Polyphasische Analyse der mikrobiellen Populationen des
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Polyphasische Analyse der mikrobiellen Populationen des Spittelwassersediments Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhemina zu Braunschweig zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Christel Hoch aus Haren-Ems (Emsland) 1. Referent: Prof. Dr. K.N. Timmis 2. Referent: apl. Prof. Dr. J. Wehland eingereicht am: 08.03.1999 mündliche Prüfung (Disputation) am: 03.06.1999 Druckjahr: 1999 meinen Eltern, meiner Schwester Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät, vertreten durch die Mentorin oder den Mentor/die Betreuerin oder den Betreuer der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht: Publikationen Tesar, M., Hoch, C., Moore, E.R.B., Timmis, K.N. Westprinting: Development of a Rapid Immunochemical Identification for Species within the Genus Pseudomonas sensu stricto. System. Appl. Microbiol. 19, 577-588 (1996) Tagungsbeiträge Hoch, C., Mau, M., Moore, E.R.B., Timmis, K.N. Analysis of Bacterial Community Structure by DNA Sequence Determination. (Poster) International Workshop on New Approaches in Microbial Ecology, Helsing∅r, Dänemark (1994) Hoch, C., Timmis, K.N., Moore, E.R.B. Application of TGGE on the investigation of microbial communities of sediment cores. (Abstract) EU-Workshop on Application of DGGE and TGGE in Microbial Ecology, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Braunschweig (1995) Hoch, C., Mau, M., Moore, E.R.B., Timmis, K.N. Physiological and Phylogenetic Analysis of a Bacterial Community. (Poster) 95. General Meeting American Society for Microbiology, Washington DC (1995) Hoch, C., Mau, M., Vancanneyt, M., Kersters, K., Timmis, K.N., Moore, E. Physiological and Phylogenetic Analysis of a Bacterial Community. (Poster) EC - GBF International Symposium on Exploration of Microbial Diversity: Ecological Basis and Biotechnological Utility, Goslar (1995) Mau, M., Hoch, C., Moore, E.R.B., Timmis, K.N. Domination of β-Subgroup Proteobacteria in Microbial Communities of Polluted Sediments. (Poster) 95. General Meeting American Society for Microbiology, Washington DC (1995) Mau, M., Hoch, C., Moore, E.R.B., Timmis, K.N. Domination of β-Subgroup Proteobacteria in Microbial Communities of Polluted Sediments. (Poster) EC - GBF International Symposium on Exploration of Microbial Diversity: Ecological Basis and Biotechnological Utility, Goslar (1995) Moore, E.R.B., Shouche, Y., Mau, M., Hoch, C., Tindall, B.J., Böttger, E., Collins, M.D., Timmis, K.N. A Phylogenetically-based taxonomic Framework for the environmentally-important Pseudomonads. (Vortrag) EC - GBF International Symposium on Exploration of Microbial Diversity: Ecological Basis and Biotechnological Utility, Goslar (1995) Inhalt Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1-1 1.1 Fließgewässer als Forschungsobjekt 1-1 1.2 Fließgewässerbiologie 1-1 1.2.1 Umweltbiotechnologie 1-3 1.2.2 Mikrobielle Ökologie 1-5 Taxonomische Bestimmung von Bakterien 1-7 1.3 Charakterisierung des Standortes 1-10 1.3.1 Standortentwicklung 1989-1994 1-12 1.3.2 Spezifische organische Belastung zum Zeitpunkt der Probenahmen 1-14 1.4 Ziel der Arbeit 2 MATERIAL UND METHODEN 1-18 2-19 2.1 Arbeitsschema 2-19 2.2 Bestimmung der physiographischen Verhältnisse und chemischen Parameter 2-21 2.3 Probenahme und Transport 2-21 2.4 Mikrobiologische Methoden 2-22 2.4.1 Quantitative mikrobiologische Populationsuntersuchungen 2-22 Probenaufbereitung 2-22 Mikroskopische Bestimmung 2-23 Bestimmung der Gesamtkoloniezahl auf Komplex-Medien 2-23 Bestimmung der Koloniezahlen auf Xenobiotika-Minimal-Medien 2-24 2.4.2 Isolierung 2-25 Stammhaltung 2-25 Kennzeichnung der Isolate 2-25 2.4.3 Mikrobiologische Charakterisierung der Isolate 2-26 Xenobiotika-Toleranz der SA-Isolate 2-26 Charakterisierung und Identifikation mit dem BIOLOG-System 2-26 Identifikation durch die FAME-Analyse 2-27 2.5 Molekularbiologische Methoden 2-28 2.5.1 Aufbereitung der 16S rDNA 2-28 Präparation zellulärer DNA 2-28 Primer (PCR-Startmoleküle) 2-29 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 2-30 Agarosegelelektrophorese 2-31 2.5.2 Molekularbiologische Charakterisierung der Isolate 2-31 I II Inhalt 2.5.2.1 TGGE-Screening 2-32 Grundlagen 2-33 Optimierung 2-35 Referenzstämme 2-38 2.5.2.2 Sequenzierung Analyse der 16S rRNA Sequenzdaten 2.6 Mathematische Verfahren 2-38 2-40 2-41 Sequenzanalyse 2-43 Zur Sequenzanalyse verwendete Algorithmen 2-46 3 ERGEBNISSE 3.1 Charakterisierung des Standortes 3-48 3-48 3.1.1 Witterungsverlauf 3-48 3.1.2 Chemisch-physikalische Parameter 3-49 3.2 Quantitative mikrobiologische Populationsuntersuchungen 3-50 3.2.1 Mikroskopische Bestimmung 3-52 3.2.2 Gesamtkoloniezahlen auf Komplexmedien 3-53 3.2.3 Koloniezahlen auf Xenobiotika-Minimal-Medien 3-54 3.3 Mikrobiologische Charakterisierung 3-55 3.3.1 Gram-Verteilung 3-56 3.3.2 Xenobiotika-Toleranz 3-57 3.3.3 Physiologische Charakterisierung und Identifikation der Isolate mit BIOLOG 3-59 Clusteranalyse 3-59 Aktivität 3-63 Identifikationen 3-65 Gram-negative Isolate 3-67 Gram-positive Isolate 3-73 Bilanzierung 3-75 Selektivität der Medien 3-76 3.3.4 Vergleichende Identifikation der Isolate mit der FAME-Analyse 3-77 Gram-negative Isolate 3-78 Gram-positive Isolate 3-81 Zusammenfassung zur FAME-Analyse 3-84 3.4 Molekularbiologische Charakterisierung 3-87 3.4.1 Genetisches Screening mit der TGGE 3-87 3.4.1.1 TGGE-Analyse der Referenzstämme 3-94 Gram-negative Referenzstämme 3-94 Inhalt β/γ-Proteobakterien 3-94 γ-Proteobakterien 3-96 β-Proteobakterien 3-96 α-Proteobakterien 3-98 Cytophaga-Flavobakterien-Bakteroides-Gruppe 3-98 Gram-positive Referenzstämme 3-99 Interpretation des Trennverhaltens 3-99 3.4.1.2 TGGE-Analyse der Isolate 3-104 Gram-positive Isolate und α-Proteobakterien (aP/GP-Cluster) 3-105 Verifizierung Gram-positiver Identifikationen durch die TGGE 3-108 Gram-negative Isolate 3-109 α-Proteobakterien 3-109 β - und γ-Proteobakterien 3-110 Verifizierung Gram-negativer Identifikationen durch die TGGE 3-111 Zusammenfassung zur TGGE-Analyse der Isolate 3-115 3.4.2 Sequenzierung der 16S rDNA Kriterien der 16S rDNA-Sequenz-Klassifizierung 3.4.2.1 Taxonomische Zuordnung der Isolate anhand der 16S rDNA-Sequenz 3-116 3-117 3-118 Isolate der CYF-Gruppe 3-118 Gram-positive Isolate 3-119 Gram-negative Isolate 3-122 α-Proteobakterien 3-122 β-Proteobakterien 3-127 β/γ- und γ-Proteobakterien 3-132 Phänotypisch nicht bestimmbare Isolate 3.4.2.2 Vergleich der Sequenzierung mit der mikrobiologischen Bestimmung 3-136 3-138 BIOLOG 3-139 Gram-positive Identifikationen 3-139 Gram-negative Identifikationen 3-141 FAME 3-145 Zusammenfassung 3-147 3.4.2.3 Vergleich der Sequenzierung mit dem TGGE-Screening 3-151 Gram-positive Gruppen 3-151 Gram-negative Gruppen 3-152 Zusammenfassung 3-155 3.4.3 Taxonomische Struktur der Spittelwasser-Populationen 3-156 III IV Inhalt Vergleich mit Klonierungsdaten (Mau [1997]) 3.5 Xenobiotika-Toleranz der Population 3-157 3-160 3.5.1 Wachstum der SA-Isolate auf den Xenobiotika-Medien 3-160 3.5.2 Vergleich des Wuchsverhaltens der SA-Isolate und Xenobiotika-Anreicherung 3-168 4 DISKUSSION 4.1 Die Verwendung kultureller Verfahren 4-170 4-170 Sediment-Extrakt-Medium 4-171 Quantifizierung 4-172 Repräsentativität der Probenahme 4-173 Isolierung und Kultur 4-174 4.2 Mikrobiologische Charakterisierung des Standortes 4-175 Koloniezahlen auf Xenobiotika-Minimalmedien 4-177 Rekultivierbarkeit 4-178 4.3 Die Charakterisierung und taxonomische Bestimmung von Bakterien 4-179 Genetische Variabilität der Arten und fließende taxonomische Übergänge 4-181 4.4 Charakterisierung und Identifikation der Spittelwasser-Isolate 4.4.1 Mikrobiologische Charakterisierung und Identifikation 4-182 4-182 Problematik der Gram-Bestimmung 4-185 Qualität der Datenbanken 4-186 4.4.2 Molekularbiologische Bestimmung (TGGE und Sequenzanalyse) 4-187 4.4.2.1 TGGE 4-187 Populationsbeschreibung mit der TGGE 4.4.2.2 16S rDNA-Sequenzierung 4-189 4-190 Populationsbeschreibung mit der 16S rDNA-Sequenzierung 4-192 Vergleich mit dem Klonierungsansatz von Mau [1997] 4-194 Divergenz phänetischer Identifikation und genetischer Zuordnung 4-196 4.4.3 Belastungsspezifisches Charakterisierung der Spittelwasserpopulation 4-197 Testverfahren 4-199 Taxonspezifität 4-200 4.5 Die Struktur der Spittelwasserpopulation im Vergleich mit Literaturdaten 4-202 4.5.1 Vergleich mit Umweltbiotopen 4-204 4.5.2 Vergleich mit Bakterien der Abwasseraufreinigung 4-206 4.5.3 Vorkommen Xenobiotika-degradierender Bakterien 4-210 4.6 Ökologische Implikationen der Diversitätsbestimmung 4-215 5 ZUSAMMENFASSUNG 5-218 6 SCHLUßWORT 6-221 Inhalt 7 LITERATURVERZEICHNIS 7-222 8 ANHANG 8-235 8.1 Medien 8-235 8.1.1 Komplexmedien 8.1.2 Sediment-Extrakt-Medien 8-236 8.1.3 Xenobiotika-Minimal-Medien 8-236 8.1.3.1 Xenobiotika-Mischplatten (4CS, 5CS, 24D, 3CB, βHN) 8-238 8.1.3.2 Xenobiotika-Verdunstungsplatten (Etb, Tol, oXy, mXy, pXy, Bip, Nap) 8-238 8.1.3.3 Anthracen-Gußplatten (Ant) 8-238 8.2 Stammlösungen und Puffer für molekularbiologische Arbeiten 8-239 8.3 Feldprotokoll 8-241 DANKSAGUNG V Einleitung 1 Einleitung 1.1 Fließgewässer als Forschungsobjekt Fließgewässer sind einzigartige Lebensräume der Erde. Es sind lange, lineare Ökosysteme, in denen die Hauptstruktur (Flußbett) stationär und die zweite (Freiwasser) gerichtet dynamisch ist. Gestalt und Struktur der Fließgewässer entsprechen ihrer Funktion als Entwässerungssystem im Wasserkreislauf der Erde, das Wasser und Wasserinhaltsstoffe dem Meer zuführt. Gerade diese Eigenschaft macht sie zu den durch die Zivilisation am schwersten belasteten Lebensräumen. Der Mensch hat die geologische Funktion der Fließgewässer in seinem Sinne ausgenutzt, indem er sie zu Abwasserrinnen degradierte. Zwar sind in technologisch hochentwickelten Ländern in letzter Zeit spürbare Entlastungen der Fließgewässer, vor allem von organischen Stoffen eingetreten, die Mehrzahl der Länder hat jedoch noch auf lange Zeit große Abwasserprobleme oder wird sie in Zukunft noch bekommen. Niemand weiß, welche Umweltbelastungen wir in Zukunft haben werden. Die umfassende Renaturierung der Flußsysteme stellt sich somit als kulturelle Aufgabe. Jedes Detail der Flußforschung, der Hydrologie, Morphometrie, Hydrochemie und Biologie (Habitate, Organismengemeinschaften, Stoffhaushalt und Selbstreinigungspotential) ist hierfür unentbehrlich (Campbell [1980]). 1.2 Fließgewässerbiologie Der Einfluß organischer Abwässer hat schon zu Beginn des 20. Jahrhunderts, als die Beeinflussung immer deutlicher wurde, die Limnologen fasziniert und beunruhigt. Entsprechend war noch vor einem Jahrzehnt die Fließgewässerbiologie weitgehend auf Saprobiologie (Abbau allochthoner und authochthoner organischer Substanz) reduziert und bestimmte unmittelbar die Entwicklung der Abwassertechnologie. In den 50er und 60er Jahren kam es durch Einleitung nicht oder nur unvollständig behandelter Abwässer allgemein zu einer starken Belastung der großen deutschen Flüsse (Elbe, Rhein und Weser). In den 70er Jahren wurde in der Bundesrepublik durch den Bau biologischer Kläranlagen im kommunalen Bereich und verstärkter industrieller Abwasserbehandlung der Schadstoffeintrag in die Oberflächengewässer wesentlich reduziert (BMFT [1990]). Im Gebiet der Deutschen Demokratischen Republik setzte diese Entwicklung dagegen erst mit der wirtschaftlichen Wende Ende der 80er Jahre ein. Von grundlegender Bedeutung ist der mikrobiologische Abbau organischen Stoffe bis zur Mineralisierung, der zur Selbstreinigung eines belasteten Gewässers führt (Campbell [1980]). In aquatischen Ökosystemen werden 80-95% aller Stoffumsetzungen durch Mikroorganismen bewirkt. Im Fließgewässer ist der Abbau etwa viermal schneller als in stehendem Wasser, das heißt sie besitzen ein höheres Selbstreinigungspotential. Verantwortlich ist die Strömung, die Transport der Nährstoffe, größeres Sauerstoffangebot und erhöhten Kontakt mit dem mikrobiellen Aufwuchs bedingt. Die Abbauleistung ist außerdem 1-1 1-2 Einleitung um so größer, je habitatreicher das Flußbett und umso mehr mikrobieller Aufwuchs vorhanden ist. In Bächen, kleinen Flüssen und in Pflanzenbeständen ist die Abbauleistung entsprechend hoch. Die organische Belastung eines Fließgewässers hat eine Änderung der Artenzusammensetzung zur Folge: Für höhere Organismen die Reduktion der Artenzahl und die Erhöhung der Dichte toleranter Arten. Für Bakterien eine Erhöhung der Dichte (häufig stärker der benthischen als der suspendierten Bakterienflora) und die Änderung ihrer Zusammensetzung. Wie in Tab. 1.1 vereinfacht dargestellt, ist die Abundanz bestimmter Mikroorganismen für den Belastungsgrad charakteristisch. Starke und stetige allochthone Zufuhr von organischer Substanz verschiebt das natürliche Gleichgewicht von Autotrophie und Saprobie zu letzterer Größe hin. Die heterotrophen Arten nehmen zu und die Abbauleistung steigt. Tab. 1.1 Die Artzusammensetzung bei organischer Belastung von Fließgewässern (Schönborn [1992]) Belastung dominante Arten und Gattungen leichte Belastung starke Belastung, Aminosäuren werden noch gebildet Pseudomonas stutzeri, Achromobacter, Penicillium, Mucor, Aspergillus Sphaerotilus natans-Fäden, dazwischen Bakterien wie Beggiatoa, außerdem Pilze, Kieselalgen, Protozoa, Simuliiden, Rotatorien, Chironomiden (in Konkurrenz mit Leptomitus) Bacillus, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Aspergillus flavus, Achromobacter ochraceus, Geotrichum, Mucor, Penicillum Aeromonas hydrophila ssp. anaerogena, A. punctata ssp. caviae (anaerogene Formen) starke Belastung polysaprobe Flüsse Da die Anzahl an Mikroorganismen und ihre Aktivität gewöhnlich in den Schlämmen flacher Gewässer am größten ist, kommt den Sedimenten besondere Bedeutung im Mineralisationsprozeß zu. Die Bakterienzahl, auch der Anaerobier, nimmt mit zunehmender Tiefe im Sediment rasch ab. Bei hohem Gehalt organischen Materials ist Sauerstoff nur an der Sedimentoberfläche verfügbar, nach unten schichten sich sequentiell Nitratreduktion, Eisenreduktion, Sulfatreduktion und Methanbildung. Viele Verbindungen (Lignin, Carotinoide, aliphatische und polycyklische Kohlenwasserstoffe) werden unter Sauerstoffausschluß nur noch unvollständig oder gar nicht abgebaut (Schönborn [1992]). Konsortien aerober und anaerober Bakterien in der Übergangszone (in Biofilmen oder Aggregaten) können aber auch durch Kometabolismus und Symbiose Mineralisierung der Problemstoffe ermöglichen (Field et al. [1995]). Während eine verfeinerte chemische Analytik in den vergangenen Jahren eine Vielzahl neuer Befunde über den Kohlenstoff- und Elektronenfluß ermöglicht hat, ist die Zuordnung der Stoffwechselleistungen zu den vorhandenen Bakterienpopulationen in Sedimenten bislang jedoch in einem Anfangsstadium. Viele wichtige metabolische Gruppen von Bakterien in Sedimenten wurden erst in den letzten Jahren kultiviert und damit einer Untersuchung zugänglich gemacht. Über ihre Wechselwirkungen mit anderen Mikroorganismen und unbelebten Sedimentstrukturen (Oberflächen, kolloide Polymere etc.) ist fast nichts bekannt (Schink [1989]). Einleitung Auf der anderen Seite sind die Sedimente als „Sedimentationsfalle“ und Reservoir für zugeführte organische Substanzen von größter Umweltrelevanz. Die Sedimentbelastung stellt das „Gedächtnis“ der Gewässerverschmutzung dar und belegt mit hohen Gehalten an Schwermetallen und organischen Schadstoffen die flußaufwärtsgelegenen Emissionsschwerpunkte. Auch noch Jahre über Beendigung einer Einleitung hinaus existiert das potentielle Risiko einer plötzlichen extremen Belastung durch freigesetzte Schwebstoffe, zum Beispiel bei Hochwasserereignissen. Hochbelastete Sedimente sind in diesem Sinne als Altlast (d.h. Ablagerungen und Standorte von denen eine Gefährdung für Mensch und Umwelt ausgeht oder zu erwarten ist) zu betrachten. Als primäre „Reinigungszone“ ist die Untersuchung der aeroben Sedimentoberfäche umweltbiotechnologisch von größtem Interesse. Als Habitat für Organismen mit verschiedensten Degradationsfähigkeiten bietet das Sediment ein umfangreiches Depot für Isolate zur Anwendung im Bioreaktor oder bei in situ Maßnahmen der Altlastensanierung. Die Strukturanalyse des Sedimentes ist von allgemeinem Interesse, da es als „natürliches Modell“ eines offenen degradierenden Ökosystems, dessen Lebensgemeinschaften und Populationen angesehen werden kann. Das Bundesministerium für Forschung und Technik (BMFT [1992]) fordert im Kontext der mikrobiellen Selbstreinigung die Auswirkungen von kontinuierlichen und stoßweisen Belastungen und die Bedeutung des Schadstoffdepots in den Sedimenten zu erforschen. Die bakterielle Diversität im Sediment verdient dabei besondere Beachtung. Ziel ist die Entwicklung neuer Methoden, umweltbiotechnologischer Verfahren und Maßnahmen, so daß für die Oberflächengewässer eine Gewässergüteklasse besser als II, bzw. ein Zustand besser als mesotroph erreicht werden kann. 1.2.1 Umweltbiotechnologie Die Umweltbiotechnologie ist definiert als Umsetzung kommunaler und industrieller Abfallprodukte, die schädlich für die Biosphäre sind (Oleskin & Samuilov [1992]). Aufgrund des geringen Energieaufwandes und relativ niedriger Kosten werden vor allem natürliche Abbauvorgänge genutzt. Vom ökologischen Standpunkt sind nur biologische Verfahren vertretbar, da hier die Schadstoffe abgebaut und nicht nur auf eine Deponie verlagert werden. Den biologischen Verfahren gemeinsam ist, daß durch technische Maßnahmen wie Belüftung, Einstellen physikochemischer Parameter und mehrstufige Verfahrensweise die Stoffwechselaktivität der natürlichen Mikroflora aktiviert wird. Grundlage der Umweltbiotechnologie ist die angewandte Hydrobiologie (Klee [1991]). Seit der Jahrhundertwende wird das mikrobiologische Selbstreinigungspotential zur Reinigung von Abwässern und zur Trinkwassergewinnung verfahrenstechnisch genutzt. Biologische Kläranlagen (Schmider [1981]) ahmen die natürlichen Reinigungsvorgänge nach (aerobe Belebungsbecken, anaerobe Faultürme) und intensivieren sie durch Schaffung optimaler Lebensbedingungen für die Mikroorganismen. Naturnahe Methoden nutzen Abwasser-, Fischteiche und Sumpfpflanzenbeete. Die Trinkwasserversorgung nutzt Uferfiltration, Versickerung und Denitrifikationsreaktoren (Rohmann [1988]). Mit zunehmendem Umweltbewußtsein kam Ende der siebziger, Anfang der achtziger Jahre der Begriff Altlasten in die um- 1-3 1-4 Einleitung weltpolitische Diskussion. Basierend auf den klassischen Techniken der Abwasserreinigung wurden verschiedene Verfahren zur Altlastensanierung für Boden und Grundwasser entwickelt1. Dem Problem belasteter Fließgewässersedimente begegnet man dagegen bislang nur selten, zumeist nur, wenn Sediment zur Vertiefung von Fahrrinnen ausgehoben wird. Die Hamburger Hafenbecken müssen z.B. jährlich mit einem Aufwand von über 50 Mio. DM ausgebaggert und rund 1 Mio. m3 mit Schwermetallen und organischen Schadstoffen kontaminierte Sedimente durch Deponierung entsorgt werden. Teilweise wird das Problem „entfernt“ indem der Schlick einfach durch Eggen in den Flußlauf zurückgegeben wird (Wilken et al. [1991]). Durch die Belastungssituation in den fünf neuen Bundesländern wurde immer wieder auf die Problematik der Remobilisierung von Schadstoffen aus den „Altlasten Fließgewässersedimente“ hingewiesen (siehe z.B. Statusbericht des BMFT [1995], Gewässergüteberichte der Region). Die Beseitigung dieser Altlasten steht aber nicht im Mittelpunkt des öffentlichen Interesses, da die Altlast die primäre Nutzung des Fließgewässers (als Transportweg, Vorfluter) nicht beeinflußt, nach Eliminierung des Emittenten nur zeitweilig in Erscheinung tritt (bei Hochwasser oder Ausbaggern) und sich darüberhinaus selbst entsorgt (durch Abfluß ins Meer, Selbstreinigung). Im Vordergrund steht verständlicherweise die Vermeidung der Fließgewässerbelastung. Zur Verminderung der Gewässer- und Sedimentbelastung durch schwer abbaubare beziehungsweise gefährliche Stoffe ist die Entwicklung von Methoden für die industrielle Abwasserbehandlung derzeit von größter Bedeutung. Da oft Einzelstoffe in hoher Konzentration (AOX) oder extremer Toxizität (z.B. Schwermetalle) die Hauptbelastung bilden, gehört hierzu die Entwicklung stoffspezifischer Behandlungsverfahren. Die Optimierung der umwelttechnischen Anlagen (Abwasserbehandlung, Altlastensanierung, Trinkwasseraufbereitung) ist in Hinblick auf die Biodegradation von Xenobiotika jedoch nicht möglich ohne Wissen um die taxonomische Struktur der natürlichen Mikroflora (Dwyer et al. [1988]). Die mikrobielle Ökologie belasteter Böden, Gewässer und Sedimente ist daher sowohl in ökologischer als auch in technologischer Hinsicht relevante Forschungsaufgabe. In Hinblick auf die Optimierung technischer Anwendungen stellen sich momentan vorrangig zwei Aufgaben: 1) die taxonomische Struktur der Populationen mit Selbstreinigungspotential zu bestimmen 2) die Isolierung natürlicherweise relvanter Bakterien 1 Derzeit kennt man Verfahren zur oberirdischen Bodenentnahme und Behandlung (on site bzw. off site Mieten-Verfahren) und unterirdische (in situ-) Verfahren zur Reinigung ungesättigter Bodenzonen und Aquifere (Hanert et al. [1990]). Vergleiche Seppänen & Wihuri [1988], Raymond et al. [1976] Einleitung 1.2.2 Mikrobielle Ökologie Geringe Biodegradation gefährlicher Substanzen (Pestizide, halogenierte Aliphate und Aromaten wie Benzoate, Biphenyle, Aniline) in der Umwelt kann verschiedene Ursachen haben: Bakterientoxizität der Substanzen oder Akkumulation toxischer Intermediärprodukte, ungünstige physikochemische Bedingungen (T, pH, Redoxpotential, Salzgehalt, Sauerstoffgehalt), Vorhandensein und Bioverfügbarkeit anderer Nährstoffe (Wasserstoffakzeptoren, Mineralstoffe, deren Löslichkeit, Adsorption an Partikel), Räuberdruck, aber auch fehlende Kapazität der natürlichen Mikroflora, Substanzen mit ungewöhnlicher chemischer Strukturen oder Eigenschaften effektiv umzusetzen. Derartige, für die existierenden Enzymsysteme fremde Komponenten, nennt man Xenobiotika. Häufig können sich mikrobielle Gemeinschaften die solchen Xenobiotika ausgesetzt sind, an diese Chemikalien adaptieren. Tolerante und abbauende Bakterien sollten unter diesen Bedingungen „natürlich“ angereichert werden. Aus derartigen Gesellschaften wurden Mikroorganismen isoliert, die die Xenobiotika komplett und in akzeptabler Rate metabolisieren. Bis ins Detail wurde das Abbauverhalten der einzelnen Stämme bestimmt (Neilson [1990]) und durch Einbau zusätzlicher katabolischer Gene die molekularen Ereignisse und regulatorischen Mechanismen des Abbauverhaltens erforscht. Die Isolierung und weitere Modifizierung von Mikroorganismen, die chemische Schadstoffe besser abbauen oder detoxifizieren können, und deren Entwicklung als Biokatalysatoren soll neue Verfahren für die Entsorgung ermöglichen. Sanierungsmaßnahmen für kontaminierte Böden, Gewässer und Grundwässer, Kläranlagen und Trinkwasseraufbereitungsanlagen (Rohmann [1988]) könnten durch Zusatz isolierter degradierender Bakterien oder Konsortien und auch genetisch manipulierter Mikroorganismen (Sussman et al. [1988]), optimiert werden. Es hat sich jedoch erwiesen, daß hierzu weniger die Autökologie als die populationsökologischen Aspekte zu berücksichtigen sind: Bislang sind spezialisierte Stämme nur unter spezifischen Bedingungen stabil zu erhalten. Thiobacillus denitrificans-Monokulturen sind z.B. unter den sehr selektiven Bedingungen der autotrophen Denitrifikation in Trinkwasseraufbereitungsanlagen stabil. Animpfen heterotropher Reaktoren mit speziellen Monokulturen verkürzte dagegen lediglich die Anfahrphase, die Dominanz der Kultur ging bei Anpassung der Biozönose an die Betriebsbedingungen verloren (Rohmann [1988]). Auch zur Bioremediation2 in Boden und Abwassersystemen konnten bislang nur unter selektivem Druck eines spezifischen Substrates oder toxischer Chemikalien isolierte und genmanipulierte Stämme erfolgreich angewandt werden. Häufig zeigte die Kontrolle eingebrachter Bakterien (z.B. mittels selektiver Anzucht der mit Antibiotika-Resistenz markierten Stämme, Einsatz von Gensonden oder PCR-Amplifikation spezifischer genetischer Marker) in kurzer Zeit drastische Abnahme der Zellen und fehlende Abbaueffizienz. 2 Stimulierung eingeführter oder vorhandener Mikroorganismen zum Abbau von Verunreinigungen 1-5 1-6 Einleitung Als Gründe für die Inkompetenz der hochgezüchteten degradierenden Mikroorganismen in situ werden die konkurrierenden natürlichen Mikroorganismenpopulationen (besetzte ökologische Nischen), mangelnde Angepaßtheit an die gegebenen Umweltbedingungen und Auswaschungseffekte gesehen (Scheuermann et al. [1988]). Vorhandensein einer Kombination von Problemstoffen, extreme pH und Sauerstoffverhältnisse können den Spezialisten des Bioreaktors überfordern. Für die Konstruktion genetisch veränderter Bakterien sucht man nun nach gut angepaßten, in der gegebenen Umwelt überlebensfähigen Stämmen (Sussman et al. [1988]). Ursächlich sind auch die Anreicherungsbedingungen zu nennen. Die häufig zur Isolierung Xenobiotikaabbauender Bakterien (nach Kiyohara et al. [1992]), aber auch zur Bestimmung des vorhandenen Selbstreinigungspotentials (Hanert et al. [1990]) verwendeten Minimalmedien, mit dem abzubauenden Stoff als einzige Kohlenstoffquelle, entsprechen ungleich härteren Bedingungen als vor Ort und liefern wahrscheinlich extreme Spezialisten. In einer Multisubstrat-, Multiorganismen-Umgebung ohne spezifischen Selektionsdruck können diese Organismen im Allgemeinen nicht erfolgreich sein (Van der Meer et al. [1992]). Natürlicherweise vorhandene Kosubstrate, einfache organische Substanzen oder selbst Aromaten wie Phenol, können die Abbaurate bereits erheblich steigern (Gorlatov & Golovleva [1992]). Eine primäre Anreicherung und Isolierung mit dem Standortsubstrat (auf Boden-/Sedimentextraktmedien) könnte daher bereits besser angepaßte, stärker degradierende Bakterien liefern. Derzeitiges Wissen spricht dafür, das vorhandene Potential der Mikroorganismen neue und notwendige Abbauwege selbst zu evolvieren auszunutzen. Fakt ist, daß natürlich evolvierte Mikroorganismen konkurrenzfähiger sind, da sie bereits die natürliche Auslese überlebt haben (Van der Meer et a. [1992]). Zum anderen sind Mikroorganismen im Allgemeinen so weit verbreitet, daß sie überall dort, wo sie zu leben und zu wachsen vermögen, mit großer Wahrscheinlichkeit auch vorkommen. Oder anders ausgedrückt, wenn ein Mikroorganismus dort nicht vorhanden ist, so hat dies für gewöhnlich einen Grund. Es ist daher schwierig, einen Mikroorganismus in eine fest etablierte Umwelt einzuführen, in der er gegenwärtig nicht existiert. Bakteriengruppen die eine gewünschte Stoffwechselfähigkeit besitzen, werden heute zur Abwasserreinigung, Trinkwasseraufbereitung standardmäßig in situ oder im Bioreaktor aktiviert und angereichert. Umfassendes Wissen über das Verhalten degradierender Taxa in situ und genaue Kenntnis ihrer Populationsökologie, könnten eine gezielte Selektion der Bakterien zur Altlastensanierung ermöglichen. In der bisherigen Praxis wird dagegen relativ unspezifisch die Aktivität von Mikroorganismen, d.h. auch möglicher Konkurrenten der Degradierer oder pathogener Taxa, erhöht. In die gleiche Richtung zielen Ansätze zur Kultivierung der Bakterien im Kontext ihrer superorganismischen Strukturen wie Populationen, Assoziationen (Lebensgemeinschaften) und Ökosysteme. Wiederholt wurde die höhere Effizienz bakterieller Konsortien im Abbau von Problemstoffen gezeigt (Pettigrew et al. [1990]: Kometabolismus und Symbiose, Davison et al. [1994]: synergistisches Wachstum, Field et al. [1995]: Ermöglichung der Mineralisierung). Daher werden für Umweltschutz und Produktion wichtiger Substanzen zunehmend alternative Ansätze der Ökosystem-Biotechnologie überdacht, die Mikroorganis- Einleitung men in ihrer natürlichen Umgebung kultivieren. Zugrunde liegt die Annahme, daß 1) in der Regel mit der Diversität die Stabilität eines Systems zunimmt, und daß 2) ein Organismus verschiedene Rollen im Ökosystem erfüllt und 3) die Kombination derartiger Organismen stabiler, flexibler und unter bestimmten Bedingungen effizienter arbeitet. Aus Mischsubstraten erzielen demnach nur Mischkulturen vernünftig das gewünschte Produkt oder den Abbau bestimmter Substanzen. Bereits im großen Maßstab angewandt wird die Kultivierung von Mischpopulationen in der Methanproduktion aus organischem Abfall, denn Reinkulturen methanogener Archaebakterien können per se keine komplexen organischen Substrate verwenden (Oleskin & Samuilov [1992]). Zu fragen bleibt, mit welchen Gefahren die massive in situ Vermehrung oder Zufuhr einzelner Bakteriengruppen und die Freisetzung gentechnisch veränderter Mikroorganismen verknüpft ist. Für die praktische Umsetzung und als Entscheidungsbasis für eine sachlich fundierte Risikobewertung moderner Entwicklungen in der Bio- und Gentechnologie, ist das Wissen um die grundlegenden Zusammenhänge ökologischer Wirkungsgefüge Voraussetzung (BMFT [1992]). Das heißt, die taxonomische Struktur der endogenen mikrobiellen Gemeinschaft, ihr genetisches System und ihre Pufferkapazität müssen bestimmt werden (Sussman et al. [1988]). Für den Einsatz, bzw. die Anreicherung spezifischer Stämme und Konsortien in situ ist bislang einfach zu wenig über die mikrobiellen Grundlagen in komplexen Ökosystemen bekannt. Taxonomische Bestimmung von Bakterien Die größte Lücke in unserem Kenntnissstand mikrobieller Ökologie ist der Mangel an Informationen über die taxonomische Struktur natürlicher Mikrobengesellschaften. Nur in sehr extremen oder streng zonierten Habitaten wie heißen Quellen (Stahl et al.[1985]) und mikrobiellen Matten (Cohen & Rosenberg [1989]) ist die taxonomische Zusammensetzung der Biozönose inzwischen besser untersucht. Gegenwärtig ist zwar der prinzipielle Ablauf vieler mikrobiologisch-ökologischer Prozesse bekannt, die Regulationsmechanismen und die Populationsdynamik dieser Prozesse sind aber noch weitgehend unverstanden. Es fehlen Mikroorganismen-orientierte Studien zur Struktur und Funktion von Ökosystemen, Gemeinschaften und Populationen. Prozesse der Respiration, Degradation, Stickstofffixierung usw. wurden als wichtiger erachtet als die Organismen selber, obwohl das Wissen um die verantwortlichen Organismen notwendig für das Verständnis der Prozessregulierung ist. Bedingt wird dieser Mangel an Verständnis durch das Fehlen eines ausreichenden methodischen Instrumentariums für die Aktivitätsbestimmung und Identifizierung der Organismen in ihrer natürlichen Umgebung. Grund ist auch das Fehlen zuverlässiger Identifizierungsmethoden und mangelhafte taxonomische Beschreibung der analysierten degradierenden Stämme, bei gleichzeitig revolutionären Entwicklungen in der bakteriellen Systematik. Die vielfache Nennung von Arthrobacter, Pseudomonas und Bacillus unter den am häufigsten isolierten mikrobiellen Gattungen mit Bedeutung für den Abbau von Xenobiotika (siehe Tab. 1.2) ist nach heutiger Kenntnis eher auf die vage taxonomische Bestimmung zurückzuführen als auf „charakteristische Abbau- 1-7 1-8 Einleitung fähigkeiten“ der Taxa. Nach der Reklassifikation der Pseudomonaden (Kersters et al. [1996]) gehören die nahezu universell bestimmten, degradierenden „Pseudomonas spec.“ vielfach dem Acidovorax- und Alcaligenes-Zweig der β-Proteobakterien an (Busse et al. [1992]). Eine ähnliche Reklassifizierung zeichnet sich innerhalb des Phylums Gram-positiver Bakterien für die phylogenetisch heterogenen Gruppen Bacillus und Clostridium ab (Collins et al. [1994]). Symptomatisch für die Situation ist, daß Acinetobacter spec. P6 (Gram-negativ), einer der bekannten PCB abbauenden Stämme, ebenso wie dessen Kontaminant Corynebacterium spec. MB1 (Gram-positiv) von Asturias et al. [1994] als Gram-positive Rhodococcus globerulus-Stämme reklassifiziert wurden. Eine umfassende Charakterisierung belasteter Standorte nach den neuesten taxonomischen Kentnissen ist dringend erforderlich. Nur die akkurate Identifikation der Bakterien in der Umwelt bietet den geforderten Einblick in die autochthone Bakterienflora. Zur mikrobiellen Charakterisierung eines Ökosystems können Identifizierung der isolierbaren Mikroorganismen und die Erfassung ihrer physiologischen Leistungen im Zusammenhang mit gegebenen physikochemischen Parametern dienen (Dott & Kämpfer [1988]). Die kultivierbare Biozönose liefert wertvolle Informationen zur Beschreibung eines mikrobiologischen Ökosystems, dessen Zusammensetzung und Schwankungen, sowie der Belastung und Belastbarkeit durch exogene Faktoren. Der vergleichende polyphasische Einsatz numerischer taxonomischer und neuer genetischer Verfahren bietet heute die Voraussetzungen für die geforderte akkurate Bestimmung der Isolate und ermöglicht den Aufbau einer umweltgerechten Systematik, bzw. Taxonomie. Legende (Tab. 1.2): 1 2 Kometabolismus Metabolismus & Kometabolismus kombiniert 3 4 Kometabolismus zweier Arten mit Cyclohexan terminale Oxygenierung Einleitung Tab. 1.2 Einige mikrobielle Gattungen mit Bedeutung für den Abbau von Xenobiotika (Higgins & Burns [1975]) Bakterien Herbizide mindestens 16 Bakterienarten Pseudomonas, Xanthomonas, Sarcina, Bacillus, u.a. Pseudomonas Corynebacterium Achromobacter Bacillus Arthrobacter Flavobacterium Nocardia Aerobacter aerogenes, Hydrogenomonas1 Arthrobacter, Achromobacter2 Substanz Abbau Chlorphenoxyessigsäure (2,4D) Harnstoff vollständiger Abbau TCA, Dalapon, 2,4D, Monuron, PCP, Paraquat, Diquat, DNOC 2,4D, Paraquat 2,4D, 2,4,5T, MCPA Dalapon, Monuron TCA, Dalapon, 2,4D, 2,4,5T, Propanil, DNOC Dalapon, 2,4D, 2,4DB, Maleinsäure Hydrazid Dalapon, 2,4D, 2,4DB, Propanil DDT 2,3,6TBA, 2,4,5T, 2,4D Wuchs mit Pestiziden als einzige Energie-, C-, oder N-Quelle Organophosphate rascher Abbau im Boden Insektizide Pseudomonas fluorescens, Thiobacillus thiooxidans, u.a. Pseudomonas melophthora Arthrobacter, Streptomyces Pseudomonas Arthrobacter,Achromobacter,u.a. Parathion, Diazinon Diazinin Malathion Carbamat (Naphthalin) Fungizide Escherichia coli, Nocardia, Corynebacterium simplex Phenole & verwandte Komponenten Detergentien Pseudomonas, P. putida, Bacillus, Seife, Sulfonate Aerobacter cloacae Pseudomonas, Clostridium glycolicum, nicht-ionische Detergentien Acetobacter,Aerob.aerogenes,Gluconobac. Pseudomonas, Aerobier, Anaerobier phosphatfreie Waschmittel (NTA) kationische Detergentien . i.R. harmlos, nicht-persistent, hohe Toleranz, rascher Abbau zumeist extensiver aerober und anaerober Abbau i.R. rascher Abbau, nicht toxisch, Gefahr der Nitrosaminbildung effektive Inhibierung, z.T. extreme Resistenz (Gram-pos. < Gram-neg. Bakterien) Synthetische Polymere thermophile Bodenmikroflora PVC, PTFE, Polyacrylonitrile, -Propylen, -Ethylen, -Ester, -Amide, Elastomere Kohlenwasserstoffe ca. 20% der Mikroorganismenarten, Pseudomonas, Nocardia, Mycobacteria Pseudomonas oleovorans, Corynebacterium4; Nocardia1 Pseudomonas3, Nocardia petroleophila Alkane, Alicyklen, Aromaten n-Alkane Alizylklen Abbau relativ selten, meist sehr langsam, physik. Veränderungen durch mikrob. Ausscheidungen 1-9 1-10 Einleitung 1.3 Charakterisierung des Standortes Charakteristisch für die Belastung der Fließgewässer in der ehemaligen Deutschen Demokratischen Republik war der katastrophale Sauerstoffrückgang in der Elbe in den 50er Jahren und permanenter Sauerstoffmangel bis etwa Mitte des Jahres 1990. Als Ursache sind vor allem die Wiederaufnahme und Steigerung der industriellen Produktion nach dem Krieg in teilweise veralteten Betrieben zu nennen und der ausbleibende Bau notwendiger Abwasserbehandlungsanlagen. Die Mehrzahl der Kläranlagen verfügte nur über eine mechanische Reinigungsstufe, war technisch meist völlig veraltet, häufig überbelastet und in schlechtem Wartungszustand. Abwässer gelangten daher oftmals nicht oder nur unvollständig behandelt in die Vorfluter. Hauptverursacher der extremen Gewässerbelastung war die chemische Großindustrie. Erst mit der Wende (1989) setzte in den fünf neuen Bundesländern durch Schließung von Betrieben und Produktionsreduzierung, zunehmend unterstützt durch den Bau von Kläranlagen, die Entlastung der Elbe und ihrer Nebenflüsse ein (Spott [1995]). Als Altlasten werden noch über Jahre hinaus die Flußsedimente zu benennen sein. Das Elbe-Sediment weist z.B. hohe Konzentrationen an Schwermetallen (v.a. Quecksilber und Zinn) in zumeist hochtoxischen organischen Verbindungen sowie schwer flüchtige chlorierte Verbindungen auf. Als Produktions-charakteristischer Abfallstoff kann die Belastung des Elbe-Sedimentes mit Tetrabutylzinn über die Mulde bis in den kleinen Nebenfluß Spittelwasser zurückverfolgt werden, der Abwasser der Industrieregion Bitterfeld abführt. Die Spittelwasser wird von der Arbeitsgruppe Molekulare Mikrobielle Ökologie der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig (GBF) seit Beginn der 90er Jahre beprobt und als eine Quelle für Bakterien mit schadstoffdegradierendem Potential genutzt. Als Modell für ein extrem belastetes Fließgewässer bietet sie die Möglichkeit grundlegende ökologische Zusammenhänge der Bioremediation in situ zu studieren. Die Spittelwasser dient den Chemiewerken des Industrieparks Bitterfeld-Wolfen (Landkreis Bitterfeld, Sachsen-Anhalt) und der Stadt Bitterfeld als „Abwasserrinne“. Aufgrund der hohen Schadstoffbelastung ist das Gewässer biologisch verödet. Mit auffälligen Geruch und Färbung steht die Spittelwasser in scharfem Kontrast zu der naturgeschützen Auenlandschaft, die sie frei durchfließt. Das Abwasser wird von Bitterfeld über den cirka 5 km langen Schachtgraben in die östliche Fuhne und bei Jeßnitz in die Spittelwasser eingeleitet (siehe Karte, Abb. 1.1). Nach etwa 4 km mündet der Fluß bei Raghun in einen Stichkanal der Mulde ein, die wiederum bei Dessau in die Elbe fließt. Die Industriefelder von Bitterfeld liegen im Hochwasserbereich der Mulde und wurden seit Beginn der Industrieansiedlung vor 100 Jahren durch die ursprünglichen Altarme der Mulde und zusätzliche Gräben entwässert. Die Spittelwasser wird hierdurch stark beeinflußt. Bei starker Wasserführung in der Mulde wird das Wasser in den Seitenarmen aufgestaut. Die Hochwasserphasen führen in der Spittelwasser auch zur Auswaschung des im Randbereich bis zu 60 cm anwachsenden Schlammes und Abtransport der darin abgelagerten Substanzen. Einleitung Abb. 1.1 Lage der Probenahmestelle im Landkreis Bitterfeld, Sachsen-Anhalt Der Pfeil kennzeichnet die Probenahme oberhalb der Einmündung in den Stichkanal zur Mulde Der Ausschnitt ist einer Militärkarte der früheren DDR entnommen, Maßstab 1:25.000 1-11 1-12 Einleitung 1.3.1 Standortentwicklung 1989-1994 Seit 1989 wird der Zustand der Fließgewässer regelmäßig und detailliert in den Gewässergüteberichten Sachsen-Anhalts beschrieben. Die Daten der Mulde als ableitender Fluß der Spittelwasser reflektieren deren Schadstofffracht und die allgemeine Standortentwicklung. Durch Betriebsstillegungen und Produktionsrückgang sank die Belastung bis 1992 sprunghaft, während sich der Rückgang 1993/1994 (im Beprobungszeitraum der vorliegenden Arbeit) wesentlich verlangsamte. Tab. 1.3 Belastung der Mulde durch industrielle und kommunale Einleiter (Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt [1994]) Einleiter Jahr CSB [t/a] BSB [t/a] kommunal 1989 1992 1993 . 1.388 1.622 1.257 871 790 industriell 1989 19921 19931 144.000 7.067 5.813 Hg [t/a] 6 0,085 0,076 TIN [t/a] Pges. [t/a] AOX [t/a] 251 188 201 . 28 24 . 1,68 0,30 5.050 655 490 . 34 58 580 112 137 Legende: . Pges Hg CSB BSB AO X TIN 1 keine Angaben Summe aller Phosphorverbindungen Quecksilber, stellvertretend für Schwermetallverbindungen Sauerstoffbedarf für die chemische Oxidation der enthaltenen oxidierbaren Stoffe Biochemischer Sauerstoffbedarf, Sauerstoff der in einem bestimmten Zeitraum von den im Wasser lebenden Organismen für die Oxidation der abbaubaren Stoffe verbraucht wird absorbierte organische Halogenverbindungen gesamt anorganisch gebundener Stickstoff Der Anstieg der AOX- und Pges.-Frachten bei den industriellen Einleitern wurde auf Sanierungsmaßnahmen am Kanalsystem in der Region Bitterfeld-Wolfen zurückgeführt Die Jahresfrachten der industriellen und kommunalen Abwassereinleiter in die Mulde (Tab. 1.3) lassen anhand der Summengrößen der organischen Belastung und Quecksilber (stellvertretend für Schwermetallverbindungen) die extrem hohen Konzentrationen bis zur Wende erkennen. Infolge der drastischen Reduzierung der organischen und toxischen Belastungen (durch Betriebsstillegungen und in Betriebnahme von 87 neuen Kläranlagen bis 1994) erfüllt die Mulde nun die Mindestgüteanforderungen für Gewässer ohne konkrete Nutzung (Güteklasse II-III, kritisch belastet). Der Hauptemittent war die Chemie AG Bitterfeld-Wolfen (Umweltbundesamt [1992]). Das Umweltbundesamt betonte den Handlungsbedarf zur Sanierung des Einleiters und warnte besonders vor einem rapiden Anstieg des Schadstoffausstoßes bei Erhöhung bzw. Wiederaufnahme der Produktion vor Abschluß der Sanierung. Im Jahr 1893 gegründet, waren die Werke eine der ersten und bedeutendsten chemischen Produktionsstätten. Die Erfindung der NaCl-Elektrolyse zur Herstellung von Chlor Ende des 19. Jahr- Einleitung hunderts führte neben massivem Einsatz von Chlorat als Bleichmittel zur Entwicklung extrem stabiler Verbindungen wie Herbizide, PVC und anderer Kunststoffe. Bekannte resultierende Abfallprodukte sind hohe Konzentrationen an freiem, hoch reaktiven Chlor, Chloralkane, chlorierte Aromaten und Quecksilber. Das Chemie-Kombinat in Bitterfeld-Wolfen wurde zu einem Industriestandort mit breiter Anwendung der modernen Elektro- und Chlorchemie. Nach der Wende 1989 wurden die umweltbelastenden Chloralkalielektrolysen nach dem Amalgamverfahren (Quecksilberbelastung) eingestellt. Seit 1992 werden organische Farbstoffe und Zwischenprodukte, Pflanzenschutzmittel, Anorganika und organische Chlorierungsprodukte produziert. Von der für Ende 1993 geplanten Gemeinschaftskläranlage wurde erst zu Beginn 1994 die mechanische Klärung in Betrieb genommen. Die Betreiber rechneten dadurch bereits mit einer weiteren CSB-Reduktion um 10-15%. Weiterhin wird das Abwasser mit dem Kühlwasser in den Vorfluter Spittelwasser eingeleitet. Die Konzentrationen an Calcium, Natrium, Chloriden, Sulfaten und Härtebildnern in der Mulde erhöhten sich durch die Ableitungen aus dem Raum Bitterfeld um ca. 10-20%. In größeren Mengen wurden Arsen, Blei, Cadmium, Quecksilber eingetragen (Gewässergüteberichte Sachsen-Anhalt [1991-1994]). Durch Einstellung der Chloralkalielektrolyse der Chemie-AG sank die Quecksilberbelastung auf 45% des Wertes vor 1989. Trotzdem war im Unterlauf der Mulde 1991 Quecksilber noch in so hoher Konzentration nachzuweisen, daß das Gewässer als vergiftet eingestuft wurde (Umweltbundesamt [1992]). Die organische Abwasserlast sank durch die Produktionsstillegungen bis 1992 sprunghaft um etwa 90% und bis 1994 um weitere 5%. Entsprechend stiegen die O2-Konzentrationen und setzten Nitrifikationsvorgänge ein (sinkende NH4-, steigende NO3-Konzentrationen). Die AOX-Werte (adsorbierbare organische Halogenverbindungen) sanken nach Firmenangaben bis 1990 um etwa 40% (Umweltbundesamt [1992]). Produktionsabhängig wurden in der Gewässergütebestimmung zu verschiedenen Zeiten größere Mengen leicht-flüchtiger Halogenwasserstoffe und schwerflüchtige Hexachlorcyclohexane bestimmt, darüberhinaus wurden eine ganze Reihe chemischer Stoffe erfasst für die Grenzwerte, z.B. nach der Trinkwasserverordnung, existieren3 (Gewässergüteberichte Sachsen-Anhalt [1990]-[1994]). Die Belastungssituation an organischen Schadstoffen stellte sich nach diesen Berichten zunehmend günstiger dar, aber bei Durchflußanstieg ist mit Remobilisierung aus dem Sediment und mit enormen Konzentrationen organischer Schadstoffe in der Wasserphase zu rechnen. 3 Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe: Fluoranthen, Benzo(b)-, Benzo(k)Fluoranthen, Benzo- (a)Pyren, Benzo(ghi)Perylen, Indeno(1,2,3cd)Pyren; Organische Chlorverbindungen: 1,1,1-Trichlorethan, Trichlorethylen, Tetrachlorethylen, Dichlormethan, Tetrachlorkohlenstoff; Chemische Stoffe zur Pflanzenbehandlung und Schädlingsbekämpfung und toxische Hauptabbauprodukte (z.B. HCH); Polychlorierte, polybromierte Biphenyle und Terphenyle 1-13 1-14 Einleitung 1.3.2 Spezifische organische Belastung zum Zeitpunkt der Probenahmen (1993/1994) Im Rahmen des Projektes „Elbe und Nebenflüsse“ des BMFT wurde im Oktober 1993 ein Screening der organischen Substanzen in Wasser und Sediment des Muldesystems durchgeführt (Statusbericht BMFT [1995]). Generell wurde im Unterlauf der Mulde eine Zunahme der Chloraliphaten, -Aromaten, Chlor-, Nitro-, Aminobenzole und HCH-Isomere und Vorkommen der Phthalsäure-, Phosphorsäureester, aromatischer Ketone (z.B. Naphthalin) und einkerniger Aromate (z.B. Benzole, Toluole, Xylole, Ethylbenzol) im Wasser bestimmt. Zu vergleichen waren hier die Daten vor und unmittelbar nach Einmündung der Spittelwasser in die Mulde (Meßstellen Pouch / Raghun). Tab. 1.5 Belastung des Wassers mit organischen Substanzen, Mulde Oktober 1993 (Statusbericht BMFT [1995]) Substanz P R D Substanz Aromaten Ethylbenzol, C3-Benzole, Trimethylbenzole, Toluol, m/p-, o-Xylol n-Propylbenzol PAH, Me-PAH / Aromatische Ketone Naphthalin, Phenanthren, Anthrachinon, Fluorenon, Fluoranthen, Pyren Cyclopenta(def)-Phenanthrenon, Acetophenon, Benzophenon Phthalsäureester Dimethyl-, Ditere-/-isophthalat, Diethyl-, Diiso-, Dibutyl-, Bis(2-Ethylexyl)-Phthalat Benzylbutylphthalat Phosphorsäureester Triisobutyl-, Tributyl-, Triphenylphosphat, Tris(1-Chlor-2-Propyl)-Phosphat O,O,S-Trimethyldithiophosphat Pestizide & Metabolite 2-Phenylphenol Heterocyclen + + + Acridin, Xanthon Chloraliphate + + Trichlorethen Tetrachlorethen + + + Disulfide Methyl-, Ethyl-, Diisopropyldisulfid + + Dimethyldisulfid Chloraromaten 1,2-, 1,3-, 1,4-Dichlorbenzol, 1,2,4-, 1,2,3+ + + Trichlorbenzol Chlorbenzol + Chlor-, Nitro- und Aminobenzole Azobenzol + + + N-Ethylanilin Andere Industrieprodukte + + 2-Phenoxyethanol N,N-Diethyl-N,N-Diphenylharnstoff, + Benzothiazol, 2-Thiomethylbenzothiazol, + + + Diphenylsulfon, 4-Tertbutylcyclohexanon, Prometryn, α-, β-HCH γ-HCH (z.B. Lindan) + + P R D + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 2-Ethylhexansäure, Galaxolit Legende (Tab. 1.5, Tab. 1.6): P / R Pouch / Raghun: Probenahmeort oberhalb / unterhalb der Einmündung der Spittelwasser in die Mulde D Dessau-Törten: Probenahmeort vor der Einmündung der Mulde in die Elbe Unterstreichungen kennzeichen Verbindungen (bzw. deren Derivate) die im Rahmen dieser Arbeit zur Charakterisierung des mikrobiellen Selbstreinigungspotentials der Spittelwasser verwendet wurden Einleitung Tab. 1.6 Belastung des Sedimentes mit organischen Substanzen, Mulde Oktober 1993 (Statusbericht BMFT [1995]) – Legende siehe Tab. 1.5 Substanz [µg/kg] P R D Substanz [µg/kg] Alkane: n-Undecan bis -Tetratriacontan Terpendiole Tetrahydro-, Reten, Diplopten, Hopan + + + Sauerstoffheterocyclen Methyl-, C2-, Dibenzofuran, Methyl-, + + + C2-, Benzonaphthofuran + Stickstoffheterocyclen α-,β-Pinen, Cadalen, 1,3,8p-Menthatrien, δ3-Caren, p-Cymol, α-Caryophyllen, Campher, Nerylaceton Aldehyde, Ketone n-Dodecanal bis n-Dotriacontanal, 2-Octanon bis 2-Heptadecanon, Methyl-, Dimethylbenzaldehyd 6,10,14-Trimethylpentadecan-2-on, Benzaldehyd, 4-Methylacetophenon Alkylbenzole, Phenylalkane Phenylundecan, -Dodecan, -Tridecan Trimethylbenzol Alkylphenole: 2,6-Ditertbutyl-p-Cresol PAH, c-PAH, Hydro-PAH Naphthalin, 1-, 2-Methyl-, Dimethyl-, Propyl-, Ethylmethyl-, Trimethyl-, C4-, 1-, 2-Phenylnaphthalin, Biphenyl, 2-, 3-, 4-Methyl-, Dimethyl-, C3-Biphenyl, Triphenylmethan,o-, p-Terphenyl, Chrysen / Triphenylen, Benz(b)-, Dibenzo-(def, mno)-Chrysen, 3,3,7-Trimethyl-, 1,2,3,4-Tetrahydrochrysen, TetramethylBenz-, Acenaphthylen, Acenaphthen, Fluoren, 9-, Methyl-, C2-Fluoren, Benzfluoren, Pyren, Methyl-,Cyclopenta(cd)-, Benz(e)-, Benz(a)-, Indeno(1,2,3-cd)-, Methyl-, Dimethyl-, Ethylpyren, Fluoranthen, 1-Methyl-, Benz(ghi)-, Benz(j,k,b), Methyl-, Dimethyl-, Ethylfluoranthen, Perylen, Benz(ghi)Perylen, Phenanthren, 1-, 2-, 3-, 4-, 9-Methyl-, Dimethyl-, Ethyl-, C3-, 4H-Cyclopenta(def)-, Benz(c)-, Phenyl-, Dihydrophenanthren, Anthracen, Methyl-, Dimethyl-, Phenyl-, Benz(a)-, Dibenzanthracen, Binaphthyl Typ 1,2 / 2,2, Picen Ethylnaphthalin, m-Terphenyl Schwefelheterocyclen Methyl-,Benz(b)-,Benzonaphtho-,MethylDimethyl-, Ethyldibenzothiophen 9H-Carbazol P R D + + + + + + Benzcarbazol + + Oxyaromaten + + + Biphenylether, Dimethoxyphenanthren + + + Methyl-, Propenylanisol, 2-Ethoxynaph+ thalin + Amine u. a. Stickstoffverbindungen N-Ethylanilin, N-Formylpiperidin + + + N,N-Methylphenylanilin + + + + + Chlorierte Monoaromaten 135 981 3699 + ΣChlorbenzole + + + Bromchlorbenzol <1 3 31 ΣChlortoluole (Di-, Trichlortoluol) + + + Bis(Chlormethyl)-,-Methylbenzol, -Xylol, Tetra-,Trichlortrimethylbenzol Dichlorxylol, Trichlorpropylbenzol Chlorierte Anisole <1 13 108 + + ΣChloranisole (Tetra-,Pentachloranis.) Tetrachlorveratrol (1-Chlor-2-Chlormethyl-3-Methoxypropyl)-Benzol Di-, Tri-Chloranisol Chlorierte Stickstoff-Monoaromaten Dichlorazoxybenzol, N-(2 Chlorethyl) -N-Ethyl-, N,NBis(2Chlorethyl)Anilin 9 ΣChlorthiophene: Tri-,Tetrachlorth. Chlorierte Di- und Triaromaten Di-,Trichlorbiphenyl, Di-, Trichlordi-, Tri-,Tetrachlor-, Triphenylmethan, Chlor-, Dichlor-,Trichlorbiphenylether Tetrachlorbiphenylether,Chlordi-,-tri-, Dichlortriphenylmethan,Chlorbiphenyl Pestizide & Metabolite <1 + 19 197 + + + + 34 80 + + + ΣHCH (α-, β-,γ-,δ-HCH) 94 ΣDDT-Gruppe 220 1731 8042 ΣMethoxychlor (o,o-, p,p-Methoxych.) + + 2,4-Dichlor-4-Nitrobiphenylether o,p-, p,p-Bischlorphenylacetonitril, + + + 1(2Chlorph.)1-,1,1Bis4Chlorph.ethen Zinnorganyle: Σ Tetrabutylzinn 94 986 <1 41 1272 20 153 286 + + <1 2083 2725 1-15 1-16 Einleitung Der Vergleich der Wasserproben (Tab. 1.5) zeigte die enorme Zunahme des Spektrums organischer Einzelstoffe (vor allem aromatischer Verbindungen) mit teilweise sehr hohen Konzentrationen, die auf Zuleitung aus Bitterfeld/Wolfen zurückzuführen ist. Im Sediment wurde eine besonders große Zahl organischer Substanzen identifiziert (Tab. 1.6). Alkane, Phenylalkane, Diterpenabkömmlinge und Hapone wurden im gesamten Muldesystem angetroffen. Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) und alkylierte PAH (c-PAH) waren in bemerkenswerter Zahl omnipräsent und wurden von teilhydrierten PAH, Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Stickstoffheterocyclen sowie Oxyaromaten begleitet. Gehäuft traten nach Einmündung der Spittelwasser bei Raghun allgemein chlorierte, cyclische und aromatische Verbindungen auf. Vor allem enorme Mengen Zinnorganyle, bestimmte industrielle Terpenoide (Campher, Pinen, Cadalen etc.), niedere Alkylbenzole sowie eine Gruppe chlorierter Monoaromaten wiesen auf die spezifische industrielle Einleitung hin. Die quantitative Bestimmung einiger wesentlicher Substanzen zeigte außerdem starke Zunahme der DDTMetabolite und Chlorbenzole, Zunahme der Chlorthiophene, Methoxychlorverbindungen und des Pestizids Nitrofen (2,4-Dichlor-4-Nitrobiphenylether). Im Rahmen des ARGE-Elbe-Meßprogramms (Arbeitsgemeinschaft für die Reinhaltung der Elbe [1996]) wurden für das Jahr 1994 Probenahmen der Mulde bei Dessau (vor der Einmündung in die Elbe) durchgeführt. In Monatsmischproben des frischen, schwebstoffbürtigen Sediments wurden verschiedene PCB (Polychlorierte Biphenyle), chlorierte Benzole und Phenole, Pestizide (DDT, HCH), Zinnorganyle und AOX (Adsorbierte organische Halogenverbindungen) bestimmt (Tab. 1.7). Der Vergleich mit den Sedimentdaten 1993 bestätigte qualitativ die anhaltend hohe Belastung. Die Werte unterlagen starken monatlichen Schwankungen, für die hydrologische / metereologische Gegebenheiten, aber auch Chargenproduktion in Wolfen-Bitterfeld bzw. Ausbringung in der Landwirtschaft ursächlich anzunehmen sind. Die Werte in Wassereinzelproben lagen wie zu erwarten deutlich unter denen des frischen, schwebstoffbürtigen Sediments. Im Gegensatz zu 1993 lagen 1994 jedoch die Werte für Chlorbenzene (0,001-0,2 µg/l) und BTXE (Benzen, Toluen, Xylen, Ethylbenzen: 1-5 µg/l) im Wasser grundsätzlich unterhalb der Bestimmungsgrenze. Die Analyse der spezifischen Inhaltsstoffe ließ allgemeine Abnahme der Belastung aus Bitterfeld-Wolfen von 1993 auf 1994 nicht erkennen (Die AOX-Werte der Gewässergüteberichte Sachsen-Anhalt für die beiden Jahre zeigten dagegen insgesamt sinkende Schadstofffracht im Wasser der Mulde, allerdings konnte anhand der Daten der Meßpunkte Dessau und Retzau auch kein Einfluß der Spittelwasser ausgemacht werden). Aufgrund der starken Anwendung im Agrarbereich und der Produktion in den chemischen Werken wurden über den Zeitraum der Probenahmen die meisten wichtigen Pestizidklassen in extremem Umfang nachgewiesen: Chlorierte Kohlenwasserstoffe, organische Phosphor-Verbindungen, Phosphorsäureester, Phenol-Verbindungen, Phthalsäure-Verbindungen, Phenoxycarbonsäuren, Harnstoff-Verbindungen und heterocyclische Verbindungen (Einsatz und Wirkung siehe Ernst et al. [1986]). Einleitung Tab. 1.7 Belastung der Mulde mit organischen Substanzen, Monatsmischproben 1994 (Arbeitsgemeinschaft für die Reinhaltung der Elbe [1996]) Substanz [µg/kg] Monatsmittel Min Max 2.-31.5. 19941 3.-29.8. 19941 4,99 * 10,6 16,3 PCB PCB Nr. 28, 52, 101 PCB Nr. 138, 153, 180 * 45,3 10,6 60 März Mai März 1604,3 154,8 6650 Okt. April 1209 719 29,4 6 48 Aug. Juli 40 6 170 665 470 27.700 Mai April Juli April 170 516 5190 2070 11,3 29,8 Chlorierte Monoaromaten Σ Chlorbenzole (Monochlorbenzen, Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexachlorbenzol) Σ Chlorphenole (Trichlorphenol, Pentachlorphenol) Pestizide und Metabolite Σ HCH (α-, β-,γ-HCH) 401,7 Σ DDT-Gruppe (p,pDDE, o,p-, p,pDDD, o,p-, p,pDDT) 4839,3 AOX Σ Zinnorganyle (Mono-, Di-, Tri-, Tetrabutylzinn) 247.000 150.000 Juli 580.000 April 190.000 170.000 27.317 10.980 60.080 24.040 33.470 Juni Sept. Legende: 1 Daten der Monatsmischproben zum Zeitpunkt der in vorliegender Arbeit erhobenen Proben * Werte für Juli bis September und Dezember unterhalb der Nachweisgrenze (<0,1 µg/kg) Probenahme in Dessau, vor der Einmündung der Mulde in die Elbe, Monatsmischproben vom 1.3.94-2.1.95 (Zinnorganyle vom 6.4.94-2.1.95) des frischen, schwebstoffbürtigen Sediments Darüberhinaus wurden spezifische Substanzen wie Farbstoffe, Lösungsmittel, organische und anorganische Nebenprodukte der Herstellung, sowie biotische und abiotische Abbauprodukte bestimmt. Das Vorkommen der Aromaten im Spittelwassersediment ist bezüglich ihrer Verbreitung, der Anwendung als Modellsubstanzen mikrobiellen Abbaus und in Hinblick auf die Nutzung des mikrobiellen Selbstreinigungspotentials für industrielle Zwecke von besonderem Interesse. Obwohl PAH (Polycyklische aromatische Kohlenwasserstoffe) nicht „bewußt“ hergestellt werden, gehören sie zu den am weitesten verbreiteten organischen Verunreinigungen. Sie werden bei unvollständiger Verbrennung fossiler organischer Energieträger freigesetzt (Otto- und Dieselmotoren, in Kokereien, Kraftwerken, Teerfabriken). Zu den produzierenden Branchen zählen unter anderem Lack- und Farbenfabriken. Der ubiquitäre Nachweis der flüchtigen BTXE-Aromaten (Toluol, Ethylbenzol, Xylol) im Wasser, Nachweis von Naphthalin, Biphenyl, Anthracen und deren Derivate im Sediment der Spittelwasser (Tab. 1.5, Tab. 1.6) unterstreicht die Notwendigkeit einer diesbezüglichen Analyse des Toleranz- und Abbauverhaltens der mikrobiellen Gemeinschaften. 1-17 1-18 Einleitung 1.4 Ziel der Arbeit Ziel dieser Arbeit ist eine umfassende Beschreibung der natürlich vorkommenden, isolierbaren Bakterienflora des Spittelwasser-Sediments. Die Mikroorganismenpopulationen sind in Hinblick auf die Selbstreinigungskraft des Gewässers und biotechnologische Nutzung näher zu charakterisieren. • Um die Struktur der Biozönose zu erfassen sind die natürlicherweise relevanten Bakterien unter möglichst naturnahen Bedingungen mit Sediment-Extrakt-Medium anzureichern und zu bestimmen. • Für die Beschreibung der degradierenden mikrobiologischen Gesellschaft 1) ist mit Xenobiotika-Minimalmedien in einem längerfristigen Versuch das Potential Xenobiotikadegradierender Bakterien abhängig von der Belastungssituation zu bestimmen, 2) sind spezifisch für charakteristische Xenobiotika Bakterien zu isolieren und zu bestimmen, 3) sind die erfassten Taxa Xenobiotika-spezifischer und nicht-spezifischer Isolierung anhand des Wachstums auf den Xenobiotika-Minimalmedien zu charakterisieren und zu vergleichen. • Zur Bestimmung der taxonomische Struktur sind in einem polyphasischen Ansatz mikrobielle und genetische Screeningmethoden einzusetzen, bzw. zu entwickeln und mittels 16S rRNA-Sequenzanalyse die Zuordnung im phylogenetischen Kontext zu prüfen. Material & Methoden 2 Material und Methoden Eine allgemeine Beschreibung des Standortes wurde in der Einleitung gegeben. In Abbildung 1.1 wurde die genaue Lage der Probenahmestelle gekennzeichnet. Für diese Arbeit wurden Proben der Untersuchungen April, Mai und August 1993, sowie Mai und August 1994 verwendet. Die taxonomischen Studien beziehen sich hauptsächlich auf die Probe vom 24. August 1993, vergleichend wurden die Ergebnisse der Isolation der ersten Voruntersuchung vom 12. Mai 1993 herangezogen. 2.1 Arbeitsschema Das folgende Fließschema (Abb. 2.1) soll die Vorgehensweise dieser Arbeit verdeutlichen. Die einzelnen Arbeitsschritte werden hier zum besseren Verständnis kurz erläutert. Zunächst wurden mit Standardkomplexmedium (Nähragar), Sediment-Extrakt-Medium und einem Spektrum an Xenobiotika-Minimalmedien eine grobe Quantifizierung der Populationen vorgenommen. Während das Standardmedium einen direkten Vergleich der Werte mit anderen Studien ermöglicht, ist mit Sediment-Extrakt eine Anreicherung der aeroben Bakterien der Sedimentoberfläche unter naturnahen Bedingungen möglich. Die Xenobiotika-Medien dienen der Charakterisierung der vorhandenen spezifischen toleranten und abbauenden Mikroflora. Die Quantifizierung erfolgte über einen Zeitraum von zwei Jahren (1993-1994) und ermöglichte eine Charakterisierung der Population in Abhängigkeit von den stark variablen Standortbedingungen. Für eine genaue Bestimmung der taxonomischen Struktur wurden von der Probenahme August 1993 die als möglichst natürlich angenommene Bakterienpopulation des Sediment-Extrakt-Mediums und die für die Selbstreinigung spezifisch angenommenen Bakterien charakteristischer Xenobiotika isoliert. Ein umfangreiches Screening der Sediment-Extrakt-Isolate auf den Xenobiotika-Minimalmedien ermöglichte unmittelbaren Vergleich mit den Xenobiotika-spezifisch isolierten Bakterien. Zur Analyse der taxonomischen Struktur wurden die Bakterien (soweit sie ausreichendes Wachstum auf Komplexmedium zeigten) Gram-bestimmt und mit dem Substratverwertungstest der Fa. BIOLOG phänotypisch charakterisiert, gruppiert und identifiziert. Einzelne Gruppen wurden zusätzlich anhand der Fettsäuremuster (FAME-Analyse mit dem MIDI-Microbial Identification System) identifiziert. Das molekulare Screening von 16S rDNA-Fragmenten (TPCR) in einem eigens optimierten Verfahren der Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese (TGGE), ermöglichte Charakterisierung und Vergleich auch langsam wachsender und physiologisch nicht-bestimmbarer Isolate. Sequenzierung der PCR-amplifizierten 16S rDNA, bzw. der TPCR schwach wüchsiger Bakterien, ermöglichte die taxonomische Zuordnung der Gruppen im phylogenetischen Kontext. Durch den polyphasischen Ansatz waren Schwächen der einzelnen Methoden und derzeitiger Taxonomie aufzudecken und analysierbar. 2-19 2-20 Material & Methoden Toleranztest Quantifikation durch Keimzahlbestimmung Standard-Gesamtkeimzahl (Nähragar) Screening der SA-Isolate auf Xenobiotica-Medien NA "natürliche" Gesamtkeimzahl (Sediment-Extrakt-Agar) SA SA-Masterplate Keimzahlen toleranter Bakterien (Xenobiotika-Minimalmedien) oXy Ant Nap 24D oXy 3CB 4CS Ant 24D Nap 3CB 4CS Isolierung von Reinkulturen Phänotypische Charakterisierung GRAM-Bestimmung ? Nicht-Bestimmbar GN GP BIOLOG-Analyse C-Quellen-Veratmung, 24h/30°C Identifikation FAME-Identifikation SA 031 A SA 001 A 24D 03 D Nap 10 B 4CS 01 B SA 034 B SA 123 F SA 001 F Ant 01 Z SA 024 NI SA 004 NI oXy 08 NI Nap 01 NI SA 002 Y SA 013 X SA 034 X SA 02 X "Breathprint" (Gesamtfettsäuren) Art Gattung Clusteranalyse physiologische Gruppen Nicht-Identifiziert, aber gruppiert ? Nicht-Bestimmbar Genetische Charakterisierung 16S rDNA-Sequenzierung TPCR, PCR - partiell/komplett TGGE-Screening Schmelzverhalten der TPCR (16S-rDNA-Fragment) Taxon A1 Taxon A2 Taxon A3 Isolat SA-001 Taxon B1 Taxon B2 Taxon B3 Taxon B4 Isolat Nap-043 Isolat Ant-001 Taxon C1 Isolat SA-050 Taxon C2 Outgroup 1 Outgroup 2 50°C 70°C Temperatur-GradientenGelelektrophorese Clusteranalyse genetische Gruppen Taxonomische Zuordnung Abb. 2.1 Arbeitsschema Material & Methoden 2.2 Bestimmung der physiographischen Verhältnisse und chemischen Parameter In einem Feldprotokoll wurden die physiographischen Verhältnisse (Wetter, Hydrologische Daten, Substratverhältnisse) vor Ort aufgenommen. Routinemäßig wurden zur Probenahme die Konzentration an Ammonium, Nitrat, Nitrit, Phosphat, Sulfat bestimmt sowie Basenkapazität und Wasserhärte (Schnelltests von Merck, Darmstadt und Riedel de Haen, Seelze). Mittels Meßelektroden wurden Sauerstoffgehalt, Temperatur, pH und Leitfähigkeit bestimmt (Mikroprozessor-Taschen-Meßgeräte WTW LF96A / Set, WTW OXI 96A / Set, Wissenschaftlich Technische Werkstätten GmbH, Weilheim). Informationen über die Belastung mit Schwermetallen und typischen Chemikalien aus dem Industrieabwasser wurden dem Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt und Untersuchungen der GKSS Geestacht entnommen (Jantzen et al. [1993], Wilken et al. [1994]). Ein Muster des Feldprotokolls (modifiziert nach Landesamt für Wasser und Abwasser NW [1982]) ist im Anhang abgedruckt. 2.3 Probenahme und Transport Diese Arbeit versteht sich als ein „Screening“ nach bakterieller Diversität. Da Informationen über den natürlichen Zustand der Population vor Ort gesammelt werden sollen, ist die Wahl der Methoden für Probenahme und anschließenden Transport ein kritischer Punkt. Aufgrund der Heterogenität des Standortes und begrenzter Arbeitskraft ist es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich, die für eine statistische Analyse (Variabilität in Zeit und Raum) notwendige Anzahl zufälliger Proben zu analysieren (zu generellen Prinzipien und Problemen der Probenahme in Boden siehe z.B.Williams & Gray [1973]). Die Proben wurden so repräsentativ als möglich für die Gesamtpopulation genommen, d.h. von gleicher Probenahmestelle und gleicher Grundeinheit. Die Entnahme von Sedimentkernen erfolgte mit beidseitig verschließbaren 28 cm hohen Plexiglaszylindern mit 7,5 cm Innendurchmesser (siehe Ergebnisse, Abb. 3.1). Zur Isolation der Bakterien wurden die obersten 0,5 cm des Schlammes verwendet. Die Grundeinheit wurde daher durch die folgende Formel definiert: Volumen der Grundeinheit = π r2 h = π x (3,75 cm)2 x 0,5 cm = 22,09 cm3 = 220,9 ml Um den natürlichen Zustand der Proben zu erhalten wurden komplette, abgeschlossene Sedimentkerne unter Lagerung auf Eis transportiert und bis zur Verarbeitung innerhalb von 24 h bei 4°C gelagert. 2-21 2-22 Material & Methoden 2.4 Mikrobiologische Methoden Unter den mikrobiologischen Methoden werden die Probenaufbereitung vorgestellt, mikroskopische Auswertung der Proben und Koloniezahlbestimmungen in den verschiedenen Versuchsansätzen, Isolierung der Bakterien und Verfahren der mikrobiologischen, phänotypischen Charakterisierung und Identifikation. Die Zusammensetzung und Herstellung der verwendeten Medien zur Anreicherung und Isolierung der Bakterien ist im Anhang beschrieben. 2.4.1 Quantitative mikrobiologische Populationsuntersuchungen Um gleichzeitig eine quantitative Zellzahlbestimmung und Isolation zu ermöglichen wurde das Plate Count Verfahren angewandt. Hierbei wurde zur Anreicherung aus den Stufen einer Verdünnungsreihe auf Festmedien ausgestrichen, die koloniebildenden Einheiten (KBE) zur Koloniezahlbestimmung ausgezählt und durch serielles Überimpfen der KBE auf Festmedium Isolate bis zur Reinkultur gebracht. Für eine differenzierte quantitative Erfassung der morphologisch-stoffwechselphysiologischen Bakteriengruppen wurden verschiedene Komplex- und Xenobiotika-Minimal-Medien verwendet. Probenaufbereitung Vom Sedimentkern wurden die obersten 50 mm mit Hilfe einer umgekehrten 10 ml Pipette abgezogen, ausgewogen und gemischt. Von dieser Grundeinheit wurden Aliquots für verschiedene Bestimmungen verwendet. Um eine Vergleichbarkeit zwischen den Probenahmen zu gewährleisten, d.h. bei unterschiedlicher Ablagerungsdichte, Höhe und Alter der Schlammschicht, wurde jeweils das Trockengewicht bestimmt. Drei Aliquots à 1 ml wurden gewogen, bei 80°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und das mittlere Trokkengewicht in % des Naßgewichts berechnet (% TG/NG). Insgesamt wurden 4 ml Aliquot zur Bestimmung der Koloniezahlen auf den verschiedenen Medien benötigt. Von der Probe wurde 1 ml 1:100 mit steriler 0,1% Peptonlösung verdünnt und 1 Minute bei 8000 U mit dem Ultraturrax (Fa. Janke & Kunkel, Staufen) im Eisbad homogenisiert (Gunkel [1964]). Zur Bestimmung der Gesamt-Koloniezahl auf Komplexmedien wurde hiervon eine Verdünnungsreihe in 0,1% Pepton mit 3 Parallelen, in 1:5 Verdünnungssschritten bis 10-8 angelegt. Die Beimpfung der Xenobiotika-Minimal-Medien zur Koloniezahlbestimmung erfolgte direkt aus der unverdünnten Probe. 50 ml der 1:100 verdünnten und homogenisierten Probe wurden zur mikroskopischen Bestimmung mit 2% Formalin fixiert und bei 4°C gelagert. Zur Probenkonservierung für spätere Versuche wurden acht Aliquots à 2 ml mit 15% Glycerin versetzt und ebenso wie die restliche Probe bei -70°C tiefgefroren. Material & Methoden Mikroskopische Bestimmung Bekanntlich kann eine Großzahl der Bakterien nicht kultiviert werden (Staley & Konopka [1985]). Für eine vergleichende Bestimmung der absoluten Zellzahl wurde deshalb versucht die Bakterien direkt mikroskopisch auszuzählen. Die Bestimmung der Bakterienzahl erfolgte nach Färbung der Zellen mit Acridin-Orange, das an ZellDNA bindet, unter dem Epifluoreszenz-Mikroskop (Zeiss Standard II) bei 1000x Vergrößerung (Grundlagen in Jones & Simon [1975], Ghiorse & Balkwill [1982]). Die Methode erwies sich trotz Optimierung zur Zellzahlbestimmung in Sedimenten (nach Fry [1988]), mit und ohne Homogenisierung (Ultraturrax, Jahnke & Kunkel) und Filtration als nicht praktikabel. Bestimmung der Gesamtkoloniezahl auf Komplex-Medien Die Komplex-Medien zur Bestimmung der allgemeinen Gesamtkoloniezahlen wurden nach quantitativen und qualitativen Gesichtspunkten ausgewählt: Nähragar (NA) wurde als gängiges Standard-Komplexmedium zur Bestimmung von Koloniezahlen ausgewählt, um einen Vergleich mit Literaturdaten zu ermöglichen. Die klassischen Kulturmedien der Gesamtkoloniezahlbestimmung wie NA selektieren allerdings schnellwüchsige, eutrophe Bakterien, mit engem Reaktionsschema, die in der Regel nicht standorttypisch sind. Eher den natürlichen Bedingungen entspricht die Verwendung der nährstoffreduzierten artifiziellen Medien 1/10 NA (1:10 verdünnter Nähragar) und R2A (Reasoner-2-Agar, Reasoner & Geldreich [1985]), sowie Medium mit Extrakt des natürlichen Substrates (Sediment, Semenov [1991]). Sie sollen eine Balance halten zwischen der Vermehrung eutropher und oligotropher Bakterien, entsprechend möglichst hoher Koloniezahlen und Diversität - dafür muß langsamerer Wuchs und kleinere Koloniegröße in Kauf genommen werden. Positiv für die Isolation der Bakterien nach längerer Inkubation ist die zu beobachtende geringere Tendenz zu Schwärmen (Reasoner & Geldreich [1985]). In einem Vorversuch der Probenahme April 1993 wurden verschiedene Medienkombinationen von Sedimentextrakt mit Minimalagar, R2A und NA in unterschiedlicher Konzentrationen verwendet um das optimale Anreicherungsmedium für die Isolation zu bestimmen. Der Vergleich der Probenahmen Mai / August 1993 und 1994 erfolgte anhand des zur Isolation verwendeten Sedimentextraktagars (SA, Zusammensetzung siehe Anhang) und NA. Die Beimpfung der Agarplatten erfolgte in 3 Parallelen durch Ausstrich von je 100 µl der Verdünnungsstufen 10-5 bis 10-8 mit dem Drigalski-Spatel. Die Auszählung erfolgt entsprechend des langsameren Wuchses auf den nährstoffärmeren Medien über einen Monat in größeren zeitlichen Abständen (7d) als für die normalen Komplexmedien üblich (z. B. Plate Count Agar nach 48h). Um möglichst umweltnahe Bedingungen zu schaffen, wurde bei Raumtemperatur, das heißt bei geringerer Temperatur als i.R. in Gewässeruntersuchungen (30°C bzw. 37°C) üblich, inkubiert. 2-23 2-24 Material & Methoden Bestimmung der Koloniezahlen auf Xenobiotika-Minimal-Medien Da die Belastung mit organischen Schadstoffen im Spittelwasser extrem hoch ist (Wilken et al. [1993]), soll das Vorhandensein der degradierenden Mikroflora näher charakterisiert werden. Zur differenzierten Erfassung der degradierenden Mikroflora wurde auf Wachstum mit insgesamt 13 verschiedenen Xenobiotika als einziger Kohlenstoffquelle auf Minimalagarplatten getestet (Verfahren nach Kyohara et al. [1992]). Die Medienherstellung und Konzentration der einzelnen Substanzen finden sich im Anhang. Ausgewählt wurden vielfach untersuchter Modellsubstanzen für den aeroben mikrobiellen Abbau. Die Abbaubarkeitkeit sinkt in der Regel mit der Kettenlänge und -Verzweigung, Anzahl der aromatischen Ringe und Halogensubstituenten und deren Stellung. Dies wurde bei der Auswahl der Substanzen berücksichtigt. Wie die folgende Tabelle zeigt, umfasst das Spektrum ein- bis polycyklische Aromaten, unterschiedlichen Substitutionsgrad (Hydroxy-, Methyl-, Ethyl-, Carboxygruppe) und Grad der Halogenierung (ein bis zwei Chlorsubstituenten). Diese Stoffe sind typische Zwischenprodukte der Farb- und Kunststoffherstellung, werden als Beizenfarbstoffe, Lösungsmittel oder Biozid eingesetzt (Schröter et al. [1982]). Aufgrund ihrer chronischen oder akuten Toxizität werden sie als wassergefährdend eingestuft. Tab. 2.1 Spektrum der verwendeten Xenobiotika Substanzklasse Substanz Abkürzung aromatische Chlorkohlenwasserstoffe 4-Chlorsalicylsäure 5-Chlorsalicylsäure 3-Chlorbenzoesäure 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 4CS 5CS 3CB 24D polycyklische Aromaten Biphenyl Naphthalin Bip Nap β-Hydroxycarboxynaphthalin1 Anthracen βHN Ant Ethylbenzol Toluol o-Xylol m-Xylol p-Xylol Etb Tol oXy mXy pXy leichtflüchtige Kohlenwasserstoffe Legende: 1 3-Hydroxy-2-Naphthoesäure, Zwischenprodukt des bakteriellen Naphthalinabbaus Für das Screening der Sedimentpopulationen auf ihr degradierendes Potential erfolgte Beimpfung der Agarplatten in 3 Parallelen mit je 100 µl der unverdünnten, nicht-homogenisierten Probe. Die Inkubation und Auszählung erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie für die Komplex-Medien beschrieben. Material & Methoden 2.4.2 Isolierung Bakterien, die auf den Agar-Platten zur Bestimmung der Koloniezahlen wuchsen, wurden zur Gewinnung von Reinkulturen mehrfach auf dem Anreicherungsmedium (SA oder Xenobiotika-Medien) ausgestrichen und soweit möglich auf NA subkultiviert. Für eine ausreichende Charakterisierung des Mikrohabitats, d.h. um die „häufigsten“ Gruppen zu bestimmen, waren pro Stichprobe 50 bis 100 Reinkulturen zu isolieren (Dott & Kämpfer [1988]). In einer ersten Voruntersuchung wurden 50 SA-Kolonien der Verdünnungsstufe 5x10-6 der Probenahme Mai 1993 gepickt. Für die Untersuchung der Hauptprobe August 1993 wurden sämtliche 147 Einzelkolonien der Verdünnungsstufen 5x10-7 bis 10-5 von SA und sämtliche 9 bis 90 Kolonien der isolierbaren, die Population kennzeichnenden Xenobiotika-Medien 4CS, 24D, 3CB, Ant, Nap und oXy (Verdünnung 10-1) gepickt. Stammhaltung Von allen Isolaten wurden Gefrierkulturen in 15% Glycerol angelegt. Die einzelnen Isolate wurden in 8.5 ml Flüssigkultur angeimpft und auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Je nach Wachstum der Isolate wurde zwei Tage bis maximal zwei Wochen in NB, R2A oder RNS bis zu einer OD650nm von mindestens 0,5 bebrütet. Aliquots à 1 ml wurden mit 200 µl Glycerol gut gemischt und bei -70°C gelagert. Zum Animpfen neuer Kulturen wurde mit der Impföse vom gefrorenen Material auf entsprechendes Medium überimpft. Die Umweltisolate wurden katalogisiert und in die Stammsammlung der Abteilung Mikrobiologie der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung Braunschweig (GBF) aufgenommen. Kennzeichnung der Isolate Verwendet wurde eine Codierung, die in den ersten drei Ziffern das verwendete Anreicherungsmedium (Ant, Nap, Tol etc.) beschreibt. Von Xeniobiotika-Medien wurde nur im August 1993 isoliert, von SA im Mai und August 1993, daher wurde dem Code für SA eine 5 bzw. 8 zur Unterscheidung der Probenahmen zugefügt (SA5 bzw. SA8). Die Isolate wurden pro Medium durchnummeriert (z.B. SA5-01 bis SA5-50, SA8-001 bis SA8-147). Bei Vereinzelung aus einer gepickten Kolonie wurden die daraus erhaltenen Reinkulturen zusätzlich einem kleinen Buchstaben gekennzeichnet. SA5-27b entspricht zum Beispiel einem Isolat, das aus der 27-sten gepickten Kolonie vom Anreicherungsmedium Sedimentextrakt (SA) im Mai 1993 vereinzelt wurde. In den Clusteranalysen wurden neben der Codierung der Isolate zusätzlich die BIOLOG-Identifikationen im Dreibuchstaben-Code (nach BIOLOG) angegeben. Bei nicht identifizierten Isolaten mit Similarity Werten über 0.3, jedoch unterhalb der Identifikationsgrenze von 0.5, wurde das nächste Taxon in der Datenbank mit N: (nicht identifiziert) und dem Dreibuchstabencode für die Gattung angegeben. Die Cluster wurden in den Dendrogrammen mit den in ihnen enthaltenen Identifikationen gekennzeichnet. 2-25 2-26 Material & Methoden 2.4.3 Mikrobiologische Charakterisierung der Isolate Die Isolate wurden mikrobiologisch anhand der klassisch phänotypischen Hauptmerkmale Koloniemorphologie, Gram-Bestimmung (Manafi & Kneifel [1990]) und stoffwechselphysiologisch durch den Wuchs auf den verschiedenen Xenobiotika-Medien und mit verschiedenen Kohlenstoffquellen (Substratverwertungstest, BIOLOG) charakterisiert. Die Identifikation erfolgte konventionell mit dem BIOLOG-System, in einigen strittigen Fällen wurde zusätzlich die FAME-Analyse der Zelllipide zur Identifikation angewandt. 2.4.3.1 Xenobiotika-Toleranz der SA-Isolate Die Sediment-Extrakt-Agar-Isolate wurden unter den Bedingungen des Xenobiotika-Screenings (siehe Kap. 2.4.1) auf ihre Toleranz getestet. Aus Gründen der Praktikabilität wurden die verschiedenen Medien im Stempelverfahren beimpft (siehe Drews [1968], Schlegel [1981]). Dazu wurden die Reinkulturen mit dem Lederbergstempel von SA-“Masterplates“ mit je 26 Kolonien auf die 13 Xenobiotika-Testplatten, Sedimentextraktagar und Minimalmedium ohne Kohlenstoffquelle übertragen. Unter Berücksichtigung quantitativer Wachstumsunterschiede wurde das qualitative Merkmal „positiver Wuchs“ im Vergleich mit den beiden Kontrollmedien bestimmt. Die metabolische Nutzung der Xenobiotika wurde hier nicht direkt nachgewiesen. Die Nutzung als Kohlenstoffquelle war wahrscheinlich, wenn kein Wuchs auf dem Minimalmedium ohne Kohlenstoffquelle beobachtet wurde. Charakterisierung und Identifikation mit dem BIOLOG-System Für die hier durchzuführende Populationsuntersuchung war ein rasches, d.h. automatisiertes und kostengünstiges System zur primären Identifikation der bekannten Taxa notwendig. Verwendet wurde das kommerzielle BIOLOG-System (Biolog Inc., Hayward, Ca.), bei dem in einem C-Quellen-Verwertungstest der „biochemische Fingerabdruck“ der Isolate bestimmt wird. Die computerisierte Identifikation nach den Verfahren der numerischen Taxonomie folgt der konventionellen, phänotypischen Bakterientaxonomie. Gleichzeitig ermöglichte das System eine stoffwechsel-physiologische Charakterisierung der Stammsammlung. Das BIOLOG-Identifikationssystem ermöglicht eine Bestimmung innerhalb von 24 h. Das System umfaßt ein Turbidimeter (Messung der optischen Dichte bei 590 nm), MicroLog Software (MicroLog 2 Release 3.01, installiert auf einem IBM PC), Mikrotiterplatten-Lesegerät (ELISA-Reader) und Mikrotiterplatten mit 95 verschiedenen Kohlenstoffquellen für Gram-negative (GN Microplate), bzw. Grampositive Bakterien (GP Microplate). Positives Testergebnis wird basierend auf einer Redox-Reaktion durch Respiration, durch einen Farbumschlag nach violett angezeigt. Die zugehörige Datenbank ist bislang die umfangreichste aller kommerziellen Identifikationssysteme. Die verwendete Version 3.01 umfaßt 569 Gram-negative und 225 Gram-positive Bakterienarten bzw. Gruppen. Sie enthält human-, tier- Material & Methoden und pflanzenpathogene Bakterien sowie Umwelt-Taxa, die in keiner anderen Datenbank enthalten sind. Das System ist einfach zu benutzen, zu aktualisieren und auf die Benutzerwünsche einzustellen. Zur Charakterisierung der Umweltisolate waren Modifikationen des normalerweise vom Hersteller empfohlenen Protokolls notwendig. Vorinkubation auf R2A, in 1/10 PTYG oder LB Medium, Verwendung von Wasser anstelle der üblichen physiologischen Kochsalzlösung zur Beimpfung, Inkubation bei niedriger Temperatur (25°C) und längere Inkubationszeiten (mindestens 24 h) sind gängige Modifikationen der eigentlichen Versuchsdurchführung. Der Hersteller empfiehlt beispielsweise Gram-positive Bodenbakterien vor dem Test „hungern zu lassen“ bis interne Speichernährstoffe verbraucht sind oder eine Induktion der Sporenbildung zu veranlassen, da die Veratmung endogen gespeicherter Substrate eine hohe Hintergrundfärbung in den BIOLOG Testplatten verursachen kann. Die Tests wurden im Rahmen der Hersteller-Angaben bezüglich Inkubationstemperatur und Präkulturmedium auf die Sediment-Isolate abgestimmt. Von Isolaten die zuvor 24 h auf NA (Nähragar) kultiviert wurden, wurde nach Bestimmung des Gram-Verhaltens Zellmaterial mit der Impföse in steriler Kochsalzlösung (0,85%) suspendiert. Die vorgegebene optische Dichte für Gram-positive / -negative Bakterien wurde mittels Turbidimeter eingestellt. Die mit der Suspension beimpften Testplatten wurden auf dem Schüttler bei 30°C inkubiert. Eine erste Kontrolle erfolgte nach 4 Stunden, in der Regel war aber eine 24 Stunden-Inkubation notwendig, um klare Reaktionsmuster zu erhalten. Die Computer-unterstützte Identifikation wurde als korrekt akzeptiert, wenn der „Similarity Index“ (basiert auf der bedingten Wahrscheinlichkeit für das Reaktionsmuster) nach 24 h Inkubation größer oder gleich 0,500 war. Der „metabolischen Fingerabdruck“ der Isolate wurden in eine eigene, benutzerdefinierte Datenbank aufgenommen. Mit dem MLCLUST-Programm der MicroLog 2-Software wurden Clusteranalysen durchgeführt und anhand der Dendrogramme die Isolate zu Gruppen zusammengefaßt. Für Präsentationszwecke wurden die Daten mit STATISTICA (StatSoft Inc., Tulsa, US) berechnet. Die UPGMA-Analyse („Unweighted Pair-Group Average“) mit quadrierten Euklidischen Distanzen ergab gleiche Gruppierung wie mit dem BIOLOG MLCLUST-Programm. Identifikation durch die FAME-Analyse Zur FAME-Analyse („Fatty Acid Methyl Esters“) wurde das MIDI-MIS-System (Microbial Identification Systems, Newark, Delaware) verwendet. Diese Identifikation wurde freundlicherweise von Dr. M. Vancanneyt und Mitarbeitern des Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, Belgium) durchgeführt. Ebenso wie im BIOLOG-System ist die Identifikation anhand der Geamtfettsäuren von der genauen Einhaltung der Inkubationsbedingungen abhängig und vor allem für unter Laborbedingungen gut wüchsige Isolate geeignet. Standard für aerobe Bakterien ist die Inkubation auf TSBA („Trypticase Soy Broth Agar“) bei 28±1°C für 24±2 h. Die Analyse der Gesamtfettsäuren erfolgt von Zellen des dritten Quadranten (Vier-Quadranten-Ausstrich). Die rechnerische Auswertung erfolgt über eine Kovarianzmatrix, Hauptfaktorenanalyse und Mustererkennung. Die Kor- 2-27 2-28 Material & Methoden relation zwischen den Profilen eines unbekannten Isolates und einem Datenbanktaxon wird mittels eines Similarity Index mit Werten von 0-1,0 angegeben. Im Allgemeinen wird die Gattungsidentifikation angenommen, wenn zum nächst möglichen Taxon ≥0,25 Similarity besteht. Für die Artidentifikation sollte die Ähnlichkeit zum nächst möglichen Taxon ≥0,50 und der Abstand zum folgenden Taxon ≥0,10 sein. 2.5 Molekularbiologische Methoden Die in diesem Kapitel beschriebenen molekularbiologischen Arbeiten umfassen Methoden der DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation, Gelelektrophorese und Sequenzierung zur Analyse des 16S rRNA-Gens. Amplifizierte 16S rDNA-Fragmente ermöglichten eine genetische Charakterisierung der Isolate in einer Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE), anhand des sequenzierten Gens wurde die Zuordnung der Isolate im phylogenetischen Kontext bestimmt (16S rDNA-Sequenzierung). 