommt es zu einer verminderten Bildung von Tränenflüssigkeit, was wiederum Auswirkungen auf die Befeuchtung der Augenoberfläche hat. Betroffen von dieser Erkrankung sind vor allem Frauen im Klimakterium, in der Menopause und bei Ovarialinsuffizienz [3]. Neben dem Sjögren-Syndrom können auch andere Systemerkrankungen ein Trockenes Auge verursachen. Im Rahmen von rheumatoider Arthritis, Lupus erythematodes, systemischer Sklerose und primär biliärer Sklerose kann die Tränenproduktion vermindert sein. Auch eine Parkinson-Erkrankung (reduzierte Blinzelfrequenz und Tränensektretion) und ein Diabetes mellitus (herabgesetzter Reflex bei Reizungen der Augenoberfläche aufgrund einer Schädigung von Nervenfasern der Hornhaut) können für eine Keratokonjunktivitis sicca verantwortlich sein. Eine Facialisparese und eine Schädigung des Nervus Trigeminus (beispielsweise durch eine Herpesinfektion) sind ebenso mögliche Auslöser eines SiccaSyndroms [9]. Ein Mangel an Tränenflüssigkeit kann auch oftmals bei älteren Personen (vor allem Frauen) beobachtet werden. Mit zunehmendem Alter werden viele Abläufe im Körper langsamer, davon ist auch die Tränenproduktion nicht ausgenommen [9]. Aus der Tatsache, dass rund zwei Drittel aller Keratokonjunktivitis sicca Patienten Frauen sind lässt sich schließen, dass Hormone einen Einfluss auf das Trockene Auge haben. 11 Androgene haben einen förderlichen, Östrogene einen dämpfenden Einfluss auf die Aktivität und Sekretion der Meibom-Drüsen. Eine hohe Konzentration an weiblichen und eine niedrige an männlichen Sexualhormonen begünstigt somit die Entstehung der Keratokonjunktivitis sicca. Insbesondere Umstellungen im Hormonhaushalt, wie etwa durch die Anti-Baby-Pille, Schwangerschaft, Klimakterium und Hormonersatztherapien können das Sicca-Syndrom auslösen [9, 12]. Die Einnahme von Medikamenten, wie etwa Anticholinergika, Beta-Rezeptorblockern, Ergotamin, tri- und tetrazyklischen Antidepressiva etc., kann ebenso einen Einfluss auf die Befeuchtung der Augenoberfläche haben. Hier ist besonders hervorzuheben, dass auch die Einnahme von Antihistaminika zur Entstehung eines Trockenen Auges beitragen kann. Diese Tatsache ist insofern von Bedeutung, da zahlreiche Personen, die an Konjunktivitis leiden, mit Antihistaminika behandelt werden. In Wahrheit leiden aber viele von ihnen nicht an einer Allergie sondern am SNAK-Syndrom. Die Einnahme von Antihistaminika ist somit nicht nur wirkungslos, sondern kann ganz im Gegenteil, auch zur Entstehung eines Sicca-Syndroms beitragen [9]. Weitere Ursachen der Keratokonjunktivis sicca können sein: Fehlsichtigkeit, Office-Eye-Syndrom (Verminderung der Blinzelfrequenz), Kosmetika (Make-up kann zu einer Destabilisierung des Tränenfilms führen), Verletzungen, gestörter Tränenabfluss und infolgedessen Ansammlung von Bakterien, falsche Ernährung (insbesondere Vitamin A-Mangel) [9]. Nicht zu unterschätzen sind jedoch auch die Faktoren Stress und psychische Belastung. So wie wir bei Freude oder Trauer weinen, ist auch denkbar, dass das Trockene Auge psychischen Einflüssen unterliegt [3]. In Zukunft wird das Thema Umwelt hinsichtlich der Entstehung des Sicca-Syndroms immer mehr an Relevanz gewinnen. Das umweltinduzierte Trockene Auge kann durch Zigarettenrauch, Ozon aber auch durch Feinstaub, wie aktuelle Forschungsergebnisse an der Univ.-Augenklinik Graz belegen, entstehen. Besonders aggressiv auf die Tränenflüssigkeit wirken diese schädlichen Partikel jedoch erst in Kombination mit UV-Licht. Die Inhaltsstoffe der Tränen können zerstört werden und trockene Stellen an der Kornea entstehen [9]. 12 1.3.4 Symptome und Diagnostik Die Patienten, die an einem Sicca-Syndrom leiden, klagen in erster Linie über müde Augen, Augenbrennen, Fremdkörpergefühl, Photophobie, Juckreiz und Sehstörungen [13]. Die Diagnostik beginnt mit einer ausführlichen Anamnese. In diesem Erstgespräch sollte geklärt werden, seit wann der Patient an diesen Beschwerden leidet und was er bisher dagegen unternommen hat. Hilfreich bei der Einschätzung des Schweregrads der Symptomatik sind zwei standardisierte Fragebögen. Der „Ocular Surface Disease Index©“ Fragebogen beinhaltet 12 Fragen, Beschwerden und Lebensstileinschränkungen betreffend, die der Arzt dem Patienten stellt. Mithilfe einer mathematischen Formel wird ein Wert errechnet, welcher dann in einer Tabelle eingetragen wird. Mit einer Skala kann dann der Schweregrad des Sicca-Syndroms bestimmt werden. Der „Symptom Assessment iN Dry Eye©“ Fragebogen dient dazu, die Veränderungen der Symptomatik des Patienten hinsichtlich der Häufigkeit der Beschwerden und dem Schweregrad im Vergleich zum letzen Arztbesuch zu erfassen [9]. Liegt nun, basierend auf der beschriebenen Symptomatik des Patienten und der Anamnese, der Verdacht auf ein Trockenes Auge vor, ist eine zielgerichtete Diagnostik erforderlich. Begonnen wird mit einer Spaltlampenuntersuchung. Die Spaltlampe (Abbildung 4), das wohl wichtigste „Werkzeug“ des Ophthalmologen, ist eine Art Mikroskop mit spezieller Beleuchtungstechnik. Mit dieser Untersuchungsmethode lassen sich Rötungen, Schwellungen, Austrocknungsstellen sowie Ansammlungen von verdicktem Sekret und Schleim an der Augenoberfläche und den Lidkanten nachweisen [9]. Abbildung 4: Spaltlampe 13 Die Augenlider und Lidkanten sollten genauer inspiziert werden. Bei einer Blepharitis (=Entzündung der Augenlider) können die Augenlider gerötet und verdickt sein. Die Ausführungsgänge der Meibom-Drüsen können im Rahmen einer Meibom-Drüsen-Dysfunktion verstopft sein, was zur Folge hat, dass die Stabilität des Tränenfilms herabgesetzt wird. Ebenso kann der Tränensee über der hinteren Lidkante des Unterlids (Tränenmeniskus) erniedrigt sein. Das ist ein wichtiger diagnostischer Hinweis für ein Trockenes Auge [9]. Ein weiteres diagnostisches Kriterium stellen die sogenannten Lid Parallel Conjunctival Folds (LIPCOF) dar. Leidet ein Patient an der Keratokonjunktivitis sicca, so können aufgrund erhöhter Reibungskräfte zwischen den Lidern und der Bindehaut diese lidkantenparallelen Bindehautfalten entstehen und je nach Anzahl und Größe in 4 Grade eingeteilt werden [9]. Bei Patienten, die am Sicca-Syndrom erkrankt sind, kann auch die Fluoreszein-Break Up Time (F-BUT) verkürzt sein. Um diesen Test durchführen zu können, wird dem Patienten ein Papierstreifen, getränkt mit Fluoreszein kurz ans Unterlid gehängt. Die Tränenflüssigkeit nimmt den Farbstoff auf und der Patient wird aufgefordert, einmal zu blinzeln und danach ohne weiteres Blinzeln geradeaus zu sehen. Mit Hilfe der Spaltlampe kann der Ophthalmologe nun beobachten, wann die ersten Risse im Tränenfilm, der aufgrund des Farbstoffes sichtbar ist, auftreten. Als normal wird ein Wert von mehr als zehn Sekunden eingestuft. In Abbildung 5 ist das Aufreißen des Tränenfilms mit einem Pfeil gekennzeichnet [9]. Abbildung 5: F-BUT 14 Besonders relevant in Bezug auf das Thema dieser Diplomarbeit ist die Beurteilung der Lipidinterferenz, mit deren Hilfe Aussagen über die Lipidschicht des Tränenfilms getroffen werden können. Mit der Spaltlampe wird das zu untersuchende Auge beleuchtet, und aufgrund des Musters und der Farbe der entstehenden Interferenzen kann man auf die Dicke der Lipidschicht rückschließen [9]. Ein weiteres diagnostisches Werkzeug zur Erkennung einer Keratokonjunktivitis sicca ist die Färbung der Augenoberfläche. Fluoreszein wird für die Färbung der Hornhaut (Abbildung 8), Bengalrosa (Abbildung 6) und Lissamingrün (Abbildung 7) für die Untersuchung der Bindehaut verwendet. Mit Hilfe dieser Methode können krankhafte Veränderungen der Augenoberfläche sichtbar gemacht werden, die man ohne Farbstoff eventuell nicht als solche erkannt hätte [9]. Abbildung 8: Fluoreszein Abbildung 7: Lissamingrün Abbildung 6: Bengalrosa Will man herausfinden, ob die Sekretionsleistung der Tränendrüse ausreichend ist, stellt der Schirmer Test, der schon 1903 erstmals angewendet wurde, eine gute Methode dar. Wie in Abbildung 9 ersichtlich, wird auf beiden Seiten jeweils ein Filterpapierstreifen an den äußeren Augenwinkel eingehängt und der Patient wird gebeten, die Augen für fünf Minuten geschlossen zu halten. Anschließend wird das Filterpapier wieder entnommen und die Befeuchtung der Streifen in Millimetern abgemessen. Ein Wert von über zehn Millimeter gilt als normal [9]. 15 Abbildung 9: Schirmer Test Differentialdiagnostisch (z.B bei einer Herpes-Infektion) stellt die Überprüfung der Hornhautsensibilität mithilfe eines Nylonfaden-Ästhesiometers eine wichtige Untersuchungstechnik da. Die Sensibilität der Kornea kann jedoch auch bei schweren Formen des Trockenen Auges herabgesetzt sein [3, 9]. Bei Verdacht auf eine Keratokonjunktivitis sicca sollte auch überprüft werden, ob ein ungestörter Abfluss der Tränenflüssigkeit über die ableitenden Strukturen (siehe Kapitel 1.2.3) möglich ist. Eine Möglichkeit zur Durchführung dieser Untersuchung stellt der Fluoreszein-Clearance-Test dar. Hierbei wird Fluoreszein auf die Augenoberfläche aufgebracht und nach einem Zeitintervall von 1, 10, 20 und 30 Minuten mittels eines Filterpapierstreifens ermittelt, ob noch Farbstoff nachweisbar ist. Normalerweise sollte sich binnen 20 Minuten kein Farbstoff mehr auf der Augenoberfläche befinden [9]. Tränenflüssigkeit kann auch, labortechnisch untersucht werden. Im Rahmen dieser Diplomarbeit haben wir von dieser Möglichkeit Gebrauch gemacht. Näheres dazu im Kapitel 2. Die Gefrierkristallisation stellt eine neue Methode da, mit der Tränenflüssigkeit analysiert werden kann. Hierbei wird ein Mikroliter dieser Flüssigkeit auf einen Objektträger aufgebracht und tiefgefroren. Nach 24 Stunden kann das gefriergetrocknete Kristallisationsmuster untersucht und mit Vorlagen von gesunder Tränenflüssigkeit verglichen werden [9]. Hat man nun die Diagnose „Sicca-Syndrom“ verifiziert, stellt sich die Frage, wie man diese Erkrankung therapieren kann. Auf die Therapie der Keratokonjunktivitis sicca werde ich nur 16 in groben Grundzügen eingehen, da dies sonst den Rahmen dieser Diplomarbeit überschreiten würde. 