Teil 1 - Kinderkliniken

Unsere Lungen sind nicht steril - Das Mikrobiom
der Lunge
Markus Hilty
Institute for Infectious Diseases, University of Bern, Switzerland
Department of Infectious Diseases, University Hospital, Switzerland
Department of Pediatrics, University Hospital, Switzerland
1
Inhaltsverzeichnis
 Teil 1: Lunge steril oder nicht? – Wie alles begann
- Molekulare Methoden
- Bakterien in der Lunge von Patienten mit Asthma,
COPD und Kontrollen
 Teil 2: Obere Atemwege von Kleinkindern mit und ohne
Cystischer Fibrose
- Einleitung
- Methoden
- Erste Resultate und Vergleich zu Kindern mit
Mittelohrenentzündung
2
Teil 1: Wie alles begann – Bakterien in der
Lunge von Asthmatikern und Kontrollen






Asthma: Am häufigsten in Kindern
Nord-Süd Gradient
Vererbbar
Aufwachsen auf dem Bauernhof hat einen protektiven Effekt
Exazerbationen werden oft durch Infektionen ausgelöst
Analyse von Bakterien mit molekularen Methoden eine gute
Idee?
3
Aufarbeitung von Abstrichen
swab
einfrieren -80°C
Rasen
Einfrieren -80°C
Isolierte Stämme
von S. pneumoniae
Einfrieren -80°C
Mikrobiota?
- 16S multiplex PCR
Brugger et al., PLoS One 2010; Hilty et al. JID, 2012
4
V7
16S rRNA
Sekundärstruktur
V4
V6
V5
V3
V8
primers
V1
V2
V9
→ Sequenzen vergleichen mit GenBank
5
PCR Produkte
6
Mikrobiota in der Lunge - Patientenauswahl
 Klinische Proben von Erwachsenen (11 Asthmatiker, 5 mit
COPD und 8 gesunde)
 Geburtsdatum (COPD 58±12.5y, Asthma 38.6±18.3y und
Kontrollen 53.9±10.9y) Geschlecht (COPD 3m/2f, Asthma
8m/3f und gesunde 3m/5f), Gewicht und Grösse,
Raucherstatus, Antibiotika
 FVC, FEV1, DLCO und Bronchoskopie
 Sterile Abstriche und ‘bedeckte’ Lungenbürsten
7
Mikrobiota in der Lunge - Probengewinnung
A
D
C
B
E
A: Nasenabstrich
B: Rachenabstrich
C: Linker oberer Lappen prox.
D: Linker oberer Lappen distal
E: Rechter unterer Lappen
Quantifizierung von totaler bakterieller DNA
4
COPD
3.5
Asthma
Controls
LUL1
LUL2
2.5
2
1.5
Smokers
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
1
log10 (cells per 40 ng)
3
Reference
RLL bronchus
LUL bronchus
LUL bronchus
OP
Nose
RLL bronchus
LUL bronchus
LUL bronchus
OP
Nose
LUL bronchus
LUL bronchus
OP
Nose
OP
LUL bronchus
LUL bronchus
Nose
‘Denaturing Gradient Gel Electrophoresis’
(DGGE) zur Untersuchung von Kontamination
1
2, 3
4
5
6
7
8, 9
10,11
12,13
14,15
16
Taxonomie der Bakterien
11
Häufigkeit von bakteriellen phyla in der Lunge
P<10-16
60
P<10-16
50
P<10-7
P<10-6
%
40
Proteobacteria
Firmicutes
Bacteriodites
Actinobacteria
Fusobacteria
others
30
20
10
0
COPD
ASTHMA
Disease status
Hilty et al., PLoS One 2010
CONTROLS
Teil 2 - Bakterielle Infektion und
Krankheitsverlauf von Cystischer Fibrose
 Staphylococcus aureus (früh), Haemophilus influenzae (früh)
und Pseudomonas aeruginosa (spät) haben erhöhte
Prävalenz
 P. aeruginosa kann sich während der Infektion anpassen z.B.
Ausprägung des mukoiden Phänotyps oder durch seine
Fähigkeit Biofilme zu bilden.
 Krankheitsverlauf komplex; anstatt einzelnen Bakterien sollte
man die ganze Zusammensetzung auf einmal untersuchen
 => Methoden, die nicht auf bakterieller Kultur basieren sind
nötig um den Krankheitsverlauf zu verstehen.
13
Faktoren, die die nasopharnygeale Flora
beeinflussen können
14
Microbiota in Cystischer Fibrose
Cox et al, 2010 PLoS One;
Vanja Klepac-Ceraj, 2010
Env. Microbiology
Harris JK et al, 2008 PNAS
15
Forschungsziele
 Charakterisierung der bakteriellen Besiedleung des
Nasopharynx im ersten Lebensjahr von gesunden Babies.