2.5.1 Aufbereitung der 16S rDNA Soweit keine anderen Quellen zitiert sind, entsprechen die Techniken den in Sambrook et al. [1989] angegebenen. Die Zusammensetzung und Herstellung allgemein verwendeter Puffer und Vorratslösungen ist im Anhang beschrieben. Präparation zellulärer DNA Genomische DNA wurde aus etwa 0,1 g Zellen nach dem Protokoll von Wilson [1987] präpariert. Von einer 2-14 Tage alten Flüssigkultur wurden 7 ml bei 14.000 UPM 3 Min. zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Zellpellet wurde in 500 µl TE Puffer pH 8,0 aufgenommen und bei -20°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Für den Zellaufschluß wurde das gefrorene Material 5 Min. bei 100°C gekocht, auf Eis abgekühlt und über Nacht mit je 10 µl 1% Proteinase K und RNAse (DNAse frei), sowie 25 µl 10% Lysozym inkubiert. Nach Zusatz von 30 µl 10% SDS wurde weitere 60 Min. bei 37°C inkubiert. Zur Trennung der DNA von Polysacchariden wurde erst mit 100 µl 5 M NaCl und 100 µl CTAB (10% in 0,7 M NaCl, vorgewärmt) gemischt und 10 Min. auf 65°C erwärmt, dann mit 750 µl 24:1 Chloroform : Isoamylalkohol geschüttelt. Nach 3 Min. Zentrifugation bei 14.000 UPM wurde zur Extraktion von Proteinen der Überstand 2 Mal mit 25 µl StrataCleanTMResin (Stratagene, Herstelleranweisung) 25 Sek. auf dem Whirl Mix gevortext, bei 12.000 UPM 1 Min. zentrifugiert und abpipettiert. Die Fällung erfolgte bei einer Konzentration von 0,7 M NaCl durch Zusatz des 0,7-fachen Volumens Isopropanol. Die DNA wurde bei 14.000 UPM 20 Min. abzentrifugiert, der Alkohol abgezogen und 2 Mal mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen, abpipettiert nach Zentrifugation bei 14.000 RPM für 10 Min. Das Material & Methoden getrocknete DNA-Pellet (Speed-Vac, 10 Min.) wurde in 54 µl TE Puffer pH 8,0 resuspendiert. Das DNA-Präparat wurde für häufigeren Gebrauch im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt, bzw. bei -20°C für längere Lagerung. Primer (PCR-Startmoleküle) Die verwendeten synthetischen Oligonukleotide (Primer) wurden auf einem DNA-Synthesegerät 380B hergestellt und über OPC-Säulen der gleichen Firma aufgereinigt (Applied Biosystems, Weiterstadt). Die universellen eubakteriellen Primer sind komplementär zu konservativen Sequenzregionen der 16S rRNA und sollen die Amplifikation jeglicher bakterieller 16S rDNA ermöglichen. Tab. 2.3 Verwendete Primer zur Amplifikation von 16S rDNA aus chromosomaler DNA Primer1 Sequenz (5´-3´) TGGE-PCR 16F341GC2 ATTACCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 16R534 ATTACCGCGGCTGCTGG Basen Tm[°C] 51 184 17 56 20 24 55 72 24 17 19 18 74 58 62 60 58 22 19 20 66 68 64 Sequenzierungs-PCR P16F27 16R1488 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG CGGTTACCTTGTTACGACTTCACC Sequenzierung 16F38 16F341 16R345 16F357 16R519 16R534 16R685 16F945 16R1087 GATCTTTGGCTCAGGTTGAACGCTG CCTACGGGAGGCAGCAG TCCTTACTGCTGCCTCCCG ACTCCTACGGGAGGCAGC GTATTACCGCGGCTGCTG s.o. TCTCTACGCATTTCACCGCTAC GGGCCCGCACAAGCGGTGG CTCGTTGCGGGACTTAACCC Legende: 1 Primerbenennung: F Vorwärtsprimer, bindet an den zur RNA-Sequenz komplementären DNA-Strang (sense-Strang; in Richtung aufsteigender Positionsnummerierung) R Rückwärtsprimer, bindet an den der RNA-Sequenz entsprechenden Strang der DNA (antisense-Strang; in Richtung absteigender Positionsnummerierung) Die folgenden Zahlen geben die Startpositionen am 3´-Ende des Primers in 16S rRNANummerierung für Escherichia coli an (Brosius et al. [1978]) 2 Kursiv markierte Basen entsprechen der an den Primer 16F341 angehängten GC-Klammer (34 Basen am 5´Ende; stablisieren das Fragment im Temperaturgradienten der TGGE ) Tm Schmelztemperatur nach der 4+2 Formel (Suggs et al. [1981]) 2-29 2-30 Material & Methoden Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) In der Polymerase-Ketten-Reaktion, allgemein als PCR bezeichnet („polymerase chain reaction“), werden bestimmte Bereiche der vorgegebenen DNA durch Einsatz spezifischer Oligonukleotide als Startmoleküle (Primer) für eine thermostabile DNA-Polymerase gezielt vermehrt (amplifiziert). Die Amplifikation der 16S rRNA-Gene zur TGGE-Analyse und Sequenzierung erfolgte mit chromosomaler DNA als Ausgangsmaterial entsprechend der bekannten Protokolle (Edwards et al. [1989], Hutson et al. [1993], Karlson et al. [1993]). Zum einen wurde nahezu das gesamte 16S rDNA-Gen unter Verwendung der Primer 16F27 und 16R1488 zur Sequenzierung amplifiziert (Gesamt-PCR oder PCRdirekt), zum anderen mit den Primern 16F341GC und 16R534 ein kurzes Fragment (TGGE-PCR oder TPCR) für die TGGE-Analyse und TPCR-Sequenzierung vervielfacht. Tab. 2.4 PCR-Reaktion PCR-Ansatz Ausgangslösung 5 µl 10 µM Vorwärts-Primer 5 µl 10 µM Rückwärts-Primer 16 µl dNTP Mix : je 1,25 mM dNTPs 10 µl 10x PCR-Puffer: 100 mM Tris/HCl 15 mM MgCl2 500 mM KCl 1 µg/µl Gelatine 0,25 - 1 µg DNA (variabel ) ad 100 µl bidest. H2O, steril 0,5 µl Taq-Polymerase, LD 5 Einheiten/µl Die PCR-Ansätze wurden in speziellen dünnwandigen 0,2 ml Eppendorf-Gefäßen für 1 Min. auf 96°C erhitzt, auf Eis gekühlt und dann 2,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, LD („low DNA content“, Perkin Elmer) zugegeben. Die Amplifikation erfolgte im GenAmp 9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Weiterstadt) nach folgendem Programm: Tab. 2.5 PCR-Programm Zyklus Start 30 Zyklen Amplifikation Auffüllen nicht vollständig synthetisierter Fragmente Stop Reaktion Denaturierung Denaturierung Primeranlagerung DNA-Synthese DNA-Synthese Kühlung Temperatur [°C] Zeit 94 96 Tm Primer - 5 72 72 120 60 60 120 600 4 bis Abbruch Material & Methoden Die Temperatur zur Anlagerung der Primer an die vorhandene DNA wurde durch Abschätzung der Schmelztemperatur (Tm) nach der Gleichung von Suggs et al. [1981] festgelegt, wobei die im Programm verwendete Temperatur meist um 5°C unter der berechneten Schmelztemperatur lag. Bei Einsatz von Vorwärts und Rückwärts-Primer wurde die niedrigere Tm verwendet. Agarosegelelektrophorese Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte in Agarosegelen, deren Konzentration entsprechend der Größe der zu trennenden Fragmente gewählt wurde. Die Auftrennung chromosomaler DNA erfolgte in 0,5 %igen Gelen, die von PCR-Produkten zur 16S rDNA-Sequenzierung in 1 %igen Gelen (w/v). Für die kurzen TPCR-Fargmente (PCR-Produkte für die TGGE) wurden 2,5 %ige NuSieve-Agarose-Gele verwendet (NuSieve 3:1 Agarose, fertige Mischung aus 3 Teile NuSieve plus 1 Teil Seakem LE Agarose; FMC BioProducts, USA). Die Proben wurden mit 0,25 Volumina 5-fach konzentriertem Ladepuffer (TAE-Puffer mit Glycerin und Xyalencyanol und Bromphenolblau als Farbmarker) versetzt. Als Größenstandard für DNA-Fragmente von 300 bp bis 12.2 kb diente 700 ng 1kb-Leiter (Gibco, Eggenstein), für Fragmente von 8 bis 587 bp 500 ng mit HAE III Restriktionsenzym verdautes Plasmid pBR322 (Sigma, Deisenhofen). Die Gele wurden mit einer Spannung von 10-12 V/cm Trennstrecke betrieben. Die Färbung erfolgte anschliessend durch Inkubation in einer 2 µg/ml Ethidium-BromidLösung. Die Dokumentation und TPCR-Fragmentlängenbestimmung erfolgte mit dem EASY-System (Herolab, Wiesloch) bei UV-Durchlicht. Der Größenunterschied der PCR-amplifizierten TGGE-Fragmente war häufig bereits nach dem Lauf auf Agarosegelen zu sehen. 2.5.2 Molekularbiologische Charakterisierung der Isolate Für eine rasche molekulare Identifizierung war ein Screening der Stammsammlung auf genetischer Ebene notwendig. Die Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE-Bestimmung) PCR-amplifizierter 16S rDNA-Fragmente (TPCR) ermöglichte die Charakterisierung der Isolate anhand ihres „genetischen Fingerabdrucks“ („fingerprint“). Die TGGE wurde für nicht-identifizierbare Isolate angewandt und Isolate die aufgrund ihres langsamen Wachstums unter normalen Laborbedingungen eine geringe Reaktivität im BIOLOG-System aufwiesen, phänotypisch also nicht näher zu charakterisieren waren. Von den mittels BIOLOG und TGGE vorsortierten Isolaten wurde für ausgewählte Gruppenvertreter die PCR-amplifizierte 16S rDNA sequenziert. Bei geringem Wuchs der Isolate wurde die TPCR sequenziert. Die Sequenzierung erlaubte die Bestimmung der phylogenetischen Zugehörigkeit im Vergleich mit derzeitiger Identifikationspraxis. 2-31 2-32 Material & Methoden 2.5.2.1 TGGE-Screening Zur Generierung der spezifischen genetischen Fingerprints wurden die TPCR-Produkte der Isolate auf Polyacrylamidgele aufgetragen und eine Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE), entsprechend dem Protokoll der Herstellerfirma (Diagen, Hilden), durchgeführt. Tab. 2.6 Polyacrylamidgel zur TGGE-Analyse Ansatz 21,6 g 1,2 ml 2,25 ml 29 ml 12 ml Endkonzentration Harnstoff (Gibco-BRL, Berlin) 50x MOPS-Puffer 40% Glycerin H2O 30 % (w/v) Acrylamid:Bisacrylamid (60:1) 6,4 M 1x 1,5 % 6,0 % Die Gellösung wurde durch eine 0.2 µm Membran filtriert und entgast 75 µl Temed (Kodak) 340 µl 4 % (w/v) Ammoniumpersulfat in H2O 0,12 % 0,02 % Das Gel wurde zwischen zwei Glasplatten auf die hydrophile Seite einer Gelbondfolie gegossen. Nach der Polymerisation wurde das Gel mit 1 ml 1%iger Triton-X100-Lösung als Kontaktmittel (bei bereits eingestellten Temperaturgradienten) auf die Thermoplatte aufgelegt. Über doppelt gelegte Puffertücher wurde das Gel mit 1x MOPS-Laufpuffer in den Pufferkammern verbunden und mit Saran-Klarsicht-Folie gegen Austrocknen geschützt. Zusätzlich wurde das Gel mit einer Glasplatte beschwert. Nach Kontrolle der elektrischen Spannung wurden die mit 0,1 Volumen 10x Ladepuffer (Zusammensetzung siehe Anhang) versetzten TPCR-Proben geladen. Die Auftragungsmenge der PCR-Produkte betrug 10-20 ng in 2-3 µl. Der Lauf erfolgte mit maximal 250 V / 28 mA über einen Temperaturgradienten von 50-70°C über 3 h 30 min. Die Visualisierung der Banden erfolgte im Anschluß an die Elektrophorese in einer Silberfärbung. Banden mit Einzelstrang-DNA wurden dabei rötlich gefärbt, Doppelstrang-DNA schwarzbraun. Tab. 2.7 Silberfärbung Reaktion 2x Ansäuern Färbung 2x Waschen Entwicklung Fixierung Flexibilisierung Lösung 10% Ethanol / 0,5% Essigsäure 0,1% AgNO3 ddH2O 1,5% NaOH / 0.01% NaBH4 / 0,15% Formaldehyd 0,75% Na2CO3 2% Glycerin Zeit 3 Min. 10 Min. 10 Sek. 20 Min. 5-10 Min. 10 Min. Das Gel wurde mit der Trägerfolie nach oben auf einer Glasplatte fixiert und mit dem Elscript 300 (Hirschmann, Taufkirchen) als Tiff-File dokumentiert. Die Analyse der Bandenmuster, Clusteranalyse Material & Methoden der Isolate und Referenzstämme erfolgte mit dem PC-Programm GelCompar 4.0 (Applied Maths BVBA, Kortrijk, Belgien). Zur Konservierung der Gele wurden diese nach dem Densitometer-Scan mit der Trägerfolie 6 min. in Geltrocknunglösung (10% Glycerin / 25% Ethanol) inkubiert, luftblasenfrei mit Cellophanfolie (1 Min. in der gleichen Lösung eingeweicht) abgedeckt, in einen Geltrocknungsrahmen gespannt und 1-2 Tage bei Raumtemperatur getrocknet (Rahmen und Folien von Anamed, Offenbach). Grundlagen Da die Methode der TGGE zum Sreening von Isolaten in dieser Form bislang kaum Anwendung fand (Heuer et al. [1997]), werden ihre Grundlagen und Modifikationen zur Bestimmung des genetischen Fingerprints im Folgenden ausführlicher behandelt. Mit der Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese (TGGE) werden Biomoleküle nicht nur auf Grund der Größe, Form und Ladung getrennt wie in konventionellen Elektrophoresen, sondern auch anhand ihrer thermischen Stabilität. 1. Werden Biomoleküle zunehmenden Temperaturen ausgesetzt unterlaufen sie Konformationsänderungen, die im Allgemeinen als Denaturierung bekannt sind: Doppelstrang-DNA (ds DNA) wird zu Einzelsträngen (ss DNA), Haarschleifen in Nukleinsäuren schmelzen und Proteine entfalten sich. Die Mobilität in der Elektrophorese wird durch die Konformationsänderungen beeinflußt. 2. Biomoleküle mit unterschiedlichen Sequenzen denaturieren bei unterschiedlichen Temperaturen. Eine Punktmutation in der Doppelstrang-DNA bedingt z.B. eine Änderung der Schmelztemperatur, die die Trennung basensubstituierter Analoga ermöglicht (Riesner et al. [1991], Fischer & Lerman [1983]). 3. Doppelstrang DNA-Moleküle schmelzen nicht von den Enden Base für Base, sondern es erfolgt eine kooperative Denaturierung längerer Abschnitte („stretches“), der sogenannten Schmelzregionen („melting domain“). Die mittlere Schmelztemperatur Tm und die Länge der Schmelzregion werden hauptsächlich durch die Nukleotidsequenz bestimmt. Die Tm eines DNA-Fragmentes kann bereits durch eine Punktmutationen um 1,5°C differieren. Erreicht ein Fragment in der TGGE die Temperatur, an der die empfindlichste Region zu schmelzen beginnt, spaltet sich die DNA hier Y-förmig, die Wanderungsgeschwindigkeit wird reduziert. Im optimierten System können Sequenzunterschiede in nur einer Base am unterschiedlichen Laufverhalten detektiert werden. Das Quiagen TGGE-System (Diagen, Hilden) besteht aus einer Thermoplatte mittels der ein linearer Temperatur-Gradient auf ein horizontales Polyacrylamid-Gel übertragen wird. Der Temperatur-Gradient ist dabei parallel zur Elektrophorese-Richtung von der niedrigen zur höheren Temperatur. Die Änderung der Sekundärstruktur des Biomoleküls durch Denaturierung resultiert in einer Verringerung der Elektrophorese-Mobilität, d.h. je geringer die thermische Stabilität desto kürzer Rf der resultierenden Bande. 2-33 2-34 Material & Methoden Unterschiede in der Schmelztemperatur resultieren in einer früheren oder späteren Denaturierung und führen zu einer Verschiebung des Bandenmusters. Durch das Anfügen einer 30-60 bp langen „GC-Klammer“ mit Hilfe eines entsprechend verlängerten Primers in der PCR kann eine gleichmäßig niedrige Schmelztemperatur im spezifischen Bereich des PCRProduktes erreicht werden. Dabei wird die teilweise dissoziierte DNA aufgrund der hohen Schmelztemperatur der GC-Klammer an einer Seite zusammengehalten (Sheffield et al. [1989]). Für die verwandte Methode der DGGE (Denaturierungs-Gradienten-Gel-Elektrophorese, verwendet einen Harnstoff- statt Temperaturgradienten) wurden Computerprogramme entwickelt, mit denen die zu erwartenden Schmelzeigenschaften simuliert werden können. Diese Modellierungen liefern auch für die TGGE gute Näherungen. Hier wurde das POLAND-Programm verwendet, eine Variante des MELT-Programms von Lerman & Silverstein [1987], die vom Hersteller (Diagen, Hilden) vertrieben wird. Bei Vorhandensein mehrerer unterschiedlicher Operons in einem Bakterium kann ein PCR-amplifiziertes 16S rDNA-Fragment in der TGGE entsprechend der Operons getrennt werden und zu Mehrfachbanden führen (Nübel et al. [1996]). Mehrfachbanden können aber auch durch „unsaubere“ PCR-Amplifikation entstehen, bei vorzeitigem Abbruch der Kettenreaktion durch Bildung von Haarschleifen, durch Kontamination mit Fremd-DNA, unspezifische Bindung der Primer oder „unsaubere“ Bakterien-Kulturen. Bei Verwendung der TGGE als Screeningmethode für Isolate ist es deshalb wichtig, 1. daß zur DNA-Amplifikation stabile, genau definierte Primer verwendet werden (im Gegensatz zur Sequenzierung oder Gesamt-DNA-Analyse, bei der zum Teil Primer mit unterschiedlichen Basen an bestimmter Position verwendet werden, um die Universalität der Amplifikation zu erhöhen). 2. daß insbesondere bei geringer Konzentration des Ausgangsmaterials Kontamination mit Fremd-DNA vermieden wird. Aus diesem Grund wurde Taq-DNA-Polymerase mit garantiert stark reduzierter DNA-Kontamination eingesetzt (LD-Taq, „low DNA content“, Perkin Elmer). In der Agarose-Gelelektrophorese wurde deshalb die PCR-Reaktion anhand von Negativ- und Positiv Kontrollen (Reaktion ohne DNA-Zusatz, bzw. Zusatz bestimmter DNA) auf etwaige DNA-Kontamination geprüft, sowie die Einheitlichkeit der Länge des amplifizierten Fragmentes überprüft. DNAKontaminationen, unvollständige Fragmentsynthese (z.B. bei Instabilität der GC-Klammer) und Mischkulturen wurden anhand von Mehrfachbanden detektiert. Fragmentlängenunterschiede können auch durch komplementäre Paarung innerhalb des Primermoleküls (vor allem bei angehängter GC-Klammer) und Reaktionsabbruch während der PCR-Reaktion möglich sein. In Anlehnung an die Arbeiten von Muyzer et al. [1993] wurde hier für die TGGE ein 193 bp Fragment der variablen V3-Region der 16S rDNA mittels der Primer 16R534 und 16F341GC amplifiziert. Zur Stabilisierung der DNA-Fragmente im Temperaturgradienten der TGGE ist die GC-Klammer am 5´-Ende des Primers 16F341GC notwendig. Die Basensequenz wurde so variiert, daß nach Analyse der Material & Methoden Sekundärstruktur des Primers mit dem GENMON-Programm (GBF-Version 1992, Algorithmus nach Zuker & Stiegler [1981]) im Temperaturbereich der PCR-Reaktion keine Paarung zu erwarten ist. Optimierung Der Temperaturgradient und die Laufzeit wurden in Vorversuchen mit TGGE-PCR von Referenzstämmen nach Herstellerangaben (TGGE-Handbuch [1993], Fa. Diagen, Hilden) optimiert. Die drei Stämme Comamonas testosteroni LMG1800t (β-Proteobakterium), Stenotrophomonas maltophilia LMG958t (γ-Proteobakterium) und Rhodococcus rhodochrous DSM43241t (Gram-positiv, hoher G+C-Gehalt) wurden zur Optimierung der TGGE verwendet unter der Annahme, daß sie die dominanten Phyla abdecken. Das Schmelzverhalten der doppelsträngigen Nukleinsäuren wurde mit den POLAND-Programmen V1.1 simuliert. Zur Berechnung wurden die folgenden Hypochromitätswerte (Blake & Haydock [1979]) und thermodynamischen Parameter für DNA in 0.019 M NaCl (Gotoh [1983]) verwendet: DeltaS Faktor = 1.000 = 10-9 beta * c0 Sigma = 10-2 Stabilität der Basenpaarung Dissoziationskonstante x Einzelstrangkonzentration Die Öffnung der DNA („Loop“-Bildung) wurde mit dem Algorithmmus von Poland [1974] berechnet. Eingesetzt wurden die vollständigen Sequenzen der TGGE-PCR-Fragmente, d.h. die Sequenz mit Primer-Region und GC-Klammer (228 bzw. 208 Basen). Die grafische Darstellung zeigte die Eignung der Fragmente und das zu erwartende Verhalten in der Perpendikular-TGGE. Praktisch wurde zunächst das Schmelz- und Wanderungsverhalten der TPCR-Fragmente in der Perpendikular-TGGE bestimmt. Die in gleichen Mengen gemischte TGGE-PCR-DNA wurde senkrecht zur Laufrichtung in einem Slot über die gesamte Gelbreite, d.h. den gesamten Bereich des Temperaturgradienten, aufgetragen. Aus diesem Gel ließ sich der benötigte Temperaturgradient ableiten. Die optimale Laufzeit wurde in einer anschließenden Parallel-TGGE durch zeitversetztes Laden der drei Referenz-Fragmente bestimmt. Zur Veranschaulichung wurden die aufeinander folgenden Optimierungsschritte der Perpendikular- und Parallel-TGGE in Abb. 2.2 schematisch dargestellt. Abb. 2.2 (links) zeigt schematisch das Verhalten eines doppelsträngigen DMA-Moleküls in der Perpendikular-TGGE. Der Temperaturgradient (20° bis 70°C) verläuft quer zur Elektrophorese-Laufrichtung, oben im Gel ist der längliche Slot eingezeichnet, in der Mitte die Autrennung der Probe: Links, bei 20°C noch als Doppelstrang (ds DNA); rechts gegen 70°C die denaturierte Einzelstrang-DNA (ss DNA). Darunter wurde das Schmelzverhalten des Moleküls schematisch dargestellt. Stärkste Verbindung ist die GC-Klammer, das amplifizierte 16S rDNA-Fragment schmilzt zuerst am Ende und innerhalb eines „Loops“. Im Bereich reversibler Denaturierung (ds DNA) sieht man auf dem Gel eine Kurve, deren exponentielle Anstieg mit der Temperatur der reduzierten Mobilität der Moleküle durch Konformationsänderung entspricht. Je nach Anzahl der Schmelzregionen steigt die Kurve stufenweise an. 2-35 Material & Methoden Perpendikular-TGGE T1 Parallel-TGGE T2 20°C t-30 70°C _ t0 t+30 t+60 t+90 _ T1 ss DNA ds DNA GC-Klammer 2-36 T2 ds DNA ss DNA + + Abb. 2.2 Optimierung der TGGE Wird die absolute Schmelztemperatur erreicht, d.h. erfolgt irreversible Denaturierung in Einzelstränge, bricht die Kurve ab und die Einzelstränge („ss DNA“) laufen deutlich versetzt mit verringerter Retention. Ohne GC-Klammer erhält man bei den kurzen TPCR-Fragmenten eine mit zunehmender Temperatur leicht abfallende Gerade (keine unterscheidbaren Schmelzregionen), die an der Stelle der Denaturierungstemperatur einen Sprung zu höherer Retention aufweist. Der optimale Temperaturgradient umfaßt den Bereich des exponentiellen Anstiegs, d.h. der reversiblen Denaturierung der Fragmente. Dies entspricht dem Bereich der effektiven Trennung, in dem sich die verschiedenen Fragmente am meisten unterscheiden. Die unterste Grenze ist die Temperatur (T1), bei der noch alle Fragmente als Doppelstrang vorliegen und ohne Mobilitätsverlust mit der Elektrophorese wandern. Oberste Grenze ist die Schmelztemperatur (T2) des stabilsten Moleküls (hier: das hoch-G+C-haltige Fragment von Rhodococcus rhodochrous DSM43241t). Da Fragmente unterschiedlicher Herkunft (unbestimmter Isolate) untersucht werden sollten, wurde der Temperatur-Bereich der Parall-TGGE etwas größer gewählt als der bestimmte Bereich. Die minimale Laufzeit für die Parallel-TGGE wurde anhand der Laufgeschwindigkeit der Doppelstrang-DNA der drei Referenzstämme bis zum Erreichen von T2 abgeschätzt. In der Parallel-TGGE wird dieser Temperaturgradient in Elektrophoreserichtung angelegt (Abb. 2.2, rechts) und die zu analysierenden Fragmente in „normale“ einzelne Slots aufgetragen. Durch die Silberfärbung kann die irreversible Denaturierung der DNA auch in der Parallelen-TGGE nachgewiesen werden (ds DNA: schwarzbraun, ss DNA: rot). Die optimale Laufzeit wurde in der ParallelTGGE durch zeitversetztes Laden (in der Abbildung t-30 bis t+90) der drei Referenz-Fragmente bestimmt. Beim Lauf über die gesamte Gelstrecke ändert sich die Wandergeschwindigkeit entsprechend der exponentiellen Kurve der Perpendikular-TGGE. Bei der optimalen Zeit zeigen die Referenzsstämme maximale Trennung der Fragmente. Material & Methoden Tab. 2.2 Referenzstämme G Stamm Nr. G Stamm Nr. Gram positiv, niedrig GC Bacillus subtilis DSM 3258 Thermoanaerobacter ethanolicus DSM 2355 δ-Proteobakterien Desulfovibrio desulfuricans Desulfovibrio vulgaris ss. vulgaris DSM 642 t DSM 644 t Gram positiv, hoch GC α-Proteobakterien Erythrobacter longus Oligotropha carboxydovorans Pseudomonas carboxydohydrogena1 ATCC 33941 t DSM 1227 DSM 1083 t Rhodobacter capsulatus Rhodobacter sphaeroides Sphingomonas adhaesiva Sphingomonas capsulata Sphingomonas devorans Sphingomonas parapaucimobilis Sphingomonas paucimobilis Sphingomonas trueperi Sphingomonas yanoikuyae2 DSM 1710 t DSM 160 JCM 7370 DSM 30196 t DSM 30198 t JCM 7510 t DSM 1098 t LMG 2142 t JCM 7371 t Gardnerella vaginalis Rhodococcus globerulus Rhodococcus rhodochrous CCUG 3717 NCIMB 12315 DSM 43241 t Bacteroides, Flavobakterien & Verwandte Chryseobacterium gleum LMG 8334 t Chryseobacterium indologenes LMG 8337 t Flavobacterium johnsonii LMG 1341 t1 Empedobacter breve LMG 4011 t Flavobacterium odoratum LMG 1233 t Sphingobacterium mizutae LMG 8340 t Sphingobacterium spiritivorum LMG 8347 t Weeksella virosa LMG 8350 γ-Poteobakterien IV Brevundimonas diminuta Acinetobacter spec I I I I I I I I β-Poteobakterien DSM 6220 t Xanthomonas populi DSM 3069 t III Acidovorax delafieldii DSM 30102 III Acidovorax facilis LMG 1242 t Acidovorax konjaci DSM 50342 t Acidovorax temperans 3 LMG 1245 III Comamonas acidovorans DSM 50090 t Comamonas terrigena DSM 50106 III Comamonas testosteroni LMG 1244 Pseudomonas glathei LMG 5168 Pseudomonas oleovorans LMG 5167 t II Burkholderia cepacia LMG 2089 t DSM 590 Frateuria aurantia Klebsiella planticola Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas chlororaphis Pseudomonas fluorescens A Pseudomonas fluorescens B Pseudomonas fluorescens C Pseudomonas fluorescens F Pseudomonas fluorescens G β/γ-Proteobakterien Pseudomonas indigofera DSM 3303 t V Stenotrophomonas maltophilia4 I Pseudomonas mendocina DSM 50017 t Xanthomonas albilineans Pseudomonas pertucinogena LMG 1874 t Xanthomonas campestris campestris I Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225 t Xanthomonas campestris graminis I Pseudomonas putida A DSM 291 t Xanthomonas fragariae Pseudomonas resinovorans LMG 2274 t Xanthomonas oryzae pv. oryzae Pseudomonas taetrolens LMG 2336 t Xanthomonas polyphagus5 Pseudomonas fragi LMG 5743 t LMG 5934 t LMG 2193 t LMG 5691 LMG 7167 LMG 1226 t LMG 1253 t LMG 1800 t DSM 50014 t LMG 2229 t LMG 1222 t DSM 3456 t 6 LMG 958 t LMG 494 t LMG 568 t LMG 726 LMG 708 t LMG 5047 t LMG 538 t t1 Legende: Die Zuordnung ehemaliger Pseudomonaden zu den Proteobakteriengruppen folgt Kersters et al. [1996] 3 G rRNA-Gruppe (Palleroni et al. [1973], [1984]) ehemals Pseudomonas azotocolligans 1 4 Bradyrhizobium - Rhodopseudomonas rRNA Zweig ehemals Xanthomonas maltophilia 2 5 ehemals P. aureofaciens, Genospec. P. chlororaphis ehemals Xanthomonas axonopodis 6 Phylogenetische Position nach Kersters et al. [1996] unklar, nach Grimes et al. [1997] sollte P. indigofera ATCC19706t in Vogesella i. [β] umbenannt werden 2-37 2-38 Material & Methoden Referenzstämme Für Kontrollen und zur Validierung der entwickelten Methode wurden vorhandene DNA-Präparate verschiedener Referenzstämme der Stammsammlungen Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent (LMG), American Type Culture Collection (ATCC) und Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) verwendet. Die Arten und Stämme sind in Tab. 2.2 aufgelistet. 2.5.2.2 Sequenzierung Die PCR-amplifizierte 16S rDNA wurde über Microcon-100 Konzentrator (Amicon GmbH, Witten) aufgereinigt. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung des Dye Terminator Kits und dem 373A DNA Sequenzer von Applied Biosystems Inc. (Weiterstadt). Sie erfolgte mit Taq-DNA-Polymerase nach dem Prinzip einer asymmetrischen PCR-Reaktion. Das produzierte DNA-Fragment wird in einer Kettenabbruch-Reaktion durch Einbau der als Terminatoren wirkenden fluoreszenz-markierten DideoxyNukleotide (ddNTPs) basenspezifisch fluoreszenzmarkiert. Tab. 2.8 Sequenzierungs-Reaktion Sequenz-Ansatz Ausgangslösung 1 µl ca. 1 µg/µl DNA 2 µl 5 µM Primer 1 µl DMSO (bei Bedarf) 9,5 µl dNTP-Premix: dATP, dTTP, dITP, dCTP ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP 4 Einheiten Taq-Polymerase 80 mM Tris-HCl, pH 9 2 mM MgCl2 100mM (NH4)2SO4 ad 20 µl H2O Die Farbstoffe sind verhältnismäßig unempfindlich gegenüber Licht und hohen Temperaturen. Nicht eingebaute ddNTPs wurden durch Extraktion mit wassergesättigtem Phenol/Chloroform abgetrennt. Die Reaktion erfolgte in speziellen 0,2 ml dünnwandigen Eppendorfgefäßen im GenAmp 9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Weiterstadt) nach dem in Tab. 2.9 beschriebenen Programm. Die Synthesetemperatur von nur 60°C verminderte den bevorzugten Einbau der einfachen gegenüber den fluoreszenzmarkierten dNTPs durch die Taq-Polymerase. So wurde ein effizienterer Kettenabbruch ermöglicht als bei Inkubation bei 72°C, der optimalen Synthesetemperatur der Taq-DNA-Polymerase. Material & Methoden Tab. 2.9 Sequenzierungs-Programm Zyklus Reaktion Start 25 Zyklen Amplifikation Stop Denaturierung Denaturierung Primeranlagerung DNA-Synthese bis zum Kettenabbruch Kühlung Temperatur [°C] Zeit [Sek.] 94 96 Tm Primer - 5 60 4 120 15 15 240 bis Abbruch Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf 100 µl mit Milli-Q-H2O aufgefüllt. Durch zweifache Extraktion mit 100 µl wassergesättigtem Phenol/Chloroform (18:68:14; Applied Biosystems, Weiterstadt) wurden die nicht eingebauten, fluoreszenzmarkierten ddNTPs abgetrennt. Aus dem wäßrigen Überstand wurden die DNA-Fragmente durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Na-Acetat, pH 5,2 und 3 Volumina Ethanol bei Raumtemperatur gefällt. Der Niederschlag wurde nach 20 Min. Zentrifugation mit 70%-igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 3 µl Lade-Puffer (deionisiertes Formamid, 25 mM EDTA, pH 8) resuspendiert. Für den Auftrag auf das Sequenzierungsgel wurde der Sequenzansatz 2 Minuten bei 90°C denaturiert, in ein Eisbad umgesetzt und nach 2 Minuten abzentrifugiert. Tab. 2.10 Polyacrylamidgel zur Sequenzierung Ansatz 22,5 g 4,5 ml 5,6 ml 18,1 ml Harnstoff (Gibco-BRL, Berlin) 10x TBE-Puffer 40 % (w/v) Acrylamid:Bisacrylamid (19:1) H2O Endkonzentration 8M 1x 5% Die Gellösung wurde durch eine 0,2 µm Membran filtriert und entgast 18 µl Temed (Kodak) 135 µl 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat in H2O Das Sequenzierungsgel wurde zwischen zwei mit Isopropanol gereinigten Quarzglasplatten in einer Stärke von 0,3 mm gegossen. Vor dem Probenauftrag erfolgte ein einstündiger Elektrophorese-Vorlauf. Spannung und Strom im Vor- und Trennlauf wurden auf maximal 2500 V und 40 mA begrenzt. Der Trennlauf erfolgte über insgesamt 16 Stunden. Während der elektrophoretischen Trennung auf dem denaturieren-den Polyacrylamidgel wurde im unteren Bereich des Geles die Fluoreszenz-Markierung der DNA-Fragmente durch einen langwelligen Laserstrahl angeregt und die Farbe der vorbeiwandernden Banden registriert. Im Anschluß an den Gelllauf erfolgte die Analyse der registrierten Bandenmuster und Sequenzbestimmung durch die Systemsoftware. Analyse der 16S rRNA Sequenzdaten Da die meisten bisher in den Datenbanken enthaltenen 16S rDNA-Sequenzen das 5´Ende umfassen, wurden nach der Empfehlung von Stackebrandt & Rainey [1995] für zuverlässige Zuordnung mindestens 2-39 2-40 Material & Methoden 300 bis 500 Nukleotide der Gesamt-PCR (Sequenzierungs-PCR) vom 5´Ende aus sequenziert. Als rasche, reaktionstechnisch zuverlässige Methode einer ersten groben Zuordnung für schwachwüchsige Isolate wurde die TPCR sequenziert. Variable Regionen wurden aufgrund der Kürze und dem begrenzten Informationsgehalt der partiellen Sequenzen in den Vergleich mit den bekannten Taxa einbezogen (Sequenzanalyse ohne Gewichtung). Die Sequenzen wurden mit 16S rRNA Sequenzen der Datenbanken RDP (The Ribosomal Database Project, Maidak et al. [1996]), EMBL (European Molecular Biology Laboratory, Emmert et al. [1994]) und GenBank (Benson et al.[1994]) verglichen. Zusätzlich wurden die Sequenzen zur „Similarity-Rank-Analyse“ an die RDP gesandt. Mit Hilfe des OLSEN-Editors wurden homologe Sequenzregionen der verschiedenen Sequenzen unter Berücksichtigung der Sekundärstruktur gegeneinander ausgerichtet („aligned“). Die Sequenzanalyse erfolgte mit den Programmen des PHYLIP-Paketes (Phylogeny Inference Package, Version 3.5c, J. Felsenstein 3/1993, University of Washington, USA). Für die „Bootstrap“-Analyse (mit 100 zufällig generierten Stichproben) wurden die Programme SEQBOOT, DNADIST, FITCH (mit Jukes Cantor Transformation) und CONSENSE verwendet. Die berechneten Bäume wurden mit dem Programm TREEVIEW grafisch in „Phylogrammen“ ohne Wurzel (gemeinsamen Ursprung ) dargestellt. Die berechneten Bäume visualisieren die verwandtschaftlichen Beziehungen zwischen den Organismen, nicht die Reihenfolge in der Evolution (Priest & Austin [1993]). Die Distanzen werden durch Summation nur der horizontalen Komponenten der verbindenden Linien in der Grafik bestimmt. Die Verwandtschaft benachbarter Taxa wurde durch Einbeziehung von „outgroup“-Organismen (mehrere relativ entfernte Verwandte der untersuchten taxonomischen Einheit dienen als Bezugspunkt) betont. Als „Pseudowurzel“ begrenzen sie die eigentlich untersuchte Verwandtschaftsgruppe räumlich und erzielen eine stabilere Baumtopologie. Material & Methoden 2.6 Mathematische Verfahren Die Klassifikation von Daten gemäß ihrer natürlichen Beziehungen bezeichnet man als Taxonomie (Ciba et al. [1982]). Die hier verwandten Verfahren zur mikrobiologischen (BIOLOG), genetischen (TGGE) und „phylogenetischen“ (Sequenzierung) Charakterisierung und Identifikation folgen den gleichen, in der Biologie häufig angewandten mathematischen Prinzipien der Klassifikation. Das mathematische Verfahren die beobachteten Daten so zu organisieren, daß eine sinnvolle Klassifikation entsteht, ist die Clusteranalyse. Die Clusteranalyse ist kein typisches statistisches Verfahren, da sie nicht ein Test auf statistische Signifikanz sondern beschreibend ist. Methoden der Clusteranalyse werden zumeist in der Explorationsphase einer Untersuchung angewandt, wenn es noch keine a priori Hypothese gibt. In diesem Sinne findet die Clusteranalyse die am ehesten signifikante mögliche Lösung, auf Grund derer dann eine objektive Einteilung, z.B. die Klassifikation von Arten, Gattungen, Familien etc. erfolgen kann. Die taxometrische Bearbeitung eines Klassifikationsproblems kann in drei Schritte zerlegt werden (Nöbauer & Timischl [1979]): Im ersten Schritt werden die festgelegten Merkmale der Untersuchungsobjekte (taxonomische Einheiten), in diesem Fall der Isolate, bestimmt. In der FAME-Analyse sind die Gesamtfettsäuren (GC-Peaks) die Merkmale, in der TGGE die Bandenmuster der Sequenzfragmente (Densitometerkurven). Für den BIOLOG-Test wird die Verwertung der 95 C-Quellen bestimmt: Positiv / negativ / „borderline“. Mathematisch codiert lauten die Werte: 1 / 0 / 0,5. Die schwachen „borderline“ Reaktionen erhalten hier nur halbsoviel Gewicht wie eindeutig positive Reaktionen. In der Sequenzierung wird die 16S rDNABasen-Sequenz (A,T,G,C-Folge) bestimmt und gegebenenfalls hypervariable Regionen durch Gewichtung eliminiert. Die so codierten Daten werden in einer Datenmatrix gesammelt. Im zweiten Schritt werden die Merkmale jedes Isolats mit denen von jedem anderen verglichen. Die Ähnlichkeit der verglichenen Paare beschreibt die zugeordnete Maßzahl. Als Maßzahlen verwendet man hauptsächlich Korrelations-, Abstands- (Distanz-) und Assoziationskoeffizienten (Ähnlichkeitsmaß, „Similarity"-Index). In der TGGE-Analyse mit dem GELCOMPAR-Programm wird mit dem „Pearson product-moment-correlation coefficient“ die Kongruenz (Deckungsgleichheit) der densitometrischen Kurven bestimmt. Die Kurven werden als Ganzes verglichen, nicht vorher definierte Banden (Peaks). Der Vorteil ist, daß der Koeffizient unsensibel gegenüber den relativen Konzentrationen ist, aber sensitiv gegenüber Unterschieden im Hintergrund. Beim „Band-matching coefficient“ treten dagegen oft Peak / Schulter-Fehlübereinstimmungen auf. Solch ein Ähnlichkeitsmaß zweiwertiger Merkmale (Banden vorhanden: ja/nein) ist der Jaccard-Koeffizient (SJ,, Jaccard-Similarity). In der Mikrobiologie wird im Rahmen der numerischen Taxonomie SJ vielfach für den Vergleich phänotypischer Merkmale (morphologische und stoffwechselphysiologische Daten in +/- Codierung) verwendet, wobei für zwei Organismen (Isolate) die Anzahl übereinstimmender positiver Tests (Σ (+/+) ) und die Anzahl Tests mit divergierendem Ergebnis (Σ (+/-) ) bestimmt wird: 2-41 2-42 Material & Methoden ∑ (+ / +) S J =: ∑ ( + / +) + ∑ (+ / −) Für beide Isolate negativ ausgefallene Tests werden nicht gewertet, da negative Übereinstimmungen wenig aussagekräftig sind und ein negatives Ergebnis auch wachstumsbedingt sein kann. Dieser Koeffizient veranschaulicht die Interpretationsmöglichkeiten simpler mathematischen Formulierungen, bzw. wie die Erfahrungen der Mikrobiologen als mathematisches Modell formuliert werden. In der BIOLOG-Analyse wird ein Distanzmaß verwendet. Dabei denkt man sich die Untersuchungsobjekte als Punkte in einem n-dimensionalen „Merkmalsraum“ (n = 95 verschiedene Substrate). Jedes Untersuchungsobjekt wird durch einen Merkmalsvektor Pi = (M1i,...,Mni) beschrieben (Testwerte für Substrat 1 bis 95: 0/0,5/1). Der Abstand zwischen zwei Punkten Pi und Pj wird durch die euklidische Distanz (Abstandskoeffizient D) definiert: ∑ ( M mi − M mj ) n D =: 2 m =1 Die in der Analyse der BIOLOG-Daten mit dem STATISTICA-Programm verwendete quadratische euklidische Distanz legt progressiv mehr Gewicht auf die Distanz zweier Objekte (Isolate): ∑ ( M mi − M mj ) n D’ =: 2 m =1 In der Sequenzanalyse dividiert man zumeist mit der Wurzel aus dem mittleren Abstandsquadrat unterschiedlich lange Sequenzen, also unterschiedliche Anzahlen von Merkmalen, zu vergleichen. Mit der „power distance“ (P) oder Lr-Metrik des PHYLIP-Programms DNADIST wird ebenfalls progressiv Gewicht auf die Differenz einzelner Merkmale gelegt. Die Wahrscheinlickeit von Punktmutationen wird mit p kontrolliert, mit r wird Gewicht auf größere, durch phylogenetische Evolution bedingte Unterschiede gelegt : n P =: r ∑ m =1 M mi − M mj p Als Spezialfall ergibt sich aus dieser Gleichung mit p = r = 2 die Metrik D, mit p = 1 und r = 2 D´. Im dritten Schritt erfolgt die Gruppenbildung anhand der Distanz- oder Ähnlichkeitsmatrix. Die bestimmten Klassen sollen in sich möglichst homogen sein, untereinander möglichst heterogen. Mathematisch formuliert haben die Mitglieder in einer Klasse zueinander geringeren Abstand (größere Ähnlichkeit) als zu irgendeinem Objekt außerhalb dieser Klasse. Die Klassifikation erfolgt hierarchisch: Stufenweise werden einander ähnliche Klassen von Objekten (Isolate) immer gröber bis zu einer einzigen Klasse zusammengefaßt. In einem ersten Aggregationsschritt werden die „ähnlichsten“ Objekte (mit den höchsten Korrelations-/ Ähnlichkeitswerten oder geringsten Distanzen) zu einer Gruppe (Cluster, Klasse) zusammengefasst. Für den nächsten Aggregationschritt werden die Koeffizienten für die verbliebenen Material & Methoden Objekte und die gebildeten Gruppen bestimmt, die ähnlichsten Objekte und Gruppen zusammengefasst und so fort, bis alle Objekte in einer Gruppe zusammengefasst sind. Das Ergebnis dieser hierarchischen Methode wird grafisch in einem taxonomischen Baum dargestellt (Dendrogramm, Verwandtschaftsbaum). Er zeigt zweidimensional, welche Objekte (Y-Achse) zu Gruppen oder Klassen zusammentreten und auf welcher Ähnlichkeitsstufe (X-Achse) die Gruppenbildung erfolgt. In einem „Evolutions-Baum“, der die stammesgeschichtliche Entwicklung der Arten rekonstruieren soll, entspricht zum Beispiel jede Stufe einer Evolutionsphase - die Zusammenführung in eine einzige Klasse entspricht der Zurückführung auf die „gemeinsame Wurzel“ („common ancestor“). Die Zusammenfassung der Cluster unterliegt bestimmten Gesetzen („linkage rules“), die über die Cluster-Homogenitäts- bzw. Heterogenitätsmaße bestimmt werden: Meist wird die Methode des „unweighted pair-group method using arithmetic average“ verwendet (auch „Unweighted Pair-Group Average“ genannt, allgemein abgekürzt mit UPGMA). In jedem Agglomerationsschritt wird der Abstand H zwischen den bereits bestimmten Clustern K und L als mittlerer Abstand aller Objekte Ki und Lj der Cluster bestimmt (Sneath & Sokal [1973]): ∑ ∑ Dij H Cluster K,L =: i j Ki L j Die Cluster die den geringsten mittleren Abstand ergeben, werden vereint. Dieses Verfahren wurde bei der Analyse der BIOLOG und der TGGE-Daten angewandt. Vorteil der Methode ist, daß sie von der Gruppengröße wenig beeinflußt wird (Clifford & Stephenson [1975]) und daher besonders geeignet ist für Populationsanalysen, bei denen Einercluster bis umfangreiche Hauptgruppen bestimmt werden. Die letztendliche Definition der Gruppen, d.h. die Bestimmung des Grenzwertes ab dem ein Isolat einer Gruppe angehört, obliegt dem Anwender. Gleichrangige Taxa (z.B. Arten) sollten auf etwa gleicher Ähnlichkeitsstufe klassifiziert werden, höherrangige taxonomische Einheiten (z.B. Familien) auf geringerer Ähnlichkeitsstufe. Sequenzanalyse Die Sequenzanalyse unterscheidet sich in einigen wesentlichen Punkten von der BIOLOG-, FAME- und TGGE-Clusteranalyse: Zum einen durch den Charakter der Merkmale: Die Merkmale sind voneinander abhängig, da sie Teil einer „Sequenz“ sind (keine einzelnen Tests). Die Merkmale sind von der zu beobachtenden Mutationsund der zu schätzenden Evolutions-Rate der Nukleotide abhängig (nur innerhalb von Verwandschaftslinien ist innerhalb bestimmter Sequenzbereiche gleiche Variationsmöglichkeit und konstante Variationsrate der vier Basen anzunehmen). 2-43 2-44 Material & Methoden Zum anderen unterliegen die mathematischen Methoden der Sequenzanalyse einer a priori Hypothese: Den zugrunde gelegten Evolutions-Theorien. Als solche sind Theorien rein hypothetisch und nicht zu beweisen (Priest & Austin [1993]), ebensowenig wie die resultierende „phylogenetische Klassifikation“. In diesem Sinne ist die phylogenetische Analyse nicht objektiv. Außerdem gibt es ein Optimalitätskriterium zur Konstruktion der Bäume: Der Baum ist optimal, der die wenigsten Mutationen verlangt (Prinzip der minimalen Evolution). Anhand des mathematisch zu definierenden Kriteriums „minimale Zweiglängen bei Kompatibilität mit der maximalen Anzahl Merkmale“ wird die Qualität der phylogenetischen Klassifikation testbar (Priest & Austin[1993]). In der phänetischen Clusteranalyse existiert kein derartiges Kriterium4. Da für die Phylogenie darüberhinaus von entscheidender Bedeutung ist, wann sich eine Verzweigung bildet, wird zusätzlich sehr viel Arbeit auf die Berechnung der „richtigen“ Baumtopologie (Verzweigungsmuster) verwendet. Die Baum-Konstruktion stellt sich als ein kombinatorisches Problem dar: Aus 4 Sequenzen A-D lassen sich zum Beispiel 3 Bäume ohne Wurzel5 und 15 Bäume mit Wurzel6 konstruieren. Bei Reduktion des m x n dimensionalen Raumes (divergierende Merkmale x Anzahl taxonomische Einheiten) auf die 2-dimensionale grafische Darstellungsebene gibt es verschiedene korrekte Möglichkeiten der Verzweigung. Die Stabilität und Reproduzierbarkeit der Verzweigungen zeigt die Analyse aller möglichen Baumtopologien für unterschiedlich kombinierte Sequenzen eines Datensatzes. Die statistische Signifikanz der Baumtopologie wird mittels einer theoretischen Stichprobenerhebung in der „Bootstrap“-Analyse getestet werden. Die „Bootstrap“-Analyse berechnet hierfür anhand von zufällig erzeuten Stichproben des Datensatzes die prozentuale Häufigkeit für die Position einer Verzweigung. Die „Bootstrap“-Analyse veranschaulicht beispielsweise, daß die Position einzelner, stark divergieren-der Sequenzen in einem Baum nur grob bestimmbar ist, d.h. eine zuverlässige phylogenetische Klassifizierung nicht möglich ist. Beim Umfang der Merkmale (bei kompletter 16S rDNA-Analyse rund 1500 Basen) sind die benötigte Rechnerkapazität und -Zeit für die Berechnung des „optimalen“ Baumes und die Stabilität der Verzweigungen entscheidende Kriterien für die Wahl der Methode. Da kombinatorisch die Anzahl an Möglichkeiten geringer ist, werden daher zumeist Bäume ohne Wurzel berechnet. 4 Nur wenn die Clusteranalyse zur Zuordnung neuer Datensätze (Isolate) verwendet wird, ist durch die nachzuvollziehende derzeitige Klassifikation im gewissen Sinne ein Optimalitätskriterium gegeben. 5 Kombinationsmöglichkeiten für 4 Einheiten ohne Wurzel: (AB)(CD), (AC)(BD), (AD)(BC) 6 Kombinationsmöglichkeiten mit Wurzel (Klammern geben die Reihenfolge der Vereinigung zu einer Gruppe): (AB)(CD), (AC)(BD), (AD)(BC), (AB)C)D), (AB)D)C), (AC)D)B), (AC)B)D), (AD)B)C), (AD)C)B), (BC)D)A), (BC)A)D), (BD)A)C), (BD)C)A), (CD)A)B), (CD)B)A) Material & Methoden 2 1 2 3 6 2A 1 B 2 C 1 D 1 2 A 1 B 2 C 2 1 D 6 E Einheit Zeit E Unskaliert: Knoten proportional zur Zeit der Divergenz Skaliert: Zweiglängen proportional zur Anzahl molekularer Veränderungen Abb. 2.3 Phylogenetische Bäume Die phylogenetische Interpretation der eigentlich phänetischen Daten (sie repräsentieren heutige Genstruktur, den heutigen genetischen Phänotyp) verdient bei der Konstruktion und Interpretation der Dendrogramme (Bäume) besondere Aufmerksamkeit: „Phylogramme“ (skalierte Bäume, siehe Abb. 2.3 rechts; wie z.B. hier mit TREEVIEW generiert) unterscheiden sich bereits optisch eindeutig von denen rein phänotypischer Charakterisierung: Der hierarchische Aufbau der höheren Klassen erfolgt von rechts nach links (sonst: von links nach rechts), die Sequenzen bilden die Endpunkte (sonst: zuzuordnende Einheiten als Ausgangspunkte) und enden nicht auf einer Linie sondern mit unterschiedlichen Zweiglängen (sonst: Normierung auf die maximale Distanz). Die Länge der Zweige wird proportional zur Zahl der molekularen Änderungen bestimmt. Bei einer Normierung auf gleiche Gesamtlänge (skalierte Bäume, siehe Abbildung, links) entsprechen die Zweiglängen dem Evolutionszeitraum. Die Sequenzunterschiede werden dann auf unterschiedliche Evolutionsraten in den verschiedenen Verwandtschaftszweigen zurückgeführt. Die oben dargestellten Bäume vereinen die Sequenzen in einer gemeinsamen Wurzel („root“), die als gemeinsamer Vorfahr oder Urahn („common ancestor“) interpretiert wird. Die gleichgerichteten Zweige lassen in diesem Sinne die Richtung der Evolution erkennen und korrespondieren mit der Evolutionszeit. Um den phänetischen Charakter der Klassifikation zu betonen, wurde in vorgelegter Arbeit ein Algorithmus für skalierte Bäume ohne gemeinsame Wurzel verwendet. Diese Bäume repräsentieren die „phylogenetische“ Verwandtschaft aber nicht den Evolutionsweg. In diesem Sinne visualisieren die Zweige nur die derzeitige Verbindung zwischen den Organismen und betonen benachbarte Taxa. 2-45 2-46 Material & Methoden Zur Sequenzanalyse verwendete Algorithmen Die Bootstrap-Analyse der 16S rDNA-Sequenzen wurde in dieser Arbeit mit den Programmen des PHYLIP-Paketes in den folgenden Schritten durchgeführt: 1) SEQBOOT zur Erzeugung von 100 Datensätzen, 2) DNADIST zur Berechnung der Distanzmatrizen, 3) FITCH zur Konstruktion phylogenetischer Bäume und 4) CONSENSE für die Zusammenfassung der Bäume im Bootstrap-Dendrogram. Die Algorithmen werden im Folgenden kurz erklärt: SEQBOOT: Aus dem vorhandenen Datensatz mit n Sequenzen und m Merkmalen wird wiederholt, zufällig ein neuer Datensatz gleicher Größe ausgewählt. Die Methode geht von der Annahme aus, daß die Merkmale unabhängig voneinander evolvieren. Unter dieser Annahme ist die zufällige Variation der Ergebnisse typisch für die Variation die man bei realer Stichprobenerhebung erhalten würde. Für jeden Datensatz wird im Folgenden das Dendrogramm berechnet und aus diesen die prozentuale Häufigkeit der Verzweigungen berechnet. Diese statistischen Werte für die Position der Zweige werden in die einfache Analyse (DNADIST, FITCH) eingebracht. Zweige, die nach der Bootstrap-Analyse mindestens in 50% der berechneten Bäume die bestimmte Position einnehmen, wurden in den Grafiken mit diesem Wert am Verzweigungspunkt gekennzeichnet. DNADIST: Das verwendete Einparameter-Modell von Jukes & Cantor [1969] nimmt an, daß unabhängig voneinander an beliebiger Stelle der Sequenz Änderungen in der Basenfolge auftreten und Substitutionen der 4 Basen gleich häufig vorkommen. Basierend auf dem Modell der evolutionären Veränderungen ist die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, daß die Sequenzen einen bestimmten Baum ergeben (nicht die Wahrscheinlichkeit, daß der Baum korrekt ist). Der Baum der diese Wahrscheinlichkeit maximiert (der wahrscheinlichste Baum), ist der Maximum Likelihood Schätzwert. Die Wahrscheinlichkeit P, daß zwei Sequenzen an bestimmter Stelle im Verlauf der Zeit t mit der Substitutionsrate u variieren (evoluieren) wird im Modell beschrieben mit: P =: 3 4 (1 − e − 4 3ut ) Die Raten für Transitions- und Transversionsmutationen werden gleichgesetzt (hier: 0,5), Insertionen und Deletionen ignoriert und die Häufigkeit der 4 Basen als gleich angenommen. Die Distanz zwischen zwei Sequenzen ergibt sich nach Umformung der obigen Gleichung als Produkt der Substitutionsrate u und dem dem Zeitintervall dt zu: ut = − 3 4 ln (1 − 4 3 P ) Material & Methoden Die obige Gleichung entspricht der Beziehung von µ zum zu beobachtenden Anteil Punktmutationen P. Die mittlere Anzahl Basendifferenzen µ zwischen zwei bestimmten Sequenzen ist ein Maximum Likelihood Schätzwert für ut im Jukes-Cantor-Modell. FITCH: Das Programm sucht die beste Baumtopologie, d.h. die Baumstruktur, die am besten die Differenzen im m-dimensionalen Merkmalsraum wiedergibt. Hierfür werden die Sequenzen in variabler Reihenfolge wiederholt dem Algorithmus unterworfen. Nachdem die letzte Sequenz dem Baum zugeordnet wurde, werden die einzelnen Gruppen entfernt und neu zugeordnet um das Ergebnis zu verbessern. Das folgende Kriterium der Kleinsten Quadrate, mit D den beobachteten und d den erwarteten Distanzen (berechnet aus dem konstruierten Baum) zwischen zwei Sequenzen i und j, wird zur Anpassung der Bäume an die Distanzmatrizen verwendet (Distanz-Matrix-Methode nach Fitch & Margoliash [1967]): S =: ∑∑ i j ( D ij − d ij ) Dij2 2 = min Wird die Potenz im Nenner gleich Null gesetzt, entspricht die Methode vom Ansatz her dem in der phänotypischen Analyse angeandten UPGMA. Die Distanzen im Baum entsprechen der Zweiglänge (nur die horizontale Komponenten im hierarchischen Baum) von i bis j. Der berechnete Baum enthält keine Wurzel, aber durch Verwendung von „outgroup“-Sequenzen werden Organismengruppen im räumlichen Kontext dargestellt. 2-47 3-48 Ergebnisse 3 Ergebnisse Die hauptsächlich untersuchte Sedimentprobe wurde am 24. August 1993 der Spittelwasser kurz vor der Einmündung in den Muldestichkanal entnommen (siehe Abb. 1.1). Anhand dieser Probe wurde die taxonomische Struktur der Spittelwasser-Sedimentpopulation und das Xenobiotika-nutzende Potential bestimmt. Für vergleichende Untersuchungen wurden die Daten der Vorversuche vom 21. April und 12. Mai 1993 sowie der im folgenden Jahr durchgeführten Probenahmen am 10. Mai und 30. August 1994 herangezogen. Physikochemische Parameter und mikrobielle Bestimmungen charakterisierten die Standortentwicklung über den Untersuchungszeitraum von zwei Jahren. 3.1 Charakterisierung des Standortes Der Fluß durchzieht eine Auenlandschaft und ist bei kräftigem Uferbewuchs schwach bis mittel stark beschattet. Die Probenahmen erfolgten aus der Uferzone bei normaler Wasserführung und ruhigem Fluß (0.2-0.4 m/s geschätzte Strömungsgeschwindigkeit). An der Probenahmestelle war das Gewässer je nach Wasserführung 5-10 m breit und nur 0.5-1 m tief. Bei mittlerer Wasserführung wurde das Flußbett an dieser Stelle nicht beschattet. Das Wasser war im Frühjahr mittel, im Herbst stark getrübt und hatte eine auffällige braune Grundfärbung (u.a. wahrscheinlich durch hohen Gehalt an Huminstoffen bedingt, Statusbericht BMFT [1996]) die mit dem Chargenbetrieb der Industrieanlagen in Bitterfeld variierte (z.B. August 1993 braun-gelb, August 1994 braun-violett). Es wies einen für die Zufuhr von Rohabwasser charakteristischen chemischen Geruch auf. Auf einem Untergrund aus Kies, bestand das Substrat vorherrschend aus Sand; einzig beobachteter Pflanzenwuchs waren Fadenalgen. Eine Bedeckung von ¼ der Fläche mit Faulschlamm und zeitweilig beobachtete Schwarzfärbung der Steinunterseiten zeigten Reduktionsverhältnisse an. 3.1.1 Witterungsverlauf Die Jahre 1993 und 1994 waren nach Angaben des Deutschen Wetterdienstes (Wetteramt Leipzig) im Vergleich zu den vierteljährlichen Mittelwerten überdurchschnittlich warm und nach den Flächenmitteln des Niederschlages überdurchschnittlich naß. Die Trockenheit der Monate Februar bis Mai im Jahr 1993 bedingte eine geringe Wasserführung bei den Probenahmen im April und Mai (12.04. / 12.05.93). Trotz intensiver Regenfälle im Juli und Niederschlagstätigkeit im August (Probenahme 24.08.93) blieb die Wasserführung 1993 unter normal. Die Hochwasserlagen im Januar / Februar und eine extreme Hochwasserlage im April kennzeichneten das Jahr 1994. Nach der Probenahme im Mai (12.05.94) sank der Durchfluß bis leicht unter die Normalwerte. Trotz zwischenzeitlich reichlicher Niederschläge blieb die Wasserführung auch bei der Probenahme im August (30.08.94) unter den Normalwerten. Ergebnisse 3.1.2 Chemisch-physikalische Parameter Die vor Ort erhobenen chemisch-physikalischen Parameter wurden in der folgenden Tab. 3.1 zusammengefaßt. Die Werte für Gesamt- und Karbonathärte waren in beiden Jahren extrem hoch. Im Vergleich zur Mulde bei Retzau war die Gesamthärte in der Spittelwasser 3,3 bis 4,5-fach höher. Durch die Härte könnte die toxische Wirkung vorhandener Schwermetallionen (Hg, Zn) herabgesetzt worden sein (Schönborn [1992], Bell [1976]). Ebenfalls im Vergleich zur Mulde stark überhöhte Werte zeigten Ammonium (Faktor >10) und Nitrat (2-4 fach). Sulfat und Phosphat waren nur im Mai 1994 wesentlich höher als in der Mulde. Legt man die Gewässergüteklasse II / III zugrunde, wurde von den entscheidenden Parametern der Mindestgüteanforderungen für Fließgewässer (Landesamt für Wasser und Abfall Nordrheinwestfalen [1986]) nur der Wert für Ammonium stark überschritten. Für den Erhalt des Lebens von Fischen in Süßwasser sollte die NH4-Konzentration ≤1 mg/l sein. Tab. 3.1 Chemisch-physikalische Charakterisierung des Standortes Spittelwasser und Vergleich mit Daten für die Mulde bei Retzau* Mulde* Spittelwasser Parameter Wassertemperatur [°C] Lufttemperatur [°C] pH Basenkapazität [mmol/l]2 Säurekapazität [mmol/l]3 Gesamthärte [°dH] Karbonathärte [mmol/l Ca] Ammonium [mg/l] Nitrit [mg/l] Nitrat [mg/l] Sulfat [mg/l] o-Phosphat, gelöst [mg/l] 24.08.93 10.05.94 30.08.94 20 17 6,52 0,6-0,7 1,8 50 8,9 8,0 >1,6 80 230 0,02 15 19 7,10 0,4 3,8 40 7,12 3,0 0,64 . 550 0,14 19 17 6,75 0,4 2,8 41 7,3 5,0 0,05 40 184 0,02 12.05.93 18.08.93 19,1 . 7,40 . . 8,8 / 11,011 2,2 / 3,111 0,271 0,320 29,00 13011 0,0052 19,7 . 7,30 . . 11,11 2,81 0,451 0,360 19,40 . 0,061 10.05.94 26.08.94 14,8 18,2 . . 7,20 7,34 . . . . 1 10,6 / 12,01 14,6 / 11,711 2,2 / 3,111 3,4 / 3,111 0,24 0,37 0,36 0,38 30,2 17,3 1 1631 13311 <0,03 0,18 Legende: * . 1 2 3 Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt [1993, 1994] nicht bestimmt Bestimmungen erfolgten nur bei jeder 2. Probenahme, Werte vom 26.05.93, 25.05.94 und 17.08. / 14.09.94 Basenkapazität: Acidität, Umschlag bei pH 8.2 = -p Wert Säurekapazität: Alkalität, Umschlag bei pH 4.3 = +m Wert Das Fehlen von Makroorganismen im gesamten Beobachtungszeitraum deutete auf die LAWA-Güteklasse IV - ökologisch zerstört (LAWA: Länderarbeitsgemeinschaft Wasser). Neben den im Sediment abgelagerten Schwermetallen, sind vor allem die sich aus der Produktpalette des Chemie-Kombinates Bitterfeld / Wolfen ergebenden spezifischen organischen Substanzen als ursächlich anzunehmen. Die Bestimmung dieser Substanzen erfordert eine spezielle Analytik, die den Rahmen des üblichen Meßpro- 3-49 3-50 Ergebnisse gramms überschreitend. Entsprechende Daten wurden soweit möglich anhand der Gewässergüteberichte des Landes Sachsen-Anhalt [1992-1994], dem Statusbericht des BMFT [1996] und den Tabellen der Arbeitsgemeinschaft für die Reinhaltung der Elbe [1996] recherchiert (siehe Einleitung, Kaptitel 1.3.2). 3.2 Quantitative mikrobiologische Populationsuntersuchungen Am Probenahmeort ließen sich Sedimentkerne von 14-19 cm Höhe stechen. Charakteristischerweise bestanden im August die obersten 3 bis 10 mm aus leichtem, braunen Sediment, gefolgt von mit zunehmender Tiefe fester werdendem schwarzen Sediment. Zum Teil war in etwa 12 cm Tiefe eine dünne Sandschicht eingelagert. Im Mai zeigte sich eine deutliche Schichtung der Sedimentkerne. Auf die 3 bis 10 mm dicke, helle Deckschicht folgten ca. 4 cm leichtes, schwarzes Sediment, 5 bis 9 cm festes dunkelgraues Sediment, zum Teil eine bis zu 1 cm starke mit Sandkörnern versetzte Schicht und dann in der Tiefe wiederum festes schwarzes Sediment. Der schwarze Niederschlag demonstrierte eine reichliche Ausfällung von Schwermetallsulfiden, vor allem Eisensulfid. Die Sulfatreduktion war vor Ort am typischen Geruch des in Gasblasen austretenden freigesetzten Schwefelwasserstoffes erkennbar. Abb. 3.1 Entnahme der Sedimentkerne Probenahme Mai (links) und August (rechts) 1993 Aufgrund der instabilen, flockigen Konsistenz wurde für die Entnahme der Oberflächen-Sedimenproben die oberste Schicht der Sedimentkerne mit einer umgedrehten 10 ml Glaspipette abgezogen. Die Trok- Ergebnisse kengewichtsbestimmung zeigte im August tendentiell festere Konsistenz der oberen Sedimentschicht als im Mai (0-0,5 cm Schichttiefe: August 35-38 mg/ml, Mai 23,5-27 mg/ml Trockengewicht / Naßgewicht). Dies kann in Hinblick auf den Witterungsverlauf auf eine längere Verweilzeit und Absetzmöglichkeit im August zurückgeführt werden. Die Schichtung im Mai 1994 geht auf das unmittelbar vorausgegangene extreme Hochwasser zurück, bei dem das Sediment stark ausgewaschen wurde. Bis August hatte sich bei niedriger Wasserführung wieder eine starke Sedimentschicht aufgebaut. [g TG/ml NG] 0,25 0,038 0,0575 0,2 0,15 0,1 0,035 0,027 0,035 0,029 0,035 0,03 0,05 0 0,069 0,0235 0,0275 0,028 0,04 0,035 Mai August 1993 0,07 0,0295 Mai August 1994 Schichttiefe 0,0-0,5 cm 0,5-1,0 cm 1,0-1,5 cm 1,5-2,0 cm Abb. 3.2 Trockengewichtsbestimmung Probenahme 1993 / 1994, Mittelwerte aus 2 Sedimentkernen, je 3 Aliquots à 1 ml In einem Vorversuch (Probenahme 21.04.93) wurden Probenaufbereitung und die Eignung verschiedener Medien zur Koloniezahlbestimmung (Bestimmung der „Lebendkeimzahlen“) und Isolation erprobt. Unter optimierten Versuchsbedingungen zeigte der Vergleich homogenisierter und nicht-homogenisierten Proben einen Anstieg der koloniebildende Einheiten (KBE/g TG) um das 1,1-1,3 fache mit der Homogenisierung, entsprechend erfolgreicher Separation von Aggregaten und minimaler Abtötung der Bakterien durch die angewandten Scherkräfte (Gunkel [1964], Pike [1972]). Für die folgenden Probenahmen wurden die Proben 10-2 vorverdünnt und die Suspension mit dem Ultraturrax 1 min. bei 8.000 U homogenisiert, weiter verdünnt und in 3 Parallelen auf verschiedenen Medien ausgestrichen. Für die Bestimmung der optimalen Medienzusammensetzung wurden die Koloniezahlen auf verschiedenen Medien untterschiedlicher Konzentration und Zumischung von Sedimentextrakt bestimmt: Nähragar (NA einfach und 1:10 verdünnt), Reasoner-2-Agar (R2A) und Minimalagar (MM) sowie diese Medien mit einem Drittel Sedimentextrakt (NS, N10S, RS, MS) und Sedimentextraktagar (S4 mit 1:2 verdünntem, SA mit einfachem und S2 mit doppelt konzentriertem Sedimentextrakt). Höchste Werte ergaben NA (6,9x109 KBE/g TG = 1,8x108 KBE/ml), RS (8,5x109 KBE/g TG = 2,2x108 KBE/ml) und SA (7,7x109 KBE/g TG = 2,0x108 KBE/ml), entsprechend etwa 100-125 Kolonien / Platte in der Verdünnungsstufe 10-6. NA-Kolonien zeigten starken Wuchs, häufig kräftige Pigmentierung und bereits nach kurzer Zeit 3-51 3-52 Ergebnisse (>2 Tage) starke Tendenz zum Schwärmen, die die Isolierung von einzelnen Kolonien nach längerer Inkubation teilweise unmöglich machte. Die Kolonien auf SA waren kleiner und morphologisch differenter als auf RS und NA. Für die Populationsuntersuchungen empfahl sich die Primärisolierung auf den nährstoffarmen komplexen Medien (RS, SA), damit bei Erfassung einer möglichst große Zahl von Bakterien unterschiedlichste Arten heranwachsen können (Dott [1980]). Aufgrund der besseren Abgrenzung der Kolonien bei höherer Zelldichte und ihrer morphologischen Diversität, wurde im folgenden SA zur Gewinnung von Isolaten verwendet. Koloniezahlbestimmungen auf NA dienten im weiteren als Standard, d.h. zur Kontrolle der Koloniezahlen bei wechselnder Zusammensetzung des Sedimentextrakts und zum Vergleich mit Literaturangaben. 3.2.1 Mikroskopische Bestimmung Die homogenisierten Sedimentproben zeigten nach Färbung der Zellen mit Acridin-Orange unter dem Epifluoreszenz-Mikroskop sehr hohe Hintergrundfluoreszenz bei sehr kleiner Zellgröße. Mehrfachbestimmungen der Zellzahlen zeigten bei gleichzeitig starker Heterogenität der Proben und Anheftung der Bakterien an Partikel bzw. nicht aufgelöste Bakterienflocken, daß eine objektive (im Sinne der Statistik sinnvolle) Auszählung der Zellen nicht möglich war. Dieser Effekt wurde auch von Staley [1974] beschrieben: Für den Oxidationsteich einer Papiermühle mit dem Phasenkontrast-Mikroskop bestimmte Zahlen waren aufgrund der Aggregate und Anheftung an Holzfasern niedriger als die bestimmten Lebendkeimzahlen (MPN/ml). Der Einsatz des Ultraturrax erzielte offenbar keine absolute Homogenisierung der Suspension. Dies mußte akzeptiert werden um Abtötung bei stärkerer Homogenisierung zu vermeiden. Auf die mikroskopische Bestimmung der Zellzahlen wurde schließlich verzichtet, da außerdem eine Unterscheidung lebender bzw. aktiver und toter bzw. inaktiver Zellen bei dieser Methode nicht möglich ist und somit die bestimmte „absolute“ Zellzahl mehrdeutig ist. Aus der unvollständigen Homogenisierung ergab sich, daß die quantitativen Keimzahlen (koloniebildende Einheiten, KBE) wahrscheinlich zu niedrig bestimmt wurden. Bekanntlich ist nur ein geringer Teil der Populationen isolierbar, so daß die bestimmten Zahlen nur eine tendentielle Beschreibung ermöglichten. In den folgenden Diagrammen wurde versucht dieser Tatsache durch Angabe der Extremwerte (minimale und maximale Koloniezahlen dreier Parallelen) statt der Standardabweichung zu betonen. Ergebnisse 3.2.2 Gesamtkoloniezahlen auf Komplexmedien Koloniezahlen auf SA und NA ermöglichten den Vergleich realitätsnaher und praxisüblicher Keimzahlbestimmungen. In den beiden Probenahmen 1993 waren die Koloniezahlen für beide Medien annähernd gleich hoch (siehe Abb. 3.3): Im Mai wurden mit SA 1,1x109 und NA 1,3x109 KBE/g TG bestimmt (bzw. 2,9x107 und 3,7x107 KBE/ml). Im August wurden mit SA 1,7x109 und NA 1,1x109 KBE/g TG bestimmt (bzw. 3,9 x107 und 5,5 x107 KBE/ml). Die Extremwerte zeigten im Mai auf SA, im August auf NA größere Schwankungsbreite der Zellzahlen. Tendentiell zeigte SA eine Zunahme der Zellzahlen im August, NA dagegen möglicherweise eine Abnahme. Dies könnte einer Abnahme des Anteils raschwüchsiger heterotropher Bakterien an der Population im älteren Sediment entsprechen. [KBE/g TG] NA SA SA NA mXy mXy pXy pXy Etb Etb Tol Tol oXy oXy ßHN ßHN Ant Ant Bip Bip Nap Nap 24D 24D 3CB 3CB Probenahme 5/93 8/93 4CS 4CS 5CS 5CS 1E+11 1E+10 1E+09 1E+08 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 1E+01 1E+00 1E-01 Abb. 3.3 Koloniezahlen Mai / August 1993 Inkubation 6 Tage / Raumtemperatur, Mittlere Koloniezahlen und Extremwerte Im Jahr 1994 (Abb. 3.4) waren die Werte beider Probenahmen um eine Zehnerpotenz höher als 1993. Nach einem unmittelbar vorangegangenem Hochwasser waren die bestimmten Koloniezahlen im Mai (SA / NA 1,8 / 1,4x1010 KBE/g TG, bzw. 4,1 / 3,3x108 KBE/ml) wesentlich höher als im August (SA / NA 5,2 / 8,8x109 KBE/g TG, bzw. 1,9 / 3,3x108 KBE/ml), wobei SA wesentlich stärkere Abnahme der Koloniezahl belegte. Die Koloniezahlen der anzunehmenden raschwüchsigen heterotrophen NAOrganismen waren allgemein höher als die der mit SA zu bestimmenden Bakterien. Im Mai betrug der Unterschied 4x109 KBE/g TG, im August noch 1,8x109 KBE/g TG. Angenommen wurde eine erhöhte Toxizität des Spittelwassersediments gegenüber dem Vorjahr und erhöhte Freisetzung derartiger Substanzen durch das Hochwasser im Frühjahr. 3-53 Ergebnisse [KBE/g TG] Probenahme 5/94 8/94 SANA NASA + pXy pXy mXy mXy + + TolTol oXy oXy + EtbEtb + Ant Ant ßHN ßHN Bip Bip Nap Nap 3CB 3CB 24D 24D + + 5CS 5CS 1E+11 1E+10 1E+09 1E+08 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 1E+01 1E+00 1E-01 4CS 4CS 3-54 Abb. 3.4 Koloniezahlen Mai / August 1994 Inkubation 6 Tage / Raumtemperatur, Mittlere Koloniezahlen und Extremwerte (+: Agarliquifizierer, KBE nicht genau bestimmbar) 3.2.3 Koloniezahlen auf Xenobiotika-Minimal-Medien Das Screening auf 13 verschiedenen Xenobiotika-Medien zeigte starke Unterschiede der Probenahmen Mai und August, 1993 und 1994 (siehe Abb. 3.3, Abb. 3.4). Die Koloniezahlen ergaben quantitativ und qualitativ stark unterschiedliches Wachstum mit den Aromaten und charakterisierten die unterschiedliche bakterielle Populationen. Die Koloniezahlen beschrieben Verbreitung und Adaptation der Xenobiotika degradierenden, toleranten oder resistenten Bakteriengruppen in Abhängigkeit von den vor Ort gegebenen Substratbedingungen, das heißt in Abhängigkeit von der Belastung mit bestimmten Xenobiotika zur Zeit der Probenahme. Bei etwa gleichen Gesamtkoloniezahlen (SA, NA) der Probenahmen 1993, lagen die Werte für die Xeno-biotika, soweit Wuchs nachgewiesen wurde, zwischen 5x102 und 5x105 KBE/g TG. Die höchsten Koloniezahlen wurden mit den leichtflüchtigen und leicht verwertbaren Kohlenwasserstoffen erzielt (maximal mit Toluol). 4CS, 24D, 3CB zeigten 1993 überhaupt keinen Bewuchs. Kein Wuchs wurde im Mai auf 5CS, im August auf Nap und dem Nap-Metaboliten βHN beobachtet. Die unterschiedlichen Gesamtkoloniezahlen der Probenahme Mai / August 1994 zeigten sich mit zumeist gegenläufiger Tendenz auch beim Screening auf den Xenobiotika. Während die Gesamtkoloniezahlen im August niedriger waren als im Mai, zeigten 9 der 13 Xenobiotika in der Probenahme August höhere Werte. Soweit Wuchs nachgewiesen wurde liegen die Werte im Mai zwischen 103 und 105 KBE/g TG, im August zwischen 103 und 5x106 KBE/g TG. Kein Wuchs wurde 1994 auf 5CS und im August auf Ergebnisse βHN erzielt. Die chlorierten und zwei- bis dreiringigen Aromaten wurden 1994 wesentlich stärker bewachsen als 1993 und zeigten (bis auf 5CS, βHN) etwa gleich starken Bewuchs wie die flüchtigen Aromaten. Höchste Koloniezahlen ergaben 1994 die Augustproben auf den Aromaten 24D, 3CB, Bip, Nap. Im Mai wurde die Auswertung durch Agar liquifizierende Kolonien stark erschwert. Auf den leichtflüchtigen Kohlenwasserstoffen waren im August besonders zahlreich Mikrokolonien (∅ ≤ 1 mm) zu beobachten, die nicht mitbestimmt wurden. Beide Faktoren (Agarliquifizierer und Mikrokolonien) führen im Allgemeinen zu einer Unterschätzung der Keimzahlen. Auch hier muß wieder die tendentielle Art der quantitativen Bestimmung betont werden. Der Wuchs mit den Aromaten, bzw. die Toleranz gegenüber den Aromaten, war 1994 deutlich höher als 1993. O-Xylol zeigte unter den leichtflüchtigen Verbindungen in beiden Jahren relativ niedrige Koloniezahlen. Auffällig war, daß es entweder zu Wuchs auf 4CS, 3CB und 24D kam, oder auf keinem der drei Substrate. 5CS erwies sich als wesentlich schwierigeres Substrat als 4CS: Nur im August 1993 gab es geringen Wuchs mit dieser Kohlenstoffquelle. Die höheren Xenobiotika-Koloniezahlen 1994 unterstützten die These, daß die im Vergleich zu NA geringen Koloniezahlen auf SA auf erhöhte Toxizität des Substrats zurückzuführen sind. 3.3 Mikrobiologische Charakterisierung Insgesamt wurden 1993, Probenahme Mai, aus der Verdünnungsstufe 5x10-6 des SA Plate Count Ansatzes 53 Reinkulturen isoliert. Für die Probenahme August wurden vom gleichen Medium insgesamt 135 Isolate erzielt. Die für die Isolierung angestrebte Zahl von 100 Einzelkolonien pro Verdünnungsstufe wurde aufgrund von Schwarmverhalten und Mischkolonien in keiner Verdünnungsstufe erreicht; daher wurde für SA 8/93 auch aus den folgenden Stufen isoliert. Die Isolierung der Reinkulturen von Xenobiotika-Platten erfolgte von den jeweils 3 mit unverdünnter Probe beimpften Platten der Probe August 1993. Die Isolierung erfolgte nach 2 bis maximal 4 Wochen Wuchs auf den Anreicherungsmedien von Platten mittlerer Koloniezahlen. Biphenyl, Toluol und Ethylbenzol waren aufgrund der hohen Zelldichte zur Isolierung nicht zu verwenden. Von den Xylolen wurde aufgrund der mittleren Zelldichte nur o-Xylol ausgewählt. Von den nach 6 Tagen auf 5CS bestimmten Kolonien konnte keine einzige isoliert werden. Tab. 3.2 zeigt die Anzahl gepickter Einzelkolonien der verwendeten Isolationsmedien sowie die Zahl der daraus auf Komplexmedium rekultivierbaren Isolate. Die beiden Zahlen wichen aufgrund der Vereinzelung von Mischkolonien und Nicht-Rekultivierbarkeit voneinander ab. Extreme bildeten oXy, bei dem aus jeder gepickten Kolonie im Schnitt drei Isolate vereinzelt wurden, und 4CS mit 40% Verlust im Versuch. In der Literatur wird auf Rekultivierungsprobleme vor allem bei nährstoffarmen Habitaten hingewiesen (Stetzenbach et al. [1986], Dott [1980]). Nachdem die auf Isolierungsmedium gewachsenen Bakterien ihre Reservestoffe verbraucht haben, werden die Nährstoffbedürfnisse auf dem Sekundärmedium wahrscheinlich nicht befriedigt. 3-55 3-56 Ergebnisse Tab. 3.2 Isolate der Probenahmen 1993 Probenahme Mai Medium SA 5x10 Verdünnung August SA -6 -7 5x10 -10 4CS 24D 3CB Ant Nap -5 oXy ∑ 0,1 gepickte Kolonien Isolate 50 53 146 135 15 9 18 17 60 70 39 42 76 88 35 90 439 504 % Kultiviert 106 93 60 94 117 108 116 257 115 Legende: Für den Ausstrich auf SA wurden je 0,1 ml der homogenisierten, verdünnten Probe verwendet, für Xenobiotika-Medien je 0,1 ml der unbehandelten Probe Unter der Annahme, daß die Bakterien 4CS tolerieren aber nicht nutzen, wurde hier ähnliche Ursache vermutet. Als Ursache für die große Anzahl der „Mischkolonien“ auf o-Xylol wurde umgekehrt die kometabolische Nutzung des Substrats angenommen. 3.3.1 Gram-Verteilung Die Gram-Bestimmung zeigte Abhängigkeit der Verteilung der Bakteriengruppen von Medium und Probenahme. Aufgrund geringer Wachstumsrate war das Gram-Verhalten einiger Isolate nicht bestimmbar. Vor allem von SA 8/93 isolierte Kolonien ließen sich vielfach nicht bestimmen, während die Xenobiotika-Isolate der Probenahme 8/93 unter Laborbedingungen auf Komplexmedien zumeist starken Wuchs und eindeutiges Gram-Verhalten zeigten. Lediglich von 24D wurden einige reaktionsschwache, nicht bestimmbare Bakterien isoliert. [Anzahl Isolate] 140 120 100 80 Gram-Bestimmung: 60 nicht bestimmbar Gram positiv Gram negativ 40 20 0 5/93 5E-6 8/93 5E-7 - 1E-5 8/93 8/93 8/93 8/93 Probenahme 5E-7 1E-6 5E-6 1E-5 Verdünnungsstufe Abb. 3.5 Gram-Verteilung der SA-Isolate Mai / August 1993 Ergebnisse Abb. 3.5 zeigt die Gram-Verteilung der mit Sedimentextraktagar (SA) angereicherten Bakterien im Vergleich für die beiden Probenahmen. Im Mai wurden nahezu ausschließlich Gram-negative Bakterien isoliert. Im August war ein nennbarer Anteil der Isolate gleicher Verdünnungsstufe Gram-positiv und ein hoher Prozentsatz der isolierten Bakterien konnte nicht Gram-bestimmt werden. Im Folgenden wurden SA-Isolate der Probenahme August 1993 (d.h. Isolate der Verdünnungsstufen 5x10-7 bis 10-5) in einer Gruppe zusammengefaßt. In der Gram-Verteilung entspricht dies einer Mittelwertbildung der beiden niedrigsten Verdünnungsstufen. Die 22 Isolate aus Verdünnungsstufe 5x10-7 und 10-6 erhöhten den Anteil der Gram-negativen Isolate geringfügig. [Anzahl Isolate] 140 120 100 80 60 Gram-Bestimmung 40 nicht bestimmbar Gram positiv Gram negativ 20 0 SA 135 24D 17 3CB 70 4CS 9 ANT NAP OXY Anreicherung August/1993 42 88 90 Summe der Isolate / Medium Abb. 3.6 Gram-Verteilung der Isolate 8/93 in Abhängigkeit vom Isolationsmedium Das Gram-Verhalten der im August 1993 von Xenobiotika-Minimalmedien und SA isolierten Kolonien zeigte charakteristische Verteilung für die verwendeten Anreicherungsmedien (Abb. 3.6). Im Vergleich zu SA wurden von den Xenobiotika-Medien verstärkt Gram-positive Bakterien isoliert. Extrem war dieser Effekt auf 4CS zu beobachten: Die wenigen isolierbaren Bakterien waren Gram-positiv. Auf oXy und 24D stellten sie über 50% der Isolate. 3.3.2 Xenobiotika-Toleranz Mit den SA-Isolaten wurde ein Screening auf den verschiedenen Xenobiotika-Medien durchgeführt. Entsprechend der beobachteten Xenobiotika-Koloniezahlen (siehe Abb. 3.7, Abb. 3.8) war für Isolate beider Probenahmen (SA 5/93, SA 8/93) häufig Wuchs auf den leichtflüchtigen Substanzen (Etb, Tol, oXy, mXy, pXy) und Biphenyl zu beobachten sowie weniger häufig Wuchs auf 4CS und 3CB. Die besten Wachstumsbedingungen bot o-Xylol: 68% der Mai- und 58% der August-Isolate zeigten rasches Wachstum auf dem Substrat. Anthracen wurde von den Isolaten SA 5/93 weniger genutzt als nach den Xenobiotika-Koloniezahlen zu vermuten. βHN und 5CS ermöglichten nur wenigen SA-Isolaten Wuchs, obwohl 3-57 Ergebnisse relativ hohe Koloniezahlen mit βHN im Mai 1993 und mit 5CS im August 1993 gezählt wurden. Allerdings überstand auch keine einzige der Kolonien dieser Plate Count Ansätze (βHN 5/93, 5CS 8/93) den mehrfachen Ausstrich auf den Medien zur Gewinnung von Reinkulturen. βHN und 5CS stellten als einzige Kohlenstoffquelle ein wenig geeignetes Substrat für das Wachstum von Bakterien dar. Durchschnittlich wuchsen ca. 41% der SA-Isolate beider Probenahmen auf mindestens einem der 13 Medien. Die Gram-negativen Isolate wuchsen allgemein gut auf den Xenobiotika-Medien (im Mittel 42% der SA-Isolate 5/93, 47% der SA-Isolate 8/93). Die meisten Isolate wuchsen mit oXy: 61 von 93 SA-Isolaten der Probenahme 8/93, 33 von 48 SA-Isolaten der Probenahme 5/93. Ähnlich verhielten sich die mit SA 8/93 isolierten Gram-positiven Bakterien. Die einfach zu verwertenden Aromaten ermöglichten bis zu 72% dieser Isolate den Wuchs (maximal wuchsen 13 der 18 Gram-positiven SA 8/93-Isolate auf mXy). Maximal 21% (5 von 24 Isolaten) der reaktionsschwachen, nicht Gram-bestimmbaren Isolate SA 8/93 wuchsen auf den Aromaten 24D,oXy und mXy. Das einzige Gram-positive SA 5/93Isolat wuchs auf 10 der 13 Medien, ebenso zwei der 4 nicht Gram-bestimmbaren Isolaten 5/93. [Anzahl Isolate] 60 50 40 Gram-Bestimmung nicht bestimmbar Gram positiv Gram negativ 30 20 pXY pXy oXY oXy mXY mXy ETB Etb TOL Tol ßHN ßHN ANT Ant BIP Bip NAP Nap 24D 24D 3CB 3CB 4CS 4CS 5CS 5CS 0 Isolate SA 5/93 10 Anreicherungsmedien Mai 1993 Abb. 3.7 Wuchs der SA-Isolate 5/93 auf Xenobiotika [Anzahl Isolate] 140 120 100 80 Gram-Bestimmung nicht bestimmbar Gram positiv Gram negativ 60 40 20 pXy mXy oXy Tol Ant Etb ßHN Nap 3CB Bip 24D 5CS 4CS5CS24D3CBBIPNAPßHNANTETBTOLoXYmXYpXY Anreicherungsmedien 4CS 0 SA SA 3-58 August 1993 Abb. 3.8 Wuchs der SA-Isolate 8/93 auf Xenobiotika Ergebnisse 3.3.3 Physiologische Charakterisierung und Identifikation der Isolate mit BIOLOG Eine Bestimmung der Isolate mit dem BIOLOG-System war nur bei ausreichendem Wuchs der Isolate auf dem verwendeten Standardkomplexmedium NA möglich. Das heißt, daß innerhalb von 24h genügend Zellmaterial zur Beimpfung vorhanden sein mußte. Um entsprechende Menden zu erreichen, wurden bis zu 3 Platten mit dem entsprechenden Stamm beimpft, trotzdem reichte das Inokulum teilweise nicht aus. Isolate die zwei Wochen brauchten um etwa 2 mm große Kolonien zu bilden, konnten in dem 24h-Test nicht die zur Identifizierung notwendigen Reaktionen zeigen. Dies gilt allgemein, insbesondere für oligotrophe und psychrophile Bakterien, und war hier für Isolate des SA-Mediums häufig festzustellen. Im Folgenden werden diese Isolate als nicht-bestimmbar bezeichnet. Clusteranalyse Abb. 3.9 bis Abb. 3.11 zeigen die mit STATISTICA berechneten Dendrogramme für Gram-positive und Gram-negative Isolate. Letztere wurden zu Präsentationszwecken in zwei Graphiken unterteilt. In der Clusteranalyse wurden die Isolate nach ihrem Reaktionsmuster in stoffwechselphysiologische Gruppen (Cluster), d.h. Substrat-Verwertungsgruppen eingeteilt. Identifikationen des BIOLOG-Systems ermöglichten die taxonomische Zuordnung der Cluster. Die Bestimmung der Cluster erfolgte auf dem 35 bis 40%-Dissimilarity-Niveau (DLink.= 1-Similarity). Hiervon ausgehend waren Kerngruppen und übergeordnete Cluster zu unterscheiden. Die BIOLOG-Cluster (BCl ) wurden für die Gram-positiven Isolate mit A-Q (17 Cluster), für die Gram-negativen Isolate mit 1-49 gekennzeichnet. Die Gram-positiven Isolate konnten zumeist nicht identifiziert werden. Das Dendrogramm der Grampositiven Isolate (Abb. 3.9) zeigte Unterteilung in zwei unabhängige Hauptzweige. Der erste Zweig enthielt 54 Isolate die keine Ähnlichkeit zu Taxa in der Datenbank des BIOLOG-Systems zeigten und auf dem 35%-Niveau in die 6 Cluster BCl A-F unterteilt wurde. Die größten Gruppen bildeten BCl C und D (17 bzw. 22 Isolate). Im zweiten Zweig wurden 11 Cluster (BCl G-Q) differenziert, von denen BCl G mit 55 Isolaten den Hauptteil des Zweiges bildete. Weitere 20 Isolate verteilten sich mit ein bis fünf Isolaten auf die BCl H-Q. Die in diesem Zweig vorhandenen Identifikationen beschrieben mit Arcanobacterium haemolyticum, Corynebacterium propinquum, C. pseudodiphteriticum, Aureobacterium saperdae, Micrococcus luteus sowie Cellulomonas-, Curtobacterium- und Rhodococcus-ähnlichen Isolaten überwiegend Taxa mit hohem G+C-Gehalt, die als „Coryneforme Bakterien im weiteren Sinne“ bezeichnet werden. Nur 16% der Reaktionsmuster ähnelten niedrig G+C-haltigen Taxa: Im BCl G wurden 2 Isolate als Brevibacillus brevis identifiziert und 7 weitere als ähnlich beschrieben sowie ein Isolat als Staphylococcus-ähnlich. In BCl H wurden 3 Isolate als Bacillus-ähnliche bestimmt. Die Gram-negativen Isolate differenzierten sich bereits auf dem 80% Dissimilarity-Niveau in 7 unabhängige Hauptzweige, wobei das nicht identifizierbare Isolat SA8-079 einen eigenen Zweig bildete. 