1.3.5 Therapie Ein Sicca-Syndrom zu therapieren stellt oft eine Herausforderung dar, da diesem Krankheitsbild meist ein multifaktorieller Prozess zugrunde liegt und die Therapie daher komplex sein muss [3]. In den meisten Fällen können die Beschwerden eines Patienten mithilfe einer Substitutionstherapie in Form von Tränenersatzmitteln gemildert werden. Hier stehen mittlerweile eine Fülle von Produkten mit verschiedenen Inhalts- und Wirkstoffen zur Auswahl. Die Hyaluronsäure zählt zu den am häufigsten verwendeten Mitteln und findet in zahlreichen Tränenersatzpräparaten ihre Verwendung. Neben der Hyaluronsäure gibt es aber noch zahlreiche andere Möglichkeiten, wie etwa Zellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Carbomer, lipidhältiger Tränenersatz, Vitamin A und noch einige mehr [9]. Bei der Wahl eines Produktes sollte man jedoch auf darin enthaltene Konservierungsstoffe achten, welche dazu dienen, eine Kontamination mit Keimen zu verhindern. Diese können bei regelmäßiger Anwendung zu Augenreizungen und -entzündungen führen. Bei Ein-DosisSystemen ist kein Konservierungsmittel zugesetzt, da der gesamte Inhalt bei einer Anwendung aufgebraucht wird [9]. Neben Tränenersatzmitteln gibt es jedoch auch noch andere Therapieformen. Liegt der Keratokonjunktivitis sicca beispielsweise eine Fehlfunktion der Meibom-Drüsen zugrunde, so können Erwärmung und Massagen der Lidränder sowie entzündungshemmende und antibakterielle Medikamente Linderung verschaffen. Beim Sjögren-Syndrom stellt die Anregung der Produktion von Tränenflüssigkeit mithilfe von Parasympathomimetika eine gute Therapieoption dar [9]. Unterstützend zur Schuldmedizin können auch komplementäre Heilmethoden wie Ayurveda, Kampo, Homöopathie, Schüßler-Salze, Heilkräuter, Akupunktur eingesetzt werden. Da wie in Kapitel 1.3.3 besprochen auch psychische Ursachen Auslöser für ein Trockenes Auge sein können, stellt sich oft eine psychotherapeutische Therapie als hilfreich dar [9]. 17 Bei schweren Formen des Trockenen Auges, wo die bisher besprochenen Therapien nicht mehr den gewünschten Erfolg erzielen, besteht die Möglichkeit eines operativen Eingriffs. Abhängig von der Ursache des Sicca-Syndroms, stehen verschiedene Operationstechniken zur Auswahl [9]. Wie in Kapitel 1.3.3 bereits erwähnt, kann die Ursache eines Trockenen Auges umweltbedingt sein. Um zu verstehen, wieso Pollen Auslöser eines SNAK-Syndroms und demzufolge, mitverantwortlich für eine Keratokonjunktivitis sicca sein können, werden zuerst einige Grundlagen erläutert. 1.4 Pollen 1.4.1 Allgemeines Pollen oder Blütenstaub wird von Samenpflanzen (Spermatophytina, Blütenpflanzen) gebildet. Für die Entstehung und das Wachstum neuer Sprösslinge sind die männlichen (Staubblätter mit den Pollen) und weiblichen Fortpflanzungsorgane (Furchtblätter mit der Eizelle) der Pflanze wichtig. Hier kann man zwischen einhäusigen (monözischen), zweihäusigen (diözischen) Pflanzen und Zwitterblüten unterscheiden. Bei einhäusigen sind männliche und weibliche Blüten getrennt voneinander auf einer Pflanze vorhanden (Abbildung 10). Zweihäusig bedeutet, dass es männliche und weibliche Pflanzen gibt, wobei die männlichen nur männliche Blüten und die weiblichen nur weibliche Blüten besitzen. Die meisten Samenpflanzen haben jedoch zweigeschlechtliche Blüten (Zwitterblüten). Das heißt männliche und weibliche Fortpflanzungsorgane sind auf derselben Blüte vereinigt [14]. 18 weiblich männlich männlich Abbildung 10: Männlicher und weiblicher Blütenstand eines Haselstrauchs 1.4.2 Pollenentwicklung Die Pollenentwicklung beginnt mit der Bildung von Pollensäckchen in den Antheren, das sind die oberen Teile des Staubblattes. Es entstehen sogenannte Pollenmutterzellen. Die weitere Entwicklung kann in zwei Phasen, die Mikrosporogenese und die Mikrogametogenese, unterteilt werden. Während der Mikrosporogenese entstehen aus dem Nukleus der Pollenmutterzellen durch eine meiotische Teilung vier haploide Nuklei. Diese Mikrosporen sind durch eine dicke Wand getrennt, jedoch löst sich diese im weiteren Verlauf auf und es bilden sich große Vakuolen. Nun beginnt die zweite Phase der Pollenentwicklung, die miotische Teilung des Nukleus der Mikrospore und eine asymmetrische Zellteilung. Durch diese Mikrogametogenese sind nun eine vegetative und eine generative Zelle entstanden, das heißt ein Pollenkorn enthält nun zwei Kerne bzw. einige Pollenarten können auch drei Kerne enthalten. Die Pollenkornentwicklung ist nun abgeschlossen und die dehydrierten reifen Pollenkörner werden von den Antheren freigegeben [15]. Pollenkörner sind durch eine Zellwand geschützt die sich in eine innere Schicht (Intine) und eine äußere Schicht (Exine) unterteilt. Die äußere Schicht ist aus Sporopollenin aufgebaut. Anhand dieses Sporopollenin, das Pollenkörner extrem widerstandfähig gegen extreme 19 Umweltbedingungen macht, kann man verschiedene Pollenarten erkennen und identifizieren (Abbildung 11) [15]. Die äußere Hülle ist jedoch an einigen Stellen schwächer ausgebildet. Diese Stellen werden Aperturen genannt. Hier kann die Intine als Pollenschlauch hindurch wachsen, wenn es zur Bestäubung kommt. Diese Keimöffnungen dienen aber auch dazu, Proteine auszuschütten, sobald das Pollenkorn hydriert wird [16]. Abbildung 11: Pollen im Elektronenmikroskop 1.4.3 Die Aufgabe des Pollenschlauchs und seiner darin enthaltenen Enzyme im Rahmen der pflanzlichen Befruchtung Im Rahmen der pflanzlichen Befruchtung spielen die in Pollen enthaltenen Enzyme eine wichtige Rolle. Am menschlichen Auge können aber genau diese Substanzen schwere Reaktionen hervorrufen. Um die Wirkung der Enzyme, speziell der Lipase, am menschlichen Auge besser verstehen zu können, ist es hilfreich, sich den pflanzlichen Befruchtungsvorgang näher anzusehen. 20 b a c d Abbildung 12: Schematische Darstellung des Befruchtungsvorgangs Die reifen Pollenkörner werden beispielsweise durch den Wind vertragen (Abbildung 12, a). Trifft das Pollenkorn auf den weiblichen Teil einer geeigneten Blüte, die Narbe, (dieser Vorgang wird Bestäubung genannt) beginnt der Befruchtungsvorgang (Abbildung 12, b). Das dehydrierte Pollenkorn schwillt durch Wasseraufnahme an und beginnt innerhalb von 40-60 Minuten mit der Ausbildung eines Pollenschlauchs (Abbildung 12, c) [15]. Dieser Pollenschlauch wächst durch den Griffel bis zur weiblichen Samenanlage (Abbildung 12, d) in sehr raschem Tempo. Je nach Pollenart kann das Pollenschlauchwachstum bis zu 21 1 cm pro Stunde betragen und es kann eine Länge von bis zu 5 cm erreicht werden. Ziel dieses Vorgangs ist es, den Spermakern in die weibliche Samenanlage zu befördern, damit es zur Befruchtung kommen kann. Hat der Pollenschlauch die Eizelle erreicht, kommt es zur Verschmelzung von Spermakern und Eizelle und ein neuer Keimling entsteht [15, 17]. Der Vorgang der Bestäubung, Keimung und des Pollenschlauchwachstums ist an die Aktivität von zahlreichen Enzymen gebunden. Bereits bei der Hydrierung, am Beginn der Bestäubung, werden durch die Aperturen viele Proteine freigesetzt. Diese Proteine sind für die Keimung, Entwicklung und speziell für die Durchdringung des Pollenschlauchs bis zur Eizelle notwendig [16]. Ein Teil dieser freigesetzten Enzyme sind Proteasen. Das sind Proteine, die eine proteolytische Aktivität besitzen und somit andere Eiweiße hydrolytisch abbauen können [18, 19]. Auch Lipasen, das sind Enzyme die von Lipiden freie Fettsäuren abspalten, spielen eine Rolle in der Keimung des Pollenkorns und des Pollenschlauchwachstums. Die Hauptaufgabe von Lipasen, bei denen es sich um Proteinstrukturen handelt, ist die Produktion von second-messengern im Pollenschlauch. Eine erhöhte Ca2+-Konzentration im Cytosol des Pollenschlauchs ist für das Wachstum notwendig. Auch Richtungsänderungen werden durch diese Calciumionen-Konzentration induziert. Ebenso sind in der Spitze des Schlauchs sekretorische Vesikel lokalisiert, welche laufend für Nachschub an Zellwandmaterial und Lipidmembran sorgen. Es gibt noch zahlreiche andere Vorgänge im Pollenschlauch, die für sein Wachstum verantwortlich sind. Für all diese Funktionen sind Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) und seine Derivate von entscheidender Bedeutung. PIP2 wird durch Phospholipasen gespalten. Diese Derivate, wie zum Beispiel Inositol-1,4,5,-trisphophate (IP3) und Diacyl-glycerol (DAG) fungieren als second-messenger im Pollenschlauch. PIP2 und IP3 sind für die Erhaltung des Ca2+-Gradienten und für die Vesikelsekretion wichtig [15, 19, 20]. Lipasen sind nicht nur für das Pollenschlauchwachstum wichtig, sondern spielen schon eine Rolle bei der Hydrierung des Pollenkorns, nachdem sie auf der Narbe, auch Stigma genannt, gelandet sind. Grundsätzlich kann man zwischen Pflanzen unterscheiden, die eine trockene oder eine feuchte Narbe haben. Die mit dem feuchten Stigma sind mit einer klebrigen Schicht überzogen. Pollenkörner, welche für die Bestäubung von Pflanzenarten mit einer trockenen Narbe bestimmt sind, benötigen das Protein EXL4 (extracelluläre lipase 4), welches sich in 22 der Pollenhülle befindet. EXL4 spielt eine entscheidende Rolle für den Beginn der Hydratisierung des Pollenkorns. Es ist noch nicht vollständig geklärt, wie die Flüssigkeit innerhalb der Narbe das Pollenkorn erreicht. Man vermutet jedoch, dass durch die Lipaseaktivität Lipide an der Oberfläche der Narbe hydrolisiert werden und somit Wasser zur Hydrierung der Pollen austreten kann [21]. Die pflanzliche Befruchtung wäre ohne Lipasen, Proteasen und anderen Enzymen nicht möglich. Für den Menschen können aber eben diese Proteine unerwünschte Reaktionen hervorrufen. 