 Charakterisierung der bakteriellen Besiedleung des
Nasopharynx im ersten Lebensjahr von Babies mit CF.
 Vergleich zwischen den beiden Gruppen:
=> Identifikation von ‘guten’ Bakterien
=> Identifikation von Krankheit (Exacerbation) assozierten
Bakterien
=> Bakterielle Diversität als diagnostischer Marker?
16
Abstrich
gelagert bei -20°C
Virus
- RNA extraction and
RT PCR (Pädiatrische
Pneumologie)
Microbielle flora
- 16S multiplex PCR
Lagerung von
Stämmen
17
Terminologie
 OTU (Operational Taxonomic Unit):
Normalerweise 97% Sequenzidentität
 Richness
Anzahl OTUs in einer Probe
 Shannon diversity index (SDI):
Zusätzlich zur Anzahl auch die relative Häufigkeit von verschiedenen
OTUs/Bakterien
Beispiel:
gleiche Anzahl
verschiedene SDI
18
Resultate: Shannon Diversity Index
(Proben von 10 gesunden Kindern)
19
Kolonisationsdichte – Quantifizierung der
Bakterien
100
90
n=6
n=5
Concentration in ng/ull
n=8
70
60
n=10
n=10
n=10
n=10
50
40
n=9
n=9
80
n=9
n=9
n=9
n=9
n=9
n=9
n=9n=7
n=9
n=9
n=6
n=4
n=5
n=5
n=6
30
20
10
0
Aug 10
October 10
December 10
February 11
Apr 11
June 11
20
27.06.2011
14.06.2011
30.05.2011
16.05.2011
02.05.2011
18.04.2011
04.04.2011
21.03.2011
13.04.2011
31.03.2011
18.03.2011
04.03.2011
22.02.2011
08.02.2011
24.01.2011
11.01.2011
28.12.2010
14.12.2010
25.05.2010
10.06.2010
24.06.2010
06.07.2010
20.07.2010
06.08.2010
17.08.2010
07.09.2010
21.09.2010.
05.10.2010
19.10.2010
02.11.2010
19.11.2010
30.11.2010
100
07.03.2011
.
24.08.2010
06.09.2010
21.09.2010
04.10.2010
18.10.2010
01.11.2010
08.11.2010
15.11.2010
29.11.2010
13.12.2010
28.12.2010
10.01.2011
24.01.2011
07.02.2011
21.02.2011
391
% relative abundance
381
% relative abundance
Relative Häufigkeit von bakteriellen Familien
Husten
80
LRTI
Streptococcus
60
Moraxella
Staphylococcus
40
Corynebacterium
20
Haemophilus influenzae
0
Chryseobacterium
Pseudomonas aeruginosa
Brevundimonas
Methylobacterium
100
80
60
Streptococcus
40
20
Moraxella
Staphylococcus
0
Corynebacterium
Haemophilus
influenzae
21
Prävalenz von Bakterienfamilien
22
0.0
p<0.005
-0.2
NMDS2
0.2
Principal component Analyse (PCA): AOM versus
gesunden Babys
AOM
Controls
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
NMDS1
Hilty et al., JID, 2012
23
Klinische Relevanz?
Infektion auf Grund
eines Erregers
‘Abnormale’ flora
Ziel der Behandlung
- Auslöschung des
infektiösen Erreger
- Wiederherstellung
der ‘normalen’ flora
Frage an die Diagnostik
- Gibt es eine
Infektion?
- Quantität des
Erregers??
- Ist die flora
abnormal?
- Veränderung in der
Quantität aller
Bakterien?
Labormethoden
- Spezifische Kultur oder
PCR
- Quantifizierung durch
Zählung von Bakterien
- 16S Sequenzierung
- 16S Q-PCR
=> Was ist normal?
Zusammenfassung
Teil 1:
Definition eines Profils der bakteriellen Besiedelung in der
Lunge ist möglich.
Profil gemäss dem Phänotyp der Krankheit (z.B. Asthma)
Teil 2:
In 10 Kindern der BILD Kohorte, die bakterielle Diversität im
ersten Lebensjahr nimmt ab
Die Quantität der bakteriellen flora hängt von der Saison ab
→ Rolle der Microbiota in CF?
25
Acknowledgments
William O Cookson, Miriam F Moffatt
und Gruppe ‘Molecular Genetics’
Silvio Brugger, Philipp Agyeman,
Suzanne Aebi und Gruppe ifik
Kathrin Mühlemann
Nicolas Regamey, Carmen Casaulta,
Philipp Latzin und Gruppe pädiatrische
Pneumologie
26