3-59 3-60 Ergebnisse ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE N:BRE BRE.BRE BRE.BRE ARC.HAE N:BRE N:BRE N:BRE N:ARC ARC.HAE N:BRE COR.PRP ARC.HAE ARC.HAE ARC.HAE N:BRE N:BRE AUR.SAP AUR.SAP N:AUR N:AUR N:AUR N:ARC N:STA N:ARC N:ARC N:AUR MIC.LUT N:MIC N:ARC N:ARC N:ARC N:BRE N:BAC N:BAC COR.PSD MIC.LUT N:BAC AUR.SAP AUR.SAP N:COR N:COR MIC.DIV N:RHO N:CEL N:CUR A OXY-05B 24D-04B ANT-10B ANT-21B SA5-46_ OXY-15B OXY-07D 24D-15A 24D-13_ 24D-11_ OXY-07B OXY-16A OXY-23B OXY-07A OXY-15D OXY-08B OXY-35A OXY-18B OXY-24B NAP-18A NAP-34_ NAP-31A OXY-11A 24D-03_ NAP-55B 24D-08_ 24D-15B OXY-09F OXY-19B 3CB-54B NAP-28A 4CS-11_ NAP-62_ 3CB-52A OXY-06D 24D-04A 3CB-06_ 3CB-55_ OXY-18D OXY-30A NAP-01_ OXY-34_ ANT-24_ NAP-06_ 3CB-59A ANT-29_ 24D-06_ 3CB-25_ OXY-35B OXY-09D OXY-32A SA8-026 SA8-027 NAP-26A NAP-57_ 24D-01_ 4CS-13_ NAP-38_ NAP-52D OXY-30B NAP-65A 4CS-03_ 4CS-08_ 4CS-05_ OXY-04_ NAP-35_ 3CB-30_ 3CB-34_ 3CB-59B OXY-29A 3CB-52C OXY-31A ANT-09B ANT-31A 3CB-32B NAP-16_ NAP-73_ 3CB-47A NAP-43_ OXY-09A NAP-47A 24D-18_ 3CB-28A OXY-09B OXY-22_ OXY-23C 3CB-27B NAP-24B NAP-55A NAP-28B NAP-31B NAP-46_ 3CB-46A 3CB-54A 4CS-02_ 4CS-04_ NAP-37B NAP-63_ NAP-49_ NAP-67_ 3CB-60_ NAP-26B NAP-36A OXY-02_ OXY-28A OXY-24C NAP-61_ OXY-07E OXY-06A NAP-29_ 3CB-50B SA8-038 OXY-33_ OXY-30D SA8-078 NAP-02_ NAP-23_ OXY-18A OXY-15E OXY-25A OXY-21B OXY-23A OXY-10A SA8-013 SA8-090 SA8-137 SA8-032 ANT-21A OXY-05C B C keine Ähnlichkeit mit Taxa in der Datenbank D E F Brevibacillus Arcanobacterium Aureobacterium G H I Aureobacterium J K L M N O P Q 0 20 40 60 80 Abb. 3.9 BIOLOG-Clusteranalyse: Gram-positive Bakterien (BCl A-Q, 129 Isolate) STATISTICA: Unweighted Pair Group Average, Squared Euclidian Distances [Dlink / Dmax *100] Ergebnisse PSD.NIT PSD.NIT PSD.AZE PSD.NIT PSD.AZE PSD.NIT PSD.NIT PSD.NIT PSD PSD.AZE PSD.AZE PSD.FLB PSD.FLB PSD.FLB PSD.FLB PSD.FLB PSD.FLB PSD.COR PSD.COR PSD.FLB PSD.FLB PSD.FLB PSD.FLB PSD.COR PSD.MGS PSD.MGS PSD.MGS PSD.MGS PSD.MGS PSD.MGS PSD.PUB N:ENT N:XAN STM.MLT STM.MLT N:STM N:STM STM.MLT N:STM STM.MLT STM.MLT STM.MLT XAN.CAM STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT N:STM STM.MLT STM.MLT N:STM STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT N:STM STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT N:STM STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT N:STM N:STM STM.MLT N:STM STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT STM.MLT AER.CAV OCH.ANT OCH.ANT OCH.ANT N:OCH N:OCH CIT.FRE CIT.FRE ENT.TAY ENT.TAY ENT.TAY SER.MAR SER.MAR SER.L/G SER.L/G N:KLB N:KLB N:KLB N:KLB N:KLB CDC II-I N:II-I SPH.THA SPH.THA SPH.THA N:SPH N:SPH N:DF3 N:PAS ANT-10A NAP-22_ NAP-76_ ANT-19_ NAP-59B NAP-30_ NAP-54A NAP-47C NAP-50_ NAP-52B NAP-54B NAP-52A ANT-33_ ANT-15_ ANT-37_ ANT-38_ ANT-39_ ANT-17_ ANT-18_ ANT-25_ ANT-26_ ANT-35_ ANT-36_ ANT-28_ 3CB-27C ANT-12_ ANT-22_ ANT-23_ ANT-34_ OXY-32B NAP-75_ ANT-31B SA8-141 SA8-125 SA8-120 3CB-05_ 3CB-21B 24D-16_ 3CB-32A ANT-04_ ANT-06_ OXY-15A NAP-18B OXY-24D OXY-24E NAP-41_ NAP-27_ 3CB-01_ 3CB-47B NAP-74_ 3CB-18A 3CB-09A NAP-48_ 3CB-16_ 3CB-29_ 3CB-35_ OXY-23D 3CB-45_ NAP-58_ 3CB-44_ OXY-08A 3CB-23_ OXY-11B 3CB-36_ NAP-65B 3CB-02_ OXY-21A 3CB-04_ 3CB-10_ NAP-31C OXY-01_ OXY-28B OXY-19C OXY-26C 3CB-46C NAP-56_ 3CB-21A OXY-05A NAP-70_ 3CB-49B OXY-03B OXY-03D OXY-09C OXY-06B OXY-16B SA8-044 24D-02_ 4CS-11_ ANT-13_ ANT-09A ANT-29_ OXY-07D ANT-05_ ANT-20_ ANT-08_ ANT-16B ANT-11_ ANT-01_ ANT-03_ ANT-02_ NAP-40_ ANT-14_ 3CB-27A NAP-24A NAP-68_ NAP-47B 3CB-15_ OXY-24A OXY-06C OXY-09E 3CB-49A OXY-19A 3CB-37B 3CB-58_ OXY-03A OXY-07C OXY-17E SA8-051 1 P. nitroreducens / P. azelaica 2 Pseudomonas P. fluorescens B / P. corrugata 3 P. marginalis P. putida B 4 5 7 6 8 9 Stenotrophomonas 10 Aeromonas 11 Ochrobactrum 12 13 Enterobacter Citrobacter 14 Enterobakterien Serratia 15 16 Sphingobacterium 17 0 20 40 60 80 Abb. 3.10 BIOLOG-Clusteranalyse: Gram-negative Bakterien, Teil I (BCl 1-17, 118 Isolate) STATISTICA: Unweighted Pair Group Average, Squared Euclidian Distances [Dlink / Dmax *100] 3-61 3-62 Ergebnisse PSD.PSA N:COM N:PSD ACD.DEL ALC.XYL ALC.XYL ALC.XYL ALC.FAE ALC.FAE N:HAL ALC.FAE ALC.FAE ALC.FAE ALC.FAE N:PSY ACN.JOH ACN.JOH ALC.FAE COM.TER COM.TER ACN.JOH ACN.JOH COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES COM.TES ALC.FAE COM.TES COM.TES PSD.SYR ACD.FAC COM.TES COM.ACI COM.ACI N:AQU N:COM N:COM COM.TER N:MET N:ACN N:BRV N:ACN ALC.FAE N:ACN N:ACN ANC.AQU N:VIB COM.TER COM.TER N:IIH N:EF4 N:HAL N:NEI N:BRU KIN.KIN N:BRU MRX MRX.OSL MRX N:BRU N:MRX MRX.BOV MRX.BOV MRX MRX.LIN ACN.RAD N:MRX N:MRX N:MRX N:MRX N:MRX N:MRX N:MRX MRX.ATL MRX.ATL N:LAM MRX.ATL MRX.BOV LAM.HYA ACN.RAD N:PSD PSD.CAR N:BRU N:SHE SHE.PTA SHE.PTA BRV.DIM PSY.IMM PSY.IMM N:BRU PSA.HAL PSA.HAL BRV.VES BRV.VES N:BRU N:PAS N:PSA N:PSA N:PSA PSA.HAL BRV.VES FLA.JOH FLA.JOH FLA.JOH FLA.JOH FLA.JOH FLA.JOH FLA.JOH N:PSA N:XAN N:PSA N:SHE PSA.HAL PSA.HAL PSA.HAL PSA.HAL PSA.HAL CDC.IIH N:IIH CDC.IIH N:IIH 18 20 22 SA8-079 SA8-072 SA8-094 SA8-114 SA8-016 OXY-15C 3CB-46B OXY-30C 3CB-57A NAP-36B NAP-15_ NAP-17A OXY-29C NAP-08_ NAP-33_ NAP-69_ NAP-71_ NAP-13_ SA8-099 SA5-15_ SA5-16_ SA8-063 SA8-126 SA8-039 SA8-106 SA8-130 3CB-07_ 3CB-14_ 3CB-19A 3CB-17_ NAP-05_ NAP-21_ NAP-37A 3CB-50A 3CB-11_ 3CB-22_ NAP-53_ 3CB-33_ NAP-03_ NAP-42_ NAP-52C NAP-11A NAP-25_ 3CB-26_ NAP-10_ 3CB-28B NAP-19_ SA8-015 NAP-11B 3CB-09B NAP-39_ NAP-59A SA8-022 ANT-07_ OXY-17B OXY-17D SA8-071 SA5-29B SA5-37B SA5-48_ SA5-42_ SA5-37A SA5-47_ SA8-069 SA8-089 SA8-096 SA8-137 SA8-032 SA5-04_ SA5-28_ SA8-041 SA8-047 SA8-129 SA5-12_ SA8-070 SA8-102 SA5-32_ OXY-03C OXY-17A SA5-13_ SA8-052 SA5-23_ SA5-24_ SA8-011 SA5-34_ SA8-080 SA8-083 SA8-045 SA8-018 SA8-040 SA5-26_ SA5-40_ SA5-35_ SA5-02_ SA5-05_ SA5-07_ SA5-10_ SA5-08_ SA5-14_ SA5-09_ SA5-06_ SA5-31_ SA5-41_ SA5-20_ SA5-45_ SA5-17A SA5-22_ SA5-36_ SA5-38_ SA5-50_ SA8-014 SA8-086 SA8-088 ANT-16A SA5-01_ SA5-27_ SA8-104 3CB-52B NAP-09_ NAP-45_ SA8-020 NAP-12_ NAP-14_ SA8-008 SA8-024 SA8-068 SA8-131 SA8-029 SA8-030 SA8-043 SA8-055 SA8-127 OXY-10B OXY-17C OXY-25C OXY-20_ OXY-21C OXY-26A OXY-18C 3CB-08A 3CB-19C 3CB-20_ 3CB-24_ 3CB-31_ 3CB-59C OXY-19D OXY-29B NAP-17B NAP-51_ SA5-11_ SA5-17B SA5-30_ SA5-33_ 19 21 23 24 25 26 Pseudomonas Acidovorax Alcaligenes 27 Acinetobacter 28 29 30 Comamonas 31 34 35 36 37 32 33 Alcaligenes Ancylobacter Comamonas 38 39 40 Kingella Moraxella 41 Pseudomonas / Shewanella 42 Brevundimonas / Psychrobacter 43 Brevundimonas / Pseudoalteromonas 44 45 46 Flavobacterium 47 48 49 0 20 40 Pseudoalteromonas CDC Gruppe IIh 60 80 Abb. 3.11 BIOLOG-Clusteranalyse: Gram-negative Bakterien, Teil II (BCl 18-49, 153 Isolate) STATISTICA: Unweighted Pair Group Average, Squared Euclidian Distances [Dlink / Dmax *100] Ergebnisse Das Dendrogramm Teil I (Abb. 3.10) zeigte zwei der Zweige mit klar umrissenen Clustern. Der erste Zweig mit BCl 1-15 umfaßte die deutlich zu unterscheidenden Gruppen der γ-Proteobakterien (Pseudomonas, Aeromonas, Enterobakterien), β/γ-Proteobakterien (Stenotrophomonas, Xanthomonas; nehmen phylogenetisch eine Übergangsposition zu den β-Proteobakterien ein) und α-Proteobakterien (Ochrobactrum), insgesamt über 100 Isolate. Der zweite Hauptzweig charakterisierte ein distinktes Cluster mit α-Proteobakterien (Sphingobacterium). Dendrogramm Teil II (Abb. 3.11) wies drei weiteren Hauptzweigen 6 Isolate zu, die bereits auf dem 50%-Niveau Einzelcluster bildeten (BCl 18-23) und nur zwei Identifikationen für Pseudomonas pseudoalcaligenes (γ-Proteobakterien) und Acidovorax delafieldii (β-Proteobakterien) umfaßten. Die zwei weiteren Hauptzweige bildeten heterogene Cluster: Mehr als 100 Isolate in BCl 24-42 entsprachen β- / γ-Proteobakterien-Gruppen. In den BCl 43-49 bildeten die Bakterien der Cytophaga-Flavobakterien-Gruppe ein eindeutiges Cluster mit geringer Varianz zwischen Pseudoalteromonas und Brevundimonas (γ- / α-Proteobakterien). Aktivität Neben der Similarity (bzw. Dissimilarity) war die „Aktivität“ der Isolate im Testsystem ein Kriterium bei der Clusterdefinition und Identifikation. Nach Dott & Trampisch [1983] wird die „Aktivität“ als Prozentzahl positiver Reaktionen definiert. „Borderline“-Reaktionen, d.h. Grenzfälle schwacher Reaktionen die nicht eindeutig als positiv zu bestimmen waren, wurden mit 0,5 gewichtet. Aktivitä t % =: ∑ positive Tests + 12 ∑ borderline Tests x100 ∑ Tests Die Aktivität entsprach bei 95 verschiedenen Substraten im Testsystem näherungsweise der Anzahl positiver Tests. Sowohl Isolate, die in weniger als 20% der Tests positive Reaktion zeigten, als auch Isolate die in mehr als 80% der Tests positive Reaktion zeigten, waren kritisch zu betrachten. Sie konnten taxonomisch nicht gut differenziert werden, da sie außerhalb des annehmbaren Differenzierungsbereichs des Testsystems lagen. Die beobachteten Aktivitäten wurden in Abb. 3.12 als „Scatterplot“ (Streudiagramm) der Häufigkeiten pro Cluster dargestellt. Die Scatterplots verdeutlichten die Korrelation zwischen Aktivität und Zuordnung der Isolate in die bestimmten Cluster. Der Scatterplot der Gram-positiven Isolate zeigte, daß die Isolate ohne Ähnlichkeit mit Taxa in der BIOLOG-Datenbank (BCl A-F, erster Hauptzweig) Aktivitäten von >40 bis maximal 92% aufwiesen. Damit lagen sie zumeist in einem Bereich der guter bis sehr guter Differenzierung in einem Testsystem entspricht. Das BIOLOG-System war für das Screening der unbekannten Stämme daher sehr gut geeignet. 3-63 Ergebnisse BIOLOG: Gram positive Bakterien (Cluster A-Q, 129 Isolate) STATISTICA Frequency Scatter Plot Aktivität [Npositive Tests + 0.5x Nvariable Tests] 100 80 60 40 20 1x 2x 3x 4x 0 A B C D E F G H I J K L M N O P Q Mittelwert Cluster BIOLOG: Gram negative Bakterien (Cluster 1-49, 271 Isolate) STATISTICA Frequency Scatter Plot 100 Aktivität [Npositive Tests + 0.5x Nvariable Tests] 3-64 80 60 40 20 1x 2x 3x 4x 5x 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 Mittelwert Cluster Abb. 3.12 Aktivität der Gram-positiven und -negativen Isolate im BIOLOG-System Aufgrund der sehr hohen Aktivität waren BCl B und (teilweise) C sowie aufgrund geringer Aktivität etwa die Hälfte der Isolate in BCl G, in H und N als gering differenzierbar einzustufen. Dies bestätigte die Verteilung der einzelnen Arcanobacterium- und Brevibacillus-Identifikationen auf verschiedene Zweige im Cluster G sowie die hohe Rate nicht identifizierter Isolate mit relativ hoher Similarity zu den Gattungen Arcanobacterium, Aureobacterium, Brevibacillus (im Dendrogramm gekennzeichnet mit N:). Ergebnisse Der Scatterplot der Gram-negativen Bakterien (Abb. 3.12, unten) zeigte eine deutliche Trennung nach Reaktivität. Der erste Hauptzweig (BCl 1-15, Dendrogramm Gram-negative Teil I) umfaßte Cluster mit durchschnittlich 40-80 % Aktivität und höchster Identifikationsrate, die nächsten 6 Hauptzweige (BCl 1649, Gram-negative Teil I, II) zeigten durchschnittlich nur 10-40 % Aktivität. Die Enterobakterien in den BCl 14-15 (Gram-negative, Teil I) waren aufgrund der hohen Aktivität schlecht differenzierbar; hierauf wurde auch vom Hersteller extra hingewiesen (speziell für Klebsiella und Serratia). Aufgrund der geringen Aktivität von im Mittel 10% waren insbesondere die Identifikationen in BCl 41 kritisch zu beurteilen. Im Dendrogramm fiel die Heterogenität des Clusters anhand der Identifikationen für α-, β- und γ-Proteobakterien auf. Auch hier wurde vom Hersteller kritisch auf die Identifikation schwach-reaktiver Bakterien als Moraxella und Brucella hingewiesen. Gleiches galt für das BCl 42 mit den Identifikationen Psychrobacter immobilis und Brevundimonas diminuta. Die Aktivitäten im BIOLOG-System zeigten deutliche Unterschiede in der Testdurchführbarkeit zwischen Gram-negativen und Gram-positiven Isolaten aber auch dem Isolationsmedium. Allgemein waren Isolate von Xenobiotika-Medien unter Laborbedingungen auf dem Standardkomplexmedium NA rasch wüchsig und konnten dem Substratverwertungstest unterworfen werden. Im Test zeigten sie Aktivitäten von 40% bis >90%. SA-Isolate waren dagegen aufgrund des geringen Wuchses zu einem relativ hohen Prozensatz nicht-testbar (nicht bestimmbar) und von den testbaren zeigte ein hoher Prozentsatz im BIOLOG-System Aktivitäten von <20 bis 40%. Identifikationen In der Tab. 3.3 und Tab. 3.4 sind die Ergebnisse der Clusteranalyse, die Identifikationen und Clusterzuordnungen zusammengestellt, sowie die phylogenetische Zuordnung der bestimmten Taxa. Die Nomenklatur wurde weitestgehend der momentanen Taxonomie angepaßt (entsprechend International Journal of Systematic Bacteriology, Systematic and Applied Microbiology [1997]). Für die Annahme der BIOLOG-Identifikation war nicht allein das Erreichen der vom Testsystem vorgeschriebenen Similarity-Werte (>0.5 bei 24h Inkubation) und der Ativitätsbereich (ca. 20-85%) entscheidend. Bei umfangreicher Untersuchung von Isolaten konnte die Clusteranalyse der Reaktionsmuster die Güte der Identifikation aufzeigen: Die erkennbaren Cluster (Gruppen) sollten die identifizierten Taxa auf bestimmtem Niveau einheitlich darstellen. Bei bekannter Nicht-Differenzierbarkeit taxonomischer Einheiten oder auch Unterscheidung von Stämmen war eine entsprechende Gruppen- oder Stammidentifikation in der Datenbank enthalten (z.B. Gruppenidentifikation für Bacillus cereus / thuringiensis, Unterscheidung von Alcaligenes faecalis Typ I und II). Abhängig von der taxonomischen Gruppe waren Unterschiede in der Differenzierung auf Art- oder Gattungsniveau zu berücksichtigen. Dabei spielten auch die bislang unterschiedlichen Definitionen der Taxa in den verschiedenen Bakteriengruppen eine Rolle. 3-65 3-66 Ergebnisse Tab. 3.3 Identifikation Gram-negativer Isolate mit dem BIOLOG-System (vergleiche Dendrogramm Abb. 3.10, Abb. 3.11) Mai BIOLOG 24h-Identifikation [Phänon] SA nb [nb] 6 N [2,4-9,11,12,15-19,21,22,26-28,31-35,37-44,47,49] 25 Pseudomonas [1,3] Pseudomonas azelaica [1] Pseudomonas nitroreducens [1] Pseudomonas corrugata [3] Pseudomonas fluorescens B [3] Pseudomonas marginalis [3] Stenotrophomonas maltophilia [9] Xanthomonas campestris pv. strelitzia [9] Aeromonas caviae [10] Ochrobactrum anthropi [11] Citrobacter freundii [13] Enterobacter taylorae [14] Serratia liquefaciens / grimesii [15] Serratia marcescens [15] CDC II-i [16] Sphingobacterium thalpophilum [16] Pseudomonas pseudoalcaligenes [20] Acidovorax delafieldii [23] Alcaligenes xylosoxidans ss xylosoxidans [24] Alcaligenes faecalis Type II [25-27,29,30,34] Acinetobacter johnsonii / genosp.7 [28,29] 2 Comamonas terrigena [29,32,37] 1 Acidovorax facilis [30] Comamonas acidovorans [30] Comamonas testosteroni [30] Pseudomonas syringae pv. citrulli [30] Ancylobacter aquaticus [36] Acinetobacter radioresistens [41] 2 Brucella abortus [41] 1 Kingella kingae [41] Lampropedia hyalina [41] 1 Moraxella [41] Moraxella atlantae [41] 3 Moraxella bovis [41] 1 Moraxella lincolnii [41] Moraxella osloensis [41] 1 Pseudomonas carboxydohydrogena [41] 1 Shewanella putrefaciens A [41] Brevundimonas diminuta [42] Psychrobacter immobilis3 [42] 2 Pseudoalteromonas haloplanktis [43-45,47] Brevundimonas vesicularis [43,45] Flavobacterium johnsonae [46] CDC IIh [48, 49] 2 SUMME Gram-negative Isolate: 48 Legende siehe Tab. 3.4 August SA 24D 3CB 4CS Ant Nap oXy 43 1 1 2 26 15 5 10 11 1 1 1 4 2 4 1 2 9 5 1 1 13 8 14 1 1 1 1 1 2 3 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 2 7 2 4 1 2 1 11 1 12 1 1 4 1 1 2 1 1 2 93 1 2 47 3 1 1 36 53 ∑ 53 92 3 4 6 3 9 6 36 1 1 3 2 3 2 2 1 3 1 1 3 9 4 5 1 2 25 1 1 2 1 1 1 1 4 3 2 1 1 1 2 1 2 2 7 3 7 7 2 44 324 BG gP ?gP2 ?gP2 gP bP/gP gP aP gP gP gP aP gP bP bP bP gP bP bP gP aP gP aP bP gP aP gP aP gP gP aP CYF CYF Ergebnisse Tab. 3.4 Identifikation Gram-negativer Isolate mit dem BIOLOG-System (vergleiche Dendrogramm Abb. 3.9) Mai BIOLOG 24h-Identifikation [Phänon] nb [nb] N [A-Q] Arcanobacterium haemolyticum [G] Brevibacillus brevis [G] Corynebacterium propinquum1 [G] Aureobacterium saperdae [G,I] Micrococcus luteus [G,H] Corynebacterium pseudodiphteriticum1 [H] Micrococcus diversus [N] SUMME Gram-positive Isolate: August SA SA 24D 3CB 4CS Ant Nap oXy 1 12 7 9 2 6 14 2 2 2 3 4 7 1 25 4 1 3 3 36 4 1 2 1 1 1 20 11 24 9 7 34 47 ∑ 24 102 16 2 1 4 2 1 1 BG hGC nGC hGC hGC hGC hGC 153 Legende (Tab. 3.3, Tab. 3.4): ∑ [] BG Summe der Isolate nb nicht bestimmbar BIOLOG-Cluster (BCl) N nicht identifiziert Phylogenetische Hauptgruppen der identifizierten Taxa: Gram positiv, hoch / niedrig G+C (hGC / nGC), α-, β-, γ- Proteobakterien (aP, bP, gP), Xanthomonas-Gruppe (bP / gP: Übergang von β- zu γ-Proteobakterien nach Kersters et al. [1996]), Cytophaga-Flavobakterien-Bakteroides-Gruppe (CYF) CDC für klinische Isolate definierte Gruppen des Center for Disease Control, Atlanta, Georgia 1 Synonym für CDC ANF 3; phylogenetisch nahe verwandt mit C. pseudodiphtericum 2 phylogenetische Zuordnung unklar (Kersters et al. [1996]) 3 Synonym für Psychrobacter immobilis: „Moraxella-ähnliche Psychotrophe“ Die Analyse der Ergebnisse erfolgte unter Berücksichtigung der Aktivitäten in den Scatterplots, der Cluster, der angenommenen Identifikationen und auch dem Vorkommen der bestimmten Taxa. Die Ergebnisse wurden im Folgenden nach den Hauptgruppen 1) der Gram-positiven und 2) der Gram-negativen Bakterien gegliedert und die benannten Taxa detailliert besprochen. Gram-negative Isolate Die mit Xenobiotika isolierten Pseudomonaden bildeten mit BCl 1-4 eine eindeutige Gruppe im Dendrogramm, Teil I (Abb. 3.10). Ein Pseudomonas pseudoalcaligenes identifiziertes SA-Isolat bildete ein einzelnes Cluster (BCl 20). Die Pseudomonaden (i.e.S., γ-Proteobakterien) werden ubiquitär isoliert und aufgrund ihrer metabolischen Vielseitigkeit für biotechnologische Zwecke, Biodegradation angereichert. In Hinblick auf die allgemein hervorgehobene Bedeutung und Vorkommen der Pseudomonaden, insbesondere von P. fluorescens, wurden sie hier nur in geringer Zahl durch selektive Anreicherung mit Xenobiotika detektiert. Pseudomonas nitroreducens / azelaica und Pseudomonas fluorescens B / corrugata wurden hier als nicht trennbare Arten zusammengefaßt. Die Zweifelhaftigkeit der eigenständigen Artbenennung zeigte eine Reanalyse der Daten mit der BIOLOG GN Upgrade Version 3.50, bei der die Vertreter 3-67 3-68 Ergebnisse der Gruppen umgekehrte Identifikationen aufwiesen. Einige der P. fluorescens B / corrugata-Isolate wurden danach als P. marginalis (synonym für P. fluorescens) identifiziert. Bochner [1990] wies bei der Entwicklung des BIOLOG-Systems auf die starke Korrelation der Arten und der P. fluorescens B / corrugata-Gruppe mit Pseudomonas marginalis und Pseudomonas fluorescens A hin. P. fluorescens wird außerdem als eine in sich heterogene Art beschrieben und nach verschiedenen taxonomischen Kriterien in Biovare, Unterarten oder Biotypen unterteilt, die zum Teil den Kriterien eigenständiger Arten entsprechen (Balows et al. [1992]). Eindeutig wurde die Stenotrophomonas-Gruppe (β/γ-Proteobakterien) in BCl 9 definiert. Stenotrophomonas maltophilia-Identifikationen, eine einzelne Identifikation für Xanthomonas campestris und nicht identifizierte Isolate mit hoher Similarity zu Stenotrophomonas bestimmten das Cluster. Da Stenotrophomonas die bisher einzige bekannte nicht pflanzenpathoge Gattung der phänotypisch und phylogenetisch engen Xanthomonas / Stenotrophomonas-Gruppe ist, wurde die Gattungsidentifikation des Clusters angenommen (Vandamme et al. [1996]). Die BCl 13-15 umfaßten Vertreter der Enterobacteriaceae (γ-Proteobakterien), die ausschließlich mit Xenobiotika selektioniert wurden. Die BIOLOG-Bestimmung der Fäkalbakterien Citrobacter freundii [BCl 13], humanpathogener Enterobacter taylorae [BCl 14] und Klebsiella-ähnlicher Isolate [BCl 15], war in Hinblick auf die Einleitung kommunaler Abwässer in die Spittelwasser durchaus möglich und bedenklich (gleiches gilt für Shewanella putrefaciens [BCl 41]), für klinische Diagnostik war das System jedoch nicht zugelassen. Da taxonomische Studien der Enterobakteriaceae fast ausschließlich an Isolaten von Menschen durchgeführt wurden, ist nicht sicher ob die benannten Umweltstämme (Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter) den etablierten Arten angehören oder neue Taxa repräsentieren (Balows et al. [1992]). Von daher ist ein Vorkommen der Arten taxonomisch abzusichern. Die normalerweise zu erwartenden Arten, z.B. die in Boden und Gewässer weitverbreiteten Proteus vulgaris Enterobacter aerogenes, Klebsiella spp. oder auch Escherichia coli als Indikation für fäkale Verunreinigung (Balows et al. [1992], Schlegel [1981]), konnten hier nicht nachgewiesen werden. Stämme in BCl 15 zeigten nach 24h über 80% Aktivität und falsch-positive Kontrollen. Die Identifikation als Klebsiella pneumoniae wurde daher verworfen. Die Stämme wurden im Dendrogramm entsprechend als Nicht-identifiziert, stoffwechselphysiologisch Klebsiella-ähnlich (N:Klb) gekennzeichnet. Da die meisten Klebsiella, einige Enterobacter, Serratia und Salmonella-Stämme eine Polysaccaridkapsel absondern die als Kohlenstoffquelle wiederverwendet werden kann, kam es zu „falsch positiver Reaktion“ in den Testplatten, auch der Substrat freien Kontrolle. Die vom Hersteller empfohlene Verdünnung der Zellsuspension und Auswertung nach bereits 4-6h Inkubation ermöglichte keine Identifikation. Darüberhinaus wird die Identität von K. pneumoniae in Umweltproben allgemein angezweifelt (Balows et al. [1992]). Ergebnisse In einem Subcluster des BCl 15 wurden Anthracen- und Naphthalin-Isolate als die in Flüßen häufig nachgewiesenen Arten Serratia marcescens und S. liquefaciens / grimesii identifiziert. Die Fähigkeit von Serratia mit Aromaten zu wachsen und die Fähigkeit von S marcescens organisches Eisen zu mineralisieren, sprach bei der großen Menge Eisenocker in der Spittelwasser für das Vorkommen der Arten. Die hier identifizierten Isolate (S.mar: Ant-01, Ant-03 , S.liq/gri: Ant-02, Nap-40; BCl 15) entsprachen dem auf NA beschriebenen weiß-opaquen Kolonietyp (Balows et al. [1992]). Ein einzelnes Isolat, identifiziert als Aeromonas caviae, bildete BCl 10. Die weite Verbreitung der Gattung und das Vorherrschen der Art in mit Abwasser belasteten Gewässern (Balows et al. [1992], Ramteke et al [1993]) unterstützten die Annahme der Identifikation. Bei Einmaligkeit der Identifikation war kein größeres Vorkommen vor Ort anzunehmen. Für die Einer-Cluster BCl 4-8, 12 waren keine Identifikationen möglich. Da sie weniger als 50% Übereinstimmung zu den nächsten benannten Gruppen zeigten, waren der Clusteranalyse keine Informationen zur Taxonomie dieser Stämme zu entnehmen. BCl 16 und 17 bildeten einen eigenen Hauptzweig und entsprachen mit relativ geringer Aktivität (im Schnitt 28%) bereits den Isolaten im zweiten Teil der Clusteranalyse (Dendrogramm Teil II, Abb. 3.11). BCl 16 wurden α-Proteobakterien zugeordnet. Sphingobacterium thalpophilum (ehemals Flavobacterium t.), Sphingobacterium- und CDC IIi-ähnliche Isolate (CDC Gruppe IIi, „Flavobacterium“, Center for Disease Control, USA) ließen die Gattungsidentifikation für dieses Cluster annehmen. Gelb-pigmentierte Kolonien und allgemeine Isolierung aus Frischwasser (Balows et al. [1992]) stützten die Identifikation von S. thalpophilum. Aufgrund der Zuordnung zum distinkten zweiten Hauptzweig wurde für die 3 nicht identifizierten Isolate in BCl 17 ebenfalls Zugehörigkeit zu den α-Proteobakterien angenommen. Weitere α-Proteobakterien mit >60% Aktivität wurden in BCl 11 als Ochrobactrum anthropi (ehemals CDC Gruppe Vd) bestimmt, eine primär klinisch isolierte Art (Holmes et al. [1988]). Hier galt, wie für die Enterobacteriaceae, die Artbenennung als fraglich. Nach dem Reaktionsmuster gruppiert die Art als nächstes mit weiteren pflanzen- und bodenbürtige Arten (Phyllobacterium, Agrobacterium; Bochner [1990]). Ochrobactrum wird inzwischen auch in nährstoffreicher Umgebung, z.B. an Wurzeloberflächen, bestimmt. Die relative Vielseitigkeit bezüglich der Nährstoffquellen könnte flexible Anpassung an wechselnde Belastungen (Chargenbetrieb) und gute Wuchsbedingungen im Spittelwassersediment bedeuten. Die α-Proteobakterienarten Brevundimonas diminuta und B. vesicularis wiesen ebenfalls <40% Aktivität auf, wurden aber im zweiten Teil des Dendrogramms dem 6. und 7. Hauptzweig der Gram-negativen Bakterien zugeordnet (BCl 42, bzw. BCl 43, 45). Drei der vier identifizierten Stämme bildeten mit weniger als 40% Differenz keine eigenen Cluster, das heißt sie waren nicht eindeutig differenzierbar. Der zweite Teil des Dendrogramms Gram-negativer Isolate (Abb. 3.11) enthielt überwiegend heterogene Cluster geringen Umfangs, häufig ohne Identifikationen im Cluster. Verschiedene Identifikationen traten 3-69 3-70 Ergebnisse in mehreren, mehr oder weniger differenten Clustern auf. Bedingt durch die geringe Aktivität wurden Arten selbst verschiedener Superfamilien (α-, β-, β/γ-, γ-Proteobakterien) vereint. Die BCl 24-27 bildeten die Kerngruppe der saprophytischen, in Boden und Wasser weitverbreiteten Gattung Alcaligenes (A. xylosoxidans, A. faecalis; β-Proteobakterien). Einzelne Alcaligenes faecalis-Identifikationen verteilten sich auf insgesamt 6 weitere Cluster geringerer Aktivität. Unter Berücksichtigung der Zweidimensionalität der Darstellung (BCl 34), der relativ geringen Aktivität (BCl 29, 30) und Variabilität des Wuchsverhaltens unter Laborbedingungen waren atypische Varianten zu vermuten. Da aufgrund schwacher Definition der Gattung Alcaligenes und Abwesenheit spezifischer physiologischer oder biochemischer Charakteristika eine verläßliche Identifikation nur mit chemotaxonomischen und phylogenetischen Methoden möglich ist (Balows et al. [1992]), waren die Bestimmungen weiter zu untersuchen. In der Clusteranalyse wurden zwei Acinetobacter-Arten (γ-Proteobakterien) unterschieden. Zwei Acinetobacter radioresistens-Isolate mit geringer Aktivität waren innerhalb des BCl 41 zu differenzieren, A. johnsonii gsp.7 wurde distinkten Clustern zugeordnet (BCl 28, 29, ähnliche Isolate in BCl 34, 35). Die Charakterisierung der Arten im Substratverwertungstest von Kämpfer et al. [1993] bestätigte recht variables Verhalten und schlechteste Ergebnisse (bzgl. Differenzierbarkeit, Homogenität, Reaktivität) für A. johnsonii-Referenzstämme, A. radioresistens war dagegen in sich homogen und anhand von acht „Schlüsselreaktionen“ deutlich differenzierbar. Aufgrund phänotypischer und genotypischer Diversität der nicht hinlänglich definierten Gattung Acinetobacter (DNA-DNA-Hybridisierung unterscheidet 12 Genospecies, zum Teil auf Gattungsniveau; Bouvet & Grimont [1986]; Van Landschoot et al. [1986]) sollte die Gattung genetisch näher beschrieben werden. Die Anzahl der Isolate erschien gering und die alleinige Anreicherung mit SA überraschend in Hinsicht auf die beschriebenen Eigenschaften der Gattung. Acinetobacter nutzt eine Vielzahl organischer Substanzen als einzige C- und Energiequelle, kann ein breites Spektrum an Aromaten und sonstigen Kohlenwasserstoffen abbauen, ist anspruchslos, ubiquitär in Boden, Wasser und Abwasser (Balows et al. [1992]), das Spittelwasser sollte der Gattung daher eigentlich gute Wachstumsmöglichkeiten bieten. Die allgemein aus Boden, Schlamm und Wasser natürlicher oder industrieller Standorte isolierte Gattung Comamonas (β-Proteobakterien) wurde mit den drei Arten Comamonas testosteroni, C. acidovorans (differenzierbar in BCl 30) und C. terrigena (BCl 29, 32, 37) nachgewiesen. Einzelne Identifikationen für Alcaligenes faecalis, Acidovorax facilis und Pseudomonas syringae im Übergangsbereich der beiden Arten in BCl 30 sollten näher untersucht werden. In der BIOLOG-Datenbank waren z.B. der mit Acidovorax sehr nahe verwandte Rubrivivax gelatinosus-Leptothrix-rRNA-Zweig (De Ley [1992]) und die Gattung Xylophilus nicht vertreten. Die Zuordnung der Comamonas terrigena-identifizierten SA-Isolate zu drei verschiedenen Clustern (BCl 29, 32, 37) war fraglich. Zwar sind 3 DNA-Hybridisierungsgruppen der Art bekannt, aber diese sind phänotypisch nicht zu unterscheiden (Vandamme et al. [1996]). Comamonas gehört zur phylogenetisch engen, aber physiologisch sehr heterogenen „Acidovorans rRNAGruppe“ (Vandamme et al. [1996], Balows et al. [1992]: womöglich eine eigene Familie). Unvollstän- Ergebnisse dige Beschreibungen und fehlende Originalkulturen bedingten eine „turbulente Geschichte der Nomenklatur“ der Gattung Comamonas (Balows et al. [1992]). Bei zahlreicher Bestimmung mit SA und Xenobiotika-Medien war daher die genetische Analyse dieser Verwandtschaftsgruppe zur Beschreibung der Spittelwasserpopulation von Bedeutung. Pseudoalteromonas haloplanktis (synonym Alteromonas h., A. tetradonis; γ-Proteobakterien) bildete eine Kerngruppe in BCl 47, trat aber auch vereinzelt mit Brevundimonas diminuta (α-Proteobakterien) in BCl 43 und als einzige Identifikation in BCl 44 auf. Derartig heterogen über die Cluster verteilte Identifikationen wurden grundsätzlich kritisch betrachtet. Da die Gattung außerdem als mehr oder weniger halophil und marin beschrieben wird, war die Identifikation hier auszuschließen. Vom Vorkommen her möglich wäre dagegen Shewanella putrefaciens (ehemals Alteromonas) die in der BIOLOG-Clusteranalyse Pseudoalteromonas haloplanktis sehr nahe benachbart sind (Bochner [1990]). Die Fehldiagnose einer Variante oder anderen Art dieser Gattung wurde in Betracht gezogen. Die Verteilung der Identifikationen in der Clusteranalyse wies auf mindestens zwei verschiedene Arten oder Gattungen hin (Shewanella oder Pseudoalteromonas). Die in Boden und Wasser weitverbreiten Shewanella putrefaciens (synonym Pseudomonas p.) wurden mit <20% Aktivität in BCl 41 bestimmt. Die charakteristische Koloniemorphologie bestätigte die Identifikation nicht: Shewanella können in peptonhaltigen Medien Hydrogensulfid produzieren, das die Kolonien schwarz färbt. Hier wurde nur weiße bzw. gelbe Färbung auf NA nachgewiesen (dunkle Färbung wurde nur bei älteren Kolonien von Stenotrophomonas und -ähnlichen Isolaten in Cluster 9 beobachtet). Umfangreiche genetische Analysen der ehemaligen „Alteromonas“-Gruppe (i.w.S.) stehen bislang leider noch aus, z.B. fehlt noch die genetische Zuordnung der neu definierten Arten Alteromonas denitrificans und A. colwelliana (De Ley [1992]). Die 36 Stämme des BCl 41 und 3 Stämme des BCl 42 zeigten mit <20% nur sehr geringe Aktivität (siehe Scattterplot, Abb. 3.12) und waren bei unspezifischer Anzucht allgemein nicht eindeutig zu identifizieren. Die 22 Identifikationen (für etwa jedes zweite Isolat im Cluster) kennzeichneten die Heterogenität dieser Cluster: Überwiegend wurden zwar γ-Proteobakterien bestimmt, Moraxellaceae (Acinetobacter, Moraxella, Psychrobacter) und Lampropedia, zum Teil aber auch α- und β-Proteobakterien. Allgemein bilden Moraxella, Neisseria (γ-Proteobakterien) und Kingella β-Proteobakterien) im Substratverwertungstest eine enge phänotypische Gruppe, da sie nicht sehr viele Kohlenstoffquellen nutzen (unter anderem Grund für den Zusammenschluß zur Familie Neisseriaceae, De Ley [1992]). In diesem Sinne ähneln sie auch einigen Acinetobacter-Stämmen (Bochner [1990]). Nach der bisherigen taxonomischen Beschreibung ist das Vorkommen der saprophytischen Gattung Acinetobacter am wahrscheinlichsten. Die Identifikation der Gattungen Moraxella und Neisseria im Spittelwassersediment war nach der allgemeinen Beschreibung der Taxa nicht möglich: Beide sind von Warmblütern zu isolieren, bevorzugen in der Kultur relativ reiche Medien und wachsen nur spärlich bei Raumtemperatur (Henriksen [1976]). Hinweise auf ein Vorkommen von Moraxella in der Umwelt werden zumeist auf unpräzise Identifizierung, aufgrund fehlender adäquater Merkmale, zurückgeführt. Da die Gattungen physiologisch und im 3-71 3-72 Ergebnisse Antibiotika-Test nicht zu trennen waren, wurde jedoch unter der Annahme bislang nicht beschriebene Arten die Gattungsgruppe Acinetobacter-Moraxella für Denitrifikanten in Böden, Gewässern und Kläranlagen definiert (Schmider & Ottow [1981], Schmider [1985]). Aufgrund der näheren Verwandtschaft wurde auch eine Zusammenfassung von Acinetobacter und Moraxella in einer neuen Familie überlegt (Balows et al. [1992]). Zwei als Neisseria-ähnlich bestimmte Isolate im BCl 39 (N:EF4: ähnlich CDC Gruppe EF4) und ein einzelnes Isolat in BCl 40 (N:Nei) wiesen auf Abtrennung unterschiedlicher Arten hin. Kingella kingae bildete mit Brucella-ähnlichen Stämmen (N: Bru) auf dem 18%-Niveau eine Untergruppe des BCl 41. Allgemein wird Kingella als Schleimhautparasit beschrieben (Murray et al. [1984]) und war daher hier nicht isolierbar, die Isolate könnten aber den von Schmider [1985] als Denitrifikanten beschriebenen Arten entsprechen. Der Nachweis der saprophytischen, im eutrophen Teich dominant bestimmten Art Lampropedia hyalina (Pelczar et al. [1986], Campbell [1980]) und eines Psychrobacter immobilis-Isolats in BCl 41 (Luftkontaminant, ansonsten von Fischen und biologischem Material zu isolieren; Balows et al. [1992]) war dagegen aufgrund des Vorkommens grundsätzlich möglich. Sechs Brucella abortus-ähnliche Isolate (N: Bru) wurden in BCl 41-43 bestimmt. Aufgrund der extrem geringen Aktivität war die Zuordnung sehr fraglich. Nach Bochner [1990] charakterisiert der BIOLOGTest Ancylobacter aquaticus (hier: BCl 36) und Methylobacterium (hier ein ähnliches Isolat in BCl 32) als nächst verwandte Taxa. Die Clusteranalyse der Isolate vereinte diese Taxa jedoch mit weniger als 30% Übereinstimmung, was gegen die Annahme der ähnlichen Identifikationen sprach. Brucella abortus ist eine fakultativ human und tierpathogene Art und ein mögliches Vorkommen bedenklich. Nach der rRNA-Analyse ist Brucella nahe verwandt mit der Gattung Ochrobactrum (De Ley [1992], Balows et al. [1992]). Hier wurden die beiden Gattungen, bzw. ähnliche Isolate, entsprechend der Aktivitätsunterschiede verschiedenen Hauptzweigen des Gram-Negativen Dendrogramms zugeordnet (Och.ant, N:Och in BCl 11). Möglicherweise wurden hier jedoch neue Arten oder Gattungen dieses Zweiges bestimmt. Die Isolate der BCl 46 (Flavobacterium johnsoniae), BCl 48 und BCl 49 (CDC-Gruppe IIh, Center for Clinical Disease Control, USA) vertraten die Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe (Balows et al. [1992]). Flavobacterium johnsoniae (ehemals Cytophaga j.) wurde als aerober Degradierer, Cellulose-abbauendes Boden- und Wasserbakterium für das Spittelwassersediment als bedeutend angenommen. Das klar umrissene Art-Cluster umfaßte allerdings nur o-Xylol-selektionierte Stämme. Die CDC IIh-identifizierten SA-Isolate waren aufgrund der Beschreibung der klinischen Gruppe CDC IIh, der in der BIOLOG-Analyse von Bochner [1990] beschrieben Verwandtschaft mit Empedobacter breve (ehemals Flavobacterium b.) und Umstrukturierung innerhalb der Flavobakteriengruppe (Bernadet et al. [1996]) als „nicht näher bestimmt“ anzunehmen. Obwohl die Isolierung mit SA derart langsam wachsende Taxa erfassen sollte, war die als typisch in Wasser beschriebene Gattung Flavobacterium i.w.S. (Reichenbach & Weeks [1981]) als solche hier unterrepräsentiert. Ergebnisse Gram-positive Isolate Ein hoher Prozentsatz der Gram-positiven Isolate zeigte klare Reaktionsmuster ohne jegliche Ähnlichkeit zu Taxa in der BIOLOG-Datenbank. Diese 54 Isolate konnten anhand der Reaktionsmuster in die BCl A bis F unterteilt werden. Auffällig war in BCl C und E die vorherrschend weiße Färbung der Kolonien auf NA, Kolonien des BCl D zeigten weiße und gelbe Färbung. Die Identifikationen in BCl G-Q entsprachen nahezu ausschließlich 5 Gattungen mit hohem G+C-Gehalt, die gemeinhin als „Coryneforme“ bezeichnet wurden7. Charakteristisch war die überwiegend (in BCl G ausschließlich) gelbe Pigmentierung der Kolonien auf NA. Nur 7 der 74 Isolate dieses Hauptzweiges, d.h. nur 2 der 27 identifizierten Isolate, wiesen mehr als Aktivität 40% Aktivität auf (BCl I-K, M, P), so daß die Differenzierung der Taxa grundsätzlich anzuzweifeln war. Darüberhinaus belegte die Zuordnung einzelner Taxa zu verschiedenen Clustern die Zweifelhaftigkeit der Identifikationen. Das BIOLOGSystem erwies sich zur Identifikation Gram-positiven Isolate des Spittelwassersediments wenig geeignet. Der Arcanobacterium-Kerngruppe aus 11 Isolaten mit mindestens 85% Übereinstimmung der Reaktionsmuster wurden mit etwa 10% Differenz weitere 5 Identifikationen zugeordnet. Auf diesem Niveau umfasste das Cluster allerdings auch neben Art-ähnlichen und nicht identifizierbaren Isolaten eine Identifikation für Corynebacterium propinquum (synonym CDC ANF 3) und zwei Identifikationen für Brevibacillus brevis (ehemals Bacillus b., niedriger G+C-Gehalt). Auf dem 25%-Divergenzniveau wurden 4 weitere Gruppen innerhalb des Cluster BCl G unterschieden. Eine der Gruppen enthielt neben zwei Identifikationen für Aureobacterium saperdae (basonym Curtobacterium s.) sogar ein Staphylococcusähnliches Isolat (niedriger G+C-Gehalt), eine weitere Gruppe eine Identifikation für Micrococcus luteus. Corynebacteriums-, Aureobacterium- und Micrococcus-Identifikationen wurden nach ihrer Aktivität über die Cluster des Hauptzweiges verteilt: Einzelne Identifikationen für Micrococcus (M. luteus) und Corynebacterium (C. pseudodiphtericum, nahe verwandt mit C. propinquum) charakterisierten mit <20% sehr schwach aktive Isolate des BCl H. Ein stärker aktives Micrococcus diversus-Isolat wurde dem BCl N zugewiesen, stärker aktive Aureobacterium saperdae-Isolate dem BCl I. Die ausschließlich mit Xenobiotika isolierten Arcanobacterium haemolyticum-Stämme (basonym Corynebacterium h.) in BCl G bildeten die einzige größere Identifikationsgruppe. Phylogenetisch wird die Gattung Arcanobacterium (BCl G) der Actinomyces-Gruppe zugeordnet (Ramos et al. [1997]). Vertreter 7 Die Taxonomie der morphologisch definierten Gruppe coryneformer Bakterien unterlag einem beson- ders großen Wandel. Im Sinne der ursprünglichen Definition versteht man unter den „Coryneformen“ nicht-sporenbildende, Gram-positive Stäbchen mit unregelmäßiger Form. Zu ihnen wurden die Gattungen Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Cellulomonas, Agromyces, Arachnia, Rothia, Propionibacterium, Actinomyces, Eubacterium, Bifidobacterium u. a. gezählt. Heute werden sie etwa 19 getrennten Gattungen zugeordnet (Pelczar et al. [1986]). 3-73 3-74 Ergebnisse dieser Gruppe sind häufig saprophytisch, in Boden und Pflanzen weitverbreitet. Aufgrund der Fähigkeit Aromaten zu nutzen, der Produktion sekundärer Metabolite, insbesondere Antibiotika, werden sie in der Biotechnologie vielfach angewandt und waren sie hier von größerem Interesse (Präve et al. [1987]). Arcanobacterium haemolyticum wird jedoch primär aus Wunden von Mensch und Nutztieren isoliert, während das natürliches Habitat der Art und ihre Rolle darin bislang unbekannt sind (Balows et al. [1992]). Die Bestimmung war daher nicht logisch und zu überprüfen. Aureobacterium (BCl G), Micrococcus (BCl G, H, N), Curtobacterium, Cellulomonas (je ein ähnliches Isolat in BCl P, Q) der entsprechen Arthrobacter-Gruppe. Der Nachweis der Vertreter der ArthrobacterGruppe im Spittelwassersediment war nach dem Vorkommen der Gattungen wahrscheinlicher als der Nachweis von Arcanobacterium: Cellulomonas wird wie Aureobacterium als Bodenbakterien charakterisiert, aber auch aus Belebtschlamm isoliert und könnte hier aufgrund der cellulolytischen Aktivität für die Mineralisierung von Bedeutung sein (Yokota et al. [1993]). Curtobacterium wird von Pflanzen und deren Substraten isoliert (Balows et al. [1992]), Micrococcus ist als harmloser Saprophyt in Boden und Wasser, aber auch auf der Haut zu finden (Pelczar et al. [1986]). Die Gattungen innerhalb der Arthrobacter-Gruppe sind nahe verwandt und wahrscheinlich hier nicht differenzierbar. Micrococcus und Arthrobacter sind z.B. auf Gattungsebene nicht zu trennen (Balows et al. [1992]), sehr nahe verwandt mit Cellulomonas und der nicht in der BIOLOG-Datenbank enthaltenen Gattung der Bodenbakterien Oerskovia. Microbacterium, Agromyces und Clavibacter sind sehr nahe verwandt mit Curtobacterium und Aureobacterium. Eine allgemeine Bestimmung der „Arthrobacter-Gruppe“ wurde daher in Betracht gezogen und sollte auf eine Überschneidung mit der Actinomyces-Gruppe geprüft werden. Ein Staphylococcus-ähnliches Isolat wurde in BCl G bestimmt. Die Nicht-Identifizierung der Gattung war wahrscheinlich, denn aufgrund der Morphologie wurden die niedrig G+C-haltigen Gattungen Staphylococcus und Planococcus ursprünglich mit Micrococcus in der Familie Microccocaceae zusammengefaßt. Da die physiologische und biochemische Charakterisierung der Gattungen auf diese Gruppierung zielte (Balows et al. [1992]) und Micrococcus und Staphylococcus sich häufig das Habitat teilen (Murray et al [1984]), war die hier beobachtete Ähnlichkeit historisch zu verstehen. Die einzelnen Identifikationen für Corynebacterium (C. pseudodiphtericum in BCl H, C. propinquum in BCl G und C. urealyticum-ähnliche Isolate in BCl L, N) entsprachen untereinander sehr nahe verwandten Arten der Nocardia-Gruppe (Ruimy et al. [1995]). Das Vorkommen der Darm-, bzw. Hautflora besiedelnden Arten (Balows et al. [1992]) war mit der Einleitung kommunaler Abwässer möglich, aber auch hier galt gleiche Kritik an der Artbestimmung wie für die Enterobacteriacea (s.o.). Mangelnde Aktivität (C. pseudodiphtericum: <20%) und Verteilung der Identifikationen, bzw. der ähnlichen Isolate, über mehrere Cluster sprachen gegen die Identifikation. Als niedrig G+C-haltige Taxa waren Bacillus cereus / thuringiensis-ähnliche Isolate in BCl H bestimmt worden, ein Staphylococcus-ähnliches Isolat, Brevibacillus brevis und -ähnliche Isolate in BCl G. Die Staphylococcus-Ähnlichkeit wurde mit der ursprünglichen Definition der Familie Microccaceae erklärt Ergebnisse (siehe oben). Aufgrund der Heterogenität des Clusters (3 Bacillus-ähnliche, je ein Micrococcus und Corynebacterium bestimmtes Isolat) und Aktivitäten von <20% wurden Identifikationen in BCl H zurückgewiesen. Einzig für Brevibacillus brevis (2 Identifikationen und 8 ähnliche Xenobiotika-Isolate) schien die Identifikation innerhalb des BCl G möglich. Die Heterogenität der physiologischen Daten und der DNA:DNA-Hybridisierung (Kämpfer [1991]) könnte die Splittung der ähnlichen Isolate in BCl G erklären. Normalerweise werden Brevibacillus brevis Bacillus cereus überwiegend in Böden nachgewiesen (bis zu 81% der Denitrifikanten), in Sedimenten dagegen überwiegend (zu 23-43%) Bacillus cereus und B. licheniformis (Schmider [1985]). Möglicherweise bietet die Bakterizid-Ausscheidung Brevibacillus brevis gegenüber anderen sporenbildenen, niedrig G+C-haltigen Taxa beim raschen Wechsel der Substratverhältnisse im Spittelwasser einen Selektionsvorteil (Pelczar et al. [1986]). Nitratreduktion, Stickstoff-Fixierung und cellulolytische Aktivität machen die Bedeutung der zumeist harmlosen, saprophytischen Bacillen in Gewässern und Böden aus (Campbell, [1980]), die extrem geringe Anzahl hier isolierter Stämme war daher sehr erstaunlich. Bilanzierung der BIOLOG-Bestimmung Eine zahlenmäßige Zusammenfassung der Identifikationsraten mit dem BIOLOG-System wurde in Tab. 3.5 angestrebt. Von 510 in Reinkultur genommenen Kolonien konnten rund 22 % aufgrund des geringen Wuchses nicht mit dem BIOLOG-System getestet werden, 31 % aller Isolate wurden identifiziert, für weitere 10% wurden die Identifikationen in Frage gestellt. Die Identifikationsgüte hätte für bestimmte Taxa, v.a. Enterobacteriaceae, durch selektive Präkultur (Verwendung von Blut-Agar) und Inkubation (Präkultur und Test bei 37°C) erhöht werden können. Dies betraf allein die Xenobiotika-Isolate, nicht jedoch auf die vor Ort als relevant angenommenen Stämme die mit Sediment-Extrakt-Agar isoliert wurden. Die Aufschlüsselung nach Gram-positiven und negativen Bakterien zeigte, daß etwa die Hälfte der Gram-negativen, aber nur ein Fünftel der Gram-positiven Isolate identifiziert wurde. Aufgrund der Zuordnung zu distinkten Clustern und geringer Aktivität wurde mindestens ein Drittel der Gram-positiven und ein Viertel der Gram-negativen Identifikationen als fraglich eingestuft. Die Aufschlüsselung nach Anreicherungsmedien wies maximale Identifikationsraten für die Gram-negativen Isolate der Xenobiotika-Medien 3CB, Nap, Ant und oXy nach. Diese Medien lieferten gleichzeitig die meisten Isolate und Isolate mit gutem Wuchsverhalten unter Laborbedingungen. Offensichtlich entsprachen diese Isolate am ehesten den bislang in der Datenbank vorhandenen „Umweltisolaten“. Der Hersteller gab für entsprechend wenig untersuchte Habitate wie Boden Identifikationsraten von unter 50%. Damit waren die Untersuchungsergebnisse hier durchaus im erwarteten Rahmen. Die große Anzahl der mit SA im August 1993 isolierten Bakterien die nicht identifizierbar waren oder fragliche Identifikationen erhielten (etwa 38 % der SA-Isolate 8/93) sprach für eine erfolgreiche Strategie zur Isolierung neuer, „echter“ Umweltisolate. Sehr deutlich wurde, daß das BIOLOG-System vielen aquatischen 3-75 3-76 Ergebnisse Mikroorganismen keine Wachstumsbedingungen bietet. Der hohe Anteil nicht charakterisierbarer Isolate (58 % der SA-Isolate 8/93) sprach für die erfolgreiche Isolierung oligocarbophiler Bakterien. Dieser Anteil war größer als nach dem hohen Gehalt des Sediments an organischen, relativ einfach abbaubaren Substanzen im Sediment (siehe Einleitung, Kapitel 1.3.1) vermutet wurde. Tab. 3.5 Bilanz der Anwendung des BIOLOG-Systems Mai Gram oXy Σ % 1 3 2 33 24 53 7 5 10 1 1 5 110 22 3 7 5 3 25 4 4 36 19 8 102 4 2 20 18 7 7 33 44 129 25 2 29 2 15 1 29 1 5 40 3 10 30 1 11 139 40 92 27 8 18 50 2 46 1 35 53 42 271 53 53 138 17 71 10 43 87 91 510 100 10 27 3 14 2 8 17 18 100 SA 24D 3CB 4CS 4 4 6 25 12 43 6 1 2 10 80 4 7 2 Identifikation - Identifikation fraglich keine Identifikation 1 1 7 2 4 4 9 14 SUMME Gram-positive Isolate: 1 8 11 Identifikation - Identifikation fraglich keine Identifikation 2 15 25 6 18 26 SUMME Gram-negative Isolate: 42 SUMME der Isolate: % der Isolate: keine Bestimmung keine Bestimmung keine Bestimmung SUMME nicht bestimmte Isolate: GP GN Isolate Nap SA nb GP GN BIOLOG August Ant 1 Legende: Gram % Σ Gram-Verhalten GP Gram-positiv GN Gram-negativ nb nicht bestimmbar prozentuale Verteilung bezogen auf sämtliche 510 untersuchten Isolate (Werte gerundet) Summe der bestimmten Isolate Selektivität der Medien Die Selektivität der Anreicherungsmedien für bestimmte Bakteriengruppen war evident. In der Clusteranalyse wurde die Medienspezifität der Gruppen Pseudomonas, Stenotrophomonas, Enterobakterien, Ochrobactrum, Sphingobacterium deutlich hervorgehoben. Diese Taxa wurden hier ausschließlich mit Xenobiotika-Medien isoliert und dominierten den ersten Teil der Clusteranalyse Gram-negativer Bakterien (Dendrogramm Gram-Negative, Teil I, Abb. 3.10). Lediglich 5 der 118 Isolate in diesem Teil waren mit SA (Probenahme 8/93) angereichert worden: Ein Isolat wurde als Aeromonas caviae identifiziert, die anderen entsprachen nicht näher zuzuordnenden, nicht identifizierbaren Einer-Clustern (γ/β-Proteobakterien, bzw. α-Proteobakterien-Hauptzweig). Auch in den Clustern des heterogenen zweiten Teils der Analyse (Denrogram Gram-negative, Teil II, Abb. 3.11) war die Korrelation mit dem Isolationsmedium und der Probenahme auffällig. Die Kern- Ergebnisse gruppe Alcaligenes umfaßte ausschließlich Isolate von Xenobiotika-Medien, A. faecalis wurde innerhalb dieser Gruppe ausschließlich für Nap-Isolate identifiziert. Das Acinetobacter-Cluster BCl 28 enthielt nur SA-Isolate, zwei A. johsonii gsp. 7 identifizierte Isolate der Probenahme 8/93 sowie ein nicht-identifiziertes Isolat von 5/93. Das heterogene Acinetobacter -Cluster BCl 29 enthielt nur SA-Isolate der Probenahme 8/93 sowie eine A. faecalis-Identifikation für ein Isolat gleicher Probenahme. Der tabellarische Vergleich der Identifikationen (Tab. 3.3, Tab. 3.4) zeigte die Selektivität der Medien in Zahlen. Enorm häufig wurden beispielsweise Comamonas testosteroni und Stenotrophomonas maltophilia mit 3CB, Nap bzw. oXy identifiziert (>30-50% der Gram-negativen Isolate dieser Medien). SA lieferte zu einem hohen Prozentsatz schwach aktive Isolate und Bakterien die nicht charakterisierbar (Gram-Verhalten, BIOLOG-Test) und identifizierbar waren. Gram-positive SA-Isolate waren grundsätzlich nicht-bestimmbar oder nicht-identifizierbar, Xenobiotika-selektierte Gram-positive Bakterien zumindest charakterisierbar. Auch die im Vergleich zu SA geringe Anzahl mit Xenobiotika bestimmterTaxa zeigte die Selektivität der Medien (bereits mindestens 15 Taxa für nur 58 bestimmbare SA-Isolate, gegenüber 13-15 Taxa für 86 bestimmbare Nap- und oXy-Isolate). 3.3.4 Vergleichende Identifikation der Isolate mit der FAME-Analyse Dank der freundlichen Unterstützung von M. Vancanneyt, Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent (Belgien), konnten einige Identifikationsgruppen durch die Bestimmung mit dem MIDI-MISSystem (Analyse der zellulären Fettsäuren, FAME: „Fatty Acid Methyl Esters“) verifiziert werden. Für die Analyse kamen nur Bakterien mit hinreichendem Wuchs auf TSBA (Trypticase Soy Broth Agar) in Frage. Dies schränkte die Anwendung der Methode zur Analyse der schwach aktiven Gram-negativen Bakterien sehr stark ein. Im Rahmen eines neuen Projektes wurde primär die Gram-positive Gruppe der vermuteten G+C reichen „coryneformen“ Bakterien verifiziert (BCl F-J). Die Ergebnisse der FAMEAnalyse wurden in den Tabellen 3.6 (Gram-negative) und 3.7 (Gram-positive Bakterien) dargestellt, unter Einbeziehung der definierten BIOLOG-Cluster. Im Gegensatz zum BIOLOG-System war für die FAME-Analyse keine vorhergehende Gram-Bestimmung notwendig, das heißt eine sichere Identifikation Gram-variabler Bakterien, Gram-positiver Bakterien mit Gram-negativer Zellwand und umgekehrt, ist möglich. Von 117 analysierten Isolaten (72 Grampositiv, 43 Gram-negativ) erwiesen sich 3 Isolate als falsch Gram-positiv und 1 Isolat als falsch Gramnegativ bestimmt. Diese falsch vorsortierten Isolate waren vom BIOLOG-System korrekterweise nicht identifiziert worden. 3-77 3-78 Ergebnisse Gram-negative Isolate Die FAME-Analyse lieferte nur begrenzt neue Informationen für die Identität der Gram-negativen BIOLOG-Cluster (vergleiche Tab. 3.6). Von den 24 analysierten Stämmen, die mit BIOLOG nicht zu identifizieren waren, wurden 14 über die FAME identifiziert (BCl 5, 6, 12, 21, 28, 31, 35, 37, 39). Die Identifikation von Xanthobacter flavus entsprach einem nicht in der BIOLOG-Datenbank enthaltenen Taxon. Zwei Stämme, für die die Gram-Bestimmung und Identifikation im BIOLOG-GN- und GP-Testsystem nicht eindeutig war (Ant-29 BCl 11 / D, oXy-7d BCl 12 / C), konnten mittels FAME als α-Proteobakterien identifiziert werden. Von den BIOLOG-Identifikationen waren 6 nicht über die FAME identifizierbar. Im Detail ergaben sich folgende Identifikationen: Bestätigt wurde die Identifikation von Aeromonas caviae (BIOLOG-Einer-Cluster BCl 10). Xanthobacter flavus wurde mit 0,6-0,8 Sim. eindeutig zwei BIOLOG-nicht-identifizierten Isolaten in BCl 31 und einem falsch Gram-positiv-bestimmten Isolat (SA8-013) in BCl N zugewiesen. Die Fehldiagnose in der Gram-Färbung (durch dunkel eingefärbte Einschlußkörper) ist für Xanthobacter bekannt, auch die gelbe Pigmentierung der Isolate sprach für die FAME-Identifikation (Balows et al. [1992]). Korrekterweise wurde die nicht in der GN 3.01 Datenbank enthaltene Art vom BIOLOG-System nicht identifiziert. Aufgrund des wahrscheinlich ubiquitären Vorkommens in mikroaerophilen Habitaten ist der Nachweis der methylotrophen („Knallgasbakterien“), chemolithoautotroph N2-fixierenden Xanthobacter (eine Fähigkeit die sie mit Hydrogenophaga pseudoflava und Bradyrhizobium japonicum gemein haben) hier von Bedeutung. Nicht eindeutig Gram-bestimmbar und mit beiden BIOLOG-Systemen getestet wurde das Isolat SA8-032. Das BIOLOG-GP-System ergab sehr geringe Ähnlichkeit zu Rhodococcus und definierte das Einer-Cluster BCl O, die GN-Identifikation ergab Ancylobacter aquaticus (α-Proteobakterien, synonym Microcyclus a.) und definierte das Einer-Cluster BCl 36. Die Fettsäureanalyse bestätigte die Zugehörigkeit zu den α-Proteobakterien, ergab aber mit Sim. 0,4-0,5 zu Xanthobacter flavus, Methylobacterium mesophilicum (basonym Pseudomonas m.) und Bradyrhizobium japonicum keine eindeutige Identifikation. Die weiße Koloniefärbung sprach in diesem Fall eher für die BIOLOG-GN-Identifikation und gegen das nächstmögliche Taxon der FAME-Identifikation (Balows et al. [1992]). Methylobacterium mesophilicum ähnlich (nur 0,3 Sim.) war nach der FAME-Analyse auch ein Isolat des Ochrobactrum-bestimmten α-Proteobakterienclusters BCl 11. Die häufige pinkfarbene Pigmentierung der fakultativ methylotrophen, ubiquitär als Luftkeime auftretenden Methylobacterium war jedoch nicht zu beobachten (Balows et al. [1992]). Gegensätzliche Identifikationen von FAME und BIOLOG für Ochrobactrum in diesem Cluster (siehe Tab. 3.6) lassen stattdessen eine verwandte Art vermuten. Einige der im BIOLOG-Test extrem schwach wüchsigen Isolate des BCl 41 („Moraxella“-Cluster) ließen sich für die Analyse der Fettsäuren ausreichend anziehen. Die 7 bestimmten Isolaten (von insgesamt 37 im Cluster) konnten Identifikationen für Moraxella und Shewanella nicht bestätigen. Zwei „Moraxellen“ wurden den β-Proteobakterien zugeordnet, die anderen Isolate zeigten keine Ähnlichkeit mit Taxa in Ergebnisse der FAME-Datenbank, bzw. waren nicht identifizierbar. Keine zusätzliche Information ergab sich für das nicht-identifizierte Isolat im Brevundimonas / Psychrobacter-Cluster BCl 42. Das Isolat war mit beiden Methoden nicht zu identifizieren. Bestätigt wurde auch die Identifikation von BCl 43 als Brevundimonas vesicularis und die Fraglichkeit der gleichen Identifikation für das separate Einer-Cluster BCl 45 (FAME: nicht identifiziert). BCl 44 enthielt bei 8 Isolaten lediglich eine einzelne „verirrte“ Pseudoalteromonas haloplaktis-Identifikation. Von den 7 nicht-identifizierten Isolate waren 5 ohne Korrelation zur FAMEDatenbank. Die Rate „neuer“ Taxa dürfte in den (aufgrund der geringen Aktivität) „schwierigen“ Clustern wie vermutet sehr hoch sein. Die FAME-Analyse ordnete zwei nicht identifizierte Isolate in den Einer-Clustern BCl 6 und BCl 21 Acidovorax delafieldii (0,6 bzw. 0,7 Sim.), d.h. den bereits umfangreich bestimmten β-Proteobakterien zu. Das BIOLOG-Reaktionsmuster von BCl 6 wich so erheblich von dieser Art ab (vergleiche Dendrogramm Teil II, Identifikation für Acidovorax delafieldii in BCl 23), daß es den γ-Proteobakterien im Dendrogramm Teil I zugeordnet wurde. Als Hydrogenophaga (β-Proteobakterien, Comamonadaceae) wurden 6 Isolate aus 4 BIOLOG-Clustern identifiziert. Größte Übereinstimmung mit H. pseudoflava (ehemals Pseudomonas p., FAME Sim. 0,8) zeigte das mit BIOLOG nicht identifizierte Isolat des BCl 5. Drei Isolate des BCl 37 mit fraglicher Comamonas terrigena-Identifikation wurden über die FAME mit maximal Sim. 0,6 als Hydrogenophaga identifiziert. Von den fraglichen Acidovorax facilis und Pseudomonas syringae, in BCl 30 im Übergangsbereich der Kerngruppen von Comamonas testosteroni und C. acidovorans bestimmt, wurde ein Isolat überprüft und revidiert, es zeigte geringe Übereinstimmung mit den Fettsäuremustern von Hydrogenophaga (Sim. 0,3). Auch eines der schwach aktiven „Moraxella“-Isolate des BCl 41 wurde als Hydrogenophaga identifiziert. Bestätigt wurde Comamonas testosteroni in BCl 30. Die als zu verifizieren eingestuften BIOLOG-Identifikationen für C. terrigena im BCl 29 wurden vom FAME nicht identifiziert, bzw. waren nicht bestimmbar, BCl 37 wurde als wie gesagt als Hydrogenophaga revidiert. Hydrogenophaga pseudoflava sollte im BIOLOG-Test identifizierbar und nicht mit C. terrigena (BCl 37) zu verwechseln sein (Bochner [1990]). Die Splittung der Gattung Acinetobacter wurde bestätigt. Höchste Similarity zu Acinetobacter johnsonii (Sim. 0,7) zeigte das nicht-identifizierte Isolat des BCl 39. Eine Acinetobacter johnsonii-Identifikation im BCl 29 wurden mit 0,4 Sim. auf Gattungsniveau bestätigt, eine zweite erwies sich als Acidovorax delafieldii (β-Proteobakterien). Die Acinetobacter-ähnlichen Isolate in BCl 34 und 35 wurden mit relativ geringer Similarity (Sim. 0,2-0,4) als solche bestätigt. Aufgrund der niedrigen Similarity war eine nicht in den Datenbanken enthaltene Art zu vermuten. Für BCl 28 bestätigte die FAME-Identifikation als Pseudomonas alcaligenes die auf dem 35%-Niveau erkennbare Separierung eines BIOLOG-nicht identifizierten Isolates von zwei Acinetobacter johnsonii-Isolaten. 3-79 3-80 Ergebnisse Tab. 3.6 FAME-Analyse der Gram-negativen Bakterien BIOLOG BCl Identifikation (Anzahl Isolate) 4 5 6 10 11 N N N Aeromonas caviae Ochrobactrum anthropi N N N N N N N Comamonas terrigena Acinetobacter johnsonii / genosp.7 12 18 19 21 22 28 29 FAME ∑BCl Gr 1 1 1 1 nb nb nb, - 5 1 1 1 1 1 3 5 30 Comamonas testosteroni Acidovorax facilis 31 N 34 Alcaligenes faecalis Type II N 35 N 36 Ancylobacter aquaticus 37 N Comamonas terrigena 39 N 41 Moraxella lincolnii Moraxella Moraxella, N Shewanella putrefaciens (2), N (1) 42 N 43 Brevundimonas vesicularis 44 N 45 Brevundimonas vesicularis 30 1 3 1 1 4 2 37 4 6 1 SUMME Gram-negative Isolate: 120 Identifikation (Anzahl Isolate) N Hydrogenophaga pseudoflava Acidovorax delafieldii Aeromonas caviae Methylobacterium (mesophilicum) Ochrobactrum anthropi Agrobacterium (radiobacter) nb N Acidovorax delafieldii nb Pseudomonas alcaligenes nb, N Acidovorax delafieldii Acinetobacter johnsonii - Comamonas testosteroni - Hydrogenophaga (pseudoflava ) - Xanthobacter flavus - Acinetobacter calcoaceticus - N - Acinetobacter (johnsonii) - (Xanthobacter flavus / Bradyrhizobium japonicum / Methylobacterium mesophilicum)1 - Hydrogenophaga (pseudoflava ) - Hydrogenophaga pseudoflava - Acinetobacter johnsonii - Hydrogenophaga pseudoflava - Acidovorax delafieldii nb, - nb nb, - nb (2), N (1) - N - Brevundimonas vesicularis nb nb nb nb ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 2 3 1 1 5 1 SUMME FAME-analysierte Isolate: 42 Legende (Tab. 3.6): BCl, ∑BCl BIOLOG-Cluster, Gesamtzahl der Isolate im BIOLOG-Cluster Gr, ∑ N, nb Gram-Bestimmung nach FAME, Anzahl FAME und BIOLOG analysierter Isolate 1 nicht identifiziert, nicht bestimmbar (keine Übereinstimmung mit FAME-Datenbank) keine eindeutige FAME-Identifikation: max. 0.46 Sim. zu X. flavus, zu nächsten Taxa 0.4 Sim. Wie anhand der Clusteranalyse vermutet, waren einzelne, „verstreute“ Identifikationen für Alcaligenes faecalis in den BCl 29, 30, 34 nicht zu halten. Die Alcaligenes faecalis-Identifikation in BCl 34 wurde Ergebnisse mittels FAME als Acinetobacter calcoaceticus wiederlegt, allerdings wurden bei diesem Isolat nach längerer Kultur auf TSA unterschiedliche Morphotypen beobachtet. Eine Fehlidentifikation durch Anreicherung unterschiedlicher Stämme erscheint wahrscheinlich. Gram-positive Isolate Die FAME-Analyse lieferte wesentliche Informationen für die Identität der Gram-positiven BIOLOGCluster. Die mit beiden Testsystemen bestimmten Taxa wurden in Tab. 3.7 gegenüberstellt. Insgesamt wurden 73 Gram-positive Stämme der FAME-Analyse unterworfen. Von 47 mit BIOLOG nicht zu identifizierenden Stämmen konnten 37 über die Fettsäuren taxonomisch zugeordnet werden. Von den BCl A-F, deren Isolate keine Ähnlichkeit zu den Taxa in der BIOLOG-Datenbank zeigten, wurden 7 Stämme anhand der Fettsäuren bestimmt. Nur zwei der Stämme ergaben eine Identifikation: In BCl C wurde einmal die Gattung Rhodococcus bestimmt, in BCl F Aureobacterium saperdae. Ein weiteres Isolat des BCl F wurde nicht identifiziert, konnte aber mittels SDS-Page der Gattung Rhodococcus zugeordnet werden (M.Vancanneyt, persönliche Mitteilung). Die Homogenität der BIOLOG-Cluster und die typischen physiologischen Reaktionsmuster ließen die Bestimmung Rhodococcus / Aureobacteriumähnlicher Taxa in diesen Gruppen vermuten. Da beide Systeme (FAME, BIOLOG) keine entsprechenden Arten in der Datenbank enthielten wurde angenommen, daß mindestens die Hälfte der 54 Isolate in BCl A-F nicht zu bestimmenden neuen Arten entspricht. Die Isolate der BIOLOG-Cluster BCl G-J wurden als „Coryneforme i.w.S.“ bestätigt. Die BIOLOG-Identifikation Arcanobacterium haemolyticum (synonym Corynebacterium h.) war nach der FAME-Analyse der Gattung Aureobacterium (A. saperdae, A.esteroaromaticum) zuzuordnen. Die FAME-Analyse identifizierte insgesamt 44 Stämme der BIOLOG-Cluster BCl F-J (insgesamt 66 Isolate) als Aureobacterium (0,4-0,9 Sim.). Die Identität der vielfach saprophytischen Gattung bestätigte der SDS-Page-Vergleich der Gesamtzellproteine mit denen bekannter Referenzstämmen (Bestimmung im Rahmen des „Coryneformen“-Projektes durch M.Vancanneyt, persönliche Mitteilung), die Isolate konnten aber nicht eindeutig den bekannten Arten konnten zugeordnet werden. Die manuelle Auswertung der indifferenten BIOLOGReaktionsmuster (schwache Färbung der Tests, d.h. viele Borderline-Reaktionen) wurde als mögliche Ursache für die offenbar systematische Fehlidentifikation als „Arcanobacterium haemolyticum“ gesehen. Aureobacterium esteroaromaticum war bei korrekter Gram-Bestimmung vom BIOLOG-System (Version 3.50) nicht zu identifizieren, da es als ehemaliges Flavobacterium esteroaromaticum in dieser Version in der Datenbank Gram-negativer Bakterien stand (wurde in Version 3.70 korrigiert). 3-81 3-82 Ergebnisse Tab. 3.7 FAME-Analyse der Gram-positiven Bakterien BIOLOG BCl Identifikation (Anzahl Isolate) B C D E F N N N N N N Arcanobacterium haemolyticum2 (10), Brevibacillus brevis (2), N3 (14) Arcanobacterium haemolyticum (6), Corynebacterium propinquum (1), N (5) Aureobacterium saperdae6 (1), N (4) N4 Aureobacterium saperdae (1), N (2) Micrococcus luteus (1), N (1) N N Corynebacterium pseudodiphteriticum N Aureobacterium saperdae (2), N (1) N N N G H I J N Q FAME ∑BCl Gr 5 17 23 7 2 55 5 3 1 3 1 nb + + + + + + Identifikation (Anzahl Isolate) ∑ nb (Rhodococcus erythropolis / Nocardia globerula)1 N N Aureobacterium saperdae N5 Aureobacterium esteroaromaticum 1 1 1 2 1 1 26 + Aureobacterium saperdae 12 + + + + + + nb nb + + nb 5 3 3 2 1 1 1 2 3 1 1 1 Micrococcus kristinae (4), (A.saperdae / M. krist.) Micrococcus varians Cellulomonas flavigena Clavibacter michiganense Corynebacterium bovis N nb no growth (Aureob. esteroaromaticum / Micrococcus krist.) Aureobacterium saperdae Xanthobacter flavus nb GESAMTZAHL Gram-positive Isolate: 122 GESAMTZAHL FAME-analysierter Isolate: 69 Legende: BCl Gr BIOLOG-Cluster FAME Gram-Bestimmung Anzahl Isolate im BIOLOG-Cluster N, nb * nicht identifiziert, nicht bestimmbar Kontaminant Anzahl FAME (und BIOLOG) analysierte Isolate ∑BCl ∑ FAME-Analyse 1 keine eindeutige Trennung von Rhodococcus erythropolis / Nocardia globerula 2 2 Isolate: Rathayibacterium tritici / Aureobac. esteroaromaticum, Wiederholung ergab A. esteroaromaticum 3 1 Isolat: A. esteroaromaticum / A. saperdae, Wiederholung ergab A. esteroaromaticum 4 1 Isolat: Rathayibacterium tritici / Corynebacterium aquaticum, Wiederholung ergab Micrococcus varians 5 SDS-Page ergab Identifikation für Rhodococcus erythropolis 6 Zweifache Bestimmung ergab einmal Aureobacterium saperdae, Wiederholung Micrococcus kristinae Daß Aureobacterium saperdae in der FAME-Analyse zum Teil nicht von A.esteroaromaticum unterschieden werden konnte, sprach hier ebenso gegen die exakte Identifikation dieser Art, wie deren primäre Isolierung aus Insekten (Balows et al. [1992]). In der FAME-Analyse waren außerdem A. saperdae und Micrococcus kristinae zum Teil nicht eindeutig zu differenzieren. Auch die BIOLOGAnalyse wies einzelne Identifikationen beider Gattungen bzw. Arten in den Clustern nach, häufiger waren aber lediglich ähnlich Stämme zu bestimmten. Für die Micrococcus-Bestimmungen wies die gelbe Ergebnisse Koloniemorphologie der Stämme auf die Wahrscheinlichkeit der BIOLOG-Identifikation für M. luteus hin, während die typische schwach orange Färbung der FAME-identifizierten Art M. kristinae hier nicht zu beobachten waren (Balows et al. [1992]). Der Nachweis dieser „Luftkeime“ war bei der Praxis der Probenahme nicht vollständig auszuschließen. Ein mit BIOLOG Aureobacterium spaerdae identifiziertes Isolat und weitere nicht zu identifizierende Stämme wurden anhand der Fettsäuren als Cellulomonas charakterisiert, einer phylogenetisch Micrococcus,Oerskovia und Arthrobacter nächst verwandten Gattung. Als Clavibacter michiganense wurden zwei der Isolate in BCl G bestimmt (ein mit BIOLOG nicht-identifiziertes Isolat, ein Micrococcus luteus bestimmter Stamm). Nach den komplexen und nur teilweise bekannten Nährstoffansprüche der saprophytischen, bzw. phytopathogenen und langsam wachsenden Gattung Clavibacter war die Anreicherung mit SA-Medium zu erwarten. Sie wurden jedoch nur mit Xenobiotika-Minimalmedien isoliert. BIOLOG-Cluster BCl H (Corynebacterium / Micrococcus) enthielt 5 Isolate sehr geringer Aktivität (weniger als 20% positive Tests, vergleiche Scatterplot Abb. 3.12). Aufgrund des schlechten Wuchses auf TSBA waren sie mittels FAME nicht bestimmbar. Da die Taxa in der Datenbank des MIDI-MISSystems enthalten, d.h. prinzipiell bestimmbar sind, waren die BIOLOG-Identifikationen zurückzuweisen. BCl N enthielt 3 Isolate geringer Aktivität und fraglicher Zuordnung. Die FAME-Identifikation eines Isolates als α-Proteobacterium zeigte wiederum fehlerhafte Gram-Bestimmung dieser Bakteriengruppe. Vereinzelt waren mit BIOLOG Taxa mit niedrigem G+C-Gehalt identifiziert und anhand der Clusteranalyse in Frage gestellt worden. Keine der Identifikationen der „Clostridium-Bacillus“-Gruppe, Bacillus cereus / thuringiensis- und Staphylococcus-ähnlichen Isolate wurden als solche in der FAME-Analyse bestätigt. Auch die BIOLOG-Identifikationen für Brevibacillus brevis wurden durch eine eindeutige Identifikation für Aureobacterium esteroaromaticum wiederlegt. 3-83 3-84 Ergebnisse Zusammenfassung zur FAME-Analyse Die „bekannten“, in den beiden Datenbanken enthaltenen Arten, reichten für die Bestimmung der Population nicht aus. Die FAME-Analyse belegte vor allem die in der BIOLOG-Clusteranalyse aufgedeckten „taxonomischen“ Mißstände. Für die Gram-positiven Cluster BCl B, D, E, Q und die Gram-negativen Cluster BCl 4, 18, 19, 22, 42, 44, 45 lieferte die FAME-Analyse keine weiteren Informationen. Durch die nicht erfolgte Identifikation wurden fragliche BIOLOG-Identifikationen der BCl 29, 41, 45, H eindeutig wiederlegt. Einige schwach aktiven Bakterien die mit BIOLOG charakterisiert, aber nicht sicher identifiziert worden waren (z.B. Gram-positiv: BCl H, Gram-negativ: BCl 41), konnten in Mengen angezogen werden, daß die Fettsäuren extrahiert werden konnten. Vom MIDI-MIS waren sie in der Regel nicht zu bestimmen (siehe Tab. 3.7, Tab. 3.6: lediglich zwei Stämme des BCl 41 wurden als β-Proteobakterien (Hydrogenophaga, Acidovorax) bestimmt). Diese Stämme waren unbedingt genetisch zu charakterisieren. Die BIOLOG- und FAME-analysierten Isolate bestätigten die in den Clustern (Dendrogramm Teil II, Abb. 3.11) festgestellte Vermischung der umfangreich bestimmten β-Proteobakterien-Familie Comamonadaceae (Hydrogenophaga, Acidovorax, Comamonas) mit der Familie der Alcaligenaceae und der γ-Proteobakteriengattung Acinetobacter, aber auch die mögliche Differenzierbarkeit einzelner Stämme oder Arten auf unterschiedlichem Divergenzniveau. Die FAME-Analyse bestätigte, daß es sich wahrscheinlich um atypische oder neue Arten handelt. Beispielsweise wurden Hydrogenophaga-, Acinetobacter-, Acidovorax-Stämme (möglicherweise neue Arten) anhand verschiedener BIOLOG-Cluster unterschieden. Comamonas acidovorans und C. testosteroni wurden innerhalb eines Clusters (BCl 30) differenziert und mit unbekannten Taxa (gleicher oder nah verwandter Gattungen) zusammengefaßt. Pseudomonas alcaligenes (FAME-Identifikation in BCl 28) und P. pseudoalcaligenes (BCl 20) wurden von den benachbarten Alcaligenes-Clustern separiert (BCl 24 Alcaligenes xylosoxidans, BCl 25-30 Alcaligenes faecalis). Die BIOLOG-Clusteranalyse erwies sich für die unzureichend definierten Gruppen als unerläßlich8. Eine weitere genetische Analyse des gesamten Komplexes sollte durchgeführt werden. Als zusätzlich fraglicher Bereich wurden mit der FAME-Analyse die α-Proteobakterien der Gattungen Xanthobacter, Methylobacterium und Bradyrhizobium definiert. Die Gram-Bestimmung erwies sich für 8 Die Comamonas / Alcaligenes-Gruppe weist im BIOLOG-Test größte Ähnlichkeit zur Acinetobacter- Gruppe [γ] auf, sehr ähnlich sind Pseudomonas alcaligenes, P. pseudoalcaligenes und die nächste benachbarte β-Proteobakterien-Gruppe Acidovorax (Bochner [1990]). Die Ähnlichkeit der Alcaligenaceae (Alcaligenes, Bordetella) mit den nahe verwandten Gattungen Oligella und Comamonas kommentierte Bochner [1990]: „..[they] form closely adjacent clusters...It is not clear that these are sufficiently resolved to be distinct genera. It would be helpful to study this issue further using nucleic acid analysis.“ Ergebnisse diese Gruppe als schwierig (siehe FAME-Identifikation Gram-positiv angenommener Bakterien des BCl N, Tab. 3.7). Die FAME-Analyse war in diesem Fall eindeutig von Vorteil, da sie keine vorherige Gram-Bestimmung erfordert. Die Identifikationen waren jedoch zumeist schwach oder widersprüchlich (z.B. BCl 11: nach BIOLOG Ochrobactrum, nach FAME Methylobacterium, BCl 36, N: nach BIOLOG wahrscheinlich Ancylobacter, nach FAME Xanthobacter / Methylobacterium / Bradyrhizobium). Die derzeitige Umstrukturierung nach den neueren genetischen Kenntnissen erfordert entsprechende Überprüfung der Isolate dieser Gruppe9. Die fragliche BIOLOG-Identifikation niedrig G+C-haltiger Bakterien konnte durch die FAME-Analyse in keinem Fall bestätigt werden. Die mit BIOLOG nicht näher bestimmbaren Isolate der BCl A-F konnten auch mit der FAME-Analyse zumeist nicht näher bestimmt werden. Wenn sie Ähnlichkeit mit Bakterien der FAME-Datenbank aufwiesen, dann entsprachen sie am ehesten Bakterien der Nocardia-Gruppe (Corynebacterium, Rhodococcus). Isolate der BCl G-J entsprachen zumeist der Arthrobacter-Gruppe (Curtobacterium,Clavibacter, Aureobacterium, Cellulomonas, Micrococcus, Arthrobacter), wenige der Nocardia-Gruppe. Arcanobacterium haemolyticum erwies sich als eine systematische Fehlidentifikation der BIOLOG-Ergebnisse für Aureobacterium. Die Isolate entsprachen wahrscheinlich bislang unbekannten oder atypischen Arten. Die überwiegend mit Xenobiotika isolierten Gram-positiven Bakterien wurden mit beiden Systemen als hoch G+C-haltige Taxa der morphologisch definierten Gruppe der „coryneformen Bakterien“ bestätigt. Chemotaxonomische, physiologische und genetische Differenzen führten in den letzten Jahren in dieser Gruppe zu gewaltigen Umstrukturierungen und Umbenennungen (vergleiche z.B. Balows et al. [1992], Ruimy et al. [1995], Bendinger et al. [1992], Stackebrandt et al. [1995]). Tab. 3.8 verdeutlicht die derzeitigen Ansätze zur sytematischen Umstrukturierung und die nahe Verwandtschaft der mit beiden Identifikationssystemen bestimmten Taxa (systematische Stellung, Benennung der Gruppen nach RDP). Die BIOLOG-Clusteranalyse der BCl G-J ensprach prinzipiell der monophyletischen Gruppe Corynebacteriaceae / Nocardiaceae (Ruimy et al. [1995]). Da die Gattungen der Arthrobacter-Gruppe phylogenetisch sehr nahe verwandt und auch auf der Basis des Fettsäuregehaltes sehr schwer zu differenziern sind (Bendinger et al. [1992]), war auch hier die nähere genetische Analyse angeraten. 9 Die phänotypische bzw. physiologische Identifikation ist vermutlich „historisch“ bedingt problema- tisch: Rhizobien wurden primär nach Wirtspflanzen systematisiert, d.h. auch die von Boden und Pflanzen zu isolierende Gattung Bradyrhizobium („langsam wachsenden Rhizobien“, Balows et al. [1992]). Phylogenetisch wurde dagegen ein distinkter Bradyrhizobium / Rhodopseudomonas-Zweig charakterisiert, dem auch Xanthobacter flavus zuzuordnen ist (Kersters et al. [1996]). 3-85 3-86 Ergebnisse Tab. 3.8 Bestimmung Gram-positiver Bakterien mit hohem G+C-Gehalt B F Taxon Anmerkungen Actinomyces-Gruppe (RDP 2.15.1.6, Ramos et al. [1997]): I,N Arcanobacterium haemolyticum (syn Corynebacterium) nahe verwandt mit Actinomyces, keine klare phänotypische Trennung Arthrobacter-Gruppe (RDP 2.15.1.7, Stackebrandt et al.[1995]): N Arthrobacter ilicis (bas Corynebacterium) Micrococcus luteus I M. kristinae I M. varians N M. diversus I Cellulomonas flavigena N C. cartae (syn Oerskovia) N Rathayibacter tritici (bas Clavibacter, Corynebacterium) I,N Aureobacterium esteroaromaticum (bas Flavobacterium) I,N I,N Aureobacterium saperdae (bas Curtobacterium) I Clavibacter michiganense (bas Corynebacterium) N Curtobacterium flaccumfaciens (bas Corynebacterium) Arthrobacter-Cluster 1 I,N nahe verwandt mit Rothia dentocariosa, Stomatococcus mucilaginosus Arthrobacter-Cluster 2 Arthrobacter-Cluster 3 Flavobacterium e. in BIOLOG 3.50 GN Nocardia-Gruppe (RDP 2.15.1.12.1, Ruimy et al. [1995]): I,N I N I N I Corynebacterium propinquum (ehem CDC-Gruppe ANF3) C. pseudodiphtericum C. urealyticum (ehem CDC-Gruppe D2) C. bovis Rhodococcus equi (ehem Corynebacterium) R. erythropolis Corynebacterium-Cluster 1 Corynebacterium-Cluster 3 nahe verwandt mit Nocardia Legende: B, F Bestimmung in der BIOLOG-, FAME-Analyse I, N mit dem System identifiziert (Taxon entspricht nächst möglicher Art), nicht identifiziert Abkürzungen bas basonym ehem ehemals syn synonym Ergebnisse 3.4 Molekularbiologische Charakterisierung Die molekulare Charakterisierung umfasst ein genetisches Screening der Isolate mit einem optimierten TGGE-Verfahren in neuem Einsatzbereich und die Analyse der 16S rDNA ausgewählter Isolate. Die Clusteranalyse der BIOLOG-Daten verdeutlichte, daß aufgrund der großen Anzahl Bakterien und der geringen Identifikationsrate im Rahmen dieser Arbeit nur stichprobenweise eine nähere, genetische Untersuchung der bestimmter Hauptgruppen vorzunehmen war. Der Schwerpunkt lag auf den Isolaten die mit Sedimentextrakt angereichert wurden (Probenahme 5/93 und 8/93). Soweit für die Bestimmtung fraglicher Gruppen von Interesse, wurden auch Xenobiotika-Isolate näher genetisch bestimmt. Analysiert werden sollten primär die mit BIOLOG nicht analysierbaren Isolate, die unzureichende Bestimmung mit BIOLOG und FAME erforderte darüberhinaus die Analyse nicht näher bestimmbarer BIOLOG-Gruppen (nicht FAME bestimmbare Isolate der BCl B-E, H, BCl 4, 18, 22, 29, 41, 42, 44, 45), der Gruppen mit fraglichen, bzw. widersprüchlichen BIOLOG- oder FAMEIdentifikationen (BCl 36 / O, G, 29, 34, 38, 41, 49), der zumeist falsch Gram-bestimmten α-Proteobakterien (BCl C / 12, D / 11, N, 36 / O, Xanthobacter, Agrobacterium / Ochrobactrum) bzw. systematisch fraglicher Gruppen (Arthrobacter-Gruppe des BCl G, Comamonadaceae / Alcaligenaceae, Acinetobacter / Moraxella in BCl 5, 23-41). 3.4.1 Genetisches Screening mit der TGGE Für das genetische Screening der Isolate wurde zunächst das TGGE-Verfahren entsprechend angepasst und optimiert. Ziel war es, eine möglichst große Bandbreite an Taxa zu erfassen. Für die Vorversuche wurden Comamonas testosteroni LMG1800t (β-Proteobacterium), Stenotrophomonas maltophilia LMG958t (γ-Proteobacterium) und Rhodococcus rhodochrous DSM43241t (Gram-positiv, mit hohem G+C Gehalt) als Referenzstämme ausgewählt. Das Schmelzverhalten der drei Referenzstämme wurde durch den Lauf der 1:1:1 gemischten TGGEPCR-Fragmente in einer Perpendikular-TGGE (Abb. 3.13, links) bestimmt. Der exponentielle Anstieg der Kurven markierte den Temperaturbereich reversibler Denaturierung und effektiven Trennung der Referenzstämme. Außerhalb dieses Bereichs (bei niedrigerer oder höherer Temperatur) konnte Rhodococcus rhodochrous DSM3421t aufgrund der geringeren Fragmentlänge (208 b) und dadurch bedingtem schnelleren Laufverhalten von den beiden anderen, gleich langen Fragmenten (beide 228 b) unterschieden werden. Der Temperaturbereich wurde für die Parallel-TGGE auf [50;70°C] eingeschränkt. Die optimierte Laufzeit von 3h wurde durch zeitversetztes Laden in der Parallel-TGGE so bestimmt (siehe Abb. 3.13, rechts), daß die beiden längengleichen Fragmente von Comamonas testosteroni LMG1800t und Stenotrophomonas maltophilia LMG958t maximalen Abstand aufwiesen. 3-87 3-88 Ergebnisse Perpendikular-TGGE [50; 75°] 350V / 30mA, 2h T 50°C Parallel-TGGE [50; 70°] 350V / 30mA, 3h T 75°C T 50°C Slot Stm. mlt Stm. mlt Com. tes Com. tes Rho. rho Rho. rho effektiver Trennbereich reversibler Denaturierung T 75°C Abb. 3.13 Optimierung der TGGE Legende: Perpendikular-TGGE Temperaturgradient senkrecht zur Laufrichtung - in der Grafik von links nach rechts Parallel-TGGE Temperaturgradient parallel zur Laufrichtung - in der Grafik von oben nach unten Standard 1:1:1 Gemisch der TPCR-Fragmente (Primer 16F341GC, 16R534) von Comamonas testosteroni LMG1800t (Com.tes), Stenotrophomonas maltophilia LMG958t (Stm.mlt) und Rhodococcus rhodochrous DSM43241t (Rho.rho) Entscheidend für die beobachteten Unterschiede im Schmelzverhalten und unterschiedliche Wanderung in der TGGE war die Stabilität der Sekundärstruktur, daß heißt die Basenpaarung und deren Position im doppelsträngigen DNA-Molekül. Nach der Basenzusammensetzung (Tab. 3.9, siehe ∑A, ∑T, ∑G, ∑C) unterschieden sich Comamonas testosteroni und Stenotrophomonas lediglich in einem T und C. Anhand der alignten Sequenzen (Tab. 3.9) wurde das unterschiedliche Schmelzverhalten von Comamonas testosteroni und Stenotrophomonas maltophilia auf 12 nicht überlappende Basen in der variablen Region, 8 Purin / Pyrimidin-Unterschiede und je 6 A / T und C / G-Unterschiede zurückgeführt. Das Schmelzverhalten der doppelsträngigen Nukleinsäuren wurde mit den Programmen von POLAND (Version V1.1) simuliert. Berechnet wurde das Verhalten der vollständigen Sequenzen der TPCR, d.h. mit Primer-Region und GC-Klammer (228 bzw. 208 Basen). Ergebnisse Tab. 3.9 16S rDNA / rRNA-Sequenzen der Standard-Referenzstämme zur TGGE-Optimierung (E.coli-Position 357-533, ausschließlich der Primer 16F341 und 16R534) Sequenzen G A T C ∑bp %GC Comamonas testosteroni ATCC11996t (LMG1800t)1 49 42 33 35 159 52,8 Stenotrophomonas maltophilia LMG958t2 49 42 34 34 159 52,2 3 Rhodococcus rhodochrous ATCC 13808t (DSM43241) 46 37 23 31 137 70,8 1.......10........20........30........40........50..... Position 1-55 C. testosteroni S. maltophilia R. rhodochrous UGGGGAAUUUUGGACAAUGGGCGAAAGCCUGAUCCAGCAAUGCCGCGUGCAGGAU TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAA TGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAT Position 56-110 ...60........70........80........90.......100.......110 C. testosteroni S. maltophilia R. rhodochrous GAAGGCCCUCGGGUUGUAAACUGCUUUUGUACGGAACGAAA...AGCCUGGGGCU GAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGC.TGG..TT GACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTT................CAGC.AGGGACG Position 110-166 .......120.......130.......140.......150.......160...... C. testosteroni S. maltophilia R. rhodochrous AAUAUCCCCGGGU...CAUGACGGUACCGUAAGAAUAAGCACCGGCUAACUACGUG AATA..CCCG.GTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG AAGC.GAAAG........TGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTG Legende: 1 2 3 . rRNA-Sequenz der RDP 16S rDNA-Sequenz von L. Hauben 16S rDNA-Sequenz von R. Cowan Lücke im Alignment A,T, G, C ∑bp %GC Fettdruck Summe der einzelnen Basen Anzahl der Basen prozentualer Anteil der Basen G und C Sequenzunterschiede Das Aufschmelzen der Fragmente wurde im Temperaturplot (Abb. 3.14, rechts) grafisch dargestellt, daneben gibt die Abb. 3.14 (links) das theoretische Verhalten der Fragmente in der Perpendikular-TGGE wieder. Das Aufschmelzen der Fragmente folgt einer Reaktion zweiter Ordnung. Im Temperaturplot (Abb. 3.14, rechts) entsprach die für eine Sequenzposition angegebene Temperatur einer Wahrscheinlichkeit von 50%, daß die doppelsträngige DNA in diesem Bereich geöffnet ist. Die Basen 1 bis 34 (entspricht der Sequenz-Position in der Grafik) umfassten die zur Stabilisierung angefügte GC-Klammer, die Basen 35-46 den Vorwärtsprimer F341, dann folgte die eigentliche Sequenz und an Position 213-228, bzw. 203-218 die 16 Basen des Rückwärtsprimers R534. Die Fragmente von Comamonas und Stenotrophomonas zeigten in der Kurve 3 Plateaus, entsprechend 3 unterscheidbaren Schmelzdomänen. Rhodococcus zeigte keine unterscheidbaren Schmelzdomänen und hohe Stabilität des Fragmentes, die auf den hohen G+C-Gehalt (AT:GC = 60:97) des Taxons zurückzuführen ist. Wie beabsichtigt zeigte die Domäne mit der GC-Klammer größte Stabilität (in der Simulation mindestens 77°C). 