1.5 Das SNAK-Syndrom In der Pollenflugsaison können gerötete, juckende, tränende und verklebte Augen (Abbildung 13) aber auch ein Trockenes Auge Symptome einer Allergie oder aber auch einer saisonalen nicht-allergischen Konjunktivitis (SNAK) sein [18]. Abbildung 13: Stark gerötetes, rinnendes Auge 1.5.1 Ursachen Es wurde in einer Studie bereits nachgewiesen, dass Pollen Proteasen freisetzen, sobald sie mit der Augenoberfläche in Kontakt kommen. Diese Proteasen sind in der Lage, Proteine zu zerstören. Betroffen sind hier vor allem die Eiweiße, welche sich in der wässrigen Schicht des Tränenfilms befinden. Der Tränenfilm verliert dadurch seine Stabilität. Ebenso werden durch 23 die sezernierten Proteasen Lysozym und Lactoferrin zerstört, die aber für die Bakterienabwehr notwendig sind. Bindehautzellen werden ebenso durch die Proteasen angegriffen. Doch nicht jeder Mensch ist gleich betroffen. Physiologisch sind Antiproteasen in unseren Körperflüssigkeiten vorhanden, jedoch können sich beispielsweise aufgrund einer unzureichenden Produktion von Tränenflüssigkeit zu wenig Antiproteasen an der Augenoberfläche befinden. Diese Personen sind den eiweißspaltenden Enzymen somit schutzlos ausgeliefert [18]. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wird untersucht, ob nicht auch die in den Pollen enthaltenen Lipasen ein SNAK-Syndrom auslösen können. Es ist aber zu vermuten, dass neben Proteasen und Lipasen noch zahlreiche andere Enzyme zur Entstehung der saisonalen nicht-allergischen Konjunktivitis beitragen. Die Erforschung dieses Syndroms steht somit erst am Beginn. 1.5.2 Diagnostik Um abzuklären, ob es sich um ein SNAK-Syndrom handelt, sollte man einen Allergietest (z.B. Prick-Test) durchführen lassen. Ist dieser negativ, versprechen antiallergische Medikamente keine Linderung der Symptome, da sich hinter der saisonalen nicht-allergischen Konjunktivitis nachweislich keine allergische Reaktion verbirgt [18]. 1.5.3 Therapie Zurzeit gibt es noch keine Medikamente, die Menschen mit SNAK-Syndrom helfen, da diese Erkrankung noch zu wenig erforscht ist. Man kann nur allgemein gültige Ratschläge geben, wie etwa Fenster erst nach Regenfällen zu öffnen sowie lange Aufenthalte im Freien während der Pollenflugsaison zu meiden. Ebenso kann man die Beschwerden eines SNAK-Syndroms wie etwa ein Trockenes Auge mit Tränenersatzmitteln lindern [18]. 24 2 Material und Methoden 2.1 Tränenflüssigkeit 2.1.1 Allgemeines Um Tränenflüssigkeit von freiwilligen Probanden gewinnen zu dürfen, war zuerst die Genehmigung der Ethikkommission der Medizinischen Universität Graz erforderlich. Jene Probanden, die sich freiwillig für diese Studie zur Verfügung stellten, erhielten detaillierte Informationen über das Prozedere und eine Einwilligungserklärung, die sorgfältig durchgelesen und unterschrieben werden musste (siehe Anhang). 2.1.2 Gewinnung Um das Auge zu reizen und die Tränenproduktion zu steigern, wurde Chinaöl (BIO-DIÄT-BERLIN GmbH, Deutschland) auf das rechte bzw. linke Jochbein des Probanden aufgetragen, abhängig davon ob man am rechten bzw. am linken Auge die Tränen abnahm. Man führte nun eine sterile 50 µl Glaskapillare (Blaubrand®, Brand GmbH & Co KG, Wertheim, Deutschland) an die Innenseite des Unterlides heran, und die in der Konjunktiva fornicis angesammelte Tränenflüssigkeit floss hinein (Abbildung 14). Abbildung 14: Tränenabnahme an freiwilliger Probandin 25 Für das weitere Vorgehen war entscheidend, für welchen Zweck die Tränen verwendet werden sollten. Für die Versuche im Labor der Univ.-Augenklinik Graz wurde die in der Kapillare gesammelte Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß (Eppendorf-Hütchen) überführt und fünf Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert. Durch Zentrifugation werden unerwünschte Bestandteile, wie etwa Schleim- oder Epithelablagerungen, aus der Tränenflüssigkeit entfernt. Jene Tränen, die man zur Lipidanalyse an das Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung, Medizinische Universität Graz (ZMF) übermittelte (siehe Kapitel 2.6) wurden nicht in ein Eppendorf-Hütchen überführt, sondern bis zur Weiterverwendung in einem Kulturröhrchen aus Glas (Pyrex® Kulturröhrchen, SciLabware Limited, Stone, Großbritannien) gepoolt. Dieses wurde rasch verschlossen, um die Kontaktzeit mit Luftsauerstoff so kurz wie möglich zu halten, da O2 durch Oxidation der Lipide zu einer Verfälschung der Ergebnisse beitragen kann. Wie bereits in Kapitel 1.2.4 beschrieben, kann es durch produktionsbedingte Rückstände in den Wänden von Eppendorf-Hütchen zu einer Verunreinigung kommen, was die Analyse der Lipide in der Tränenflüssigkeit verfälschen kann. Durch das Chinaöl wird der Tränenfluss künstlich stimuliert. Daher ist zu beachten, dass es möglicherweise Abweichungen in der Konzentration der Träneninhaltsstoffe, im Vergleich zu nicht künstlich stimulierter Tränenflüssigkeit, geben kann. Ebenso kann durch die beschriebene Abnahmetechnik keine Standardisierung gewährleistet werden, da die Intensität des Tränenflusses individuell verschieden ist. Zahlreiche weitere Faktoren, wie etwa Austrocknung aufgrund mangelnder Flüssigkeitszufuhr, beeinflussen ebenfalls die Konzentration der Träneninhaltsstoffe. 26 2.2 Pollen 2.2.1 Sammlung Die für die Versuche benötigten männlichen Blütenstände, welche die Pollen enthalten, wurden von den Biomedizinischen Analytikerinnen der Universitäts-Augenklinik Graz gesammelt. Nach der Sammlung wurden diese Blütenstände getrocknet, gesiebt und anschließend bei Raumtemperatur in Papiertüten gelagert. Es wurden folgende Pollenarten für die Versuche verwendet: Hasel (Corylus avellana) Gesammelt in: Graz, Leibnitz, Deutschlandsberg Dieser lichtbedürftige Strauch, der vorwiegend an Waldrändern zu finden ist, hat seine Hauptblütezeit meist im Februar/März. Die Blütezeit ist jedoch stark abhängig von den Temperaturen (blüht ab etwa 5 ºC). Die Haselpollen zählen zu den mäßig bis starken Allergenen [22]. Erle (Alnus) Gesammelt in: Graz und Leibnitz Die sehr wasserliebenden Erlen findet man bevorzugt an den Ufern von Gewässern. Sie benötigen etwas höhere Temperaturen als die Hasel zum Stäuben, jedoch deckt sich die Hauptblütezeit dieser beiden Pflanzen weitgehend. Wie die Haselpollen haben auch die Pollen der Erle eine mäßig bis starke allergene Potenz [22]. Knäuelgras (Dactylis glomerata) Gesammelt in: Graz und Leibnitz Das Knäuelgras, das häufig auf Wiesen, Wegrändern und Waldlichtungen vorkommt, hat seine Hauptblütezeit von Mai bis Juni. Es können jedoch vereinzelt auch noch Pflanzen im Juli und August blühen. Gräserpollen zählen zu den starken Allergenen. Selbst wenn die 27 Gräser durch regelmäßigen Schnitt nicht zur Blüte gelangen, können winzige Aerosoltröpfchen aus Halmen und Blättern freigesetzt werden, die bei Inhalation zu allergischen Reaktionen führen [22]. Birke (Betula) Gesammelt in: Graz Die Birke, aufgrund ihrer weißen Borke leicht zu erkennen, ist ein lichtliebender Baum und wird wegen ihres raschen Wuchses und attraktivem Äußeren oft als Zierbaum angepflanzt. Die Blütezeit ist sehr stark vom Wetter und von den Temperaturen abhängig. Die Pollenausschüttung beginnt erst ab einer Temperatur von 15 ºC. In Mitteleuropa ist die Hauptblütezeit der Birke meist im April. Birkenpollen sind sehr stark allergen [22]. 2.2.2 Pollenextraktherstellung Um die Polleninhaltsstoffe für die Versuche verwenden zu können, musste ein Pollenextrakt hergestellt werden. Es wurden 100 mg Pollen mit 1000 µl physiologischer Kochsalzlösung, bzw. 20 mg Pollen mit 100 µl Tränen in Eppendorf-Hütchen (für die Versuche im Labor der Univ.-Augenklinik Graz) bzw. in einem Pyrex Kulturröhrchen (für die Lipidanalyse im ZMF) vermischt. Man ließ diese Lösungen nun eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um die gewünschten Stoffe aus den Pollen zu extrahieren. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Gemisch bei 10000 U/min für 4 Minuten zentrifugiert. Der durch die Zentrifugation entstandene Überstand konnte nun für die Versuche weiterverwendet werden. 