3-89 3-90 Ergebnisse Relative Mobilität in der TGGE Simulation des Schmelzverhaltens in der TGGE Poland V1.1, Temperaturplot Reaktion 2. Ord., 50% Schmelzwahrscheinlichkeit Poland V1.1, Gelplot Stiffness 90 1 Mobilität 80 Temperatur Rho.rho 0,8 78 0,6 76 Com.tes 74 Stm.mlt Stm.mlt 0,4 Com.tes 0,2 72 Rho.rho 0 70 72 74 76 Temperatur 78 80 70 3 23 43 63 83 103 123 143 163 183 203 223 Sequenz-Position Abb. 3.14 Simulation des Schmelzverhaltens in der TGGE Die Schmelzdomänen von Comamonas und Stenotrophomonas waren auch im simulierten Kurvenverlauf der Perpendikular-TGGE erkennbar (Abb. 3.14, links). Die Schmelztemperaturen lagen in der Simulation zwar höher als real in der Perpendikular-TGGE, der Kurvenverlauf gab aber sehr gut das Wanderungsverhalten der Fragmente im Gel wider. Das Verhalten der Fragmente von Comamonas testosteroni und Stenotrophomonas maltophilia beim Übergang zur Einzelstrang-DNA wurde in dieser Form in der TGGE selbst nicht sichtbar. Abb. 3.15 zeigt die densitrometrische Aufnahme eines Gels mit Referenzstämmen der optimierten Parallel-TGGE. Die Banden der Doppelstrang-DNA zeigten im silbergefärbten Gel braun-schwarze Färbung, während das Auftreten der Einzelstrang-DNA anhand der rötlichen Färbung nachzuweisen war. Die Gelfläche betrug im Original etwa 18,5 x 19,5 cm2, die effektive Trennstrecke zwischen der 50°C und 70°C Heizschlange der Thermoplatte etwa 11 cm. Um Seiteneffekte im Gel zu minimieren wurden die äußersten Slots mit dem Größenmarker pBR Hae III beschickt. Da die Trennung in der TGGE nicht allein nach Größe erfolgt, hatte der Marker als „Größenstandard“ hier keine Bedeutung. Das Bandenmuster des Markers war als Standard nicht brauchbar da es nur begrenzt reproduzierbar war. Als Standard wurde ein Cocktail mit gleichem Mengenverhältnis der TGGE-PCR-Fragmente von Rhodochoccus rhodochrous DSM43241t (Rho.rho), Stenotrophomonas maltophilia LMG958t (Stm.mlt), Comamonas testosteroni LMG1800t (Com.tes) und Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG1225 (Psd.psa) verwendet. Routinemäßig wurden die TGGE-Gele mit jeweils 5 Standards und 20 Proben geladen. Ladeschema: Standard pBR HAE III Standard Desulfovibrio vulgaris vulg. DSM644t Desulfovibrio desulfuricans DSM642t Oligotropha carboxidovorans DSM1227 Standard Rhodobacter capsulatus DSM1710t Rhodobacter sphaeroides DSM160 Erythrobacter longus ATCC33941t1 Sphingomonas adhaesiva JCM7370 Brevundimonas diminuta LMG2089t Shingomonas trueperi LMG2142t Standard Klebsiella pneumoniae DSM30102 Klebsiella planticola DSM3069t Frateuria aurantia DSM6220t Pseudomonas taetrolens LMG2336t Pseudomonas resinovorans LMG2274t Pseudomonas indigofera DSM3303 Standard Pseudomonas fragi DSM3456t nicht klassifiziert LMG6220 Pseudomonas aureofaciens LMG1245t Acinetobacter sp. DSM590 (calcoaceticus) Pseudomonas oleovorans LMG2229t Standard pBR HAE III Ergebnisse δ δα α α α α αα γ γ γ γ γβ γ γ γ Puffertuch Slotreihe 50°C Standard: Psd.psa. Stm.mlt. Com.tes. Rho.rho. 70°C Puffertuch Trägerfolie Abb. 3.15 Beispiel einer Parallel-TGGE Laufbedingungen: [50;70°C], max. 250V, 28mA, 3h30min Legende: α, β, γ, δ pBR HAE III Kb-Marker zum Auffüllen der seitlichen Slots, hier ohne Größenfunktion 1:1:1:1 Mix Rhodococcus rhodochrous DSM43241t, Comamonas testosteroni LMG1800t, Stenotrophomonas maltophilia LMG958t, Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG1225t Proteobakteriengruppen 3-91 3-92 Ergebnisse Wie die Abbildung zeigt, ergab die Mischung der Referenzstämme (mit einem stabilen 2-Bandenmuster hoher Retention für Pseudomonas pseudoalcaligenes) ein über den beobachteten Trennbereichen gleichmäßig verteiltes Bandenmuster. Verschiedene Stämme zeigten in der TGGE ein stabiles Muster mit Mehrfachbanden doppelsträngiger DNA. Das dargestellte Gel wies z.B. vier bzw. fünf Banden für Klebsiella planticola DSM3096t und Klebsiella pneumoniae DSM30102 nach, drei Banden für Brevundimonas diminuta LMG2089t und zwei Banden für Pseudomonas resinovorans LMG2274t und P. fragi DSM3456t (auf gleicher Höhe wie P. pseudoalcaligenes LMG1225t im Standard). Diese Mehrfachbanden waren keine PCR-Artefakte. Nübel et al. [1996] clonierten und sequenzierten die für Paenibacillus polymyxa DSM36t in der TGGE nachgewiesenen Mehfachbanden und konnten mittels Hybridisierung unterschiedliche chromosomale Position, d.h. Heterogenität des 16S rRNA-Gens nachweisen. Der vorherige Auftrag der TPCR-Produkte auf ein Agarosegel diente der Reaktionskontrolle und Bestimmung, Abschätzung der Produktmengen und der Fragmentlängenbestimmung. Bei Auftragung der Negativkontrollen in hohen Volumen (Ansätze ohne DNA, Kontrolle schwacher PCR-Produkte) war bei Verwendung der „normalen“ Taq statt der LD-Taq („low DNA content“) chargenabhängig eine schwache Bande beobachtet worden. Beim Auftrag entsprechend hoher Mengen (4-6 µl) in der TGGE ergaben diese Kontrollen ebenfalls „Mehrfachbanden“. Im Vergleich zu den Mustern der Referenzstämme und Isolate waren „positiven“ Negativkontrollen charakteristisch komplex aber schwach ausgeprägt. Lediglich bei geringer Templatemenge (bei Isolaten mit geringem Wachstum) und hohen Auftragungsvolumina waren sie im Hintergrund zu erkennen. Ein „falsch-positiver“ Effekt war bei ausreichender Menge Template und Verwendung von LD-Taq auszuschließen. Versuche zur Reproduzierbarkeit zeigten die Stabilität der Bandenmuster bei Verwendung von LD-Taq. Abb. 3.16 zeigt beispielsweise die Auswertung (GELCOMPAR 4.0) der Bandenmuster von Referenzstämmen und Isolaten unterschiedlicher 1) TGGE-PCR-Ansätze, 2) DNA-Präparate und 3) TGGE-Gele. Die Stärke der Einzelstrang-DNA-Banden variierte und mußte bei der Auswertung berücksichtigt werden. Beste Ergebnisse zeigte die Clusteranalyse unter Verwendung des Pearson-Korrelationskoeffizienten und Hintergrundreduktion („curve fitting“ = 20). Auch bei stark unterschiedlicher Auftragungsmenge wurde die Identität der Banden erkannt (vergleiche Abb. 3.16, unten: Isolat SA5-30). „Gel zu Gel“-Differenzen wurden durch Normierung der internen Standards auf einen per Definition „absoluten“ Standard ausgeglichen. Die maximale Varianz zwischen zwei Gelen mit denselben TGGE-PCR-Ansätzen zeigten die Isolate SA5-37b und SA5-29b in Abb. 3.16 (unten). Die Statistik der Referenztracks (Prozent Übereinstimmung der Standards) und der Vergleich von Doppelbestimmungen auf verschiedenen Gelen zeigte, daß bei mindestens 85% Übereinstimmung der Standards (Referenztracks) die Identität in einem Cluster auf dem 80% Niveau garantiert wurde. Ergebnisse Clustering: UPGMA Referenzstämme 00 10 20 20 30 40 40 50 60 6070 80 8090100 100 50°C 70°C t120396 C.TES 7 L1800 t120396 C.TES 8 L1800 t140596 C.JOH 8 L1341 tgge1910 C.JOH 8 L1341 t120396 S.Mlt 20 D958 tgge0408 S.MLT 11 L958 t140596 BH.CE 5 L1222 tgge1910 BH.CE 20 L1222 t140596 E.BRE 10 L4011 tgge1910 E.BRE 9 L4011 tgge1910 K.PLA 16 D3069 t290396 K.PLA 14 D3069 tgge1910 P.CHL 21 L1245 t290396 P.CHL 22 L1245 tgge1910 K.PNE 15 D30102 t290396 K.PNE 13 D30102 t120396 RC.RO 14 D43241 t120396 RC.RO 15 D43241 t120396 RC.RO 16 D43241 t140596 RC.RO 18 D43241 tgge1910 RC.RO 2 D43241 tgge0408 RC.RO 8 D43241 List: REP_ISE Entries: 24 Correlation: Correlation - Fine Zones: [190-648] Clustering: UPGMA Isolate 00 10 20 100 50°C 20 30 40 40 50 60 60 70 80 80 90100 tgge1312 IIH 14 5S30 tgge0712 IIH 13 5S30 tgge1312 IIH 15 5S11 tgge0712 IIH 14 5S11 t230396 N:D.AE 14 S102 t230396 N:D.AE 15 S102 tgge0712 N:C.TS-5S37b 5 tgge0712 N:C.TS-5S29b 7 tgge1312 N:C.TS 6 5S37b tgge1312 N:C.TS 8 5S29b tgge1312 N:M.ME 3 5S42 tgge0712 N:M.ME 2 5S42 t150596 nb 12 S122 t230396 nb 7 S122 tgge1312 A.JOH 23 5S16 tgge0712 A.JOH 21 5S16 t150596 nb 20 S091 t230396 nb 18 S091 t150596 nb 15 S115 t230396 nb 9 S115 t220396 nb 14 S145 t230396 nb 3 S145 t170596 M.LIN 15 S040 t170596 M.LIN 16 S040 70°C BG Stamm Gel PCR ul bP Com. testosteroni LMG1800t 12/03 08/03 II 2 bP Com. testosteroni LMG1800t 12/03 08/03 I 2 CYF Flb. johnsonii LMG1341t1 14/05 15/09 2 CYF Flb. johnsonii LMG1341t1 19/10 15/09 2 b/gP Stm. maltophilia DSM958t 12/03 08/11 2 b/gP Stm. maltophilia DSM958t 04/08 27/07 1,5 bP Bkh. cepacia LMG1222t 14/05 15/09 2 bP Bkh. cepacia LMG1222t 19/10 15/09 2 CYF Emp. breve LMG4011t 14/05 15/09 3 CYF Emp. breve LMG4011t 19/10 15/09 2 gP Klb. planticola DSM3069t 19/10 15/09 3 gP Klb. planticola DSM3069t 29/03 15/09 1,5 gP Psd. aureofaciens LMG1245t 19/10 15/09 2,5 gP Psd. aureofaciens LMG1245t 29/03 15/09 1,5 gP Klb. pneumoniae DSM30102t 19/10 15/09 2,5 gP Klb. pneumoniae DSM30102t 29/03 15/09 1,5 hGC Rho. rhodochrous DSM43241t 12/03 08/11 2 hGC Rho. rhodochrous DSM43241t 12/03 17/10 II 2 hGC Rho. rhodochrous DSM43241t 12/03 17/10 I 2 hGC Rho. rhodochrous DSM43241t 14/05 08/11 2 hGC Rho. rhodochrous DSM43241t 19/10 07/08 2 hGC Rho. rhodochrous DSM43241t 04/08 27/07 1,5 Isolat: BIOLOG-Id Code Gel PCR CDC.IIh CDC.IIh CDC.IIh CDC.IIh N:HAL N:HAL N:COM N:COM N:COM N:COM N:MET N:MET nb nb ACN.JOH ACN.JOH nb nb nb nb nb nb MRX.LIN MRX.LIN 13/12 07/12 13/12 07/12 23/03 23/03 07/12 07/12 13/12 13/12 13/12 07/12 15/05 23/03 13/12 07/12 15/05 23/03 15/05 23/03 22/03 23/03 17/05 17/05 10/11 10/11 10/11 10/11 18/01 17/10 10/11 10/11 10/11 10/11 10/11 10/11 14/02 14/02 10/11 10/11 18/01 18/01 14/02 14/02 07/03 14/02 10/04 10/04 SA5-30 SA5-30 SA5-11 SA5-11 SA8-102 SA8-102 SA5-37b SA5-29b SA5-37b SA5-29b SA5-42 SA5-42 SA8-122 SA8-122 SA5-16 SA5-16 SA8-091 SA8-091 SA8-115 SA8-115 SA8-145 SA8-145 SA8-040 SA8-040 DNA 10/95 05/94 II I 05/94 II 05/94 II I ul 1,5 3 1,5 3 2 1,5 1,5 2 1,5 2 1,5 3 1,5 2 1,5 2 1,5 3 1,5 3 1,5 I 2 1,5 2 Abb. 3.16 Reproduzierbarkeit der TGGE - Datenbank C2 GELCOMPAR 4.0 (Pearson Product Moment Correlation fine, Unweighted Pair Group Average) [BG: Bakteriengruppe; β-,β/γ-,γ-Proteobakterien, CYF, Gram-pos. hoch / niedrig GC, s. Abb. 3.17-18; ID: Identifikation; Datum und Nr. vom Gel, der PCR und DNA; ul: µl Auftragsvolumen] 3-93 3-94 Ergebnisse Aufgrund eines Defektes mußte die Thermoplatte der TGGE zwischenzeitlich ausgetauscht und die Laufbedingungen überprüft werden. Es ergaben sich leicht veränderte Versuchsbedingungen (maximal 28mA / 300V, Lauflänge 3h 30min). Die Fragmente von Rhodococcus rhodochrous DSM43241t zeigten danach höhere Retention im Gel, so daß die Standards weniger als 85% Übereinstimmung mit den vorherigen Gelen aufwiesen. Da hier die Positionen von nur ein bis maximal fünf Banden über die Gleichheit von Stämmen entscheidet, hätte gleiche Normierung beider Gelreihen zu größeren Ungenauigkeiten in der Clusterdefinition geführt: Scharfe Banden höherer Retention aus der zweiten Serie würden durch eine derartige Normierung in die Breite gezogen, d.h. unscharf. Um die Trennschärfe zu erhalten, wurden die Gelreihen getrennt analysiert und gemeinsame Cluster über Doppelbestimmungen (Referenzstämme und Isolate) definiert. Diese zwei Datenbanken wurden im Folgenden mit C1 und C2 gekennzeichnet. 3.4.1.1 TGGE-Analyse der Referenzstämme Fraglich war, ob mit den 169 bis 194 Basen der variablen Region III der 16S rDNA die verschiedenen mit BIOLOG und FAME identifizierten Phyla ausreichend zu differenzieren sind. Zur Verifizierung der TGGE als genetische Screeningmethode wurden daher Referenzstämme getestet, die die größeren Gruppen der BIOLOG-Analyse repräsentierten. Gleichzeitig dienten die Bandenmustern dem Aufbau einer Datenbank zur Klassifikation der Isolate. Insgesamt wurden 91 Referenzstämme aus 29 Gattungen und 64 Arten mit der TGGE analysiert, davon wurden 51 Taxa in die zur Klassifikation der Isolate bestimmte Datenbank aufgenommen (siehe Liste der Referenzstämme, Material & Methoden Tab. 2.2). Da starke Unterschiede im G+C-Gehalt das Laufverhalten in der TGGE maßgeblich beeinflussen, wurde der Gehalt soweit möglich angegeben. Gram-negative Referenzstämme Nach den phänotypischen Bestimmungen war anzunehmen, daß die Proteobakterien den größten Teil der mit SA isolierten Sedimentpopulation ausmachen. Abb. 3.17 zeigt einen Auschnitt der mit GELCOMPAR 4.0 analysierten Proteobakteriengruppen mit den als kritisch identifizierten Taxa. Von den α- und β/γ-Proteobakterien wurden je 2 Gattungen mit 5 bzw. 6 Arten dargestellt, von den γ- und β-Proteobakterien je 3 Gattungen mit 13 bzw. 8 Arten. β/γ-Proteobakterien Die starke phänotypische und genotypische Ähnlichkeit der Xanthomonas-Arten untereinander und mit Stenotrophomonas maltophilia zeigte sich auch in der TGGE (63,5-69,2 mol% G+C10). 10 Angaben zum G+C-Gehalt nach Balows et al. [1991] Ergebnisse 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100 20 40 60 80 100 X.OOR L5047 X.FRA L708 X.POP L5743 X.CGR L726 X.CCA L568 Xanthomonas X.AXO L538 S.MLT L958 P.TAE L2336 P.RES L2274 P.PUA D291 P.ALC D50342 P.AER L1242 P.MEN D50017 P.FLA D50090 Pseudomonas P.FLC L1244 P.FLF L5168 P.CHL L1245 P.FLG L5167 ACN. D590 ß + y -Proteobakterien A.FAC L2193 P.OLE L2229 P.FLB D50106 Pseudomonas P.FRA D3456 P.PSA L1225 Comamonas C.TER L1253 A.KON L5691 A.TEM L7167 ß + y -Proteobakterien X.ALB L494 A.DEL L5934 C.ACI L1226 Klebsiella K.PLA D3069 Brevundimonas BV.DI L2089 P.AZO L2142 P.IND D3303 a-Proteobakterien SM.PR J7510 SM.PA D1098 SM.DE D30198 Comamonas C.TES L1800 Klebsiella K.PNE D30102 70°C BG 3-95 Stamm b/gP Xanthomonas oryzae oryzae LMG5047t b/gP Xanthomonas populi LMG5743t b/gP Xanthomonas fragariae LMG708t b/gP Xanthomonas campestris graminis LMG726 b/gP Xanthomonas camp. campestris LMG568t b/gP Xanthomonas polyphagus LMG538t1 b/gP Stenotrophomonas maltophilia LMG958t gP Pseudomonas taetroleans LMG2336t gP Pseudomonas resinovorans LMG2274t gP Pseudomonas putida A DSM291t gP Pseudomonas alcaligenes DSM50342t gP Pseudomonas aeruginosa LMG1242t gP Pseudomonas mendocina DSM50017t gP Pseudomonas fluorescens A DSM50090t gP Pseudomonas fluorescens C LMG1244 gP Pseudomonas fluorescens F LMG5168 gP Pseudomonas chlororaphis LMG1245 gP Pseudomonas fluorescens G LMG5167 gP Acinetobacter spec. DSM590 bP Acidovorax facilis LMG2193t gP Pseudomonas oleovorans LMG2229t gP Pseudomonas fluorescens B DSM50106 gP Pseudomonas gP Pseudomonas pseudoalcaliges LMG1225t bP Comamonas terrigena LMG1253t bP Acidovorax konjacii LMG5691 bP Acidovorax temperans LMG7167 fragi DSM3456t b/gP Xanthomonas albilineans LMG494t bP Acidovorax delafieldii LMG5934t bP Comamonas acidovorans LMG1226t gP Klebsiella planticola DSM3069t aP Brevundimonas diminuta LMG2089t aP Sphingomonas troeperi LMG2142t bP Pseudomonas indigofera DSM3303t aP Sphingomonas parapaucimobilis JCM7510t aP Sphingomonas paucimobilis DSM1098t aP Sphingomonas devorans DSM30198t bP Comamonas testosteroni LMG1800t gP Klebsiella pneumoniae DSM30102 Abb. 3.17 TGGE-Clusteranalyse der Proteobakterien-Referenzstämme - Datenbank C2 GELCOMPAR 4.0 (Pearson Product Moment Correlation fine, Unweighted Pair Group Average) [BG: Bakteriengruppe; aP,bP,b/gP,gP: α-,β-,β/γ-,γ-Proteobakterien] 3-96 Ergebnisse Ein homogenes Xanthomonas-Gattungscluster aus 6 der Arten zeigte höchste Ähnlichkeit zum Stenotrophomonas-Einzelcluster. Einzig Xanthomonas albilineans clusterte mit β-Proteobakterien der Gattung Acidovorax und Comamonas acidovorans. γ-Proteobakterien Die TGGE ermöglichte die Bestimmung der Pseudomonaden (67 mol% G+C10) auf Gattungs-, Art(Pseudomonas chlororaphis, P. fragi, P. pseudoalcaligenes) und Subspeciesniveau (P. fluorescens A, C, F, G). Die Gattung bildete zwei distinkte Hauptcluster mit 55 bis 60% Ähnlichkeit. Diese entsprachen nicht den von Moore et al. [1996] nach 16S rRNA-Analyse definierten intragenerischen Gruppen „Pseudomonas fluorescens“ [PfZ] und „P. aeruginosa“ [PaZ]. Auf dem 80%-Niveau waren in 3 TGGEClustern Arten beider Gruppen identisch: 1) Pseudomonas taetrolens [PfZ] und P. resinovorans [PaZ] 2) P. aeruginosa, P. alcaligenes, P. mendocina [PaZ] und P. putida A [PfZ] 3) Pseudomonas oleovorans [PaZ]. und P. fluorescens B [PfZ] Unabhängig von diesen Interspezies-Gruppen wurden die vier weiteren Pseudomonas fluorescens-Biotypen [PfZ], P. chlororaphis [PfZ] (nur 63,6 mol% G+C, Palleroni [1984]), P. pseudoalcaligenes und P. fragi [PaZ] deutlich unterschieden. Die Heterogenität der Arten P. fluorescens und P. putida wurde in der TGGE stark betont (P.putida B hier nicht gezeigt). Der Stamm Pseudomonas indigofera DSM3303 bildete ein eigenes Cluster. Die nächste Art laut TGGE war das α-Proteobacterium Sphingomonas trueperi LMG2142 (erst auf dem 63%-Niveau). Bereits die Fragmentlängen (P. indigofera ca. 228 bp, S. trueperi 208 bp) differenzierten die Stämme. Im BIOLOGTest (Bochner [1990]) zeigte P. indigofera entfernte Ähnlichkeit mit Deleya aesta (rRNA-Gruppe II, γ-Proteobakterien), phylogenetisch wurde sie bislang jedoch nicht klassifiziert (Kersters et al. [1996]). Die beiden Klebsiella-Arten (53-59 mol% G+C, Jones [1988]) wurden differenziert und durch die Mehrfachbandenmuster eindeutig von allen anderen Referenzstämmen unterschieden. Acinetobacter spec. DSM590 (Acinetobacter 38-47 mol% G+C, Vanbrabant et al. [1993]) war nicht von Acidovorax facilis LMG2193 zu unterscheiden. Die beiden Stämme bildeten eine Phylum-übergreifende Gruppe aus β- und γ- Proteobakterien. β-Proteobakterien Die Gattung Comamonas zeigte stark differierende Bandenmuster. Die Trennung entsprach den Unterschieden im 16S rRNA-Gen und korrellierte mit unterschiedlichem G+C-Gehalt: Comamonas acidovorans 66-68,5 mol% G+C, C. terrigena 64-66 mol% und C. testosteroni 62-64,5 mol%10). Ergebnisse Zones: [190-648] Clustering: UPGMAAlpha-Proteobakterien 1020 20 3040 40 5060 60 7080 80 90100 100 Sphingomonas Sphingomonas Sphingomonas Sphingomonas P.CAR D1083 RB.CA D1710 RB.SP D160 SM.YA J7371 SM.CA D30196 BV.DI L2089 SM.AD J7370 SM.PR J7510 SM.PA D1098 SM.DE D30198 O.CAR D1227 P.AZO L2142 ER.LO A33941 Pseudomonas carboxydohydrogena DSM1083t Rhodobacter capsulatus DSM1710t Rhodobacter sphaeroides DSM160 Sphingomonas yanoikuyae JCM7371t Sphingomonas capsulata DSM30196t Brevundimonas diminuta LMG2089t Sphingomonas adhaesiva JCM7370 Sphingomonas parapaucimobilis JCM7510t Sphingomonas paucimobilis DSM1098t Sphingomonas devorans DSM30198t Oligotropha carboxidovorans DSM1227 Sphingomonas troeperi LMG2142t Erythrobacter longus ATCC33941 List: #CYFGP Entries: 14 Correlation: Correlation - Fine Zones: Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe [190-648] und Gram-positive Clustering: UPGMA -1000 1020 100 203040 405060 607080 8090 100 RC.GL N12315 Rhodococcus TAB.T D2247 hGC RC.RO D43241 nGC TAB.E D2355 hGC G.VAG C3717 B.SUB D3258 C.JOH L1341 CYF SB.MI L8340 SB.SP L8347 CB.GL L8334 Chryseobacterium CB.IN L8337 F.ODO L1233 W.VIR L8350 CYF E.BRE L4011 Stamm Rhodococcus globerulus NCIMB12315 Rhodococcus rhodochrous DSM43241t Thermoanaerobacter ethanolicus DSM2355 Gardnerella vaginalis CCUG3717 Bacillus subtilis DSM3258 Flavobacterium johnsonii LMG1341t1 Sphingobacterium mizutae LMG8340t Sphingobacterium spiritivorum LMG8347t Chryseobacterium gleum LMG8334t Chryseobacterium indologenes LMG8337t Flavobacterium odoratum LMG1233t Weeksella virosa LMG8350 Empedobacter breve LMG4011t Abb. 3.18 TGGE-Analyse einzelner Bakteriengruppen - Datenbank C2 GELCOMPAR 4.0 (Pearson Product Moment Correlation fine, Unweighted Pair Group Average) [h/nGC: Gram-pos hoher / niedriger GC-Gehalt, CYF: Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe] 3-97 3-98 Ergebnisse Diese einfache Relation galt nicht für die Gattung Acidovorax: Acidovorax delafieldii (65-66 mol%), A. konjacii (67,7-68,4 mol%) und A. temperans (62-66 mol%) bildeten ein Gattungscluster, mit deutlich höherer Retention wurde A. facilis (64-65 mol%) einem weiteren Cluster zugewiesen (G+C-Gehalt nach Willems et al. [1992]). Beide Cluster waren taxonomisch indifferent: Das Acidovorax-Gattungscluster umfaßte auch Comamonas acidovorans und das β/γ-Proteobacterium Xanthomonas albilineans, die über 90% Ähnlichkeit zu Acidovorax delafieldii zeigten. Acidovorax facilis clusterte mit 86% Ähnlichkeit mit dem γ-Proteobacterium Acinetobacter spec. α-Proteobakterien Insgesamt umfaßte die Datenbank 13 α-Proteobakterien, deren detaillierte Clusteranalyse in Abb. 3.18 (oben) dargestellt wurde. Von den 7 Vertretern der Gattung Sphingomonas wurde auf dem 80%-Niveau lediglich drei in einem Cluster zusammengefaßt (S. parapaucimobilis, S. paucimobilis, S. devorans). Die Gattungen Brevundimonas, Erythrobacter, Oligotropha und Rhodobacter wurden differenziert, lediglich Rhodobacter capsulatus konnte von „Pseudomonas“ carboxydohydrogena nicht unterschieden werden. Die allgemeine Analyse der Proteobakterien (Abb. 3.17) zeigte ähnliches Laufverhalten der Sphingomonaden, Pseudomonas indigofera und Comamonas testosteroni. In diesem Fall waren sie mit 65 bzw. 58% Ähnlichkeit deutlich zu differenzieren, bei ähnlicher Bandenpositionen unbekannter Isolate kann die geringere Fragmentlänge der α-Proteobakterien als zusätzliches Entscheidungskriteium dienen. Das stabile 3 Banden-Muster von Brevundimonas diminuta war ausreichend distinkt vom 5 Banden-Muster für Klebsiella planticola. Referenzstämme der Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe Die TGGE-Analyse beschränkte sich für diesen phylogenetischen Hauptzweig der Bakterien (rRNASuperfamilie V, Segers et al. [1993]) auf hier isolierbare, möglicherweise habitatrelevante, aerobe Bakterien der 5 phylogenetischen Zweige: 1) Chryseobacterium-Bergeyella-Riemerella-Zweig: C. gleum, C. indologenes 2) Weeksella-Empedobacter-Zweig: W. virosa, E. breve 3) Sphingobacterium-Zweig: S. mizutae, S. spiritivorum 4) Flavobacterium flevensis-Zweig: F. johnsoniae 5) Flavobacterium odoratum-Zweig: F. odoratum Die Analyse von 8 Arten dieser 5 Zweige in Abb. 3.18 zeigte charakteristische Retentionszeit der Gruppe (siehe Bandenhöhe im Gel im Vergleich zu den Gram-positiven Stämmen). Diese korrelierte mit dem niedrigen G+C-Gehalt von 30-40 mol%10). Chryseobacterium bildete ein Gattungscluster. Sphingobacterium mizutae LMG8340 (39,3 mol%) und Flavobacterium johnsoniae LMG1341 (35,2-35,5 mol%, Ergebnisse Bernadet et al. [1996]) konnten nicht getrennt werden und dokumentieren eine Überlappung mit den phylogenetischen Zweigen 3) und 4). Nur vier der acht Stämme wurden auf Artebene unterschieden. Gram-positive Referenzstämme Drei Arten mit hohem (Rhodococcus rhodochrous, R. globerulus, Gardnerella vaginalis) und zwei mit niedrigem G+C-Gehalt (Thermoanaerobacter ethanolicus, Bacillus subtilis) wurden in die Datenbank aufgenommen. Rhodococcus (67-73 mol%10) bildete ein homogenes Gattungscluster (87% Ähnlichkeit) und zeigte ähnliches Laufverhalten wie Gardnerella (siehe Abb. 3.18). Der hohe G+C-Gehalt bedingte hohe Stabilität der Doppelhelix und geringe Retention im Gel. Die niedrig G+C-haltige Gattung Bacillus zeigte deutlich höhere Retention (55,1 mol%, Stackebrandt & Rainey [1995]). Thermoanaerobacter charakterisierte ein komplexes Bandenmuster. Die stärkste Bande lag auf der Höhe der Arten mit hohem G+C-Gehalt, die Bande geringster Retention lag im Bereich der Banden der Cytophaga-FlavobakterienBacteroides-Gruppe. Die unterschiedliche Fragmentlänge kann hier gegebenenfalls die Differenzierung der taxonomischen Gruppen erleichtern. Interpretation des Trennverhaltens Die verwendete Sequenzregion (E. coli-Position 357-533; nach Muyzer et al. [1993]) konnte unter den gewählten Bedingungen verschiedene Taxa nicht differenzieren. Die taxonübergreifenden TGGE-Cluster wurden für die folgende Charakterisierung der Isolate definiert und Isolate die mit diesen Gruppen durch Sequenzanalyse weiter bestimmt. Das Verhalten der Fragmente in der TGGE war nur praktisch oder durch Simulation mit dem POLANDProgramm zu bestimmen. Aufgrund des Arbeitsaufwandes war die Simulation im Vorfeld der Praxisversuche nicht für alle Bakteriengruppen mit bekannter 16S rDNA-Struktur durchführbar. Faktisch konnten daher erst durch den Aufbau der Datenbank TGGE-bestimmter Referenzstämme die kritischen TaxonÜbergänge und Cluster bestimmt werden. Zur Interpretation dieser Cluster wurden in Tab. 3.10 die alignten 16S rDNA-Sequenzen der Referenzstämme im Bereich der TPCR verglichen. Die vorhandenen Unterschiede manifestierten sich in hypervariablen Region III der 16S rDNA, d.h. der Schleife („Loop“) um E.coli-Position 460 (durch Fettdruck markierte Basen der Position 94-124 in Tab. 3.10). Von den bestimmten Clustern enthielten zwei β- und γ-Proteobakterien. Diese Cluster wurden als „β+γ-Proteobakterien“-Gruppen definiert und umfassten die folgenden Referenzstämme: 1) Acidovorax facilis LMG2193 [β], Acinetobacter spec. DSM590 [γ] 2) Acidovorax delafieldii LMG5934, A. konjacii LMG5691, A. temperans LMG7167, Comamonas acidovorans LMG1226 [β], Xanthomonas albilineans LMG494 [β/γ] 3-99 Tab. 3.10 Sequenzen der TGGE-Referenzstämme 16S rDNA / rRNA-Sequenzen (E. coli-Position 357-533; ohne Primer 16F341, 16R534) Sequenzen 1 Escherichia coli Brevundimonas diminuta ATCC11568 (LMG2089t)2 Erythrobacter longus str. OCh 1012 Sphingomonas capsulata ATCC14666 (DSM30196t)2 Sphingomonas devorans ATCC10829 (DSM30198t)2 Sphingomonas paucimobilis DSM1098t5 Acidovorax delafieldii LMG5943t6 Acidovorax facilis LMG 2193t6 Burkholderia cepacia ATCC25416t (LMG1222t)9 Ralstonia solanacearum ATCC11696 (LMG2299t)10 Comamonas acidovorans LMG1226t6 Comamonas terrigena LMG1253t6 Comamonas testosteroni ATCC11996t (LMG1800t)2 Hydrogenophaga pseudoflava LMG5945t6 Stenotrophomonas maltophilia LMG958t8 Xanthomonas albilineans LMG494t8 Xanthomonas campestris campestris LMG568t8 Xanthomonas campestris graminis LMG7268 Xanthomonas polyphagus LMG538tt18 Acinetobacter spec. DSM5904 Pseudomonas alcaligenes DSM503424 Pseudomonas chlororaphis DSM50083t4 Pseudomonas fluorescens A DSM50090t (LMG1794t)4 Pseudomonas mendocina DSM 50017t4 Pseudomonas putida A DSM 291t4 Pseudomonas stutzeri CCUG11256t (LMG1119t)4 Pseudomonas taetrolens LMG2336t4 Pseudomonas pseudoalcaligenes DSM50188t (LMG1225t)4 Flavobacterium johnsoniae LMG1341t14 Chryseobacterium gleum ATCC359102 Chryseobacterium indologenes ATCC298972 Empedobacter breve LMG4011t4 Flavobacterium odoratum ATCC4651 (LMG1233t)2 Sphingobacterium mizutae ATCC33299t2 Sphingobacterium spiritivorum ATCC33861t2 Rhodococcus globerulus NCIMB12315t7 Rhodococcus rhodochrous ATCC 13808t (DSM43241)3 BG gP aP bP b/gP gP CYF hGC 1.......10........20........30........40........50........60..-......70........80 UGGGGAAUAUUGCACAAUGGGCGCAAGCCUGAUGCAGCCAUGCCGCGUGUAUGAAGAAGGCC-UUCGGGUUGUAAAGUACU UGGGGAAUCUUGCGCAAUGGGCGAAAGCCUGACGCAGCCAUGCCGCGUGAAUGAUGAAGGUC-UUAGGAUUGUAAAAUUCU UGGGgaAUCUUAGACAAUGGGCGAAAGCCugAUCUAGCCAUGCcGcgUGAGUGAUGAAGGCC-cUAGGGUCGUAAAGCUcu UGGgGAAUAUUGGACAAUGGGCGCAAGCCuGAUCCAGCAAUGCCGcgUgAGUGAUGAAGGCC-UUCGGGUCGUAAAGCUCU UGGGGaAUAUUGGACAAUGGGCGAAAGCCugAUCCAGCAAUGCCGcgUGAGUGAUGAAGGCc-NUAGGGUUGUAAAGCUNU TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCC-CTAGGGTTGTAAAGCTCT TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAACTGCT TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAACTGCT TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAAGCACT TGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAAGCACT TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAACTGCT TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAACTGCT UGGGGAAUUUUGGACAAUGGGCGAAAGCCUGAUCCAGCAAUGCCGCGUGCAGGAUGAAGGCC-CUCGGGUUGUAAACUGCU TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGCAGGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAACTGCT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAAGCCCT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAAGCCCT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAAGCCCT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAAGCCCT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGTTGAAGAAGGCC-TTCGGGTTGTAAAGCCCT TGGgGAatatTGGACaATGGGGggAAcCCTGATCCAgCCATgCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC-TTATGGTTGTAAAGCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAGCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAGCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGNCTGATCCAGNCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAGCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAGCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAGCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAGCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAASCACT TGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAGCACT TGGSGAAtaTTGGACaATGGGgGAAAcCCTGATCCAgCCATgCCGCGTGTGTGaAGAAGGTC-TTCGGATTGTAAAgCACt UGAGGAAUAUUGGACAAUGGGUGCGAGCCuNAUCCAGCCaUCCcgCGUGAAGGACGACGGCCCUAUGGGUUGUAAACUucu UGAGGAAUAUUgGACAAUGGGUGAGAGCCugAUCCAGCCAUCCcgCGUGAAGGACGACGGcccuaUGGGUUGUAAACUNcU TGAGGAataTTGGACaATGGGTGGAAgCCTGATCCAgCCATCCCGCGTGTAGGACGACtgCCTTATGGGTTGTAAACTACT UGAGGAAUAUUGGUCAAUGGAGGCAACUCUgAACCAGCCAUGCCgcgUGCAGGAUGACGGUCCUAUgGAUUGUAAACUgcN UAAGGAAUAUUgGUCAAUGGGGGcAACCCNgAACCAGCCAUGCCGcGUGCAGGACGACUGCCCUAUGGGUUGUAAACUGcu UAAGGAAUAUUGGUCAAUGGAGGGAACUCUNAACCAGCCAUGCCGcGUGCAGGAUGACUGCCCUAUGGGUUGUAAACUGCu TGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGACGACGGCC-TTCGGGTTGTAAACCTCT TGGGGAATyTTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCC-TTCGGGTTGTAAACCTCT Sequenzen Escherichia coli1 -Position [357;533] Brevundimonas diminuta ATCC11568 (LMG2089t)2 Erythrobacter longus str. OCh 1012 Sphingomonas capsulata ATCC14666 (DSM30196t)2 Sphingomonas devorans ATCC10829 (DSM30198t)2 Sphingomonas paucimobilis DSM1098t5 Acidovorax delafieldii LMG5943t6 Acidovorax facilis LMG 2193t6 Burkholderia cepacia ATCC25416t (LMG1222t)9 Ralstonia solanacearum ATCC11696 (LMG2299t)10 Comamonas acidovorans LMG1226t6 Comamonas terrigena LMG1253t6 Comamonas testosteroni ATCC11996t (LMG1800t)2 Hydrogenophaga pseudoflava LMG5945t6 Stenotrophomonas maltophilia LMG958t8 Xanthomonas albilineans LMG494t8 Xanthomonas campestris campestris LMG568t8 Xanthomonas campestris graminis LMG7268 Xanthomonas polyphagus LMG538tt18 Acinetobacter spec. DSM5904 Pseudomonas alcaligenes DSM503424 Pseudomonas chlororaphis DSM50083t4 Pseudomonas fluorescens A DSM50090t (LMG1794t)4 Pseudomonas mendocina DSM 50017t4 Pseudomonas putida A DSM 291t4 Pseudomonas stutzeri CCUG11256t (LMG1119t)4 Pseudomonas taetrolens LMG2336t4 Pseudomonas pseudoalcaligenes DSM50188t (LMG1225)4 Flavobacterium johnsoniae LMG1341t14 Chryseobacterium gleum ATCC359102 Chryseobacterium indologenes ATCC298972 Empedobacter breve LMG4011t4 Flavobacterium odoratum ATCC4651 (LMG1233t)2 Sphingobacterium mizutae ATCC33299t2 Sphingobacterium spiritivorum ATCC33861t2 Rhodococcus globerulus NCIMB12315t7 Rhodococcus rhodochrous ATCC 13808t (DSM43241)3 ........90.......100.....-..110.......-120.......130.......140.......150.......160 UUCAGCGGGGAGGAAGGGAGUAAAG-UUAAUACCUUUGC-UCAUUGACGUUACCCGCAGAAGAAGCACCGGCUAACUCCGUG UUCACCGGrGACGA-------------UAAU--------------GACGGUACCCGGAGAAGAAGCCCCGGCUAACUUCGUG UUCGCCAGGGAUGA-------------UAAU--------------GACAGUACCUGGuaAAGAAgCCCCGGCUAACUCCGUG UUUACCAGGgNUGA-------------UAAU--------------GACAGUACCUGGAGAAUAAGCUCCGGCUNaCUCCGUG UUUACCCGGGAAGA-------------UAAU--------------GACUGUACCGGgaGAAUaAGCCCCGGCUAACUCCGUG TTTACCCGGGAAGA-------------TAAT--------------GACTGTACCGATAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTG TTTGTACGGAACGAAAAGACTCTGG-TTAATACCCTGGG-TCCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG TTTGTACGGAACGAAAAGACTCCTT-CTAATAAAGGGGG-TCCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG TTTGTCCGGGAAGAAATCCTTGGCT-CTAATACAGCCGG-GGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG TTTGTCCGGAAAGAAATCGCTTCGG-TTAATACCTGGAG-TGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGGACCGGCTAACTACGTG TTTGTACGGAACGAAAAAGCTTCTC-CTAATACGAGAGG-CCCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG TTTGTACGGAACGAAAAGCTTCGGG-TTAATACCCTGGA-GTCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG UUUGUACGGAACGAAAAGCCUGGGG-CUAAUAUCCCCGG-GUCAUGACGGUACCGUAAGAAUAAGCACCGGCUAACUACGUG TTTGTACGGAACGAAACGGTCTGGG-TTAATACCCTGGA-CTAATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG TTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGG-TTAATACCCGGTT-GGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTTGTTGGGGAAGAAAAGCAGTCGG-TTAATACCCGATT-GTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTTGTTGGGAAAGAAAAGCAGTCGG-TTAATACCCGATT-GTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTTGTTGGGAAAGAAAAGCAGTCGG-TTAATACCCGATT-GTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTTGTTGGGAAAGAAAAGCAGTCGG-TTAATACCCGATT-GTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTAAGCGAGGAGGAGGCTCTCTTGG-TTAATACCCaAGA-TGAGTGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCtaACTCTGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGTACTTAC-CTAATACGTGANT-ATNTTGACGTTACCNACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGTACTTAC-CTAATACGTGAGT-ATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG TTAMGTTGGGAGGAAGGGCATTAAC-CTAMTACGTTAGT-GTTTCGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAAC-CTAATACGTTAGT-GTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAAC-CTAATACGTTAGT-GTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAG-TTAATACCTTGCT-GTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTANC-CTAATACGTTAGT-NTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAG-CTAATACCTTGCT-GTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG TTAAGTTGGGAGGAAGGGCTTgCGG-CTAATACCTgCaA-GTTTTgACGTaACCAACAGAATAAGCACCGGCtAACTCTGTG uUUGUAuAGGGAUNAAC-CUNCuCU--CGUg--AGAGUA-G--CUgAAGGUACUAUaCGAAUAAGCACCGGCUaaCUCCgUG UUUGUAuAGGGAUAAAC-CUgCNCU--CGUG--AGAGUA-G--CUgAAGGUACUAUACGAAUAAGCaCCGGCUNaCUCCGUG TTTATCTGGGGATAAAC-CTACTCA--CGTG--TGAGTA-G--CTGAAGGTACCAGAAGAATAAGCACCGGCtaACTCCGtG uUUGUACGGGAAGAAAU-GUAAUUA--CGUG--UAAUUA-U--UUGACGGUACCGuAAGAAUAAGGAUCGGCUNaCUCCGUG uUUGUUAGGGAAUAAAC-CccGCUA--CGUG--UAGCGG-G--cUgAAUGUACCUNAAGAAUAAGGAUCGGCUaACUCCGUG UUUGUCGGGGAAUAAAC-CUACGUU--UGUA--AACGUA-G--CUGAAUGUACCCNAAGAAUAAGGAUCGGCUAACUCCGUG TTCAGCAGGGACGAAGC---------GCAA-------------GTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTG TTCAGCAGGGACGAAGC---------GAAA-------------GTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTG ∑bp 160 135 135 135 135 135 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 155 155 155 155 155 155 140 140 3-102 Ergebnisse Legende (Tab. 3.10): Fettdruck Sequenzunterschiede aP, bP, b/gP, gP Anzahl Basen der Sequenz CYF ∑bp BG Bakteriengruppen hGC Quellennachweis der Sequenzen 1 RNAS 75 (10), 1978; FEBS Letter 94, S.152, 1978 2 RDP Database 3 R. Cowan, PCR direkt 4 E. Moore 1996, PCR direkt 5 A. Arnscheidt, PCR direkt α-, β-, β/γ-, γ-Proteobakterien Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe Gram-positive Bakterien mit hohem G+C-Gehalt 6 7 8 9 10 Y. Shouche, 16S rDNA; PCR direkt, P. DeVos Asturias et al. 1993 L. Hauben 1996, 16S rDNA, PCR direkt EMBL M22518 EMBL X67036 Die Sequenzen zeigten in dieser Position keine spezifische Basenfolge (Tab. 3.10). Xanthomonas-Arten und Stenotrophomonas zeigten eine TTAATACC-Folge im Loop (Basen 106-113), aber auch Verteter der γ- und β-Proteobakterien. Die in der TGGE beobachtete Ähnlichkeit bewiesen die Acinetobacter [γ] und Acidovorax [β]-Sequenzen. In der hypervariablen Region wich Acinetobacter stark von Pseudomonas[γ] ab. Die Basen 9, 50, 78, 87, 122 zeigten Unterschiede zu den β-Proteobakterien der Rubrivivax gelatinosus-Gruppe und der Pseudomonas-Untergruppe (Gruppendefinition nach RDP). Diese Sequenzunterschiede sollten bei Optimierung auf diese Stämme mit der TGGE zu bestimmen sein. Bei Anwendung auf einen weiten Bereich an bakteriellen Taxa ging diese Spezifität offensichtlich verloren. Theoretisch ist aber auch denkbar, daß sich in der TGGE die Basenunterschiede zweier Sequenzen gegeneinander aufheben, daher wurde das Verhalten der Fragmente simuliert. Abb. 3.19 zeigt die Temperaturplots für die TPCR der definierten „β+γ-Proteobakterien“-Gruppen. Zum Vergleich wurden die zur TGGE-Optimierung und als Gel-Standards eingesetzten Stämme Rhodococcus rhodochrous DSM43241 [hoher G+C-Gehalt], Comamonas testosteroni LMG1800 [β] und Stenotrophomonas maltophilia DSM958 [β/γ] mitberechnet. Die simulierten Temperaturwerte lagen etwa 10°C höher als in der Praxis. Die erheblichen Differenzen in der Schmelzregion bis Position 114 bewiesen, daß die erste „β+γ-Proteobakteriengruppe“ mit Acinetobacter spec. DSM590 [γ] und Acidovorax facilis LMG2193 [β] (Abb. 3.19, rechts) in der TGGE trennbar sein sollte, hier aber keine optimale Trennung erzielt wurde. Für die zweite Gruppe wurde das Schmelzverhalten anhand der Sequenzen von Acidovorax delafieldii LMG5934, Comamonas acidovorans LMG1226 [β] und Xanthomonas albilineans LMG494 [β/γ] simuliert (Abb. 3.19, Mitte). Die Ähnlichkeit der Schmelzkurven von A. delafieldii und X. albilineans bestätigten die TGGE-Gruppierung. Die gewählte Sequenzregion war zur Trennung dieser beiden Taxa ungeeignet. C. acidovorans zeigte dagegen deutlich divergierende Schmelztemperaturen und sollte trennbar sein. Die Divergenz von X. albilineans zur Xanthomonas / Stenotrophomonas-Gruppe manifestierte sich in den Basen bis Position 114, während die Divergenz von C. acidovorans zur Gattung Comamonas in der zweiten Sequenzhälfte zum Tragen kam. Ergebnisse Simulation des Schmelzverhaltens in der TGGE Poland V1.1, Temperaturplot Reaktion 2. Ordnung, 50% Schmelzwahrscheinlichkeit Gram-positiv, hoch GC + α -Proteobakterien 79 β + β /γ -Proteobakterien β + γ -Proteobakterien Schmelztemperatur [°C] Rho.rho DSM43241 Rho.glo NCIMB12315 Acx.del LMG5943 Xan.alb LMG494 Com.aci LMG1226 Acx.fac LMG2193 Acn.spec. DSM590 Com.tes LMG1800 77 Ery.lon Och101 Com.tes LMG1800 Com.tes LMG1800 75 Stm.mlt DSM958 Spm.pau DSM1098 73 Stm.mlt DSM 958 1 26 51 76 101 126 151 176 201 226 1 26 51 76 101 126 151 176 201 226 Sequenz-Position 1 26 51 76 101 126 151 176 201 226 Standards Abb. 3.19 Simulation des Trennverhaltens kritischer Taxa in der TGGE Aus den Simulationen konnte zum einen gefolgert werden, daß die TGGE noch weiter optimierbar ist. Zum anderen, daß das gewählte Sequenzfragment nur begrenzt zur Trennung der Taxa geeignet war. Die Gültigkeit der genetischen „β+γ-Proteobakterien“-Gruppen wurde bewiesen. Ähnliches Laufverhalten wurde für Sphingomonas [α], Comamonas testosteroni [β] und den Stamm Pseudomonas indigofera [?] beobachtet (Abb. 3.17). Mit 60-65% Ähnlichkeit liefen die Banden auf nahezu gleicher Höhe im Gel, konnten aber zusätzlich durch die Fragmentlänge unterscheiden werden. Im 2,5%igen NuSieve-Agarose-Gel waren die 25 Basen kürzeren TPCR-Fragmente der α-Proteobakterien zuverlässig zu bestimmen, obwohl die Analyse mit dem EASY-System (Vergleich mit dem Marker pBR HAE III) zumeist überhöhte Werte ergab: Die 208 b langen Fragmente der α-Proteobakterien wurden mit bis zu 220 b bestimmt, die 228 b langen Fragmente der β- und γ-Proteobakterien mit bis zu 240 b. Durch die Verwendung von Referenzstämmen war dieser Fehler zu vernachlässigen. Die Größenunterschiede konnten allgemein als zusätzliches Kriterium zur Analyse der TGGE-Cluster herangezogen werden (vergleiche Tab. 3.10). Die getesteten α-Proteobakterien unterschieden sich ebenso wie die Gram-positiven Bakterien mit hohem G+C-Gehalt durch die geringere Länge der TGGEPCR-Fragmente (135 bzw. 140 Basen) deutlich von den β- und γ-Proteobakterien (160 Basen) und der Bacteroides-Flavobakterien-Gruppe (155 Basen). 3-103 3-104 Ergebnisse Charakteristische Unterschiede im Loop um E.coli-Position 460 und weiteren einzelnen Basen (z.B. in Position 41, 136, 145) sollten ausreichende Differenzierung von Caulobacter, der Sphingomonas-Gruppe [α] und den Rhodococcen [hGC] trotz nahezu gleicher Fragmentlänge ermöglichten (Tab. 3.10). Das Schmelzverhalten wurde für die Gram-positiven, hoch G+C-haltigen Bakterien Rhodococcus globerulus NCIMB12315 und R. rhodochrous DSM43241 sowie die α-Proteobakterien Erythrobacter longus Och101 und Sphingomonas paucimobilis DSM1098 simuliert (Abb. 3.19, links). Das ähnliche Schmelzverhalten bestätigte die Identität der Rhodococcen (86% Cluster-Niveau) im Versuch, d.h. die Sequenzunterscheide reichten zur Differenzierung unter den hier gewählten Bedingungen nicht aus. Die Fragmente der hoch G+C-haltigen Bakterien (208b) zeigten im Vergleich mit α-Proteobakterien (203b) 2-4°C Differenz der Schmelztemperaturen. Im TGGE-Gel entsprach dies einer ausreichenden Trennstrecke von 3,4 cm zwischen Rhodococcus rhodochrous DSM43241 und Sphingomonas paucimobilis DSM1098. Der Vergleich der Gram-positiven Referenzstämme und Vertretern der Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe (CYF; nach RDP: Bacteroides, Flavobakterien & Verwandte) in Abb. 3.18 veranschaulicht, daß eine Aufteilung der TGGE nach Stämmen mit Banden geringerer Retention (Gram-positive Bakterien) und höhere Retention (CYF), in entsprechend optimierten TGGE-Gelen etwa doppelte Trennstrecke ermöglichen würde. Dadurch wäre z.B. eine wesentlich höhere Trennschärfe für die hoch G+C-haltigen Bakterien zu erreichen. In der hier angewandten Methode wurde die Trennung von Gardnerella und Rhodococcus erst auf den letzten Milimetern des Geles erzielt, die Rhodococcus-Arten konnten experimentell nicht getrennt werden. Die Optimierung für Banden höherer Retention würde wahrscheinlich auch eine Trennung der CYF auf Gattungsebene und die Differenzierung der „β+γ-Proteobakterien“-Cluster ermöglichen. 3.4.1.2 TGGE-Analyse der Isolate Insgesamt wurden 135 Isolate dem Screening unterworfen und 41 TGGE-Cluster (TCl) mit ein bis maximal 27 Isolaten definiert. Von den Clustern der beiden Datenbanken C1 und C2 konnten fünf durch Einbeziehung von Doppelbestimmungen und Referenzstämmen als identisch nachgewiesen werden. In der TGGE-Analyse der beiden Datenbanken (Teil I-II, Abb. 3.20 - Abb. 3.21, siehe Legende Abb. 3.21) wurden diese Cluster gleich numeriert und mit Fettdruck markiert (Tcl 8, 9, 14, 19, 21). Aufgrund des des Datenumfangs konnten in die grafische Darstellung lediglich Referenzstämme mit Bedeutung für die Zuordnung der Isolate eingebracht werden. Die Beschriftung der Isolate gibt deren Zuordnung zu den BIOLOG-Clustern (BCl) wider, die Identifikation mit dem System (abgekürzt mit 3-Buchstaben-Code) sowie die angenommene Bakteriengruppe (BG). Die Gelspuren („Tracks“) in Teil II, Datenbank C2, zeigten vielfach stärkeren Hintergrund als im Teil I (Datenbank C1). Dieser Effekt war auf das Wachstumsverhalten der analysierten Isolate zurückzuführen: Isolate mit derartigen Tracks waren phänotypisch nicht bestimmbar (mit BIOLOG, FAME), langsam Ergebnisse wachsend, die Effizienz der DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation gering. Die TPCR-Signale im Agarosegel (zur Fragmentlängenbestimmung und Quantifizierung) waren so schwach, daß die Auftragungsmenge für das TGGE-Gel stark erhöht werden mußte (4-6µl, statt normal 1-2µl). Die scheinbaren „Mehrfachbanden“ in TCl 26, 28, 8 sind entsprechend Hintergrundsignale, die bei dieser Charge TaqPolymerase auch in der in gleicher Menge aufgetragenen Negativkontrolle zu beobachten waren. Durch die gewählte Hintergrundreduktion wurde die Berechnung der genetischen Gruppen nach den „eigentlichen“ Banden nicht beinträchtigt (siehe Abschnitt Reproduzierbarkeit). Die Isolate bildeten charakteristische, deutlich abgegrenzte Cluster. Die TGGE-Analyse verschiedener BIOLOG-Gruppen sollte Informationen über den genetischen Hintergrund liefern. Die BIOLOG-Analyse teilte die Isolate in Gruppen auf, deren Homogenität und Identität zum Teil fraglich erschienen und durch die FAME-Analyse nur begrenzt verifizierbar waren. Die Ergebnisse der drei Methoden (BIOLOG, FAME, TGGE-Screening) wurden vergleichend in Tab. 3.11 zusammengefaßt. Die Tabelle beschrieb die definierten TGGE-Cluster (TCl) nach Identität der Isolate (Gram-Verhalten; BIOLOG-Identifikation und BCL; FAME-Identifikation und Gram-Bestimmung), Referenzstämmen im Cluster, die daraus resultierende anzunehmende taxonomische Bakteriengruppe (BG) und Umfang der Cluster (∑TCL). Im Folgenden werden die Ergebnisse differenziert nach den angenommenen taxonomischen Hauptgruppen vorgestellt. Gram-positive Isolate und α-Proteobakterien (aP/GP-Cluster) TGGE-Cluster 1-6, 14 und 22 enthielten Gram-positive, BIOLOG-bestimmte Isolate. Die TPCR-Fragmente wurden zu ±210 bp bestimmt, entsprechend hoch G+C-haltigen Gram-positiven Stämmen oder auch α-Proteobakterien (siehe Sequenzen der Referenzstämme, Tab. 3.10). Die Cluster wurden durch das Retentionverhalten in 3 Gruppen unterteilt: 1) TCl 1-3: Banden liefen über fast die gesamte Trennstrecke, d.h. hoher G+C-Gehalt 2) TCl 4, 5, 22: Banden ca. 1 cm höher im Gel, d.h. etwa 2°C geringere Schmelztemperatur als 1) 3) TCl 6, 14: Banden auf gleicher Höhe wie die der Cluster mit Gram-negativen Isolaten und Referenzstämmen, wesentlich rascher retardiert als 1) und 2) Isolate in TCl 1 wurden anhand des Referenzstammes Rhodococcus rhodochrous und der BIOLOG-Ähnlichkeit des Isolates 24D-06 mit Rhodococcus als Bakterien mit hohem G+C-Gehalt definiert. Mit 24D-11 und 24D-15a enthielt das Cluster außerdem zwei Isolate des BCl C, die keine Ähnlichkeit mit Taxa in der BIOLOG-Datenbank aufwiesen. Den TCl 2 und 3 wurden zwei nicht identifizierte Isolate des 3-105 3-106 Ergebnisse 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 tgge0808 DSM43241 4 RC.RO T D43241 tgge0908 . 17 N:R.ER D06 tgge0908 . 14 N D15a tgge0908 h 15 1.00 Rco. N 15 D11 tgge0908 . 9 N:S.LE A10b tgge0808 h 21 0.945 Prp. nb 15S44 tgge0708 h 22 0.951 Prp. N:S.LE 1 5S46 tgge0908 h 11 1.00 Aur. A.HAE 14 CS03 tgge0708 a 18 1.00 Anc. N:R.RH 16 S032 tgge0908 h3 1.00 Aur. N:B.BR 15 N29 tgge0908 . 12 N:B.CT CS02 tgge0708 a 21 0.982 Azrh. N:D-2 S013 tgge0908 . 18 A.HAE D01 tgge0708 a 10 0.970 Mb/Rm nb S025 tgge2409 . 18 nb S081 tgge0908 . 5 M.LUT O30d tgge0908 a7 0.976 Zo/Mp/ N A29 tgge2409 . 17 nb S082 tgge1809 . 10 N D03 tgge1809 . 9 N D04b tgge1809 a 11 1.00 Zo/Mp/O N O07d tgge0510 b 18 1.00 Acx. A.CAV 19 S044 tgge2409 . 14 N:B.VE S029 tgge0510 . 11 N:A.HA S131 tgge0510 . 12 N:A.HA S068 tgge0510 . 14 N:A.HA S043 tgge0510 . 15 A.HAL S055 tgge0808 LMG1800 5 C.TES T L1800 tgge0808 . 14 nb S107 tgge0808 . 13 nb S132 tgge0808 . 17 nb S098 tgge2409 a 15 1.00 Mp/CA/B B.VES S020 tgge2809 DSM30196 24 SM.CA T D30196 tgge2409 a 11 0.988 Sm/Cau N:B.VE S079 tgge2409 b 16 0.977 Hy. N:P.ST 17 S016 tgge0510 . 10 N:A.HA S141 tgge0510 . 22 A.JOH S106 tgge2409 b8 0.982 Hy. P.PSA 17 S094 tgge2410 . 8 B.VES S127 tgge0808 b6 0.895 3CBP nb S074 1 tgge0908 . 13 nb CS01 tgge0708 a 12 1.00 Agb/Bb nb S007 tgge0708 a 17 0.988 Agb. B.INS 1 S038 tgge0708 a9 0.988 Agb. nb 1S046 tgge0808 . 12 nb S138 tgge0808 . 15 nb S100 tgge0708 a4 0.988 Agb/Bb N:B.ME S078 tgge0708 a3 0.986 Agb. nb 1 S066 tgge0708 a6 1.00 Agb/Bb nb S053 tgge0708 b 11 1.00 Acx. nb 19S021 tgge0510 b 17 0.994 Acx. A.FAE 1 S063 tgge2409 . 9 S.PUA S088 tgge2409 . 10 S.PUA S086 tgge2809 LMG958 9 S.MLT T L958 tgge2409 g 12 0.882 Stm. N:B.VE 1 S030 tgge2809 LMG1253 16 C.TER T L1253 tgge2410 b 10 0.950 Id. nb16 5S29a tgge1810 LMG5167 20 P.FLG L5167 tgge1810 LMG1242 18 P.AER T L1242 tgge2409 . 6 N:P.IM S099 tgge0808 . 11 nb S140 tgge0908 g 19 0.737 Xan. nb 1S057 tgge2409 . 21 nb S116 tgge0808 LMG1225 2 P.PSA T L1225 tgge2409 g 20 1.00 Psd. nb 19S060 tgge0808 g 20 0.988 Psd. nb 15S49 tgge2809 LMG2193 14 A.FAC T L2193 tgge0708 g5 0.975 Xan. nb 1S061 tgge0808 g 10 0.953 Acn. nb 1S144 tgge0708 g 14 0.954 Acn. N:D-2 1 S137 tgge2410 b 20 0.995 Acx. P.IMM 1 5S27 tgge2410 b 21 0.994 Acx. N:V.CY 1 5S04 tgge2410 . 22 N:V.CY 5S28 tgge2409 b4 1.00 Acx. N:P.ME 17 S125 tgge0510 g 16 0.990 Acn. A.FAE 1 S089 tgge0808 b 22 1.00 Acx. nb 195S18 tgge0510 . 21 A.JOH S130 tgge0510 . 20 N:A.JO S069 tgge0510 . 23 N:A.CA S096 tgge0908 . 6 N:A.HA O07e tgge0708 . 19 N:R.ER S027 tgge0708 h 20 1.00 Myb. N:R.ER 17 S026 tgge0908 h 20 0.971 Sta. nb 1 S028 tgge1809 c8 1.00 Fla/Flx nb D14 70°C Stamm / Isolat Rho. rhodochrous DSM43241t N:RHO 24D-06 N 24D-15a N 24D-11 N:STA ANT-10b nb SA5-44 N:STA SA5-46 ARC.HAE 4CS-03 N/ANC SA8-032 N:BRE NAP-29 N:BAC 4CS-02 N SA8-013 ARC.HAE 24D-01 nb SA8-025 nb SA8-081 MIC.LUT oXy-30d N/N:OCH ANT-29 nb SA8-082 N 24D-03 N 24D-04b N oXy-07d AER.CAV SA8-044 N SA8-029 N:ALT SA8-131 N:ALT SA8-068 N:ALT SA8-043 ALT.HAL SA8-055 Com. testosteroni LMG1800t nb SA8-107 nb SA8-132 nb SA8-098 BRV.VES SA8-020 Spm. capsulatus DSM30196t N SA8-079 N:PSD SA8-016 N SA8-141 ACN.JOH SA8-106 PSD.PSA SA8-094 BRV.VES SA8-127 nb SA8-074 nb 4CS-01 nb SA8-007 N:BAC SA8-038 nb SA8-046 nb SA8-138 nb SA8-100 N:BAC SA8-078 nb SA8-066 nb SA8-053 nb SA8-021 ALC.FAE SA8-063 SHE.PTA SA8-088 SHE.PTA SA8-086 Stm. maltophilia LMG958t N SA8-030 Com. terrigena LMG1253t nb SA5-29a Psd. fluorescens G LMG5167 Psd. aeruginosa LMG1242t N:PSY SA8-099 nb SA8-140 nb SA8-057 nb SA8-116 Psd. pseudoalc. LMG1225t nb SA8-060 nb SA5-49 Acx. facilis LMG2193t nb SA8-061 nb SA8-144 N/N:ACN SA8-137 PSY.IMM SA5-27 N SA5-04 N:VIB SA5-28 N SA8-125 ALC.FAE SA8-089 nb SA5-18 ACN.JOH SA8-130 N:ACN SA8-069 N:ACN SA8-096 N:ARC oXy-07e N SA8-027 N SA8-026 nb SA8-028 nb 24D-14 Cl BG hGC E C C B B G O/36 G G N G hGC aP? aP? hGC H ? D/11 aP? D B C/12 aP? 10 gP 44 44 44 44 44 gP bP 43 aP aP 18 22 4 29 20 45 gP gP aP H ? H ? 29 41 41 bP gP gP b/gP 44 bP gP gP 28 gP bP N/35 ? 42 gP 37 37 5 34 bP 29 34 34 G E E gP Abb. 3.20 TGGE-Clusteranalyse der Isolate, Teil I (73 Isolate) - Datenbank C1 GELCOMPAR 4.0 (Pearson Product Moment Correlation fine, Unweighted Pair Group Average) [BG: s. Abb. 3.16-18; Isolat: BIOLOG-Identifikation, Code; CL: BCl; Zahlen: TCl - fett: in C1 & C2] Ergebnisse 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 24 25 26 27 28 9 29 30 31 8 32 14 35 33 34 36 37 38 19 39 21 40 41 t150596a90.952nb Rsp. 1S147 t170596a11 0.979nb Acdp.S050 t200596a21 1.00 Mpl. N:P.AN 16 S008 t230396. 3 nb S145 t170596. 16 M.LIN S040 t170596b17 0.964nb Com. S037 1 t230396. 21 nb S073 t170596. 7 nb S064 t170596. 8 nb S059 t170596. 9 nb S058 t150596g20.975nb Xan. 1S062 t150596b30.990nb Com. S049 1 t230396. 19 nb S087 t230396. 22 nb S065 t230396. 14 N:D.AE S102 t230396. 16 nb S097 t150596. 18 nb S093 tgge2209 g 0.887 5 nb Acn. 1S002 t230396. 7 nb S122 tgge2003 DSM1098 22 SM.PA T D1098 tgge0712 a 0.993 14 IIH Mp/Cau 5S11 tgge0712 a 0.988 13 IIH Mp/Cau 5S30 t230396. 4 nb S139 t200596. 12 P.IMM 5S01 t230396. 10 nb S105 tgge2209 . 21 nb S133 tgge2003 LMG1800 17 C.TES T L1800 tgge1312 . 3 N:M.ME 5S42 tgge2209 . 18 nb S109 tgge1312 b 0.938 6 N:C.TS Alc/Bo 5S37b tgge1312 . 8 N:C.TS 5S29b tgge0712 b 0.964 17 B.ABO Tha. 1 5S34 t290396LMG2142 11 P.AZO T L2142 t150596a61.00 Agb/Bb nb S007 t150596. 16 nb S110 t230396. 5 nb S124 t230396. 8 nb S119 t200596. 18 nb D07 t200596b14 1.00 Acx. nb 19 O25a t240396LMG1242 10 P.AER T L1242 t200596. 2 N:M.BO 5S22 tgge0712 . 10 N:IIH 5S17b t240396DSM50106 5 P.FLB D50106 tgge0712 b 1.00 9 Acx. N:IIH195S33 tgge0712 . 11 N:IIH 5S12 tgge0712 b 0.995 19 A.RAD Acx. 1 5S26 tgge0712 b 0.995 15 N:B.AB Acx. 1 5S50 tgge0712 . 16 N:B.AB 5S13 t290396DSM590 23 ACN. D590 tgge2003 LMG2193 14 A.FAC t L2193 t170596. 2 nb S077 t200596. 6 M.ATL 5S09 t200596. 8 N:M.OS 5S08 t200596. 9 N:M.AT 5S07 tgge1312 b 0.984 9 C.TER Psd. 1 5S48 tgge2209 b 1.00 8 Acx. nb 195S43 tgge2209 b 1.00 11 Acx. nb 195S03 tgge1312 . 4 N:L.HY 5S31 t200596b41.00 Acx. M.ATL 19 5S14 tgge1312 b 1.00 5 Acx. L.HYA 19 5S45 t200596g20 0.979N:M.OS Xan. 1 S011 t200596b30.994M.BOV Acx. 1 5S20 t200596. 5 N:M.AT 5S10 tgge0712 . 20 A.RAD 5S17a t200596. 10 N:M.OS 5S05 t200596. 11 N:M.OS 5S02 tgge0712 b 0.965 21 A.JOH Acx. 1 5S16 t230396. 9 nb S115 t230396. 18 nb S091 70°C Stamm / Isolat nb SA8-147 nb SA8-050 N:PAS SA8-008 nb SA8-145 MRX.LIN SA8-040 nb SA8-037 nb SA8-073 nb SA8-064 nb SA8-059 nb SA8-058 nb SA8-062 nb SA8-049 nb SA8-087 nb SA8-065 N:HAL SA8-102 nb SA8-097 nb SA8-093 nb SA8-002 nb SA8-122 Spm. paucimobilis DSM1098t CDC.IIh SA5-11 CDC.IIh SA5-30 nb SA8-139 PSY.IMM SA5-01 nb SA8-105 nb SA8-133 Com. testosteroni LMG1800t N:MET SA5-42 nb SA8-109 N:COM SA5-37b N:COM SA5-29b N:BRU SA5-34 Spm. trueperi LMG2142t nb SA8-007 nb SA8-110 nb SA8-124 nb SA8-119 nb 24D-07 nb oXy-25a Psd. aeruginosa LMG1242t N:MRX SA5-22 N:IIh SA5-17b Psd. fluorescens B DSM50106 N:IIh SA5-33 N:IIh SA5-12 ACN.RAD SA5-26 N:BRU SA5-50 N:BRU SA5-13 Acn. spec. DSM590 Acx. facilis LMG2193t nb SA8-077 MRX.ATL SA5-09 N:MRX SA5-08 N:MRX SA5-07 COM.TER SA5-48 nb SA5-43 nb SA5-03 N:LAM SA5-31 MRX.ATL SA5-14 LAM.HYA SA5-45 N:MRX SA8-011 MRX.BOV SA5-20 N:MRX SA5-10 ACN.RAD SA5-17a N:MRX SA5-05 N:MRX SA5-02 ACN.JOH SA5-16 nb SA8-115 nb SA8-091 Cl BG 44 41 gP 39 48 49 aP CYF CYF 42 gP bP 32 32 32 41 aP aP gP 41 49 gP 49 38 41 41 41 gP gP bP 41 41 41 32 41 41 41 41 41 41 41 41 41 28 gP bP gP gP gP gP gP Abb. 3.21 TGGE-Clusteranalyse der Isolate, Teil II (61 Isolate) - Datenbank C2 GELCOMPAR 4.0 (Pearson Product Moment Correlation fine, Unweighted Pair Group Average) [BG: s. Abb. 3.16-18; Isolat: BIOLOG-Identifikation, Code; CL: BCl; Zahlen: TCl - fett: in C1 & C2] 3-107 3-108 Ergebnisse BCl B (BIOLOG: entfernt Staphylococcus-ähnlich) und ein nicht-bestimmbares Isolat zugeordnet. Das Laufverhalten sprach für Bakterien mit hohem G+C-Gehalt. Die TCl 4, 5, 6 und 14 enthielten BIOLOG- bzw. FAME-Identifikationen für Gram-positive, hoch G+Chaltige Bakterien, Identifikationen für α-Proteobakterien, Isolate fraglicher Identifikation aufgrund geringer Aktivität im BIOLOG-Test (vergleiche Scatterplot, Abb. 3.12) und Gram-negative Isolate die aufgrund geringen Wachstums nicht mit den Identifikationssystemen testbar waren (siehe Tab. 3.11). Da in der Fragmentlängenbestimmung nicht zwischen α-Proteobakterien und Gram-positiven Rhodococcen unterschieden werden konnte (nur 5 b Differenz, siehe Tab. 3.10) wurden die Cluster nach der Wahrscheinlichkeit der Identifikationen als „GP+aP“ bzw. „(GP)aP“ gekennzeichnet: TCl 4+5 =: GP+aP TCl 6+14 =: (GP)aP Die TCl 4 und 5 enthielten schwach aktive Isolate des BCl G, das durch die FAME-Analyse als Grampositiv mit hohem G+C-Gehalt bestätigt worden war (16-20% Aktivität; BIOLOG: Arcanobacterium, FAME: Aureobacterium). Die α-Proteobakterien in den Clustern waren nicht eindeutig oder falsch Gram-bestimmt worden (BCl 36 / O Ancylobacter aquaticus, FAME: Xanthobacter-ähnlich; BCl N unbestimmt, FAME: Xanthobacter flavus). Durch die hohe Retention der Banden war die Zugehörigkeit der TCl 6 und 14 zu den hoch G+C-haltigen Bakterien unwahrscheinlich. TCl 6 und 14 enthielten Gram-negative, nicht bestimmbare Isolate und Isolate des fraglichen BCl H (nur ca. 11% Aktivität; BIOLOG: Micrococcus, bzw. Bacillus-ähnlich, FAME: nicht bestimmbar). Darüberhinaus enthielt TCl 6 ebenfalls nicht eindeutig Gram-bestimmte α-Proteobakterien (BCl 11 / D Ochrobactrum-ähnlich, FAME: Ochrobactrum anthropi, BCl 12 / C unbestimmt, FAME: Agrobacterium) und Gram-positive Isolate ohne Ähnlichkeit mit Taxa in der Identifikationsdatenbank (BCl C, D). Isolate der TCl 6, 14 waren wahrscheinlich (überwiegend) α-Proteobakterien, der TCl 4, 5 Gram-positiv oder α-Proteobakterien . Die Cluster sollten durch Sequenzanalyse der 16S rDNA näher charakterisiert werden, insbesondere da neun der nicht phänotypisch zu bestimmenden Isolate diesen TCl zugeordnet wurden. Verifizierung Gram-positiver Identifikationen durch die TGGE (vergleiche Tab. 3.11) Isolate der Gram-positiven BIOLOG-Cluster B bis E (keine Ähnlichkeit mit Taxa in der BIOLOGDatenbank) wurden vor allem den TCl 1 bis 3 zugeordnet. Die Retention wies bei geringer Fragmentlänge auf stabile Doppelhelices mit hohem G+C-Gehalt hin. Zwei BCl E-Isolate gleicher Fragmentlänge zeigten stärkere Retention und clusterten mit einem nicht-identifizierten BCl G-Isolat in TCl 22. Die wenigen BIOLOG-Identifikationen der BCl G-J und zwei Isolate der BCl C, F waren durch die FAME-Analyse als hoch G+C-haltige Bakterien (zumeist Arthrobacter-Gruppe) bestätigt worden. Ergebnisse Durch die Verteilung der Isolate auf die TGGE-Cluster 4, 5, 22 wurde bestätigt, daß das BCl G verschiedene Gattungen umfaßt und bei geringer Aktivität erst bei ≤15% Divergenz auf Art-Niveau gruppiert wurde. Die BIOLOG-Arcanobacterium haemolyticum-Kerngruppe in BCl G (systematisch fehlidentifiziert, FAME: Aureobacterium) wurde beispielsweise entsprechend dem 13,5%-Niveau der BIOLOGAnalyse in die TCL 4 und 5 gesplittet. Die angenommene Artdifferenzierung wurde bestätigt. Die Differenzierung der FAME-Identifikationen für Aureobacterium esteroaromaticum (in TCl 4, 14, 22) bestätigte, daß es sich um mehr als eine Art handelte (nach SDS-PAGE-Analyse womöglich neue Arten, persönliche Mitteilung M.Vancanneyt). Die endgültige taxonomische Zuordnung erforderte die 16S rDNASequenzierung der Isolate. Für die sehr schwach aktiven Gram-positiven Isolate erwiesen sich die fraglichen BIOLOG-Identifikationen (vergleiche Scatterplot, Abb. 3.12) als nicht haltbar. Nach dem Verhalten in der TGGE waren Bakterien des BCl H (BIOLOG: ca. 11% Aktivität, nicht identifiziert oder Micrococcus; FAME: nicht bestimmbar) als α-Proteobakterien verschiedener Arten oder Gattungen anzusprechen: Zwei Isolate wurden TCL 14 zugeordnet (in der BIOLOG-Analyse ≤15% Differenz), ein drittes TGGE-analysierte Isolat dem TCl 6. Der schwache Wuchs der α-Proteobakterien war als ursächlich für die fehlerhafte Gram-positive Bestimmung anzunehmen. Gram-negative Isolate Die TGGE-Cluster 7, 8, 10-12, 15-21, 24, 25, 27-32, 36-40 waren durch Referenzstämme und Identifikationen den Gram-negativen Bakterien zuzuordnen. Nach der Bandenposition im Gel und der Ähnlichkeit mit den Gram-negativen Clustern waren die stoffwechselphysiologisch nicht-bestimmbaren Isolate der TCL 9, 13, 23, 26, 33-36 und 41 wahrscheinlich ebenfalls Gram-negativ. Insgesamt wurden 44 nicht bestimmbare Isolate innerhalb der 29 Cluster Gram-negativer Bakterien gruppiert. α-Proteobakterien Die TCL 9,10, 12, 24, 29 bis 32 wurden durch geringe Fragmentlänge (<215 b), Gram-negative Isolate im Cluster und Referenzstämme als α-Proteobakterien ausgewiesen. Sphingomonas capsulata (TCl 10), S. paucimobilis (TCl 29) und S. trueperi (ähnlich TCl 32) clusterten mit 4 Isolaten. Die BIOLOG- und FAME verifizierte Identifikation von Brevundimonas vesicularis (BCl 43) in TCl 10 wiederlegte eine Artidentifikation. TCl 12 enthielt eine Brevundimonas vesicularis-Identifikation die von der FAMEAnalyse nicht bestätigt wurde, wahrscheinlich wurde hier ein aberranter Stamm oder eine unbekannte Art erfaßt. Bei nahezu identischer Position der Banden enthielten dagegen die benachbarten Cluster TCl 11, 13, 28 etwa 228 b lange TPCR-Fragmente. Die Zugehörigkeit zu den α-Proteobakterien war durch γbzw. β-Proteobakterien-Identifikationen in TCl 11 eindeutig auszuschließen. TCl 13 und TCl 28 enthielten physiologisch nicht-bestimmbare, bzw. nicht identifizierbare Isolate (BCl 38, nicht identifiziert) die durch 3-109 3-110 Ergebnisse die TGGE als Gram-negativ, aber nicht näher charakterisiert wurden. Wahrscheinlich waren sie ebenfalls keine α-Proteobakterien, daher wurden die Cluster in Tab. 3.11 als „GN“ gekennzeichnet. Die Isolate in TCL 24-27 zeigten geringe Retention der kurzen Fragmente (<210 b), die Zuordnung zu den α-Proteobakterien blieb aber fraglich, da die Cluster vor allem physiologisch nicht bestimmbare, Gramnegative Isolate enthielten. Ein nicht identifiziertes Isolat des BCl 44 und eine fragliche Moraxella lincolnii-Identifikation des BCl 41 (beide nicht mit FAME bestimmbar) lieferten keine weitere Information. Die Zugehörigkeit zu den α-Proteobakterien war durch 16S rDNA-Sequenzierung zu prüfen, die Vorläufigkeit der Klassifikation wurde in Tab. 3.11 durch die Kennzeichnung „(aP)“ betont. β- und γ-Proteobakterien Ein einziges Isolat wurde in der TGGE durch den Referenzstamm Comamonas terrigena LMG1253 in TCL 17 eindeutig als β-Proteobacterium charakterisiert. Ebenfalls nur ein Isolat wurde anhand der Ähnlichkeit mit Stenotrophomonas maltophilia LMG958 in TCl 16 eindeutig den β/γ-Proteobakterien, d.h. der Xanthomonas / Stenotrophomonas-Gruppe zugeordnet. Insgesamt 6 Cluster wurden durch Identifikationen als γ-Proteobakteriengruppen charakterisiert: TCl 7 enthielt ein eindeutig als Aeromonas identifiziertes Isolat. TCl 18 und 20 bestimmten Pseudomonas-Referenzstämme und einer FAME-Identifikation für Pseudomonas. Die TCl 39 und 40 enthielten Acinetobacter bestimmte Isolate (BCl 28 A.johnsonii, BCl 41 A. radioresistens), deren BIOLOG-Identifikation aufgrund variablen Clusterverhaltens und geringer Aktivität verifiziert werden sollte. Mit dem Referenzstamm Acinetobacter spec. DSM 590 konnte die Gattungsidentität jedoch nicht bewiesesen werden. TCl 19 clusterte mit knapp 80% Übereinstimmung mit Pseudomonas fluorescens B. Die Klassifizierung von TCl 19, 39 und 40 als γ-Proteobakterien erfolgte unter Vorbehalt und wurde in Tab. 3.11 durch „(gP)“ gekennzeichnet. Vier weitere TGGE-Cluster enthielten β- und γ-Proteobakterien: 1) TCL 8 enthielt den Referenzstamm Comamonas testosteroni LMG1800 [β] und eine fragliche BIOLOG-Identifikation für Pseudoalteromonas haloplanktis [γ] des BCl 44, das nicht durch die Fettsäureanalyse bestimmt werden konnte. 2) Das TCl 11 enthielt γ-Proteobakterien-Identifikationen für Pseudomonas pseudoalcaligenes (BCl 20) und Acinetobacter johnsonii (BCl 29), von denen letztere durch die FAME-Analyse als Acidovorax delafieldii [β] widerlegt wurde. Mit den hier verwendeten Referenzstämmen der Gattungen wiesen sie jedoch keine Ähnlichkeit auf. 3) TCL 15 enthielt fragliche Identifikationen für Alcaligenes faecalis (BCl 29, [β]) und Shewanella putrefaciens (BCl 41, [γ]) die nicht durch die FAME-Analyse bestätigt wurden. Ergebnisse In allen drei Fällen war die Wahrscheinlichkeit der Identität der β-Proteobakterien am größten, daher wurden die Cluster in Tab. 3.11 mit „b+(gP)“ bezeichnet. TCL 21 umfaßte ein eindeutig Acinetobacter identifiziertes Isolat des BCl 29 und Isolate die nach FAME oder BIOLOG als Acinetobacter identifiziert wurden (FAME: BCL 34, BCL 35, BIOLOG: BCL 41). Weitere Isolate im Cluster entstammten den näher zu untersuchenden BCl 41 ([γ] Lampropedia, Moraxella), BCl 42 ([γ] Psychrobacter), BCl 32 ([β]Comamonas terrigena) und BCl 5 ([β] FAME: Hydrogenophaga pseudoflava). Diesen Bakterien gemeinsam war die geringe BIOLOG-Aktivität. Durch die Referenzstämme wurde TCL 21 als „β-+γ-Proteobakterien“-Cluster der Gattungen Acinetobacter und Acidovorax identifiziert (vergl. TGGE-Analyse der Referenzstämme) und daher als „b+gP“ gekennzeichnet. Verifizierung Gram-negativer Identifikationen durch die TGGE (vergleiche Tab. 3.11) BIOLOG identifizierte Xenobiotika-Isolate in BCl 9 als β/γ-Proteobakterien, bzw. Stenotrophomonas / Xanthomonas-Gruppe (S. maltophilia, X. campestris und ähnliche). Die TGGE identifizierte darüberhinaus ein Sedimentextrakt-Isolat (BCL 44 nicht identifiziert, TCL 16) über den Referenzstamm Stenotrophomonas maltophilia LMG958 als gruppenzugehörig. Die absolute Divergenz von BCl 9 und BCl 44 in der stoffwechselphysiologischen Charakterisierung durch BIOLOG und die Differenzierung der Referenzstämme Stenotrophomonas maltophilia und Xanthomonas albilineans vom Xanthomonas-Gattungscluster in der TGGE läßt für BCl 9 eine nicht erfaßte Art oder sogar Gattung der β/γ-Proteobakterien-Gruppe vermuten. Für diese Gruppe war die 16S rDNA-Sequenzanalyse angeraten. Die BIOLOG-Identifikation Moraxella lincolnii (γ-Proteobakterien) war aufgrund geringer Aktivität und der Inhomogenität des BCl 41 fraglich, die FAME-Analyse war nicht möglich und die TGGE definierte eine fragliche α-Proteobakteriengruppe (TCL 27). Die Sequenzanalyse war unerläßlich. Die taxonomische Zuordnung der mit BIOLOG als CDC IIh und -ähnlich bestimmten Isolate (CYF) in den benachbarten Clustern BCl 47, 48 und dem Einzelcluster BCl 38 war fraglich. Die TGGE-Analyse verteilte die Stämme auf die TCL 19, 30, 31, 38 und zeigte keine Ähnlichkeit zu den hier verwendeten Referenzstämmen der Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe (CYF). Die CDC IIh-Isolate in TCL 30, 31 wurden anhand von Bandenposition, Fragmentlänge und der Ähnlichkeit zum Referenzstamm Sphingomonas paucimobilis DSM1098t (TCL 29) als α-Proteobakterien identifiziert. Eines der drei CDC IIh-ähnlichen Isolate clusterte mit Pseudomonas fluorescens B DSM50106 (TCL 19) auf dem 80%Niveau, die beiden anderen bildeten das TCl 38 für das keine weitere taxonomische Informationen aus der TGGE abzulesen war. Während die Differenzierung der Stämme durch die BIOLOG-Clusteranalyse zu akzeptieren war, mußte die Identifikation verworfen werden. Von BIOLOG wurde die hier unwahrscheinliche halophile, bzw. marine γ-Proteobakterien-Gattung Pseudoalteromonas identifiziert und verschiedenen Gruppen zugeordnet (Kerngruppe in BCl 47, ähnliche 3-111 3-112 Ergebnisse Isolate und einzelne Identifikationen in BCl 43, 44; FAME: nicht bestimmbar). Die TGGE bestätigte durch Zuordnung von 5 der 7 getesteten Stämmen des BCL 44 zum TCL 8 deren Übereinstimmung, die Ähnlichkeit mit Comamonas testosteroni LMG1800t [β] widerlegte die Identifikation. Das Isolat SA8-008, das erst auf dem 40% Level dem BCL 44 zugeordnet wurde, war nach der TGGE wahrscheinlich ein α-Proteobacterium (TCL 25). Aus BCL 43 bestätigte ein Brevundimonas vesicularis identifiziertes Isolat in der TGGE die Zugehörigkeit zu den α-Proteobakterien (TCL 10, clusterte mit Sphingomonas capsulatus DSM30196t). Ein weiteres Isolat des BCl 44 wurde im TCl 16 als β/γ-Proteobacterium bestimmt. Die Artidentifikation für Pseudoalteromonas haloplanktis wurde daher zurückgewiesen. Die BCl 4 und 5 enthielten einzelne, nicht identifizierbare Isolate. Die nächsten BIOLOG-Cluster entsprachen β/γ- und γ-Proteobakterien (siehe Abb. 3.10: BCl 9 Stenotrophomonas, BCl 10 Aeromonas). Die TGGE wies BCl 4 dem vermutlichen β-Proteobakteriencluster TCl 11 („b+(gP)“) zu, BCl 5 dem „β+γProteobakterien“-Cluster TCl 21 (b+gP), so daß die BIOLOG-Differenzierung bestätigt wurde. Das genetische Screening unterstützte die BIOLOG-Differenzierung schwach aktiver, bzw. gering wüchsiger Bakterien. Die heterogene Gruppe BCl 41 (fragliche Identifikationen für Brucella, Pseudomonas carboxydohydrogena [α], Moraxella, Lampropedia, Shewanella, Acinetobacter [γ], Kingella [β]) wurde von der TGGE 6 Clustern mit α-, β+γ- und γ-Proteobakterien zugeordnet (TCl 15, 21, 27, 32, 37, 39). Überwiegend wurde für sie das „β+γ-Proteobakterien“-Cluster TCl 21 bestimmt, dem weitere Isolate aus insgesamt 8 heterogenen BIOLOG-Clustern zugeordnet wurden (BCl 5, 29, 32, 34, 35, 37, 41, 42). Acinetobacter, Alcaligenes und Comamonas waren mit dem BIOLOG-System nicht ausreichend zu differenzieren und identifizieren (z.T. aufgrund taxonomischer Mißstände). Durch die TGGE-Analyse konnten die BIOLOG-Identifikationen bis auf die Kerngruppen zurückgewiesen werden: 1) Acinetobacter johnsohnii: Isolate des BCl 28 entsprachen nicht dem Referenzstamm der Gattung sondern TCl 18 (FAME, TGGE: Pseudomonas) und TCl 40. Isolate des BCl 29 entsprachen dem Gattungscluster TCl 21 (FAME, TGGE: Acinetobacter) oder TCl 11 (FAME: Acidovorax). 2) Acinetobacter radioresistens: Isolate des BCl 41 entsprachen TCl 21 aber auch TCl 39. Nur die A. johnsohnii und A. radioresistens-Identifikationen des TCl 21 waren nachweislich Acinetobacter. Die FAME Identifikationen der Gattung waren korrekt. Die Identifikation der Alcaligenes faecalis-Splittergruppen (Kerngruppe in BCl 25-27, vereinzelte Identifikationen in BCl 29, 30, 34) konnte durch die TGGE nicht bestätigt werden. Comamonas terrigenaIdentifikationen verteilten sich auf BCl 29, 32 und 37. Lediglich ein nicht identifiziertes Isolat des BCl 32 wies in der TGGE Ähnlichkeit zum Referenzstamm C. testosteroni LMG1800 (TCl 8) auf, ansonsten wurden sie den „β+γ-Proteobakterien“-Gruppen zugewiesen. Ergebnisse Tab. 3.11 TGGE-Cluster und Identifikationen TGGE TCl 1 2 3 4 5 6 7 BG GP BIOLOG bestimmte Isolate BCl C, E N GP B GP B, nb GP+aP O4/3 6 G GP+aP GP(aP) 8 gP b+(gP) 9 10 aP aP 11 b+(gP) 12 13 aP GN 14 (GP)aP 15 b+(gP) Identifikation N N, nb Ancylobacter aquaticus / N FAME bestimmte Isolate FG Identifikation Stämme 1 GP, . (Rhodococcus erythropolis) , R. rhodochrous DSM43241 . . . nb nb GN (Xanthobacter flavus)2 Arcanob. haemolyticum3 , GP, . N5 (2) G, nb Arcanob. haemolyticum, nb (2) nb N6 N GN 4 D /1 (Ochrobactrum) / N GN 1 C4/12 N / N GN B, D N . 6 H Micrococcus luteus nb nb nb nb 10 Aeromonas caviae GN 32 (Comamonas), N . 44 Pseudoalt. haloplanktis, N (4) nb nb nb nb nb nb nb 18 N nb 43 Brevundimonas vesicularis GN 4 N GN 20 Psd. pseudoalcaligenes . 22 N nb 7 29 Acinetobacter johnsonii / gsp.7 GN 45 Brevundimonas vesicularis nb nb nb nb 6 H , N (2), nb (7) nb nb 297 Alcaligenes faecalis Type II . 6 41 Shewanella putrefaciens A GN nb nb nb 44 N . Aureob. esteroaromaticum, . nb Xanthobacter flavus Ochrobactrum anthropi Agrobacterium (radiobacter) . nb nb Aeromonas (caviae) . nb nb nb nb Brevundimonas vesicularis N . nb Acidovorax delafieldii nb nb nb C. testosteroni LMG1800 S. capsulatus DSM30196 . nb, N nb 16 b/gP 17 bP nb nb nb 18 gP 28 N GN Pseudomonas (alcaligenes) 19 (gP) 20 gP 49 (CDC IIh) nb nb nb nb . nb nb . nb . nb nb ∑ Referenz- St. maltophilia LMG958 C. terrigena LMG1253 P. aeruginosa LMG1242t P. pseudoalc. LMG1225 3 3 1 2 1 1 2 3 4 3 1 1 4 1 2 1 1 6 1 1 3 5 4 12 4 4 1 1 2 1 1 1 1 4 1 1 2 2 9 9 1 2 1 1 4 1 1 1 1 1 1 3 1 4 1 3-113 3-114 Ergebnisse TGGE TCl BIOLOG bestimmte Isolate BG BCl 21 b+gP 22 23 24 25 26 27 28 GP GN (aP) (aP) (aP) (aP) GN Identifikation FAME bestimmte Isolate FG 5 297 32 34 34, 35 37 416 N GN Acinetobacter johnsonii / gsp.7 GN Comamonas terrigena . Alcaligenes faecalis Type II GN (Acinetobacter) GN N . Moraxella, M. atlantae (2), M. nb bovis, Acn. radioresistens, Lampropedia hyalina, N (6) 426 Psychrobacter immobilis nb nb nb nb E, G N GP, . nb nb nb nb nb nb 44 N . nb nb nb 416 Moraxella lincolnii nb 39 N . nb nb nb nb nb nb 29 aP 30 31 aP aP 32 33 34 35 36 37 38 39 GN GN GN GN GN GN GN (gP) 48 426 49 nb 41 nb nb nb nb 41 38, 49 416 40 41 (gP) GN 286 nb CDC IIh Psychrobacter immobilis CDC IIh nb N nb nb nb nb N (CDC IIh) Acinetobacter radioresistens, N (2) Acinetobacter johnsonii / gsp.7 nb Identifikation Hyd. pseudoflava Acinetobacter (johnsonii) . Acn. (calcoaceticus) (Acn.) (2), Acn. (johnsonii) . nb Acinetobacter spec. DSM590 S. paucimobilis DSM1098 1 1 1 1 3 2 12 1 7 3 2 2 1 1 1 1 10 1 hGC α-, β-Proteobakterien Gram-positiv mit hohem G+C-Gehalt nGC Gram-positiv mit niedrigem G+C-Gehalt aP, bP 11 1 . . . nb 1 2 1 2 . nb . nb Legende (Tab. 3.11): TCl TGGE-Cluster Bakteriengruppen (BG) GP, GN Gram-positiv, Gram-negativ 29 3 2 2 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 2 3 . . . nb nb nb nb nb . nb Acidovorax facilis LMG2193 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 . . . nb nb nb nb nb . . Stämme nb nb N, . nb nb . nb nb . nb nb ∑ Referenz- b/gP β/γ-Proteobakterien nach Kersters et al. [1996]: Stenotrophomonas / Xanthomonas-Gruppe gP γ-Proteobakterien CYF Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe 1 Ergebnisse Fortsetzung Legende (Tab. 3.11): Identifikationen bei verschiedenen Identifikationen innerhalb der Gruppe wurde die Anzahl Isolate in Klammern angegeben N nicht identifiziert keine Übereinstimmung mit FAME-Datenbank nb nicht bestimmbar nicht bestimmt . Referenzstämme (siehe Tabelle der Referenzstämme Tab. 2.2) Acn Acinetobacter C Comamonas R Rhodococcus S Sphingomonas Acx Acidovorax P Pseudomonas St Stenotrophomonas FAME FG Gram-Bestimmung nach FAME 1 keine Trennung: Rhodococcus erythropolis / Nocardia globerula 2 keine Identifikation: Xanthobacter flavus 0.46 Sim. / Bradyrhizobium / Methylobacterium 0.4 Sim. 3 keine Trennung: Aureobacterium esteroaromaticum / Rathaibacter tritici, Wiederholung ergab A. est. 5 keine Trennung: Aureobacterium esteroaromaticum / A. saperdae, Wiederholung ergab A. est. BIOLOG BCl BIOLOG-Cluster, Zahlen kennzeichnen Gram-negative Cluster, Buchstaben Gram-positive Cluster 6 BCl H, N, 28, 41, 42: Identifikationen aufgrund geringer Aktivität (<20%) unwahrscheinlich 7 BCl 29: β+γ-Proteobakterien; Alcaligenes faecalis, Acn. johnsonii, C. terrigena-Identifikationen fraglich Zusammenfassung zur TGGE-Analyse der Isolate Es wurden insgesamt 41 TGGE-Cluster bestimmt, deren Anzahl und Umfang die hohe Diversität der analysierten Populationen reflektierte. Als genetische Screening-Methode ermöglichte die TGGE insbesondere eine erste Analyse der physiologisch nicht zu bestimmenden Isolate und zeigte klare Gruppierung der Stämme und Differenzierung in 24 Clustern. Die durch BIOLOG und FAME nicht bestimmbaren Isolate wurden 13 Gram-negativ bestimmten Clustern mit nur einem oder zwei Isolaten zugeordnet und 11 genetischen Gruppen die auch BIOOG-, bzw. FAME-analysierte Isolate enthielten. Die im BIOLOG-Test schwach aktiven und indifferenten Isolate (z.B. des BCl 41) waren genetisch weiter differenzierbar. Die TGGE-Analyse bestätigte, daß die BIOLOG-Clusteranalyse auf unterschiedlichem Niveau in Abhängigkeit von der Aktivität der Isolate zu interpretieren war. Die TGGE-Cluster bestätigte außerdem die Differenzierung von BIOLOG-Clustern mit fraglichen Identifikationen. Die bestimmten β- und γ-Proteobakterien entsprachen der angenommenen Dominanz der Proteobakterien. Die TGGE konnte eine große Zahl α-Proteobakterien detektieren, die in der BIOLOG- und FAMEAna-lyse in diesem Ausmaß nicht bestimmt wurden. Die Analyse bestätigte die angenommene geringe Zahl Gram-positiver Bakterien: Auch unter den gering wüchsigen Isolaten wurden keine weiteren Grampositiven Stämme detektiert. Problematisch war die enorme Bandbreite der zu untersuchenden Taxa, der die optimierte TGGE nicht gerecht wurde. Die taxonomische Zuordnung mit der TGGE erwies sich in einigen Fällen als nicht eindeutig: Die Einbeziehung der BIOLOG-, FAME-bestimmten Isolate und Referenzstämme zeigte, daß Taxa der Gram-positiven Bakterien und α-Proteobakterien zusammen clusterten, ebenso wie Taxa der γ- und β-Proteobakterien. Für die definierten Gruppen der „β+γ- 3-115 3-116 Ergebnisse Proteobakterien“ und „Gram-positiven + α-Proteobakterien“ ist eine nähere genetische Bestimmung mittels Sequenzanalyse notwendig. Diese Gruppen bestätigten die Heterogenität der entsprechenden BIOLOG-Cluster und die Differenzierungsprobleme im Bereich der β- und γ-Proteobakterien sowie α-Proteobakterien sowohl in der physiologischen als auch genetischen Bestimmung. 3.4.2 Sequenzierung der 16S rDNA Die Standardprotokolle der PCR und für die Sequenzierung des etwa 1.500 kb großen 16S rDNA-Gens versagten häufig bei den stoffwechselphysiologisch nicht-bestimmbaren Isolaten. Durch den langsamen Wuchs der Isolate wurden geringere Zellmassen aus älteren Kulturen, d.h. aus der nicht mehr logarithmischen Wachstumsphase, geerntet. Dies hatte eine schlechtere Qualität der DNA-Präparate zur Folge (Coutinho et al. [1993]). Die für die TGGE amplifizierten PCR-Fragmente (TPCR: E. coli-Position 341-534) war dagegen leicht amplifizierbar und sequenzierbar. Als Hauptgrund für die bessere Amplifikation und Sequenzierbarkeit der TPCR, war die bei kurzen Fragmenten geringere Abbruchwahrscheinlichkeit der Kettenreaktion anzunehmen. Ein weiterer Grund ist, daß die verwendeten universellen Primer nicht für alle Bakteriengruppen gleich gut passen. Die sequenzierte TPCR ermöglichte nur eine grobe genetische Zuordnung der Isolate, während die Sequenzierung des PCR-amplifizierten gesamten 16S rRNA-Gen vom 5´Ende her (mindestens 476 Basen der E. coli-Position 7-534 sequenziert) die genetische Klassifizierung bis auf Artebene ermöglichte. In den folgenden Ergebnistabellen Tab. 3.13 bis Tab. 3.16 wurden die sequenzierten Isolate aufgeführt unter Angabe 1) der Sequenzlänge, 2) der Ähnlichkeit („Similarity“) zum nächsten Taxon in der Datenbank und 3) der genetischen Klassifizierung nach PHYLIP-Analyse und Auswertung der Dendrogramme. In den Ergebnistabellen wurde die RDP-Nummerierung und -Benennung der Untergruppen, Gruppen etc. verwendet („Subgroup, Group, Assemblage, Complex“; RDP „Prokaryotic small subunit rRNA: Phylogenetically ordered listing“, Stand 18.5.1995). Die Analyse erfolgte aufgrund der Kürze der TPCR und der partiellen Sequenzen, aber auch um Differenzen auf Art- bis Stammebene zu erfassen, unter Einbeziehung hypervariabler Regionen, d.h. ohne Gewichtung der Sequenzen. Da im Allgemeinen gewichtete Sequenzen verglichen werden, war in den berechneten Bäumen die „phylogenetisch“ korrekte Position der Zweige (siehe einschlägige Literatur) nur im engen Verwandtschaftskreis gegeben. Die Bestimmung der phylogenetischen Hauptgruppen und Auswahl der Referenzsequenzen für die PHYLIP-Analyse erfolgte anhand der Sequenzanalyse durch die RDP. Die Dendrogramme wurden entsprechend der klassifizierten Hauptgruppen in α-, β-, γ-und β/γ-Proteobakterien sowie Gram-positive Bakterien gegliedert. Auf die Abbildung einer einzigen analysierten Sequenz der Gruppe BacteroidesFlavobakterien & Verwandte (CYF) in einem Dendrogramm wurde verzichtet. Alle Dendrogramme enthielten mindestens fünf „Outgroup“-Sequenzen der phylogenetisch nächsten Hauptgruppen, die in den Grafiken durch grauen Hintergrund hervorgehoben wurden. Die Beschriftung der Zweige in den Dendrogrammen gibt die systematische Stellung der Taxa wider, die unterschiedlichen Schriftgrößen kennzeich- Ergebnisse neten die systematische Rangfolge (nächsthöhere taxonomische Einheiten). Die genetische Zuordnung der Isolate entprach grafisch der Bestimmung der nächsten Taxa im Baum (Zuordnung zum Zweig einer Gruppe, Gattung oder Art). Da derzeit eine konsequente Systematik und eindeutige Definition der Taxa fehlt, ergaben sich innerhalb der Phyla Unterschiede im Niveau der Zuordnung. Außerdem waren die unterschiedlichen Sequenzlängen, -bereiche und die Qualität der Referenzsequenzen der Datenbank zu beachten. Die TPCR-Sequenzen wurden in den Dendrogrammen besonders gekennzeichnet, da sie aufgrund der Kürze der Fragmente (135-160 bp) nur eine grobe Zuordnung ermöglichten. Kriterien der 16S rDNA-Sequenz-Klassifizierung Im Allgemeinen gilt eine Übereinstimmung von 90-98% des kompletten 16S rRNA-Gens als typisch für die Arten einer Gattung, ab 98% Ähnlichkeit wird die Artidentität angenommen. Für Teilsequenzen mit etwa 500 Basen gilt in der Regel 99% Übereinstimmung als Grenzwert für die Artidentität (Schleifer & Ludwig [1994]). Da die TPCR-Sequenz nur 10-13% des gesamten Gens umfasste, sollte ab etwa 98% Übereinstimmung die Gattungsidentität zu bestimmen sein. Dies war durch einen Vergleich der Similarity-Werte der beiden Sequenzierungsverfahren zu überprüfen. Tab. 3.12 Allgemeine Daten der Sequenzanalyse: Sequenzierte TPCR- und Gesamt-PCR sequenziertes Fragment TPCR PCR Länge der bestimmten Sequenz durchschnittliche Länge Similarity zu Taxa in der Datenbank Anzahl Sequenzen 142-195 [bp] 425-1520 [bp] 174 [bp] 803 [bp] 88,2-100 % 87,3-100 % 96 78 In Tab. 3.12 wurden die allgemeinen Eckwerte der Analyse zusammengetragen: Es wurden 96 Isolate über die TPCR-Fragmente sequenziert und 78 dieser Isolate durch Sequenzierung der PCR des gesamten 16S rDNA-Gens näher bestimmt. Die TPCR ermöglichte die Bestimmung von 142-195 Basen, mit der PCR wurden 425-1520 Basen analysiert. Die Übereinstimmung („Similarity“) mit Taxa in der Datenbank betrug mit beiden Methoden minimal etwa 88%. Der Vergleich der Similarity-Werte beider Sequenzierungsmethoden ergab (Tab. 3.13), daß die 100%ige Übereinstimmung einer TPCR-Sequenz mit einem oder mehreren Taxa in der Datenbank einer minimal 93,3%igen Übereinstimmung der PCR-Sequenz mit dem nächsten Taxon entsprach. Eine Similarity von 95% mit der TPCR bedingte minimal 89,3 % Übereinstimmung mit der PCR. Die Aussage der TPCR war um so zuverlässiger, je ähnlicher die PCRSequenz einem Taxon in der Datenbank war: Bei mindestens 90%-iger Übereinstimmung der PCRSequenz war mit mindestens ebenso hoher Ähnlichkeit in der TPCR-Bestimmung zu rechnen. 3-117 3-118 Ergebnisse Tab. 3.13 Vergleich der Similarity-Werte der TPCR und Gesamt-PCR Vergleich Similarity Anzahl Sequenzen TPCR => PCR TPCR PCR Werte der TPCR ergeben ≥95 % min. 89,5 % 70 in der PCR mindestens: ≥99 % min. 92,8 % 37 ≥100 % min. 93,3 % 24 PCR => TPCR PCR TPCR Werte der PCR ergeben in der TPCR mindestens: min. 90,9 % min. 98,4 % 90-98 % ≥98 % 48 23 Die Werte veranschaulichen, daß ab 95% Übereinstimmung der TPCR-Sequenz die Gattungsidentifikation mit der Gesamt-PCR-Sequenzierung (bei minimal 476 sequenzierten Basen) wahrscheinlich war, ab 98% mit der TPCR wurde grundsätzlich das 90%-Niveau und Gattungsidentät mit der Gesamt-PCR erreicht. Eine sichere Artidentifikation war mit der TPCR nicht möglich, sie ermöglichte maximal eine Gat-tungszuordnung. Die TPCR lieferte in diesem Sinne eine „gröbere“ Zuordnung als die partielle oder komplette Analyse der PCR. Im Dendrogramm waren bei Vergleich mit der TPCR die Abstände zwischen Isolat und Taxon (Länge der horizontalen Äste im Baum) aufgrund der geringen Sequenzlänge quantitativ geringer als für die PCR, d.h. die Ähnlichkeit wurde in den Dendrogrammen überbewertet. 3.4.2.1 Taxonomische Zuordnung der Isolate anhand der 16S rDNA-Sequenz Insgesamt wurden 96 Isolate sequenziert. Die Analyse umfasste Isolate aller phänotypisch (BIOLOG, FAME) und genetisch (TGGE) nachgewiesenen Hauptgruppen: α-, β-, β/γ-, γ-Proteobakterien, die Cytophaga-Flavobakterien-Bakteroides-Gruppe und Gram-positive Bakterien. Der Schwerpunkt lag auf der Zuordnung von Isolaten mit geringem Wuchs, die mit BIOLOG nicht bestimmbar waren und schwer differenzierbaren Gruppen („b+gP“ TCl mit β- und γ-Proteobakterien, „GP+aP“ TCl mit Gram-positiven und α-Proteobakterien). Außerdem sollten einige Identifikationen (BIOLOG, FAME) überprüft werden. Isolate in der Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe (CYF) Die Sequenzierung der TPCR-Fragmente wies ein stoffwechselphysiologisch nicht bestimmbares Isolat dieser Gruppe zu (Tab. 3.14). Die Sequenz entsprach mit 100% Übereinstimmung dem Zweig Flavobacterium johnsoniae / Flexibacter aurantiacus, RDP-Untergruppe Flavobacterium flevensis. Die Gattung war nicht eindeutig zu bestimmen, da sich die beiden Taxa im Bereich der TPCR nicht unterschieden und die PCR-Sequenzierung nicht möglich war. Die Bestimmung des mit 24D selektierten Isolates war in Übereinstimmung mit dem BIOLOG-Ergebnis, nachdem die CYF nur durch die Anreicherung mit Xenobiotika nachgewiesen wurden. Ergebnisse Tab. 3.14 Sequenzergebnisse: Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Klassifikation Isolat Sim [%] bp Taxon Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe (Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides-Phylum RDP 2.6) Flavobacterium flevensis-Untergruppe (RDP 2.6.1.2.5) Flexibacter / Flavobacterium 24D-14 100 184 Fle. aurantiacus / Fla. johnsoniae ATCC17061 Legende : bp Anzahl verglichener Basen Sim Similarity, Übereinstimmung Vergleich mit Referenzsequenzen der EMBL und RDP -Datenbank Gram-positive Isolate Das Dendrogramm in Abb. 3.22 veranschaulicht die systematische Zuordnung der Gram-positiven Isolate anhand ihrer 16S rDNA-Sequenzen. Tab. 3.15 gibt die endgültige Klassifikation der 15 Sequenzen anhand der Ähnlichkeitswerte für TPCR und Gesamt-PCR wider. Die Gram-positiven Xenobiotika-Isolate wurden wie erwartet überwiegend der Arthrobacter-Gruppe zugeordnet. Die Astlängen im Dendrogramm markierten starke Differenzen innerhalb der derzeit definierten Gattung Aureobacterium und bestätigten die Problematik der Identifikation mit BIOLOG und FAME. Die TPCR-Sequenzen von 4 Isolaten (4CS-03, Nap-28b, -29, -55a) waren identisch mit Aureobacterium liquefaciens (100% Sim.), die Gesamt-PCR-Sequenz von 4CS-03 bestätigte die Art. Da die TPCR- und PCR-Sequenzen weniger als 2% Differenz zwischen den Taxa bestimmten, wurden 4 Isolate als Aureobacterium / Microbacterium-Gattungsgruppe klassifiziert (oXy-18a, Nap-36a, -57, 3CB-28a). Mit nur 93-94,3% Ähnlichkeit der TPCR waren zwei weitere Isolate der Gattungsgruppe Curtobacterium / Corynebacterium (Differenz zwischen den Gattungen <1%) nicht eindeutig zuzuordnen (oXy-06a, -28a). Dem Mycobacterium-Komplex entsprachen zwei Sequenzen der Probenahme 8/93. Das SA-026 Isolat wurde als Mycobacterium, das Isolat 24D-11 als Rhodococcus identifiziert. Die Similarity der GesamtPCR bestätigte in beiden Fällen auf Gattungsebene die bestimmte Stamm-Identität der TPCR. Die Sequenzen zweier Isolate des SA-Vorversuches (Probenahme 5/93) entsprachen der Propionibacterium-Gruppe (SA5-44, -46). Das einzige Gram-positiv bestimmte Isolat dieser Probe und ein physiologisch nicht bestimmbares Isolat zeigten aber nur entfernte Verwandtschaft zu den Taxa in der Sequenzdatenbank und konnten nicht näher klassifiziert werden (95% TPCR-Übereinstimmung, bzw. 87% auf 481 Basen Gesamt-PCR). Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt waren mit allen Bestimmungsmethoden (BIOLOG, FAME) nur vereinzelt identifiziert worden und in der Identifikation fraglich. Die Sequenzierung konnte mit 96% Similarity auf 524 Basen einzig ein physiologisch nicht-bestimmbares Isolat der Probenahme 8/93 (SA8-028) eindeutig der Gattung Staphylococcus zuordnen. 3-119 3-120 Ergebnisse Mycobacterium flavescens ATCC14474 Mycobacterium - Komplex SA8 026 - Mycobyacteria Mycobacterium str. RJGII.135 79 Mycobacterium terrae ATCC15755 100 Mycobacterium komossense ATCC33013 Mycobacterium chelonae ATCC14472 Tsukamurella paurometabolum - Nocardia-Gruppe 99 Tsukamurella wratislaviensis NCIMB13082 63 Rhodococcus opacus DSM43205 Rhodococcus marinonanscens DSM43752 Rhodococcus equi 99 100 100 24D 11 63 Rhodococcus globerulus DSM4954 Rhodococcus erythropolis DSM43066 Gordona terrae DSM43249 Saccharopolyspora rectivirgula ATCC33515 Frankia sp. str. L27 4CS 03 Arthrobacter - Gruppe 100 Aureobacterium liquefaciens DSM20638 Nap 28bTPCR, Nap 29TPCR, Nap 55aTPCR 3CB 28a TPCR, Nap 57TPCR 86 85 oXy 18a 81 Aureobacterium testaceum DSM20166 96 Nap 36a 96 Aureobacterium barkeri DSM20145 Clavibacter michiganense DSM46364 92 Corynebacterium mediolanum DSM20152 88 oXy 06aTPCR, oXy 28aTPCR Arthrobacter globiformis DSM20124 Kineococcus aurantiacus IFO15268 Streptomyces coelicolor str. A3(2) SA5 44 Propionibacterium - Gruppe 81 Luteococcus japonicus IFO12422 SA5 46 Propionibacterium acidipropionici ATCC4875 71 89 Propionibacterium acnes ATCC6919 Propionibacterium freudenreichii ATCC6207 Bifidobacterium minimum ATCC27538 Atopobium minutum ATCC33267 Carnobacterium divergens ATCC25677 77 73 Lactobacillus sake ATCC15521 71 Enterococcus faecalis 72 Aerococcus viridans ATCC11563 Brochothrix thermosphacta ATCC11509 Kurthia zopfii ATCC33403 53 58 Bacillus subtilis 83 Bacillus thuringiensis NCIMB9134 57 Bacillus megaterium DSM32 Sporolactobacillus inulinus ATCC15538 Streptococcus salivarius str. C699 ATCC13419 Paenibacillus azotofixans ATCC35681 Aneurinobacillus aneurinolyticus NCIMB10056 Gemella haemolysans ATCC10379 Staphylococcus - Gruppe 99 SA8 028 91 Staphylococcus equorum DSM20674 94 Staphylococcus kloosii DSM20676 67 Staphylococcus intermedius ATCC29663 Staphylococcus warneri ATCC27836 Clostridium lituseburense ATCC25759 Sporohalobacter lortetii str. MD-2 ATCC35059 Gram positive Bakterien 94 Hoch-GC 100 Niedrig-GC 91 62 62 81 65 69 92 100 100 Rhodobacter capsulatus str. B10 ATCC33303 Hyphomonas jannaschiana Agrobacterium tumefaciens IAM13129 Aquaspirillum itersonii NCIMB9070 Caulobacter bacteroides str. CB7 Erythrobacter longus str. OCh101 ATCC33941 Rhodospirillum salexigenes ATCC35888 Rickettsia rickettsii Fusobacterium varium ATCC8501 Alpha-Proteobakterien Fusobakterien & Verwandte 0.1 Abb. 3.22 Sequenzanalyse der Gram-positiven Bakterien Legende: Phylip-Analyse ohne Gewichtung der Sequenzen: Berechnung der Distanzen nach Jukes & Kantor, Berechnung des Dendrogramms mit Fitch, Bootstrap-Analyse für 100 Ansätze (Werte ab 50% angegeben) 16S rDNA TPCR- bzw. Gesamt-PCR-Sequenzierung vom 5´Ende 425-1520 Basen Isolate in Fettdruck, Outgroup grau unterlegt Tab. 3.15 Sequenzergebnisse: Gram-positive Bakterien Klassifikation Isolat Gesamt-PCR (5´Ende, ab E.coli-Position 7) Sim [%] bp Taxon TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Taxon Sim [%] bp 99,4 -100 174 (M. komossense ATCC33013 / senegalense) - M. RJGII.135 Mycobacterium -Komplex (RDP 2.15.1.12) Mycobacteria (RDP 2.15.1.12.2) Mycobacterium SA8-026 96,9 M. sp. RJGII.135E 1120 Nocardia -Gruppe (RDP 2.15.1.12.1 Assemblage) Rhodococcus 24D-11 483 R. globerulus DSM4954T / R. DN22E 97,5 100 157 R. erythropolis DSM43066t Arthrobacter -Gruppe (RDP 2.15.1.7) 4CS-03 99,1 462 A. liquefaciens DSM20638E Nap-28b . . . Nap-29 . . . Nap-55a . . . Aureobacterium / oXy-18a 95,1-96,0 467 M. arborescens DSM20754E - A.liq. Microbacterium Nap-57 . . . 3CB-28a . . . Nap-36a 94,5-94,9 458 M. imperiale DSM20530 - M. arb. oXy-28a . . . . Aureobacterium liquefaciens oXy-06a . . . 100 100 100 100 98,7-99,3 98,0-98,7 98,1-98,7 97,3-97,9 94,0-94,3 148 157 157 157 151 154 157 146 159 A. liquefaciens DSM20638 (A. testaceum DSM20166 / liq. / M.imperiale DSM20530) - M. arb. (M. imperiale / arborescens) - A. liquefaciens (M. lacticum DSM20427 / arborescens) - A. liquefaciens (Corynebacterium mediolanum DSM20152 / Curtobacterium luteum) - Cur. citreum 93,0-93,6 158 Propionibacterium -Gruppe (RDP 2.15.1.9) . SA5-44 SA5-46 86,9-87,3 481 Mycobycterium chitae - (P. acnes / freudenreichii) . . . 94,5 147 Propionibacterium freudenreichii ATCC6207R 95,1 173 P. acnes ATCC6919R Staphylococcus -Gruppe (RDP 2.15.5.10) Staphylococcus SA8-028 96,1 524 S. saprophyticus ATCC15305E 96,0 173 (S. capitis ATCC27840 / saprophyticus / saccharolyticusR) Legende : Sim Similarity, Übereinstimmung bp Anzahl verglichener Basen Klassifikation Art 16S rDNA ≥98% Sim., 16S rDNA-Teilsequenz (ca. 500 Basen ) ≥99% Sim. Vergleich mit Referenzsequenzen der EMBL (E) und RDP (R)-Datenbank . nicht bestimmt Gattung 16S rDNA 90-98% Sim., TPCR ≥98% Sim. 3-122 Ergebnisse Gram-negative Isolate Die Proteobakteriengruppen werden im Folgenden getrennt vorgestellt. Durch die Einbeziehung der nächst verwandten Vertreter der angrenzenden Proteobakteriengruppen in die Dendrogramme ist aber die Eingruppierung in den Gesamtkontext zu erkennen. α-Proteobakterien Das Dendrogramm der ungewichteten Sequenzen (Abb. 3.23) gab die „phylogenetische“ Ordnung der α-Proteobakterien nur begrenzt wider. Die Bootstrap-Analyse ergab keine zuverlässige Positionierung der Hauptzweige (<50% Reproduzierbarkeit auf 100 Ansätze). Beispielsweise wurde in der Rhodopseudomonas viridis-Untergruppe das namengebende Taxon primär vom Azorhizobium / Ancylobacter-Zweig abgespalten (mit einer Länge von 0,05 Einheiten). Die beiden gebildeten Zweige wurden durch die Bootstrap-Analyse nicht festgelegt. Die Länge der primären Zweige wies auf eine, für die Zuordnung von Isolaten, unzureichende Erfassung der Gruppe hin. Bei weniger als 90% Übereinstimmung war die Position der Isolate und damit auch die Gruppenzugehörigkeit im Baum nicht eindeutig zu bestimmen, einzig die Similarity-Werte legten die (grobe) Klassifikation fest. Unter Berücksichtigung der Fragmentlängen und Similarity-Werte wurden in Tab. 3.16 insgesamt 25 Sequenzen innerhalb der α-Proteobakterien klassifiziert, davon 16 auf Gattungs- bzw. Artniveau. Der über-wiegende Teil der Sequenzen entsprach der Rhizobium-Agrobacterium-Gruppe, je 3 Sequenzen SAiso-lierter Bakterien der Caulobacter- und Sphingomonas-Gruppe und eine der Rhodospirillum rubrumGruppe. Die beiden analysierten Isolate der Probe 5/93 zeigten keine nähere Verwandtschaft mit denen der Probenahme 8/93 und die 6 Xenobiotika-Isolate waren nicht näher mit den 18 SA-Isolaten verwandt. Die Sequenzen in der Rhizobium-Agrobacterium-Gruppe entsprachen vier der 12 benannten RDP-Untergruppen („Brucella, Agrobacterium, Rhodopseudomonas viridis, Rhodomicrobium vanielii-Gruppe“): • Von den 6 Xenobiotika-Isolaten wiesen 5 innerhalb der Gruppe Brucella nähere Verwandtschaft mit der Gattung Ochrobactrum auf. Die Gesamt-PCR bestätigte die Identität des Isolats 4CS-11 mit Ochrobactrum anthropi, die weiteren Isolate wurden mit 94-97,4% Übereinstimmung der 410-448 Basen Gesamt-PCR als Ochrobactrum klassifiziert (Ant-29, Nap-06, -23, oXy-07d). • Die SA-Isolate der Probenahme 8/93 waren am stärksten in der Agrobacterium-Gruppe vertreten. Es wurden drei Gattungs-identische Sequenzen bestimmt (SA8-038, -046, -66), bei drei weiteren konnten mit 427-1171 Basen nicht zwischen Zoogloea ramigera ATCC19623 / IAM12669 und Agrobacterium vitis IAM14140 differenziert werden (SA8-007, -053, -078). • In der Rhodopseudomonas viridis-Gruppe wurden zwei SA8-Isolate als Azorhizobium und Ancylobacter klassifiziert (SA8-013, 032). Ergebnisse • Ein SA-Isolat wurde mit 59% Wiederholungsrate in der Bootstrap-Analyse in der Rhodomicrobium vanielii-Gruppe positioniert, die Gattungszugehörigkeit blieb jedoch fraglich (nur 90,2% Sim. mit Hyphomicrobium vulgare auf mehr als 1000 Basen). Die TPCR des Isolates SA8-025 betonte den Übergang zur Gruppe der Methylobacteria (97% Sim.). Zwei Isolate stimmten mit keiner Rhizobium-Agrobacterium-Untergruppe überein: Die TPCR klassifizierte das Isolat SA8-147 grob innerhalb der Rhodospirillum fulvum-Gruppe (97,9% zu R. fulvum / molischianum), in der Gesamt-PCR wurde jedoch mit nur 91% Similarity nicht zwischen Gattungen der Beijerinckia- und Methylobacteria-Gruppe differenziert (442 Basen). Das Isolat oXy-05c wurde durch die TPCR der Rhodopseudomonas viridis-Gruppe zugeordnet (97,6% Sim. zu Ancylobacter aquaticus), 715 Basen Gesamt-PCR positionierten das Isolat im Dendrogramm zwischen die Rhodopseudomonas viridis- und die R. marina-Gruppe (92% Sim. zu Devosia, Ochrobactrum und Rhodohalobium). Die Caulobacter-Gruppe bildete einen distinkten Zweig reproduzierbarer Ordnung (siehe Dendrogramm) in dem drei SA-Isolate durch die Bootstrap-Analyse relativ sicher positioniert wurden (62-100%). Zwei SA-Isolate der Probenahme 8/93 mit entsprachen mit etwa 99% Similarity (auf 555 bzw. 1127 Basen) der Art Mycoplana bullata (SA8-008, -020). Das Isolat SA5-11 war mit etwa 93% Similarity auf 727 Basen den Gattungen Mycoplana und Caulobacter nicht eindeutig zuzuordnen. Ein SA-Isolat der Probenahme 5/93 (SA5-25) zeigte Ähnlichkeit mit der Rhodobacter-Gruppe, konnte aber nicht eindeutig einer Gattung zugeordnet werden (93,6-94,5% Sim. auf 535 bp zu Rhodobacter / Paracoccus). In der Sphingomonas-Gruppe wurden drei SA8-Isolate bestimmt. Eines wurde mittels TPCR auf dem Gattungsniveau Erythrobacter zugeordnet (SA8-090). Die beiden anderen Isolate konnten auch durch Gesamt-PCR (442-1122 Basen) nicht näher klassifiziert werden, sondern zeigten 90-95% Übereinstimmung mit Caulobacter, Sphingomonas und Blastomonas (SA8-079, -126). Das Isolat SA8-050 wies auf 1123 Basen 93% Übereinstimmung mit Acetobacter auf. Demnach war dfas Isolat der Rhodopila globiformis-Gruppe zuzuordnen. Die langen Zweige im Dendrogramm zeigten aber, daß dieses Zuordnung nicht eindeutig ist und die nächsten Verwandten in der Datenbank fehlen. 3-123 3-124 Ergebnisse Brucella melitensis biotype 1 ATCC23456 Brucella ovis ATCC25840 Brucella neotomae ATCC23459 Ochrobactrum anthropi IAM14119 56 Ant 29 Ochrobactrum sp. IFO12950 4CS 11 oXy 07dTPCR Alpha-Proteobakterien 61 92 Nap 23 Nap 06 Zoogloea ramigera ATCC19623 Bartonella quintana str. Fuller ATCC VR358 Rhizobium loti LMG6125 SA8 078 96 SA8 053 SA8 007 Blastobacter aggregatus ATCC43293 Agrobacterium vitis IAM14140 52 SA8 046 SA8 066TPCR 52 SA8 038 Agrobacterium tumefaciens IAM13129 84 Agrobacterium rubi LMG156 Rhizobium leguminosaum IAM12609 Devosia riboflava IFO13587 92 Azorhizobium caulinodans LMG6465 SA8 013 100 SA8 032 Ancylobacter aquaticus ATCC35396 Rhodopseudomonas viridis ATCC19567 oXy 05c Methylosinus sporium Beijerinckia indica subsp. indica ATCC9039 Hyphomicrobium vulgare str. MC-750 SA8 025 Rhodohalobium orientis str. MB312 JCM9337 59 100 Rhi zobium-Agro bacterium - Gruppe - Bruce lla - Gruppe - Agrobac terium - Gruppe - Rhodopse udomonas viridis - Unter gruppe - Rhodomicrobium vanielii - Gruppe Methylobaterium rhodinum NCIMB9421 - Methylobac teria Methylobacterium organophilum str. XX ATCC27886 SA8 147 89 85 SA8 008 100 SA8 020 Caulobacter - Gruppe Mycoplana bullata IAM13153 Brevundimonas diminuta LMG1793 50 Caulobacter sp. str. FWC14 96 Caulobacter crescentus str. CB15A Caulobacter bacteroides str. CB7 62 SA5 11 74 SA5 25 Rhodoba cter - Gruppe 75 Rhodobacter capsulatus str. B10 ATCC33303 100 Rhodobacter sphaeroides IFO12203 Paracoccus denitrificans LMG4218 Hyphomonas jannaschiana str. VP-1 ATCC33882 Aquaspirillum itersonii NCIMB9070 Rhodospirillum fulvum str. 1360 ATCC15798 SA8 090TPCR 79 Sphingomonas - Gruppe Erythrobacter longus str. OCh101 ATCC33941 51 Blastomonas natatorius ATCC35951 Porphyrobacter neustoniensis ACM2844 56 99 SA8 126 100 SA8 079 Sphingomonas terrae IFO15098 Sphingomonas yanoikuyae JCM7371 98 Sphingomonas capsulata ATCC14666 Sphingomonas pauimobilis DSM1098 Ricketsia ricketsii Rhodospirillum salexigenes ATCC35888 Rhodopila globiformis str. 7950 DSM161 Rhodospirillum rubrum -Gruppe 98 SA8 050 - Rhodopila globiformis - Gruppe 100 Acetobacter europaeus DSM6160 Roseococcus thiosulfatophilus DSM8511 Aquaspirillum magnetotacticum Cs310 Rhodospirillum sodomense str. DS1 Ectothiorhodospira halophila str. SL1 DSM244 Methylococcus capsulatus str. BATH Coxiella burnettii str. Q177 Thiobacillus hydrothermalis str. R3 99 65 89 62 52 62 Chromatium tepidum str. MC ATCC43061 Gamma-Proteobakterien 0.1 Abb. 3.23 Sequenzanalyse der α-Proteobakterien Legende: Phylip-Analyse ohne Gewichtung der Sequenzen: Berechnung der Distanzen nach Jukes & Kantor, Berechnung des Dendrogramms mit Fitch, Bootstrap-Analyse für 100 Ansätze (Werte ab 50% angegeben) 16S rDNA TPCR- bzw. Gesamt-PCR-Sequenzierung vom 5´Ende 425-1520 Basen Isolate in Fettdruck, Outgroup grau unterlegt Tab. 3.16 Sequenzergebnisse: α-Proteobakterien Gesamt-PCR (5´Ende, ab E.coli-Position 7) Klassifikation Isolat Sim [%] bp Taxon TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Sim [%] bp Taxon Rhizobium-Agrobacterium -Gruppe (RDP 2.13.1.8) . SA8-147 oXy-05c 90,9-91,2 442 (Methylobacterium extorquens NCIMB 9399T / zatmanii 12243 / rhodesianum 12249 / rhodinum 9421T / GK118T) - Beijerinckia indica ATCC9039 92,1-92,7 715 (Ochrobactrum anthropi / Rhodohalobium orientis MB312 JCM9337) - Devosia riboflava IFO13587 97,9 145 (Rhodospirillum fulvum 1360 / molischianum) 97,6 167 Ancylobacter aquaticus ATCC25396 Brucella -Gruppe (RDP 2.13.1.8.10) Ochrobactrum Ant-29 97,4 448 Ochrobactrum sp. IFO12950E 94,9-95,5 411 (O. anthropiE ) -Ochrobactrum sp. Nap-23 93,4-94,0 410 Nap-06 oXy-07d . . . O. anthropi 99,1 425 O. anthropi 4CS-11 Agrobacterium -Gruppe (RDP 2.13.1.8.8 Assemblage) Agrobacterium SA8-046 SA8-038 SA8-066 Agrobacterium SA8-007 / Zoogloea SA8-053 SA8-078 95,7-96,3 95,0-95,7 . 96,1-96,6 94,6-95,2 95,5-96,1 1188 1134 . 427 1171 708 (A. rubi LMG156T) - A. tumefaciens IAM13129 . (Zoogloea ramigera ATCC19623 / IAM12669) - A. vitis (Z. ramigera / A.rubi / A. vitis) - A. tumefaciens (Z. ramigera / A.vitis) - Blastobacter aggregatus 97,6 99,4 98,8 100 100 98,2-98,8 98,2-98,8 98,0-98,6 100 100 98,8 168 (Zoogloea ramigera ATCC19623 / IAM12669 / 167 O. anthropi / O.sp. IFO12950 / Mycoplana ramosa 167 IAM13949 / M. dimorpha) 151 145 169 169 148 146 169 167 (Azospirillum sp. DSM1726 / Agrobacterium rhizogenes IAM13570T) - (A. rubi / tumefaciens) (A.vitis IAM14140T / Blastobacter aggregatus ATCC432893) Rhodopseudomonas viridis -Untergruppe (RDP 2.13.1.8.6) Azorhizobium SA8-013 Ancylobacter SA8-032 97,3 715 A. caulinodans LMG6465 98,0 735 Anc. aquaticus ATCC25396 97,6-98,2 169 (Z. ramigera / B.capsulatus ATCC43294) -A. cau. 100 167 Anc. aquaticus ATCC25396 Rhodomicrobium vaniellii -Gruppe (RDP 2.13.1.8.5 Assemblage) . SA8-025 90,2 1133 Hyphomicrobium vulgare MC-750 ATCC27500 96,4-97,0 169 (Rhodospirillum fulvum 1360 / molischianum) Methylobacterium extorquens NCIMB9399T / zatmanii NCIMB12243T / GK118 / rhodesianumNCIMB12249 / rhodinum 9421 / Rhodomicrobium vannielii EY33 ATCC51194TR Gesamt-PCR (5´Ende, ab E.coli-Position 7) Klassifikation Isolat Sim [%] bp Taxon Caulobacter -Gruppe (RDP 2.13.1.7) Mycoplana 98,7 555 M. bullata IAM13153 SA8-008 bullata . SA8-020 SA5-11 99,2 1127 92,2-92,8 727 (Caulobacter bacteroides / crescentus) - M. segnis TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Sim [%] bp Taxon 99,4-100 166 (C.bacteroides CB7 / crescentus CB2AE / CB15A / FWC14 / Brevundimonas diminutaR / M.bullata) M. segnis IFO13240 100 169 (C.bacteroides CB7 / crescentus CB2A / CB15A / 99,3 142 B.diminuta / M. bullata / segnis) Rhodobacter -Gruppe (RDP 2.13.1.3) Paracoccus / Rhodobacter SA5-25 93,6-94,5 535 P. aminophilus JCM7686 - R. capsulatus B10 ATCC33303 96,4-97,0 165 (R. capsulatus B10 / P. denitrificans LMG4218 / kocurii JCM7684 / alkaliphilus) - P. aminophilus / aminovorans Sphingomonas -Gruppe (RDP 2.13.1.5) Erythrobacter SA8-090 Sphingomonas/ SA8-126 Blastomonas / Caulobacter . SA8-079 . . . 94,5-95,3 442 (S. yanoikuyae JCM7371 / Blastomonas natatorius ATCC35951) - Caulobacter subvibrioides 100 169 E. longus OCh101T ATCC33941R 99,3 146 C. subvibrioides / Sphingomonas adhaesiva JCM7370 89,5-89,9 1122 C. subvibrioides - S. yanoikuyae JCM7371E 98,8 168 Rhodosirillum rubrum -Gruppe (RDP 2.13.1.1 Assemblage) Rhodopila globiformis -Gruppe (RDP 2.13.1.1.4) . SA8-050 93,2 1123 Acetobacter liquefaciens LMG1382 97,9 142 Acidiphilum cryptum ATCC33463 Legende : Sim Similarity, Übereinstimmung bp Anzahl verglichener Basen Klassifikation Art 16S rDNA ≥98% Sim., 16S rDNA-Teilsequenz (ca. 500 Basen ) ≥99% Sim. Vergleich mit Referenzsequenzen der EMBL (E) und RDP (R)-Datenbank . Gattung nicht bestimmt 16S rDNA 90-98% Sim., TPCR ≥98% Sim. Ergebnisse β-Proteobakterien Die Analyse ohne Gewichtung der Sequenzen erzielte eine hohe Trennschärfe in der Rubrivivax-Untergruppe. Im Dendrogramm (Abb. 3.24) wurden die sehr ähnlichen Sequenzen der Acidovorax-Gruppe auf dem Artniveau differenziert. Die Trennschärfe wirkte sich allerdings negativ auf die Positionierung einzelner Gruppen aus: Von der Rhodocyclus-Gruppe bildeten 3 Vertreter (Thauera selenatis, Azoarcus indiges, Zoogloea ramigera) einen Zweig der sich mit Methylobacillus flagellatum (MethylophilusGruppe) vereinte, Rhodocyclus tenuis bildete einen eigenen Zweig. Die Länge einzelner Äste war Indiz dafür, daß ihre Position im Baum nicht die phylogenetische bzw. systematische Ordnung wiedergibt. Die Isolate wurden aus den Probenahmen 8/93 und 5/93 und mit SA isoliert (einzige Ausnahme: oXy-25a). Von den 35 bestimmten Sequenzen entsprachen 33 der Rubrivivax gelatinosus-Gruppe, je eine der Rhodocyclus- und der Neisseria-Gruppe. Die Astlängen im Dendrogramm zeigten, daß die beiden Isolate SA5-34 und SA8-004 in der Rhodocyclus-, bzw. Neisseria-Gruppe durch die Referenzsequenzen nicht näher klassifiziert wurden. Die TPCR-Analyse gab für SA5-34, mit nur 96% Übereinstimmung und 3% Abstand zum nächsten Taxon, Thauera selenatis als einzig näher verwandtes Taxon an (siehe Tab. 3.17). Mit 94% Sim. (747 Basen) entsprach diese Ähnlichkeit nach der Gesamt-PCR-Analyse etwa dem Gattungsniveau, das Dendrogramm betonte jedoch die Nähe zu Azoarcus, so daß die Klassifikation Thauera / Azoarcus vorgenommen wurde. Für SA8-004 wurde durch die TPCR mit 93% Sim. Chromobacterium violaceum ATCC12472 als einzig näher verwandter Stamm klassifiziert. Auf die genauere Bestimmung mittels Gesamt-PCR wurde aus Mangel an ähnlichen Taxa in der Datenbank verzichtet. Die Sequenzanalyse betonte die Relevanz der Rubrivivax gelatinosus-Gruppe für die Untersuchung. Innerhalb der R. gelatinosus-Gruppe fiel eine Sequenz in die Untergruppe Bordetella (SA5-37b), alle anderen in die Untergruppe Rubrivivax. Zur Differenzierung der Acidovorax-Arten innerhalb der umfangreichen Rubrivivax-Untergruppe wurden mindestens 460 Basen des 5´Endes durch Gesamt-PCRSequenzierung bestimmt - für gut die Hälfte der Stämme wurden mehr als 1000 Basen sequenziert. Im Dendrogramm waren nicht eindeutig klassifizierbare Isolate anhand der größeren Astlängen leicht detektierbar. • SA5-37b wurde nach Sequenzierung des kompletten 16S rRNA-Gens eindeutig in der BordetellaUntergruppe positioniert (88% Reproduzierbarkeit in der Bootstrap-Analyse) und wurde mit 95,4 bis 96,1% Sim. als Alcaligenes / Bordetella bestimmt. Im Vergleich mit dem Isolat wiesen Alcaligenes faecalis ATCC8750, A. xylosoxidans ssp. denitrificans ATCC15173 und Bordetella bronchioseptica str. S1 nur 0,7% Differenz im gesamten 16S rRNA-Gen auf (0,1% Differenz in der TPCR). • Innerhalb der Untergruppe Rubrivivax ließen sich vier für die Zuordnung der Isolate entscheidende Zweige bestimmen: 3-127 3-128 Ergebnisse 1) SA5-29a wies auf 476 Basen lediglich 94,2% Ähnlichkeit mit Ideonella dechloratans auf. Das Dendrogramm bestätigte, daß eine sichere Gattungsidentifikation in Bezug auf die Sequenzlänge nicht möglich war, daher wurde die Gattungsgruppe Rubrivivax / Ideonella definiert. 2) Dem Comamonas-Zweig wurden drei Sequenzen mit 96-99% Ähnlichkeit der TPCR zugeordnet (SA8-012, -037, -049). Ein weiteres Isolat (SA5-16) konnte nach Sequenzierung von 767 Basen mit <92% Ähnlichkeit den Gattungen Comamons und Acidovorax nicht eindeutig zugeordnet werden. Bei etwa gleichem Ergebnis in der TPCR-Analyse war für SA8-012 und SA-037 die Gattungsidentität ebenfalls abzulehnen. Im Dendrogramm bildeten sie einen distinkten Zweig innerhalb der Comamonaden. Lediglich für SA8-049 konnte bei 99%iger Übereinstimmung der TPCR die Gat-tungsidentifikation für Comamonas angenommen werden. 3) Zwei Sequenzen wurden im Variovorax / Rhodoferax-Zweig des Baumes positioniert. SA8-072 wurde mit 97,6% Sim. auf 456 Basen der Gattung Variovorax zugeordnet, SA8-128 konnte mit ca. 95% Sim. aber <1% Abstand zwischen den Gattungen nicht eindeutig bestimmt werden. 4) Dem Acidovorax-Zweig wurden 25 Isolate zugeordnet. Für zwei Isolate der Probenahme 5/93 (SA5-37a, -47) war die Gattung nicht zu identifizieren. Die Sequenzen zeigten auf 441-824 Basen 92% Übereinstimmung mit Acidovorax, von Variovorax als nächster Gattung trennten sie jedoch bereits 2%. Die Astlängen beschrieben eine unzulängliche Zuordnung zur Gattung Acidovorax. Innerhalb des Acidovorax-Zweiges waren weiterhin 5 Sequenzgruppen auf Artniveau zu unterscheiden: Acidovorax facilis, Acidovorax temperans, Acidovorax spec. I bis III. Der Zweig Acidovorax temperans wurde mit der Referenzsequenz A. temperans LMG7169 und den drei artidentischen Isolaten SA8-021, -022, -063 klar umrissen (min. 99,3% Sim. auf 465-1090 Basen). Die drei Isolate SA8-125, SA5-20, -04 bildeten einen artidentischen Acidovorax facilis-Zweig (469-475 Basen, min. 99% Sim. mit A. facilis LMG2193). Sehr gering war der Abstand von A. facilis LMG2193 zu den zwei bislang nicht als Art benannten Stämmen Acidovorax spec. LMG11307 und EF 16. Insgesamt 12 Isolate wurden mit 96,2-99,5% Übereinstimmung zu Acidovorax spec. und 96,2-99% zu Acidovorax facilis (694-1202 Basen) als Gattung Acidovorax identifiziert. Zu unterscheiden waren der Zweig Acidovorax spec. I, mit den Isolaten SA5-26, -48, SA8-044 und oXy-25a, und der Zweig Acidovorax spec. II mit dem Isolat SA5-50. Wie das Den-drogramm zeigte, bildeten die Isolate SA8-016, -039, -045, -094 einen weiteren, distinkten Zweig mit den Acidovorax spec. III (mindestens 95,8% Sim. auf 476-1096 Basen). Die TPCR konnte diese Sequenzen keiner Gattung zuordnen, aber mit 96-98% Ähnlichkeit zu Hydrogenophaga palleroni und nur 0,7-1,2% Abstand zu Acidovorax temperans wurde die Stellung bereits indiziert. Die Gruppierung der Isolate innerhalb der Acidovorax-Gruppe machte es wahrscheinlich, daß verschiedene, nicht in der Datenbank enthaltenen Arten isoliert wurden, die für die Spittelwasserpopulation von Bedeutung sind. Die Charakterisierung der Acidovorax spec. EF16 und LMG11307 wäre in diesem Zusammenhang sehr interessant. Ergebnisse Beta-Proteobakterien Rubrivivax gelatinosus -Gruppe - Rubrivivax -Untergruppe 54 77 SA8 125 SA5 03, SA5 14, SA5 33 Acidovorax facilis LMG2193 57 SA5 04 SA5 20 Acidovorax spec. EF 16 SA5 18 SA5 43 SA5 45 SA5 27 SA8 061 Acidovorax spec. LMG11307 oXy 25a SA8 044 SA5 26 SA5 48 SA5 37a SA5 50 84 SA8 039 53 SA8 094 94 99 SA8 016 SA8 045 68 SA8 022 SA8 063 83 Acidovorax temperans LMG7169 51 SA8 021 Acidovorax delafieldii LMG5943 SA5 47 Acidovorax avenae avenae LMG2117 Acidovorax konjakii LMG5691 52 SA8 128 69 SA8 072 67 Variovorax paradoxus LMG1797 Rhodoferax fermentans FR2 JCM7819 SA8 012TPCR SA8 037TPCR SA5 16 65 51 SA8 049TPCR Comamonas testosteroni ATCC11996 69 Comamonas terrigena LMG1253 85 Comamonas acidovorans LMG1226 Hydrogenophaga taeniospiralis LMG7170 87 Brachymonas denitrificans ASP1 92 SA5 29a 97 Ideonella dechloratans CCUG30898l Rubrivivax gelatinosus str. ATH 2.2.1 ATCC11169 Nitrosomonas europae 88 - Bordetella-Untergruppe SA5 37b 100 Alcaligenes faecalis ATCC8750 97 Bordetella bronchiseptica str. S1 Alcaligenes xylosoxidans sp. denitrificans ATCC15173 99 Ralstonia solanacearum ATCC27512 Ralstonia eutrophus str. 335 ATCC17697 Rhodocyclus-Gruppe 53 Rhodocyclus tenuis str. 2761 DSM109 100 Thauera selenatis str. Ax ATCC55363 92 SA5 34 Azoarcus indiges str. VB32 Zoogloea ramigera ATCC19544 76 Methylobacillus flagellatum str. KT1 Nei sseria-Gruppe 74 SA8 004 TPCR 78 80 Chromobacterium violoaceum ATCC12472 57 Vitreoscilla stercoraria ATCC15218 Kingella denitrificans ATCC33394 73 Iodobacter fluviatile ATCC33051 91 Stenotrophomonas maltophilia LMG958 Chromatium tepidum str. MC ATCC43061 Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus ATCC33604 Pseudomonas aeruginosa str. NIH 18 ATCC25330 Gamma-Proteobakterien 0.1 Abb. 3.24 Sequenzanalyse der β-Proteobakterien Legende: Phylip-Analyse ohne Gewichtung der Sequenzen: Berechnung der Distanzen nach Jukes & Kantor, Berechnung des Dendrogramms mit Fitch, Bootstrap-Analyse für 100 Ansätze (Werte ab 50% angegeben) 16S rDNA TPCR- bzw. Gesamt-PCR-Sequenzierung vom 5´Ende 425-1520 Basen Isolate in Fettdruck, Outgroup grau unterlegt 3-129 Tab. 3.17 Sequenzergebnisse: β-Proteobakterien Gesamt-PCR (5´Ende, ab E.coli-Position 7) Klassifikation Isolat Sim [%] bp Taxon TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Sim [%] bp Taxon Rubrivivax gelatinosus -Gruppe (RDP 2.13.2.2) Rubrivivax -Untergruppe (RDP 2.13.2.2.6) Acidovorax facilis Acidovorax temperans Acidovorax I Acidovorax II Acidovorax III . SA8-125 SA5-20 SA5-04 SA8-021 SA8-063 SA8-022 oXy-25a SA8-044 SA8-061 SA5-03 SA5-14 SA5-33 SA5-18 SA5-43 SA5-45 SA5-27 SA5-26 SA5-48 SA5-50 SA8-094 SA8-016 SA8-039 SA8-045 SA5-37a SA5-47 99,2-100 99,4-99,8 99,2-99,6 99,4 99,3 99,4 99,0-99,3 98,0-98,6 98,8-99,3 98,8-99,5 98,7-99,3 97,7-98,1 97,6-98,4 98,9-99,3 98,5-99,3 98,5-99,3 98,4-98,9 97,9-98,3 96,2-96,7 96,0-96,8 95,8-96,6 95,8-96,1 95,9-96,5 92,3-92,7 92,0-92,6 476 469 475 1090 1010 465 694 1022 763 1202 1197 1080 1194 1202 1200 1197 921 1197 1146 476 476 483 1096 441 824 (A. spec. LMG11307 / EF16)- A. facilis A. temperans LMG7169M,V,S A. facilis - A. spec. (A. facilis / delafieldii ) - A. temperans A. delafieldi - A. temperans (A. facilis / temperans) - A. spec. A. spec. - A. facilis 100 99,4 99,4 99,2-100 99,4 98,5 100 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 99,5 98,4 99,5 98,2 97,7 96,1 96,7-97,4 90,2-90,9 92,1-92,7 172 166 171 194 171 163 192 194 172 194 192 194 194 194 194 192 193 193 192 171 171 178 194 188 191 (A. facilis LMG2193M,V / A. spec. ) A. delafieldii LMG5943T - A. temperans A. temperans (A. facilis / A. spec. ) Hydrogenophaga palleroni LMG2366TM,V (H. palleroni / A. delafieldii) - A. temperans (A. facilis / A. spec. / delafieldii) - A. temperans (A. delafieldii / temperans) - A. facilis / A. spec. Gesamt-PCR (5´Ende, ab E.coli-Position 7) Klassifikation Isolat Sim [%] bp Taxon Rubrivivax gelatinosus -Gruppe (RDP 2.13.2.2) Rubrivivax -Untergruppe (RDP 2.13.2.2.6) Variovorax SA8-072 97,6 456 V. paradoxus LMG1797 Variovorax / Rhodoferax SA8-128 Comamonas . Rubrivivax / Ideonella SA8-049 SA8-012 SA8-037 SA5-16 SA5-29a 94,7-95,2 479 V. paradoxus - Rhodoferax fermentans FR2 JCM7819T / FR3 JCM7820 . . . . . . . . . 91,4-91,6 767 (C. testosteroni / A. ave. avenae) - A. temperans 94,2 476 Ideonella dechloratans CCUG30898TM TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Sim [%] bp Taxon 94,9-95,5 177 V. paradoxus - A. facilis / A. spec. 95,9-96,5 172 A. avenae avenae LMG2117 - V. paradoxus 99,0 96,3-96,9 96,4 96,5 94,7-95,0 191 191 193 172 169 Comamonas testosteroni ATCC11996E (A. konjacii LMG5691TM,V) - C. testosteroni C. testosteroni A. konjacii (Rubrivivax gelatinosus 2.2.1) - I. dechloratans Bordetella -Unterguppe (RDP 2.13.2.2.5) Alcaligenes / Bordetella SA5-37b 95,4-96,1 1525 (A. faecalis ATCC8750 / A.xylosoxidans denitrificans) - B. bronchiosepticaE 93,7-93,8 193 (A.xyl. denit. ATCC15173) - B. bronchioseptica Rhodocyclus -Gruppe (RDP 2.13.2.4) Thauera / Azoarcus SA5-34 93,8 747 Thauera selenatis ATCC55363 96,4 166 T. selenatis Neisseria -Gruppe (RDP 2.13.2.1) . SA8-004 . . 93,0 171 Chromobacterium violaceum ATCC12472 . Legende : Sim Similarity, Übereinstimmung bp Anzahl verglichener Basen Klassifikation Art 16S rDNA ≥98% Sim., 16S rDNA-Teilsequenz (ca. 500 Basen ) ≥99% Sim. . nicht bestimmt 16S rDNA 90-98% Sim., TPCR ≥98% Sim. Vergleich mit Referenzsequenzen der EMBL (E) und RDP (R)-Datenbank; Labor E. Moore (M), P. DeVos (V) [16S rDNA, Gesamt-PCR] Gattung 3-132 Ergebnisse β/γ- und γ-Proteobakterien Die Referenzsequenzen der γ- und β/γ-Proteobakterien ermöglichten die Beschreibung der systematischen Stellung von 23 Sequenzen (Tab. 3.18, Abb. 3.25 ). Die Gruppe Pseudomonas & Verwandte umfaßte in den Untergruppen Pseudomonas und Acinetobacter 16 Isolate: Von der Probenahme Mai 1993 wurden zwei SA-Isolate, von der Probenahme 8/93 sechs SA- und acht Xenobiotika-Isolate analysiert (Ant, Nap, 3CB). • Isolate der Pseudomonas-Untergruppe wurden durch die TPCR bereits eindeutig der Gattung zugeordnet. Die kompletten 16S rDNA-Sequenzen bestätigten, daß die Isolate keiner bekannten Art angehören. Sie wurden 3 der von Moore et al. [1996] definierten Pseudomonas-Zweige zugeordnet: 1) Die Isolate 3CB-27c und Ant-12 bilden innerhalb des P. fluorescens-Zweiges vermutlich eine neue Art (ca. 98,5% Sim.). 2) Die Isolate Ant-15, -25, -39 und -31b ergaben einen eigenen Ast im P. agarici-Zweig und wurden mit max. 97,7% Sim. zu den nächsten Referenzstämmen als unbekannte Art definiert. 3) Innerhalb des P. aeruginosa-Zweiges wurden 5 Isolate auf 3 separaten Ästen bestimmt (SA5-24, -49, Nap-30, -47c, SA8-006). Die Position von SA8-006 war allerdings nicht eindeutig bestimmbar und die Gültigkeit der Klassifikation innerhalb des P. aeruginosa-Zweiges blieb fraglich. • Die Acinetobacter-Gruppe umfaßte die 3 gattungsidentischen Isolate SA8-089, -137 und -144 (94,796,4% Sim. auf 477-781 Basen). Die Zweiglängen implizierten zwei unabhängige, nicht in der Datenbank enthaltene Arten. Das Isolat SA8-002 wurde durch die TPCR-Sequenz zwischen Moraxella und Acinetobacter plaziert. Mit einen Bootstrap-Wert von 77% ergab die Gesamt-PCR (89,1% Sim. auf 478 Basen) eine relativ stabile Positionierung in diesem Bereich. Die Xanthomonas-Gruppe entspricht dem Übergangsbereich zwischen β- und γ-Proteobakterien. Das Dendrogramm Abb. 3.25 veranschaulicht den Abstand zu den eigentlichen γ- und β-Proteobakterien (letztere dienten als Outgroup). In diesen Bereich fielen 7 Sequenzen der mit SA angereicherten Isolate (6 Isolate der Probenahme 8/93, ein Isolat von 5/93). Die TPCR ergab 88,2-97,9% Sim. für die bekannten Gattungen Xanthomonas, Stenotrophomonas und Xylella (vergl. Tab. 3.18). Die weitere Sequenzierung ergab auf 484-518 Basen maximal 90,1-92,8% Sim. für Xyllela bzw. Stenotrophomonas. Die Isolate entsprachen damit keiner Gattung der Datenbank. Die Isolate SA8-023, -030, -038, -057 und -074 wiesen bereits in der TPCR sehr geringe Ähnlichkeit (87,6-89,3%) mit diesen Gattungen auf, nur wenig mehr als für γ- und β-Proteobakterien. Die RDP-Analyse bestätigte geringe Werte und ergab ebenfalls keine eindeutige Zuordnung. SA8-074 zeigte bei nur 1% Differenz zwischen den genannten Taxa sogar 89% Ähnlichkeit zur nächsten β-Proteobakteriengattung (Burkholderia). Die mehr als 99%ige Übereinstimmung mit den Isolaten SA8-023 und -057 plazierte es jedoch eindeutig innerhalb der fraglichen Gruppe. Ergebnisse 54 80 98 51 86 79 84 51 94 93 99 3CB 27c Pseudomonas & Verwandte Ant 12 - Pseudomonas - Untergruppe Pseudomonas marginalis marginalis LMG2210 Pseudomonas tolaasii LMG2342 Pseudomonas fluorescens DSM50090T Pseudomonas chlororaphis LMG5004 Pseudomonas syringae LMG1247t1 80 Pseudomonas cichorii LMG2162 72 Ant 39 100 Ant 15 73 Ant 25 68 Ant 31b Pseudomonas agarici LMG2112 62 Pseudomonas oryzihabitans IAM1568 Pseudomonas putida DSM291 57 Pseudomonas asplenii LMG2137 55 SA5 24 SA5 49 Pseudomonas balearica DSM6083 SA8 060 100 TPCR 95 Nap 30 76 Nap 47c Pseudomonas citronellolis DSM50332 Pseudomonas resinovorans LMG2274 Pseudomonas alcaligenes LMG1224 Pseudomonas aeruginosa LMG1242 SA8 006 Pseudomonas stutzeri CCUG11256 Pseudomonas mendocina LMG1223 50 Pseudomonas flavescens NCPPB3063 80 Acinetobacter lwoffii - Acinetobacter - Untergruppe SA8 089 Acinetobacter radioresistens DSM6976 Acinetobacter anitratum 100 SA8 137 99 SA8 144 70 77 Acinetobacter johnsonii DSM6963 Acinetobacter calcoaceticus ATCC33604 99 SA8 002 Moraxella lacunata NCTC11011 51 Teredinibacter turnerae str. T7902 ATCC39867 Oceanospirillum linum ATCC11336 Thiomicrospira thyasirae str.TG-2DSM5322 98 Escherichia coli 99 Vibrio parahaemolyticus str. 113 ATCC17802 62 Pseudoalteromonas haloplanktis ATCC14393 Methylococcus capsulatus str. BATH Coxiella burnetii str. Q177 Chromatium tepidum str. MC ATCC43061 Thiobacillus hydrothermalis str. R3 Xanthomonas fragariae LMG708 Xanthomonas - Gruppe 85 Xanthomonas oryzae LMG5047 100 Xanthomonas populi LMG5743 73 Xanthomonas axonopodis LMG538 100 Xanthomonas albilineans LMG494 51 Xanthomonas campestris graminis LMG726 Stenotrophomonas maltophilia LMG958 82 SA8 011 52 3CB-Isolat M.Yakimov 2.´MY 93 SA8 062 TPCR Xylella fastidiosa str. PWT-100 ATCC35880 SA5 38 96 66 SA8 023 SA8 057 100 89 SA8 074 SA8 030 Iodobacter fluviatile ATCC33051 Chromobacterium violaceum ATCC 12472 Zoogloea ramigera ATCC19544 Thauera selenatis str. Ax ATCC55363 Nitrosomonas europaea Alcaligenes xylosoxidans ssp. denitrificans ATCC15173 Rubrivivax gelatinosus str. ATH2.2.1 ATCC11169 Comamonas testosteroni LMG1800 Beta-Proteobakterien Gamma-Proteobakterien 0.1 Abb. 3.25 Sequenzanalyse der β/γ- und γ-Proteobakterien Legende: Phylip-Analyse ohne Gewichtung der Sequenzen: Berechnung der Distanzen nach Jukes & Kantor, Berechnung des Dendrogramms mit Fitch, Bootstrap-Analyse für 100 Ansätze (Werte ab 50% angegeben) 16S rDNA TPCR- bzw. Gesamt-PCR-Sequenzierung vom 5´Ende 425-1520 Basen Isolate in Fettdruck, Outgroup grau unterlegt 3-133 Tab. 3.18 Sequenzergebnisse: β/γ- und γ-Proteobakterien Gesamt-PCR (5´Ende, ab E.coli-Position 7) Klassifikation Isolat Sim [%] bp Taxon TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Sim [%] bp Taxon Pseudomonas & Verwandte (RDP 2.13.3.10) Pseudomonas Untergruppe (RDP 2.13.3.10.3) P. fluorescens 3CB-27c -Zweig* Ant-12 P. agarici -Zweig* Ant-31b Ant-15 Ant-25 Ant-39 P. aeruginosa - SA5-24 Zweig* SA5-49 SA8-060 Nap-30 Nap-47c SA8-006 98,0-98,5 1509 (P.aureofaciens LMG6698 / chlororaphis LMG5004 98,2-98,6 1507 / marginalis LMG2210T) - (P. tolaasii LMG2342 / fluorescens DSM50090M) 97,0-97,7 1509 (P.agarici LMG2112T / asplenii LMG2137TM / putida DSM291T / tolaasii) - P.oryzihabitans IAM1568M 96,8-97,2 1510 (P.aureofaciens / chlororaphis / oryzihabitans / putida) - (P.agarici / asplenii) 96,9-97,2 1511 96,7-97,0 1510 (P oryzihabitans / putida) - (P.agarici / asplenii / aureofaciens) 93,3-93,6 939 (P.alcaligenes LMG1224TM) - P.stutzeri CCUG11256B 94,2 495 P.alcaligenes LMG1224TM . . . 97,8 1510 P.citronellolis DSM50332TM 97,4 1520 93,5-93,8 1112 (P.aureofaciens LMG1245 / pseudoalcaligenes / oleovorans) - P.mendocina 100 194 (P.coronofaciens LMG13190T / ficuserectae 100 194 LMG5694TM) 97,9-98,5 194 (P.agarici / asplenii / balearica DSM6083TB / LMG1402B / flavescens NCPPB3063 / fluorescens / mendocina LMG1223T / syringae LMG1247Tt1 / taetrolens LMG2336T) - P.viridiflava LMG2352TM 96,4 181 P.stanieri LMG6847TM 96,4 181 96,4 181 99,5-100 191 (P.aureofaciens / citronellolis / pseudoalcaligenes / stutzeri) - P. ba1earica 98,4-98,8 171 (P.stanieri ) - P. balearica / resinovoransLMG2274M 99,5-100 194 (P. balearica / oleovorans DSM1045 / resinovorans ) (P. aureofaciens LMG1245 / pseudoalcaligenes DSM50188 / LMG1225TM) 99,5-100 194 (P.aeruginosa LMG1242M / ba1earica / resinovorans / stanierii) - (P.alcaligenes / citronellolis DSM50332TM / stutzeri) 99,7-100 194 P.stanieri - P.resinovorans 98,4-98,6 178 (P.mendocina / resinovorans) - P.stanieri Gesamt-PCR (5´Ende, ab E.coli-Position 7) Klassifikation Isolat Sim [%] bp Taxon TPCR-Fragmente (E. coli-Position 341-534) Sim [%] bp Taxon 99,0 95,3 95,4 89,0-89,3 195 A. lwofiiR 172 A. calcoaceticusR 194 178 Moraxella catarrhalis NCTC11020TE - A. johnsonii Pseudomonas & Verwandte (RDP 2.13.3.10) Acinetobacter -Untergruppe (RDP 2.13.3.10.1) Acinetobacter . SA8-089 SA8-144 SA8-137 SA8-002 94,9 94,7 96,4 89,1 730 A. lwofiiR 477 A. johnsonii DSM6963R 781 478 A. radioresistens DSM6976R Xanthomonas -Gruppe (RDP 2.13.3.4) . SA8-011 SA8-062 SA5-38 SA8-023 SA8-057 SA8-030 SA8-074 92,8 495 Stenotrophomonas maltophilia LMG958TM,H . . . 89,4-89,6 484 (S. maltophilia LMG11114M,H / X. c.citri / populi) (X. c. campestris / oryzae) 89,4 518 Xylella fastidiosa PWT100 ATCC35880R 90,1 487 87,4-87,7 509 Xy. fastidiosa - S. maltophilia LMG958TM,H . . . 97,9 193 (Xanthomonas campestris campestris LMG568T / c.citri LMG682T / c.translucens LMG876T / c.graminis LMG726T / oryzae LMG5047T / populi LMG5743TH) 95,7 162 (X. albilineans LMG494TM,H / c.graminis / oryzae / populi) 97,4 194 X. albilineans 88,9-89,3 89,0-89,5 87,6-88,2 88,5 162 S. maltophilia LMG958 - S.maltophilia LMG11087M,H 172 178 S. maltophilia LMG11087 - S.maltophilia LMG958M,H 172 Xy. fastidiosa PWT100 Legende : Sim Similarity, Übereinstimmung bp Anzahl verglichener Basen nicht bestimmt . Klassifikation Vergleich mit Referenzsequenzen der EMBL (E) und RDP (R)-Datenbank; Labor E. Moore (M), T. Bennasar (B), L. Hauben (H) [16S rDNA, Gesamt-PCR] 3-136 Ergebnisse Phänotypisch nicht bestimmbare Isolate Ein hoher Prozentsatz der Isolate konnte mittels der wachstumsabhängigen, phänotypischen Methoden (BIOLOG, FAME) nicht bestimmt werden. Anhand des TGGE-Sreenings wurden rund 30%, dieser zumeist mit SA angereicherten Isolate, für die 16S rDNA-Sequenzanalyse ausgewählt. Wie im vorherigen Kapitel ausgeführt, war die Bestimmung zum Teil nur über die kurzen Fragmente der TPCR möglich. Tab. 3.19 zeigt die taxonomische Zuordnung der Sequenzen in Abhängigkeit vom Gram-Verhalten (soweit bestimmbar). Augenfällig war die Unzulänglichkeit der Gram-positiven Bestimmung: Die angenommenen Gram-positiven Isolate waren alle Gram-negative Proteobakterien. Nur für Isolate, die aufgrund ihres geringen Wuchses nicht Gram-bestimmbar waren, ergab die Sequenzanalyse zwei Grampositive Taxa (u.a. die einzige Sequenz niedrig G+C-haltiger Bakterien), außerdem auch ein Taxon der CYF-Gruppe. Beide Phyla wurden nur bei spezifischer Anreicherung mit Xenobiotioka in größerer Zahl isoliert (CYF speziell mit o-Xylol und 24D). Alle anderen Sequenzen SA-isolierter Stämme entsprachen Proteobakterien: 4 Stämme wurden als β/γ-Proteobakterien (Xanthomonas-Gruppe), 5 Stämme als γ-Proteobakterien, 8 Stämme als α-Proteobakte-rien und 11 Stämme als β-Proteobakterien bestimmt. Die Sequenzen der 31 ausgewählten Isolate beschrieben mindestens 23 Arten die nicht in der 16S rDNA Datenbank enthalten sind. Sie entsprachen den Taxa in der Datenbank maximal auf Gattungsniveau. Einzig für Isolat SA8-021 ergab größere Übereinstimmung mit der Art Acidovorax temperans. Die Bilanz verdeutlicht die Notwendigkeit der weitergehenden Charakterisierung derartiger Stämme zur Beschreibung der mikrobiellen Populationen. Die Isolate waren vielfach mit Gattungen verwandt, die in den FAME oder BIOLOG-Datenbanken enthalten waren: Agrobacterium, Methylobacterium-ähnliche [α], Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxellaähnliche [γ], Acidovorax, Comamonas [β], Xanthomonas, Stenotrophomonas [β/γ] sowie Flavobacterium [CYF] wurden auch phänotypisch bestimmt. Die genetisch beschriebenen Isolate konnten aufgrund ihres schlechten Wuchses auf Komplexmedium mit den kommerziellen Testsystemen nicht bestimmt werden. Hierin unterschieden sich die als „Wildstämme“ zu bezeichnenden Stämme von den bekannten, in den Datenbanken beschriebenen „Laborstämmen“. Eine Acinetobacter / Moraxella-ähnliche Sequenz [γ] entspricht den BIOLOG-Identifikationen des BCl 41 und bestätigte indirekt die angenommene Indifferenz der phänotypischen Gattungsbestimmung bei geringer Anzahl positiver BIOLOG-Tests. Je ein SA-Isolat wurde den Gattungsgruppen Methylobacterium / Beijerinckia / Rhodospirillum (SA8-147) und Methylobacterium / Hyphomicrobium / Rhodohalobium (SA8-025) zugeordnet. Diese Gattungen wurden mit den Identifikationssystemen nicht erfaßt. Aus der Beschreibung der Taxa ergab sich, daß aufgrund des anaeroben Verhaltens eine nähere Verwandtschaft mit Rhodospirillum (Schlegel [1981]) auszuschließen ist. Die Salztoleranz von Beijerinckia und das ubiquitäre Vorkommen von Methylobacterium ließen dagegen das Vorkommen ähnlicher Arten im Spittelwasssersediment möglich erscheinen. Ergebnisse Tab. 3.19 Sequenzierung stoffwechselphysiologisch nicht bestimmbarer Isolate Sequenzierung Gr Isolat nächste taxonomische Einheit nicht Gram-bestimmbare Isolate (7 von 33 Isolaten sequenziert) aP (Methylobacterium / Beijerinckia / Rhodospirillum) Agrobacterium/Zoogloea I bP (Ideonella / Rubrivivax) CYF Flexibacter / Flavobacterium gP (Acinetobacter / Moraxella) hGC (Propionibacterium) I nGC Staphylococcus SA8-147 SA8-053 SA5-29a 24D-14 SA8-002 SA5-44 SA8-028 Gram-positiv bestimmte Isolate (7 von 24 Isolaten sequenziert) aP (Hyphomicrobium / Rhodohalobium / Methylobacterium) Agrobacterium Agrobacterium / Zoogloea I b/gP (Xanthomonas) bP Comamonas gP Acinetobacter (johnsonii) Pseudomonas aeruginosa-Zweig* II (Pseudomonas mendocina) SA8-025 SA8-046 SA8-007 SA8-062 SA8-049 SA8-144 SA8-006 Gram-negativ bestimmte Isolate (17 von 53 Isolaten sequenziert) aP (Acetobacter) Agrobacterium Paracoccus / Rhodobacter b/gP (Xylella) bP (Chromobacterium) (Comamonas) (Variovorax / Rhodoferax) Acidovorax (facilis) Acidovorax temperans gP Pseudomonas aeruginosa-Zweig* (P.aureofaciens / pseudoalcaligenes) Pseudomonas aeruginosa-Zweig* I (P.alcaligenes) SUMME sequenzierte Isolate: SA8-050 SA8-066 SA5-25 SA8-023, -057, -074 SA8-004 SA8-012, -037 SA8-128 SA5-03, -18, -43, SA8-061 SA8-021 SA8-060 SA5-49 31 Legende: * Pseudomonas-rRNA-Zweige nach Moore et al. [1996] Gr phylogenetische Hauptgruppe: α-, β-, γ-Proteobakterien (aP, bP, gP), Gram-positiv mit hohem / niedrigem G+C-Gehalt (hGC / nGC), Cytophaga-Bacteroides-Flavobakterien-Gruppe (CYF) Klassifizierung der Sequenzen nach Dendrogrammen und Ähnlichkeitswerten (siehe Sequenzergebnisse einzelner Hauptgruppen); Taxa in Klammern entsprechen den nächstmöglichen Verwandten; differenzierte Einheiten (möglicherweise neue Arten) wurden numeriert Die Sequenzierung der Gattungsgruppe Variovorax / Rhodoferax (SA8-128) stellte eine neue Variante der umfangreich, mit einer ganzen Reihe anzunehmender neuer Gattungen und Arten bestimmten Rubrivivax-Gruppe dar. Neu war auch die Bestimmung von SA-Isolaten als Staphylococcus, Propionibacterium-ähnlich [Gram-positiv], Xylella- [β/γ-], Chromobacterium-[β-], Acetobacter-ähnlich und der Gat- 3-137 3-138 Ergebnisse tungsgruppe Paracoccus / Rhodobacter [α-Proteobakterien]. Zwar wurde durch BIOLOG bereits ein Isolat als Staphylococcus-„ähnlich“ bestimmt (Xenobiotika-Isolat 4CS-04, BCl G), aber die weiteren Analysen widerlegten das Vorkommen der niedrig G+C-haltigen Gattung. Das Vorkommen von Paracoccus war aufgrund der regelmäßigen Isolierung von P. denitrificans aus Böden und Unterwasserböden (Gamble et al. [1977]) zu vermuten, konnte hier aber phänotypisch und genotypisch nicht nachgewiesen werden. Die Klassifizierung der Propionibacterium-ähnlichen Art für SA5-44 zeigte, daß mit Sedimentextrakt wahrscheinlich auch mikroaerophile Taxa (Schlegel [1981]) erfaßbar waren: Zur Sequenzierung wurden die Stämme in Flüssigkultur angezogen, daß heißt bei längerer Inkubation konnten sich mikroaerophile Bedingungen einstellen, die das Wachstum fördern. Die phänotypische Bestimmung war dagegen bei mikroaerophilem Verhalten unmöglich. Die taxonomische Struktur dieser Fraktion phänotypisch nicht-bestimmbarer Isolate ergänzte den Befund der BIOLOG- und TGGE-Analyse: • Die Gram-positiven Bakterien und Vertreter der Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe machten zahlenmäßig einen sehr geringen Anteil an der Gesamtpopulation isolierbarer Bakterien aus. • Die Populationen wurden von Proteobakterien dominiert. Die Sequenzierung bestätigte die im BIOLOG-Screening nachgewiesene starke Präsenz der β-Proteobakterien auch unter den phänotypisch nicht-bestimmbaren Isolaten. Sie betätigte aber auch, daß die im TGGE-Screening in hoher Zahl nachgewiesenen α-Proteobakterien einen bedeutenden Anteil an der Population haben und mit dem phänotypischen Identifikationssystem nicht hinreichend erfaßt wurden. 3.4.2.2 Vergleich der Sequenzierung mit der mikrobiologischen Bestimmung Ziel dieser Arbeit war eine möglichst umfassende phänotypische und genotypische Charakterisierung der isolierbaren Bakterienpopulationen. Aus der Anwendung verschiedener Methoden auf gleiche Untersuchungseinheiten ergab sich die Notwendigkeit des Vergleichs der unterschiedenen Gruppen und Identifikationen. Da dieser Vergleich nicht Selbstzweck der vorgelegten Arbeit war, beschränkte er sich auf die für die Populationsuntersuchung relevanten Bereiche, die sich aus der Bestimmung der Bakterien sukzessiv ergaben. Die unterschiedlichen Aspekte der Datenerfassung und Analyse mit den kommerziellen Iden-tifikationssystemen sind bei diesem Vergleich zu beachten: • Die isolierten Bakterienpopulationen wurden so weit als möglich mit dem BIOLOG-System charakterisiert. Zum Screening der Bakterien wurde das System auch bei suboptimalem Wachstum der Bakterien angewandt, entsprechend zeigten sich Probleme bei der Identifizierung. Aufgrund des Datenumfangs wurde die Sequenzierung nur für Cluster mit fraglicher Identität oder fraglichen Identifikationen angewandt. Nur diese „negativen Aspekte“ wurden in der Sequenzanalyse verifiziert, nicht die Identifikationen allgemein. Ergebnisse • Mit dem FAME-System wurden die BIOLOG-Ergebnisse verifiziert. Aufgrund der spezifischeren Testbedingungen konnte nur eine begrenzte Zahl der BIOLOG-bestimmbaren Isolate analysiert werden. Die Sequenzanalyse erfasste einzelne Stämme für die Identifikationenen beider Systeme vorlagen. Diese wurden im Folgenden vergleichend gegenübergestellt. Es ist zu betonen, daß sie keine repräsentative Stichprobe der FAME-analysierten Isolate darstellen. BIOLOG Von den bestimmten BIOLOG-Clustern wurden einzelne Isolate ausgewählt, deren Sequenzanalyse die Variabilität der Identifikationen in bzw. über die Cluster hinweg klären sollte. Die Tab. 3.20 stellt die BIOLOG-Identifikationen und Cluster (BCl ) der genetischen Zuordnung der Stämme gegenüber. Die häufig divergenten Ergebnisse ließen vor allem die Unzulänglichkeit der taxonomischen Bestimmung für Umweltisolate mit geringem Wuchs unter Laborbedingungen erkennen. Gram-positive Identifikationen Die mit BIOLOG-bestimmten Gram-positiven Isolate wurden zusätzlich intensiv mit dem FAMESystem bestimmt. Die Sequenzierung beschränkte sich daher auf 21 Stämme der dominierenden Cluster sowie einzelne fragliche Identifikationen: Vorrangig wurden das BCl G mit Bakterien mit hohem G+CGehalt analysiert und Isolate der BCl A-F, ohne Ähnlichkeit mit Taxa in der BIOLOG-Datenbank. Die Sequenzen beschrieben Gram-positive Taxa mit hohem G+C-Gehalt (BCl B-I), aber auch α-Proteobakterien, d.h. falsch Gram-bestimmte Isolate. Letztere waren durch die Clusteranalyse zumeist entsprechend gruppiert und korrekt nicht-identifiziert worden (BCl G, H, N, Q). Die α-Proteobakterien entstammten der Rhizobium-Agrobacterium-Gruppe, bis auf ein falsch identifiziertes Micrococcus diversus-Isolat in BCl N (BIOLOG: unwahrscheinlich aufgrund <20% Aktivität), das der Sphingomonas-Gruppe entsprach (SA8-090). Nur die mit zwei Arten sequenzierte Gattung Ochrobactrum ließ sich in der BIOLOG-Analyse nicht von den Gram-positiven Taxa trennen: In BCl D wurde unter den nicht einzuordnenden Isolaten und in BCl I zwischen 2 Aureobacterium saperdae identifizierten Isolaten, je 1 Ochrobactrum-Stamm bestimmt (BIOLOG: nicht identifiziert). Einzelne Sequenzen Gram-positiver Isolate der Cluster A-F, deren klar differenzierbare „breathprints“ keine Ähnlichkeit mit Taxa der BIOLOG-Datenbank aufwiesen, entsprachen bislang offenbar unbekannten Arten. Die Klassifikation von Propionibacterium (eine ähnliche Sequenz in BCl B) und Mycobacterium (BCl E) ergab zwei nicht in der BIOLOG-Datenbank enthaltene Gattungen. 3-139 3-140 Ergebnisse Tab. 3.20 BIOLOG-analysierte Isolate BCl B C D E F G BIOLOG Identifikation N N N N N Arcanobac. haemolyticum Aureobacterium saperdae, N N ∑ 5 17 22 7 2 55 5 Sequenzierung Gr hGC (Propionibacterium) II Rhodococcus aP Ochrobactrum II hGC Mycobacterium Aureobac. / Microbacterium II h(n)6GC Aureobacterium liquefaciens Gr . H7 N: Bacillus (hGC) aP I Aureobacterium saperdae hGC hGC N 3 aP N7 Micrococcus diversus (hGC) N: Corynebacterium 3 Q N: Curtobacterium 1 (hGC) 1 Pseudomonas nitroreducens 11 gP gP 3 Pseudomonas putida B P. corrugata, P. fluorescens B P. corrugata, P. marginalis 20 5 N 1 bP . 11 Ochrobactrum anthropi aP aP N: Ochrobactrum 5 12 N 1 (aP) 18 N 1 aP . 19 N 1 bP . 20 P.pseudoalcaligenes 1 gP 22 N 1 (gP) 28 Acinetobacter johnsonii /gsp.7 3 gP 29 Alcaligenes faecalis Type II gP+bP Comamonas terrigena 5 30 Acidovorax facilis2 30 bP 32 Comamonas terrigena, N 5 33 N: Brevundimonas 1 (aP) 34 Alcaligenes faecalis Type II,N 3 b(g)3P gP 35 N: Acinetobacter 1 (gP) 36 Ancylobacter aquaticus 1 aP aP 37 Comamonas terrigena, N 5 bP bP 41 Acinetobacter radioresistens g,a(b)4P Moraxella atlantae Moraxella bovis Brucella abortus Lampropedia hyalina, N P. carboxydohydrogena b/gP Moraxella Moraxella osloensis 36 gP 42 Psychrobacter immobilis 4 g(a)5P bP 43 Brevundimonas vesicularis 6 aP aP 44 N (g+aP) b/gP N: Pasteurella 8 aP 48 CDC IIh 1 CYF 49 N: CDC IIh 3 bP SUMME bestimmte Isolate: 400 Aureobac / Microbacterium II, III (Corynebac. / Curtobac.-ähnlich) Agrobacterium,Agb. / Zoogloea I Aureobac. / Microbacterium I Ochrobactrum II Erythrobacter Azorhizobium (Ochrobac. / Rhodohal / Devosia) (P. citronellosis) PaeZ* (P.oryzihabitans) PagZ* (P.agarici / P. asplenii) PagZ* (P.marginalis) PfZ* Acidovorax facilis Ochrobactrum anthropi Ochrobactrum I Ochrobactrum (anthropi) (Caulobacter / Sphingomonas) Variovorax Acidovorax (temperans) III Acidovorax (temperans) III (Comamonas / Acidovorax) Acidovorax temperans Acidovorax (temperans) III Acidovorax temperans A.(facilis) I, (Acidovorax), Alcaligenes / Bordetella (Acidovorax) II Acinetobacter (lwoffii) Acinetobacter (johnsonii) Ancylobacter Acidovorax facilis Acidovorax (facilis) I Acidovorax (facilis) I A.(temperans) III, A. facilis (Thauera) A. (facilis) I, (Acidovorax) II (Stenotrophom. / Xanthomonas) (Stenotrophomonas) (P.stutzeri) I PaeZ* Acidovorax (facilis) I Mycoplana bullata (Xylella / Stenotrophomonas) Mycoplana bullata (Caulobac / Mycopl / Brevundim) Acidovorax (facilis) I SUMME sequenzierte Isolate: Isolat SA5-46 24D-11 Nap-06 SA8-026 Nap-57 4CS-03 Nap-55a,-28b,-29 3CB-28a,Nap-36a oXy-06a,-28a SA8-038, -078 oXy-18a Nap-23 SA8-090 SA8-013 oXy-05c Nap-30,-47c Ant-31b Ant-25,-15,-39 3CB-27c,Ant-12 SA8-125 4CS-11 Ant-291 oXy-07d1 SA8-079 SA8-072 SA8-094 SA8-016 SA5-16 SA8-063 SA8-039 SA8-022 SA5-48,-37a SA5-37b SA5-47 SA8-089 SA8-137 SA8-0321 SA5-04 SA5-26 SA5-14 SA8-045,SA5-20 SA5-34 SA5-45,-50 SA5-38 SA8-011 SA5-24 SA5-27 SA8-020 SA8-030 SA8-008 SA5-11 SA5-33 65 Ergebnisse Legende (Tab. 3.20): Gr * 1 2 3 4 5 6 7 phylogenetische Hauptgruppe: α-, β-, γ-Proteobakterien (aP, bP, gP), Gram-positiv mit hohem / niedrigem G+C-Gehalt (hGC / nGC), Cytophaga-Bacteroides-Flavobakterien-Gruppe (CYF) rRNA-Zweige nach Moore et al. [1996]: P. aeruginosa (PaeZ), P. agarici (PagZ), P. fluorescens (PfZ) Grambestimmung nicht eindeutig, wahrscheinlichste Identifikation war Gram-negativ (aP) Isolat wurde von der Comamonas testosteroni -Kerngruppe unterschieden eine Alcaligenes-Bestimmung, 3 Acinetobacter-ähnliche Isolate im Cluster eine fragliche Bestimmung für Kingella kingae (bP) eine fragliche Identifikation für Brevundimonas (aP) fragliche Brevibacillus brevis Identifikationen Identifikationen aufgrund geringer Aktivität sehr fraglich Anzahl Isolate im BIOLOG-Cluster BCl BIOLOG-Cluster: 1-49 Gram-negativ, A-Q Gram-positiv ∑ N: nicht identifiziert: ähnlichstes Taxon unbekannte Hauptgruppe . Klassifizierung der Sequenzen nach Dendrogrammen und Ähnlichkeitswerten (siehe Sequenzergebnisse einzelner Hauptgruppen); Taxa in Klammern entsprechen den nächstmöglichen Verwandten; differenzierte Einheiten (möglicherweise neue Arten) wurden numeriert Die Aureobacterium / Microbacterium-Sequenzen in BCl F, G und I zeigten physiologische Variabilität eines nicht näher zu bestimmenden Taxons. Die Sequenzierung von Isolaten des dominanten BCl G bestätigte allgemeines Vorherrschen der Taxa mit hohem G+C-Gehalt. Die Differenzierung unterschiedlicher Taxa im Cluster war aufgrund der geringen Aktivität mit BIOLOG fraglich, wurde aber ebenfalls durch die Sequenzen bestätigt: Die Kerngruppe des Clusters (BIOLOG: Identifikationen für Arcanobacterium, Aureobacterium und -ähnliche) wurde in Übereinstimmung mit den FAME-Ergebnissen als Gattung Aureobacterium identifiziert. Sequenzen die nur als Gattungsgruppe Aureobacterium / Microbacterium oder Corynebacterium / Curtobacterium-ähnliche definiert wurden (3CB-28a, Nap-36a, oXy-06a, -28a), waren physiologisch von der Kerngruppe zu unterscheiden. Trotz geringer Aktivität und fehlerhafter Identifikationen lieferte die Clusteranalyse ein gutes Ergebnis. Die gute Interpretationsmöglichkeit der BIOLOG-Analyse war vor allem auf die Anreicherung einer homogenen Population Gram-positiver Bakterien mit den Xenobiotika-Medien und die Bestimmung einer großen Zahl an Isolaten zurückzuführen. Gram-negative Identifikationen Der Schwerpunkt der Sequenzanalyse lag auf der näheren Bestimmung der vorherrschenden Gram-negativen Taxa. Die geringe Aktivität der Isolate erwies sich allgemein als problematisch bei der phänetischen Bestimmung der α-, β- und γ-Proteobakterien. In der BIOLOG-Analyse daher wurden die verschiedenen Proteobakteriengruppen in einigen Clustern vereint. Die Clusteranalyse erwies sich für diesen Bereich als unerläßlich, sie gab Hinweise auf invariante Taxa und falsche Identifikationen. Die in Teil II der Clusteranalyse Gram-negativer Bakterien (Abb. 3.11) definierten „problematischen Gruppen“ führten zur Sequenzierung taxonomisch bislang schlecht beschriebener, beziehungsweise schlecht definitierter Taxa wie z.B. Acidovorax (in BCl 20-33, 37-42) und Acinetobacter (in BCl 34, 35, 41), aber auch zur Sequenzierung deren den Sequenzen der 16S-Datenbank nicht eindeutig zuzuordnen waren. Letztere 3-141 3-142 Ergebnisse beschrieben die Gattungsgruppen Caulobacter / Sphingomonas, Caulobacter / Mycoplana / Brevundimonas, Xylella / Stenotrophomonas, Comamonas / Acidovorax und Alcaligenes / Bordetella, bzw. Thauera- und Acidovorax-ähnliche Sequenzen (BCl 29, 32, 41, 44, 48). Die detaillierte Sequenzanalyse der β-Proteobakterien verdeutlichte besonders die mangelnde Umsetzung neuerer systematischer Erkenntnisse (wie der genetisch definierten Gruppe Acidovorax) in die Bestimmungspraxis. Als Kerngruppen der β-Proteobakterien wurden zum einen BCl 19-33, zum anderen BCl 41 bestimmt. Die BIOLOG-Cluster 19-33, 37-42, 49 lieferten BIOLOG-Identifikationen bzw. Sequenzen für Vertreter der Rubrivivax-Untergruppe (Comamonas, Alcaligenes, Variovorax und v.a. Acidovorax). Die Sequenzen bewiesen besonders variables Verhalten dieser Gruppe im physiologischen Test und entsprechende phänotypische Differenzierungsprobleme: • Die Cluster zeigten stark divergierendes physiologisches Verhalten der Stämme: Ein als Acidovorax facilis sequenziertes Isolat (SA8-125) bildete BCl 5, im 1. Hauptzweig der BIOLOG-Clusteranalyse, während zwei weitere Stämme dieser Art in unterschiedlichen Clustern im 6. Hauptzweig positioniert wurden (SA5-04 BCl 37, SA5-20 BCl 41). Ebenso entsprachen zwei Isolate der genetisch definierten Acidovorax-Art III dem 5. Hauptzweig (SA8-094 BCl 20, SA8-016 BCl 22), ein weiterer Stamm dem 6. Hauptzweig (SA8-39 BCl 29). Die Acidovorax-Art I wurde in Hauptzweig 6 (BCl 32, 41, 42) und Hauptzweig 7 (BCl 49) bestimmt. Eine unbekannte Variovorax-Art wurde dem 4. Hauptzweig zugeordnet (SA8-072 BCl 19). Dabei wiesen die physiologischen Hauptzweige weniger als 20% Übereinstimmung auf. • Die Cluster zeigten physiologische Indifferenz der Arten. In größeren Clustern wurden zumeist mehrere Arten nachgewiesen. So wurden in BCl 29 zwei Acidovorax-Arten sequenziert, die BIOLOG-Bestimmung von drei unterschiedlichen Gattungen in diesem Cluster (fragliche Acinetobacter johnsonii, Alcaligenes faecalis und Comamonas terrigena-Identifikationen) ließ noch eine weitere Art vermuten. In BCl 32 ließen sich zwei und in BCl 41 drei Acidovorax-Arten nachweisen. Die BIOLOG-Identifikation von γ-Proteobakterien innerhalb dieser Cluster (BCl 20 Pseudomonas, BCl 28, 41 Acinetobacter, BCl 29 Alcaligenes, BCl 41 Moraxella) erwiesen sich, wie aufgrund der Heterogenität und geringen Aktivität vermutet, in der Sequenzanalyse zumeist als inkorrekt. Die Identifikation der Gattung Acinetobacter [γ-Proteobakterien] wurde durch die Sequenzanalyse wesentlich revidiert. Die in der Literatur beschriebene genetische und phänotypische Diversität (insbeson-dere für A. johnsonii) zeigte, daß Acinetobacter in der phänotypischen Analyse nur mangelhaft beschrieben wurde (Kämpfer et al. [1993], Bouvet & Grimont [1986]; Van Landschoot et al. [1986]). Die Clusteranalyse der BIOLOG-Daten hatte Acinetobacter johnsonii und ähnliche Stämme heterogen auf mehrere Clustern verteilt (BCl 28, 29, 32, 34, 35). In BCl 41 wurden darüberhinaus zwei Stämme sehr geringer Aktivität als Acinetobacter radioresistens bestimmt. Ergebnisse • Für ein Acinetobacter radioresistens bestimmtes Isolat des heterogenen Clusters BCl 41 (nicht FAMEbestimmbar) ergab die Sequenz eine unbekannte Acidovorax-Art, d.h. eine gleichfalls phänotypisch schwach definierte Gattung (siehe oben). Auch die Identifikationen für Acinetobacter johnsonii in den BCl 28 und 29 erwiesen sich als überwiegend falsch (FAME bestätigte eine AcinetobacterIdentifikation in BCl 29). Die Sequenzierung bestätigte Cluster mit β-Proteobakterien: Die fraglichen Alcaligenes- bzw. Comamonas-identifizierten Isolate in BCl 29 ergaben unterschiedliche AcidovoraxArten, eine A. johnsonii Identifikation in BCl 28 die Gattungsgruppe Comamonas / Acidovorax. • Die Sequenzen bestätigten jedoch die Gattungsidentität der nicht identifizierten, Acinetobacterähnlichen Isolate und einer in Frage gestellte Alcaligenes faecalis-Identifikation in den BCl 34 und 35. Es wurden zwei nicht in der 16S-Datenbank enthaltene Acinetobacter-Arten sequenziert. Das BCl 41 war das umfangreichste und heterogenste Cluster, daß durch die BIOLOG-Daten beschrieben wurde. Es umfasste Isolate mit geringer Aktiviät und BIOLOG-Identifikationen für α-, β- und γ-Proteobakterien die aufgrund der Aktivität insgesamt fraglich erschienen. Die genetische Bestimmung war für diese Gruppe von entscheidendem Interesse. Über die Fettsäuren waren die Isolate aufgrund des geringen Wuchses zumeist nicht zu charakterisieren. Wie bereits für die Sequenzierung physiologisch nichtbestimmbarer Isolate angesprochen, war auch bei der phänotypischen Bestimmung gering aktiver Isolate zu berücksichtigen, daß frisch isolierte Wildstämme sich von Laborarten im Wuchsverhalten stark unterscheiden können (Boivin-Jahns et al. [1995]). Da die BIOLOG-identifizierten Taxa auch in der FAMEAnalyse zu bestimmen sein sollten, war der für diesen Test unzureichende Wuchs schwaches Indiz für eine fehlerhafte Bestimmung: • Die Sequenzanalyse bestimmte 10 Isolate als β-, γ- und β/γ-Proteobakterien, konnte aber keine der bestimmten BIOLOG-Arten bestätigen. Da nicht das ganze Cluster sequenziert wurde, war das Vorkommen von α-Proteobakterien nicht endgültig auszuschließen. • Das Cluster erwies sich als eine Sammlung aberranter, bzw. unbekannter Stämme. Die Sequenzen bestimmten für 5 Stämme 3 unbekannte Acidovorax-Arten (die auch in anderen, physiologisch stark differenten Clustern auftraten) sowie Thauera-, Stenotrophomonas- und Pseudomonas-ähnliche Sequenzen mit maximal 93-94% Sim. zur Gattung. Nur für das Isolat SA5-20 wurde mit Acidovorax facilis eine bekannte Art bestimmt. Die Sequenzierung bewies, daß neue Taxa sowie bislang schlecht definierte Taxa (Acidovorax) durch die phänotypische Bestimmung erfasst wurden und in der Clusteranalyse zu erkennen waren. Bei geringer Reaktivität im BIOLOG-System wurden die Stämme nur schlecht charakterisiert und falsch identifiziert. Bei größerer Aktivität im BIOLOG-System erwiesen sich dagegen die Cluster und Identifikationen zumeist als konsistent auf dem Gattungsniveau, auch Artunterscheidungen waren durch die Sequenzierung zu belegen. Die Arten selber erwiesen sich allerdings oft als genetisch nicht beschrieben und die Identifikationen konnten nicht bestätigt werden. 3-143 3-144 Ergebnisse Der in der BIOLOG-Clusteranalyse bestimmte Pseudomonas-Zweig (BCl 1-3, Abb. 3.10, Gram-negative Teil I) wurde zum Beispiel durch die Sequenzanalyse detailliert verifiziert. Einzelne Pseudomonas-Identifikationen außerhalb dieses BIOLOG-Zweiges wurden widerlegt. Wie erwartet entsprachen die Artidentifikationen zumeist nicht den Sequenzen der Typstämme in der 16S-rDNA-Datenbank. Lediglich zwei Sequenzen zeigten eindeutige Artidentität mit Pseudomonas marginalis, wahrscheinlich waren weitere drei neue Arten (vergleiche Dendrogramm Abb. 3.25). Trotz der widersprüchlichen Identifikationen folgte die Clusteranalyse der BIOLOG-Daten jedoch der genetischen Differenzierung: • Das BCl 1 war mit >80% Übereinstimmung der „breathprints“ in sich homogen, enthielt aber Identifikationen für Pseudomonas nitroreducens und P. azelaica. Für die von BIOLOG benannten Arten steht allerdings eine phylogenetische Zuordnung bislang aus (Kersters et al. [1996]). Die kompletten 16S rDNA Sequenzen wiesen mit 97% Similarity zu P. citronellosis nur eine Art nach. • Im BCl 3 wurden physiologisch und genetisch drei Arten bestimmt. Von BIOLOG wurden Pseudomonas marginalis, P. fluorescens B und P. putida B benannt, einzelne P. corrugata-Identifikationen zeigten fließenden Übergang zwischen den Gruppen. Die Sequenzen bestätigten die Identifikation der P. marginalis-Gruppe und die Unterscheidung eines P. corrugata identifizierte Isolat 3CB-27c (geringere genetische Übereinstimmung mit P. marginalis). Die P. fluorescens B / P. corrugataGruppe und das P. putida B-Isolat entsprachen verschiedenen, unbekannten Arten. • Die Pseudomonas pseudoalcaligenes und -ähnlichen Isolate in BCl 20 und BCl 22 wurden genetisch als eine Art der Gattung Acidovorax klassifiziert. Die Identifikation des „unechten Pseudomonaden“ P. carboxydohydrogena (α-Proteobacterium) in BCl 41 war genetisch nicht näher zuzuordnen (nur 89,6% Sim. auf 484 Basen zu Stenotrophomonas / Xanthomonas). Die Sequenzierung bestätigte auch die Bestimmung der α-Proteobakterien der Rhizobium-Agrobacterium-Gruppe. Die genetisch der Caulobacter-, bzw. Sphingomonas-Gruppe zuzuordnenden Isolate wurden in Gruppen geringerer Aktivität (<40%), im zweiten Teil der BIOLOG-Clusteranalyse Gram-negativer Bakterien, bestimmt. Bakterien der Caulobacter-Gruppe wurden jedoch auch in Clustern mit β-, bzw. β/γ-Proteobakterien nachgewiesen. Die Rhizobium / Agrobacterium-Gruppe ließ sich genetisch und physiologisch besser bestimmen, sie ist taxonomisch besser untersucht (Balows et al. [1992]). • In BCl 11 waren die Identifikationen auf Gattungs- bis Artniveau mit Ochrobactrum anthropi identisch, ebenso ein nicht identifiziertes Isolat des benachbarten Einer-Clusters BCl 12. Auch die Ancylobacter aquaticus -Identifikation in BCl 36 wurde auf Gattungsebene bestätigt. • Das korrekt nicht identifizierte Isolat des BCl 18 entsprach der Gattungsgruppe Caulobacter / Sphingomonas,die CDC IIh-Identifikation [CYF] in BCl 48 konnte nicht näher zugeordnet werden (Caulobacter / Mycoplana / Brevundimonas), die Brevundimonas-Identifikation in BCl 43 und ein nicht identifiziertes Isolat in BCl 44 entsprachen Mycoplana bullata (nicht in der BIOLOG-Datenbank). Ergebnisse • α- und β/γ-Proteobakterien wurden mit Überschneidung 1) in den BCl 43, 44 und 2) in den BCl 48, 49 nachgewiesen. Im ersten Fall zeigten Clusteranalyse und Aktivitätswerte deutlich, daß das Isolat SA8-008 (BCl 44: Nicht identifiziert; 16S-Sequenzierung: Mycoplana bullata) korrekt den α-Proteobakterien des BCl 43 zuzuordnen ist. Die falsche Gruppierung war auf die willkürliche Bestimmung des Clusterniveaus zurückzuführen. Im zweiten Fall, für BCl 48 und 49, hatte die TGGEAnalyse die genetische Einheit der in beiden Clustern als CDC IIh identifizierten Isolate nachgewiesen und die Sequenzierung eine unbekannte α-Proteobakterien-Gattung (Caulobacter-Gruppe). Unter den nicht identifizierten Stämmen in BCl 49 befand sich aber auch ein physiologisch nicht zu differenzierender Acidovorax-Stamm (die klinische Gruppe CDC IIh [CYF] erwies sich, wie vermutet, als nicht identische, unbekannte Art). FAME In Tab. 3.21 wurden die mit FAME-analysierten und sequenzierten Isolate zusammengestellt. Zur Übersicht wurden in der Tabelle auch die BIOLOG-Cluster und -Identifikationen aufgeführt. Die Sequenzierung bestätigte allgemein auf Gattungs- bis Artebene die FAME-Identifikationen Grampositiver Isolate. Die Sequenzen ergaben innerhalb der Gattung Aureobacterium eine Differenzierung der Isolate, die der Artunterscheidung der FAME-Analyse entsprach. Da relativ wenige Typstämme dieser Gattung sequenziert sind, konnten die Arten in der Sequenzanalyse nicht benannt werden. Die Fettsäuremuster einiger Isolate stimmten nicht eindeutig mit Aureobacterium esteroaromaticum überein. Ihre Sequenzen bewiesen, daß sie nicht mit A. esteroaromaticum ATCC8091 identisch sind und größere Übereinstimmung mit A. liquefaciens DSM20638 aufweisen. Die FAME-Analyse erwies sich als „vorsichtig“ in der Bestimmung Gram-positiver Taxa mit hohem G+C-Gehalt: War die Identität der Gattung Aureobacterium in der FAME-Analyse fraglich, ergab die Sequenz Zuordnung zur Gattungsgruppe Aureobacterium / Microbacterium oder zur Art A. liquefaciens. Fragliche Rhodococcus- und Mycobacterium-Identifikationen erwiesen sich anhand der Sequenzen als korrekt (auf Gattungsniveau). Vereinzelt wurden FAME-Identifikationen Gram-negativer Bakterien mit heterogener Verteilung über die BIOLOG-Cluster sequenziert. Die Sequenzanalyse bestätigte allgemein die Cluster und FAMEIdentifikation für die Gattungen Acinetobacter [γ] und Ochrobactrum [α]. Einzelne Identifikationen für β- und α-Proteobakterien erwiesen sich jedoch auch mit diesem System als falsch bestimmt: • Ein Hydrogenophaga [β] identifiziertes Isolat erwies sich dagegen als Acidovorax, deren physiologische Variabilität und Bestimmbarkeit bereits ausführlich dargelegt wurde (s.o.). In den letzten Jahren wurde die phylogenetische Gruppe Rubrivivax taxonomisch vielfältig umstrukturiert. Bei diesem „taxonomisches Wirrwarr“ (Balows et al. [1992]) war die Fehlbestimmung verständlich. • Das mit FAME als Agrobacterium [α] identifizierte Isolat oXy-25a wurde genetisch als unbekannte Ochrobactrum-Art bestimment. 3-145 3-146 Ergebnisse • Das Isolat SA8-020 wurde von beiden Testsystemen, BIOLOG und FAME, als Brevundimonas identifiziert, die Sequenz entsprach jedoch Mycoplana bullata [α]. Die Sequenzdaten konnten Brevundimonas und Mycoplana nicht eindeutig differenzieren, so daß divergierende phänotypische Benennung als akzeptabler Fehler erschien. • Die FAME-Bestimmungen Xanthobacter und Xanthobacter / Bradyrhizobium / Methylobacterium (SA8-013, -032) ergaben entsprechende Zuordnung der Sequenzen zur Rhodopseudomonas viridisUntergruppe [α], bestätigten aber nicht die Gattungszuordnung. Das Isolat SA8-013 erwies sich als Azhorhizobium, für SA8-032 wurde die BIOLOG-Bestimmung Ancylobacter bestätigt. Tab. 3.21 Sequenzierung FAME-analysierter Isolate FAME Gr Sequenzierung Identifikation BIOLOG BCl Gram-positive Isolate hGC Aureobacterium esteroaromaticum1 A. esteroaromaticum / Rathayibacterium tritici2 Aureobacterium liquefaciens Aureobacterium / Microbacterium II A. liquefaciens (Rh. erythropolis / N. globerula)3 Rhodococcus (Mycobacterium parafortuitum) Mycobacterium Identifikation Isolat G N: Brevibacillus Nap-29 G Arcanobacterium haemolyticum 3CB-28a C E N N 34 35 5 K 43 11 N 36 / O Alcaligenes faecalis N: Acinetobacter N N B. vesicularis N: Ochrobactrum N: Corynebacterium Anc. aquaticus / N: Rhodococcus 4CS-03 24D-11 SA8-026 Gram-negative Isolate gP bP aP Acinetobacter (calcoaceticus) Acinetobacter (johnsonii) Hydrogenophaga pseudoflava Agrobacterium (radiobacter) Brevundimonas vesicularis Ochrobactrum anthropi Xanthobacter flavus (X. flavus / B. japonicum / M. mesophilicum)4 Acinetobacter (lwoffii) A. (johnsonii) Acidovorax facilis Ochrobactrum (anthropi) Mycoplana bullata Ochrobactrum I Azorhizobium Ancylobacter SUMME sequenzierte Isolate: SA8-089 SA8-137 SA8-125 oXy-25a SA8-020 Ant-29 SA8-013 SA8-032 13 Legende: Gr phylogenetische Hauptgruppe: α-, β-, γ-Proteobakterien (aP, bP, gP), Gram-positiv mit hohem G+C-Gehalt (hGC) BCl BIOLOG-Cluster N: nicht identifiziert: ähnlichstes Taxon in der BIOLOG-Datenbank 1 Keine Trennung von A. saperdae / esteroaromaticum, Wiederholung ergab A. esteroaromaticum 2 Keine eindeutige Trennung der Taxa möglich 3 Keine Trennung von Rhodococcus und Nocardia möglich 4 keine eindeutige Identifikation, Sim. zu Xanthobacter 0.46, zu Bradyrhizobium, Methylobacterium 0.4 Klassifizierung der Sequenzen nach Dendrogrammen und Ähnlichkeitswerten (siehe Sequenzergebnisse einzelner Hauptgruppen); Taxa in Klammern entsprechen den nächstmöglichen Verwandten; differenzierte Einheiten (möglicherweise neue Arten) wurden numeriert Ergebnisse Zusammenfassung Bei dem Vergleich phänotypischer Identifikation und genetischer Zuordnung sind die unterschiedlichen zugrundeliegenden Datenbanken zu beachten. Die Datenbanken der kommerziellen Testsysteme (BIOLOG, FAME) basieren auf den Testergebnissen einer möglichst großen Zahl von Referenzstämmen einer Art. Hieraus wird mit statistischen Methoden das „Profil einer Art“ definiert und die wahrscheinlichste Identifikation für einen unbekannten Stamm bestimmt. Die 16S-Datenbanken enthalten dagegen vielfach nur die Sequenzen der Typstämme einer Art und für die Bestimmung unbekannter Stämme werden Algorithmen verwendet, die auf phylogenetischen Hypothesen basieren (das heißt, nicht zu beweisenden Annahmen). In diesem Kontext war die Übereinstimmung von Sequenzzuordnung und phänotypischer Identifikation auf Gattungsniveau ein sehr gutes Ergebnis und sprach für die Qualität der phänotypischen Testsysteme. Die Identifikationssysteme konnten nicht besser sein als die aktuelle Systematik. Schlecht definierte Taxa führten prinzipiell zu Identifikationsproblemen. In diesem Fall ermöglichte die Sequenzierung die Umsetzung neuerer taxonomischer, genetischer Erkenntnisse in die Bestimmungspraxis. Die Umweltisolate beschrieben bislang „schwach definierte“, näher zu untersuchende Verwandtschaftgruppen, in allen bestimmten phylogenetischen Hauptgruppen. Die stärkste Gruppe der Isolate umfasste z.B. gerade die physiologisch schlecht definierte Gattung Acidovorax aus der Hauptgruppe der β-Proteobakterien. Die Isolate betonten die Varianz innerhalb dieses rRNA-Zweiges und mangelnde Angepaßtheit derzeitiger Systematik an die Umweltstämme. Die Länge der Zweige im Dendrogramm (Abb. 3.23) zeigte auch, daß eine eindeutigen Klassifikation der α-Proteobakterien in der Sequenzanalyse aufgrund fehlender Referenzstämme nicht möglich war. Die Ergebnisse zeigten, daß die Anwendung der Identifikationssysteme umfangreiche Kenntnis der Systeme und der aktuellen Systematik erfordert. Der Inhalt der Datenbanken (Anzahl Taxa, Stämme einer Art) war beim Vergleich der Identifikationen ebenso zu berücksichtigen, wie die unterschiedliche Kultur der Isolate für die Identifikatonssysteme. • Die Anzahl und Art der mit BIOLOG und FAME analysierten Stämme war zu unterschiedlich und die Zahl der sequenzierten Stämme zu gering, um eine allgemeingültige Aussage zur „Identifikationsgüte“ der Systeme zu machen. Ein hierauf ausgelegter Versuch würde neben Isolaten ein entsprechendes Spektrum an Referenzstämmen umfassen. • Die scheinbar größere Korrektheit der FAME-Identifikationen gegenüber BIOLOG war unter anderem auf die stärkere Standardisierung und die begrenzte Anwendung zurückzuführen. Mit dem FAME-System wurden nur Wildstämme erfasst, deren Wuchsverhalten unter Laborbedingungen dem „normalen“ Wachstum der Referenzstämme der Datenbanken entsprach. 