28 2.3 Vitalitätsfärbung 2.3.1 Allgemeines Da die Pollen bereits im Frühjahr gesammelt und getrocknet wurden, war anzunehmen, dass einige von ihnen aufgrund der langen Lagerzeit und der Lagerbedingungen nicht mehr „vital“ waren. Diese „Vitalität“ wurde mit Hilfe einer Lactophenolblau-Färbung überprüft, bei der sich die morphologisch intakten Pollenkörner blau anfärben [23]. 2.3.2 Durchführung Für diesen Versuch wurden Hasel-, Erlen-, Knäuelgras- und Birkenpollen mit einer Pipettenspitze auf je einen Objektträger platziert und unter mikroskopischer Begutachtung mit je 5 µl Lactophenolblau Farblösung (Anstaltsapotheke, LKH Graz) rehydriert. 2.4 Enzymfreisetzung 2.4.1 Allgemeines Wie in Kapitel 1.4.3 erläutert, quellen dehydrierte Pollen in vivo durch Hydration auf, sobald sie auf der Narbe gelandet sind und geben Enzyme frei. Um nun aber auch das Austreten der Enzyme zu beweisen und sichtbar zu machen, haben wir diese angefärbt. Da es sich bei diesen um Proteine handelt, wurde ein blauer, proteinfärbender Farbstoff (Serva-Blue) verwendet, der sich an die basischen Seitenketten der Aminosäuren anlagert und die Proteine somit blau anfärbt [24]. 29 2.4.2 Durchführung 2.4.2.1 Rehydrierung der Pollen Gesiebte Hasel-, Birken- und Knäuelgraspollen wurden auf einen Objektträger aufgebracht und 5 µl destilliertes Wasser darauf pipettiert. Man konnte nun die Hydratisierung der Pollen bei 100-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop beobachten. 2.4.2.2 Pollen/Serva-Blue Mit Hilfe einer Pipettenspitze wurden gesiebte Hasel- und Knäuelgraspollen auf je einen Objektträger aufgebracht und zuerst mikroskopisch auf ihre Reinheit begutachtet. Man pipettierte anschließend 5 µl Serva-Blue Farblösung (SERVA Blue R, SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland) auf die sich am Objektträger befindenden Pollen und beobachtete die Reaktion bei 200-facher Vergrößerung. 2.4.2.3 Pollen/Serva-Blue/Tränenflüssigkeit Es wurden wieder Hasel- und Knäuelgraspollen auf je einen Objektträger aufgebracht und 10 µl Tränenflüssigkeit darauf pipettiert. Unter mikroskopischer Beobachtung fügten wir noch 10 µl Serva-Blue Farblösung hinzu. 2.5 Lipasenachweis mittels modifiziertem Olivenöl-Rhodamin B-Agar nach Kouker und Jäger 2.5.1 Allgemeines Um die Pollen bzw. Tränen auf Lipaseaktivität testen zu können, benötigt man einen besonders aufbereiteten Agar. Der von uns hergestellte und modifizierte Agar basiert auf einer Anleitung aus dem Jahr 1987 von Kouker und Jäger, die damit bakterielle Lipaseaktivität nachgewiesen hatten. 30 Die anfängliche Überlegung zur Modifizierung des Agars für unsere Versuche hatte das Ziel, die Zusammensetzung des Agars so zu verändern, dass dieser nicht mehr als Wachstumsmedium für Bakterien fungiert. Der modifizierte Agar wurde anschließend getestet. Es wurde Serum, das mit Sicherheit Lipasen enthält, aufgetragen. Es war jedoch keine Lipasereaktion auf dem Agar erkennbar. Bei der Herstellung einer neuen Agarplatte wurde nun Natriumchlorid der Flüssigkeit beigemengt und der saure pH-Wert auf einen leicht basischen gesenkt. Mit dieser neuen Rezeptur konnte auf den Agarplatten Lipaseaktivität im Serum nachgewiesen werden. Durch Lipaseaktivität werden die im Olivenöl enthaltenden Lipide gespalten. Es entstehen freie Fettsäuren, die mit dem Rhodamin B reagieren. Diese Bereiche fluoreszieren unter UV-Bestrahlung bei 365 nm. Der genaue molekulare Vorgang, der zu dieser Fluoreszierung führt, ist noch nicht vollständig geklärt [25]. 2.5.2 Herstellung Für die Herstellung des Agars wurden 1,0 g Agar (Agar reinst, gepulvert, Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und 0,4 g Natriumchlorid (NaCl, zur Analyse, Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) eingewogen und auf 100 ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Dieses Gemisch wurde danach für 50 Sekunden bei 600 Watt in der Mikrowelle erwärmt, geschüttelt und nochmals für 30 Sekunden erhitzt. Danach war die Flüssigkeit klar und der Agar vollständig gelöst. Mittels eines Thermometers wurde anschließend die Temperatur der erwärmten Flüssigkeit überprüft. Ein Weiterverarbeiten war erst bei 60 ºC sinnvoll, um eine optimale Lösung des Olivenöls im Gemisch zu gewährleisten. Weiters musste der pH-Wert, der mit Hilfe eines pHMeters (Taschen-pH-Meter pH 330, WTW, Weilheim, Deutschland) und einer pH-Elektrode (Blue Line 23 pH, SCHOTT® Instruments, Mainz, Deutschland) bestimmt wurde, 7,5 betragen. Im Falle eines zu sauren pH Werts konnte man Natriumhydroxid (NaOH, Plätzchen zur Analyse, Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) beifügen bzw. bei einem pHWert von über 7,5 verdünnte Salzsäure (HCl 25 %, Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland). 31 Das Gefäß mit der Flüssigkeit wurde auf einen Magnetrührer mit integrierter Wärmeplatte (IKA-Combimag-RCT, IKA® Werke GmbH & Co KG, Staufen, Deutschland) gestellt. Somit wurde auch eine Konstanthaltung der Temperatur gewährleistet. Unter ständigem Rühren wurden 3,1 ml handelsübliches, nicht steriles Olivenöl (Natives Olivenöl extra, Iliada) und 1,0 ml Rhodamin B-Stammlösung, bestehend aus 40 mg Rhodamin B (Rhodamin B, R6626, Sigma-Aldrich Handels GmbH, Wien, Österreich) und 40 ml destilliertem Wasser langsam hinzu pipettiert. Das nun rosa gefärbte Gemisch wurde mit einem Handmixer zu einer homogenisierten Masse weiterverarbeitet. Der dadurch entstehende Schaum an der Oberfläche der Flüssigkeit konnte durch eine zehnminütige Inkubation bei 60 ºC reduziert werden. Vier steril verpackte Petrischalen wurden mit je 20 ml der homogenen Masse gefüllt. Der Agar musste anschließend auskühlen und wurde dadurch fest (Abbildung 15). Abbildung 15: Olivenöl-Rhodamin B-Agar 2.5.3 Lipaseaktivitätsnachweis Nachdem die Agarplatten wie in Kapitel 2.5.2 beschrieben hergestellt wurden, konnten sie nun für die weiteren Versuche verwendet werden. Mit Hilfe einer abgeschnittenen 32 Glaspasteurpipette (Pasteurpipette aus Natron-Kalk-Glas, Brand GmbH & Co KG, Wertheim, Deutschland) wurden kreisrunde Löcher mit einem Durchmesser von zwei Millimetern ausgestanzt und der Inhalt der Löcher mit einem kleinen Spatel entfernt. In diese Löcher wurden nun jeweils die verschiedenen Substanzen, die auf Lipaseaktivität getestet werden sollten, pipettiert. Bei jedem Versuch dienten zusätzlich 10 µl physiologische Kochsalzlösung in einem eigenen Loch als Kontrolle, um eine falsch positive Reaktion ausschließen zu können. 2.5.3.1 Verdünnungsreihe Um die Lipasereaktionen auf den Agarplatten standardisieren zu können, wurde aus Serum eine Verdünnungsreihe von 1:2 bis 1:256 hergestellt (Tabelle 1). Die Lipaseaktivität im Serum wurde mit 30 U/L vom Klinischen Institut für Medizinische und Chemische Labordiagnostik, LKH Graz bestimmt. Konzentration Konzentration [U/L] [nkat] Unverdünnt 30 500,1 1:2 15 250,1 1:4 7,5 125,0 1:8 3,8 62,5 1:16 1,9 31,3 1:32 0,9 15,6 1:64 0,5 7,8 1:128 0,2 3,9 1:256 0,1 1,6 Verdünnung Tabelle 1: Serum-Verdünnungsreihe 33 Jeweils 10 µl der Verdünnung und des unverdünnten Serums wurden auf den Agarplatten aufgetragen und für 20 Stunden bei 37 ºC im Brutschrank inkubiert. Hinsichtlich der Tatsache, dass Kouker und Jäger in ihrer Arbeit den niedrigsten detektierbaren Lipasewert mit 1 nkat angeben haben, nahmen auch wir eine Umrechnung von U/L in nkat vor. Um den Zusammenhang zwischen Lipasekonzentration und Größe der fluoreszierenden Höfe wie bei der Serum-Verdünnungsreihe ebenso auch bei Pollen beweisen zu können, stellten wir zwei Verdünnungen (1:2 und 1:4) mit Pollenextrakt des Knäuelgrases her. Die Pollenextraktherstellung wurde bereits in Kapitel 2.2.2 beschrieben. Der Überstand wurde aus den Eppendorf-Hütchen mit eine Pipette entnommen und steril filtriert. Die Filtration mit einer Porengröße von 0,2 µm (Syringe Filters, Nalgene® Labware, Roskilde, Dänemark) diente der Vermeidung von Kontamination und der Reduktion unerwünschter Bestandteile, die beim Sieben nicht entfernt werden konnten. Analog zur Serum-Verdünnungsreihe wurden nun jeweils 10 µl des unverdünnten Extraktes sowie die Verdünnung am Agar aufgetragen und bei 37 ºC für 20 Stunden inkubiert. 2.5.3.2 Lipaseaktivitätsnachweis – Pollen Es gibt in der Natur zahlreiche verschiedene Pollenarten, die sich nicht nur durch ihr Aussehen, sondern auch aufgrund ihrer allergenen Potenz voneinander unterscheiden. Somit ist zu vermuten, dass auch hinsichtlich der Auslösung des SNAK-Syndroms Unterschiede zwischen den einzelnen Gattungen bestehen. Um die Lipaseaktivität von verschiedenen Pollenarten vergleichen zu können, stellen wir eine Agarplatte her, auf die folgende steril filtrierte Extrakte (Extraktherstellung siehe Kapitel 2.2.2) aufgetragen wurden: · 10 µl Haselpollenextrakt · 10 µl Erlenpollenextrakt · 10 µl Birkenpollenextrakt · 10 µl Knäuelgraspollenextrakt Als Negativkontrolle wurde physiologische Kochsalzlösung mitgeführt. Nach dem Auftragen der Proben auf dem Agar wurde dieser für 20 Stunden bei 37 ºC inkubiert. 