3-147 3-148 Ergebnisse • Die Sequenzanalyse zeigte, daß im Screening mit dem BIOLOG-System eine Vielzahl unbekannter Arten erfaßt wurde. Durch die Clusteranalyse waren die genetisch näher zu untersuchenden Gruppen bestimmbar. Die BIOLOG-Identifikationen innerhalb dieser Gruppen erwiesen sich im Vergleich mit der genetischen Bestimmung, wenn, nur auf Gattungsebene als korrekt. Die Korrektheit der Bestimmung hing von der Aktivität der Isolate im Testsystem ab. • Eine „Identifikation“ war mit der 16S rDNA-Analyse nur in wenigen Fällen möglich, da eine entsprechende Auswahl an Referenzsequenzen in den Datenbanken derzeit zumeist fehlt. • Divergenz von Identifikation und Sequenzanalyse wurde häufig auf mangelnde Umsetzung der bisherigen phänotypischen Taxonomie in die neuere genetische Klassifikation zurückgeführt. • Keine der Datenbanken enthielt die hier dominanten, als umweltrelevant anzunehmenden Taxa. Aufgrund der raschen Durchführbarkeit, Standardisierung und Umfang der Datenbanken, der Möglichkeit zum Aufbau einer benutzereigenen Datenbank, erwiesen sich sowohl BIOLOG als auch FAME für die mikrobiologische Charakterisierung der isolierbaren Bakterien als sinnvoll. Vorteil des BIOLOGSystems war die einfache Durchführbarkeit eines angepaßten Screenings, das auch frisch isolierte Umweltisolate, mit geringem Wuchs unter Standardlaborbedingungen, erfasste. Außerdem beschrieb das Screening die Kulturmöglichkeiten der Stämme. Dafür war eine geringere Exaktheit der Identifikationen, im Vergleich mit der FAME-Analyse und Sequenzierung, zu akzeptieren. __________________________ Legende (Tab. 3.22): * Gr TGr 1 2 3 4 5 6 Pseudomonas aeruginosa-rRNA-Zweig (PaeZ) nach Moore et al. [1996] phylogenetische Hauptgruppe: α-, β-, γ-Proteobakterien (aP, bP, gP), Gram-positiv, hoher / niedriger G+C-Gehalt (hGC / nGC), Cytophaga-Bacteroides-Flavobakterien (CYF) phylogenetische Hauptgruppe des TGGE-Clusters: nach BIOLOG-, FAME-Identfikationen, Referenzstämmen im Cluster und Fragmentlängen; fragliche Zuordnungen in Klammern BIOLOG: Aktivität ≤25%, Identifikationen unwahrscheinlich FAME: Keine Trennung von R. erythropolis / N. globerula FAME: Keine Identifikation, Sim. zu X. flavus 0.46, zu den anderen 0.4 FAME: Keine Trennung von A. esteroaromaticum / Rathaibacter tritici FAME: Keine Trennung von A. esteroaromaticum / A.saperdae, Wiederholung ergab A. esterom. BIOLOG: BCL 29 heterogenes β+γ-Proteobakteriencluster mit fraglichen Alcaligenes faecalis, Acinetobacter johnsonii und Comamonas terrrigena-Identifikationen Cluster nicht bestimmt Summe der Isolate im TGGE-Cluster . ∑ Klassifizierung der Sequenzen nach Dendrogrammen und Ähnlichkeitswerten (siehe Sequenzergebnisse einzelner Hauptgruppen); Taxa in Klammern entsprechen den nächstmöglichen Verwandten; differenzierte Einheiten (möglicherweise neue Arten) wurden numeriert Cl Tab. 3.22 Zusammenfassung der TGGE-Ergebnisse TGGE Cl TGr ∑ Cl 1 GP 3 GP 4 GP+aP 5 GP+aP 10 aP 11 b+(gP) 13 GN 14 (GP)aP 15 b+(gP) 16 b/gP 17 bP 19 (gP) 20 gP 21 b+gP 3 C E 2 B nb 4 36 G G 4 N nb G 2 43 18 4 4 20 22 29 2 nb 9 H nb 4 29 nb 41 1 44 1 nb 4 nb 49 1 nb 29 41 41 BIOLOG Identifikation N N N nb Ancylobacter aquaticus N Arcanobacterium haemolyticum1 N nb Arcanobacterium haemolyticum1 Brevundimonas vesicularis N N N Pseudomonas pseudoalcaligenes Acinetobacter johnsonii1 nb N5 nb Alcaligenes faecalis6 nb Shewanella putrefaciens1 N nb nb (CDC IIh) nb Moraxella1 M.atlantae1 FAME Identifikation 2 (Rh. erythropolis / Nocardia globerula) . . (Xanthob/Bradyrhizobium/Methylobacterium)3 Aureobacterium esteroaromaticum 5 (A.esteroaromaticum / Rathaybacter tritici)4 Xanthobacter flavus . . Brevundimonas vesicularis N . Acidovorax delafieldii . no growth . . . -,N . . . . . . Gr Sequenzierung Taxon hGC . hGC hGC aP hGC hGC aP aP . aP aP Rhodococcus . (Propionibacterium) (Propionibacterium) Ancylobacter Aureobacterium liquefaciens Aureobacterium liquefaciens Azorhizobium (Hyphomicrobium/Rhodoh/Methylobac) . Mycoplana bullata (Caulobacter / Sphingomonas) 24D-11 . SA5-46 SA5-44 SA8-032 Nap-29 4CS-03 SA8-013 SA8-025 . SA8-020 SA8-079 . bP bP . b/gP aP aP bP bP . b/gP bP b/gP . gP b/gP bP . Acidovorax (temperans) Acidovorax (temperans) . (Xylella) Agrobacterium, Agb. / Zoogloea Agrobacterium, Agb. / Zoogloea Acidovorax temperans Acidovorax temperans . (Xylella / Stenotrophomonas) (Ideonella / Rubrivivax) (Xylella) . (P.aureofaciens / pseudodalcaligenes)* (Stenotrophomonas) Acidovorax facilis . SA8-016 SA8-094 . SA8-074 SA8-038,-078 SA8-007,-046,-053,-066 SA8-063 SA8-021 . SA8-030 SA5-29a SA8-057 . SA8-060 SA8-011 SA5-14 Isolat TGGE Cl TGr ∑ Cl 21 b+gP 22 GP 23 GN 24 (aP) 25 (aP) 28 GN 30 aP 32 GN 38 GN 39 (gP) 40 (gP) 29 41 42 5 37 29 41 34 34 35 32 nb nb nb 4 E G 2 nb nb 2 nb nb 1 44 11 39 nb nb 1 48 1 41 2 38 49 3 41 1 28 BIOLOG Identifikation 1 FAME Identifikation 1 M. bovis , Lampropedia hyalina Psychrobacter immobilis1 N N Acinetobacter johnsonii1 N, Acinetobacter radioresistens1 Alcaligenes faecalis (Acinetobacter) (Acinetobacter) Comamonas terrigena nb nb nb N N nb nb nb nb N N nb nb CDC IIh N (CDC IIh) (CDC IIh) Acinetobacter radioresistens1, N Acinetobacter johnsonii1 . . Hydrogenophaga pseudoflava . Acinetobacter (johnsonii) . Acinetobacter (calcoaceticus) (Acinetobacter johnsonii) Acinetobacter (johnsonii) . . (Mycobacterium parafortuitum) . . . . . . . . . . . . Gr Sequenzierung Taxon Isolat bP bP bP bP . . gP . gP bP gP gP bP hGC . nGC CYF aP aP aP . b/gP bP aP bP Acidovorax facilis, A. (facilis) Acidovorax (facilis) Acidovorax facilis Acidovorax facilis . . Acinetobacter (lwoffii) . Acinetobacter (johnsonii) Acidovorax (facilis) (P.alcaligenes) * Acinetobacter (johnsonii) Acidovorax (facilis) Mycobacterium . Staphylococcus Flexibacter / Flavobacterium (Methylob./Beijerinkia/Rhodospirillum) (Acetobacter) Mycoplana bullata . (Xanthomonas) Comamonas (Caulob./Mycoplana/Brevundimonas) (Thauera) SA5-20, -45 SA5-27 SA8-125 SA5-04 . . SA8-089 . SA8-137 SA5-48 SA5-49 SA8-144 SA8-061,SA5-03,-18,-43 SA8-026 . SA8-028 24D-14 SA8-147 SA8-050 SA8-008 . SA8-062 SA8-049,-037 SA5-11 SA5-34 . bP bP bP . Acidovorax (facilis) Acidovorax (Comamonas / Acidovorax) . SA5-33 SA5-26, -50 SA5-16 Ergebnisse 3.4.2.3 Vergleich der Sequenzierung mit dem TGGE-Screening In Tab. 3.22 wurden die Ergebnisse der Sequenzanalyse und phänotypischer Bestimmungen zur Verifizierung von 25 TGGE-Clustern zusammengestellt. Die Klassifikation der TGGE-Cluster (TCl) nach Fragmentlängen und Laufverhalten, Referenzstämmen, FAME- und BIOLOG-Identifikationen, erwies sich im Allgemeinen als konsistent mit der 16S rDNA-Klassifikation. Die detaillierte Analyse (siehe Kapitel „Genetisches Screening mit der TGGE“) beschrieb bereits weitgehend die Möglichkeiten und Grenzen dieses neuen Screeningverfahrens. Im Folgenden wurde vor allem Wert auf die nähere Beschreibung der nicht zu differenzierenden taxonomischen Einheiten gelegt, die Bestätigung angenommener Clusterspezifikationen wurde dagegen relativ kurz gefasst. Gram-positive Gruppen Die Sequenzanalyse bestätigte die Gram-positiven Cluster TCl 1-5 und TCl 22, zu denen nur wenige Referenzstämme und eindeutige Identifikationen vorlagen, als Gruppen mit hoch G+C haltigen Taxa. Die Cluster entsprachen unterschiedlichen Gattungen: TCl 1 enthielt Rhodococcus (Referenzstamm Rhodococcus rhodochrous DSM43241), TCl 3 zwei Stämme mit Propionibacterium-ähnlicher Sequenz (wahrscheinlich verschiedene Arten), TCl 4 Aureobacterium und TCl 22 die Gattung Mycobacterium. Nachgewiesen wurde aber auch, daß die TCl 4 und 5, mit Banden wesentlich höherer Retention im TGGE-Gel, den Übergang zu Clustern mit Gram-negativen Stämmen bildeten. Sie enthielten Identifikationen für Gram-positive Taxa und α-Proteobakterien. Die Sequenzierung zeigte, daß die beiden Clustern vermutlich verschiedene Aureobacterium-Arten enthalten (siehe Kapitel „Vergleich von Sequenzierung und mikrobiologischen Bestimmungsmethoden - FAME“) sowie verschiedene Gattungen der Rhodopseudomonas viridis-Untergruppe. In TCl 4 wurde für die Sequenz des Isolates SA8-032 die Gattung Ancylobacter bestimmt, in TCl 5 für SA8-013 Azorhizobium (beide Isolate von FAME falsch als Xanthobacter oder -ähnlich identifiziert) und eine weitere, unbekannte Gattung für SA8-025 (Hyphomicrobium / Rhodohalobium / Methylobacterium, phänotypisch nicht bestimmbar). Diese α-Proteobakterien waren sowohl im genetischen Screening (TGGE) als auch in der phänotypischen Analyse kritisch (keine eindeutige Gram-Bestimmung, widersprüchliche Bestimmung BIOLOG / FAME). Erst die Sequenzanalyse brachte eine klare taxonomische Aussage. Aufgrund des Mangels an Referensequenzen dieser Gruppe in der 16S rDNA-Datenbank, ist hier primär eine weitere genetische Analyse von Referenzstämmen anzustreben, anhand der auch das TGGE-Screening-Verfahren zu optimieren ist. 3-151 3-152 Ergebnisse Gram-negative Gruppen Für das TCl 23 wurde aufgrund der benachbarten Cluster angenommen, daß die enthaltenen phänotypisch nicht zu bestimmenden Isolate Gram-negativ sind. Die Sequenzanalyse zeigte jedoch, daß hier das einzige Gram-positive Isolat mit niedrigem G+C Gehalt (nGP; SA8-028 Staphylococcus) mit dem einzigen genetisch nachgewiesenem Isolat der Cytophaga-Flavobakterien-Bakteroides-Gruppe (CYF; 24D-14) clusterte. Die Analyse der Referenzstämme hatte bereits eine mögliche Überschneidung der Banden dieser beiden Gruppen gezeigt. Die beiden phylogenetischen Gruppen wurden hier zwar nur in geringer Zahl isoliert (Probenahme 8/93; CYF: 7 Isolate mit o-Xylol, 1 Isolat mit 24D, nGP: 1 Isolat mit SA), da ein höheres Vorkommen bei sich verändernden Umweltbedingungen nicht auszuschließen ist, sollte aber für eine spätere Zeitreihenanalyse das Trennverhalten in der TGGE optimiert werden oder eine zusätzliche Bestimmung, zum Beispiel durch geeignete Gensonden, angewandt werden. Die TCl 10, 14, 24, 25 und 30 wurden als α-Proteobakterien Cluster bestätigt. Die TGGE-Analyse differenzierte unterschiedliche Arten, mischte aber zum Teil die übergeordneten phylogenetischen Gruppen. Eine Differenzierung sollte bei methodischer Weiterentwicklung möglich sein: • Das TCl 14 beschrieb die Agrobacterium-Gruppe. Es umfasste zwei fragliche Isolate des BCl H (sehr geringe Aktivität) und 7 nicht-bestimmbare Isolate, deren Sequenzen Agrobacterium bzw. Agrobacterium / Zoogloea entsprachen. Wahrscheinlich wurden drei Arten erfaßt (vergl. Sequenzdaten der α-Proteobakterien, Tab. 3.16), die Banden ließen aber keine Differenzierung erkennen. • TCl 24 enthielt physiologisch nicht bestimmbare Isolate. Die 16S rDNA entsprach zum einen der Rhodospirillum rubrum-Gruppe (SA8-050, Acetobacter-ähnlich), zum anderen einer nicht näher zu definierenden Gattung der Rhizobium-Agrobacterium-Gruppe (SA8-147, Methylobacterium / Beijerinckia / Rhodospirillum). Nach den Ergebnissen der TPCR-Sequenzierung sollte die Differenzierung der beiden Gruppen möglich sein (siehe Tab. 3.16). Unter den hier gewählten Bedingungen liefen die Banden dieser Stämme bis zum Ende der TGGE-Laufstrecke, daß heißt, sie waren außerhalb des Bereichs effektiver Trennung. Eine getrennte, entsprechend optimierte TGGE-Analyse für Gruppen geringer Retention (α-Proteobakterien, Gram-positive Bakterien mit hohem G+C-Gehalt) würde dieses Problem lösen. • TCl 25 und 30 unterschieden Sequenzen der Caulobacter- und Sphingomonas-Gruppe, TCl 10 umfasste beide Gruppen. Innerhalb des TCl 10 wurde jedoch Mycoplana bullata (SA8-020, CaulobacterGruppe) deutlich von der Gattungsgruppe Caulobacter subvibrioides / Sphingomonas yanoikuyae (SA8-079) und dem Referenzstamm Sphingomonas capsulatus DSM30196 differenziert (auf dem 86% Niveau). Die Trennung der Gruppen könnte durch entsprechende Optimierung der TGGE erzielt werden. TCl 25 enthielt ebenfalls ein Mycoplana bullata-ähnliches Isolat (SA8-008), dessen Sequenz geringere Übereinstimmung zu dieser Art aufwies als das Isolat des TCl 10 (SA8-008: 98,7% auf 555 Basen, SA8-020: 99% auf 1127 Basen) und auch BIOLOG differenzierte die beiden Isolate. Ergebnisse Wahrscheinlich wurden hier 2 verschiedene Arten differenziert. TCl 30 enthielt einzig ein nicht näher bestimmbares Isolat der Caulobacter-Gruppe (SA5-11: Caulobacter / Mycoplana / Brevundimonas). Das γ-Proteobakterien-Cluster TCl 20 enthielt ein nicht-bestimmbares Isolat (SA8-060) und den Referenzstamm Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG1225. Da der frisch isolierte Stamm („Wildstamm“) nicht mit BIOLOG zu testen war, war die Übereinstimmung mit der BIOLOG-bestimmbaren Art fraglich. Bereits die TPCR-Sequenz bewies die angenommene Ähnlichkeit zu P. pseudoalcaligenes, konnte aber bei der Kürze der Sequenz nicht zwischen diese Art und P. aureofaciens differenzieren (Pseudomonas aeruginosa-Zweig). Dieses Beispiel für die unterschiedlichen physiologischen Fähigkeiten von Wild- und Laborstämmen belegte widerum die Notwendigkeit der genetischen Bestimmung, zumindest eines genetischen Sreenings, für die Populationsanalyse. Die β-Proteobakterien erwiesen sich als umfangreichste Gruppe in der Popualtionsanalyse und auch im genetischen Screening als schwierig zu bestimmen. Erst die Sequenzanalyse konnte die widersprüchlichen Ergebnisse aus phänotypischer Bestimmung und TGGE-Screening klären: • Fragliche BIOLOG-Identifikationen für Acinetobacter johnsonii (BCl 28) und A. radioresistens (BCl 41) wurden mit der TGGE den beiden Cluster TCl 39 und TCl 40 zugeordnet, die nicht dem Referenzstamm der Gattung oder anderen Referenzstämmen entsprachen und auch keine weiteren Informationen lieferten. Die 16S rDNA-Analyse der SA-Isolate belegte, daß hier nicht γ-Proteobakterien, sondern β-Proteobakterien der Rubrivivax-Untergruppe differenziert wurden: In TCl 39 wurden zwei Acidovorax-Arten bestimmt (SA5-26,-50; siehe Sequenzanalyse der β-Proteobakterien), in TCl 40 eine unbekannte Gattung für die die Gattungsgruppe Comamonas / Acidovorax (SA5-16) definiert wurde. • Die BIOLOG-Clusteranalyse für Identifikationen der Art Comamonas terrigena war aufgrund der variablen Reaktionsmuster nicht schlüssig (5 SA-Isolate in den BCl 29, 32 und 37). Die FAME-Analyse konnte die Isolate des BCl 29 nicht identifizieren, während die des BCl 37 falsch als Hydrogenophaga identifiziert wurden. Die TGGE-Analyse unterschied die TCl 11 und 21, der Referenzstamm C. terrigena LMG1253 clusterte allein mit einem nicht physiologisch bestimmmbaren Isolat (TCl 17: SA5-29a). Die Sequenz dieses Stammes ergab entsprechend die Rubrivivax-Untergruppe, aber keine eindeutige Gattungsbestimmung (Gattungsgruppe Ideonella / Rubrivivax: 94,2% Sim. auf 476 Basen). Auch die von BIOLOG als C. terrigena identifizierten Isolate wurden dieser Untergruppe, aber der Gattung Acidovorax zugeordnet. Die TGGE hatte innerhalb dieser Gattung Acidovorax facilis (TCl 11) und A. temperans-ähnliche Stämme (TCl 21) unterschieden. • Ein nicht-identifiziertes, schwach aktives Isolat des BCl 41 (SA5-34) wurde in TCl 32 als Gram-negatives Bakterium bestätigt. Die Sequenz charakterisierte es als Thauera-ähnliches β-Proteobakterium der Rhodocyclus-Gruppe. 3-153 3-154 Ergebnisse • Die TCl 11 und 15 enthielten BIOLOG- und Fame-Identifikationen sowohl für β- als auch γ-Proteobakterien. Die beiden Cluster TCl 11 und 15 erwiesen sich als unterschiedliche Arten der Gattung Acidovorax. In TCl 15 wurden die fraglichen BIOLOG-Identifikation des BCl 41 für γ-Proteobakterien widerlegt, das Cluster enthielt laut Sequenzierung Acidovorax temperans. Auch in TCl 11 wurden die Identifikation für Pseudomonas pseudoalcaligenes (BCl 20) und Acinetobacter johnsonii (BCl 29) durch Sequenzen einer Acidovorax temperans ähnlichen Art widerlegt. Das TCl 21 enthielt Identifikationen und Referenzstämme der β- und γ-Proteobakterien (Acidovorax facilis LMG2193 und Acinetobacter spec. DSM590). Die Sequenzierung bestimmte in diesem Cluster einen fließenden „Übergang“ von β- und β/γ- zu γ-Proteobakterien. • β-Proteobakterien: Die Sequenzen von 8 Stämmen, daß heißt der Hälfte der Isolate im Cluster, entsprachen Acidovorax facilis bzw. einer ähnlichen Art (Acidovorax spec. I, siehe Sequenzdaten). • γ-Proteobakterien: Fünf Isolate wurden durch die Sequenzen als verschiedene Acinetobacter-Arten (Acinetobacter spec., A. calcoaceticus-, A. lwoffii-, A. johnsonii-ähnlich) bestimmt, außerdem ein Pseudomonas alcaligenes-ähnliches Isolat. • β/γ-Proteobakterien: Ein Stenotrophomonas-ähnliches Isolat wurde sequenziert. Diesem TGGE-Cluster wurden Isolate geringer Aktivität und Differenzierbarkeit im BIOLOG-System zugeordnet, die ausschließlich auf SA-Medium isoliert worden waren. TCl 21 stellte mit 29 Isolaten eine der bedeutendsten Gruppen der Population. Der Umfang und die Zusammensetzung dieser Gruppe wird sich wahrscheinlich bei weiteren Untersuchungen des Spittelwassersediments, entsprechend der zu erwartenden Verbesserung der Gewässersituation, ändern. Die TGGE-Analyse wird aufgrund der besseren Kulturbedingungen, diese Isolate besser als etwa das BIOLOG-System erfassen. Vertreter der β/γ-Proteobakterien wurden in der Sequenzanalyse außerdem in den TCl 13, 16, 19, 21, 28 nachgewiesen. Keines dieser Isolate konnte in der Sequenzanalyse bis auf das Gattungsniveau bestimmt werden. Die TGGE-Cluster entsprachen unterschiedlichen Arten oder Gattungen: • Zwei nicht-bestimmbare Isolate in TCl 13 waren nach der TGGE als Gram-negativ eingestuft worden, TCl 19 zeigte Ähnlichkeit zu Pseudomonas fluorescens B DSM50106. Die Sequenzierung wies die Isolate als nicht näher bestimmbare, unterschiedliche Xylella-ähnliche Arten oder Gattungen der β/γ-Proteobakteriengruppe aus. • TCl 16 enthielt den Referenzstamm Stenotrophomonas maltophilia LMG958 und das nicht-identifizierte Isolat SA8-030 des BCl 44. Die Sequenz dieses Isolates war mit nur 87,7% Similarity mit Stenotrophomonas (auf 509 Basen) nicht eindeutig innerhalb der Xanthomonas-Gruppe zu positionieren. Das Isolat in TCl 21 wies 92,8% (auf 495 Basen) mit der Gattung Stenotrophomonas auf. Die beiden Cluster enthalten unterschiedliche Arten, wahrscheinlicher verschiedene Gattungen. Ergebnisse Das TCl 28 war lediglich als Gram-negativ charakterisiert worden. Es enthielt ein nicht identifizierbares Isolat des BCl 39 und 10 physiologisch nicht bestimmbare Isolate. Zwei Comamonas-Sequenzen und eine Xanthomonas-ähnliche Sequenz bestimmten das Cluster als β- und β/γ-Proteobakterien-Gruppe (b+b/gP). Die Comamonas-Sequenzen unterschieden sich deutlich von den bekannten Arten (maximal 96-99% Sim. auf 191 Basen zu C. testosteroni ATCC11996). In der TGGE wurden sie vom Typstamm C. testosteroni LMG1800 (TCl 8) und den weiteren Isolaten der Rubrivivax-Untergruppe (TCl 11, 15, 17, 21, 38-40) eindeutig differenziert. Zusammenfassung Die 41 TGGE-Cluster wurden mit der Sequenzanalyse näher charakterisiert, die ursprünglichen Annahmen im Allgemeinen bestätigt. Von den angenommenen gemischten TGGE-Clustern mit α-Proteobakterien und Gram-Positiven (aP+GP), β- und γ-Proteobakterien (b+gP), wurden einige durch die Sequenzanalyse als eindeutige α-, bzw. β-Proteobakteriencluster revidiert. Als aP+GP-Cluster verblieben TCl 4 und 5. Sie enthielten Vertreter der Rhodopseudomonas viridis-Untergruppe und der Gram-positiven Gattung Aureobacterium. Als echte b+gP-Gruppen erwiesen sich TCl 21 und 28. Acinetobacter, Stenotrophomonas-, Acidovorax facilis-ähnliche und ein Pseudomonas-Stamm waren in TCl 21 nicht differenzierbar. TCl 28 unterscheidet nicht zwischen Xanthomonas-ähnlich und Comamonas. Acidovorax, als die größte der bestimmten Bakteriengruppen, wurde auf Artniveau unterschieden und mit mindestens fünf Arten bestimmt. Den Taxa der 16S-Datenbank entsprachen die Isolate des TCl 15 (Acidovorax temperans) und TCl 21 (A. facilis). Das TCl 23 wurde falsch eingeordnet. In diesem Cluster waren das einzige Isolate der niedrig G+C-haltige Gram-positive Gattung Staphylococcus und ein Flavobakterien / Flexibacter-ähnliches Isolat nichtdifferenzierbar (CYF / nGC-Cluster). Zur Trennung der Gruppen-übergreifenden Cluster ist eine differenzierte TGGE-Analyse, das heißt unterschiedliche Laufbedingungen für Banden geringer und starker Retention im Gel, zu empfehlen. Zum einen ist eine Optimierung für Fragmente niedriger Retention notwendig, da sie im hier angewandten Verfahren das Ende der Laufstrecke erreichten und den effektiven Trennbereich überschritten. Zum anderen zeigten die Sequenzen und Modellierung des Systems, daß eine feinere Differenzierung der Fragmente bei weiterer Optimierung möglich wäre. Alternativ oder zusätzlich, könnten geeignete Gensonden die Unterscheidung der phylogenetischen Hauptgruppen in den „gemischten“ Clustern ermöglichen. Diese Möglichkeit ist insbesondere bei nicht eindeutiger Gram-Bestimmung (α-Proteobakterien) zu erwägen. Aufgrund der bestimmten taxon-übergreifenden Cluster ist derzeit ein universeller Einsatz des TGGEScreening nicht möglich. Der Aufbau einer (standort-) spezifischen Datenbank ist unbedingt erforderlich. 3-155 3-156 Ergebnisse Unter dieser Voraussetzung ist die TGGE als genetische Screeningmethode zur Analyse räumlich oder zeitlich begrenzter Populationen zu verwenden. 3.4.3 Taxonomische Struktur der Spittelwasser-Populationen Die Zusammenfassung der stoffwechselphysiologischen, phänotypischen und genetischen Ergebnisse ermöglicht die Beschreibung der taxonomischen Struktur der Spittelwasser-Population. Aus Tab. 3.23 ergibt sich die Diversität und Häufigkeit der mit Sedimentextraktagar (SA) isolierten Bakterientaxa. Dabei ist anzunehmen, daß die Isolation mit diesem Medium die natürlich vorkommende Mikroorganismenpopulation bestmöglich repräsentiert. Die Ergebnisse des Vorversuchs Mai 1993 wurden der Probe August 1993 vergleichend gegenübergestellt. Die Tabelle enthält ebenfalls die Populations-Zusammensetzung nach Mau [1997], die die Population der Probe 8/93 anhand der extrahierbaren Nukleinsäuren beschrieb, um die Effizienz der Isolierung mit SA, beziehungsweise Kultivierungseffekte zu bestimmen. In dem Vorversuch der Probenahme 5/93 wurde als umfangreichste Bakteriengruppe die der β-Proteobakterien bestimmt (51% der Isolate). Dominant war die Rubrivivax gelatinosus-Gruppe mit 3 Arten der Gattung Acidovorax. Nur 4-8%, daß heißt 2-4 Isolate, entsprachen hoch G+C-haltigen Gram-positiven Bakterien (Propionibacterium), Gram-negativen γ- (Pseudomonas), β/γ- (Xanthomonas-Gruppe) oder α-Proteobakterien (Rhodobacter-, Caulobacter-Gruppe). Weitere 28% waren Gram-negativ und nicht näher bestimmbar (mindestens 3 Arten). Mit nur 53 untersuchten Isolaten ließen sich in diesem Vorversuch bereits mindestens 19 Arten bestimmen, das entsprach einer durchschnittlichen Häufigkeit von etwa 3 Isolaten pro Art. Der Vorversuch zeigte bereits, daß die Isolate mit den Identifikationsmethoden zumeist unzureichend beschrieben wurden. Eindeutig bestimmt wurden hier lediglich die Gattungen Acidovorax, Pseudomonas und Propionibacterium. Schwerpunkt der Bestimmungen lag auf der Probenahme 8/93. Anhand von 138 Isolaten wurden die α-und β-Proteobakterien als umfangreichste Gruppen (22%, bzw. 21%) mit größter Artenvielfalt bestimmt. Die α-Proteobakterien waren mit 5 Gruppen, 10 Gattungen und 13 Arten die heterogenste Gruppe. Dominiert wurde sie von Isolaten der Gattung Agrobacterium. Der Nachweis dieser Bakteriengruppe ist auf die im Vergleich zum Vorversuch 5/93 stärkeren Bemühungen zur Kultivierung und Bestimmung langsam wachsender Bakterien zurückzuführen. Die β-Proteobakterien wurden wie im Vorversuch 5/93 von der Gattung Acidovorax der Rubrivivax gelationosus-Gruppe (5 Gattungen, 8 Arten) dominiert. Beide Versuche bestimmten darüberhinaus einzelne Isolate der Thauera- bzw. Neisseria-Gruppe. Die γ- und β/γ-Proteobakterien machten mit 9,4-12,3% ebenfalls einen bedeutenden Anteil der Isolate aus. Neben Pseudomonas wurde nun auch Acinetobacter und einzelne Acinetobacter / Moraxella, bzw. Aeromonas bestimmt. Die Gram-positiven Bakterien waren mit 2% von untergeordneter Bedeutung für die mit SA zu bestimmende Population. Je eine hoch und niedrig G+C-haltige Gattung wurde bestimmt (Mycobacterium bzw. Staphylococcus). Ergebnisse Für die Probe August 1993 wurden anhand von 138 Isolaten mindestens 40 Arten beschrieben. Daraus ergab sich eine Rate von etwa 3,5 Isolaten pro Art. Im Vergleich mit dem Vorversuch war diese Rate nahezu konstant, die Zahl der zu bestimmenden Arten stieg proportional mit der Zahl der Isolate. Hervorzuheben ist, daß über 50% der Arten nicht mit den bekannten Taxa (in den Datenbanken) übereinstimmten. Insgesamt konnten 34% der analysierten Isolate mit den angewandten Methoden nicht näher bestimmt werden. In diesem Versuch wurde besonders Wert auf die Kultivierung und Bestimmung von Isolaten gelegt, die nicht (auf Dauer) mit dem Standardkomplexmedium NA zu rekultivieren sind, beziehungsweise nur geringen Wuchs unter Laborbedingungen zeigten und eine längerfristige Inkubation erforderten. Insgesamt 59% der Isolate der Probe 8/93 konnten aufgrund des Wuchsverhaltens mit BIOLOG nicht beschrieben werden, 43,5% der Isolate ließen sich aber mittels genetischer Methoden bestimmen. Diese Bakterien unterschieden sich von der Gruppe physiologisch zu charakterisierender Bakterien vor allem in der umfangreicheren Bestimmung der α-Proteobakterien, lieferten aber auch in den anderen phylogenetischen Hauptgruppen zusätzliche (nicht näher zu bestimmende) Arten. Der Forschungsbedarf im systematisch-taxonomischen Bereich ist evident. Vergleich mit Klonierungsdaten (Mau [1997]) In der Arbeit von Mau [1997] (siehe Tab. 3.23) wurde für August 1993 aus der gleichen Probe die Gesamt-DNA extrahiert, kloniert und die 16S rDNA-Sequenzen bestimmt. Die 45 Klone der unverdünnten Probe entsprechen einer Stichprobe etwa gleichen Umfangs wie die des hier durchgeführten Vorversuchs 5/93. Dieser Unterschied im Probenumfang ist beim Vergleich der Arbeiten zu bedenken. Außerdem erfaßt die Klonierung allgemein ein größeres Spektrum an Phyla als die Isolation, da sie nicht auf Aerobier beschränkt ist. Allgemein war festzustellen, daß beide Ansätze einen hohen Prozentsatz Taxa mit geringer Übereinstimmung der Sequenzen mit der Sequenzdatenbank lieferten, die wahrscheinlich als neue Arten anzusprechen sind. Soweit Isolate und Klone auf Artebene näher verwandt waren, wiesen ihre Sequenzen untereinander größere Ähnlichkeit auf als zu allen bisher kultivierten Arten der Gattung. Die β-Proteobakterien repräsentierten mit 51% die zahlenmäßig stärkste Klongruppe und größte Diversität (12 Gattungen oder Arten, 23 Klone). Die weiteren Gruppen waren wesentlich schwächer vertreten: Die δ-Proteobakterien und Gram-positive Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt machten je 9% (4 Klone) aus, α- , γ-, β/γ-, ε-Proteobakterien und Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe, umfassten nur 2-4% (1-2 Klone). Bei nur ein oder zwei Klonen war über die Bedeutung der bestimmten Gruppen in der Population nichts auszusagen. Die Bestimmung könnte rein zufällig sein, aber auch abundante Gruppen einer diversen Artenflora widergeben. Festzustellen ist bei dem gegebenen Stichprobenumfang lediglich, daß sie vorhanden sind. 3-157 3-158 Ergebnisse Im Gegensatz zur Klonierung bestimmte die Isolierung α- und β-Proteobakterien als bedeutendste Gruppen (22%, bzw. 21% der 138 Isolate). Die Artenvielfalt der β-Proteobakterien war mit 6 Gattungen und 9 Arten deutlich geringer. Die physiologisch sehr spezifische Gattung Methylophilus und 4 weitere, unbekannte Gattungen der Rhodocyclus-Gruppe wurden in der Isolierung nicht erfasst. Dafür entsprach die Vielfalt der isolierten α-Proteobakterien (10 Gattungen, 13 Arten, 30 Isolate) der der klonierten β-Proteobakterien. Dem einzelnen Klon der α-Proteobakterien (Tab. 3.23) entsprach ein Paracoccusähnliches Isolat, das im Vorversuch (Probe 5/93) mit SA isoliert wurde. Die Abundanz der isolierten γund β/γ-Proteobakterien konnte durch die einzelnen Klone nicht bestätigt werden. Den klonierten Taxa der Cytophaga-Flavobakterien-Bacteroides-Gruppe (Cytophaga-, Flexistipes-ähnlich) entsprachen Cytophaga-ähnliche Isolate, die hier nur spezifisch mit Xenobiotika-Medien zu isolieren waren. Die Gesamt-DNA-Sequenzanalyse bestimmte als zweitgrößte Bakteriengruppe (9%, 4 Klone) die Gramposiven Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt, die fast alle der anaeroben Gattung Clostridium entsprachen (derzeit als Sammelgruppe zu bezeichnen). Die SA-Isolierung konnte diese Gruppe nicht erfassen, bestimmte aber einen Vertreter der Gattung Staphylococcus und zwei hoch G+C-haltige Mycobacterium. Dabei wurde die relative Abundanz der Gram-posiven Bakterien mit hohem G+C-Gehalt durch die selektive Anreicherung mit Xenobiotika-Medien bewiesen (z.T. >50%). Die Klonierung lieferte bei vergleichbarem Stichprobenumfang ein größeres Artenspektrum als der Vorversuch (Isolierung 5/93: min. 19 Arten; 8/93: min. 40 Arten, Klonierung 8/93: 26 Arten). Hierbei ist jedoch zu berücksichtigen, daß unter den gegebenen Bedingungen typische Anaerobier wie Clostridium und Desulfurikanten (Desulfomicrobium, Desulfobulbus) und Bakterien mit stark spezialisiertem Stoffwechseltyp wie Methylotrophe (Methylophilus), nicht zu isolieren waren. Während die DNA-Extraktion sämtliche physiologischen Gruppen des Sediments erfasste, beschrieb die Isolierung nur den Bereich Sauerstoff-abhängiger und fakultativ anaerober Bakterien, vereinzelt auch vermutlich mikroaerophile Bakterien (SA5-25 Paracoccus / Rhodobacter, siehe Kapitel 3.4.1). __________________________ Legende (Tab. 3.23): G, A Gattung / -en, Art / -en 1 Isolierung aus Verdünnungsreihe mit 1 ml Spittelwassersediment (5/93: 5x10-6, 8/93: 5x10-7-10-5) 2 3 Klonierung aus 100 µl Spittelwassersediment direkt isolierter Gesamt-DNA (500 ng DNA) nur 88,5% Ähnlichkeit zu Wollinella succinoges Ergebnisse Tab. 3.23 Taxonomische Struktur der SA-Populationen 5/93 und 8/93 Sediment-Extrakt-Isolate1 Vorversuch 5/93 β-Proteobakterien 27 Isolate - 5 G, 8 A 4 Acidovorax-A Alcaligenes / Bordetella Ideonella / Rubrivivax Comamonas / Acidovorax 8/93 29 Isolate - min. 6 G, 9 A (12 BCl , 6 TCl) 4 Acidovorax-A Hydrogenophaga Variovorax, Variovorax / Rhodoferax Comamonas (Rubrivivax gelatinosus-Gr.) Neisseria-Gruppe 23 Klone - 12 G oder A Acidovorax Hydrogenophaga 2 Ideonella / Rubrivivax-A Comamonas / Acidovorax 5 Methylophilus-ähnliche A Thauera-ähnlich + 4 weitere G in der Rhodocyclus-Gruppe 13 Isolate - min. 4 G, 6 A (5 BCl , 5 TCl) 2 Pseudomonas-A Aeromonas 2 Acinetobacter-A, Acinetob. / Moraxella 1 Klon Pseudomonas Thauera-ähnlich γ-Proteobakterien 2 Isolate - 1 G, 2 A 2 Pseudomonas-A β- oder γ-Proteobakterien 11 Isolate (TCl 21) β/γ-Proteobakterien 3 Isolate - min. 2 G Xanthomonas-ähnlich Xylella-ähnlich α-Proteobakterien 4 Isolate - min. 2 G Rhodobacter-Gruppe Caulobacter-Gruppe Klonierung - Mau [1997]2 8/93 8 Isolate - min. 2 A (TCl 21, 28) 17 Isolate - min. 3 G, 6 A (3 BCl, 6 TCl) Xanthomonas-, Stenotrophomonas-ähnlich Xylella-ähnlich 1 Klon Stenotrophomonas-ähnlich 30 Isolate - 10 G, 13 A 1 Klon (Paracoccus-ähnlich) 2 A in der Rhodobacter-Gruppe Mycoplana (Caulobacter-Gruppe) 3 A in der Sphingomonas-Gruppe Acetobacter-ähnlich (Rhodosp.rubrum-Gr.) Azorhizobium, Ancylobacter, Agrobacterium, 2 A Agrob. / Zoogloea + 2 weitere G in der Rhizobium / Agrob.-Gruppe δ-Proteobakterien 4 Klone - wahrschl. 4 G Desulfomicrobium Desulfobulbus ε-Proteobakterien 1 Klon3 Gram-negativ, nicht näher charakterisiert 4 Isolate - min. 2 A (BCl40, 41) 9 Isolate - min. 3 G (BCl7,41,TCl33, 34, 41) Cytophaga-Falvobakterien-Bacteroides-Gruppe 2 Klone - 2 G Cytophaga-, Flexistipes-ähnlich Gram-positiv, hoher G+C-Gehalt 2 Isolate - 2 A 2 Isolate - 1 G 2 Propionibacterium-A Mycobacterium Gram-positiv, niedriger G+C-Gehalt 1 Isolat Staphylococcus nicht näher charakterisiert 29 Isolate Insgesamt mit den verschiedenen Methoden analysiert: 53 Isolate 138 Isolate 43 BIOLOG-bestimmt (11 BCl) 57 BIOLOG-bestimmt (28 BCl) 37 TGGE-analysiert (12 TCl) 81 TGGE-analysiert (27 TCl) 23 sequenziert 44 sequenziert 4 Klone - 4 G Clostridium-, Moorella-ähnlich 45 Klone sequenziert 3-159 3-160 Ergebnisse 3.5 Xenobiotika-Toleranz der Population In Analogie zum Xenobiotika-Screening der Sedimentproben und zur Isolierung spezifischer Stämme mit Xenobiotika (Kap. 3.2.3, 3.3.2) wurde in einem Plattentest das Wuchsverhalten der SA-Isolate auf den Xenobiotika bestimmt (2 Wochen / RT, Xenobiotika und Medien, siehe Anhang). Ziel war die Untersuchung des Wachstumsverhaltens der einzelnen Taxa und der Vergleich mit den Isolaten der Xenobiotika-Anreicherung. Neben dem rein taxonomischen Aspekt war die Toleranz der Isolate gegenüber den Xenobiotika auch als Maß für das „Selbstreinigungpotential“ der isolierten Population des Spittelwassersediments von Interesse. 3.5.1 Wachstum der SA-Isolate auf den Xenobiotika-Medien Bei der Beschreibung der Stämme auf den Xenobiotika-Medien wurde der Ausdruck „abbauend“ im Folgenden bewußt vermieden. Bekanntlich bestimmen chemische Struktur (Substituenten, Ringstabilität), Toxizität der Substanzen, enzymatische Fähigkeiten und Resistenz der Bakterien das mikrobiellem Abbauverhalten. Die Rolle dieser Faktoren war im Rahmen dieses Tests aber nicht zu bestimmen. Bei Wachstum auf dem Xenobiotika-Medium, aber nicht auf dem reinen Minimalmedium, ist ein Abbau als möglich anzunehmen, aber erst bei mehrfacher Rekultivierung „höchst wahrscheinlich“. Einerseits waren Spuren anderer Kohlenstoffquellen im Medium (Verunreinigungen, Ammonium-Fe(III)-Citrat) vorhanden die kurzfristig Wachstum oligotropher Bakterien ermöglichen könnten. Andererseits kann fehlendes Wachstum auf der Toxizität des Xenobiotikums oder sich akkumulierender Abbauprodukte beruhen, aber auch die allgemein extremen Bedingungen auf den Minimalmedien und Bedarf an Supplinen (Vitamine, Aminosäuren, Purine, Pyrimidine) können ursächlich sein. Toleranz, Resistenz und Nutzung waren hier nicht zu differenzieren 11. Ein weiteres Problem ist die häufige Plasmidcodierung von Resistenzen und Abbaufähigkeiten. Das Screening der SA-Isolate auf den Xenobiotika-Medien wird daher auch negativ ausfallen, wenn diese Plasmide bei Reinkultur der Isolate auf nicht-selektiven Komplexmedien verloren gingen (Hardman et al. [1986]). Verlust der Plasmide, fehlende Möglichkeiten zur Aufnahme entsprechender Plasmide (wie sie in Mischpopulationen diskutiert werden), bzw. allgemein fehlende Möglichkeiten zur Adaptation sind ebenfalls zu bedenken. Wahrscheinlich wurden vielfach tolerante „Hungerkünstler“ bestimmt und nur für wenige Stämme ist wirklich die Xenobiotika-Nutzung anzunehmen. Der Test maß in diesem Sinne die vorhandene Toleranz der auf SA (semispezifisch) vorkulti- 11 Eine Xenobiotika-Nutzung beweist die Substratab-, Produktzunahme oder spezifische Enzymaktivität. Zum Beispiel deutet die gelbe Färbung von Agarplatten bei Besprühen mit 2,3-Dihydroxybiphenyl auf Vorhandensein von Brenzkatechin-2,2-Dioxygenase und Biphenylnutzung. Falsch-positive Bestimmung ist möglich, da das Enzym auch Brenzkatechin umsetzt. Aufgrund der Eigenfärbung der Kolonien erwies sich das Verfahren hier als nicht praktikabel. Ergebnisse vierten Isolate gegenüber den Xenobiotika, beziehungsweise die allgemeine Nutzung (irgendwelcher Substanzen) dieser Xenobiotikamedien, unter den auf den Minimalmedien gegebenen Bedingungen. Unter den genannten Einschränkungen war das Wachstum der Bakterien auf den Testmedien erstaunlich gut. Nur 27 Stämme wuchsen auf keinem der untersuchten Medien. Wenn die Isolate wuchsen, dann zumeist auf 8 bzw. 10 der Xenobiotikamedien. In der Häufigkeitsverteilung waren diese Klassen mit 19 bzw. 13 Isolate besetzt. In Tab. 3.24 ist für die definierten taxonomischen Gruppen (nach BIOLOGAnalyse, FAME-Identifikationen, TGGE, Sequenzierung) die Anzahl der SA-Isolate mit positivem Wuchs pro Testmedium dargestellt. Am Gesamtergebnis (Tab. 3.24, unterste Zeile) wird deutlich, daß Medien mit flüchtigen Kohlenwasserstoffen den meisten SA-Isolaten Wachstum ermöglichten (maximal 62,5%, d.h. 82 von 131 Isolate auf oXy). Es ergab sich die Präferenzreihe oXy > mXy > pXy, Tol > Etb. Die Medien mit aromatischen Chlorkohlenwasserstoffen (3CB > 4CS > 5CS) wurden von den wenigsten Stämmen bewachsen (22-27%, d.h. 29-36 Isolate). Für die polycyklischen Aromaten und das bichlorierte Herbizid ergab sich die Reihe Bip > Ant, Nap > 24D > βHN. Das Wuchsverhalten auf βHN (27% der Stämme) entsprach dem mit den chlorierten Substanzen und der maximale Wuchs auf Biphenyl (Bip 52%) dem mit den flüchtigen Substanzen. Das Wuchsverhalten ermöglichte die Definition der folgenden Klassen: a) 5CS, 4CS, 3CB, βHN (von 29-36 Isolaten genutzt) ⇒ „schwer nutzbare Medien“ b) Nap, Ant, 24D, Etb (von 52-61 Isolaten genutzt) ⇒ „mäßig nutzbare Medien“ c) Bip, Tol, pXy, mXy, oXy (von 68-82 Isolaten genutzt) ⇒ „leicht nutzbare Medien“ Die für die SA-Iolate bestimmten Taxa ließen sich anhand des Xenobiotika-Screenings weiter charakterisieren. Die isolierten Proteobakterien nutzten vor allem die Medien mit flüchtigen Kohlenwasserstoffen und Biphenyl, zu etwa 42% auch 24D und Naphthalin (vergleiche Tabelle). Die α-, β- und β- / γ-Proteobakterien wuchsen im Schnitt auf 5-6,3 Medien, die γ-Proteobakterien auf durchschnittlich 7,8 Medien. Sämtliche Proteobakteriengruppen enthielten Stämme die auf keinem Xenobiotika-Medium wuchsen und nur wenige Stämme wuchsen auf sämtlichen Medien: Auf allen 13 Medien wuchsen ein Caulobacter / Sphingomonas-Stamm ([α], Sphingomonas-Gruppe, Anzahl Isolate NI=4), 3 Alcaligenes / Bordetella- Stämme ([β], Bordetella-Gruppe, NI=12) und die 3 Acinetobacter (johnsonii)-Stämme ([γ], Acinetobacter spec., NI=13). Einzelne Stämme der β-Proteobakterien (Acidovorax temperans und eine ähnliche Art) tolerierten 12 der 13 Xenobiotika. 3-161 Tab. 3.24 Xenobiotika-Toleranz der SA-Isolate Gruppe Sequenzierung Gattung / Art TCl BCl BIOLOG / FAMEIdentifikation niedrig G+C Staphylococcus (Propionibacterium) Mycobacterium 23 3 22 nb B; nb E nb N / nb; nb N / (Myc) hoch G+C Rhodospirillum Paracoccus / Rhodobacter rubrum (Acetobacter) -Gruppe 1 Rhizobium / Ancylobacter Agrobacterium 1Azorhizobium 2 -Gruppe (Hyp / Roh / Met) 3 Agrobacterium, . SUMME . 24 nb nb 4 5 5 14 Caulobacter -Gruppe Mycoplana bullata 10; 25 (Caulobacter / Mycoplana / 30 Brevundimonas), . 31 43; 44 48, 49 42; nb 26; 27 41; nb 8 28 28; . 40 32; 44; nb nb 39; nb 28 11 11; . 15 . 21 21 4; 29 20; 22, 41 29; nb; 41 30 5, 37 41; nb Acidovorax (temperans), . 5 Acidovorax temperans, . 5 Acidovorax facilis, . 10, 29, . . 36 N*; nb nb H*; nb (Caulobacter / Spm), . Erythrobacter 5 5 C S 1 1 2 nb nb 18, 29, nb N* Anc.aqu / (Xab) N / Xab.fla; nb nb N / nb; nb 1 1 2 SUMME 4 N, Com.tet / nb, nb 1 „Mic.div“ / nb SUMME 1 Brv.ves / Brv.ves; N CDC IIh 1 Psy.imm; nb SUMME 1 Mrx.lin / nb; nb 1 SUMME 7 N; Psa. hal / nb; nb 3 nb N; nb 1 Acn.joh 1 SUMME Com. 2 N / N; Acn.joh / Acx.del 2 Psd.psa; N,Com.ter, Mrx / nb Alc.fae; nb; She.puA / nb, N 3 Acx.fac N / Hyd.psf Mrx.bov / nb; nb 3 C B 2 4 D N a p ß B H i N p A n t E t b T o l o X y m p X X y y M ∑Is M 2 2 4 2 2 2 2 2 4 2 2 4 1 2 3 2 2 4 2 2 4 2 2 4 2 2 4 2 2 4 2 2 4 1 1 1 1 1 2 5 3 1 1 1 2 1 5 9 2 1 3 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 2 3 6 2 1 3 2 2 3 6 3 1 4 2 1 1 1 1 2 1 5 9 3 1 4 2 3 5 8 3 1 4 2 3 5 8 3 1 4 2 3 1 1 1 1 1 4 7 3 1 4 2 2 4 1 14 4 3 2 16 4 5 1 20 6 5 1 19 5 5 1 19 6 4 2 18 4 1 1 2 4 1 0 5 1 1 2 4 1 1 1 SUMME Shingomonas -Gruppe . α-Proteobacteria 4 Rubrivivax Alcaligenes / Bodetella, . 5 gelatinosus Comamonas 5 -Gruppe (Comamonas), . 5 (Comamonas/ Acidovorax) 4 C S 1 1 1 3 1 1 2 1 3 5 2 2 1 1 1 2 1 4 8 3 1 4 1 2 2 1 1 1 1 1 3 4 1 1 2 2 2 1 1 2 3 1 2 0 2 3 4 0 3 1 2 1 2 5 12 15 10 4 13 16 3 3 6 6 4 7 9 1 1 1 1 1 1 4 1 1 2 1 2 1 4 3 2 2 1 1 1 1 x MinMax 1 2 2 4 1 1 2 1 2 1 9 13 3 1 4 2 4 0 0 10 10 10,5 10-11 10,3 10-11 0 0 8 8 4 0-8 10 10 9 8-10 8 8 4,6 0-10 5,2 0-10 9,3 7-13 9 9 9,3 7-13 8 8 5 0-9 1 4 1 1 2 4 6 2 27 12 1 5 1 7 6 6,0 6 6,3 5,5 0 2,4 7 2,7 6,2 0-9 4-8 0-13 0-13 0 0-11 7 0-11 2-11 2 1 3 1 1 1 2 5 1 3 1 1 2 2 3 3 4 4 5 4 5 2 5 8,6 3-12 4 1 2 3 4 4 4 3 4 5,5 5-9 Gruppe Sequenzierung Gattung / Art TCl BCl 5 21 21; 39 21, 38 . 32; 42; nb 41 37, 38, 49 32 Acidovorax (facilis), . 5 (Acidovorax) 5 Variovorax (Variovorax/Rhodoferax) 5 (Ideonella / Rubrivivax) 5 (Thauera)6 (Chromobacterium)7 β-Proteobacteria (Xylella), . (Stenotrophomonas) (Xylella / Stm.) (Xanthomonas) (Xanthomonas / Stm.) β/γ-Proteobacteria 8 Acinetobacter (johnsonii) 8 Acinetobacter (lwoffii), . 8 (Acn / Moraxella), . 9 (Pseudomonas stutzeri)PaZ (Psd. mendocina)PaZ 9 (Psd.aureofac./ psdalc.)PaZ 9 (Psd.alcaligenes)PaZ 9 . 9 10 . γ-Proteobacteria . . Gesamtergebnis BIOLOG / FAMEIdentifikation Com.ter; Psy.imm; nb Mrx.atl, Lam., Acn.rad / nb N / nb N SUMME Acx. 19 N/N . nb nb . 17 nb nb SUMME 32 41 (Bru) nb nb . SUMME 19; 13 49; nb N; nb 21 41 Mrx / nb 16 44 N 28 nb nb 41 Psd.car . SUMME 21 29, 35; nb Acn.joh, (Acn) / Acn; nb 21 34 Alc,(Acn) / Acn,(Acn) 21 41 Acn.rad, N / nb 9 nb nb SUMME Acn. 41 Mrx.osl / nb . nb nb . 20 nb nb 21 nb nb 18 28 N / Psd SUMME Psd. 7 10 Aer.cav / Aer SUMME 33,34,37,41 41, nb N, nb / nb 4 C S 5 C S 1 6 1 4 1 o X y m p X X y y 2 4 D N a p ß B H i N p A n t E t b 4 5 7 4 3 9 10 10 8 7 2 2 2 2 2 1 2 2 2 8 17 15 9 21 11 19 24 25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 9 12 25 24 1 1 1 1 12 10 13 26 25 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 5 3 4 4 2 3 3 3 3 3 5 3 2 5 5 16 31 1 1 1 17 33 2 2 1 1 1 1 1 3 6 3 3 4 5 8 7 6 T o l 3 C B 5 8 1 8 1 1 9 1 23 25 30 35 1 1 1 1 24 26 31 36 2 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 3 5 6 9 3 3 3 3 4 6 6 6 1 21 1 1 1 1 1 1 7 10 10 10 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 3 1 1 1 10 8 10 13 14 1 34 29 36 60 52 36 68 54 61 70 3 1 14 1 82 1 2 1 1 2 1 1 1 1 1 1 3 3 2 3 1 1 1 1 7 12 12 9 13 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 14 1 75 x MinMax 7 13 19 4,2 0-10 2 22 1 1 2 36 1 1 1 60 1 1 60 6 1 1 6 1 15 3 6 10 5,6 10 6 0 5,3 9 4 5 3 8 10 2,8 10 4,2 13 10,2 9-11 0-12 10 6 0 0-13 9 4 0-13 0-10 8 10 0-8 10 0-10 13 3-13 4 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 5 1 1 1 13 13 19 5 72 74 131 1,5 8,2 8 1 8 11 5 6,4 10 7,8 0,6 5,8 0-6 0-13 8 1 8 11 5 1-11 10 0-13 0-3 0-13 2 25 1 1 30 31 33 1 1 1 1 31 32 35 2 2 1 1 1 1 1 1 3 2 1 1 1 8 5 5 3 3 3 5 5 5 1 1 M ∑Is M 1 9 1 1 9 1 3-164 Ergebnisse Legende (Tab. 3.24): TCl TGGE-Cluster (...) nicht identifiziert, nächst ähnliches Taxon mittlere Anzahl bewachsene Xenobiotika-Platte x ∑Is Summe der Isolate BCl * MM Min-Max BIOLOG-Cluster falsch Gram-bestimmt Kontrolle: Wuchs auf Minimalmedium Spannweite bewachsener Medien pro Isolat PaZ Psd. aeruginosa-Zweig (Moore et al. [1996] . / nb nicht bestimmt / nicht bestimmbar Taxonomische Untergruppen (nach RDP) 1 2 Rhodopseudomonas viridis Rhodopseudomonas vaniellii 3 4 5 6 Agrobacterium Bordetella Rubrivivax Rhodocyclus 7 8 9 10 Neisseria Acinetobacter Pseudomonas Aeromonas Abkürzungen Hyp/Roh/Met Hyphomicrobium / Rhodohalobium / Methylobacterium-Gattungsgruppe Spm Sphingomonas weitere Identifikationen wurden entsprechend dem 3-Buchstabencode von BIOLOG abgekürzt (vergleiche vorherige Tabellen der FAME-, BIOLOG- und TGGE-Analysen) Einige Gattungen umfassten Stämme mit extrem unterschiedlichem Wuchsverhalten: Die meisten Comamonas-ähnlichen Isolate [β] wuchsen auf keiner oder nur auf einzelnen Substanzen. Eines der 10 Isolate zeigte aber mit Wuchs auf 11 Medien recht hohe Toleranz. Von den fünf Pseudomonaden [γ] war ein P. mendocina-ähnlicher Stamm extrem sensibel (Wuchs nur auf dem schwer nutzbaren ßHN), drei zeigten mit 8-11 positiven Reaktionen gute Toleranz. Unter den Xylella- und Xanthomonas-ähnlichen waren ebenfalls einige extrem sensitive Stämme, ansonsten zeigten die Isolate der Xanthomonas-Gruppe (β/γ-Proteobakterien) zumeist gute Toleranz. Unterschiedliches Wuchsverhalten der Stämme fiel vor allem in Gruppen die in größerem Umfang isoliert wurden auf (Agrobacterium, Bordetella-Untergruppe, Comamonas, Acidovorax, Acinetobacter). Neben hoch toleranten Stämmen (Wuchs mit 10 bis 13 der angebotenen Xenobiotika) waren hier zumeist auch hoch sensitive Stämme (Wuchs mit maximal 3 Xenobiotika) isoliert worden (siehe Tab. 3.24). Die 4 Acinetobacter / Moraxella-Stämme entsprachen ihrem Ruf als „anspruchsvolle“ Bakterien (Henriksen [1975]), beziehungsweise unter Laborbedingungen schwach wüchsiger Bakterien (Schmider [1985]), und wuchsen nicht. Nur ein Stamm zeigte geringes Wachstum mit den flüchtigen C-Quellen (vergleiche Abb. 3.26). Die Anzahl Gram-positiver Stämme war für eine allgemeine Aussage zu gering. Von den wenigen Grampositiven SA-Isolaten waren die vier hoch G+C-haltigen Stämme der Gattungen Propionibacterium und Mycobacterium mit Wuchs auf 10 bis 11 Xenobiotika recht tolerant gegenüber den Wachstumsbedingungen. Sie wuchsen nicht mit den chlorierten Aromaten (4CS, 5CS, 3CB) und dem als stabil bekannten Naphthalin-Abbauprodukt (βHN). Der einzige isolierte niedrig G+C-haltige Staphylococcus-Stamm wuchs unter den gewählten Testbedingungen auf keinem der Medien. Um die Taxonspezifität des Xenobiotika-Wuchsverhaltens zu prüfen, wurde die Anzahl der XenobiotikaMedien auf denen die Isolate wuchsen (Anzahl positiver Tests pro Isolat) als funktionelles Merkmal der taxonomischen Gruppen betrachtet. Soweit die Gruppen mindestens 5 Isolate umfassten, wurden sie Ergebnisse anhand dieses Merkmals statistisch verglichen (STATISTICA: Kruskal-Wallis-Rangtest für nicht normalverteilte Daten). Die Unterschiede zwischen den taxonomischen Einheiten höherer Ebenen, den Hauptgruppen, Gruppen und Untergruppen, waren nicht signifikant (α>0,05): • Hauptgruppen: α-Proteobakterien [RDP-Nr.2.13.1; NI=27], β-Proteobakterien [2.13.2; NI=60], β/γ-Proteobakterien [2.13.3.4; NI=15], γ-Proteobakterien [2.13.3.10; NI=19] • Gruppen: Rhizobium-Agrobacterium [RDP-Nr. 2.13.1.8; NI=13], Caulobacter [2.13.1.7; NI=6], Rubrivivax gelationosus [2.13.2.2; NI=58] • Untergruppen: Agrobacterium [RDP-Nr. 2.13.1.8.8; NI=9], Bordetella [2.13.2.2.5; NI=12], Rubrivivax [2.13.2.2.6; NI=46], Acinetobacter [2.13.3.10.1; NI=13], Pseudomonas [2.13.10.3; NI=5] Diese taxonomischen Gruppen entsprechen den in Tab. 3.27 verwendeten Kategorien die mit der genetischen Bestimmung eingeführt wurden. Die Nummerierung entspricht der Kennzeichnung in der Ribosomal Database (RDP). NI bezeichnet die Anzahl Isolate pro taxonomischer Gruppe die in die statistische Berechnung eingingen. Erst auf Gattungs- und Artebene manifestierten sich Unterschiede im Wuchsverhalten (α > 0,0015 bzw. α > 0,0065): • Gattungsniveau: Agrobacterium und ähnliche Stämme [NI=9], Alcaligenes / Bordetella [NI=12], Comamonas und ähnliche Stämme [NI=6], Acidovorax [NI=34], Xylella-ähnliche [NI=6], Xanthomonas-ähnliche [NI=6], Acinetobacter [NI=9], Pseudomonas [NI=5] • Artniveau: Acidovorax (temperans)-ähnliche [NI=6], Acidovorax temperans und ähnliche Stämme [NI=5], Acidovorax (facilis)-ähnliche [NI=19], Xylella-ähnliche [NI=6], Xanthomonas-ähnliche [NI=6], Acinetobacter lwoffii und ähnliche Stämme [NI=6] Mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α<1% wurde die Nullhypothese einer gleichen Grundgesamtheit zurückgewiesen. Der statistische Test konnte Unterschiede nachweisen, erlaubte aber keine Aussage darüber, welche Gruppe oder Gruppen sich von den anderen signifikant unterscheiden. Dementsprechend war nicht zu bestimmen, welche Gruppe möglicherweise taxonspezifisches Verhalten zeigt. 3-165 Gattungsgruppen Hauptgruppen Artgruppen relative Anzahl Isolate 1 Agrobacterium (Ni=9) Alpha (Ni=27) Acidovorax facilis (Ni=4) 0,5 (Ni=5) Acidovorax temperans 0 1 Comamonas (Ni=6) Alcaligenes / Bordetella (Ni=12) Beta (Ni=60) Acidovorax (Ni=34) Acidovorax (facilis) (Ni=19) 0,5 (Ni=6) Acidovorax (temperans) 0 1 Beta/Gamma (Ni=15) Xanthomonas-ähnlich (Ni=6) Xylella-ähnlich (Ni=6) 0,5 0 1 (Ni=6) Acinetobacter lwoffii Pseudomonas (Ni=5) Gamma (Ni=19) Acinetobacter / Moraxella (Ni=4) 0,5 10Tol 11oXy 12mXy Abb. 3.26 Xenobiotika-Wachstumsprofile ausgewählter Proteobakteriengruppen Anteil der auf den einzelnen Xenobiotika wachstumsfähigen SA-Isolate pro taxonomischer Gruppe (Ni: Anzahl Isolate pro Gruppe) 13 - 11 - 9- 7- 5- 3- 1- 13 - 9- 7- 5- 13pXy 13 - 11 - 9- 7- 5- 1- 3- 7 Bip 8 Ant 9 Etb 11 - Xenobiotika: 1 4CS 4 24D 2 5CS 5 Nap 3 3CB 6 ßHN 3- 1- 11 - 13 - 9- 7- 5- 3- 1- 13 - 11 - 9- 7- 3- 1- Gesamt (Ni=135) 0,5 0 5- Acinetobacter (Ni=9) 0 1 Acinetobacter johnsonii (Ni=3) Ergebnisse Den Sachverhalt veranschaulichen die Grafiken in Abb. 3.26. Dargestellt ist die relative Anzahl Isolate einer taxonomischen Gruppe die auf den einzelnen Medien wachsen. Diese Wachstumsprofile kennzeichnen die taxonomischen Einheiten der α-, β-, β/γ- und γ-Proteobakterien (in der Abbildung: Alpha, Beta, Beta / Gamma und Gamma) auf der Ebene der Hauptgruppen, Gattungen und Arten. Auf Gattungsund Artebene wurden nur Profile vergleichbarer Gruppen dargestellt, für die mehrere Stämme isoliert werden konnten. Die (nach Reduktion der binominalen Daten auf die Anzahl bewachsener Xenobiotika pro Isolat, siehe oben) signifikanten Unterschiede auf Gattungs- und Artniveau werden in den zunehmend extremen Profile deutlich (Grafiken von links nach rechts). Bei etwa gleichem Stichprobenumfang wiesen zum Beispiel die Profile von Acidovorax temperans und der nahe verwandten, (Acidovorax temperans)-ähnlichen Art deutliche Unterschiede auf. Auf Gattungsebene unterschied sich das aus 34 Stämmen zusammengesetzte Acidovorax-Profil noch eindeutig von der nächst größeren Gattungsgruppe Alcaligenes / Bordetella (NI=12). Auf Ebene der Proteobakteriengruppen war dagegen das Profil der β-Proteobakterien (NI=60) und die Profile der α- und γ-Proteobakterien (NI=27 bzw. 15) einander sehr ähnlich und wahrscheinlich nur aufgrund der unterschiedlichen Stichprobengröße verschieden. Fraglich blieb also, ob und für welche Taxa die Xenobiotika-Wachstumsprofile allgemein Gattungs- oder Art-spezifisch sind. Bei relativ kleinen Fallzahlen (Anzahl Stämme pro taxonomischer Einheit), der bekannten Varianz verschiedener bakterieller Stämme, nicht gegebener Repräsentativität der Probenahme und Habitat-spezifisch (mit SA) isolierten Bakterien war die Frage anhand des vorliegenden Datenmaterials nicht zu beantworten. Die anscheinend taxonspezifischen Unterschiede könnten rein zufällig sein und stammspezifische Unterschiede einer selektiven (da isolierten) Auswahl von Bakterien wiedergeben. Die Einzelbeschreibungen ließen große Varianz des Wachstumsverhaltens innerhalb der Taxa erkennen und stellen die Allgemeingültigkeit der Gattungs- und Artspezifität der Profile in Frage. Betrachtet man zum Beispiel die minimale und maximale Anzahl positiver Tests in Tab. 3.24 (siehe „Min-Max“) wird deutlich, daß mit zunehmender Anzahl der Isolate pro taxonomischer Einheit die Varianz des Wuchsverhalten der Stämme anscheinend zunimmt. Womöglich heben sich bei unspezifischer Auswahl einer großen Anzahl von Stämmen bereits die Unterschiede einer Art auf (z.B. anhand von Reihenuntersuchungen der Stammsammlungen verschiedener Labore, Stämmen aus unterschiedlichen Habitaten und von verschiedenen Medien zu analysieren) und nicht wie hier erst bei Vergleich der Unter- bis Hauptgruppen. Die Beschreibung des Wuchsverhaltens der einzelnen taxonomischen Gruppen ist in diesem Sinne als spezifisch für die in dieser Arbeit isolierten Stämme zu interpretieren. 3-167 3-168 Ergebnisse 3.5.2 Vergleich des Wuchsverhaltens der SA- und Xenobiotika-Isolate Die Anreicherung und Isolierung von Xenobiotika-nutzenden Bakterien hatte eine starke Selektivität für bestimmte heterotrophe, raschwüchsige Taxa gezeigt. Die Stämme unterschieden sich darin wesentlich von den mit SA isolierten, zumeist oligotrophen Stämmen. Die Clusteranalyse der BIOLOG-Daten hatte bereits durch die getrennte Gruppierung deutlich gemacht, daß die beiden Anreicherungsverfahren im Wesentlichen verschiedene Populationen erfassten. Im Gegensatz zur Anreicherung mit Sedimentextrakt wurden mit den Xenobiotika-Minimalmedien Gram-positive, hoch G+C-haltige Taxa in großer Zahl nachgewiesen. Die zumeist der ArthrobacterGruppe zuzuordnenden Isolate (BCl G) dominierten auf 24D, 4CS, 3CB, Naphthalin und o-Xylol, aber nicht mit Anthracen. Mit SA wurden lediglich je zwei Mycobacterium- und Propionibacterium-ähnliche Stämme isoliert (BCl B, E), deren Bestimmung erst durch die genetische Analyse möglich war. Zwar wurden Vertreter dieser Taxa nicht direkt mit den Xenobiotika angereichert, aber die SA-Stämme bewiesen hohe Toleranz mit Wachstum auf 10-11 der Medien. Der mit SA-isolierte niedrig G+C-haltige Stamm der Gattung Staphylococcus erwies sich als nicht wachstumsfähig auf den Xenobiotika-Minimalmedien und war daher in der Xenobiotika-Anreicherung nicht zu erwarten. Die Selektion der Gram-negativen Taxa war wesentlich spezifischer an einzelne Xenobiotika gebunden. Pseudomonas wurde nur mit Anthracen und Naphthalin angereichert, Stenotrophomonas mit Naphthalin und o-Xylol, Enterobakterien mit Anthracen, Flavobacterium johnsonae mit o-Xylol, außerdem Alcaligenes faecalis mit Naphthalin sowie Comamonas testosteroni mit Naphthalin und 3CB. Offensichtlich bot Naphthalin noch den meisten Gram-negativen Taxa Wachstum. Die Gattungen Pseudomonas, Stenotrophomonas, Comamonas und Alcaligenes wurden auch unspezifisch mit Sedimentextrakt isoliert. Diese Stämme zeigten im Screening jedoch Toleranz gegenüber den meisten Xenobiotika (Wuchs mit ≥10 Substanzen bei einmaliger Inkubation auf den Medien). Diese breite Toleranz der SA-Isolate stand in deutlichem Kontrast zur spezifischen Anreicherung. Höchste Wachstumsraten erzielten allgemein die leicht-flüchtigen Kohlenwasserstoffe, während Naphthalin nur mäßig genutzt wurde. In der SA-Anreicherung waren besonders viele oligocarbophile, beziehungsweise oligotrophe Taxa bestimmt worden (vergleiche Tab. 3.3, insbesondere BCl 41: Acinetobacter, Acinetobacter / Moraxella, Moraxella, Acidovorax, Xanthomonas-ähnliche Stämme). Der Test bestätigte im Allgemeinen die Inkompetenz dieser Stämme unter den gegebenen Testbedingungen mit den Xenobiotika zu wachsen. Eine Ausnahme bildeten jedoch einige SA-Stämme, die in der genetischen Bestimmung als Acidovorax und Xanthomonas-Gruppe reklassifiziert worden waren: Einige dieser Stämme zeigten gutes Wuchsverhalten mit dem gebotenen Xenobiotika-Spektrum. Außerdem wurden auch sehr tolerante AcinetobacterStämme unter den SA-Isolaten bestimmt, die alle auf allen 13 Xenobiotika-Medien wuchsen. Stämme dieser Gattung konnten aber mit keinem Xenobiotikum aus der Probe direkt angereichert werden. Ergebnisse Das Wachstum mit den Xenobiotika betonte, daß extrem unterschiedliche Populationen mit den Anreicherungsmedien beschrieben wurden. Mit der Xenobiotika-Anreicherung wurden auf Komplexmedien raschwüchsige, häufig schwärmende Stämme selektioniert. Das Spektrum an isolierten Bakterien war sehr begrenzt. Dies entspricht der Populationsstrategie, offene Nischen zu besiedeln und sich gegenüber anderen Bakterien, auch unter widrigsten Umständen (wie minimalem Nährstoffangebot), auch antagonistisch, durchzusetzen. Die SA-Anreicherung bot dagegen ein reiches Spektrum an Substanzen und ermöglichte einem großen Spektrum an Bakterien gleichzeitig das Wachstum. Bakterien dieser Population sind eher „gesellschaftsfähig“ und auf das Leben in komplexen Gemeinschaften optimiert. Entsprechend zeigten diese Bakterien eher langsames Wachstum, waren „genügsam“ bis „anspruchsvoll“ und (wenn) flexibel gegenüber den Xenobiotika. Die „Spitzen-Athleten“ der Xenobiotika-Medien machen nur einen sehr geringen Anteil an dieser Population aus. 3-169 4-170 Diskussion 4 Diskussion Das Ziel der Arbeit war die Untersuchung der taxonomischen Struktur der bakteriellen Mikroflora des Oberflächensedimentes eines extremst belasteten Fließgewässers. Für diese Untersuchungen wurden kulturelle Verfahren der Isolierung gewählt, die unter naturnahen Bedingungen die Abschätzung der Bakterienzahlen ermöglichen sowie ein Xenobiotika-Screening-Verfahren zur Charakterisierung der Selbstreinigungskräfte der Mikroflora. Der Punkt „Methodik“ zieht sich bei dieser Aufgabenstellung als kritischer Faden durch die Arbeit, denn die Wahl der Methoden bestimmt das zu erfassende Bakterienspektrum. Die Methodologie ist eines der Hauptprobleme in der Ökologie der Mikroorganismen: Das Problem ist 1) die gesamte Mikroflora eines Ökosystems 2) zu identifizieren und 3) ihre Rolle innerhalb des Ökosystems zu bestimmen. Bis heute gibt es keine mikro- oder molekularbiologische Untersuchungsmethode mit der man komplette Informationen über die „Realität“ mikrobieller Gemeinschaften in ihrer natürlichen Umgebung erhält. Grundlegende Probleme sind die Entnahme repräsentativer Proben (destruktive Probenahme, inhomogene Mikrohabitate) und die Quantifizierung der Bakterien in natürlichen Biofilmen oder Aggregaten (Trennung der Konsortien, Trennung von der Sediment- oder Bodenmatrix). Außerdem ist die Methode zur taxonomische Bestimmung für das Ergebnis von entscheidender Bedeutung. Beim derzeitigen rasanten Wandel in der bakteriellen Systematik kann eine breite, detaillierte Taxonomie nur durch die Kombination mehrer Methoden in einem polyphasischen Ansatz erzielt werden. Im Rahmen einer allgemeinen Diskussion werden die hier hervorzuhebenden Aspekte kultureller Verfahren und bakterieller Identifikation erörtert. Die folgende Diskussion stellt außerdem vergleichend die Vor- und Nachteile, Anwendbarkeit und Möglichkeiten der angewandten Methoden heraus. Vor allem aber wird die bestimmte Populations-zusammensetzung in Beziehung zum Ökosystem diskutiert. 4.1 Die Verwendung kultureller Verfahren In der vorliegenden Arbeit wurden bewußt kulturelle Verfahren zur Beschreibung der mikrobiellen Populationen des Spittelwassersediments ausgewählt. Die Populationsanalyse basiert auf der „Plate Count“-Technik die, seit ihrer Einführung durch Robert Koch, immer noch die Standard-Methode zur Koloniezahl-Bestimmung („Lebendkeimzahl“) und Isolierung ist. Ihre starken quantitativen und qualitativen Limitierungen werden immer wieder betont (Medien- und Kulturselektivität, Problematik der Homogenisierung, Verdünnungs-, Pipettier- und Zählmethoden, Umfang der Stichproben etc., siehe z.B. Costerton et al. [1977]), so daß sich die Frage stellt warum hier nicht neuere molekularbiologische, Isolations unabhängige Verfahren gewählt wurden. Die Antwort wurde bereits von Buck [1979] wie folgt formuliert: „Gestern wie heute gilt: Plate counts sind zweckmäßig, einfach, billig, ermöglichen einen groben Vergleich und, wohl wichtigster Punkt, sie bieten die Möglichkeit weiterer differenzierter Laborstudien.“ Diskussion In der Veröffentlichung [1997] betont Palleroni die weiterhin bestehende Notwendigkeit lebende Kulturen zu untersuchen und fordert, daß zukünftige Forschung auf dem Gebiet bakterieller Diversität auch die Weiterentwicklung kultureller Verfahren in Richtung möglichst naturnahe Bedingungen umfassen sollte. In diesem Kapitel werden die Aspekte der Medienauswahl, Repräsentativität der Stichproben und die Bedeutung der Isolation von Bakterien für die ökologische Bestandsaufnahme erörtert, soweit wie sie für diese Arbeit von Bedeutung sind. Sediment-Extrakt-Medium Zur Isolierung und Charakterisierung der „Gesamtpopulation“ wurde hier Sedimentextrakt-Agar (SA) verwendet. Da die Wahl der Kulturmedien das Ergebnis der Populationsuntersuchung entscheidend beeinflußt, werden hier kurz die Punkte aufgezählt, die dieser Wahl zugrunde liegen: • Die mit den klassischen Kulturmedien der Gesamtkoloniezahlbestimmung (Nähragar NA, Laktosebouillon LB) selektierten schnellwüchsigen, eutrophen Bakterien mit engem Reaktionsschema sind in der Regel nicht standorttypisch. Optimale Medien für die Populationsanalyse sollten dagegen eine Balance halten zwischen der Vermehrung eutropher und oligotropher Bakterien und sie sollten möglichst hohe Koloniezahlen und Diversität bieten. Dafür muß jedoch langsamer Wuchs und geringe Koloniegröße in Kauf genommen werden (Stetzenbach et al. [1986]). Empfohlen werden artifizielle nähstoffreduzierte Medien (1:10 verdünnter Nähragar N10, nach Reasoner & Geldreich [1985] R2A) sowie Medien, die Extrakte des natürlichen Substrates (Wasser, Sediment, Boden) enthalten und eher den natürlichen Bedingungen entsprechen (Semenov [1991]). • Um die Ansprüche der einheimischen Bodenbakterien an organischen Wuchsfaktoren und mineralischen Bestandteilen zu befriedigen und gleichzeitig den Gehalt an Kohlenstoff- und Energiequellen so gering zu halten, daß antagonistische Effekte in der Population unterdrückt werden, verwendet man Boden-Extrakt-Agar und inkubiert minimal 14 Tage bei 25°C. Sediment- bzw. Boden-Extrakt-Medium zeigten in verschiedenen Untersuchungen für diese schwierigen Habitate höchste Gesamtkoloniezahlen und Variabilität (Williams & Gray [1973], Ghiorse & Blackwill [1981], Wilson et al. [1983], Bakken [1985]). • Allgemein gilt, daß nur 1% oder weniger der Zellen der natürlichen Mikroflora terrestrischer oder aquatischer Habitate auf Agarmedien isoliert werden können. Bereits Jannasch & Jones [1959] und Alexander [1961] veröffentlichten entsprechende Ergebnisse. Balkwill & Ghiorse [1982] konnten jedoch unter Verwendung von Bodenextraktagar mindestens 50% der Zellen kultivieren, die mit dem Epifluoreszenzmikroskopie bestimmt wurden (auf einem der üblichen nährstoffreichen Medium waren die Zahlen 3-5 Größenordnungen geringer). Bei jeder Probenahme wurde neu Sediment für die Bereitung des Anreicherungsmediums extrahiert, um realistische standortnahe Verhältnisse in Abhängigkeit von der Standortbelastung zu erzielen. Die Isolie- 4-171 4-172 Diskussion rung mit diesem variablen Medium ist in diesem Sinne als Anreicherung der zur Zeit vor Ort relevanten, bei standortgegebenem Selektionsdruck aktiven Population zu interpretieren. Variable Zusammensetzung und Toxizitätseffekte führten allerdings dazu, daß SA im Vergleich mit den Standardmedien nicht durchgehend höchste Koloniezahlen lieferte. Quantifizierung In relativ homogenen, aquatischen Biotopen ermöglicht die mikroskopische Zellzahlbestimmung12 relativ genaue quantitative Aussagen und liefert in der Regel mindestens 10- bis 100-fach höhere Werte als die Koloniezahlbestimmung. Besonders in Sedimenten, Böden und Belebtschlamm besteht jedoch eine Verbindung der Bakterien mit der Matrix und untereinander anhand extrazellulärer polymerer Substanzen (Dexter et al. [1975], Sutherland [1984]), so daß unter Umständen sogar niedrigere Zellzahlen als Koloniezahlen zu bestimmen sind (Staley [1974]). Für die quantitative Bestimmung und Kultivierung einzelner Bakterien (prinzipiell auch bei molekularbiologischer in situ Bestimmung einzelner Bakterien), müssen diese daher aus Aggregaten und Biofilm herausgelöst werden. Die Vereinzelung der Bakterien erfolgt durch Ultraschallbehandlung (Wilcox et al. [1983]), Zermörsern oder Schütteln in Flüssigkeit (Thomnetz et al. [1983], Tuschewitzki [1984]) oder wie hier, durch Ausnutzung der Scherkräfte mit dem Ultraturrax (Gunkel [1964], Pike et al. [1972]). Dies ist methodisch nicht unproblematisch: • Diese „Homogenisierung“ ist grundsätzlich mit einer Abtötungsrate korreliert, so daß eine vollständige Auflösung der Aggregate nicht notwendig maximale Koloniezahl ergibt. • Häufig kann selbst bei rein bakteriellen Aggregaten wie Belebtschlammflocken keine vollständige Homogenisierung erzielt werden (Kämpfer [1988]). In der vorliegenden Arbeit zeigte die mikroskopische Bestimmung13 einen großen Anteil Aggregate in den Originalproben, einen hohen Anteil kleinster, nicht zählbarer fluoreszierender Partikel und unvollständige Homogenisierung der verdünnten Proben, so daß die Zellzahlen nicht objektiv bestimmbar waren. Auf einen Vergleich der mit kulturellen und mikroskopischen Methoden zu bestimmenden Zahlen wurde hier bewußt verzichtet, denn beide verlieren durch die Heterogenität der Proben und die unvollständige Homogenisierung an Aussagekraft. Die zahlenmäßige Bestimmung der so anhand primärer Anreicherungsverfahren auf Festmedien isolierten Bakterien ist bestenfalls als „semi quantitativ“ zu bezeichnen. Die bestimmten Koloniezahlen sind in diesem Sinne erste Schätzwerte, die vor allem die 12 Zählung der Bakterien nach Membranfiltration und Anfärben des Filters mit Fluoreszenzfarbstoffen (siehe Bowden [1977], Hobbie et al. [1977], Wallis & Mellnick [1985], Zimmermann et al. [1978], Fehlerquellen siehe z.B. Jones & Simon [1975]). 13 Mit der von Fry [1988] durch Färbung der Zellen mit Acridin-Orange und Bestimmung unter dem Epifluoreszenz-Mikroskop optimierten Methode für Sediment. Diskussion Möglichkeit eines groben Vergleichs mit Literaturangaben bieten. Der qualitative Aspekt dieser Arbeit ist zu betonen. Repräsentativität der Probenahme Um einen wirklichen Eindruck der mikrobiellen Gemeinschaft zu erhalten, müßte eine „repräsentative“ Anzahl zufällig aus verschiedenen Proben ausgewählter Stämme isoliert werden. Was hierunter zu verstehen ist, wird je nach Forschungsbereich allerdings sehr unterschiedlich beurteilt. Eine statistische Auswertung findet regulär nur im hygienischen Bereich der Trinkwasseranalyse, Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Industrie Anwendung, wobei bei weniger als 400 ausgezählten Zellen oder Kolonien die Zahlen statistisch nicht abzusichern sind14. Bei mikrobiellen Populationsanalysen sind Zahl und Umfang der Stichproben dagegen primär arbeitstechnisch bedingt. „Ausreichend“ wird bereits die Identifikation von 20-30 isolierten Stämmen genannt, „glaubwürdig“ seien Ergebnisse mit 60 Stämmen (Bianchi & Bianchi [1982]). In der Regel wird die Zahl auf „handhabbare“ 100 bis maximal 1000 Individuen und eine Stichprobe begrenzt (Kämpfer & Dott [1988], Reichardt [1978], Staley [1974]). Bakteriologische Ergebnisse einer einzelnen Proben können jedoch maximal den Ort zur bestimmten Zeit charakterisieren. Selbst in einer Wasserprobe geben sie keine Information über die mögliche Variationsbreite. - Außer in dem unwahrscheinlichen Fall eines in sich homogenen Wassserkörpers (El-Shaarawi & Kwiatkowski [1986]). Kinkel et al. [1992] gehen davon aus, daß es wahrscheinlich unmöglich ist eine für taxonomische Zwecke wirklich represäntative Fraktion Bakterien aus der natürlichen Umwelt zu isolieren: • In mikrobiellen Systemen ist eine unvollständige, destruktive Stichprobenentnahme typerscherweise unvermeidlich. Es wird angenommen, daß die separaten Gemeinschaften sich über die Zeit auf ähnliche Weise entwickeln und diese Gemeinschaften durch die gleiche approximative Artabundanzverteilung über die Zeit beschrieben werden. Unabhängig davon, ob diese Annahmen biologisch begründet sind, ist eine Verifikation dieser Annahmen mit praktikablen Stichprobenumfängen nicht möglich. • Die Verteilung der Mikroorganismen ist im allgemeinen nicht homogen (insbesondere in Boden und Sediment), die Wahrscheinlichkeit variabler Ergebnisse für Stichproben unmittelbarer Nachbarschaft (Mikrohabitate) daher sehr hoch. • Stichprobengrößen die für den mikrobiellen Ökologen praktikabel sind, liefern allgemein nur begrenzte Informationen über die An- oder Abwesenheit seltener Arten, insbesondere in Gemeinschaften die hohe Variabilität in den relativen Artabundanzen zeigen. 14 Für die klassischen Zählverfahren der Lebendkeimzahl- und Zellzahlbestimmung (Plate Counts, MPN, mikroskopische Bestimmung) existieren statistische Fehleranalysen zur „Abzusicherung“ der Werte (Reichardt [1978]). Bei molekularen Zählverfahren (z.B. PCR-Quantifizierung) ist die Fehleranalyse noch nicht standardmäßig etabliert. 4-173 4-174 Diskussion Aus dem Gesagten ergibt sich, daß eine akkurate Schätzung der Veränderungen im Artenreichtum der Gemeinschaften über die Zeit mit den Standardstrategien der mikrobiellen Probenahme nicht möglich ist. Auch heute liefert keine Methode die wirkliche Zahl der Bakterien vor Ort. In diesem Sinne wurde in der vorliegenden Arbeit auf die statistische Auswertung der Anzahl KBE, Isolate und Taxa, auch auf die Umrechnung des prozentualen Anteils der bestimmten Taxa auf die Gesamtkoloniezahl (wie sie z.B. von Kölbel-Boelke et al. [1988] vorgenommen wurde) bewußt verzichtet, da sie eine nicht gegebene Sicherheit der Bestimmung vortäuschen würden. Isolierung und Kultur Prinzipiell können mikrobielle Stichproben und Schätzungen generelle Informationen über die Identität und Anzahl der dominanten Arten in einer mikrobielle Gemeinschaft liefern, wie diese zwischen den Gemeinschaften variieren und wie die Artidentität und Variabilität zwischen Gemeinschaften sich mit der Zeit ändert (Kinkel et al [1992]). Wie aber Kölbel-Boelke et al. [1988a] betonen, wird die mikrobielle Gesellschaft durch Isolate nur fragmentarisch beschrieben. Unter Berücksichtigung des selektiven Effekts wird mosaikartig Wissen bezüglich der physiologischen und ökologischen Differenzierung verschiedener Populationen zusammentragen. Methoden der Bakterien-Isolierung und in vitro Charakterisierung sind notwendigerweise selektiv und subjektiv. Die Ergebnisse sind abhängig von der Isolationsmethode, Medienzusammensetzung und anderen Faktoren wie persönlicher Erfahrung und Philosophie des Forschers. Mit der Isolierung kann auch nicht geklärt werden, ob die erfassten Bakterien einheimisch (allochthon) sind, vor Ort aktiv oder dormant. Warum der Isolierung heute trotz allem derart große Bedeutung zukommt, sollen die folgenden Punkte verdeutlichen: • In situ und molekularbiologischen Methoden haben den Nachteil, daß sie eine weitergehende umfassende Untersuchung der Bakterien nicht zulassen. Dies wird erst möglich, wenn aus Anreicherungskulturen Bakterien isoliert und getestet werden können. Der autökologische Ansatz, die Erforschung der Möglichkeiten der einzelnen Taxa, die Xenobiotika-Nutzung bzw. -Toleranz, ist für deren biotechnologische Anwendung von größter Bedeutung, aber auch grundlegend für das allgemeine Verständnis der Populationen, der synökologischen Fähigkeiten die z.B. die Selbstreinigungskraft mikrobieller Habitate ausmachen. • Bei entsprechender Handhabung (z.B. niedrigen Inkubationstemperaturen, geringerer Agar- / höherer Wassergehalt der Medien, längere Inkubationszeiten, Sediment- / Bodenextrakt- / Wassermedien) sind mit heute gängigen Methoden problemlos eine Vielzahl bisher nicht klassifizierter, „problematischer“ Bakterien zu isolieren und damit unter den verschiedensten Aspekten analysierbar. • Die bakterielle Systematik ist als ein „fließendes“ System zu betrachten. Die derzeitige Revolution in der bakteriellen Systematik aufgrund der zunehmenden genetischen Klassifizierung zeigt die Notwen- Diskussion digkeit einmal bestimmte Taxa verifizieren und revidieren zu können. Dies gelingt zuverlässig anhand von Stammsammlungen. Bisher unbekannte oder nicht beachtete Aspekte können an ihnen zu späterem Zeitpunkt untersucht werden. So war die ursprüngliche phänotypische Bestimmung auf morphologische Kennzeichen (Kolonie-, Zellmorphologie) fixiert, zunehmend kamen physiologische (Stoffwechselaktivitäten), biochemische (Fettsäuren, G+C-Gehalt) und genetische Merkmale (DNA / DNA, RNA / DNA-Hybridisierung, 5S, 16S, 23S rDNA-Restriktions- / Primermuster, -Sequenzierung) hinzu. Was heute die 16S rDNA-Sequenzierung kann in Zukunft aber auch die 23S rDNA sein oder auch eine neue Technik die die zur „Stamm“-Haltung gelagerten DNA-Präparate wertlos macht. • Die Spittelwasser ist starken Belastungen durch den Chargenbetrieb der Chemiekonzerne in Bitterfeld / Wolfen unterworfen. Durch die Produktionsstillegungen vollzog sich bereits zum Zeitpunkt der Probenahmen eine erhebliche Umstrukturierung des Gewässers, die allerdings durch die in Fließgewässern stetig mögliche Freisetzung aus dem Sediment und die langfristig dort abgelagerten Schadstoffe erst allmählich zum Tragen kommt. Bei Entlastung des Vorfluters durch die Inbetriebnahme des Gemeinschaftsklärwerkes in Bitterfeld werden die Selbstreinigung und Auswaschung das Gewässer innerhalb der nächsten Jahre vom „edelsten Dreck des Jahrhunderts“ (Wagner-Döbler, GBF News 12, [1996]) befreien und hoffentlich in den dem umgebenden Naturschutzgebiet entsprechenden natürlichen Zustand zurückversetzen. Für die mikrobielle Ökologie, Ökosystemtechnologie und Umweltbiotechnologie heißt dies aber, daß die Spittelwasser nur begrenzte Zeit zur Verfügung steht. Sei es als Modell der Selbstreinigung oder als Reservoir für isolierbare, extremsten Bedingungen unterworfenen Stämmen und Konsortien mit biotechnologischem Potential. In der Zukunft bieten konservierte Stämme und Originalproben (-70°C eingefrorene Proben mit / ohne Glycerolzusatz) die Möglichkeit auf einige dieser Bakterien oder Konsortien direkt zurückzugreifen. Bei der Analyse der extrem belasteten Spittelwasser als ein im Fluß befindlichen, in der momentanen Zusammensetzung vergänglichen System, ist daher die Isolierung als Möglichkeit zur dauerhaften Stammhaltung zu bevorzugen. 4.2 Mikrobiologische Charakterisierung des Standortes Durch die Wahl der Anreicherungsmedien und Inkubationsbedingungen wurde ein großer Anteil der aeroben, heterotrophen Population der Sediment-Oberfläche erfasst. Die standardmäße Bestimmung der Koloniezahlen auf NA und R2A ermöglichte den Vergleich mit Literaturdaten und beschrieb die variable Zusammensetzung des Sediment- Extrakt-Mediums (SA). SA bot möglichst naturnahe Bedingungen in Abhängigkeit von der Änderlichkeit des Probenahmeortes und hohe Kolonieausbeute. Die auf NA und R2A bestimmenten Koloniezahlen lagen bei 3,3 x107 bis 3,7 x108 KBE/ml (1,2 x109 bis 1,6 x1010 KBE/g TG). Die für ein Fließgewässer hohe Zelldichte, erklärt sich durch die Zufuhr organischer Belastung. Allgemein werden für Sedimente eutropher Seen und Belebtschlamm biologischer Kläranlagen 2 x107 bis 3 x108 MPN/ml angegeben (Schmider & Ottow [1981], Dott & Kämpfer [1988]). Wobei 4-175 4-176 Diskussion Kämpfer [1988] nachwies, daß in einer biologischen Kläranlage der mindest MPN-Wert von 3x108 Zellen/ml („Most Probable Number“) nur 107-8,9x107 KBE/ml auf NA entsprach und die KBE auf NA 10-100 mal höher lagen als auf R2A. Ausschlaggebend für die Spittelwasser sind die variablen Konzentrationen an organischen und anorganischen, toxischen Substanzen aus dem Chargenbetrieb des Chemiekombinates Bitterfeld / Wolfen. Da im Untersuchungszeitraum nur die mechanische Reinigungsstufe der geplanten Gemeinschaftsklärwerkes in Bitterfeld in Betrieb ging, blieben die erwarteten krassen Veränderungen aus. Die halbjährlichen Probenahmen registrierten von 1993 bis 1994 eine Zunahme der Gesamtkoloniezahlen um eine Zehnerpotenz. Dies könnte mit einer Zunahme leicht abbaubarer Verbindungen und / oder einer Abnahme toxischer Verbindungen korrelieren (zunehmende Auswaschung der Quecksilberaltlast), ebenso aber auch lediglich mit den registrierten klimatischen Schwankungen. Derart kleine Fließgewässer unterliegen relativ starken natürlichen Schwankungen. Während größere unbelastete Fließgewässern mikrobielle Maxima im Frühling und Herbst, bzw. Spätsommer (zu Zeiten stärkster Produktion) zeigen, fallen in unbelasteten kleineren Flüssen, aufgrund des Eintrags allochthonen Matrials, Maxima mit Hochwasserphasen und starken Niederschlägen zusammen. Die Abwasserbelastung kann diese mikrobielle Jahresrhytmik umkehren (Reinheimer [1991]). Bei starken Niederschlägen wird hier die Abwasserlast durch den Verdünnungseffekt erniedrigt, gleichzeitig ist die Sedimentationsrate gering. Die massiven Schlammablagerungen in der Spittelwasser wurden zum Beispiel bei Hochwasserereignissen nahezu vollständig ausgewaschen. Die mikrobielle Population bricht zusammen. Ein Vergleich der Koloniezahlen auf nährstofffreichen und nährstoffarmen Medien (NA / R2A) soll die Zahl copio-, heterotropher und oligotropher Bakterien vergleichen. Im eutrophen, saproben Milieu sollten rasch wüchsige, anspruchslose Bakterien vorherrschen (Reichardt [1978]). Dies galt im ersten Untersuchungsjahr 1993, aber im folgenden Jahr war die Anzahl der mit NA anzureichernden Bakterien durchweg etwa gleich hoch wie mit R2A. Darüberhinaus waren die Koloniezahlen auf SA 1994 grundsätzlich geringer als auf den Standardmedien NA, bzw. R2A. Als ursächlich ist die hohe industrielle Belastung mit ungewöhnlichen, zum Teil schwer abbaubaren organischen und toxischen Substanzen anzunehmen. Ein geringeres Angebot leicht verwertbarer Substanzen oder Mangel an bestimmten Mineralien könnten die relative Hemmung des Bakterienwachstum auf SA erklären, wahrscheinlicher ist jedoch ein höherer Gehalt an toxischen Substanzen. Auch eine verstärkte Produktion toxischer Derivate während des mikrobiellen Abbaus ist in Betracht zu ziehen (Meyer et al. [1984]) sowie deren abiologische Produktion durch das Autoklavieren des Sediment-Extrakt-Mediums. Die Abnahme der Bakterienzahlen im August 1994 kann entsprechend auf die Akkumulation toxischer Substanzen und sinkende Sauerstoffversorgung im längerfristig abgelagerten, kompakten „älteren“ Sediment zurück geführt werden. Diskussion Koloniezahlen auf Xenobiotika-Minimalmedien Das Potential Xenobiotika-Nutzender Bakterien wurde auf verschiedenen Xenobiotika-Minimalmedien erfasst. Das Wachstum von Bakterien auf Minimalmedium mit einer belastungstypischen Substanz als einziger Kolenstoffquelle, entspricht dem häufig angewandten Verfahren von Kiyohara et al. [1992], das im Bereich Altlastensanierung, Boden- und Grundwasserbelastung (z.B. Hanert et al. [1990], Kämpfer & Dott [1988]) zum Nachweis eines vorhandenen Selbstreinigungspotentials dient. Das Screening auf 13 verschiedenen Xenobiotika reflektierte hier die variable industrielle Belastung. Die Probenahmen 1993 wiesen etwa 102-105 KBE/g TG für leichtflüchtige Kohlenwasserstoffe und polycyklische Aromaten nach. Umfassende und empfindliche Sedimentanalysen der Mulde bei Raghun, als ableitendes System (Statusbericht BMFT [1995], siehe Kap. 1.3.2), bestätigten durch den Nachweis der leichtflüchtigen Aromaten (Tol, Etb, m / pXy, oXy) im Wasser sowie der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe Biphenyl, Anthrazen und ihrer Derivate die Spezifität des biologischen Tests. Leider fehlten entsprechende Referenzdaten für die weiteren Probenahmen. Die vorhandenen Daten der Gewässergüteberichte Sachsen-Anhalt (für die Mulde bei Dessau, 1993-1994), insbesondere die AOXWerte, erwiesen sich als zu unspezifisch für den Vergleich. Im folgenden Jahr wurden wie auf den Komplexmedien erhöhte Keimzahlen nachgewiesen, die Werte im August lagen zumeist ein bis zwei Zehnerpotenzen höher als im Mai. Die Keimzahlen betrugen mindestens 103 KBE/g TG für Chloraromaten (4CS, 24D, 3CB), polycyklische (Bip, Nap, Ant) und leichtflüchtige Verbindungen (Etb, Tol, mXy, oXy, pXy). Beim Vergleich mit 1993 war das zusätzliche Wachstum mit Naphthalin und Chloraromaten auffällig. Insgesamt ermöglichte der Test eine differenzierende Charakterisierung der Populationsveränderungen. Aus den Koloniezahlen auf den Xenobiotika-Medien ließ sich die Anpassung der Mikroorganismen an die wechselnden Konditionen im Spittelwasser ableiten. Die Verwendung der Xenobiotika als Screening-Verfahren zur Bestimmung der Belastungssituation und des Selbstreinigungspotentials hat sich insoweit bewährt. Bei entsprechender Auswahl der Substanzen kann dieser Test als empfindliches Indikatorsystem der Belastung dienen. Allerdings sind weitere vergleichende gaschromatische Untersuchungen notwendig um die Empfindlichkeit des biologischen Tests zu bestimmen, außerdem könnte das Spektrum der getesteten Substanzen verbessert werden. Zum Beispiel waren 5CS und βHN hier nicht nutzbar und könnten durch belastungsspezifische Substanzen ausgetauscht werden. Fraglich ist, wie der Schwierigkeitsgrad des mikrobiellen Abbaus (abhängig von Kettenlänge, -Verzweigung, Anzahl aromatischer Ringe, Halogensubstituenten, Substituentenstellung), das natürliche Vorkommen und Verhalten der Substanzen (Wasserlöslichkeit, Flüchtigkeit) generell berücksichtigt werden kann. Da beispielsweise BTX-Aromaten (Benzol, Toluol, Xylol) ubiquitär in Spurenkonzentrationen vorkommen ist die Fähigkeit diese abzubauen wahrscheinlich allgemein weitverbreitet (Wallnöfer & Engelhardt [1984]). Die Keimzahlen auf diesen einfachen Aromaten waren entsprechend hoch, obwohl sie in den Gewässergüteberichten selten oberhalb der Nachweisgrenze liegen. Die unterschiedlichen Koloniezahlen mit den Xylol-Isomeren verdeutlichten den Einfluß der Substituentenposition. Die chlo- 4-177 4-178 Diskussion rierten aliphatischen Kohlenwasserstoffe 4CS und 5CS ergaben wesentlich geringere Zahlen als die Aromaten 24D und das chlorierte 3CB, entsprechend geringem Vorkommen und geringer Abbaubarkeit. Auch Bakterien die polycyklische aromatische Kohlenwasserstoffen (PAK) metabolisieren, sind natürlicherweise weit verbreitet und werden vermehrt im Bereich möglicher Verunreinigung gefunden (Kiyohara et al. [1992]). Erst die im Vergleich mit den anderen Medien recht hohe Zahl der Biphenyl, Naphthalin und Anthracen-nutzenden Bakterien ergibt daher den spezifischen Nachweis im Spittelwasser. Das Wuchsverhalten mit PAK korreliert aber nicht einfach mit Struktur und Anzahl aromatischer Ringe. Nach den Studien von Kiyohara et al. [1992] waren zum Beispiel Phenanthren-nutzende Bakterien für die Komplexität des Moleküls unerwartet weit verbreitet und häufig (Anthrazen, Chrysen: 6-7%, Biphenyl, Naphthalin: 23-27%, Phenanthren: 27% in unbelasteten, 98% in Öl belasteten Böden). Sie kamen zu dem Schluß, daß die einfachen Aromaten aufgrund der Flüchtigkeit und Wasserlöslichkeit der Substanzen in geringerer Konzentration in der Umwelt vorkommen und daher keine entsprechende Adaptation der Mikroflora nachzuweisen war. Wie Kiyohara et al. [1992] betonen, sind weitere Untersuchungen über die Verbreitung der Substanzen und ihrer Derivate, die vorhandenen Oxidationsenzymsysteme der Bakterien und ihre Funktion notwendig. Rekultivierbarkeit Für die weiteren Untersuchungen wurde nach den Empfehlungen von Kämpfer & Dott [1988] die Isolierung von 100 bis 200 Reinkulturen aus einer Verdünnungsstufe angestrebt. Diese Anzahl konnte nicht erzielt werden. Grund waren zum einen das unerwartete Auftreten von Agarliquifizierern und zeitweilig hohes Aufkommen an Mikrokolonien, die Heterogenität der Proben und starke Schwankungsbreite der Zellzahlen, vor allem aber die unterschiedliche Rekultivierbarkeit der Bakterien auf den Isolationsmedien. Wie der Vergleich zählbarer und isolierbarer Kolonien in der vorliegenden Arbeit bestätigte, war die primäre Kultivierbarkeit der oligotrophen Bakterien durch die „naturnahen“ Bedingungen auf SA (Standort-Medium und Raumtemperatur) entscheidend zu fördern. Positiv für die Isolation der Bakterien erwies sich die bei relativ langer Inkubationsdauer die im Vergleich zu den Komplexmedien (NA, R2A, N10) geringere Tendenz zu Schwärmen und der geringere Koloniedurchmesser, der vermutlich die Adaptation an vergleichsweise nährstoffarme Bedingungen durch Reduktion der Zellgröße reflektiert (Novitsky & Morita [1976], zitiert in Stetzenbach et al. [1986]). Die große Anzahl oligotropher Bakterien mit geringem Wuchs auf Komplexmedium bewies den Erfolg des SA-Ansatzes. Viele der primär auf SA bestimmten Kolonien waren allerdings auch auf Sediment-Extrakt-Medium nicht zu rekultivieren. In der Literatur wird auf Rekultivierungsprobleme bei nährstoffarmen Habitaten hingewiesen: Nach Stetzenbach et al. [1986] überlebten 10% der Grundwasserisolate die Subkultur auf R2A nicht. Nach Dott [1980] schloß aus der Kreuzimpfung auf verschiedenen Medien, daß die nicht rekultivierbaren Bakterien auf den Isolierungsmedium mit Reservestoffen wuchsen, während das Sekundärmedium die Diskussion Nährstoffbedürfnisse wahrscheinlich nicht befriedigt. Die Annahme dieser Theorie betrifft auch die Interpretation der mit Xenobiotika-anzureichernden Bakterien: Bakterien die Xenobiotika (z.B. 4CS) nutzen können wurden hier möglicherweise nicht isoliert, da ihr Wachstum durch Fehlen weiterer Nährstoffe im Minimalmedium verhindert wurde. Maximal waren auf 4CS 40% der KBE nicht rekultivierbar. Durch Vereinzelung von Mischkolonien wurden von Xenobiotika-Medien teilweise aber auch mehr Isolate gewonnen als KBE bestimmt wurden. Von oXy wurden aus jeder gepickten Kolonie im Schnitt drei Isolate vereinzelt. Die „Mischkolonien“ oder Konsortien ermöglichen wahrscheinlich primäres Wachstum auf den Minimalmedien durch kometabolische Nutzung. 