34 2.5.3.3 Lipaseaktivitätsnachweis - Pollen/Tränen Wie bereits in Kapitel 1.5.1 beschrieben ist es notwendig, dass die Pollenkörner an die Augenoberfläche gelangen, um das SNAK-Syndrom auslösen zu können. Dort kommen sie mit der Tränenflüssigkeit in Berührung, quellen auf und geben ihre Enzyme frei. Um herauszufinden, ob sich die Lipaseaktivität bei Kontakt der Pollen mit der Tränenflüssigkeit verändert, inkubierten wir verschiedene Pollenarten in Tränenflüssigkeit. Um einen direkten Vergleich zwischen der Lipaseaktivität in den Pollenextrakten und den in Tränen gelösten Pollen zu haben, trugen wir auch Hasel- und Erlenpollenextrakte, sowie Tränenflüssigkeit alleine auf den Agar auf. Zur Kontrolle wurde wiederum der Leerwert mitgeführt. Alle verwendeten Proben wurden nicht steril filtriert, da dafür eine zu große Menge an Tränen notwendig gewesen wäre. Um jedoch die Vergleichbarkeit zu erhalten, wurden auch die Pollenextrakte, die für diesen Agar verwendet wurden, keiner Filtration unterzogen. Es wurden folgende Proben (Herstellung siehe Kapitel 2.2.2) auf die Agarplatte aufgetragen: · 10 µl Tränen · 10 µl Haselpollenextrakt · 10 µl Erlenpollenextrakt · 10 µl Tränen-Haselpollen-Gemisch · 10 µl Tränen-Erlenpollen-Gemisch Nach Auftragen der Proben kam der Agar für 20 Stunden bei 37 °C in den Brutschrank. 35 2.6 Lipidanalyse 2.6.1 Allgemeines Nach Lipaseaktivitätstestung der Pollen mittels modifiziertem Olivenöl-Rhodamin B-Agar nach Kouker und Jäger, stellte sich nun die Frage, welche in der Fettschicht des Tränenfilms enthaltenen Lipide von den Lipasen gespalten werden. Diese Analyse wurde in Zusammenarbeit mit dem ZMF durchgeführt. 2.6.2 Probenvorbereitung Die Tränen wurden von freiwilligen Probanden, wie in Kapitel 2.1.2 beschrieben, abgenommen und in einem Pyrex-Glasgefäß gepoolt. Man benötigte 1 ml Tränenflüssigkeit für die Analyse. Es sind daher 5 Tränenabnahmen erforderlich gewesen, da pro Proband ca. 200 µl Tränenflüssigkeit gewonnen werden konnte. 500 µl von dieser gepoolten Tränenflüssigkeit wurden bei Raumtemperatur gelagert, die anderen 500 µl mit 200 µl Pollenextrakt inkubiert. Es wurden folgende drei Proben an das ZMF geliefert: · 500 µl Tränenflüssigkeit · 700 µl Pollen-Tränen-Gemisch · 500 µl Pollenextrakt Alle Proben wurden in Glasgefäßen aufbereitet und gelagert, um eine Kontamination der Flüssigkeiten, wie in Kapitel 2.1.2 beschrieben, zu vermeiden. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lipaseaktivität in den Proben mit 500 µl Methanol (Methanol, zur Analyse EMPARTA®, Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) gestoppt und diese sofort zur Analyse ins ZMF gebracht. 36 2.6.3 Lipidextraktion Die Lipidextraktion im ZMF erfolgte nach der Anleitung von Bligh und Dyer (1959). 1,25 ml MeOH und 1,25 ml CHCl3 wurden der wässrigen Phase beigefügt. Nach Zugabe von 0,625 ml Aqua bidest. erfolgte eine Auftrennung in zwei Phasen, eine organische und eine wässrige. In der unteren, organischen Phase sammelten sich die Lipide. Diese Phase wurde getrocknet und in 200 µl CHCl3/MeOH 1:1 resuspendiert. 2.6.4 Reversed phase HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist ein Verfahren mit dem man Substanzen trennen und diese auch über Standards identifizieren und quantifizieren kann. Bei diesen chromatographischen Trennverfahren wird die zu untersuchende Substanz zusammen mit einem Laufmittel, der mobilen Phase durch eine Trennsäule gepumpt. Diese Säule enthält die stationäre Phase. Abhängig von der Stärke der Wechselwirkung zwischen den Bestandteilen der zu untersuchenden Substanz und der stationären Phase können manche dieser Bestandteile relativ lange in der Säule verbleiben. Am Ende der Trennsäule werden die zu unterschiedlichen Zeiten erscheinenden Stoffe mit einem Detektor nachgewiesen. Bei der reversed phase HPLC weist die stationäre Phase eine geringere Polarität auf als die mobile Phase [26]. Für die Lipidbestimmung wurde eine Thermo Hypersil GOLD C 18, 100 x 1 mm, 1,9 µm Säule mit einem Laufmittelgradienten verwendet. Laufmittel A bestand aus Wasser mit 1% Ammoniumacetat und 0,1% Methansäure, Laufmittel B aus Acetonitril/2-Propanol 5:2 und 1% Ammoniumacetat sowie 0,1% Methansäure. 2.6.5 Auswertung Die Datenerfassung erfolgte mittels Fourier Transformations Ionen Cyclotron Resonanz Massenspektrometrie (FT-ICR-MS), da dieses Verfahren eine 100-fach höhere Massenauflösung und Genauigkeit als andere Massenspektrometrie-Methoden besitzt. Dabei werden ionisierte Teilchen in einem elektrischen Feld beschleunigt und 37 entsprechend ihrer Masse/Ladungsverhältnisse aufgetrennt. Die Identifizierung der Lipide erfolgte über Retentionszeit, exakte Masse und MS/MS. Die Datenanalyse wurde mit Hilfe der SIEVE Software durchgeführt. 38 3 Ergebnisse 3.1 Vitalitätsfärbung 3.1.1 Birkenpollen Nach dem Aufbringen der Lactophenolblau Farblösung auf die sich am Objektträger befindenden Birkenpollen konnte man unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung beobachten, dass sich der Großteil der Pollen blau anfärbte (Abbildung 16). Abbildung 16: Vitalitätsfärbung - Birke 3.1.2 Knäuelgras Auch die Mehrheit der auf den Objektträger aufgebrachten Knäuelgraspollen färbte sich durch die Lactophenolblaufärbung an (Abbildung 17). 39 Abbildung 17: Vitalitätsfärbung - Knäuelgras 3.1.3 Hasel Wie in Abbildung 18 ersichtlich, kam es bei den Haselpollen nur vereinzelt zu einer Färbung durch die aufgebrachte Farblösung. Diese angefärbten Pollenkörner wiesen ein weit schwächeres Blau auf, als die bereits beschriebenen Birken- und Knäuelgraspollen. Abbildung 18: Vitalitätsfärbung - Hasel 40 3.1.4 Erle Bei den Erlenpollen war im Vergleich zu den sich stark anfärbenden Birken- und Knäuelgraspollen nur eine leichte Blaufärbung erkennbar (Abbildung 19). Die Intensität der Blaufärbung war jedoch stärker als bei den Haselpollen. Abbildung 19: Vitalitätsfärbung - Erle 3.2 Enzymfreisetzung 3.2.1 Rehydrierung der Pollen Das Aufquellen der Pollenkörner nach Zugabe von destilliertem Wasser konnte unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung beobachtet werden. Bereits im dehydrierten Zustand unterschieden sich die Pollenarten in ihrem Aussehen und ihrer Struktur (Abbildung 20). Durch die Flüssigkeitszugabe nahmen die Pollenkörner eine veränderte Gestalt an und die Aperturen kamen gut sichtbar zum Vorschein. Man konnte auch im rehydrierten Zustand Unterschiede zwischen den einzelnen Arten hinsichtlich ihrer Form und der Anzahl der Aperturen feststellen (Abbildung 21). 41 a c a c b b Abbildung 21: dehydrierte Pollenkörner Abbildung 20: rehydrierte Pollenkörner (a) Haselpollenkorn (b) Birkenpollenkorn (c) Knäuelgraspollenkorn 3.2.2 Pollen/Serva-Blue Nach der Zugabe von 5 µl Serva-Blue Farblösung quollen die Pollen auf, und nach dreißig Sekunden konnten unter dem Mikroskop die ersten sprühnebelartigen, durch die Farblösung dunkelblau gefärbten Enzyme vor den Pollenaperturen ausgemacht werden (Abbildung 22, 23). In Laufe der nächsten Minuten setzten immer mehr Pollenkörner Enzyme durch ihre Aperturen frei. 42 Abbildung 22: Enzymfreisetzung - Haselpollen Abbildung 23: Enzymfreisetzung - Knäuelgraspollen 43 Weiters war interessant zu beobachten, dass durch die Enzymausstoßung bei einigen Pollenkörnern die Zellwand beschädigt wurde und die Pollen die für ihre Art charakteristische Form verloren (Abbildung 24). Abbildung 24: Zellwandzerstörung aufgrund Enzymfreisetzung 3.2.3 Pollen/Serva-Blue/Tränenflüssigkeit Da in der Tränenflüssigkeit eine Vielzahl von Proteinen enthalten ist, färbte sich auch diese durch die Serva-Blue Farblösung an. Doch trotz dieser violett-bläulichen Hintergrundfärbung konnte unter dem Mikroskop die Enzymfreisetzung der Pollenkörner an den Aperturen beobachtet werden (Abbildung 25). 44 Abbildung 25: Enzymfreisetzung in der Tränenflüssigkeit 3.3 Lipasenachweis mittels modifiziertem Olivenöl-Rhodamin B-Agar nach Kouker und Jäger 3.3.1 Verdünnungsreihe Nach 20 Stunden Inkubation im Brutschrank konnten die beiden Agarplatten entnommen werden. Auf der Agarplatte der Serum-Verdünnungsreihe entstanden durch die Lipaseaktivität fluoreszierende Höfe an jenen Stellen, wo das Serum aufgebracht wurde (Abbildung 26). Die Durchmesser dieser Ringe konnten nun abgemessen werden und der aufgetragenen Serumkonzentration, die ja bekannt war, gegenübergestellt werden (Tabelle 2). Um das Ergebnis zu verdeutlichen, erstellten wir eine Eichkurve (Abbildung 27), auf der man erkennen kann, dass die Größe der fluoreszierenden Höfe proportional zur Serum- und demnach zur Lipasekonzentration zunimmt. 45 1 2 6 3 4 7 8 5 9 10 Abbildung 26: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragener Serum-Verdünnungsreihe 46 47 Tabelle 2: Ergebnis der Serum-Verdünnungsreihe 48 Abbildung 27: Eichkurve – Lipasekonzentration im Serum Analog zur Serum-Verdünnungsreihe erhielten wir auch für die KnäuelgraspollenVerdünnungsreihe entsprechende Ergebnisse. Mit Abnahme der Pollenextraktkonzentration wurden auch die fluoreszierenden Höfe kleiner, d.h. die Lipaseaktivität geringer (Abbildung 28). Bei Position 1 handelt es sich um den Leerwert und bei Position 2 um das unverdünnte Pollenextrakt. Auf Position 3 wurde die 1:2 und auf Position 4 die 1:4 Verdünnung aufgetragen. 1 2 3 4 Abbildung 28: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragener Pollenextrakt-Verdünnungsreihe 3.3.2 Lipaseaktivitätsnachweis - Pollen Nach 20 Stunden Inkubation entnahm man den Agar, auf dem jeweils 10 µl Pollenextrakt der Hasel, Erle, Birke und des Knäuelgrases aufgebracht worden waren (Abbildung 29). Man konnte nun die Größe der entstandenen fluoreszierenden Höfe betrachten und somit Rückschlüsse auf die unterschiedliche Lipaseaktivität der einzelnen Pollenarten schließen. Auf Position 1 wurde der Leerwert mitgeführt. Bei Position 2 (Haselpollenextrakt) ist lediglich ein sehr kleiner fluoreszierender Ring erkennbar, wohingegen das Erlenpollenextrakt auf Position 3 einen etwas größeren Hof hervorrief. Die Birkenpollen zeigten auf Position 4 49 keinerlei Aktivität. Auf Position 5 (Knäuelgraspollenextrakt) war ein großer fluoreszierender Ring nachweisbar. 1 2 3 4 5 Abbildung 29: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragenen Pollenextrakten 50 3.3.3 Lipaseaktivitätsnachweis - Pollen/Tränen Der Agar wurde nach 20 Stunden Inkubation bei 37 °C entnommen (Abbildung 30). Position 1 war auch bei dieser Agarplatte der Leerwert. An dieser Stelle war keine Reaktion ersichtlich, womit wir eine falsch positive Reaktion ausschließen konnten. Durch die Tränenflüssigkeit auf Position 2 war ein mittelgroßer fluoreszierender Hof entstanden, was belegt, dass auch in der menschlichen Tränenflüssigkeit Lipasen enthalten sind. Das Haselpollenextrakt auf Position 3 rief nur einen kleinen Ring hervor, wohingegen das Pollenextrakt der Erle einen etwas größeren fluoreszierenden Ring bildete. Das Tränen-Haselpollengemisch auf Position 4 und das Tränen-Erlenpollengemisch auf Position 5 zeigten mittelgroße Ringe, jedoch ist der Hof auf Position 5 etwas größer. 1 2 3 5 4 6 Abbildung 30: Ergebnis des modifizierten Olivenöl-Rhodamin B-Agars mit aufgetragenen Pollenextrakten und Tränenflüssigkeit 51 3.4 Lipidanalyse Im ZMF (Zentrum für Medizinische Grundlagenforschung, Medizinische Universität Graz) wurde mittels reversed Phase HPLC (siehe Kapitel 2.6) die Lipidzusammensetzung von Tränenflüssigkeit, Pollenextrakten und von in Tränenflüssigkeit gelösten Pollen analysiert (Tabelle 4). Die aus Pollen beim Kontakt mit Tränenflüssigkeit austretenden Lipasen veränderten die Lipide – speziell Glycerophospholipide, Glycerolipide, Sphingolipide und Sterole – der Tränenflüssigkeit (Abbildung 31). Diese Änderungen waren im Molekulargewicht feststellbar. Tabelle 3 bietet eine Übersicht über die detektierten Lipide (Haupt- und Untergruppen) und deren Abkürzungen. GPL Glycerophospholipide PC Phosphatidylcholine PE Phosphatidylethanolamine PS Phosphatidylserine LyGPL Lysoglycerophospholipide LyPC Lysophosphatidylcholine GL Glycerolipide TG Triacylglycerol DG Diacylglycerol SM Sphingomyelin Cer Ceramide CE Cholesterolesters SP ST Sphingolipide Sterols Tabelle 3: Lipide und deren Abkürzungen 52 53 Tabelle 4: Ergebnis der Lipidbestimmung, ZMF 54 Abbildung 31: Ergebnis der Lipidbestimmung, ZMF 4 Diskussion Kommen Pollenkörner mit Tränenflüssigkeit oder anderen Körperflüssigkeiten in Kontakt, blähen sie sich auf und verändern ihre Form. Durch Poren in der Pollenwand, auch Aperturen genannt, geben einige von ihnen ihren Inhalt an die Umgebung ab. Dieses Phänomen kann auch in-vitro unter dem Mikroskop durch Aufbringen von destilliertem Wasser auf Pollenkörner beobachtet werden. Um jedoch auch die ausgetretenen Enzyme sichtbar zu machen, ist es nötig, diese anzufärben. In unseren Versuchen ist es uns mittels eines proteinfärbenden Farbstoffs (Serva-Blue Farblösung) gelungen, die Enzyme anzufärben und damit die Freisetzung dieser Proteine beweisen zu können. Gelangen Pollenkörner in das Auge, rehydrieren sie und stoßen ihren Inhalt aus. Beobachtungen in-vivo zeigten, dass die Pollen lange Zeit, bis zu 5 Stunden und länger, an der Augenoberfläche verweilen können [27]. In einer Studie wurde bereits nachgewiesen, dass sich unter den Enzymen, die von den rehydrierten Pollenkörnern ausgestoßen werden, Proteasen befinden. Diese Proteasen zerstören die wässrige Schicht des Tränenfilms, indem sie die darin enthaltenen Proteine schädigen [18]. 4.1 Einfluss von Pollenlipasen auf den Tränenfilm Im Rahmen unserer Versuche haben wir mittels Olivenöl-Rhodamin B-Agar herausgefunden, dass sich nicht nur Proteasen unter den ausgestoßenen Pollenenzymen befinden, sondern auch Lipasen, die ebenso an der Schädigung des Tränenfilms und somit an der Entstehung des Trockenen Auges beteiligt sind. Durch die Bestimmung der Lipide des Tränenfilms im ZMF vor und nach der Inkubation der Tränenflüssigkeit mit Pollenextrakten (siehe Kapitel 3.4) konnte bestätigt werden, dass die Pollenlipasen die Lipidschicht des Tränenfilms verändern. Diese Reaktion konnte mit Hilfe der Massenspektroskopie untersucht werden, wobei Veränderungen im Molekulargewicht feststellbar waren. Es konnten Unterschiede zwischen den verschiedenen Pollenarten hinsichtlich ihrer Enzymaktivität entdeckt werden. So besitzen Knäuelgraspollen, welche auch allergisch als 55 sehr potent beschrieben werden, eine deutlich größere Lipaseaktivität als die Erlenpollen und diese wiederum zeigen mehr Lipaseaktivität auf dem Agar als die Haselpollen. Bei den stark allergen wirkenden Birkenpollen konnte keine Lipaseaktivität nachgewiesen werden. Allerdings ist schon bei früheren Versuchen an der Universitäts-Augenklinik Graz aufgefallen, dass die Birkenpollen bei laborexperimentellen Versuchen sehr eigenwillig reagieren und sich oftmals „anders“ verhalten als erwartet. Wie bereits im ersten Absatz erwähnt, geben nur einige und nicht alle Pollenkörner nach der Rehydrierung Enzyme an ihre Umgebung ab. Das wirft die Frage auf, warum es nicht bei jedem Pollenkorn zu solch einer Enzymausschüttung und infolge dessen zur Initialisierung des Befruchtungsvorgangs kam. Wahrscheinlich ist, dass nur vitale, d.h. morphologisch intakte Pollen dazu in der Lage sind. Da man die Pollen schon einige Monate vor ihrer Verwendung gesammelt und gelagert hatte, wurde die Vitalität der Pollenkörner mittels einer Lactophenolblau-Färbung überprüft. Hier konnte klar erkannt werden, dass ein Zusammenhang zwischen der Vitalität der Pollen und deren Lipaseaktivität bestand. Je stärker die Pollen durch die Farblösung blau angefärbt wurden, desto vitaler waren sie und eine umso höhere Lipaseaktivität konnte auf den Agarplatten nachgewiesen werden. Eine Ausnahme bildeten wiederum die Birkenpollen, die sich genau gegenteilig verhielten, was jedoch wie bereits erwähnt, bei in-vitro Versuchen mit Birkenpollen nichts Ungewöhnliches ist. Eine detaillierte Übersicht hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen Vitalität und Lipaseaktivität der einzelnen Pollenarten bietet Tabelle 5. Pollenart Vitalitätsfärbung Lipaseaktivität Hasel schwach gering Erle mittel mittel Birke stark keine Knäuelgras stark hoch Tabelle 5: Ergebnisvergleich - Vitalitätsfärbung/Lipaseaktivität 56 Nicht nur Pollenextrakte wurden auf dem Olivenöl-Rhodamin B-Agar hinsichtlich Lipaseaktivität getestet, sondern auch Tränenflüssigkeit alleine sowie nach vorheriger Inkubation mit Pollen. Es zeigte sich, dass auch Tränenflüssigkeit Lipase enthält. Verglich man die entstandenen fluoreszierenden Höfe von Pollen, die in Tränenflüssigkeit inkubiert worden waren und Tränenflüssigkeit alleine, so war ersichtlich, dass die Lipaseaktivität der inkubierten Pollen im Vergleich zur Lipaseaktivität der Tränenflüssigkeit ohne Inkubation geringer war. Dies lässt die Vermutung zu, dass die in den Pollen enthaltenen Pollenproteasen auch die Lipasen der Tränenflüssigkeit angreifen und zerstören. Die Tatsache, dass in der Tränenflüssigkeit Lipasen enthalten sind, ist jedoch schon seit längerem bekannt. 2008 konnten Forscher aus New York die Lipase sPLA2-IIa identifizieren, welche die Augenoberfläche vor mikrobiellen Infektionen, speziell gram-positiven Bakterien, schützt [28, 29]. Gebildet werden die Lipasen von den Tränendrüsen und den Becherzellen des Konjunktivaepithels. sPLA2-IIa hydrolysiert Fettsäuren, das zur Entstehung von freier Arachidonsäure (AA) und Lysophospholipiden führt. Diese Spaltprodukte fungieren wiederum als Vorläufer von proinflammatorischen Lipidmediatoren wie etwa des Prostaglandin E2 (PGE2). Neben seiner katalytischen Aktivität dient sPLA2-IIa jedoch auch als inflammatorischer Mediator bei nicht-entzündlichen Augenerkrankungen, wie zum Beispiel rheumatoider Arthritis. Im Rahmen der Studie kamen die Forscher zu dem Ergebnis, dass die sPLA2-IIa-Aktivität in der Tränenflüssigkeit von Patienten, die am Trockenen Auge leiden, deutlich erhöht ist. Weiters kann eine vermehrte Lipaseaktivität durch Kontaktlinsen, UV-Licht-Exposition und Augenmedikamente hervorgerufen werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass sPLA2-IIa eine protektive Wirkung bei einer normalen okulären Oberfläche besitzt. Bei bereits durch diverse Noxen wie etwa UV-Strahlung vorgeschädigten Zellen kann es jedoch zu einer übermäßigen Lipaseaktivität und folge dessen zu entzündlichen Vorgängen kommen. Eine weitere Aufgabe der sich in der Tränenflüssigkeit befindenden physiologischen Lipase ist, die Qualität des Lidöls zu beeinflussen [28, 29]. Die Tatsache, dass es physiologisch ist, eine gewisse Menge an Lipasen in der Tränenflüssigkeit zu haben, wirft nun die Frage auf, warum diese Lipasen die Lipidschicht des Tränenfilms im Gegensatz zu den Lipasen der Pollen nicht angreifen und somit nicht zur Entstehung des SNAK-Syndroms führen. Da es unzählige verschiedene Lipasen gibt, wird vermutet, dass es sich bei den physiologischen Lipasen in der Tränenflüssigkeit um andere handelt, als jene, die in den Pollen enthalten sind. Diese Annahme soll in Kürze von Forschern der Universitäts-Augenklinik Graz mit einem modifizierten Tributyrin–Agar nach 57 der Vorlage von Nack-Shick et al. untersucht werden [30]. Dabei werden die in den Pollenextrakten enthaltenen Proteine mittels Elektrophorese aufgetrennt und auf den Tributyrin-Agar aufgebracht [30]. Man kann jedoch auch davon ausgehen, dass aufgrund der sehr spezifischen Eigenschaften von Enzymen, diese die eigene Lipidschicht erkennen und nicht angreifen. 