4.3 Die Charakterisierung und taxonomische Bestimmung von Bakterien Die Charakterisierung und Identifikation von Bakterien ist ein Punkt allgemeiner Diskussion. Im Vordergrund steht auch hierbei die Anwendung molekularbiologischer Techniken. Für die taxonomische Zuordnung gilt die Bestimmung der Nukleinsäuresequenzen inzwischen vielfach als „ultimatives“ Maß der Charakterisierung. Die rRNA-Gen-Sequenzierung ermöglicht einen kulturunabhängigen Vergleich der verschiedensten, phylogenetisch weit entfernten Organismen (Prokaryonten, Eubakterien und den anderen Reichen). Die Bedeutung der Nukleinsäuren wird allerdings häufig aufgrund einer Fehlinterpretation des Begriffs der „phylogenetischen“ Klassifikation überschätzt: • Phylogenetische Klassifikation bedeutet eine natürliche Klassifikation nach der Evolution der Organismen. Die existierenden Evolutionstheorien sind jedoch rein hypothetischer Natur und nicht zu beweisen. Dies betrifft zum Beispiel die Frage der Evolutionsraten, gemeinsamer Vorfahren, Stellung der Archaebakterien im Bakteriensystem etc. • Die heutige Gen-Struktur eines Organismus entspricht dessen molekularem, genetischen „Phänotyp“. Die hierauf beruhende Analyse der Verwandtschaften und Klassifikation ist selber nicht „phylogenetisch“ (Priest & Austin [1993]). • Trotz verschiedener Behauptungen in der Literatur gibt es keinen festen Beweis, daß die phylogenetische Klassifikation besser vorhersagbar, kongruenter oder stabiler ist als die phänetische Klassifikation (Sokal [1985]). Die Anwendung unterschiedlicher Analysemethoden auf Sequenzdaten kann zum Beispiel weitreichende Veränderungen im Verzweigungsmuster der Kladogramme bedeuten (siehe z.B. Felsenstein [1984]). • Eine rein kladistische (phylogenetische) Klassifikation die nicht dem Grad der phänotypischen Verwandtschaft zwischen Arten folgt ist für die Praxis von geringem Wert (Priest & Austin [1993]). In der Systematik der höheren Tiere werden zum Beispiel die Krokodile zweckmäßigerweise den Reptilien zugeordnet, nach ihrer phylogenetischen Verwandtschaft sollten sie mit den Vögeln zusammengefasst werden (gemeinsamer Vorfahr: Archaeopteryx). 4-179 4-180 Diskussion Es bleibt festzustellen, daß die bakterielle Systematik auch mittels der Nukleinsäuretechniken bislang kein stabiles, phylogenetisch-basiertes Klasssifikationssystems erreicht hat. Das Ziel der Klasssifikation ist ein praktisches Schema, anhand dem unbekannte Organismen identifiziert werden können. Sie soll so akkurat wie möglich und praxisrelevant, die Affinität zwischen Organismen wiederzugeben. Die hierfür erhobenen Daten (phäno- oder genotypisch) können mittels statistischer Methoden objektiv analysiert werden, die daraus entwickelten Klassifikationen (biochemische, physiologische, genetische Klassifikation) können unabhängig getestet werden. Wenn neue Daten belegen, daß die bisherige Klassifikation nicht korrekt ist, wird mittels der neuen Information eine bessere Klassifikation konstruiert. Dies geschieht zur Zeit mit Hilfe der Sequenzdaten. Zur Entwicklung eines anwendbaren Klassifikationssystems der Bakterien sind die verschiedenen Identifikationsmethoden in einem „Polyphasic Approach“ zu kombinieren (Murray et al. [1990]). Die bakteriellen Gruppen sind außerdem nicht anhand rein phänotypischer oder phylogenetischer Analysen und daraus zu generierenden numerischer Grenzwerte (z.B. Grad der DNA-DNA-Homologie) zu beschreiben (Stackebrandt [1988], Tindall [1994]). Methodisch könnten sich die molekularbiologischen Techniken, insbesondere der PCR, „als bedeutendstes Werkzeug des Mikrobiologen seit Einführung der Impföse erweisen“ (Feltham & Stevens [1994]). Die hiermit erhoffte routinemäßige direkte und akkurate Bestimmung von Bakterien innerhalb weniger Minuten, ist aber bislang noch nicht gelungen. Moderne Anwendungsformen metabolischer und phänotypischer Tests (beispielsweise die C-Quellen-Verwertung, Fettsäureanalytik) sind weiterhin kosteneffektivste Mittel zur Detektion und Identifikation von Bakterien im Labor, da sie beweisen konnten, daß sie Identifikation und taxonomische Vorhersagen erlauben, die sehr eng mit den phylogenentischen Schlußfolgerungen der Nukleinsäureanalyse korrelieren. Die Kombination der unterschiedlichen Methoden, der „Polyphasic Approach“, ist grundsätzlich für die Umweltanalyse optimal. Wie innerhalb des vorangegangenen Kapitels zur Verwendung kultureller Verfahren bereits hervorgehoben wurde, kann im Rahmen einer Populationsanalyse nicht allein die molekularbiologische, beziehungsweise taxonomische Zuordnung eines Bakteriums interessieren. Da bislang nur wenige Bakterien benannt sind und aus dem Namen eines Bakteriums kaum oder gar nichts über dessen Fähigkeiten und Lebensweise ausgesagt werden kann, ist die kulturelle phänotypische Beschreibung von besonderer Bedeutung. Bakterien wenig bekannter Habitate, das heißt allgemein im Umweltbereich, sollten nach Möglichkeit „polyphasisch charakterisiert“ werden. Die polyphasische Analyse bietet eine zuverlässige taxonomische Bestimmung und kann gleichzeitig eine weitergehende physiologische Beschreibung des Phänotyps bieten. Entsprechend basierte die taxonomische Zuordnung hier auf den Vergleich verschiedener Methoden: Der genetischen 16S rDNA-Analyse, der Bestimmung der Gesamtfettsäuren (FAME) und der Verwertung von Kohlenstoffquellen (BIOLOG). Um darüberhinaus das erwartete belastungspezifische Verhalten der Spittelwasserpopulationen, beziehungsweise der isolierten Taxa zu charakterisieren, wurde hier zusätzlich ein Screening auf Xenobiotika-Minimalmedien durchgeführt. Diskussion Genetische Variabilität der Arten und fließende taxonomische Übergänge Ein Punkt der für die Bestimmung der Arten von wesentlicher Bedeutung ist, ist die Variabilität der zu bestimmenden taxonomischen Einheiten. Für den Mikrobiologen der mit praktischen Problemen des Nachweis, Identifizierung, Klassifizierung von Isolaten auf dem Artniveau konfrontiert ist, ist die innerartliche Variation (genetisch, metabolisch oder biochemisch) ein lästiges Hintergrundsignal, das es erschwert distinkte artinvariante Charakteristika zu finden (Selander et al. [1994]). Gerade in der molekularen Bestimmungspraxis wird der Polymorphismus von Allelen, als Motor der evolutionären Populationsgenetik, obwohl direkt zu beobachten, kaum berücksichtigt. Dabei zeigen bekanntlich selbst inaktive, gelagerte Stämme mit der Zeit deutlichen Polymorphismus. Subkulturen des E. coli K12 Standardstammes W3110 wiesen zum Beispiel nach 30 Jahren in der Stammsammlung derartig hohe Varianz der Populationen, daß es schwierig war die postulierte parentale Form des Chromosoms mittels RFLP zu identifizieren (Arber et al. [1994]). Nübel et al. [1996] konnten die Heterogenität von 16S rRNA-Genen für Paenibacillus polymyxa nachweisen. Eine Analyse der prokaryotischen SSU rRNA (GenBank 87, Ausgabe 15.2.1995) ergab für einige Taxa substantielle intraspezifische Variationen (Clayton et al. [1995]). Hierfür könnten aber nicht nur Interoperon-Variation eines Stammes und Stamm-zu-StammVariation einer Art ursächlich sein, sondern auch inadäquate Taxondefinition, Sequenzierungs- oder Laborfehler. Um die genetische Variabilität zu analysieren sind zuverlässige Daten und statistische Verfahren für die Evolutionsgenetik gefragt (Tibayrenc [1996]). Analog den Ansätzen numerischer Taxonomie (siehe z.B. Kriterien der BIOLOG-Identifikation) sind operative statistische Verfahren zur Definition der taxonomischen Einheiten zu entwickeln. Die Varianz und Streuung der Reaktions- oder Sequenzmuster um einen Art-Mittelwert würden dann die Grenzen einer Art beschreiben. Das Identifikationsverfahren testet dann zum Beispiel die Hypothese H0 : „Gleiche Grundgesamtheit, d.h. eine Art ?“. Interessant wäre in diesem Zusammenhang eine statistische Analyse der Stammvariabilität innerhalb der Datenbanken für den humanmedizinischen Bereich, da dieser bislang am umfassendsten und genauesten analysiert wurde. Ein bislang wenig beachteter Aspekt der Phylogenie ist, daß innerhalb der beobachteten Evolutionslinien von Natur fließende Übergänge zu erwarten sind und keine „Evolutionssprünge“. Das bisher praktizierte bakterielle Artkonzept dividiert dieses evolvierende Kontinuum willkürlich (Maynard Smith [1995]). Vandamme et al. [1996] brachten die Diskussion auf, daß das Bild distinkter taxonomischer Cluster allein die bisherigen Limitierungen in der Beschreibung des vollen Ausmaßes bakterieller Diversität widergibt. Mit zunehmender Informationsmenge und Kenntnis der mikrobiologischen Populationen werden demnach die distinkten Cluster graduell verschwinden und fließende Taxon-Übergänge bestimmt. Alle Schemata bakterieller Typisierung und Identifizierung, vom „Biotyping“ bis hin zum „PCR-Fingerprinting“, basieren jedoch auf der Annahme, daß dinstinkte Organismen oder Zelllinien erfasst werden. Die angewandten deskriptiven Verfahren der statistischen Analyse werden diesem Aspekt nicht gerecht: In der numerischen Taxonomie wird meist das konservative „Average Linkage“-Verfahren angewandt, 4-181 4-182 Diskussion empfohlen für distinkte Cluster und unterschiedliche Clustergrößen. Die Clusteranalyse der BIOLOGReaktionsmuster erfolgte beispielsweise mit dem UPGMA-Verfahren („Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average“). Die bei fließenden Übergängen zu erwartenden „kettenbildenden“ Datensätze würden aber mit dem „Single Linkage“-Clusterverfahren besser beschrieben (Anderberg [1973], Sokal & Sneath [1963], Clifford & Stephenson [1975]). Vielversprechend scheint der Vorschlag von Vandamme et al. [1996] zur Analyse in die polyphasische Taxonomie die „Fuzzy Logik“ (Kosko [1994]) einzubringen. Mit diesem Verfahren wird die Idee, daß ein Objekt einer Gruppe nicht ausschließlich („ganz oder gar nicht“) sondern zu einem bestimmten Grad angehört, mathematisch formuliert. Eine Verbesserung der zur Verfügung stehenden statistischen Methoden in der Evolutionsgenetik würde nicht nur die Taxonomie (Definition und Beschreibung der Taxa), sondern auch Epidemiologie (Stabilität von Genotypen in Raum und Zeit) betreffen, die Beurteilung des Einflusses genetischer Diversität der Mikroorganismen auf ihre Fähigkeiten (Pathogenität, Resistenz, Degradation usw.) und Quantifizierung des aktuellen Impakts des Genaustausches in natürlichen mikrobiellen Populationen (Tibayrenc [1996]). Letztendlich beeinflusst die unbestimmte Sequenzvariabilität jegliche ökologische Schlußfolgerung. 4.4 Charakterisierung und Identifikation der Spittelwasser-Isolate Die Isolierung stellte die Aufgabe einige 100 Stämme, ohne Vorwissen über ihre mögliche Identität, taxonomisch zuzuordnen. Die polyphasische Analyse umfaßte hier physiologische, biochemische und genetische Charaktierisierung und wurde ergänzt durch klassisch morphologische Beschreibung. Primär, basierend auf der Bestimmung des Gram-Verhaltens, erfolgte ein physiologisches Screening mit dem Kohlenstoff-Verwertungstest der Fa. Biolog (BIOLOG-System). Zusätzlich erfolgte eine biochemische Analyse der Gesamtfettsäuren mit dem MIDI-Microbial Identification System (FAME-Analyse, MIS). Beide Systeme ermöglichten die Identifikation bekannter Taxa. Als genetisches Screeningverfahren wurde die Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese (TGGE) spezifisch PCR-amplifizierter 16S rDNA Fragmente (TPCR) eigens optimiert. Die Sequenzierung des kompletten PCR-amplifizierten 16S rDNAGens oder auch der TPCR-Fragmente bestimmte die (phylo-)genetische Verwandtschaft. Das Wachstum der Bakterien auf den verschiedenen Medien des Xenobiotika-Screenings diente darüberhinaus der autökologischen Beschreibung der Stämme und zur Beschreibung des Ökosystems. Dieses Kapitel greift die kritischen Punkte der Methoden auf, diskutiert die resultierende Populationszusammensetzung und leitet über zu dem Versuch einer allgemeinen Ökosystembeschreibung. 4.4.1 Mikrobiologische Charakterisierung und Identifikation Bei der Auswahl des BIOLOG-Systems als primäre Bestimmungsmethode wurde Wert auf die rasche Durchführung, Gruppierung und Charakterisierung auch empfindlicher Stämme und möglichst hohen Informationsgehalt gelegt. Vorteil der physiologischen Charakterisierung und Aktivitätsbestimmung ist Diskussion die Möglichkeit zur Anpaßung der Test- an die Umweltbedingungen und die Beschreibung der Kohlenstoff-quellen für eine verbesserte Kultur. BIOLOG bietet die derzeit umfassenste kommerzielle Datenbank zur Identifikation von Umwelt-Bakterien. Die Hersteller weisen allerdings ausdrücklich daraufhin, daß bei „weniger untersuchten“ Habitaten wie Boden, die Identifikationsrate unter 50% liegt (80% in der pharmazeutischen und Nahrungsmittelindustrie). Außerdem kann man feststellen, daß mit dem Umfang des zu analysierenden Bereichs, der Habitate und Taxa, die Identifikationsgüte leidet. Je spezifischer ein Nachweis (Stämme, Biotypen, Serotypen) und je begrenzter der Ursprung (klinischer Bereich, heiße Quellen, methanogene Bakterien usw.), desto bessere Identifikationstechniken stehen derzeit zur Verfügung. Das BIOLOG-System schneidet daher im Vergleich mit automatisierten Systemen für die klinische Diagnose in diesem Bereich relativ schlecht ab: Enterobacteriacea werden von BIOLOG nur zu 60% richtig erkannt, von Sesititre aber zu 88,5% und von Vitek zu 98,8% (Feltham & Stevens [1994]). Dies ist unmittelbar auf den geringeren Grad der Spezialisierung zurückzuführen. Da die „naturnah“ isolierten SA-Stämme geringes Wachstum unter den üblichen Laborbedingungen zeigten, wurden die BIOLOG-Testbedingungen modifiziert um diese große Gruppe der Bakterien beschreiben zu können (Vorinkubation mit NA bei Raumtemperatur, Test bei 30°C). Da zu erwarten war, daß nur ein relativ geringer Prozentsatz der isolierten Bakterien identifizierbar ist, wurde die hierdurch herabgesetzte Identifikationsgüte in Kauf genommen. Die Clusteranalyse der BIOLOG-Daten bot dafür die Möglichkeit Identifikationsschwächen unter angepaßten Bedingungen (Inkubationszeit, -Temperatur, Vorinkubation, Inokulumdichte, -Medium) aufzudecken, Gruppierung und Differenzierbarkeit anhand identifizierter Taxa zu prüfen. Theoretisch sind zwar bei 95 Substraten im BIOLOG-Test 295 = 3,96 x 1028 Reaktionskombinationen (positiv / negativ) und „Breathprints“ möglich, die eine entsprechende Zahl von Bakterien charakterisieren könnten. Praktisch besteht aber zwischen der Nutzung verschiedener Säuren, Zucker oder Aminosäuren ein faktorieller Zusammenhang, der die Anwendung erheblich einschränkt (Bochner [1990]). Es ist daher nicht anzunehmen, daß sämtliche mit BIOLOG testbaren Taxa auch differenzierbar sind. Wie Bochner [1990] betont, versagt daß das BIOLOG-Testsystem auch bei unzureichender metabolischer Information. Identifikationen wie „Bacillus insolitus 26°C“ (BIOLOG GP-Datenbank Version 3.50), die auf nur 3 positiven Reaktionen beruhen, sind nur bei Isolierung aus spezifischen Biotopen (im humanbeeinflussten, klinischen Bereich) und unter Verwendung spezifischer Medien annehmbar. Die Ergebnisse zeigten zum Beispiel, daß bei geringer Aktivität Gramnegative Taxa verschiedener Superfamilien zusammen gruppierten (Brucella, Pasteurellaceae, Neisseriaceae, Moraxella und atypische Xanthomonas). Der Nachweis taxonübergreifender Cluster weist zum einen auf systemspezifische Schwächen hin, ist aber teilweise auch auf die ausschließliche Analyse von Isolaten zurückzuführen. Die Clusteranalyse umfaßte zumeist unbekannte Stämme, aber nicht die „taxonomischen Centroide“. Die der Identifikationsdatenbank zugrunde liegenden Reaktionsmuster des „typischen Laborstamms“ fehlten zur Beschreibung 4-183 4-184 Diskussion der Isolate eines taxonomisch wenig charakterisierten Habitats. Analog der Sequenzanalyse, kann aber prinzipiell jedes neue, distinkte Reaktionsmuster das einer bestehenden Analyse hinzugefügt wird, die Struktur der Cluster beeinflussen. In der Sequenzanalyse werden daher zur Stabilisierung „neuer“ Zweige weitere, möglichst nahe verwandte Taxa, hinzugefügt. In Screening-Verfahren unterstützen getestete Referenzstämme und eindeutig identifizierte Isolate das Clusterverfahren (z.B. TGGE, oder wie hier BIOLOG). Aber auch die zunehmende Zahl Isolate pro Cluster minimiert diese Effekte. Eine Populationsanalyse sollte daher möglichst großen Stichprobenumfang, weitere Probenahmen und wiederholten Nachweis der unterbesetzten Cluster anstreben. Die Aktivitäten und Identifikationen mit dem BIOLOG-System zeigten deutliche Unterschiede in der Durchführbarkeit zwischen Gram-negativen und -positiven Isolaten, selektiv mit Xenobiotika und unspezifisch mit SA angereicherten Bakterien. Vor allem bei geringem Wuchs der Isolate unter Laborbedingungen kam es zu fehlerhaften Identifikationen und Differenzierungsproblemen mit dem extensiv genutzten BIOLOG-System. Aufgrund der Zuordnung zu distinkten Clustern und geringer Aktivität wurden unmittelbar mindestens 2% der Identifikationen als fraglich eingestuft. Isolate die „gerade eben“ entsprechenden Wuchs zeigten um eine FAME-Analyse durchzuführen, wurden auch mit diesem System nicht zuverlässig bestimmt. Die FAME-Analyse wurde streng nach Herstellerangaben angewandt (TSBVorinkubation), daher war die Identifikationsgüte insgesamt höher als mit BIOLOG. Die Anwendung beschränkte sich aber auf Stämme die auf NA rasch wachsen, daß heißt vor allem die mit Xenobiotika angereicherten Bakterien. Auch mit diesem System war die Zahl nicht identifizierbarer Bakterien sehr hoch (>80% der Gram-positiven Bakterien), entsprechend einem „bislang gering untersuchten Habitat“. Von den 510 Isolaten wurden 40,4 % von BIOLOG benannt, zu 35,1% Gram-negative und nur zu 5,3 % Gram-positive Isolate. Die Anzahl der gering aktiven (i.R. 20-40% Aktivität), nicht zu identifizierenden und nicht zu bestimmenden Isolate (52%) sprach für die erfolgreiche Isolierung der „echten Umweltisolate“ mit SA. Die von den verschiedenen Systemen benannten nächst-möglichen Taxa für SAIsolate erwiesen sich häufig als wenig bzw. schlecht beschriebene Arten, die unzulänglich in den Datenbanken vertreten waren. Die Xenobiotika-selektierte Stämme entsprachen eher dem Typ des raschwüchsigen Laborstammes. Bei Aktivitäten von 40% bis >90%, waren sie grundsätzlich mit BIOLOG und FAME testbar und lieferten im Vergleich zu den SA-Isolaten klare Gruppierungen. Maximale phänotypische Bestimmbarkeit und Identifikationsraten erzielten die Gram-negativen Isolate der XenobiotikaMedien 3CB, Nap, Ant und oXy, die die meisten Xenobiotika-Isolate lieferten. Sie ergaben Identifikationen für Pseudomonas, Stenotrophomonas, Enterobakterien, Ochrobactrum und Sphingobacterium. Die Gram-positiven Stämme mittlerer Aktivität ergaben zwar klare Reaktionsmuster, entsprachen aber keinem Taxon der BIOLOG-Datenbank. Die Gram-positiven BIOLOG-Cluster mit Identifikationen (3,5%) zeigten dagegen zumeist geringe Aktivität und entsprechend geringe Differenzierbarkeit der benannten Taxa im System. Diskussion Die FAME-Analyse bestätigte diese Ergebnisse. Für die Isolate der Arthrobacter-Gruppe wurde mittels FAME ein Gattungs-ähnliches Isolat bestimmt (ähnlich der pflanzenpathogen Art A. ilicis amerikanischer Stechpalmen), zumeist aber die Gattung Aureobacterium. In diesem Zusammenhang wurde ein systematischer Fehler aufgedeckt: Die Gram-positive Art Aureobacterium esteroaromaticum konnte bei korrekter Gram-Bestimmung in der hier verwendeten BIOLOG-Version 3.50 nicht bestimmt werden, da es nach älterer Nomenklatur als Flavobacterium este-roaromaticum in der Datenbank Gram-negativer Bakterien stand. Unabhängig von der Gram-Bestim-mung, bestimmte das MIDI-MIS (FAME-Analyse) die in der Datenbank inzwischen korrekt bezeichnete, reklassifizierte Art. Die folgende Sequenzierung der Isolate bewies die bessere FAME-Identifikation der Gattung Aureobacterium, auf der anderen Seite aber auch, daß metabolische Unterschiede mit dem Verwandtschaftgrad korrelierten. Die physiologische Gruppierung entsprach verschiedenen und teilweise unbekannten Arten. Bereits Bendinger et al. [1992] verweisen darauf, daß die Fettsäureanalysetechnik die Gram-positiven Bakterien der phylogenetisch nahe verwandten Arthrobacter-Gruppe nur unzureichend differenziert. Die Fehlidentifikationen der beiden Systeme in diesem Bereich ist vor allem auf den mangelnden Kenntnisstand und unzureichenden Datenbankumfang zurückzuführen. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß ein großer Teil der Population den phänotypischen Identifikationsverfahren, trotz Anpassung des BIOLOG-Systems, nicht zugänglich war, weil die Wuchsbedingungen für die aquatischen Mikroorganismen gegeben waren. Bei 20% Aktivität (entspricht Wachstum mit 19 Kohlenstoffquellen) war hier für das unspezifische Habitat die Grenze der Differenzierbarkeit mit dem BIOLOG-System erreicht. Für die taxonomische Zuordnung der Isolate der Spittelwasser-Population reichten außerdem die „bekannten“, in den kommerziellen Datenbanken enthaltenen Arten nicht aus. Da Taxonomie, Systematik und Analytik primär human-relevanten Interessen folgen, wurden bislang vor allem human-medizinisch oder biotechnologisch als relevant erachtete Stämme mit raschem Wachstum beschrieben. Selbst die rasch-wüchsigen Xenobiotika-Isolate waren jedoch mit den kommerziellen Systemen zumeist nicht identifizierbar. Den Identifikationsdatenbanken fehlen die „natürlich“ vorkommenden Arten, sie sind daher als nicht „umweltgerecht“ zu bezeichnen. Problematik der Gram-Bestimmung Die Verwendung der Gram-Reaktion, als primäres Entscheidungskriterium für den anzuwendenden BIOLOG-Test, erwies sich als entscheidendes Problem. Bekannt ist, daß die Tendenz zur Entfärbung Gram-positiver Bakterien durch schlechte Kultivierbarkeit, nicht logarithmische Wachstumsphase und Zusammensetzung des Mediums beeinflusst wird. Zum anderen können Bakterien mit Gram-variablenVerhalten zu Fehlidentifikation führen. Allgemein gibt es Probleme bei der Gram-Bestimmung in der Arthrobacter-Gruppe, die hier die Gram-positiven Bakterien dominierten. Eine Besonderheit der Bodenbakterien dieser Gattung ist, daß sie in frischen Kulturen Gram-negative unregelmäßige Stäbchen bilden, in älteren Kulturen aber Gram-positive Kokken. Manafi & Kneifel [1990] zeigten Fehler der KOH- 4-185 4-186 Diskussion Bestimmung und der Bestimmung des Gram-Verhaltens mit fluorogenen bzw. chromogenen Substraten (z.B. Aminopeptidase-Schnelltest Bactident, der Fa. Merck Darmstadt). Sie beschrieben falsch-positive Ergebnisse für Gram-positive Stäbchen (Bacillus cereus, B. subtilis, mit Bactident außerdem auch B. circulans, B. licheniformis), schwache bis keine Reaktion im KOH-Test für Yersinia enterolytica und Y. intermedia. Auch die Problematik falscher Bestimmung der Farbreaktion im Aminopeptidase-Test bei intensiver Eigenfärbung (z.B. den auf hier bestimmten gelben Kolonien) und starker Turbidität der Bakteriensuspension wurde beschrieben. Da die FAME-Analyse keine vorherige Gram-Bestimmung erforderte, war sie in diesem Punkt gegenüber BIOLOG im Vorteil. In Folge falscher Gram-Bestimmung wurden hier Bakterien mit den falschen BIOLOG-Testplatten (GP / GN) bestimmt. Teilweise wurden sie erkennbar differenten BIOLOG-Clustern zugeordnet, korrekt nicht identifiziert und als fraglich erkannt. In mehreren Fällen bewies die FAME-Analyse dann die Zugehörigkeit zu den α-Proteobakterien (Xanthobacter). Diese Gruppe erwies sich auch in den folgenden genetischen Analysen als problematisch. Wie die physiologische Bestimmung zeigte die TGGE-Analyse eine mögliche Vermischung von Gram-positiven Stämmen und α-Proteobakterien. Ein Verzicht auf Vorsortierung nach dem Gram-Verhalten wäre für eine bessere taxonomische Zuordnung allgemein wünschenswert (Tindall [1994]). Sind die Bakterien nicht mit einem einzigen Testansatz zu beschreiben, sollte sich die notwendige Vorsortierung auf die eigentlich zu bestimmenden Parameter beziehen. Für BIOLOG wären zum Beispiel eine Vorsortierung nach dem allgemeinen Wuchsverhalten (oligotroph / prototroph) und an dieses Verhalten angepaßte metabolische Tests möglich. Dadurch wäre auch die Differenzierung der an geringere Nährstoffkonzentrationen angepaßten Bakterien zu optimieren. Qualität der Datenbanken Die falsche Vorsortierung von Aureobacterium esteroaromaticum (ehem. Flavobacterium e.) in die Gram-negative BIOLOG-Datenbank verdeutlichte ein weiteres, generelles Problem. Wie Tindall [1994] betont, fehlt allgemein die taxonomischen Kontrolle der Datenbanken durch den Anbieter. Von BIOLOG wurde ein Dendrogramm herausgegeben, in dem Sphingobacterium [CYF] und Sphingomonas [α] zusammengruppierten. Pseudomonas saccharophila wurde von FAME den β-Proteobakterien zugeordnet, gehört aber zur Sphingomonas-Gruppe. Eine Fehlerquelle sind die Stammsammlungen auf denen die Datenbanken basieren. Sie enthalten viele Stämme die unzutreffend benannt wurden und sich hinter falschen Gattungs- und Artbezeichnungen verstecken. So konnten fehlerhaften FAME-Daten auf falsche Stämme oder Kontaminanten zurückgeführt werden. In den verschiedenen ribosomalen Sequenzdatenbanken gibt es zwar keine fehlerhafte Voreinstufung, dafür existieren aber eine Vielzahl nicht gekennzeichnete Stämme, fehlerhafte Datensätze und Benennungen, häufig die fehlen die Daten der Typstämme. Gerade da die verfügbaren Datenbanken fehlerhaft sind, ist es wichtig daß der polyphasische Ansatz unter verschiedenen Aspekten aufgebaute Datenbanken vereint: Kommerzielle Identifikationssysteme Diskussion sind bemüht die „gut bekannten“, häufig auftretenden Taxa zu beschreiben. Sie sollten anhand von möglichst vielen Stämmen einer Art dessen typisches Muster und mögliche Abweichungen erfassen. Die Sequenzdatenbanken haben den Vorteil, daß sie bislang schlecht oder (kulturell) nicht beschriebene Taxa und Stämme enthalten und unabhängige Zuordnung ermöglichen. 4.4.2 Molekularbiologische Bestimmung (TGGE und Sequenzanalyse) Die nicht zufriedenstellend beschriebenen Stämme wurden mittels Nukleinsäure-Techniken molekularbiologisch charakterisiert und phylogenetisch zugeordnet. Aufgrund des Arbeits- und Zeitaufwands wurde auch hierfür ein geeignetes Verfahren zur Vorsortierung gesucht mit dem die zu analysierende Menge an Sequenzen zu reduzieren ist. Eine Vielzahl derartiger Screening-, DNA- und PCR-FingerprintMethoden werden inzwischen in Taxonomie, Molekular- und Populationsgenetik angewandt (für einen umfassenden Einblick siehe zum Beispiel Priest et al. [1994]). Die Stärke derzeitiger DNA-FingerprintTechniken liegt allerdings in der Analyse nahe verwandter Organismen (Gürtler & Anker [1994]), im Nachweis der Diversität und Verteilung bestimmter Organismen und bestimmter Fähigkeiten (Bull & Hardman [1991]). Sie wurden aber auch in speziellen, begrenzten Populationen zur Analyse der Diversität ihrer extrahierbaren Gesamt-DNA / -RNA verwendet. Relativ neu ist die Verwendung der TGGE bzw. DGGE zur Profilanalyse, die vor allem durch die Arbeiten von Muyzer eingeführt wurde (z.B. Muyzer et al. [1993], [1995], Muyzer & De Waal [1994], Wawer & Muyzer [1995], Murray et al. [1996], Nübel et al. [1996]). Ein Vergleich der Profile mit Banden von Referenzstämmen und Sequenzierung der Banden ermöglichen dabei Identifizierung spezifischer Taxa. Die Verwendung der TGGE zum Screening von Isolaten stellt in diesem Zusammenhang eine neue Anwendungsform dar. 4.4.2.1 TGGE Gesucht wurde ein Verfahren, daß eine Vorsortierung bezüglich des eigentlich zu analysierenden Merkmals, des 16S rDNA-Gens, ermöglicht. Die TGGE-Analyse kann bei entsprechender Optimierung bezüglich der ausgewählten Gen-Fragmente den gesamten Bereich von Stamm bis Reich erfassen (entsprechend Hybridisierung-, Sequenzierungsmethoden und Gensonden). Darüberhinaus kann das PCR generierte Fragment (TPCR) sequenziert werden, so daß die gesamte Information des Moleküls gegen den kompletten Hintergrund der 16S-Datenbank auszuwerten ist. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß die Amplifikation und Sequenzierung der TPCR auch für schlecht kultivierbare Stämme gelingt. Zum einen ist die Amplifikation der mit 150 Basen sehr kurzer Fragmente methodisch einfacher als die des gesamten 1,5 kB großen 16S rDNA-Gens, zum anderen ist über die angehängte GC-Klammer eine Sequenzierung mit einem hochspezifischen Primer möglich. So kann eine erste grobe genetisch-taxonomische Zuordnung erzielt werden. Alternativ könnten bei geringem Wachstum der Bakterien einzelne Kolonien aus der primären Anreicherung mittels spezieller PCR-Protokolle, TGGE und Sequenzierung 4-187 4-188 Diskussion charakterisiert werden. Arbeiten in unserem Labor legen allerdings die Vermutung nahe, daß auch hierbei Kolonien mit geringer Wachstumsgeschwindigkeit problematisch sind. Die Sequenzanalyse bot außerdem die notwendige Möglichkeit die Differenzierung taxonomischer Einheiten zu überprüfen, die mit dem gewählten Spektrum an Referenzstämmen und deren Modellierung (POLAND-Analyse) in der Optimierungsphase der TGGE nicht erfaßt wurden. So sind auch Isolate wenig beschriebener Populationen zuverlässig zu analysieren. Der „genetische Fingerabdruck“ der TGGE bestand je nach Bakteriengruppe aus einer einzelnen Bande, z.B. für Acidovorax, oder stabilen Mehrfachbandenmustern, wie z.B. für Thermoanaerobacter. Die Arbeiten von Nübel et al. [1996] bewiesen, daß Mehrfachbanden in der TGGE keine PCR-Artefakte sondern die natürliche genetische Heterogenität eines Stammes wiedergeben kann. Die Möglichkeit der Mehrfachbanden verlangt allerdings präzises Arbeiten mit Kontrollen (Negativ- und Positivkontrollen des PCR-Ansatzes, Primerkontrolle, DNA-freie Polymerase). Eine geringe Anzahl Banden stellt dagegen hohe Anforderungen an die Reproduzierbarkeit und Auswertung der Gele. Die Normalisierung der Muster anhand von Standardmustern, zur Kompensation von Diskrepanzen im und zwischen Gelen, ist einer der kritischsten Punkte der Gel-Auswertung. Die Glaubwürdigkeit der Clusteranalyse und Identifikation der Muster beruht zum großen Teil auf der Akkuranz der Normalisierungsmethode (hier: GelCompar, Fa. Applied Maths, Kortrijk-Belgien). Bei geringer Anzahl Banden und Erkennung der Einzelstrang-DNA als Hintergrundmuster ist der hier angewandte Pearson Product Moment Korrelationskoeffizient nachweislich objektivstes und glaubwürdigstes Ähnlichkeitsmaß zur Mustererkennung (Vergleich der Konturen der Kurve und nicht nur der Peaks). Nur bei höchster Übereinstimmung der in Abständen aufgebrachten Referenzproben (die ein Mehrfachbandenmuster über den Differenzierungsbereich des Geles ergaben) im Gel und zwischen Gelen, waren diese zu verwenden. Die Ausschußrate war relativ hoch, könnte aber duch eine verlängerte Laufzeit verringert werden. Die Wahl des 16S rDNA-Fragments folgte der einschlägigen Literatur (Muyzer et al [1993]). Die TGGEPCR zielte aber in diesem Fall nicht auf eine bestimmte Bakteriengruppe oder ein spezifisches funktionelles Gen, sondern eine allgemeine Differenzierung unterschiedlichster Bakteriengruppen. Dies galt es nachzuweisen, beziehungsweise die TGGE entsprechend zu optimieren. Aufgrund der spezifischen Bedingungen im Gel waren Programme zur Gensondenentwicklung für die theoretische Analyse der Spezifität des gewählten Fragmentes in den vorhandenen Sequenzdatenbanken ungeeignet. Eine Kontrolle der entsprechenden Sequenzregionen war nur unter Modellierung des Schmelzverhaltens in der TGGE möglich (POLAND-Analyse). Der Rechneraufwand hierfür beschränkte die Anwendung auf wenige Sequenzen. Zunächst wurden daher nur ausgewählte Sequenzen der physiologisch häufig nachgewiesenen, aber teilweise schwer zu differenzierenden β- bis γ-Proteobakterien auf ihre Differenzierung im Gel geprüft. Nach Optimierung der TGGE wurden mehr als 70 Referenzstämmen verschiedener phyloge-netischer Gruppen getestet und ihre Bandenmuster in der spezifischen Datenbank abgespeichert. Diskussion Sie zeigten zumeist ausreichende Differenzierung der Arten und Gattungen, auf gruppenspezifisch unterschiedlichem Niveau. Die Modellierung der problematischen Stämme mit dem POLAND-Programm ergab, daß die Sequenzunterschiede in dem verwendeten Fragment teilweise zu gering waren (z.B. keine für die Unterscheidung der β- und γ-Proteobakterien spezifische Basenfolge im Loop, d.h. keine entsprechende Sequenzsignatur Woese et al. [1985]) aber auch, daß die Trennschärfe im Gel weiter zu erhöhen ist. Die einzelnen BasenUnterschiede sollten bei optimalem Einsatz der TGGE ausreichend für eine Differenzierung sein. Diese Probleme sind darauf zurückzuführen, daß die TGGE für ein breites Spektrum an Bakterien, von α-Proteobakterien bis hoch G+C-haltigen Gram-positiven Stämmen, optimiert wurde. Dies ging auf Kosten der Differenzierbarkeit in den Gruppen. Die maximal mögliche Auflösung des Systems (Ein-BasenpaarDifferenzen im Homoduplex-Molekül, Myers et al [1987], Sheffield et al. [1989]) ist nur bei Spezialisierung auf einzelne phylogenetische Linien zu erzielen. Da es sich hier um ein neues Einsatzgebiet der TGGE handelt, blieben verschiedene Möglichkeiten zur methodischen Verbesserung offen. Zu empfehlen ist: • Eine differenzierte TGGE-Analyse nach Retention der Fragmente im Gel. Die Bakterien werden nach Banden höherer und niedrigerer Retention vorsortiert und die TGGE-Bedingungen für beide optimiert. • Eine Vorsortierung nach größeren taxonomischen Einheiten, Proteobakteriengruppen, Gram-positive oder -negative Bakterien. Dies kann durch Einsatz von Gensonden (Ogram & Sayler [1988]) erfolgen, möglich wäre auch eine Hybridisierung im Gel. • Wahl eines stärker differenzierenden, größeren Genfragmentes. Die Schwierigkeiten der Differenzierung mit dem relativ kurzen Fragment der Variablen Region III des 16S rRNA-Gens (vergleiche Tab. 3.14), veranlassten inzwischen verschiedene Anwender größere Fragmente des 3´-Endes, aus den hypervariablen Regionen V6-V9, zur Trennung in der DGGE (z.B. Muyzer et al. [1995]: E. coliPosition 341-907 = 550 bp, Ferris et al. [1996]: E. coli-Position 1055-1406 = 323bp) und TGGE zu verwenden (Nübel et al.[1996]: E.coli-Position 968 bis 1346 bzw. 1401 = 378 bzw. 433 bp). Eine im Vorfeld der Methodenentwicklung durchzuführende statistische Auswertung der genetischen Datenbanken (mit Analyse von mehr als einem Stamm pro Art) würde bei der Entwicklung von Fingerprintmethoden und Gensonden bereits viele der Anfangsfehler vermeiden helfen. Nach bisherigem Stand kann man allerdings auch dann nicht sicher sein was genau mit einer spezifisch entwickelten Sonde, in einem komplexen Habitat, detektiert wird. Populationsbeschreibung mit der TGGE Ebenso wie die physiologisch / biochemischen Methoden ergab das molekulare Screening der Isolate mit der TGGE nicht zu differenzierende Cluster für β-Proteobakterien der Rubrivivax-Gruppe, β- und γ-Pro- 4-189 4-190 Diskussion teobakterien (b+gP) sowie α-Proteobakterien und Gram-positiven Bakterien (a+GP). Erst die Sequenzierung bewies, daß zum Beispiel nur die FAME-Analyse zwei Vertreter der Rhodopseudomonas viridisUntergruppe eindeutig als α-Proteobakterien erkannte (aber fälschlich als Xanthobacter identifizierte). Die TGGE bewies außerdem die Fraglichkeit verschiedener BIOLOG-Identifikationen. Zum Beispiel wurden die mit BIOLOG als CDC IIh und -ähnlich, in zwei benachbarten Clustern bestimmten und, da im klinischen Bereich definiert, in Frage gestellten Identifikationen, in der TGGE eindeutig differenziert. Die Sequenzierung bewies letztendlich die Unzulänglichkeit der Identifikation, beziehungsweise die Unbestimmbarkeit der Bakterien im derzeit vorhandenen taxonomischen System: Sie entsprachen nicht näher zu bestimmenden Gattungen der α-Proteobakterien bzw. nicht näher zuzuordnenden Proteobakterien. Die Taxa waren stoffwechselphysiologisch und genetisch differenzierbar, aber nicht korrekt identifizierbar. Gleiches galt für die schwach aktiven Bakterien in den BIOLOG-Clustern BCl 41, G, D und H. Trotz der genannten methodischen Einschränkungen erwies sich die TGGE-Analyse als praktikable Charakterisierungsmethode, besonders für die aufgrund geringen Wachstums physiologisch nicht-testbaren Isolate. Die TGGE bewies die Diversität dieser Isolate. Auffällig war die Gruppierung mit physiologisch bestimmbaren Isolaten, die stammspezifische Unterschiede im Wuchsverhalten und genetisch-phänotypische Variabilität der Arten implizierten. Durch die Sequenzanalyse bestätigte sich die Verteilung auf die verschiedenen Phyla, Gattungen und Arten. Die Isolierung „neuer“ taxonomischer Einheiten, daß heißt nicht-zuzuordnender Arten, war eindeutig. 4.4.2.2 16S rDNA-Sequenzierung Die 16S rDNA-Sequenzanalyse bietet die Möglichkeit einer methodisch möglichst „objektiven“ Zuordnung im phylogenetischen Kontext. Allerdings war auch hier die Wahrscheinlichkeit entsprechende Stämme und Arten in den Datenbanken zu finden relativ gering, da diese zumeist auf kultivierbaren, humanrelevanten Stämmen oder Stämmen sehr spezifischer Habitate basieren. Die hier analysierten Sequenzen kommen in diesem Sinne zumindest dem Aufbau mehr umweltgerechter Sequenz-Datenbanken zu Gute und bieten wie gesagt, anhand der Isolate „kultivierbare“ Hintergrundinformationen. Eine erste Sequenzierung partieller TPCR ermöglicht bereits eine rasche Zuordnung zu den höheren taxonomischen Einheiten, bzw. deren Hauptlinien und ist für die erste Zuordnung unbekannter Bakterien mit geringer Kultivierbarkeit zu empfehlen. Die partielle Sequenzanalyse bezüglich des gesamten PCRamplifizierten 16S rDNA-Gens konnte primär den Datenbankbereich für die weitere Analyse einschränken und fragliche Bestimmungen prüfen. Eine vollständige Sequenzanalyse erfolgte insbesondere für die Pseudomonas und Acidovorax, da für diese Gattungen umfangreiche Sequenzinformationen vorlagen, die einen Vergleich auf Stammebene ermöglichten. Bei der Sequenzanalyse sind jedoch einige methodische Einschränkungen zu berücksichtigen: • Eine in der Sequenzanalyse gängige Maßnahme ist die Eliminierung fraglicher Position aus dem Vergleichsalgorithmus, die die Artidentifikation beeinflussen könnten. Derartige „Ambigous Positions“ Diskussion sind zum Beispiel verfahrensbedingte Überlagerung von G- und C-, oder A- und T-Peaks (bekannt für Sequenzierung Taq-amplifizierter PCR mit dem ABI Cycle-Sequenzer). Bei geringer Häufigkeit sind sie für die Gattungs-zuordnung mit der 16S rDNA in der Regel nicht entscheidend. Diese „Ambigous Positions“ könnten aber auch mögliche Genheterogenitäten wiedergeben (vergleiche z.B. Nübel et al. [1996], Mehrfachbanden von Bacillus polymixa in der TGGE) und sollten daher nicht einfach ignoriert, sondern als innerartliche Varianz akzeptiert werden. Hier wurden sie durch entsprechende Gewichtung fraglicher Basen (z.B. „A oder T“ je 0.5) einbezogen. • Die Sequenzierung der 16S rDNA erfolgte vom 5´Ende her. Zum einen ermöglicht dies den Vergleich mit den meisten bisher in den Datenbanken enthaltenen Sequenzen (Stackebrandt & Rainey [1995]). Zum anderen sind die Sequenzen des 5´Endes variabler als die des 3´Endes und daher besser zur Differenzierung nahe verwandter Arten geeignet. Die Sequenzanalyse erfolgte hier unter Einbeziehung hypervariabler Regionen. Kurze Sequenzen, wie die der TPCR, sind aufgrund der geringen Länge (nur 135 bis 160 bp zwischen den Primern) grundsätzlich vollständig zu analysieren, da sonst der Informationsgehalt zu gering ist. Bei größeren partiellen oder kompletten Sequenzen kann so eine Differenzierung entsprechend dem Niveau der Identifikationsverfahren (BIOLOG, FAME) erzielt werden, z.B. Unterscheidung von Acidovorax spec. auf Art- oder Stamm-Niveau. • In der vorgelegten Studie wurden vergleichend Bäume kompletter Sequenzen mit Gewichtung und partieller Sequenzen ohne Gewichtung berechnet. Dadurch konnte den unterschiedlichen Sequenzlängen und den Grenzen zwischenartlicher Phylogenie bei der Zuordnung und Benennung der nächstverwandten Taxa eines Isolats Rechnung getragen werden. Bei Analyse der Sequenzen mit hypervariablen Regionen wird aber zugunsten der Trennschärfe auf die „phylogenetische“ Korrektheit der Bäume („absolute“ Positionierung der Zweige) verzichtet. Auch Bäume mit Teilsequenzen können nur begrenzt die genetische Ordnung, bzw. die angenommene intraspezifische Phylogenie aufzeigen (Stackebrandt & Rainey [1995]). Die Einbeziehung der hypervariablen Regionen war notwendig, da die taxonomische Auflösung der 16S rDNA relativ gering ist (Fox et al. [1992]). Nach Stackebrandt & Goebel [1994] gehören in der Regel erst Organismen mit mehr als 97% Ähnlichkeit der 16S rRNA zu einer Art. Vergleichende Studien von Amann et al.[1995] belegen sogar, daß 50% Paarung in der DNA-DNA-Hybidisierung typischerweise nur mit etwa 99% 16S rRNA Similarity korrespondieren, wobei die einzig bislang verbindliche Artdefinition mindestens 70% Homologie in der DNA-DNA-Hybridisierung verlangt (Wayne et al. [1987]). Die sequentielle Art-Differenzierung anhand des kompletten 16S rDNA-Moleküls erfolgte hier auf dem ≥98% Niveau. Methodisch betrachtet, ist eine Differenzierung anhand von weniger als 2% der vorhandenen Information, das entspricht 30 Basen der 11,5 Kb großen Sequenz, nicht effektiv. Ist die Gattung z.B. mittels BIOLOG bestimmt, würde die Sequenzierung der „entscheidenden“ 30 Positionen der 16S rDNA zur Artbestimmung ausreichen. Der Einsatz von Gensonden bezüglich der spezifischen Signaturen, die Verwendung partieller Sequenzen mit hochvariablen Regionen hoher Diskriminierungs- 4-191 4-192 Diskussion kraft oder wie hier, TGGE-Differenzierung dieser Fragmente, nutzen in diesem Sinne die vorhandenen Unterschiede besser aus und ermöglichen wesentlich rascher die allgemein geforderte genetische Charakterisierung. In phylogenetischen Studien und bei der Analyse der Taxa oberhalb des GattungsNiveaus werden jedoch bevorzugt gewichtete Sequenzen, ohne hochvariable Sequenzregionen analysiert (z.B. mittels „Eubakterienmaske“ eliminiert, Lane [1991]). Sie liefern bei Analyse des kompletten 16S rDNA-Gens konsistentere Ergebnisse im Sinne von stabileren, besser reproduzierbaren Bäumen. Ein wesentlicher Grund hierfür ist, daß das Alignmentverfahren nicht standardisiert ist und besonders in hypervariablen Regionen, auch unter Berücksichtung der Sekundärstruktur, unterschiedlich ausgeführt werden kann. Ein objektives Alignment von Daten entfernt verwandter Taxa oder in hypervariablen Regionen ist somit derzeit nicht möglich (Stackebrandt & Ludwig [1994]). Auch die hier vorgelegten Analysen beziehen sich dem zu Folge auf ein „Anwender-spezifisches Alignment“. In der Literatur sind entsprechend häufig übereinstimmende Baumtopographien auf gleiche Arbeitsgruppen beschränkt (Tindall [1994]). Im Rahmen der vorgelegten Arbeit wurde es grundsätzlich vermieden, die Sequenzierung als „Identifizierung“ zu bezeichnen. Zum einen ist eine Übereinstimmung der 16S rDNA-Sequenzen von Umweltisolaten mit bekannten Sequenzen aufgrund des mangelhaften Umfangs der Datenbanken bisher selten zu erzielen. Wie Amann et al.[1995] betonen, repräsentieren die Stämme in den 16S rRNA-Datenbanken nicht die natürlich vorkommende Diversität der Mikroorganismen, sondern zumeist Stämme mikrobieller Sammlungen, die etwa 25% der gültig beschriebenen Arten umfassen. Außerdem aber sind in der Regel nur einzelne Stämme einer Art enthalten, häufig wurde kein Typstamm oder weitere Referenzstämme einer Stammsammlung sequenziert. Da die genetische Variabilität selbst innerhalb der bekannten Arten weitgehend unbekannt ist, kann daher nur die Identität mit den sequenzierten Stämmen und nicht mit der Art nachgewiesen werden. Derartige Stammidentität wurde hier nur zwischen Isolaten und einzelnen klonierten Sequenzen von Mau [1997] nachgewiesen, daß heißt nur für Sequenzen des selben Habitats. Populationsbeschreibung mit der 16S rDNA-Sequenzierung Die 16S rDNA ermöglichte nur in wenigen Fällen Bestimmung bis auf Artniveau, ein bedeutender Anteil der Stämme war auch auf Gattungsniveau nicht zu benennen. In verschiedenen Bereichen der Proteobakterien, die hier überwiegend analysiert wurden und relativ umfangreich in der Datenbank vertreten sind, fehlten nahe verwandte Arten. Einzelne isolierte Acidovorax Stämme zeigten höhere Übereinstimmung mit aus gleicher Probe klonierter Sequenz (Mau [1997]) als mit den bislang kultivierten und den in unserer Arbeitsgruppe recht umfassend sequenzierten Arten dieser β-Proteobakterien-Gattung. Für physiologisch nicht-bestimmbare Bakterien fehlten selbst nächste Gattungen. Es bestätigte sich eine große Anzahl bislang nicht näher beschriebener Stämme. Allerdings war die Häufigkeitsverteilung der Proteobakterien innerhalb physiologisch charakterisierbarer und nicht-bestimmbarer Stämme etwa gleich: Die wenigen Gram-positiven Isolate wurden überwiegend der Arthrobacter-Gruppe zugeordnet, unter den Gram-nega- Diskussion tiven Isolaten dominierte die Rubrivivax gelatinosus-Gruppe (β-Proteobakterien). Die Bestimmung einer Vielzahl von α-Proteobakterien, überwiegend aus der Rhizobium-Agrobacterium-Gruppe, war spezifisch für gering aktive, nicht oder falsch identifizierte Bakterien. Isolate die nicht mit BIOLOG oder FAME zu bestimmen waren, waren nach den Ergebnissen der Sequenzierung vielfach mit Taxa verwandt die in den kommerziellen Identifikationsdatenbanken durchaus enthalten sind und auch bestimmt wurden. Zum Beispiel wurden die Gattungen Agrobacterium, Methylobacterium-Ähnliche [α-], Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella-Ähnliche [γ-], Acidovorax, Comamonas [β-], Xanthomonas, Stenotrophomonas [β/γ-Proteobakterien] sowie Flavobacterium [CYF] sowohl phänetisch als auch genetisch bestimmt. Da sich die hier nur genetisch beschriebenen „Wildstämme“ sich von testbaren „Laborstämmen“ anscheinend primär nur durch den schlechten Wuchs auf den Komplexmedien unterschieden, könnten möglicherweise durch intensive Vorkultur FAME-, bzw. BIOLOG-testbare Laborvarianten selektioniert werden. Boivin-Jahns et al. [1995] wiesen nach, daß die phänotypische Bestimmung von Wildstämmen eines Aquifers nach längerer Laborkultur häufig glaubwürdigere Ergebnisse lieferte. Als Konsequenz der Abhängigkeit phänotypische Bestimmungen von der Dauer der Haltung empfahlen sie die genetische Analyse „frischer“ Isolate. Dies gilt insbesondere für oligocarbophile Stämme mit geringer Aktivität unter Laborbedingungen. Die FAME-Identifikationen erwiesen sich zumeist auf Gattungs- bis Artniveau als korrekt. Dies wurde bei Vergleich mit dem BIOLOG-System unter anderem auf die Einschränkung des Anwendungsbereichs zurückgeführt. Die BIOLOG-Identifikationen wurden in der Regel nicht bestätigt, allerdings war die Identifikationsgüte durch die Anpassung der Testbedingungen herabgesetzt und die Sequenzanalyse beschränkte sich auf fragliche Bestimmungen. Die genetische Analyse erwies sich auch unter diesen Bedingungen zumeist als kongruent mit der metabolischen Charakterisierung: Wurden von BIOLOG Stämme mit gleicher Benennung (korrekt oder falsch identifiziert) verschiedenen Clustern zugeordnet, wies die Sequenzanalyse unterschiedlichen Verwandtschaftsgrad, verschiedene Stämmen einer Art oder verschiedene Arten, nach (siehe z.B. „CDC IIh“). Bei eindeutiger mikrobiologischer Bestimmung mit den Identifikationssystemen wurde die Gattungsbestimmung mittels Sequenz bestätigt, aber nicht unbedingt die Artbestimmmung (z.B. Aureobacterium nach FAME, Pseudomonas i.e.S. nach BIOLOG). Dies ist zumindest teilweise auf die Begrenzung der 16S Datenbank auf einzelne Referenzstämme pro Art zurückzuführen. Die Divergenz der sequenzierten Pseudomonaden von den bekannten Arten dieser umfangreich analysierten Gruppe (Kersters et al. [1996], Moore et al. [1996]) betonte die Unzulänglichkeit bisheriger Bestimmungsmethoden im Umweltbereich. Konsequent wurden die hier neu isolierten und sequenzierten Pseudomonaden von Tesar et al. [1996] zur Entwicklung einer immunochemischen Identifikationsmethode für diese Gattung („Westprinting“) verwendet. Typisch sind die hier aufgetretenen Schwierigkeiten der phänotypischen Bestimmung von Acidovorax, die primär nur genetisch beschrieben wurden. Die isolierten Acidovorax-Stämme waren metabolisch sehr heterogen und fanden sich sowohl unter den phänotypisch nicht testbaren Bakterien, als auch in verschie- 4-193 4-194 Diskussion denen BIOLOG-Clustern und waren meist falsch bestimmt. Die physiologische Vielfalt entsprach aber weitgehend der genetischen Variabilität innerhalb der Gattung. Die verschiedenen, zum Teil wahrscheinlich neuen Arten zeigten unterschiedliches Wachstum auf den Komplexmedien und unterschiedliche metabolische Fähigkeiten. Es bleibt zu untersuchen, inwieweit dies der genetischen Variabilität der Arten entspricht, unterschiedlicher Adaptibilität und spezifischen Anpaßungsmechanismen oder auch „nur“ zufälligen Mutationen, Verlust von Plasmid-codierter Information oder Springen von Transposons (vergl. Resistenzverhalten Austin [1988], Grimes et al. [1993], Blot et al. [1994], Stevens et al. [1993]). Vergleich mit dem Klonierungsansatz von Mau [1997] Die Sequenzierung der Isolate ermöglichte den unmittelbaren Vergleich mit der aus gleicher Probe extrahierten DNA. Bei wesentlich größerem Stichprobenumfang zeichnete die Isolierung ein detaillierteres Bild der aeroben Populationen als die Klonierung (138 SA-Isolate / 45 Klone). Beide Methoden zeigten die β-Proteobakterien zahlenmäßig deutlich stärker repräsentiert und wesentlich diverser als die anderen phylogenetischen Gruppen. Nur im Isolierungsansatz waren auch α-Proteobakterien häufig. Sicherlich ist die Repräsentativität der Stichproben ist in beiden Fällen nicht gegeben und bei der gegebenen Heterogenität des Habitats, ist die abweichende Schätzung der Abundanzen vor Ort (basierend auf einem Sedimentkern mit ∅ 7,5 cm) möglicherweise zufällig. Unmittelbare Schlußfolgerung ist jedoch die selektive Anreicherung spezifischer Gruppen mit Sedimentextrakt. Die Diskussion zur „Selektivität der Kulturbedingungen“ ist allgemein bekannt und bedarf keiner weiteren Erläuterungen. Neuere Studien weisen aber auch komplexe mehodische Probleme der direkten Nukleinsäureanalyse nach die, ebenso wie Kultivierungsansätze, zu einem verzerrten Bild der betrachteten Bakteriengemeinschaft führen. In Analogie zur Kultivierung sind folgende „selektive“ Faktoren zu nennen, die die Aussagekraft des Klonierungsansatzes (als Kultur-unabhängige Methode) einschränken: • Die Lyse Gram-positiver Zellen ist deutlich schwerer zu bewerkstelligen als die von Gram-negativen, d.h. die DNA-Extraktion ist selektiv. • Die Anzahl Primer-Bindungsstellen und die Primer-Bindungseffizienz, somit die PCR-Amplifikationsrate, ist für einzelne Bakteriengruppen unterschiedlich. Die PCR-Quantifizierung (anhand einer mit-amplifizierten Menge Standard-DNA) wird bei exponentieller Reaktion durch den Plateau-Effekt, ungleiche Primerbindungseffizienz und variabler Cykluseffizienz beeinflußt. • Bei der Empfindlichkeit der Nachweismethoden werden die aus absterbenden Zellen freigesetzten Verbindungen (freie DNA) mitbestimmt. • Die Kopienzahl der rrn-Operons ist bei Bakterien mit erhöhter Wachstumsrate größer. Die Anzahl rasch wüchsiger Bakterien, beziehungsweise der Bakterien mit größerer Anpassungsfähigkeit, wird wahrscheinlich überschätzt (Ellwood & Nomura [1982], LaFauci et al. [1986]). In der Praxis erwies sich hier die Sequenzanalyse für α-Proteobakterien als schwieriger als für β- oder Diskussion γ-Proteobakterien. Die Sequenzen der Gesamt-PCR waren qualitativ schlecht im Vergleich zur TPCR, vielfach nur über die kurzen TPCR-Fragmente generierbar. Dies bedingt möglicherweise eine negative Selektion im Klonierungsansatz. Es ist zu vermuten, daß für diese Bakteriengruppe spezifische Protokolle bezüglich PCR und Sequenzierung, spezifische Primer, möglicherweise auch der DNA-Extraktion zu entwickeln sind. Chromosomale DNA und RNA sind strukturelle Merkmale und sollten daher weitestgehend von Wachstum und Kultur unabhängig sein. Gelingt (irgendwie) die Extraktion aus einer Umweltprobe, Flüssigoder Festkultur beliebigen Alters und beliebiger Wachstumsphase, kann mittels PCR ein Gen oder Genfragmente hochamplifiziert und dessen Sequenz bestimmt werden. Theoretisch sollte lediglich die Konzentration variieren, praktisch beeinflußt aber unzureichendes Wachstum nachweislich Quantität und Qualität der DNA-Präparate und die PCR-Amplifikation. Vermutlich nimmt die Anzahl geernteter Zellen und die DNA-Extraktionseffizienz mit der erhöhten Inkubationsdauer ab. Die Akkumulation von Exopolysacchariden, Salzkonzentration und weiteren unbekannten Substanzen (zum Beispiel bei längerfristiger Flüssigkultur mit Sedimentextrakt) sowie die eingesetzte DNA-Menge beeinflußen Zelllyse und Amplifikationsreaktion (Coutinho et al. [1993]). Als unmittelbare Schlußfolgerung ergibt sich, daß die rasch wüchsigen Bakterien allgemein überproportional bestimmt werden: Sie werden häufiger kultiviert15, bei der rDNA direkt Bestimmung stärker hochamplifiziert16 und auch ihre metabolische Aktivität überchätzt17. Einzelne Bakteriengruppen werden in molekularbiologischen Direktanalysen womöglich ebenso unterschätzt, wie in der kulturellen Analyse raschwüchsiger Bakterien mit Komplexmedien. Die Anreicherung mit SA gibt womöglich am besten die natürlichen Verhältnisse wieder. - Eine rein spekulative Behauptung, die bei bisherigem Kenntnisstand provokativ zu verstehen ist. Der positive oder negative Nachweis wäre zum Beispiel durch die Entwicklung spezifischer Gensonden und in situ-Hybridisierung zu erbringen. Anhand der Isolate stehen unterschiedliche Targets zur Verfügung, können DNA-Extraktions-, PCR-, Sequenzierungs- und Hybridisierungsprotokolle spezifisch angepaßt werden, sind in vitro mikroskopische Kontrollen möglich. Zur in situ-Quantifizierung ist der gleichzeitige Nachweis der dominant bestimmten Gattung Acidovorax zu empfehlen. 15 Standardmäßige Bestimmung auf Komplexmedien (Dott [1980], Reichardt [1978]). 16 Die Operonzahl hängt von Wachstums- und Anpassungsfähigkeit ab: Es wurden 7 bzw. 10 Operons für Escherichia coli (Kiss et al. [1977]) und Bacillus subtilis (Bott et al. [1984]) bestimmt, nur eines für langsam wachsende Mycoplasma (Amikam et al [1984]) und Bradyrhizobium (Kündig et al [1995]). 17 rRNA-Bestimmung (DeLong et al. [1989]). Der rRNA-Gehalt korreliert mit der Wachstumsphase, außerdem ist die max. Anzahl Ribosomen innerhalb der Taxa unterschiedlich (Kemp et al. [1993]). 4-195 4-196 Diskussion Divergenz phänetischer Identifikation und genetischer Zuordnung Schwierigkeiten der Klassifikation und systematischen Zuordnung einzelner Taxa im polyphasischen Ansatz konnten auf mangelhafte Bestimmung (z.B. falsche Gram-Bestimmung der α-Proteobakterien), unzureichenden Umfang der Datenbanken und unzureichende Umsetzung neuerer taxonomischer Erkenntnisse in die Bestimmungspraxis zurückgeführt werden. Für Taxa wie Arthrobacter und Acidovorax, die erst in den letzten Jahren anhand der genetischen Information neu definiert wurden, ist die Ursache fehlerhafter phänotypischer Bestimmung in der bislang mangelhaften phänotypischen Beschreibung zu sehen (vergl. Balows et al. [1992]). Der Vergleich der verschiedenen Methoden zur Charakterisierung und Identifikation der Bakterien ergab Methoden- und Taxon-spezifische Divergenzen phänotypischer und genetischer Zuordnung. Diese Divergenz phänotypisch-numerischer und genetischer Bestimmung ist ein bekanntes Problem. Der Literaturvergleich zeigte, daß die taxonomische Bestimmung außerdem Habitat-spezifisch ist. Dies wird beim Vergleich mit der Studie von Boivin-Jahns et al. [1995] deutlich. Beim Vergleich genetischer und konventioneller Identifikation frisch isolierter Bodenbakterien erwiesen sich die konventionellen Identifikationen zu 45-66% korrekt, d.h. sie entsprachen der von BIOLOG für Umweltisolate angegeben Effizienz. Die Taxa, für die phänotypische Identifikationen und Zuordnung durch die 16S rDNA divergierten, entsprachen weitgehend denen der vorgelegten Arbeit: • Ebenso wie hier erwiesen sich Gram-positiv identifizierte Isolate genetisch als α-Proteobakterien (Clavibacter, Rhizobium / Agrobacterium-Ähnlich) oder auch β-Proteobakterien (Alcaligenes). Offensichtlich versagte die Gram-Bestimmung, vor allem bei Stämmen mit geringem Wachstum. In der vorgelegten Arbeit zeigte auch das genetische Screening mit der TGGE Differenzierungsprobleme zwischen Gram-positiven Taxa und α-Proteobakterien. • Im Gegensatz zur vorgestellten Arbeit erwiesen sich unter den Bodenbakterien Identifikationen für Bacillus und Staphylococcus als konsistent. Diese Rolle übernahm im Spittelwassersediment Aureobacterium, von denen viele Stämme BIOLOG-typisch falsch als Arcanobacterium identifiziert worden waren (von FAME zumeist korrekte Gattung bestimmt). In beiden Studien gab es Probleme bei der phänotypischen Bestimmung der hoch G+C-haltigen Gram-positiven Bakterien der ArthrobacterGruppe. • Habitat-spezifisch erwiesen sich phänotypisch als Moraxella, Acinetobacter, Paracoccus, Staphylococcus und ähnlich bestimmte Bodenbakterien in der Arbeit von Boivin-Jahns et al. [1995] häufig als Alcaligenes, während in der vorgelegten Arbeit derartig fragliche Bestimmungen genetisch der hier dominanten Gattung Acidovorax zugeordnet wurden. Ursächlich ist primär die mangelnde Kultivierbarkeit und Testaktivität. Die Aktivität im BIOLOG-System wurde in der vorgelegten Arbeit entsprechend als Maß für die Glaubwürdigkeit der Identifikationen herangezogen. Diskussion Die Bestimmung Acinetobacter- und Moraxella-ähnlicher Taxa ist eine bekannte Schwachstelle physiologischer Methoden im Umweltbereich. Die Benennung der Gattungsgruppe Acinetobacter-Moraxella erfolgte bis dato erstmalig von Fabig & Ottow [1979] für eine dominant aus einer Modell-Kläranlage isolierten Gruppe von Denitrifikanten. Sie charakterisierte Gram-variable, kokkoide bis stäbchenfömige Denitrifikanten, die sich von den beiden namengebenden Gattungen durch Penicillinresistenz und Beweglichkeit unterschied. Fabig & Ottow [1979] empfahlen zur taxonomischen Einordnung der Umweltorganismen eine Erweiterung der bestehenden Gattungsdemarkationen oder Konzipierung einer neuen taxonomischen Gruppe. Die numerisch taxonomische Beschreibungen aquatischer und terrestrischer Biotope der 80er Jahre enthielten im Folgenden vielfach „Acinetobacter-Moraxella“ bezeichnete Gruppen (Schmider & Ottow [1981], Schmider [1985], Feidieker et al. [1994], Kölbel-Boelke et al. [1988]), soweit nicht die „unmöglichen“ Moraxella18 aus der Datenbank ausgeschlossen wurden (Kämpfer [1988]). Die Bestimmung dieser Gattungen im Grundwasser wurde zum Beispiel in Hinblick auf die Verbreitung opportunistisch pathogener Arten in Trinkwasseraufbereitungsanlagen diskutiert (Stetzenbach et al [1986]). Der Status der Arbeitsbezeichnung für die BIOLOG-Bestimmung innerhalb des umfangreichen BCl 41 wurde hier betont. Die Identifikationen „Acinetobacter-ähnlich“, „AcinetobacterMoraxella“ und „Moraxella“ beschrieben oligocarbophile, physiologisch zu differenzierende Stämme in diesem Cluster. Die polyphasische Analyse charakterisierte eine Ansammlung diverser β/γ- und γ-Proteobakterien, überwiegend aber β-Proteobakterien (Stenotrophomonas-, Pseudomonas stutzeri-ähnliche, Acinetobacter, Thauera-ähnliche, häufig Acidovorax bzw. -ähnliche). Von BIOLOG als Moraxella, M. bovis und M. atlantae identifizierte Isolate wurden genetisch als Acidovorax oder auch Stenotrophomonas-ähnlich beschrieben. Ein metabolisch nicht zu beschreibendes Isolat wurde auch genetisch der Gattungsgruppe Acinetobacter-Moraxella zugeordnet. In der Studie von Boivin-Jahns et al. [1995] waren von 20 Moraxella-ähnlich bestimmten Isolaten genetisch 4 Moraxella und Acinetobacter [γ] 14 als Alcaligenes [β] identifiziert worden. Nach diesen Ergebnissen handelt es sich bei „Moraxella“ nur in wenigen Fällen um γ-Proteobakterien der Gattungsgruppe Acinetobacter-Moraxella. Mehr als die Hälfte sind β-Proteobakterien, habitatspezifisch entsprechen sie der Gattung Alcaligenes (Boden) oder Acidovorax (Sediment). 4.4.3 Belastungsspezifisches Charakterisierung der Spittelwasserpopulation Das Ziel dieser Arbeit war nicht nur die taxonomische Beschreibung der isolierbaren, aeroben Population des Spittelwassersedimentes, sondern auch die Beschreibung der Anpassung der Population an die Belastungssituation. Wie zur schadstoffspezifischen Analyse des biologischen Selbstreinigungspotentials bei 18 als asaccharolytisch und chemoorganotroph in Assoziation mit Schleimhäuten beschrieben 4-197 4-198 Diskussion Grundwasser- und Bodensanierung wurden hier Xenobiotika19-Minimalmedien verwendet (Hanert et al. [1990], Kiyohara et al. [1992]). Diese Medien fanden in drei Bereichen Anwendung. Die Ergebnisse werden hier kurz zusammengefaßt um die Unterschiede dieser Anwendungen noch einmal hervorzuheben: 1. Das Screening der Proben auf den Xenobiotika-Minimalmedien lieferte eine Aussage über die Anpassung der Standortflora an die Belastungssituation (siehe Kap. 4.2). Den wechselnden Konditionen im Spittelwasser entsprach die Selektivität der Mikroorganismen gegenüber den ausgewählten Substanzen. Die Koloniezahlen auf den Xenobiotika-Medien könnten, standardmäßig angewandt, als empfindliches Indikatorsystem der Belastung dienen. Das Wuchsverhaltens korrelierte mit erheblicher Konzentration an Chlorbenzolen, Naphthalin, Biphenyl, Anthracen und ihrer Derivate im Sediment und leichtflüchtiger Aromaten (Toluol, Ethylbenzol, m- / p-Xylol, o-Xylol) im Wasser. 2. Die Anreicherung und Isolierung von Xenobiotika-Isolaten ausgewählter Medien des ScreeningTests ermöglichte eine Charakterisierung der Xenobiotika-spezifischen Taxa des Spittelwassersedimentes. Die phänotypische Charakterisierung zeigte homogene Gruppen und geringe taxonomische Diversität (4CS, 24D: 2-3 identifizierte Taxa für 10-17 Isolate; 3CB, Ant, Nap, oXy: 7-9 Taxa für 36-91 Isolate). Auf 3CB dominierten Stenotrophomonas maltophilia und Comamonas testosteroni, auf oXy S. maltophilia und Flavobacterium johnsonae und auf Anthracen Pseudomonaden (P. azelaica / nitroreducens, P. fluorescens / corrugata, P. marginalis). Auf Naphthalin dominierte C. testosteroni, aber auch S. maltophilia, P. azelaica / nitroreducens und Alcaligenes faecalis waren häufig. Der Anteil Gram-positiver Bakterien war mit etwa einem Drittel hoch (Ausnahme: Anthracen nur 16%). Zumeist wurden die Stämme nicht-identifiziert, wenn, erwiesen sie sich zumeist als hoch G+Chaltige Bakterien (v.a. Aureobacterium). 3. Das Screening der isolierten SA-(Gesamt-)Population auf den Xenobiotika-Medien ermöglichte die allgemeine Bestimmung der Toleranz und Vergleich mit den Xenobiotika-Isolaten. Die SA-Population war auch in ihrer Toleranz divers. Bei ausreichender Anzahl Stämme pro taxonomischer Einheit ließen sich Art- und Gattungsspezifische Unterschiede nachweisen. Von den 15 Gruppen mit mindestens drei Vertretern waren die Acinetobacter (jonsonii)-Isolate einheitlich tolerant gegenüber allen getesteten Xenobiotika, Comamonas spec. und 5 nicht bestimmte Gram-negative Isolate einheitlich nicht tolerant. Die wenigen hoch G+C-haltigen SA-Stämme (4 Isolate) zeigten wie die Xenobiotika-Isolate gute Toleranz, ebenso die meisten Gattungsgruppen der α-Proteobakterien. Die zahlreichen β- und γ-Proteobakterien zeigten innnerhalb der Gattungsgruppen stark variables Verhalten (z.B. 19 Aliphate: 4ChlorSalicylsäure, 5ChlorSalicylsäure (4CS, 5CS), 1 Ring: Ethylbenzol, Toluol, o-, m-, p- Xylol, 3Chlorbenzoat, 2,4Dichlorphenoxyessigsäure (Etb, Tol, oXy, mXy, pXy, 3CB, 24D), 2-3 Ringe: Biphenyl, Naphthalin, β-Hydroxy-Naphthalin, Anthracen (Bip, Nap, βHN, Ant). Diskussion Comamonas spec., Acidovorax (facilis), Acinetobacter (lwoffii), Acinetobacter / Moraxella, Pseudomonas). In den folgenden Abschnitten wird die Taxonspezifität des Xenobiotika-Wachstums unter Vergleich des Xenobiotika-Sreenings der SA-Isolate (Punkt 3) mit der spezifischen Anreicherung von Xenobiotika-Isolaten (Punkt 2) diskutiert. Der Einsatz des Screening-Verfahren (Punkt 1) wurde bereits im ersten Teil der Diskussion (siehe Kapitel 4.2) vorgestellt. Xenobiotika-Testverfahren Im Rahmen dieser Diskussion ist zu bedenken, daß der Abbau der Verbindungen hier nicht konkret nachgewiesen wurde (z.B. durch GC-Analysen in Flüssigkultur, siehe z.B. Populationsanalysen und Reinkulturstudien von Kämpfer et al. [1988]). Nach Anreicherung und mehrfachem Überimpfen auf den Medien ist der Abbau der Substanzen durch die Xenobiotika-Isolate als wahrscheinlich anzunehmen. Die SA-Isolate die auf den Xenobiotika-Medien Kolonien bilden, können dagegen bei einmaliger Inkubation lediglich „tolerante Hungerkünstler“ sein. Ihr Wachstum auf reinem Minimalmedium unterstützte diese Annahme. Durch mehrfaches Überimpfen oder vorhergehendes „Aushungern“ der nicht selektiv gehaltenen Stämme wäre dagegen Wachstum mit Reservestoffen von vorneherin ausgeschlossen gewesen, so kennzeichnete das Wuchsverhalten bei geringen Kohlenstoffspuren im Medium gleichzeitig die Toleranz gegenüber den Testbedingungen. Auch die Möglichkeit des Verlusts Plasmid-codierter Fähigkeit in Folge nicht-selektiver Stammhaltung auf Komplexmedien ist zu betonen (Hardman et al. [1986]). Vor dem Screening wäre daher eigentlich Selektion und Adaptation, bei biotechnologischer Anwendung gegebenenfalls auch „Aktivierung“ durch Plasmid-haltige Stämme notwendig (Focht [1988]), das heißt mittels Plasmidtransfer. Ein wesentlicher Kritikpunkt des Verfahrens sind auch die extremen Bedingungen unter denen der Test stattfindet. Für die Isolate entspricht die Bestimmung des Xenobiotika-Nutzungsverhaltens gleichzeitig einem „Streß“-Test: • Das natürlicherweise weitgefächerte Wuchstoffspektrum (C-, N-Quellen, Vitamine etc.) fehlt. • Es herrscht extremer Mangel an leicht verwertbaren Kohlenstoffquellen, dafür gibt es hohe Konzentrationen „fremder“ oder auch toxischer Substanzen. • Die Kulturbedingungen sind für aquatische Bakterien extrem trocken. Die Bedeutung von Konsortien für das primäre Wachstum unter diesen Bedingungen wurde bei der Isolierung von Mischkolonien von den Xenobiotikamedien deutlich (siehe Kap.4.2, Rekultivierbarkeit). Das Wachstum auf oXy wurde wahrscheinlich häufig durch Kometabolismus ermöglicht. Bei gleicher Anfangskoloniezahl konnte dagegen nach längerer Inkubation von 5CS keine einzige Kolonie isoliert werden. Fehlen von Wachstumsfaktoren und anfängliches Wachstum mit Reservestoffen sind ursächlich zu nennen. Andererseits führte längere Inkubation der primär nicht bewachsenen Medien 4CS und 24D 4-199 4-200 Diskussion zur Selektion von 9 bzw. 17 Stämmen. Van der Meer [1992] fand bei Exposition von Chlorbenzoaten eine meßbare Biodegradation durch die mikrobielle Gemeinschaft im Boden erst nach einer Stunden bis Monate dauernden Phase. Diskutiert werden in diesem Zusammenhang molekulare Mechanismen der Adaptation wie interspezifischer Plasmidtransfer, Genexpression und Gene analoger Funktion. Van der Meer [1992] betonte den hohen Forschungsbedarf für diesen Bereich. Die nachweislich höherer Effizienz aerober und anaerober Konsortien beim Abbau aromatischer Substanzen (Pettigrew et al. [1990]) sollte nicht nur in der Umweltbiotechnologie (Field et al. [1995]) sondern auch in der diesbezüglichen Populationsökologie verstärkt berücksichtigt werden. In Hinblick hierauf ist eine Modifizierung der Testbedingungen zu erwägen, so daß sie mehr den in situ Bedingungen entsprechen (Flüssigkultur, Mischkultur, Komplexmedium). Im Rahmen derartiger Analysen ist allerdings die konkrete Messung der Xenobiotika-Konzentration (oder indirekte Bestimmung der Zunahme von Produkten) erforderlich. Auch die Bestimmung der hemmenden Xenobiotika-Konzentrationen, beziehungsweise der Xenobiotika-Resistenz der Stämme, Arten und Gattungen erfordert weitergehende Untersuchungen. Ein derartig umfangreiches Testprogramm kann im Rahmen einer Populationsstudie jedoch nicht bewältigt werden, sondern erfordert Reihenanalysen im Labor. Taxonspezifität Die hier durchgeführten Tests wiesen nach, daß ein breites Spektrum an Bakterien des Spittelwassersedimentes potentiell Xenobiotika-tolerant oder nutzend ist. Die Isolierung mit SA ergab Stämme mit teilweise hoher Toleranz gegenüber den Xenobiotika, die nicht in der direkten Xenobiotika-Anreicherung erfasst wurden. Umgekehrt wurden die mit den Xenobiotika-Minimalmedien isolierten Stämme in der Regel nicht mit SA isoliert. Im Vergleich zu den SA-Stämmen sind sie anscheinend extreme Spezialisten mit geringem Anteil an der Gesamtpopulation. Aus der Beobachtung, daß die Xenobiotika-Isolate grundsätzlich gute metabolische Aktivität aufwiesen, ergab sich die Annahme, daß eine Korrelation der Aktivität der SA-Isolate mit deren Wachstum auf den Xenobiotika-Medien besteht. Dies ließ sich aber nicht schlüssig belegen. Zwar ließen sich Gruppen mit im BIOLOG-Test sehr schwach aktiven und nicht auf den Xenobiotika wachsenden SA-Isolaten (z.B. Moraxella-ähnliche), Gruppen mit grundsätzlich mäßig bis stark aktiven Xenobiotika-nutzenden Isolaten (z.B. Stenotrophomonas) gegenüberstellen. Die wenigen, metabolisch relativ schwach aktiven Acinetobacter-Isolate waren aber alle sehr tolerant. Die Toleranz der SA-Isolate konnte nicht eindeutig bestimmten Arten oder Gattungen zugeschrieben werden, da die Sensibilität der Stämme gegenüber den Xenobiotika und die Anzahl Stämme pro taxonomischer Einheit sehr verschieden war. Nur Gruppen mit wenigen Stämmen, z.B. die drei Acinetobacter (johnsonii) Isolate, zeigten gleiches Verhalten. Gruppen die in größerem Umfang isoliert wurden, z.B. Acidovorax, zeigten bereits auf Artebene kein homogenes Verhalten, sondern wiesen Stämme mit geringer bis starker Toleranz auf. Um den Sachverhalt objektiv zu beschreiben, wurde die Anzahl der Xenobiotika-Medien auf denen die SA-Isolate wuchsen als Merkmal der taxonomischen Gruppen betrachtet Diskussion und statistisch analysiert. Wenn überhaupt, wuchsen die Isolate in der Regel auf 8-10 Medien. Gattungsund Artgruppen mit mindestens 5 Isolaten waren bezüglich der Anzahl Xenobiotika-Medien auf denen sie wuchsen, signifikant verschieden (Agrobacterium, Alcaligenes / Bordetella, Comamonas und ähnliche Stämme, Acidovorax, Xyllela-, Xanthomonas-Ähnliche, Acinetobacter, Pseudomonas). Zwischen höheren taxonomischen Einheiten (Untergruppen, Gruppen) waren keine Unterschiede nachzuweisen. Ob die beobachteten Unterschiede lediglich die Stamm-spezifische Variation widergeben, oder ob sie wirklich art- und gattungstypisch sind, war aufgrund der hohen Diversität der Population und dadurch bedingter geringer Anzahl genetisch oder physiologisch gleicher Stämme, nicht zu analysieren. Die taxonomische Bestimmung konnte die Frage der Verteilung des Abbauverhaltens innerhalb der Taxa nicht beantworten. Die einfache Relation „Abbau in Taxon A: ja, Taxon B: nein“ galt, wie gesagt, nur innerhalb von Taxa die nur mit einzelnen Stämmen vertreten waren. Das vorhandene Datenmaterial führt zu der Hypothese, daß die Fähigkeit mit zu Xenobiotika zu wachsen nicht grundsätzlich für jeden Stamm einer Gruppe gleich stark ausgeprägt ist, sondern innerhalb der Gruppen (Arten, Gattungen) einer spezifischen Verteilung folgt. Die Variationsbreite der Taxa kann sehr verschieden sein. Entsprechend wird es taxonomische Gruppen geben, deren Stämme mit größerer Wahrscheinlichkeit Xenobiotika-spezifisch angereichert werden. Mit SA sollte, unter Annahme der belastungsspezifischen Zusammensetzung des Mediums und entsprechend großem Stichprobenumfang, diese Verteilung näherungsweise zu erfassen sein. Mit den Xenobiotika-Medien wird dagegen nur ein sehr begrenzter Ausschnitt dieser Grundgesamtheit beschrieben. Aus einer Sammlung degradierender Stämme kann daher keine generelle Aussage über die Verteilung der Fähigkeit innerhalb des Taxons abgeleitet werden. Es bleibt weiterhin offen, inwieweit physiologische Eigenschaften bzw. Variabilitäten taxonspezifisch sind. Um die taxonspezifischen Zusammenhänge zu beschreiben, könnten zum Beispiel zufällig ausgewählte Stämme jeder taxonomischer Einheit einem Toleranztest unterworfen werden. Dabei ist Herkunft, Anreicherung und Dauer der Laborhaltung in einer multivariaten Teststatistik zu berücksichtigen (siehe z.B. Marinell [1977], Rosswall & Kvillner [1978]). Das Xenobiotika-Spektrum sollte spezifisch nach Löslichkeit, Anzahl der Ringe und Chlorsubstitutenten zusammengestellt werden. Für ein derartiges Testprogramm sollte Rücksprache mit Fachleuten aus Biodegradation und Biometrie gehalten werden. Wichtig ist auch in diesem Forschungsbereich die Analyse der genetischen Variationsbreite einer Art sowie der Wahrscheinlichkeiten des Gentransfers innerhalb und zwischen den Taxa eines Genpools (zum Beispiel für die Freisetzung genetisch manipulierter Mikroorganismen). Zum Verständnis des Selbstreinigungspotentials, der Stoffkreisläufe und der Populationsökologie allgemein, ist die Populationsgenetik von entscheidender Bedeutung. In vitro Studien an Isolaten helfen das aut- und synökologische Verhalten zu analysieren und populationsbiologische Hypothesen zu validieren. Mit molekularen Methoden kann die Taxonspezifität und Verbreitung bakterieller Fähigkeiten in situ untersucht werden. Für große Mengen Isolate, große Stichprobenumfänge, sind aber bisherige molekularbiologische Verfahren (z.B. Plasmidtransfertest, Screening auf spezifische Gene) nur schlecht handhabbar oder unmöglich. 4-201 4-202 Diskussion 4.5 Die Struktur der Spittelwasserpopulation im Vergleich mit der Literatur Separate Gemeinschaften werden in der Ökologie oft über die „Diversität“ verglichen (siehe z.B. Streit [1980]). Ein bakterieller Diversitätsindex kann jedoch bislang kaum etwas aussagen, denn dazu ist die Anzahl der Individuen aller Arten oder einer trophischen Gruppe und die relative Abundanz der Arten im Habitat zu bestimmen (Kinkel et al [1992]). Aufgrund der Identifikationsgrenzen und Zählprobleme ist maximal eine Schätzung der Stammdiversität möglich. Bei der Unstimmigkeit des mikrobiellen Artenkonzeptes müßten Indizes taxonomischer oder phylogentischer Diversität den unterschiedlichen Rang der detektierten Taxa berücksichtigen (O´Donnell et al. [1994]). Alternativ werden anhand der Clusteranalyse numerischer Charakteristika (z.B. BIOLOG) Phäne gleichen Niveaus bestimmt und verglichen, oder die mittlere taxonomische Distanz aller Isolate als Diversitätsindex verwendet (Watve & Gangal [1996]). Die Aussagekraft dieser Indices bleibt aber begrenzt, so daß man sich gegebenenfalls auf den restriktiven Vergleich des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Art oder den Vergleich der „Arten“-Anzahl (Arten-Reichtum) zwischen Gemeinschaften beschränkt. Diesem Konzept folgte auch der hier durchgeführte Vergleich mit Literaturdaten. Die in Tab. 4.1 aus einer Reihe von Studien beispielhaft zusammengetragen Informationen zu Fähigkeiten verschiedener Taxa verdeutlichen die häufig starke Verallgemeinerung der Aussagen durch Angabe des Gattungsniveaus. Nach den neueren Revisionen der Bakteriensystematik20 sind gerade die häufig genannten Gattungen (z.B. Bacillus, Pseudomonas, Corynebacterium und Actinomyceten) allgemeinen Sammelgruppen gleichzusetzen. Bei dem Vergleich mit anderen Populationsstudien sind grundsätzlich die unterschiedlichen Methoden der Identifikation und Isolation zu beachten. Soweit in älterer Literatur phänotypische Verfahren angewandt wurden, sind sie unter Vorbehalt mit den BIOLOG- und FAMEAnalysen zu vergleichen und nur indirekt auf die genetischen Gruppen zu übertragen. Vergleichbare Studien finden sich in verschiedenen Bereichen der Literatur. Erste umfassende Beschreibungen mikrobieller Populationen wurden zum Beispiel für bestimmte physiologische Gruppen mit Einführung der MPN-Methodik erhoben. Das Vorkommen von Nitrifizierern, Denitrifikanten, Desulfurikanten, Methanbildner und Knallgasbakterien wurden mit der heterotrophen Flora der Komplexmedien verglichen ( Schink [1989], Wilson et al. [1983], Bone & Balkwill [1988], Ghiorse & Balkwill [1981], Dott et al. [1980-1988], Kölbel-Boelke et al. [1988], Stetzenbach et al. [1986]). Vom Umfang her mit vorliegender Arbeit vergleichbare Populationsstudien findet man mit Einführung numerischer, automatisierter Identifikationsmethoden. 20 Beispiel: Genetische Umstrukturierung von Bacillus in Alicyclobacillus, Paenibacillus, Brevibacillus; von Clostridium in Eubacterium, Syntrophospora, Paenibacillus, Caloramator, Sporohalobacter, Oxobacter, Oxalophagus, Moorella, Thermoanaerobacter, Filifactor, Thermoanaerobacterium. Diskussion Tab. 4.25 Vorkommen und Bedeutung der Bakterien in Abhängigkeit vom Eutrophierungsgrad Taxon Vorkommen & Bedeutung Literatur filamentöse Bakterien (Sphaerotilus natans, Beggiatoa) Actinomyceten polysaprobe Gewässer: häufig Higgins & Burns [1975] Cellulomonas, Corynebacterium, Cytophaga Streptomyces, Achromobacter, Cytophaga, Bacillus, Pseudomonas Micrococcus, Bacillus, Pseudomonas Bacillus, Pseudomonas Selbstreinigungsstrecke: häufig, Abbau von Kohlenhydraten Zelluloseabbau Hemizelluloseabbau Proteinabbau Pektin-, aerober Fettabbau Arthrobacter Balows [1992] Boden und ähnlichen Habitate (Sedimente, Abwasser, Belebtschlamm): dominant, nutzen diverses Spektrum org. Substrate (Aromaten), bedeutende Rolle im Mineralisationszyklus Rhodococcus (R. erythropolis), Micrococcus, Pseudomonas Wasserkörper: autochthon, Kohlewasserstoffabbau, Xenobiotika oxidierend Berdichevskaya et al. [1992] Alcaligenes, Pseudomonas, Acinetobacter Streptokokken, Enterobakterien Acinetobacter, coryneforme Keime Isar: dominant bei Abwassereinleitung: dominant nach 5 Km: wieder verstärkt Seiler & Busse [1978] Pseudomonas, Alcaligenes vielfach beschrieben, Degradierer umweltgefährdender Chemikalien Reinheimer [1991] Pseudomonaden stark organisch belastete Fließgewässer: dominant Schönborn [1992] Pseudomonas stutzeri,Achromobacter Higgins & Burns [1975] Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens leichte organische Belastung: dominant, Indikator aquatischer Bereich: allgemein häufig Pseudomonas stutzeri ersetzt bei Belastung P. fluorescens Schmider [1985] Aeromonas organische Belastung: typischer Zeiger Farmer et. al [1992] Aeromonas hydrophila ssp. anaerogena, A. punctata ssp. caviae polysaprobe Flüsse: typisch (anaerogene Formen) Schönborn [1992] Aeromonas hydrophila, A. caviae, A. sobria Fließgewässer mit komm. Abwasser: in größeren Mengen Farmer et. al [1992] Aeromonas caviae Fließgewässer mit komm. Abwasser: vorherrschend Ramteke et al. [1993] Citrobacter freundii, Escherichia coli Zeiger fäkaler Verunreinigung Balows [1992] Rhodococcus luteus, R. maris Öl-verschmutzter Fluß: Indikatorarten, halotolerant Berdichevskaya et al. [1992] In den 70er Jahren erfolgte erstmalig eine systematische Untersuchung der Belebtschlammflora unter Einbeziehung taxonomischer Methoden (z.B. Seiler [1973]). Sie zeigte den Einfluß der Abwasserbehandlung auf die Zusammensetzung der Populationen und Nutzen und die Notwendigkeit taxonomisch fundierter Florenanalysen. Aufgrund der zunehmenden Eutrophierung der Gewässer mit Nitrat wurde intensiv die Verbreitung der Denitrifikanten zur Optimierung von Kläranlagen untersucht (Davies & Toerin [1971], Gamble et al. [1977], Fabig & Ottow [1979], Sommer & Ottow [1985], Benckiser [1980], Schmider [1985]). Da die fakultativ anaerobe Fähigkeit der Denitrifikation taxonomisch weit verbreitet und die Selbstreinigungsstrecke eines Fließgewässers prinzipiell mit der biologischen Kläranlage ver- 4-203 4-204 Diskussion gleichbar ist (Klee [1991]), können die aerob isolierten Bakterien dieser Arbeit mit entprechende Florenanalysen verglichen werden (Tab. 4.2, 4.3). Die Mikroorganismen im Belebungsbecken sind vielen Umweltchemikalien, auch toxischen Kohlenwasserstoffverbindungen, ausgesetzt. Sie werden auch, stellvertretend für autochthone Populationen, zur vergleichenden Untersuchung mikrobiologischer Sanierungsansätze kohlenwasserstoffbelasteter Milieus herangezogen (Kämpfer et al. [1988]). Der Vergleich mit kommunalen Kläranlagen wird der Einleitung industrieller Abwässer die in die Spittelwasser allerdings nicht gerecht. Industrielles Rohabwasser entpricht mit seiner konzentrierten organischen und mineralischen Schmutzmenge einer Altlast mit gehemmtem biologischem Selbstreinigungspotential. Etwa ab Mitte der 80er Jahre findet man Studien zur Altlastensanierung, für Boden und Grundwasser „belasteter Standorte“ (Tab. 4.29). In der Regel interessiert allerdings lediglich das Vorkommen oder im Vergleich zum unbelasteten Standort erhöhte Vorkommen der Xenobiotika-spezifisch zu isolierenden Arten oder Stämme (z.B. Hanert et al. [1990], Kiyohara et al. [1992]). 