4.2 Antilipasen – Physiologische Schutzfaktoren Viele Menschen leiden während der Pollenflugsaison am SNAK-Syndrom, jedoch gibt es auch einige, die resistent gegen die in den Pollen enthaltenen Enzyme zu sein scheinen. Die Erklärung liefern die Abwehrmechanismen, in die humanen sogenannten Zellen und Körperflüssigkeiten Proteaseinhibitoren bzw. vorhandenen Antiproteasen. In Tränenflüssigkeit und Nasensekret finden sich u.a. α1-Antitrypsin, α1-Antichymotrypsin und α2-Makroglobulin. Diese bieten ausreichend Schutz vor proteolytischem Abbau [31, 32]. Sind diese Schutzfaktoren jedoch defekt oder werden zu wenige davon gebildet, so können die Proteasen ungehindert angreifen. Dies ist auch der Fall, wenn aufgrund einer Keratokonjunktivitis sicca zu wenig Tränenflüssigkeit gebildet wird und demzufolge zu wenig Antiproteasen an die Augenoberfläche gelangen [18]. Es wird vermutet, dass sich auch Antilipasen bzw. Lipaseinhibitoren in der Tränenflüssigkeit befinden. Bis dato ist dieses Gebiet jedoch noch weitgehend unerforscht. 4.3 Therapieansätze Bei Patienten, die an allergischen Symptomen wie etwa geröteten, juckenden oder tränenden Augen leiden, sollte ein Allergietest (z.B. Prick-Test) durchgeführt werden, um differenzieren zu können, ob die Beschwerden auf eine Allergie gegen eine bestimmte Pollenspezies zurückzuführen sind oder ob es sich um eine nicht-allergische Reaktion, d.h. um das sogenannte SNAK-Syndrom handelt. Handelt es sich nachweislich um eine Allergie, so verschaffen antiallergische Medikamente (z.B. Antihistaminika, Cromoglycinsäure-Präparate etc.) oder eine Hyposensibilisierungstherapie eine gewisse Linderung. Bei Patienten mit allergieähnlichen 58 Beschwerden, bei denen jedoch keine Pollenallergie nachzuweisen ist, sind antiallergische Therapiemaßnahmen wirkungslos, da die Ursache nicht in einer allergischen Sensibilisierung des Organismus liegt, sondern in einer enzymatischen Schädigung des Tränenfilms. Es kann jedoch auch bei Patienten, die nachweislich eine Allergie gegen eine Pollenspezies haben, die Therapie mit antiallergischen Medikamenten unzureichend effektiv sein. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass sie zusätzlich zu ihrer Allergie auch noch am SNAK-Syndrom leiden. Diese beiden Patientengruppen, Nicht-Allergiker und Allergiker, die trotz Medikation weiterhin an ihren Symptomen leiden, bedürfen einer Therapie, welche gezielt die PollenEnzym-Reaktion hemmt. Ein Ansatz wäre die Entwicklung von Augentropfen, die Antiproteasen und –lipasen beinhalten. Hier steht man jedoch vor dem Problem der enormen Enzymvielfalt in Pollen und der Tatsache, dass ein Großteil der Enzyme noch nicht spezifiziert ist. Weiters ist die Inhibition von Enzymen insofern problematisch, als dass die körpereigenen Enzyme, die wir für physiologische Vorgänge benötigen, nicht inaktiviert werden dürfen. Einen ersten Erfolg zeigten laborexperimentelle Versuche mit Doxycyclin. Forscher fanden heraus, dass dieses Antibiotikum aus der Klasse der Tetracykline den durch Pollenproteasen verursachten proteolytischen Abbau von Proteinen des Nasensekrets verhindern kann [32]. Es blockiert die 30S-Untereinheit und hemmt somit die bakterielle Proteinsynthese [33, 34]. Weiters ist Doxycyclin ein Matrix-Metalloproteasen-Inhibitor und scheint die Expression von Proteasen und Antiproteasen zu beeinflussen [35, 36]. Ob das Antibiotikum hinsichtlich der Hemmung von Pollenproteasen am Patienten Wirkung zeigt, wurde bisher noch nicht weiter untersucht. Ein weiterer denkbarer Ansatzpunkt in der Therapie des SNAK-Syndroms wäre der Einsatz von antiretroviralen Proteaseinhibitoren (z.B. Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir, etc.). Diese kommen bereits bei der HIV-Therapie zum Einsatz, um spezifisch die HIV-Proteasen zu hemmen. In der Reifungsphase der Viruspartikel bewirkt dieses virale Enzym die Spaltung des viralen Polyproteins in verschiedene Proteine. Dieser für das Virus wichtige Spaltvorgang kann durch Proteaseinhibitoren verhindert werden und folglich kommt es zur Bildung defekter Viruspartikel [33, 37]. Ob sich diese Aspertylproteaseinhibitoren jedoch auch zur Hemmung von Pollenproteasen eignen, ist fraglich und noch nicht bewiesen. Denkbar wäre auch der Zusatz von körpereigenen Antiproteasen zu Tränenersatzpräparaten, doch auch das ist noch weitgehend unerforscht. 59 Bis zur Einführung einer effektiven Therapie wird noch einige Zeit vergehen und deshalb ist es wichtig, dass jene Personen, die am SNAK-Syndrom leiden, Empfehlungen zur Prävention bekommen. Diese Ratschläge gelten auch für Allergiker und haben zum Ziel, den Kontakt von Pollen mit der Augenoberfläche so gering bzw. so kurz wie möglich zu halten. Demzufolge sollten Fenster erst nach Regenfällen geöffnet werden und längere Aufenthalte im Freien während der Pollenflugsaison vermieden werden [18]. Weiters ist es ratsam, sich die Augen nach Pollenexposition auszuspülen. Befinden sich im ungespülten Auge auch nach 5 Stunden immer noch Pollen, so sind durch eine viermalige Spülung innerhalb von 10 Minuten kaum mehr Pollen nachweisbar [27]. Allerdings sollte man bei der Haarwäsche vorsichtig sein, denn die Pollen verfangen sich oft in den Haaren. Bei der Haarwäsche quellen sie durch die Flüssigkeitsaufnahme auf und können auch in das Auge gespült werden, wo sie dann ihre Enzyme freigeben. Zusammenfassend kann man sagen, dass in der Erforschung des SNAK-Syndroms noch viel Potential steckt. Weiß man bereits aus einer vorangegangen Arbeit, dass in Pollen Proteasen vorhanden sind, so konnte anhand dieser Studie die Aktivität von Pollenlipasen und deren schädigende Wirkung auf den Tränenfilm nachgewiesen werden. Doch es ist zu vermuten, dass Pollen neben Proteasen und Lipasen auch noch andere Enzyme, wie etwa Glykosidasen enthalten. Die Forschung auf diesem Gebiet steht somit erst am Beginn, doch es ist abzusehen, dass vielen Menschen, die am SNAK-Syndrom leiden, bislang jedoch fälschlicherweise mit Antiallergika behandelt worden sind, geholfen werden könnte. 60 5 Literaturverzeichnis [1] Welsch. Lehrbuch Histologie. 2nd ed. München: Urban & Fischer 2006. [2] Augustin AJ. Augenheilkunde. 3rd ed. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag 2007. [3] Brewitt H, Zierhut M. Trockenes Auge - Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie, Diagnostik, Therapie. Heidelberg: Kaden Verlag 2001. [4] Sachsenweger M. Augenheilkunde. 2nd ed. Stuttgart: Georg Thieme Verlag KG 2003. [5] Butovich IA, Uchiyama E, McCulley JP. Lipids of human meibum: mass-spectrometric analysis and structural elucidation. J Lipid Res. 2007 Oct;48(10):2220-35. [6] Butovich IA, Millar TJ, Ham BM. Understanding and analyzing meibomian lipids–a review. Curr Eye Res. 2008 May;33(5):405-20. [7] Joffre C, Souchier M, Gregoire S, Viau S, Bretillon L, Acar N, et al. 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Die Aufklärung darüber erfolgt in einem ausführlichen ärztlichen Gespräch. Ihre Teilnahme an dieser Prüfung erfolgt freiwillig. Sie können jederzeit ohne Angabe von Gründen aus der Studie ausscheiden. Die Ablehnung der Teilnahme oder ein vorzeitiges Ausscheiden aus dieser Studie hat keine nachteiligen Folgen für Ihre medizinische Betreuung. Studien sind notwendig, um verlässliche neue medizinische Forschungsergebnisse zu gewinnen. Unverzichtbare Voraussetzung für die Durchführung einer Studie ist jedoch, dass Sie Ihr Einverständnis zur Teilnahme an dieser Studie schriftlich erklären. Bitte lesen Sie den folgenden Text als Ergänzung zum Informationsgespräch mit Ihrem Arzt sorgfältig durch und zögern Sie nicht Fragen zu stellen. Bitte unterschreiben Sie die Einwilligungserklärung nur - wenn Sie Art und Ablauf der Studie vollständig verstanden haben, - wenn Sie bereit sind, der Teilnahme zuzustimmen und - wenn Sie sich über Ihre Rechte als Teilnehmer an dieser Studie im Klaren sind. Zu dieser Studie, sowie zur Patienteninformation und Einwilligungserklärung wurde von der zuständigen Ethikkommission eine befürwortende Stellungnahme abgegeben. 1. WAS IST DER ZWECK DER STUDIE? Der Zweck dieser Studie ist, erstmals zu klären werden, ob Pollen einen negativen Einfluss auf die Zusammensetzung der Lipidschichte der menschlichen Tränenflüssigkeit haben Seite I von V Unterschrift des Patienten ................................ und somit für die Entstehung des Trockenen Auges bzw. des SNAK(saisonale nicht-allergische Konjunktivitis)-Syndroms mitverantwotlich sein können. 2. WIE LÄUFT DIE STUDIE AB? Diese Studie wird an der Universitäts-Augenklinik Graz durchgeführt, und es werden insgesamt 6 Personen daran teilnehmen. Ihre Teilnahme an dieser Studie wird voraussichtlich 1 Tag dauern. Folgende Maßnahmen werden ausschließlich aus Studiengründen durchgeführt: Während dieser Studie wird an einem Tag einmalig eine Tränenabnahme (10 - 15 µl) durch Berühren des Tränensees im nasalen Lidwinkel durch Anlegen einer Glaskapillare (hohles Glasröhrchen von 20 µl Fassungsvermögen) durchgeführt. Es handelt sich dabei um eine standardisierte Methode zur Untersuchung der Tränenflüssigkeit. Sie werden gebeten, hierzu einmal an die Universitäts-Augenklinik Graz zu kommen. Insgesamt ist ein Besuch notwendig. Die Einhaltung des Besuchstermins, einschließlich der Anweisungen des Prüfarztes ist von entscheidender Bedeutung für den Erfolg dieser Studie. 3. WORIN LIEGT DER NUTZEN EINER TEILNAHME AN DER STUDIE ? Es ist nicht zu erwarten, dass Sie aus Ihrer Teilnahme an dieser Studie gesundheitlichen Nutzen ziehen werden. Sie erhalten Informationen über mögliche Veränderungen der Lipidzusammensetzung Ihrer Tränenflüssigkeit durch Pollen. Die Tränenflüssigkeit enthält zahlreiche Lipide, die durch Umweltfaktoren in ihrer Struktur verändert werden. Über die Wirkung von Pollen gibt es noch keine Studienergebnisse. 4. GIBT ES RISIKEN, B ESCHWERDEN UND BEGLEITERSCHEINUNGEN? Nach der Tränenabnahme besteht die Möglichkeit einer kurzfristigen leichten Reizung der Bindehaut. Spätkomplikationen sind nicht zu erwarten. 5. ZUSÄTZLICHE EINNAHME VON ARZNEIMITTELN? Die Einnahme von Arzneimitteln beeinflusst diese Studie in keiner Weise. 6. HAT DIE TEILNAHME AN DER STUDIE SONSTIGE AUSWIRKUNGEN AUF DIE LEBENSFÜHRUNG UND WELCHE VERPFLICHTUNGEN ERGEBEN SICH DARAUS? Es sind keine Auswirkungen auf die Lebensführung zu erwarten. Seite II von V Unterschrift des Patienten ................................ 7. WAS IST ZU TUN BEIM AUFTRETEN VON SYMPTOMEN, B EGLEITERSCHEINUNGEN UND/ODER VERLETZUNGEN ? Sollten nach der Tränenabnahme irgendwelche Symptome (Reizungen und Rötungen der Bindehaut) auftreten, müssen Sie diese Ihrem Arzt mitteilen, bei schwerwiegenden Begleiterscheinungen umgehend, ggf. telefonisch (Telefonnummern, etc. siehe unten). 8. WANN WIRD DIE STUDIE VORZEITIG BEENDET ? Sie können jederzeit auch ohne Angabe von Gründen, Ihre Teilnahmebereitschaft widerrufen und aus der Studie ausscheiden ohne dass Ihnen dadurch irgendwelche Nachteile für Ihre weitere medizinische Betreuung entstehen. Ihr Prüfarzt wird Sie über alle neuen Erkenntnisse, die in Bezug auf diese Studie bekannt werden, und für Sie wesentlich werden könnten, umgehend informieren. Auf dieser Basis können Sie dann Ihre Entscheidung zur weiteren Teilnahme an dieser Studie neu überdenken. Es ist aber auch möglich, dass Ihr Prüfarzt entscheidet, Ihre Teilnahme an der Studie vorzeitig zu beenden, ohne vorher Ihr Einverständnis einzuholen. Die Gründe hierfür können sein: 9. - Sie können den Erfordernissen der Studie nicht entsprechen; - Ihr behandelnder Arzt hat den Eindruck, dass eine weitere Teilnahme an der Studie nicht in Ihrem Interesse ist; IN WELCHER WEISE WERDEN DIE IM RAHMEN DIESER STUDIE GESAMMELTEN DATEN VERWENDET? Sofern gesetzlich nicht etwas anderes vorgesehen ist, haben nur die Prüfer und deren Mitarbeiter Zugang zu den vertraulichen Daten, in denen Sie namentlich genannt werden. Diese Personen unterliegen der Schweigepflicht. Die Weitergabe der Daten erfolgt ausschließlich zu statistischen Zwecken und Sie werden ausnahmslos darin nicht namentlich genannt. Auch in etwaigen Veröffentlichungen der Daten dieser Studie werden Sie nicht namentlich genannt. 10. ENTSTEHEN FÜR DIE TEILNEHMER K OSTEN? GIBT ES EINEN KOSTENERSATZ ODER EINE VERGÜTUNG? Durch Ihre Teilnahme an dieser Studie entstehen für Sie keine zusätzlichen Kosten. Allerdings gibt es auch keinen Kostenersatz oder eine Vergütung. Seite III von V Unterschrift des Patienten ................................ 11. M ÖGLICHKEIT ZUR DISKUSSION WEITERER FRAGEN Für weitere Fragen im Zusammenhang mit dieser Studie stehen Ihnen Ihr Prüfarzt und seine Mitarbeiter gern zur Verfügung. Auch Fragen, die Ihre Rechte als Patient und Teilnehmer an dieser Studie betreffen, werden Ihnen gerne beantwortet. Name der Kontaktperson: PD Dr. Jutta Horwath-Winter.............................................. Ständig erreichbar unter: 0316 385 80807................................................................... Name der Kontaktperson: ...................................................................................... Ständig erreichbar unter: ...................................................................................... Name der Kontaktperson: ...................................................................................... Ständig erreichbar unter: 12. ...................................................................................... SOLLTEN ANDERE BEHANDELNDE ÄRZTE VON DER TEILNAHME AN DER STUDIE INFORMIERT WERDEN ? Nein. 13. EINWILLIGUNGSERKLÄRUNG Name des Patienten in Druckbuchstaben: ........................................................................... Geb.Datum: ............................ ........................................................................... Code: Ich erkläre mich bereit, an der Studie: Bedeutung von Pollenlipasen für das Trockene Auge teilzunehmen. Ich bin von Frau PD Dr. Jutta Horwath-Winter ausführlich und verständlich über mögliche Belastungen und Risiken, sowie über Wesen, Bedeutung und Tragweite der Studie, sich für mich daraus ergebenden Anforderungen aufgeklärt worden. Ich habe darüber hinaus den Text dieser Patientenaufklärung und Einwilligungserklärung, die insgesamt 5 Seiten umfasst, gelesen. Aufgetretene Fragen wurden mir vom Prüfarzt verständlich und genügend beantwortet. Ich hatte ausreichend Zeit, mich zu entscheiden. Ich habe zur Zeit keine weiteren Fragen mehr. Ich werde den ärztlichen Anordnungen, die für die Durchführung der Studie erforderlich sind, Folge leisten, behalte mir jedoch das Recht vor, meine freiwillige Mitwirkung jederzeit zu beenden, ohne dass mir daraus Nachteile für meine weitere medizinische Betreuung entstehen. Ich bin zugleich damit einverstanden, dass meine im Rahmen dieser Studie ermittelten Daten aufgezeichnet werden. Um die Richtigkeit der Datenaufzeichnung zu überprüfen, Seite IV von V Unterschrift des Patienten ................................ dürfen Beauftragte der zuständigen Behörden beim Prüfarzt Einblick in meine personenbezogenen Krankheitsdaten nehmen. Beim Umgang mit den Daten werden die Bestimmungen des Datenschutzgesetzes beachtet. Eine Kopie dieser Patienteninformation und Einwilligungserklärung habe ich erhalten. Das Original verbleibt beim Prüfarzt. ...................................................................................................... (Datum und Unterschrift des Patienten) ...................................................................................................... (Datum, Name und Unterschrift des verantwortlichen Arztes) (Der Patient erhält eine unterschriebene Kopie der Patienteninformation und Einwilligungserklärung, das Original verbleibt im Studienordner des Prüfarztes.) Seite V von V Unterschrift des Patienten ................................ 7 Curriculum Vitae Persönliche Daten Name: Eva Wimmer Geburtsort: Linz Staatsbürgerschaft: Österreich Religionsbekenntnis: römisch-katholisch Familienstand: ledig Wohnadresse: Vogeltenn 2, 4322 Windhaag bei Perg E-mail: [email protected] Private Interessen: Reisen, Lesen, Gitarre spielen, Volleyball, Schwimmen Schulische Ausbildung 1992–1996 Volksschule in Windhaag bei Perg 1996–2000 Hauptschule in Perg 2000–2005 BHAK Fachrichtung „Internationale Wirtschaft“ in Perg 2005 Reifeprüfung mit gutem Erfolg Universitäre Ausbildung seit 10/2005 Studium Humanmedizin Medizinische Universität Graz 03/2009-07/2009 Studienaufenthalt an der Faculty of Health, Medicine and Life Sciences, Maastricht University 70 Pflichtfamulaturen im Rahmen des 2. Studienabschnitts: 07/2007 Interne Abteilung des LKH Weiz 08/2007-09/2007 Abteilung für Kardiologie Elisabethinen Linz 07/2008 Abteilung für Kinder- und Jugendpsychiatrie Landesnervenklinik Sigmund Freud 09/2008 Abteilung für Neurologie Wagner-Jauregg 09/2008 Abteilung für Psychiatrie Wagner-Jauregg 03/2009-04/2009 Department of Surgery University Hospital Maastricht (NL) Spezielle Studienmodule · Histologie · Dermatoonkologie · Cased-based learning in Clinical Practice · Ageing · Cancer and oxygen - friend or foe Wissenschaftliche Arbeiten Abstract: Schmut O, Köfeler H, Knopf A, Kirchengast S, Wimmer E, Meditz K, Rabensteiner DF. Der Einfluss von Pollenlipasen auf die Tränenflüssigkeit im Rahmen des SNAK (saisonale nicht-allergische Konjunktivitis)-Syndroms. Spektrum der Augenheilkunde. 2010;24(2):140-1. Posterpräsentation: Schmut O, Köfeler H, Knopf A, Kirchengast S, Wimmer E, Meditz K, Rabensteiner DF. Der Einfluss von Pollenlipasen auf die Tränenflüssigkeit im Rahmen des SNAK (saisonale nicht-allergische Konjunktivitis)-Syndroms. Posterpräsentation auf der 51. Tagung der Österreichischen Ophthalmologischen Gesellschaft (ÖOG), Zell am See, Österreich, 13.-15. Mai 2010 71 Sonstiges · Rettungssanitäterausbildung · Cambridge First Certificate · 5 Wochen Sprachaufenthalt in Kanada · Medical-English Kurse · Niederländisch-Sprachkurs (Level A2) · Tätigkeit an der Landessanitätsdirektion Steiermark 72