4.5.1 Vergleich mit Umweltbiotopen Die allgemein für aquatische Habitate „typisch“ beschriebenen Arten wurden in der mit SA bestimmten Gesamtpopulation kaum nachgewiesen. Der Anteil mit Sedimentextrakt isolierter Gram-positiver Bakterien war gering. Die von Reinheimer [1991] für den Kreislauf der Stoffe bedeutend angegebenen Gattungen Arthrobacter, Rhodococcus, Corynebacterium, Cellulomonas und Nocardia, oder die von Gamble et al. [1977], Schönborn [1992], Schmider [1985] und Schmider & Ottow [1981] häufig genannten Bacillen (Tab. 4.25, Tab. 4.26) sind mit Sedimentextrakt, Xenobiotika-Medien und auch im Klonierungsansatz von Mau [1997] nicht in entsprechendem Ausmaß bestimmt worden. Dabei wurde bereits berücksichtigt, daß viele der genannten Taxa nach heutiger Definition unterschiedliche Gattungen vereinen oder falsch bestimmt wurden. Zum Beispiel wird Arthrobacter in allen bodenähnlichen Habitaten dominant genannt und immer wieder die bedeutende Rolle im Mineralisationszyklus betont (nutzen ein weites, diverses Spektrum an organischen Substraten als einzige C- und Energiequelle). Die Universalität der Arthrobacter-Bestimmungen in älteren Studien ist allerdings aufgrund rein morphologischer Bestimmung anzuzweifeln, nach Balows et al. [1992] handelt es sich stattdessen häufig um Rhodococcus rhodochrous. Aber auch wenn man die bei der Interpretation der BIOLOG- und FAME-Daten vorgeschlagene Arthrobacter-Gruppen-Identifikation akzeptiert, war für diese mit Xenobiotika umfangreich bestimmte Gruppe keine Dominanz nachzuweisen, denn mit Sedimentextrakt waren sie nicht nicht isolierbar, in diesem Sinne nicht bestandbildend. Entsprechend dem von Campbell [1980] angebenen Anteil von 80-95% Gram-negativen Bakterien im Plankton, war das Spektrum an identifizierten Gram-negativen Taxa umfangreich und bot entsprechend größere Vergleichsmöglichkeiten (Tab. 4.25). Die heute von Achromobacter unterschiedenen Alcaligenes und Acinetobacter wurden nur in relativ geringen Zahlen bestimmt. Unter Berücksichtigung der neueren Taxonomie wurde die Gruppe der ehemaligen Pseudomonaden (Pseudomonas i.w.S.) mit Aci- Diskussion dovorax, Comamonas, Brevundimonas, Sphingomonas, Burkholderia, Xanthomonas, Stenotrophomonas und ähnlichen Stämmen im Spittelwassersediment umfangreich beschrieben. Bei SA-Isolierung dominant waren die β-Proteobakterien (vor allem der Rubrivivax-rRNA-Untergruppe: Acidovorax, Variovorax, Comamonas, Hydrogenophaga und -ähnliche, einige Alcaligenes aus der Bordetella-rRNA-Untergruppe). Diese Stämme entsprechen aber nicht dem in älteren Studien (phänotypisch) bestimmten „anspruchslosen“, universellen, unter Laborbedingungen raschwüchsigen „Pseudomonas“-Typ. Derartige γ-Proteobakterien wurden in der Xenobiotika-Anreicherung (Pseudomonas aeruginosa-, P. fluorescens-rRNA-Zweig), aber nur für ein SA-Isolat (Pseudomonas stutzeri-ähnlich) bestimmt. Nach Higgins & Burns [1975] sollten zumindest die beiden ersten Arten im aquatischen Bereich relativ häufig sein. Tab. 4.26 Denitrifikanten in Böden und Gewässern unterschiedlicher Eutrophie (MPN-Analysen Schmider & Ottow [1981], Schmider [1985]) Denitrifikanten Vorkommen Enterobacteriaceae (Enterobacter, Serratia liquefaciens), fluoreszierende Pseudomonaden (P. fluorescens) Acinetobacter-Moraxella*, Hyphomicrobium, Pseudomonas, Bacillus (B. cereus, B. licheniformis) Acinetobacter-Moraxella* Serratia liquefaciens Aeromonas-Vibrio Enterobacteriaceae, Pseudomonas, AcinetobacterMoraxella* / Aeromonas-Vibrio, Alcaligenes (A. denitrificans) P. fluorescens / P. stutzeri (P. aeruginosa) Aeromonas hydrophila Bacillus häufigste Denitrifikanten an oligotrophen Standorten (23-30%), in Sediment und fließender Welle verantwortlich für Denitrifikation in Böden, Gewässern (Sedim., fließ. Welle), oligo- bis eutrophe Standorte nur in oligotrophen Gewässern nennenswert (max. 11%) typisch im oligo- bis mesotrophen Sedim., fließ. Welle typisch im meso- bis eutrophen Sedim., fließ. Welle Sedimente von Stillgewässern mit zunehmender organischer und anorganischer (NH3, PO4) Belastung: abnehmend / zunehmend bei stärkerer Verschmutzung: abnehmend / zunehmend Belastungsindikator fließ. Welle (kaum im Sediment) allg. hoher Anteil Sporenbildner (23%), max. am mesotrophen Standort (44%) oligotrophe Sedimente und Böden meso- bis eutrophe Sedimente und Böden Bacillus cereus Bacillus licheniformis Legende: * genetische Analysen dieser Arbeit und Boivin-Jahns et al [1995] weisen habitatspezifisch auf die Taxa Acidovorax und Alcaligenes (Sediment / Boden) hin Vertreter der allgemein häufigen, für kommunale Abwässer belastungstypischen Enterobacteriaceae (z.B. Schönborn [1992]) wurden nur vereinzelt mit Xenobiotika selektioniert (BCl 13-15), ein Aeromonas caviae-Isolat mit SA. Indikatoren für fäkale Verunreinigung wurden trotz Einleitung kommunaler Abwässer in die Spittelwasser nicht nachgewiesen, auch nicht in der Klonierung von Mau [1997] (z.B. Escherichia coli oder anaerogene Aeromonaden). Schmider [1985] wies allerdings nach, daß die denitrifizierenden Aeromonas hydrophila zwar bei Belastung aus der fließenden Welle, aber kaum aus Sedimenten zu isolieren ist (Tab. 4.26). Dies könnte bedeuten, daß die Belastungsindikatoren vor Ort längerfristig nicht überlebensfähig sind. Auch die in Boden und Gewässer weitverbreiteten Arten Proteus vul- 4-205 4-206 Diskussion garis und Enterobacter aerogenes (z.B. Balows [1992]) wurden nicht bestimmt. Die Identifikation ergab keine humanpathogenen oder opportunistisch pathogenen Arten, aber nach BIOLOG Shewanella putrefaciens, Enterobacter taylorae und Klebsiella-ähnliche Isolate21. Die für Flußwasser beschriebenen Arten S. marcescens und S. liquefaciens / grimesii (Balows et al. [1992]) wurden hier nur mit Anthracen und Naphthalin isoliert (BCl 15). Serratia ist bekannt für Wachstum mit Aromaten, S. marcescens kann darüberhinaus organisches Eisen mineralisieren (Eisenocker in großen Mengen in der Spittelwasser). Ein Nachweis der in polysaproben Gewässern häufigen filamentösen Bakterien (Higgins & Burns [1975]) wurde für das Spittelwasser nicht erbracht. Bei niedrigem Wasserstand war zwar ein fädiger Aufwuchs im Flußbett sichtbar, die Probenahme erfaßte aber nur die ufernahe Schlammzone. Das Vorherrschen der definierten „Acinetobacter-Moraxella“-Gruppe spricht, verglichen mit dem Anteil BIOLOG-bestimmter Pseudomonaden (P. aeruginosa-Zweig), Alcaligenes, Enterobacter, Aeromonas und Serratia, für eine Gewässertypisierung als maximal „mesotroph“ (vergleiche Tab. 4.25, Tab. 4.26). Aus dem Vergleich mit Gewässern unterschiedlicher Trophie kann hier allerdings keine gültige Klassifizierung abgeleitet werden, da nicht kommunale Abwässer die Hauptbelastung bilden, sondern industrielle Abwässer mit hohem Anteil an Xenobiotika. Der starke Einfluß persistenter, toxischer Verbindungen (hier charakterisitisch: Tetrabutylzinn, Quecksilber) wird in diesem System nicht berücksichtigt. 4.5.2 Vergleich mit Bakterien der Abwasseraufreinigung Das verwendete Datenmaterial bezieht sich auf die Aufreinigung kommunaler Abwässer in Belebtschlammanlagen. Da die Populationszusammensetzung von der Abwasserbehandlung abhängig ist (Seiler & Busse [1978]) wurden Studien zu speziellen biologischen Anlagen (Rohmann [1988]), z. B. der von Schmider [1985] durchgeführte Vergleich mit einer Tropfkörper-Anlage, nicht berücksichtigt. Der Einfluß des Substratangebots auf die Mikroflora wird in der Kläranlage auf die Art und Menge der Wasserstoffdonatoren im Abwasser zurückgeführt (Schmider [1985]). Bei hinlänglicher taxonomischer und physikochemischer Beschreibung können Populationsanalysen biologischer Kläranlagen wesentlich zum Verständnis mikrobieller Ökologie beitragen: Zum einen sind die zur (Selbst-)Reinigung notwendigen Prozeßschritte linear und räumlich getrennt ana-lysierbar, zum anderen können die Populationen in dem vereinfachten artifiziellen Habitat bei bestimmter Belastung beziehungsweise Zudosierung erforscht werden. Davies & Toerien [1971] wiesen nach, daß der Anteil denitrifizierender Enterobacteriaceae mit der Zugabe vergärbarer Kohlenhydrate steigt. Alcaligenes und Acinetobacter konnten bei Zugabe von 21 Die meisten Klebsiella, einige Enterobacter, Serratia und Salmonella-Stämme sondern eine Polysac- caridkapsel ab die als Kohlenstoffquelle wiederverwendet werden kann, so daß es zu „falsch positiven Reaktionen“ in Tests und der Kontrolle kommt. Die vom Hersteller empfohlene Verdünnung der Zellsuspension und Auswertung nach 4-6h Inkubation ermöglichte hier in keinem Fall eine Identifikation. Diskussion Malat vermehrt isoliert werden. Der geringe Anteil dieser Gattungen an den Isolaten läßt vermuten, daß dartige Kohlenstoffquellen den Populationen des Spittelwassersedimentes nur in vergleichsweise geringen Mengen zur Verfügung standen. Interessanterweise fanden Sommer & Ottow [1985] eine Anreicherung von denitrifizierenden Pseudomonas, Cellulomonas sowie Acinetobacter-Moraxella mit Cellulose als einzigem H-Donator und nach Fabig & Ottow [1979] und Benckiser [1989] werden auch unter semianaeroben Bedingungen mit Nitrat und relativ persistenten organischen Verbindungen (z.B. Xenobiotika), neben Pseudomonas und Alcaligenes, vorwiegend Acinetobacter-Moraxella bestimmt. Berücksichtigt man die neuere Nomenklatur, entsprechen diese Taxa wahrscheinlich der „Acinetobacter-Moraxella“-Gruppe (nach der genetischen Ana-lyse handelt es sich hierbei v.a. um Acidovorax, z.T. Stenotrophomonas-ähnliche) und weiteren ehemaligen Pseudomonaden (Acidovorax, Comamonas, Stenotrophomonas, Brevundimonas u.a.) der Spittelwasseranalyse. Das Vorkommen in Kläranlagen und Umwelthabitaten erscheint jedoch widersprüchlich: Diese Gruppen, insbesondere Acinetobacter-Moraxella, werden allgemein als „oligocarbophil und stoffwechselarm“ charakterisiert. Sie werden zwar mit verantwortlich für die Denitrifikation in Böden und Gewässern (Sediment, fließende Welle) oligo- bis eutropher Standorte genannt, ihre Anzahl sollte aber mit zunehmender organischer und anorganischer (Ammonium, Phosphat) Belastung abnehmen (Tab. 4.26). In einem Vorklärbecken mit kohlenhydratund proteinreichem kommunalen Abwasser dominieren aber Acinetobacter-Moraxella die Population (Schmider [1985], Schmider & Ottow [1981]). Verschiedene Erklärungen sind hier möglich: Zum einen fehlerhafte Bestimmung oder Taxonomie, das heißt Beschreibung verschiedener Taxa verschiedener Standorte unter gleichem Namen oder fehlende Differenzierung unterschiedlicher Arten. Zum anderen unzureichende Charakterisierung des bakteriellen Verhaltens in der Umwelt, das heißt die komplexen Zusammenhänge (Zusammenhang physikochemischer und biologischer Parameter, z.B. Temperatur und Umsetzungsrate, komplexes Nährstofffangebot, unterschiedliche Konzentrationen, Verhalten mikrobieller Konsortien etc.) wurden bislang nicht erkannt. Das Vorkommen in der Kläranlage ist in diesem Punkt als weiteres Merkmal von nutzen. Für den Populationsvergleich wurden in Tab. 4.27 die Taxa die in den verschiedenen Stufen der Abwasseraufreinigung nachgewiesen wurden zusammengestellt. In Übereinstimmung mit der bestimmten Spittelwasserpopulation ist der Gehalt an Gram-positiven Bakterien allgemein niedrig, Gram-negative Bakterien dominieren. Entsprechend wenige denitrifizierende Pseudomonaden, Enterobacteriaceae und Bacillen wurden von Schmider [1985] mit MPN-Methode nachgewiesen. Der bereits angesprochene hohe Anteil Acinetobacter-Moraxella zeigt ähnliche Verhältnisse im Spittelwassersediment wie zu Beginn der Aufreinigung. Für Alcaligenes, Aeromonas-Vibrio oder Empedobacter, P. aeruginosa und Hyphomicrobium herrschen in der Kläranlage bessere Bedingungen (Nährstoffe, Temperatur oder O2Gehalt?). Kämpfer [1988] beschrieb mit einem BIOLOG-analogem System eine mit der Spittelwasseranalyse vergleichbar hohe Diversität in Belebtschlammproben. Er unterschied 75 Arten für insgesamt 588 Isolate (im Schnitt 7,8 Isolate pro Art), etwa ein Drittel der Identifikationen wurde nur für einzelne Isolate bestimmt (192 R2A-, 396 NA-Isolate). 4-207 4-208 Diskussion Tab. 4.27 Bakterien in der biologischen Kläranlage Taxon Vorkommen Literatur Pseudomonas*, Zoogloea, Achromobacter*, Flavobacterium*, Nocardia*, Bdellovibrio, Mycobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter Sphaerotilus, Nocardia, Beggiatoa, Thiotrix, Leucothrix, Geotrichum Flocken bildend bei sehr geringer NKonzentration im Abwasser Gram-negative Organismen: Alcaligenes, Achromobacter*, Pseudomonas*, Enterobacteriaceae dominant im Belebtschlamm kommunaler Abwässer Seiler & Busse [1978] überwiegend Gram-negative Organismen: Pseudomonas*, Alcaligenes, Cytophaga, Cellulomonas, Flavobacterium*, Enterobacteriaceae; auch coryneforme Keime (Schaumbildung v.a. durch Nocardia amarae) Zoogloea Micrococcus, Bacillus, Brevibacterium, fadenförmige Bakterien (Sphaerotilus natans, Haliscomenobacter hydrossis, Nocardia limicola, Microthrix parviscella, Flexibacter, Microscilla, Flavobacterium) Hyphomicrobium typische Besiedler der Belebungsbecken in biologischen Kläranlagen aus der Literaturanalyse von Schmider [1985] Denitrifikanten (MPN-Analyse) 1: Bacillus (B. licheniformis, B. cereus), Alcaligenes (A. denitrificans), Empedobacter-ähnliche Enterobacteriaceae (Enterobacter) Acinetobacter-Moraxella4 Pseudomonas (P. stutzeri) Aeromonas-Vibrio (A. hydrophila, V. anguillarum) zumeist im Belebtschlamm Higgins & Burns [1975] Belebtschlammflocke: hoher Anteil nachgewiesen mit Methanol als einziger C-Quelle Schmider [1985] relativ häufig (7-24% ), E. nur im Denitrifikations-, Nachklärbecken nur im Vorklärbecken (4%) Zulauf, Vorklärb.: dominant (30%) maximal (29%) in Belebungsbecken Denitrifikationsb.: dominant (38%) Gram-positive Bakterien: v.a. Bacillus (B. cereus), allgemein wenig im Belebtschlamm Coryneforme, Nocardioforme Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous z.T. in größeren Mengen dominant in Belebtschlamm Gram-negative Bakterien: am häufigsten fakultativ anaerobe Aeromonaden (34% der Isolate, Aeromonas hydrophila > A. sobria) zumeist häufig (7-8% der Isolate) Pseudomonaden (P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes3, P. stutzeri), Acinetobacter (A. calcoaceticus, A. lwofii) Empedobacter (E. breve, E. odoratum), Brevundimonas regelmäßig bestimmt (B. diminuta, B. vesicularis), Alcaligenes (A. faecalis / odorans) Comamonas (C. acidovorans), Shewanella putrefavielfach bestimmt ciens, Sphingomonas paucimobilis, Stenotrophomonas maltophilia Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella einige Isolate Kämpfer [1988]2 Legende: * 1 2 3 4 nach heutiger Systematik taxonomische Zuordnung fraglich Anzahl Isolate: Zulauf, Vorklärbecken 21-25, Belebungs-, Denitrifikations-, Nachklärbecken 38-45 Substrattest mit automatisch numerischer Identifikation, vermutlich keine Acinetobacter-Moraxella, sondern nur Acinetobacter-Bestimmung, da Datenbank auf aquatische Bakterien abgestimmt Anzahl Isolate: R2A 192, NA 396 aus verschiedenen Belebtschlammproben nach derzeitiger Taxonomie Acidovorax konjaci, A. avenae ? nach Analysen dieser Arbeit, Studie von Boivin-Jahns et al [1995] wahrschl. Acidovorax oder Alcaligenes Diskussion Die BIOLOG-Bestimmung ergab hier für 226 bestimmbare Isolate 51 Arten (im Schnitt 4,4 Isolate pro Art) und einen etwa gleich hohen Anteil einmaliger Identifikationen22. Dem BIOLOG-Bild der Spittelwasser entsprechen die von Kämpfer regelmäßig aus dem Belebtschlamm isolierten Brevundimonas und Alcaligenes, die vielfach bestimmten Comamonas, Shewanella putrefaciens und Stenotrophomonas maltophilia und in geringer Anzahl vertretene Enterobacteriaceae. Im Gegensatz zum Spittelwassersediment waren fakultativ anaerobe Aeromonaden die häufigste Gattung, waren Pseudomonas und Acinetobacter in den meisten Proben häufig, wurden regelmäßig Empedobacter und Sphingomonas paucimobilis bestimmt (nach neuerer Nomenklatur). Die BIOLOG-Bestimmung ergab für die SA-Population keine eindeutig dominanten Arten, sondern nur für die Xenobiotika-Anreicherung (ehemal. Cytophaga, Brevundimonas, CDC-Gruppen, Stenotrophomonas, Pseudomonas, Comamonas, Alcaligenes, hoch G+C-haltige Gram-positive Arten). Zusammenfassend läßt sich sagen, daß verschiedene in biologischen Kläranlagen dominante Taxa nachgewiesen wurden (Higgins & Burns [1975], Schmider & Ottow [1981], Schmider [1985], Kämpfer [1988]), diese waren im Spittelwassersediment aber nicht bestandsbildend. Eindeutig dominante Taxa waren in der entsprechenden biochemischen Analyse der SA-Isolate nicht zu bestimmen. Allgemein deutlich höher als in den Kläranlagen war der Anteil phänotypisch bestimmbarer β-Proteobakterien (v.a. Acidovorax). Die genetische Analyse bestimmte die Dominanz der phänotypisch nicht korrekt zu identifizierenden Rubrivivax-Gruppe. Die Klonierungsdaten von Mau [1997] zeigten zusätzlich geringe Ähnlichkeit der anaeroben Floren von Belebtschlamm und Spittelwassersediment: Mit Desulfovibrio und Clostridium sind zwar in der Klonierung typische Bakterien der 1. Stufe anaeroben Abbaus in Kläranlagen nachgewiesen worden, weitere für den anaeroben Abbau typische Arten (Staphylococcus, Corynebacterium, Peptococcus anaerobus, Bifidobacterium, Lactobacillus, Actinomyces, Escherichia coli) oder auch chemolithotrophe Arten (z.B. Nitrosomonas, Nitrobacter) fehlen jedoch (vergl. Higgins & Burns [1975]). Die Unterschiede lassen sich auf die Art der Belastung zurückführen: Im Belebtschlamm biologischer Kläranlagen kann sich bei kontinuierlicher Zufuhr eine bestimmte mikrobielle Gemeinschaft etablieren. Die beschriebenen Kläranlagen, beziehungsweise Belebtschalmm-Populationen sind charakteristisch für die Belastung mit kommunalen Abwässern, ebenso wie die in Tab. 4.25 - Tab. 4.26 beschriebenen Gesellschaften eutropher Gewässer. Die Fließgewässern inhärenten Störungen und spezielle industriellen Belastung der Spittelwasser (Hochwasser / Abwasserchargen) bewirken eine abweichende, spezifische Populationszusammensetzung. 22 Zusätzlich wurden hier auch nicht zu identifizierende oder nicht testbare Isolate bestimmt, diese machten mehr als 60% der insgesamt 201 SA-und 319 Xenobiotika-Isolate aus. Solche Stämme werden für Kläranlagen allgemein nicht näher beschrieben 4-209 4-210 Diskussion 4.5.3 Vorkommen Xenobiotika-degradierender Bakterien Soweit man nicht biotechnologisch anzuwendende Stämme professionell identifizieren läßt (z.B. durch Einsenden an Stammsammlungen wie DSMZ), wird die Identifikation im Forschungsbereich der Biodegradation häufig nebensächlich behandelt und hinkt dem heutigen Stand der Populationsanalysen oft hinterher. So findet sich zum Beispiel ein Benzoat-nutzender Stamm, von dem man „ursprünglich annahm, daß es sich um Moraxella spec. oder Pseudomonas stutzeri [γ] handelt, nun aber, daß es ein Paracoccus denitrificans [α] ist“ (Evans & Fuchs [1988]). Der bekannte PCB-abbauende Stamm Acinetobacter spec. P6 wurde inzwischen als die Gram-positive Art Rhodococcus globerulus reklassifiziert (Asturias et al [1994]). Die beiden Beispiele verdeutlichen bereits, daß die Angaben zur Identifikation kritisch zu betrachten sind und der Vergleich mit den in der Literatur genannten degradierenden Stämmen häufig schwierig ist. Bei Gattungsangaben ist (nur) der Vergleich mit Sequenzdaten relativ sicher. Tab. 4.28 Genetische Revision Xenobiotika abbauender „Pseudomonas“-Stämme (Busse et al. [1992]) systematische Zuordnung Stamm Alcaligenes (eutrophus) D7-4 Alcaligenes (eutrophus) Alcaligenes xylosoxidans Comamonas Alcaligenes (xylosoxidans) Acidovorax1 Telluria-Gruppe1 Alcaligenes KTW11 A3-C A3 PSB1, PSB4 P3 T2 NRRL B-12227 NRRL B-12228 BN9 Thauera aromatica Azoarcus evansii Burkholderia Sphingomonas S. chlorophenolicus K172 KB740 LB400 RA2 SR3 Abbau von Isolationsbedingungen 3-Chlorbiphenyl, 3-Methylbenzoat, 2-Methyllakton 2-Methyllakton Naphthylen-Sulfonat Boden, mit Cl-Phenolen und -Krenolen, in Gegenwart von Stamm B13 Boden Schlamm 4-Sulfobenzoat Phenolsulfonsäure Toluensulfonsäure s-Triazin Belebtschlamm städtischer oder industrieller Anlagen mit Sulfonatbelastung Hydroxy-, Aminosalicylsäure-Derivate Phenol, Toluol 2-Aminobenzoat chlorierte Biphenyle Pentachlorphenol Elbe-Wasser anaerober Schlamm, mit NO3Schlamm aus einem Bach kontaminierter Boden Legende: 1 Zuordnung nach Mau [1997] durch 16S rDNA-Sequenzvergleich Die genetische Reklasssifizierung degradierender „Pseudomonas“-Stämme durch Busse et al. [1992] bewies, daß die Rolle der β-Proteobakterien und weiterer Taxa im Aromatenabbau bislang unterschätzt wird (Tab. 4.28). Die Dominanz von Acidovorax und deren Toleranz gegenüber den analysierten Xenobiotika war in der vorliegenden Arbeit evident. Der von Busse et al. [1992] genannte AcidovoraxStamm, einzelne Comamonas, Sphingomonas und Alcaligenes-Stämme decken sich mit dem Bild der mit Diskussion SA-bestimmten Spittelwasserpopulation. Die häufige Nennung von Alcaligenes in der Arbeit von Busse et al. ist allerdings wahrscheinlich habitatspezifisch, gilt für bodenbürtige „Pseudomonas“ (vergleiche Kap. 4.4.2.2 „Divergenz phänetischer Identifikation und genetischer Zuordnung“, Bestimmung von Acidovorax und Alcaligenes). Für den Vergleich mit der vorgelegten Populationsstudie bieten sich Arbeiten zum intensiv studierten mikrobiellen Abbau von polycyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) und Petroleum in Böden und kontaminierten Sedimente an (siehe Herbes & Schwall [1987]). Zum Thema Altlastensanierung findet man Studien zur Aktivierung des bakteriellen Abbaus, in denen auch das standorteigene Selbstreinigungspotential anhand von Isolaten charakterisiert wird. Die Isolierung aus der „natürlichen“ Umwelt erfolgt allerdings sehr selektiv, nach spezifischer Anreicherung mit Xenobotika-Medien, und bestimmt zumeist nur wenige Taxa. Obwohl zum Beispiel der Petroleum-Abbau in einem diversen Spektrum bakterieller Taxa möglich ist, wurden in Öl-kontaminierten Wasserproben nur 4 Gattungen für 57 Stämme identifiziert (Bagy et al. [1992]: Corynebacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas), in kontaminiertem Grundwasser 5 Gattungen (Raymond et al. [1976]: Micrococcus, Nocardia, Acinetobacter, Flavobacterium, Pseudomonas), in Wasser und Sediment Petroleum belasteter und unbelasteter Standorte nur 8 Taxa für 99 Stämme (Austin et al. [1977]: Actinomyceten, Coryneforme, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas, Sphaerotilus). Kämpfer et al. [1988] bestimmten mittels selektiver Anreicherung 7-19 verschiedene Arten in mit Kohlenwasserstoffen kontaminierte Böden, Grundwässer und Belebtschlammanlagen (Tab. 4.29). Kiyohara et al. [1992] lieferten eine der wohl umfassendsten Umweltanalysen auf diesem Gebiet: Sie analysierten 700 Boden- und Sedimentproben unterschiedlich belasteter Standorte und bestimmten 180 Stämme (Tab. 4.29), deren Identifikation eine Xenobiotika-spezifische Anreicherung der Gattungen Acinetobacter (mit Biphenyl, Naphthalin, Phenanthren, Pyren), Alcaligenes (Phenanthren, Pyren), Aeromonas, Flavobacterium (mit Biphenyl, Naphthalin, Phenanthren) und Pseudomonas (Biphenyl, Naphthalin, Phenanthren, Pyren, Anthracen) ergab. Die vergleichsweise geringe Anzahl bestimmter Taxa ist evident. Ein derart enges Spektrum an Bakterien ergab sich auch für das Spittelwassersediment bei Anreicherung und Isolierung mit Xenobiotika-Minimalmedien. Berücksichtigt man taxonomische Revisionen, ist eine Übereinstimmung mit den Literaturangaben für immerhin 8 Taxa festzustellen: Von der ehemaligen Gattung „Pseudomonas“ ließen sich Stenotrophomonas maltophilia (häufig mit 3CB, Nap, oXy), Brevundimonas diminuta (Ant) und Comamonas (C. testosteroni-ähnlich, 3CB, Nap) nachweisen. Außerdem wurden Pseudomonas fluorescens (dominant auf Ant) und Vertreter des P. aeruginosaZweiges (häufig mit Ant, Nap), Klebsiella-ähnliche (Ant, Nap, 3CB), Alcaligenes faecalis (häufig mit Nap) und Vertreter der Arthrobacter-Gruppe bestimmt (ehem. Coryneforme, auf allen 6 zur Isolierung verwendeten Medien, Ant, Nap, 3CB, oXy, 4CS, 24D). Auffällig ist, daß mit den Xenobiotika-Medien keine Acinetobacter bestimmt wurden, obwohl einige mit SA isolierte Stämme sich als sehr tolerant gegenüber diesen Medien erwiesen. 4-211 4-212 Diskussion Tab. 4.29 Populationsanalysen belasteter Standorte Taxon Vorkommen, Isolationsbedingungen Literatur Actinomyceten (21%), Coryneforme (10%), Enterobacteriaceae (6%), Klebsiella aerogenes, Micrococcus (20%), Nocardia (N. asteroides / corallina 11%), Pseudomonas (27%), Sphaerotilus natans (1%) Petroleum abbauende Bakterien aus Wasser und Sediment belasteter und unbelasteter Standorte Austin et al. [1977]1 Achromobacter, Acinetobacter calcoaceticus, Bacillus sphaericus, B. cereus, Brevibacillus brevis, Burkholderia pickettii, Comamonas testosteroni, Empedobacter breve, Flavobacterium odoratum, Pseudomonas aeruginosa, P. putida Sphingomonas paucimobilis Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter calcoaceticus, A. lwoffii, Alcaligenes eutrophus, A. denitrificans, Bacillus megaterium, Burkholderia picketti, Brevundimonas versicularis, Empedobacter brevei, Pseudomonas aeruginosa, P. alcaligenes, P. fluorescens, P. pseudoalcaligenes, P. putida. P. stutzeri, Stenotrophomonas maltophilia, Xanthomonas oryzihabitans Alcal. faecalis, Brevundimonas diminuta, Burkholderia cepacia Acinetobacter calcoaceticus, Chryseobacterium gleum, Empedobacter indologenes, E. breve, Flavobacterium odoratum, Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia bestimmt bei in vitro Anreicherung mit 1%-bis 5%-igen ÖlAnsätzen aus Belebtschlamm Kämpfer et al. [1988]2 Bacillus cereus, B. circulans, B. megaterium, Brevibacillus brevis, Brevundimonas diminuta, Micrococcus, Nocardiaähnliche Acinetobacter, Alcalgigenes xylosoxidans ssp. denitrificans, Brevundimonas diminuta, Chryseomonas luteola, Flavobacterium / Cytophaga-Gruppe, Pseudomonas fluorescens, Sphingomonas paucimobilis Arthrobacter globiformis, Bacillus spec., B. cereus, B. circulans, B. megaterium, Breviacillus brevis, Clavibacter michiganensis, Coryneforme, Micrococcus, Nocardia-Ähnlich Alcaligenes faecalis, A. xylosoxidans ssp. denitrificans, Arthrobacter globiformis, Bacillus spec.,Chryseomonas luteola, Clavibacter michiganensis, Coryneforme, Flavimonas oryzihabitans, Flavobacterium / Cytophaga-Gruppe, Hydrogenophaga pseudoflava, Methylobacterium, Microbacterium laevaniformans, Mycobacterium phlei, Nocardia asteroides, Moraxella osloensis-ähnliche, Oligella urethralisähnliche, Psychrobacter immobilis, Pseudomonas alcaligenes, P. pseudoalcaligenes-ähnliche, P. putida, P. stutzeri / mendocina, Rhodococcus spec., Shewanella putrefaciens, Sphingomonas paucimobilis, Terrabacter tumescens, Weeksella / Cytophaga, Xanthomonas (Stenotrophomonas nach neuerer Taxonomie ?) Acinetobacter (A. johnsonii, A. lwofii, A. spec.), Aeromonas hydrophila-Komplex, Pseudomonas fluorescens, P. stutzeri hoher Anteil in 1% Öl-Ansatz hoher Anteil in 5% Öl-Ansatz isoliert nach Perkolation ölhaltigen Bodenmaterials mit Phosphat und Ammonium dominant (>10 Isolate) Öl-degradierende Reinkulturen aus Anreicherung kontaminierten Bodens ebenso isoliert, kein Öl-Abbau unspezif. Isolierung (R2A): in Cl-Aromaten, Hexa-Chlorcyclohexan kontaminierten Böden unspezif. Isolierung (R2A): in Böden allgemein verbreitet dominant in Böden unspezif. Isolierung (R2A): in heterogenen Aquiferproben, relativ weites Spektrum an Bakterien, in 9-26m allgemein Gramnegative Isolate im Aquifer dominant dominant Legende: 1 2 numerische Charakterisierung (bioch. / morph. / physiol.), Identifikation anhand von Typstämmen automatisierte numerische Identifikation (selbst entwickelt, analog BIOLOG) Feidieker et al. [1994]2 Diskussion Die nachgewiesenen Flavobacterium johnsonae (ehem. Cytophaga, häufig mit oXy) stimmen dagegen aufgrund der Revision in der Nomenklatur nicht mit den in der Literatur erwähnten Stämmen dieser Gattung überein. Das Vorkommen dieser Art kann daher als spezifisch für die Spittelwasser interpretiert werden. Hinsichtlich der selektiven Anreicherung bestimmter Taxa mit bestimmten Xenobiotika, scheint es hier angebracht noch einmal auf den Begriff der „Taxonspezifität“ einzugehen. Die selektive Anreicherung und Isolierung mit verschiedenen Xenobiotika deutet auf Taxon-spezifische Abbaufähigkeiten der Gattungen hin. Diese Xenobiotika-Spezifität der Gattungen muß allerdings mit deren Identiät in Frage gestellt werden, denn einige der genannten Gattungen umfassen nach neuerer Taxonomie verschiedene Taxa (z.B. Flavobacterium, Pseudomonas). Eher ist eine Artspezifität anzunehmen, nach der beobachteten Varianz des Wachstumsverhaltens SA-isolierter Taxa mit Xenobiotika und der angenommenen statistischen Verteilung der Fähigkeiten innerhalb der Taxa, entspricht aber die Xenobiotika-Anreicherung der Selektion mehr oder weniger häufiger Stämme mit der gewünschten extremen Anpassungsfähigkeit innerhalb einer Art. Dies und die Heterogenität des Probenmaterials sind bereits ausreichend Grund dafür, daß hier keiner der vorhandenen toleranten Acinetobacter-Stämme mit Xenobiotika-Medien selektiert wurde. Die Selektion bestimmt nicht, wieviele Stämme einer Art degradierend sind, sondern nur, daß es welche gibt. Seit langem werden zum Beispiel Actinomyceten genutzt um eine Vielzahl sekundärer Metaboliten, wie Antibiotika und Pigmente, zu produzieren und entsprechend intensiv werden sie studiert und selektiert (vergl. z.B. Heuer et al. [1997]). Die Fähigkeiten lassen sich aber nicht vom taxonomischen Status der Isolate ableiten und erscheinen „zufällig“ innerhalb der Gruppe verteilt. Ein weiteres Beispiel soll die häufige Verallgemeinerung von Selektionierbarkeit auf Taxonspezifität verdeutlichen: Stenotrophomonas wurde hier mit 24D, 3-Chlorbenzoat, o-Xylol und Naphthalin angereichert. Weitere, mit SA isolierte Vertreter der genetisch bestimmten Xanthomonas-Gruppe, zeigten mit bis zu 10 der getesteten Xenobiotika gutes Wachstum. Higgins & Burns [1975] nennen Xanthomonas (wahrscheinlich Stenotrophomonas) zumindest zum Abbau von Harnstoff fähig. Su & Kafkewitz [1994] berichten über ein API-identifiziertes Abwasser-Isolat Stenotrophomonas maltophilia SU1, das in der Lage ist unter anoxischen oder mikroaerophilen Bedingungen mit Nitrat Toluol, m- und p-Xylol als einzige C-Quellen zu nutzen. Die Fähigkeiten von Stenotrophomonas scheinen somit allgemeingültig belegt. Nichts desto trotz war der von Kämpfer et al. [1988] mit Öl angereicherte und selektionierte Stamm Stenotrophomonas maltophilia aber nicht fähig die Substanz in Reinkultur abzubauen. Die Aussage dieses Abschnitts muß daher lauten: Für konkrete taxonomische Aussagen ist das bisher vorliegende Datenmaterial in diesem Bereich zu ungenau, es sind noch viele Fragen zum mikrobiellen Abbau offen und es ist zu wenig über die Fähigkeiten der Taxa bekannt. Der Vergleich von Xenobiotika-, beziehungsweise Belastung-spezifischen Populationen sollte sich unter diesen Voraussetzungen, wie zu Beginn des Literaturkapitels ausgeführt, nur auf den restriktiven Ver- 4-213 4-214 Diskussion gleich des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Art zwischen Gemeinschaften beschränken. Wesentlich informeller sind „unspezifische“ Populationsanalysen der belasteten Standorte. Mit der hier durchgeführten (Standort-spezifischen) SA-Anreicherung zu vergleichen ist die von Feidieker et al. [1994] durchgeführte Populationsanalyse mit chlorinierten Aromaten und Hexa-Chlorcyclohexan kontaminierter Böden und eines Aquifers (Tab. 4.29). Die Isolierung oligotropher Bakterien mit R2A ergab ein vergleichbar weites Spektrum an Bakterien. Wie in der Bodenextrakt-Isolierung von Bone & Balkwill [1988] dominierten Gram-positive Bakterien (Coryneforme, Bacillus) an der Oberfläche, Gramnegative Stäbchen im tieferen Aquifer. Wenige der Gram-positiven, aber viele der bestimmten Gram-negativen Arten, entsprachen bei ähnlicher Bestimmungs- und Anreicherungsmethode den mit BIOLOG und FAME-identifizierten Taxa der vorliegenden Arbeit (Acinetobacter johnsonii, A. lwofii, A. spec., Alcaligenes faecalis, Aeromonas hydrophila, Arthrobacter, Brevundimonas diminuta, Coryneforme, Flavobac-terium / Cytophaga-Gruppe, Hydrogenophaga pseudoflava, Methylobacterium, Moraxella osloensis-ähnliche, Psychrobacter immobilis, Pseudomonas fluorescens, P. pseudoalcaligenes-ähnliche, Rhodococcus spec., Shewanella putrefaciens, Xanthomonas / Stenotrophomonas). Hervorzuheben ist der Nachweis der Flavobacerium / Cytophaga-Gruppe, da aus dem Spittelwassersediment Flavobacterium johnsonae (ehem. Cytophaga, BCl 46) spezifisch für o-Xylol isoliert wurde (s.o.). Deutliche Unterschiede ergeben sich aber nicht nur bezüglich der weiteren Taxa, sondern auch in der Häufigkeit der dominanten Taxa. Für Boden typisch dominant sind die Gram-positiven Arthrobacter, Bacillus, Nocardia, Coryneforme, Micrococcus und Clavibacter, im Aquifer sind Gram-negative Acinetobacter, Aeromonas und Pseudomonas dominant (Feidieker et al. [1994]). Im Spittelwassersediment ist Acidovorax häufigste Gattung, insgesamt setzt sich die Population aber aus vielen, in geringer Zahl vertretenen Taxa zusammen die zumeist den β- und α-Proteobakterien, aber auch β/γ und γ-Proteobakterien angehören. Die zusätzliche Bestimmung der Xenobiotika-Isolate und Test der unspezifisch isolierten Bakterien mit Xenobiotika, wie sie in vorliegender Arbeit versucht wurde, findet leider keine Entsprechung in der Literatur. Daher bleibt der Vergleich mit bisherigen Arbeiten fragmentarisch. Zusammenfassend sind einige grundsätzliche Punkte zu nennen: • Die selektive Anreicherung beschreibt die Fähigkeiten der Taxa nur unzureichend. Die Diskussion zur Verteilung der Phenanthren-Nutzer nach Kiyohara et al. [1992] oder zum Verhalten des mit Öl-angereicherten Stenotrophomonas maltophilia bei Kämpfer et al. [1988] verdeutlicht, daß sowohl über Verhalten und Vorkommen der Taxa, als auch über das der Substanzen nicht genügend bekannt ist. • Über die Taxonspezifität der bakteriellen Fähigkeiten ist bislang zu wenig bekannt. Ein Vergleich mit einzelnen degradierenden Stämmen ist in diesem Sinne wenig aussagekräftig. Die Ergebnisse des Xenobiotika-Toleranztests belegten, daß noch umfangreiche Studien zur Bestimmung des Xenobiotika-Nutzungsverhaltens ausstehen, die das Verhalten der Taxa als Summe einzelner Stämme (im statistischen Rahmen) und der Populationen beschreiben können. Diskussion • In der vorgelegten Arbeit wurden einige typisch zu nennende Organismen belasteter Standorte und bekannte Xenobiotika nutzende Mikroorganismen bestimmt. Die Spezifität der Mikroflora des Spittelwassersedimentes, eines industriell belasteten Fließgewässers wurde sehr deutlich, da die Literatur sich zwangsläufig auf Boden, Aquifer, Seen und die Abwasseraufbereitung bezog. Eine entsprechende Population wurde in der Literatur nicht beschrieben. Die Gattung Serratia, seit langem zur Umsetzung von Aromaten biotechnologisch genutzt, war zum Beispiel nur hier, Xenobiotika(Naphthalin, Anthracen) und Habitat-spezifisch (Flußwasser), zu bestimmen. Der Nachweis von Ochrobactrum mit Anthracen, 4CS und o-Xylol ist in diesem Zusammenhang ebenfalls neu (primär klinisch isolierte Art, inzwischen auch in nährstoffreicher Umgebung, z.B. an Wurzeloberflächen, bestimmt). 4.6 Ökologische Implikationen der Diversitätsbestimmung Es stellt sich die Frage, welche ökologischen Schlußfolgerungen aus der hohen Diversität der Spittelwasserpopulation abgeleitet werden können. Forney et al. [1995] diskutierten, daß die genetische Diversität einer mikrobiellen Population umgekehrt proportional zur Konzentration an wachstumslimitierenden, verfügbaren Nährstoffen ist. Nur bei ausreichendem Nahrungsangebot ist die Zellteilungsrate so hoch, daß sich genetische Variationen etablieren können, weniger fitte Varianten verdrängt werden und die Diversität reduziert wird. Ist die Nahrungskonzentration gering oder nicht ausreichend, wird die Rate mit der die fitten Varianten die weniger fitten verdrängen gering sein und die genetische Variation in der Population hoch. Daraus folgt hohe genetische Diversität bakterieller Populationen in oligotrophen oder nährstofflimitierten Ökosystemen. Diese Interpretation ist auf die Isolate der Spittelwasser und die Nährstoffsituation des Ökosystems zu übertragen: • Die mit SA isolierbare Spittelwasserpopulation bestand zu einem großen Teil aus physiologisch nicht oder schwach aktiven Bakterien (52% der 138 SA-Isolate 8/93 metabolisch tesbar, Aktivität <20 bis 40%). Geringe in vitro Aktivität gilt als charakteristisch für Bakterien die an geringe Nährstoffkonzentrationen angepaßt sind und entsprechend langsame Abbauleistung aufweisen (Wuhrmann [1977]). Der Wuchs vieler SA-Isolate wurde außerdem auf den Komplexmedien NA und TSA gehemmt. Der Vergleich mit den von Kuznetsov et al. [1979] definierten Kategorien und Taxa bestätigte, daß mit SA oligotrophe Bakterien abgereichert wurden. Ein Mangel an einfachen Kohlenstoffquellen und Persistenz der eingeleiteten organischen Verbindungen erklären die relative Nährstoffarmut des belasteten Gewässers. Entsprechend der Theorie von Forney et al. [1995] für oligotrophe Systeme, bestätigte die polyphasische Charakterisierung eine hohe Diversität der Isolate. • Aufgrund der Belastungssituation ist das Spittelwassersediment als „Altlast“ zu charakterisieren. Das Xenobiotika-Screening zeigte das Vorhandensein degradierender Bakterien. Der Anteil bekannter degradierender, prototropher Bakterien war jedoch relativ gering und läßt eine Hemmung des „in situ Selbstreinigungspotentials“ annehmen (Hanert et al. [1990]). Neben einem Mangel an notwendigen 4-215 4-216 Diskussion Substanzen für Wachstum und Abbau (z.B. Mangel an O2, einfachen Kohlenstoffquellen, Vitaminen und weiteren Wachstumsfaktoren) sind die hohen Konzentrationen toxischer Substanzen als wachstums-limitierende Faktoren zu nennen. Bekannterweise hemmen im Spittelwasser vorhandene Verbindungen wie höhere Ketone, Nitrile, Thiophen und Cymol den Abbau organischer Substanzen (Schönborn [1992]). Außerdem war eine zunehmende Toxizität des Spittelwasser-Sedimentes für die gesunkene Gesamtkoloniezahl und Anzahl isolierbarer Kolonien der Probenahme 8/93 gegenüber 5/93 diskutiert worden. Auch diese Wachstumslimitierung erhöht im Sinne von Forney et al. [1995] die Artenvielfalt. Allerdings kann auch angenommen werden, daß der rasche Wechsel der Substratverhältnisse und die variable Belastung, aufgrund der kurzfristigen Verfügbarkeit der Nährstoffe, keine längerfristig gerichtete Selektion der Populationen des Spittelwassersedimentes zuläßt. Jedes Ökosystem besitzt aber sowohl langfristig stabile Populationen als auch kurzfristig adaptierbare Populationen für bestimmte Nahrungsangebote (Streit [1980]). Das heißt die Biozönose als Ganzes zeigt eine Mischstrategie von r- und K-, auf spezifische Zuwachsrate oder auf die Kapazität der Ökosystems, selektierten Organismen: • Unter Laborbedingungen raschwüchsige Bakterien wie die Xenobiotika-isolierten Stämme entsprächen nach dieser Theorie den zu explosionsartiger Massenvermehrung fähigen, r-selektionierten Bakterien. Diese Bakterien sind an variable, nicht vorhersagbare Nahrungs- und Klimafaktoren angepaßt, besiedeln unsaturierte Ökosysteme, wiederbesiedeln oft auch jahresrhytmisch. • Als gegensätzliches Extrem sind K-Selektionisten für konstante oder vorraussagbar variable Umweltbedingungen definiert. Sie sind auf möglichst vollständige Ausnutzung begrenzter Nährstoffmengen optimiert und können auch aggressive Konkurrenzmechanismen entwickeln. Diesem Grenztyp könnten die bestimmten oligotrophen Bakterien entsprechen. Diese Zuordnung erscheint logisch, aber ob diese populationsökologischen Strategien überhaupt auf Bakterien anzuwenden sind, ist bislang noch einer der fraglichen Aspekte mikrobieller Ökologie. Dabei scheint das Konzept der r-Strategen gerade in Fließgewässern von Bedeutung. Infolge der inhärenten Störungsereignisse (Durchflußschwankungen, Überschwemmungen, Niedrigwasserzeiten) sind sie mehr auf Wiederbesiedlungsstrategien als auf Regulationsmechanismen evolviert. Die Fließgewässer zeigen auch nach starken Störungen, wie Pestizidanwendung oder organische Belastung, eine rasche Regenerationsphase. Sie sind stabile und stark elastische Ökosysteme: Sie kehren nach einer Störung zum ursprünglichen Gleichgewicht zurück (Definition der Stabilität) und ertragen eine Störung ohne in einen anderen Typus umzuschlagen (Definition der Elastizität). In der Regel nimmt die Elastizität flußabwärts zu (Naimann & Sedell [1979b]). Entgegen ursprünglicher Meinung ist hohe Diversität eines Systems aber kein Garant der Stabilität (Streit [1980]). Stabilität und Diversität können allgemein positiv oder negativ miteinander korreliert sein (Campbell [1980]). Die Korrelation von Diversität und Stabilität ist nur insofern gültig, wie verschiedene Diskussion Organismen mit überlappender oder kooperativer Rolle im Ökosystem koexistieren. Wenn eine ökologisch äquivalente Art ausfällt, kann dann dessen Rolle von den anderen übernommen werden. Bei nahezu vollständigem Zusammenbruch der Population, z.B. infolge von Hochwasserereignissen, könnte sich aber auch aus dem geringen, zufällig erhaltenen „Restkapital“, sensitiv abhängig von diesen Anfangsbedingungen (Gleick [1990]), eine neue, andersartige Population entwickeln. Eine verbindliche Aussage über die Stabilität des Systems läßt sich aus der hohen Diversität der Spittelwasserpopulation also nicht ableiten. Es ist lediglich zu vermuten, daß sich aufgrund der beständig schwankenden Belastungen eine besonders elastische Grundpopulation entwickelt hat. Ein Vergleich von Ökosystemen mit wenig oder hochspezialisierten Organismen zeigt auch, daß Ökosysteme mit Organismen die verschiedene Rollen erfüllen, stabiler, flexibler und unter bestimmten Bedingungen (v.a. in einer veränderlichen Umwelt) effizienter funktionieren. Da Arten mit äquivalenter Rolle häufig zur Kooperation tendieren (wenn sie nicht konkurrieren) erhöht sich aufgrund des synergistischen Effekts im Allgemeinen (aber nicht immer) die Produktivität des Ökosystems. Dieser Punkt ist für die Selbstreinigung der Spittelwasser von besonderer Bedeutung, denn durch Kooperation wird häufig erst ein Xenobiotika-Abbau ermöglicht. Die diverse, synergistische Gesellschaft für den Biotechnologen gewinnt folgerichtig produktions- oder degradationstechnisch zunehmend an Interesse. Wobei die Frage erlaubt ist, ob langsam wachsendere Konsortien von Mikroorganismen nicht oftmals zu bevorzugen wären (z.B. wenn reine Umsetzung, Degradation, gefragt ist), denn geringeres Wachstum heißt geringere Biomasse und weniger zu entsorgender Abfall, aber nicht geringere Stoffwechselleistung (erhöhten Durchsatz der „schlechten Futterverwerter“, Soeder et al. [1988 / 1989]). Ein Biotechnologe sollte außerdem eine realistische Vorstellung haben, wie die Funktionalität eines gegebenen Ökosystems zum Beispiel zur Altlastensanierung optimiert werden kann, und nicht nur blind versuchen ein Ökosystem zu bereichern, in dem so viele Arten wie möglich eingeführt werden (Oleskin & Samuilov [1992]). Mikroorganismen sind im allgemeinen so weit verbreitet, daß sie überall dort, wo sie zu leben und zu wachsen vermögen, mit großer Wahrscheinlichkeit auch vorkommen. Anders ausgedrückt: Wenn ein Mikroorganismus dort nicht vorhanden ist, so hat dies für gewöhnlich einen Grund. Es ist daher schwierig, einen spezialisierten Mikroorganismus in eine fest etablierte Umwelt einzuführen, in der er gegenwärtig nicht existiert. Besser ist es die vorhandenen natürlichen Gegebenheiten auszunutzen. Zur Sanierung der Spittelwasser und anderer Fließgewässer eignen sich hydrologische Maßnahmen, die eine effektive Selbstreinigung in begrenzten Bereichen ermöglichen und die räumliche Verfrachtung der Altlast verhindern (gut belüftete „in situ Klärbecken“), oder das Ausbaggern der belasteten Sedimente und deren biotechnologische Aufbereitung. 4-217 5-218 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Die hier angewandten kulturellen Methoden dienen der Beschreibung des an der Sedimentoberfläche der Spittelwasser vorhandenen Spektrums an aeroben und fakultativ anaeroben, chemoheterotrophen Bakterien. Die Anreicherung mit Sediment-Extrakt-Agar (SA) erfasste die „Gesamtpopulation“ kultivierbarer Bakterien. Die Anreicherung mit verschiedenen Xenobiotika-Medien charakterisierte das Vorkommen der gegenüber diesen oder ähnlichen Substanzen toleranten, beziehungsweise diese Verbindungen nutzenden Bakterien und beschreibt das Selbstreinigungspotential der industriell extrem belasteten Spittelwasser. Die Keimzahlen auf diesen Medien zeigten über den Beobachtungszeitraum starke Schwankungen, die auf das unterschiedliche Vorkommen vergleichbarer Substanzen im Gewässer und eine entsprechende Adaptation der bakteriellen Populationen zurückgeführt wurden. Insgesamt 504 Isolate von SA und sechs der Xenobiotika-Medien (4-Chlorsalicylsäure, 3-Chlorbenzoesäure, 2,4-Diphenoxyessigsäure, Anthracen, Naphthalin, o-Xylol) wurden polyphasisch charakterisiert und identifiziert. Die Bestimmung umfasste die Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen und die daraus abzuleitende Stoffwechselaktivität (BIOLOG-Identifikationssystem), die Analyse der Gesamtfettsäuren (FAME, MIDI-MIS-Identifikationssystem) und der 16S rDNA (TGGE, Sequenzierung). Dabei dienten BIOLOG und TGGE der biochemischen und genetischen Vorsortierung der Isolate. Die SAIsolate wurden außerdem einem Xenobiotika-Screening unterworfen, das den Vergleich mit den Xenobiotika-Isolaten ermöglicht. Die vorliegenden Ergebnisse haben gezeigt, daß mit einem solchen polyphasischen Ansatz das Spektrum isolierbarer Bakterienarten zuverlässig zu beschreiben ist. Für die in dieser Art neue Anwendung der TGGE (Temperaturgradienten-Gelelektrophorese) blieben allerdings einige Optimierungsmöglichkeiten offen. Die hier bestimmten Bakterien ergaben ein unerwartet großes Spektrum unbekannter Arten, das mit Sedimentextrakt-Medium, statt der üblichen Komplex-Medien, und durch den Einsatz verschiedener phänotypischer und genetischer Methoden detektierbar war. Insbesondere für die Beschreibung der physiologisch schwach aktiven Bakterien erwies sich die Kombination der verschiedenen Methoden als sehr nützlich. Ein Großteil der naturnah kultivierten SA-Kolonien war unter Laborbedingungen gering aktiv. Sie können mit den üblichen Medien (LB, NA, R2A) wahrscheinlich nicht erfaßt werden und sind daher mit den üblichen Methoden auch nicht zu identifizieren. Die BIOLOG-Clusteranalyse ermöglichte die Charakterisierung auch gering aktiver Isolate die mit FAME nicht zu analysieren waren und zeigte hohe Diversität der analysierten Populationen, aber eine Identifikation bekannter Taxa war nur bei ausreichender Aktivität möglich. Schlecht wachsende Isolate konnten durch PCR-Amplifikation eines kurzen Fragmentes 16S rDNA, TGGE-Screening und Sequenzierung beschrieben werden, aber bis auf wenige Ausnahmen waren diese Sequenzen keiner Art eindeutig zuzuordnen. Alle Identifikationen waren spezifisch der Methode, Datenbanken und derzeitiger Taxonomie zu interpretieren. Offensichtlich sind in allen Datenbanken die umweltrelevanten Taxa bislang nicht enthalten. Den „neuen“ genetischen Metho- Zusammenfassung den (TGGE-Screening, aber auch 16S rDNA-Analyse) fehlt darüberhinaus der systematische Aufbau und die statistische Analyse vorhandener Referenzstämme, die bei den gängigen kommerziellen Identifikationssystemen etabliert sind. Da die isolierten Taxa, auf Art oder sogar Gattungsebene, in den Datenbanken überwiegend nicht enthalten sind, ist der reine Einsatz genetischer Methoden nicht zu empfehlen. Die Identifizierung ergab eine heterogene, artenreiche Gemeinschaft mit dem naturnahen Medium sowie artenarme, Xenobiotika-spezifische Gesellschaften. Die Zahl der Gram-positiven Bakterien war für das bodenähnliche Habitat vergleichsweise gering. Nur sehr wenige Gram-positive Bakterien wurden isoliert und nur auf einigen Xenobiotika-Minimal-Medien dominierten sie (24D, 4CS, Naphthalin, o-Xylol). In größerer Anzahl und sicher bestimmbar, waren die Gattung Aureobacterium (Arthrobacter-Gruppe) und einige Rhodococcen. Der Anteil der Arthrobacter-Rhodococcus-Gruppe entsprach aber nicht dem vielfältig beschriebenen Abbauverhalten. Die Isolate auf Sediment-Extrakt-Medium und die Klonierung von Mau [1997] konnten die Bedeutung der Gruppe für die Umsetzungen im Spittelwassersediment mengenmäßig nicht belegen. Die Gram-negativen Bakterien wurden dominant und in großer Vielfalt bestimmt. Die mit SA isolierte aerobe Gesamtpopulation der Sedimentoberfläche bestand zu über 90% aus Gram-negativen Bakterien. Trotz des hohen Gehalts des Spittelwassersedimentes an organischen Substanzen (vermutlich aufgrund der Persistenz oder Toxizität der Substanzen) wurden diese Bakterien als überwiegend oligocarbophil und stoffwechselschwach charakterisiert. Die in der Literatur genannten degradierenden Arten wurden nur in geringen Zahlen bestimmt: Echte Pseudomonas-Arten konnten nur mit Xenobiotika-Medien (v.a. mit Anthracen, Naphthalin) angereichert werden und entsprachen nicht den allgemein häufig bestimmten Arten (P. aeruginosa, P. fluorescens). Dafür wurden genetisch vier neue Arten innerhalb des Pseudomonas aeruginosa-, P. agarici- und P. fluorescens-rRNA-Zweiges klassifiziert, phänotypisch und genetisch kongruent waren P. marginalisBestimmungen. Acinetobacter wurde in geringer Zahl nur mit SA isoliert, Alcaligenes in geringer Zahl mit SA (5/93) und Naphthalin (8/93). Dominant waren die β-Proteobakterien der Rubrivivax gelatinosusGruppe (ehemalige Pseudomonaden), deren Rolle in der Biodegradation aufgrund fehlerhafter Identifikation bislang wahrscheinlich unterschätzt wird. Häufigste Gattung, mit verschiedenen, auch neuen Arten, war Acidovorax. Relativ stark vetreten waren auch α-Proteobakterien der Agrobacterium-Gruppe. Das vorhandene Selbstreinigungspotential ergänzten weitere, spezifisch isolierte Bakterien: Zum Beispiel die nur mit o-Xylol zu isolierenden Flavobacterium johnsonae (ehem. Cytophaga), die spezifisch mit Naphthalin und Anthracen isolierten Serratia marcescens und S. liquefaciens/grimesii, die mit 3CB, Naphthalin und o-Xylol zu isolierenden Stenotrophomonas und die mit Anthracen, 4CS und o-Xylol bestimmten Ochrobactrum. Mit dem Xenobiotika-Screening der Sedimentextrakt-Isolate wurde unseres Wissens nach erstmalig im großen Umfang unspezifisch isolierte Bakterien auf ihre Toleranz, beziehungsweise Nutzung, gegenüber einem großen Spektrum verschiedener Substanzen getestet. Einige Taxa, zum Beispiel Acinetobacter die nur mit SA isoliert wurden, umfassten Stämme die mit 10 oder mehr verschiedenen Xenobiotika wuch- 5-219 5-220 Zusammenfassung sen. Insgesamt aber war das Verhalten der Stämme recht variabel, so daß das Testverfahren in Hinblick auf die Stichprobengröße und Auswahl der Bakterien keine eindeutige Taxonabhängigkeit des Verhaltens ergab. Es wurde vermutet, daß das Vorkommen dieser Fähigkeiten innerhalb einer Art statistisch verteilt ist. Die Anreicherung und Isolierung mit Xenobiotika als einziger C-Quelle kann daher nur begrenzten Einblick in das vorhandene Selbstreinigungspotential ermöglichen. Die hier erzielte Anreicherung einer relativ geringen Anzahl bekannter degradierender Stämme und der hohe Anteil oligotropher Bakterien wies auf die Unterdrückung der Abbaufähigkeit am „Altlastenstandort“ Spittelwasser hin. Bei gegebener Sauerstoffversorgung an der Sedimentoberfläche des Fließgewässers, hohen Konzentrationen nicht nur persistenter, sondern auch leicht flüchtiger und abbaubarer Substanzen, ist zum einen ein Mangel an spe-zifischen Wuchsstoffen, zum anderen die Toxizität der Substanzen als ursächlich anzunehmen. Die diffizile Belastungssituation und die natürlichen Störungen des Fließgewässers verhindern wahrscheinlich die Selektion artenreduzierter, angepaßter Populationen. Zusammenfassung 6 Schlußwort „...Die Untersuchungen an Bakterien leiden unter der Komplexität der Populationen, den Schwierigkeiten sie zu klassifizieren und dem Fehlen einer klaren Systematik. Alles das hat zu ungenauen Beschreibungen von Bakterien-Gesellschaften geführt. Das Problem kann vermutlich nur dadurch gelöst werden, daß noch viel Arbeit in die Klassifizierung der Bakterien investiert wird.“ R. Campbell [1980] in seinem Buch „Mikrobielle Ökologie“ (Kap. 9, S.227) 6-221 7-222 Literatur 7 Literaturverzeichnis Alexander M. 1961. Introduction to soil microbiology. Wiley & Sons, New York Amann RI, Ludwig W, Schleifer K-H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59(1), 143-169 Anderberg MR. 1973. Cluster analysis for applications. Academic Press, New York Arbeitsgemeinschaft für die Reinhaltung der Elbe. 1996. Wassergütedaten der Elbe: Von Schmilka bis zur See. Zahlentafel 1994. Bearbeitet von S. Wolff. Wassergütestelle Elbe der Arbeitsgemeinschaft dür die Reinhaltung der Elbe. Nessdeich 120-121, 21129 Hamburg Arber W, Naas T, Blot M. 1994. Generation of genetic diversity by DNA rearrangements in resting bacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 15, 5-14 Astolfi P, Kidd KK, Cavalli-Sforza LL. 1981. A comparison of methods for reconstructing evolutionary trees. Syst. Zool. 30(2), 156-169 Asturias JA, Moore E, Yakimov MM, Klatte S, Timmis KN. 1994. Reclassification of the polychlorinated biphenyl-degraders Acinetobacter sp. strain P6 and Corynebacterium sp. strain MB1 as Rhodococcus globerulus. System. Appl. Microbiol. 17, 226-231 Austin B, Calomiris JJ, Walker JD, Colwell RR. 1977. Numerical taxonomy and ecology of petroleum-degrading bacteria. Appl. Environm. Microbiol. 34(1), 60-68 Austin B. 1988. Marine microbiology. Cambridge University Press, Cambridge. 222 Backhaus H. 1995. Approaches to fingerprinting of microbial communities by separating ribosomal squences with temperature gradient electrophoresis. Workshop on Application of DGGE and TGGE in Microbial Ecology, 7.-10.6.1995, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Braunschweig, Deutschland Bakken LR. 1985. Separation and purification of bacteria from soil. Appl. Environm. Microbiol. 49(6), 1482-1487 Balkwill DL & Ghiorse WC. 1982. Characterization of subsurface microorganisms. ASM, Abstracts of the annual meeting. N85 Balows A, Trüper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer K-H (Eds). 1992. The Prokaryotes: A handbook on the biology of bacteria - Ecophysiology, isolation, identification, applications. 2nd Ed. Springer-Verlag New York, Berlin, Heidelberg Bell AV. 1976. Waste controls at base metal mines. Environ. Sci. Technol. 10, 130-135 Benckiser G. 1980. Umwandlung und Verwertbarkeit relativ persistenter Verbindungen im Zuge der anaeroben Atmung (Denitrifikation) am Beispiel von Polyäthylen-Sorbitan-mono-Oleat, Phthalsäuredi-N,N-Butylester, Hexachlorbenzol und Abwasserkonzentrat. Diss. Universität Hohenheim Bendinger B, Kroppenstedt RM, Klatte S, Altendorf K. 1992. Chemotaxonomic differentiation of coryneform bacteria isolated from biofilters. Int. J. System. Bacteriol. 42(3), 474-486 Bennasar A, Rossello-Mora R, Lalucat J, Moore ERB. 1996. 16S rRNA gene sequence analysis relative to genomovars of Pseudomonas stutzeri and proposal of Pseudomonas balearica sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 200-205 Benson D, Boguski M, Lipman DJ, Ostell J. 1994. GenBank. Nucl. Acids Res. 2, 3441-3444 Bernadet J-F, Segers P, Vancanneyt M, Berthe F, Kersters K, Vandamme P. 1996. Cutting a gordian knot: Emended classification and discription of the genus Flavobacterium, emended description of the family Flavobacteriaceae, and proposal of Flavobacterium hydatis nom. nov. (basonym, Cytophaga aquatilis Strohl and Tait 1987). Int. J. Syst. Bacteriol. 46(1), 128-148 Bianchi MAG & Bianchi AJM. 1982. Statistical sampling of bacterial strains and ist use in bacterial diversity measurement. Microb. Ecol. 8, 61-69 Literatur Blake RD & Haydock PV. 1979. Effect of sodium ion on the high-resolution melting of lambda DNA. Biopolymers. 18, 3089-3109 Blot M, Hauer B, Monnet G. 1994. The Tn5 bleomycin resistance gene congers improved survival and growth advantage on Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 242, 595-601 BMFT. 1990. Umweltforschung und Umwelttechnologie. Programm 1989 bis 1994. Der Bundesminister für Forschung und Technologie (Hrsg.). Referat für Öffentlichkeitsarbeit, Bonn, 4. Auflage 2/1991 Bochner B. 1990. Taxonomy of gram-negative aerobic bacteria: Carbon source utilization data combined with phylogenetic inferences. Draft of 11/6/90 for submission to Microbiol. Rev., Biolog Inc., 3447 Investment Blvd., Suite 2, Hayward, CA 94545 Boivin-Jahns V, Bianchi A, Ruimy R, Garcin J, Daumas S, Christen R. 1995. Comparison of phenotypical and molecular methods for the identification of bacterial strains isolated from a deep subsurface environment. Appl. Environm. Microbiol. 61(9), 3400-3406 Bone TL & Balkwill DL. 1988. Morphological and cultural comparison of microorganisms in surface soil and subsurface sediments at a pristine study site in Oklahoma. Microb. Ecol. 16, 49-64 Bouvet PJM & Grimont PAD. 1986. Taxonomy of the genus Acinetobacter with the recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov., Acinetobacter haemolyticus sp. nov., Acinetobacter johnsonii sp. nov., and Acinetobacter junii sp. nov. and emended descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwofii. Int J. Syst. Bacteriol. 36, 228-240. Bouwer EJ. 1992. Bioremediation of organic contaminants in the subsurface. In: Mitchell R (Ed.). Environmental microbiology. Wiley-Liss Inc. New York. 287-318 Britschgi TB, Giovannoni SJ. 1991. Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing. Appl. Environm. Microbiol. 42, 44-55 Brosius J, Palmer ML, Kennedy PJ, Noller HF. 1978. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 4801-4805 Buck JD. 1979. The plate count in aquatic microbiology. In: Costerton JW , Colwell RR (Eds.). Native aquatic bacteria: Enumeration, activity, and ecology. ASTM STP 695, American Society for Testing and Materials. 19-28 Bull AT, Goodfellow M, Slater JH. 1992. Biodiversity as a source of innovation in biotechnology. Ann. Rev. Microbiol. 46, 219-252 Busse H-J, El-Banna T, Oyazu H, Auling G. 1992. Identification of xenobiotic-degrading isolates from the beta subclass of the Proteobacteria by a polyphasic approach including 16S rRNA partial sequencing. Int J. Syst. Bacteriol. 42, 19-26 Campbell R. 1980. Mikrobielle Ökologie. Verlag Chemie, Weinheim (Taschentext; 78) Christensen JJ, Whitney AM, Teixeira LM, Steigerwalt AG, Facklam RR, Korner B, Brenner DJ. 1997. Aerococcus urinae: Intraspecies genetic and phenotypic relatedness. Int. J. Syst. Bacteriol. 47(1), 28-32 Clayton RA, Sutton G, Hinkle PS Jr., Bult C, Fields C. 1995. Intraspecific variation in small-subunit rRNA sequences in GenBank: Why single sequences may not adequately represent prokaryotic taxa. Int. J. Syst. Bacteriol. 45(3), 595-599 Clifford H T & Stephenson W. 1975. An introduction to numerical classification. Academic Press, New York Costerton JW, Colwell RR (Eds.). 1977. Native aquatic bacteria: Enumeration, activity, and ecology. ASTM Special Technical Publication 695, Philadelphia Coutinho HLC, Handley BA, Kay HE, Stevenson L, Beringer JE. 1993. The effect of colony age on PCR fingerprinting. Letters in Appl. Microbiol. 17, 282-284 7-223 7-224 Literatur Dahle AB & Laake M. 1982. Diversity dynamics of marine bacteria studied by immunofluorescenct staining on membrane filters. Appl. Environm. Microbiol. 43, 169-176 D´Aquila RT, Bechtel LJ, Videler JA, Eron JJ, Gorczyca P, Kaplan JC. 1991. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by preamplification heating. Nucl. Acids. Res. 19, 3749 Davies TR & Toerien DF. 1971. Population description of a denitrifying microbial system. Water Res. 5, 553-564 Davison AD, Csellner H, Karuso P, Veal DA. 1994. Synergistic growth of two members from a mixed microbial consortium growing on biphenyl. FEMS Microbiol. Ecol. 14, 133-146 De Ley J. 1992. The Proteobacteria: Ribosomal RNA cistron similarities and bacterial taxonomy. In: The Prokaryotes: A handbook on the biology of bacteria - ecophysiology, isolation, identification, applications. Vol. II, Chapter 100. Balows A, Trüper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer K-H (Eds). 2nd Ed. 2111-2140 Dott W. 1980. Qualitative und quantitative Bestimmung von Bakterienpopulationen aus aquatischen Biotopen. 1. Mitteilung: Selektionierung von Bakteriengruppen durch Isolierung auf verschiedenen Nährböden. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 170, 93-98 Dott W & Kämpfer P. 1988. Biochemical methods for automated bacterial identification and testing metabolic activities in water and wastewater. Wat. Sci. Tech. 20(11/12), 221-227 Dott W & Thofern E. 1980. Qualitative und quantitative Bestimmung von Bakterienpopulationen aus aquatischen Biotopen. 2. Mitteilung: Anwendung miniaturisierter Systeme zur Identifizierung und Biotypisierung von Bakterien umter Verwendung der Vielpunktbeimpfungsmethode. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 170, 99-107 Dott W & Trampisch HJ. 1983. Qualitative und quantitative Bestimmung von Bakterienpopulationen aus aquatischen Biotopen. 3. Mitteilung: Datentechnische Erfassung der Identifizierungsmerkmale und numerische Taxonomie. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 173, 273-284 Dott W & Trampisch HJ. 1983. Qualitative und quantitative Bestimmung von Bakterienpopulationen aus aquatischen Biotopen. 5. Mitteilung: Vergleichende Untersuchungen an zwei Schnellsandfiltern. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 177, 141-155 Dwyer DF, Rojo F, Timmins KN. 1988. Fate and behaviour in an activated sludge microcosm af a genetically-engineered micro-organism designed to degrade substituted aromatic compounds. In: Sussman M, Collins CH, Skinner FA, Stewart-Tull DE (Eds), The release of genetically-engineered microorganisms. Academic Press, London. 77-88 Edwards U, Rogall T, Blöcker H, Emde M, Böttger EC. 1989. Isolation and direct nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucl. Acids Res. 17, 7843-7853 El-Shaarawi AH & Kwiatkowski RE (Eds.). 1986. Statistical aspects of water quality monitoring. Proceedings of the workshop held at the Canada Centre for Inland Waters, October 7-10, 1985. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam New York Emmert DB, Stoehr PJ, Stoessner G, Cameron GN. 1994. The European Bioinformatics Institute (EBI) databases. Nucl. Acids Res. 22, 3445-3449 Engelen B, Heuer H, Felske A, Nübel U, Backhaus H. 1995. Application of TGGE to investigate microbial soil communities. Workshop on Application of DGGE and TGGE in Microbial Ecology, 7.10.6.1995, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Braunschweig, Deutschland Ernst A, Langbein K, Weiss H. 1986. Gift-Grün. Chemie in der Landwirtschaft und die Folgen. Kiepenheuer & Witsch, Köln Evans WC. 1977. Biochemistry of the bacterial catabolism of aromatic compounds in anaerobic environments. Nature. 270, 17-22 Literatur Evans CW & Fuchs G. 1988. Anaerobic degradation of aromatic compounds. Ann. Rev. Microbiol. 42, 289-317 Fabig W & Ottow JCG. 1979. Isolierung und Identifizierung neuer denitrifizierender Bakterien aus einer Modellkläranlage mit anaeroben Festbettreaktoren. Arch. Hydrobiol. 85(3), 372-391 Feidieker D, Kämpfer P, Dott W. 1994. Microbiological and chemical evaluation of a site contaminated with aromatic compounds and hexachlorocyclohexanes. FEMS Microbiol. Ecol. 15, 265-278 Felsenstein J. 1982. Numerical methods for inferring phylogenetic trees. Quart. Rev. Biol. 57, 379-404 Felsenstein J. 1984. The statistical approach to inferring evolutionary trees and what it tells us about parsimony and compatibility. In: Cladistics. Duncan T & Stuessy TF (Eds.), Columbia University Press, New York. 169-191 Felsenstein J. 1988. Phylogenies from molecular sequenses: Inference and reliability. Annu. Rev. Genet. 22, 521-565 Feltham KA & Stevens M. 1994. Present trends and future prospects for rapid methods and automation in the clinical laboratory. In: Priest FG, Ramos-Cormenzana A, Tindall BJ (Eds). Bacterial diversity and systematics. FEMS Symposium No. 75. Plenum Press New York London. 309-322 Ferris MJ, Muyzer G, Ward DM. 1996. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNAdefined populations inhabiting a hot spring microbial mat community. Appl. Environm. Microbiol. 62(2), 340-346 Field JA, Stams AJM, Kato M, Schraa G. 1995. Enhanced biodegradation of aromatic pollutants in cocultures of anaerobic and aerobic bacterial consortia. Antonie van Leeuwenhoek. 67, 47-77 Fischer SG & Lerman LS. 1983. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1579-1583 Fitch WM & Margoliash E. 1967. Construction of phylogenetic trees. Science. 155(1), 279-284 Focht DD. 1988. Performance of biodegradative microorganisms in soil: Xenobiotic chemicals as unexploited metabolic niches. In: Omenn G (Ed). Environmental biotechnology: Reducing risks from environmental chemicals through biotechnology. Plenum Press, New York London. 15-29 Forney L, Dunbar J, Zlatkin I. 1995. Genetic diversity of microbial populations from soils and deep surface sediments. Workshop on Application of DGGE and TGGE in Microbial Ecology, 7.-10.6.1995, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Braunschweig, Deutschland Fox GE, Wisotzkey JD, Jurtshuk P. 1992. How close is close: 16S rRNA sequence identity my not be sufficient to guarantee species identity. Int. J. Syst. Bacteriol. 42, 166-170 Fry JC. 1988. Determination of biomass. In: Austin B (Ed.), Methods in aquatic bacteriology. Chap. 2, Wiley & Sons Ltd. Gamble TN, Betlach MR, Tieje JM. 1977. Numerically dominant denitrifying bacteria from world soils. Appl. Environm. Microbiol. 33, 926-939 Garland JL & Mills AL. 1991. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilizazion. Appl. Environm. Microbiol. 57, 2351-2359 Gavin JJ & Cummings DP. 1978. Enumeration of microorganisms. In: Laskin AI, Lechevalier HA (Eds.), CRC handbook of microbiology, CRC Press, United States. 727-736 Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt. 1992. Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt, 1992. Herausgeber: Landesamt für Umweltschutz Sachsen-Anhalt, Abteilung Wasserwirtschaft, Halle Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt. 1993. Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt, 1993. s.o. Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt. 1994. Gewässergütebericht Sachsen-Anhalt, 1994. s.o. 7-225 7-226 Literatur Ghiorse WC & Balkwill DL. 1981. Microbiological characterization of subsurface environments. First International Conference on Ground Water Quality Research, Houston, Texas, 6.-10.10.1981 Ghiorse WC & Balkwill DL. 1982. Microbiological characterization of subsurface environments. In: Ward CH, Giger W (Eds.), Proc. 1st Intl. Conf. on Groundwater Quality Research. Wiley Intersience Publishing Co, New York. 387-401 Gleick J. 1990. Chaos - Die Ordnung des Universums. Kap. 1. Der Schmetterlingseffekt. Knaur-Verlag München. 20-53 Gorlatov SN & Golovleva LA. 1992. Effect of cosubstrates on the dechlorination of selected chlorophenolic compounds by Rhodococcus erythropolis 1CP. J. Basic Microbiol. 32(3), 177-184 Gotoh O. 1983. Prediction of melting profiles and local helix stability for sequenced DNA. Adv. Biophys. 16, 1-52 Grimes DJ, Jacobs D, Swartz DG, Brayton PR, Colwell RR. 1993. Numerical taxonomy of gramnegative, oxidase-positive rods from carcharhinid sharks. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 88-98 Grimes DJ, Woese CR, MacDonell MT, Colwell RR. 1997. Systematic study of the genus Vogesella gen. nov. and ist type species, Vogesella indigofera comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriology. 47(1), 19-27 Gunkel W. 1964. Die Verwendung des Ultraturrax zur Aufteilung von Bakterienaggregaten in marinen Proben. Helgol. wiss. Meeresunters. 11, 287-295 Hanert HH, Harborth P, Lehmann M, Wind E, Rinkel U, Scheibel HJ, Hoppenheidt K, Rose H, Niemeyer T. 1990. Biologische Selbstreinigung in Böden und Grundwässern und ihre technische Nutzung in der Bodensanierung und Grundwasserreinigung. Verein zur Reinhaltung der Gewässer e.V. (Hrsg.), Claus-Druckerei u. Verlag, Braunschweig Hardman DJ, Gowland PC, Slater JH. 1986. Large plasmids from soil bacteria enriched on halogenated alkanoic acids. Appl. Environm. Microbiol. 51, 44-51 Hartung J & Elpelt B. 1984. Multivariate Statistik. Lehr- und Handbuch der angewandten Statistik. R. Oldenbourg Verlag, München Henriksen SD. 1976. Moraxella, Neisseria, Branhamella, and Acinetobacter. Ann. Rev. Microbiol. 30, 63-83 Herbes SE & Schwall LR. 1978. Microbial transformation of polycyclic aromatic hydrocarbons in pristine and petroleum-contaminated sediments. Appl. Environm. Microbiol. 35(2), 306-316 Herbert RA. 1990. Methods for enumerating microorganisms and determining biomass in natural environments. Methods in Microbiol. 19, 1-40 Heuer H, Krsek M, Baker P, Smalla K, Wellington EMH. 1997. Analysis of Actinomyces communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients. Appl. Environm. Microbiol. 63(8), 3233-3241 Higgins IJ & Burns RG. 1975. The chemistry and microbiology of pollution. Academic Press, London Höfle MG. 1990. RNA chemotaxonomy of bacterial isolates and natural microbial communities. In: Overbeck J, Chróst RJ (Eds). Aquatic microbial ecology: Biochemical and molecular approaches. Springer Verlag New York. 129-159 Holmes B, Popoff M, Kiredjian M, Kersters K. 1988. Ochrobactrium anthropi gen. nov., sp. nov. from human clinical specimens and previously known as group Vd. Int. J. Syst. Bacteriol. 38, 406-416 Hopwood DA & Chater KF (Eds). 1989. Genetics of bacterial diversity. Academic Press, London Hutson RA, Thompson DE, Collins MD. 1993. Genetic interrelationships of saccharolytic Chlostridium botulinum types B, E and F and related clostridia as revealed by small-subunit rRNA gene sequense. FEMS Microbiol. Lett. 108, 103-110 Literatur Huys G, Kersters I, Vancanneyt M, Coopman R, Janssen P, Kersters K. 1995. Diversity of Aeromonas sp. in Flemish drinking water production plants as determined by gas-liquid chromatographic analysis of cellular fatty acid methyl esters (FAME). J. Appl. Bacteriol. 78, 445-455 Jannasch HW & Jones GE. 1959. Bacterial populations in sea water as determined by different methods of enumeration. Limnology and Oceanography 4, 128-139 Jantzen E, Kuballa J, Wilken R-D. 1993. Muster zinnorganischer Verbindungen in der Elbe. Vom Wasser 80, 245-252 Jones JG. 1982. Activities of aerobic and anaerobic bacteria in lake sediments and their effect on the water colum. In: Sediment Microbiology. Nedwell DB & Brown CM (Eds.). Soc. General Microbiol. Academic Press, London New York. 107-145 Jones JG & Simon BM. 1975. An investigation of errors in direct counts of aquatic bacteria by epifluorescence microscopy, with reference to a new method for dyeing membrane filters. J. Appl. Bact. 39, 317-329 Jukes TH & Cantor CR. 1969. Evolution of protein molecules. In: Mammalian protein metabolism, Munro HN (Ed.), Academic Press, New York. 21-132 Kämpfer P. 1988. Automatisierte Charakterisierung mikrobieller Lebensgemeinschaften. Veröffentlichung aus dem Fachgebiet Hygiene der Technischen Universität Berlin und dem Institut für Hygiene der Freien Universität Berlin. 1. Dott W, Rüden H (Hrsg.), Berlin Kämpfer P. 1991. Application of miniaturized physiological tests in numerical classification and identification of some Bacilli. J. Gen. Appl. Microbiol. 37, 225-247 Kämpfer P. 1994. Limits and possibilities of total fatty acid analysis for classification and identification of Bacillus species. System. Appl. Microbiol. 17, 86-98 Kämpfer P & Dott W. 1988. Systematisierung der mikrobiologischen Untersuchung von Boden und Wasser. In: Thomé-Kozmiensky KJ (Ed), Altlasten. EF-Verlag für Energie- und Umwelttechnik, Berlin. 653-664. Kämpfer P, Feidieker D, Strechel S, Steiof M. 1988. Untersuchungen zum mikrobiellen Abbau von Kohlenwasserstoffen. Veröffentlichung aus dem Fachgebiet Hygiene der Technischen Universität Berlin und dem Institut für Hygiene der Freien Universität Berlin. 2 Kämpfer P, Tjernberg I, Ursing J. 1993. Numerical classification and identification of Acinetobacter genomic species. J. Appl. Bacteriol. 75, 259-268. Karlson U, Dwyer DF, Hooper SW, Moore ERB, Timmis KN, Eltis LD. 1993. Two independently regulated cytochromes P-450 in Rhodococcus rhodochrous strain that degrades 2-ethoxaphenol and 4-methoxybenzoate. J. Bact. 175, 1467-1474 Kersters K, Ludwig W, Vancanneyt M, De Vos P, Gillis M, Schleifer K-H. 1996. Recent changes in the classification of the Pseudomonads: An overview. Syst. Appl. Microbiol. 19, 465-477 Kinkel LL, Nordheim EV, Andrews JH. 1992. Microbial community analysis in incompletely or destructevely sampled systems. Microb. Ecol. 24, 227-242 Kiyohara H, Takizawa N, Nagao K. 1992. Natural distribution of bacteria metabolizing many kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Ferment. Bioengin. 74(1), 49-51 Klee O. 1991. Angewandte Hydrobiologie: Trinkwasser - Abwasser - Gewässerschutz. Thieme-Verlag, Stuttgart, New York Klingler JM, Stowe RP, Obenhuber DC, Groves TO, Mishra SK, Pierson DL. 1992. Evaluation of the Biolog automated microbial identification system. Appl. Environ. Microbiol. 58(6), 2089-2092 Kölbel-Boelke J, Tienken B, Nehrkorn A. 1988(a). Microbial communities in the saturated groundwater environment I: Methods of isolation and characterization of heterotrophic bacteria. Microb. Ecol. 16, 17-29 7-227 7-228 Literatur Kölbel-Boelke J, Anders E-M, Nehrkorn A. 1988(b). Microbial communities in the saturated groundwater environment II: Diversity of bacterial communities in a pleistocene sand aquifer and their in vitro activities. Microb. Ecol. 16, 31-48 Kosko B. 1994. Fuzzy thinking. Harper Collins Publishers. London Kuznetsov SI, Dubinia GA, Lapteva NA. 1979. Biology of oligotrophic bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 33, 377-387 Landesamt für Wasser und Abwasser Nordrhein-Westfalen. 1982. Fließgewässer. Richtlinie für die Ermittlung der Gewässergüteklasse. Düsseldorf Lane DJ. 1991. 16S/23S sequencing. In: Stackebrandt E & Goodfellow M (Eds.). Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Chichester. 115-175 Lerman LS & Silverstein K. 1987. Computational simulation of DNA melting and ist application to denaturing gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 155, 482-501 Ludwig W & Schleifer K H. 1994. Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis. FEMS Micobiol. Rev. 15, 155-173 Maidak BJ, Olsen GJ, Larsen N, Overbeek R, McCaughey MJ, Woese CR. 1996. The ribosomal RNA database project (RDP). Nucl. Acids Res. 24, 82-85 Manafi M & Kneifel W. 1990. Rapid methods for differentiating Gram-positive from Gram-negative aerobic and facultative anaerobic bacteria. J. Appl. Bacteriol. 69, 822-827. Marinell G. 1977. Multivariate Verfahren: Eine Einführung für Studierende und Praktiker. 1. Auflage, Oldenbourg Verlag, München, Wien Mau MK. 1997. 16S rDNA-Sequenzanalyse und Sondendesign zur Charakterisierung der Bakterienpopulation im Sediment eines hochbelasteten Gewässers. Dissertation 1996, Techn. Univ. Braunschweig. Cuvillier Verlag Göttingen Maynard Smith J. 1995. Do bacteria have population genetics? In: Baumberg S, Young JPW, Wellington EMH, Saunders JR (Eds.), Population genetics of bacteria. Cambridge University Press, Cambridge. 1-12 Meier A, Persing DH, Finken M, Böttger EC. 1993. Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implications for a general approach to detection of uncultured pathogens. J. Clin. Microbiol. 31(3), 646-652 Meyer JS, Marcus MD, Bergman HL. 1984. Inhibitory interactions of aromatic organics during microbial degradation. Environm. Toxicol. Chem. 3, 583-587 Mindestgüteanforderungen für Fließgewässer. 1986. Aus: Bewertung der Gewässerqualität und Gewässergüteanforderungen. Münchner Beiträge Abwasser, Fischerei- und Flußbiologie. Bd.40. Oldenbourg-Verlag, München, Wien Moore ERB, Mau M, Arnscheidt A, Böttger EC, Hutson RA, Collins MD, Van de Peer Y, De Wachter R, Timmis KN. 1996. The determination and comparison of the 16S rRNA gene sequences of species of the genus Pseudomonas (sensu stricto) and estimation of the natural intrageneric relationships. Sytem. Appl. Microbiol. 19, 478-492 Mullis KB & Faloona F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 Murray RGE, Brenner DJ, Colwell RR, De Vos P, Goodfellow M, Grimont PAD, Pfennig N., Stackebrandt E, Zavarin GA. 1990. Report of the Ad Hoc Committee on approaches to taxonomy within the Proteobacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 40, 213-215 Muyzer G, De Waal E, Uiterlinden AG. 1993. Profiling complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59, 695-700 Literatur Muyzer G & De Waal E. 1994. Determination of the genetic diversity of microbial communities using DGGE analysis of PCR-amplified 16S rRNA. In: Microbial Mats. Stal LJ, Caumette P (Eds.). NATO ASI Series. G35, 207-214 Muyzer G, Teske A, Wirsen CO, Jannasch HW. 1995. Phylogenetic relationships of Thiomicrospira species and their identification in deep-sea hydrothermal vent samples by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments. Arch. Microbiol. 164, 165-172 Myers RM, Maniatis T, Lerman LS. 1987. Detection and localization of single base changes by denaturing gel electrophoresis. Methods Enzymol. 155, 501-527 Newton CR & Graham A. 1994. PCR. BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford Nielson AH. 1990. A Review. The biodegradation of halogenated organic compounds. J. Appl. Bacteriol. 69, 445-470 Nikitin DI. 1973. Direct electron microscopic techniques for the observation of microorganisms in soil. In: Rosswell T (Ed.). Modern methods in the study of microbial ecology. Bull. Ecol. Re. Comm. (Stockholm). 17, 85ff Nöbauer W & Timischl W. 1979. Mathematische Modelle in der Biologie: Eine Einführung für Biologen, Mathematiker, Mediziner und Pharmazeuten. Vieweg, Braunschweig Nübel U, Engelen B, Felske A, Snaidr J, Wieshuber A, Amann RJ, Ludwig W, Backhaus H. 1996. Sequence heterogeneteis of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymyxa detected by temperature gradient gel electrophoresis. J. Bacteriol. 178(19), 5636-5643 O´Donnell AG, Goodfellow M, Hawksworth DL. 1994. Theoretical and practical aspects of the quantification of biodiversity among microorganisms. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 345, 65-73 Ogram AV & Sayler GS. 1988. The use of gene probes in the rapid analysis of natural microbial communities. J. Indust. Microbiol. 3, 281-292 Oleskin A & Samuilov VD. 1992. Technical bioenergetics and ecosystem biotechnology. J. Basic Microbiol. 32(2), 129-144 Olsen GJ, Lane DJ, Giovannoni SJ, Pace NR. 1986. Microbial ecology and evolution: A ribosomal RNA approach. Ann. Rev. Microbiol. 40, 337-365 Olsen BH & Tsai Y-L. 1992. Molecular approaches to environmental managment. Environm. Microbiol., Wiley-Liss. Inc. 239-263 Olsen GJ & Woese CR. 1993. Ribosomal RNA: A key to phylogeny. FASEB J. 7, 113-123 Pace NR, Stahl DA, Lane DJ, Olsen GJ. 1986. The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequences. Adv. Microbiol. Ecol. 8, 1-55 Palleroni NJ, Kunisawa R, Contopoulou R, Doudoroff M. 1973. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas. Int. J. Syst. Bacteriol. 23, 333-339 Palleroni NJ. 1984. Genus I. Pseudomonas Migula 1894, 141-199. In: Bergey´s manual of systematic bacteriology. Krieg NR & Holt JG, Eds., Vol. 1, Williams and Wilkins, Baltimore Palleroni NJ. 1997. Prokaryotic diversity and the importance of culturing. Antonie van Leeuwenhoek. 72, 3-19 Pelczar MJ Jr., Chan ECS, Krieg NR. 1986. Microbiology. 5th Edition, International Student Edition. McGraw-Hill Book Company, New York Pettigrew CA, Breen A, Corcoran C, Sayler GS. 1990. Chlorinated biphenyl minerilazation by individual populations and consortia of freshwater bacteria. Appl. Environm. Microbiol. 56, 2036-2045 Pike EB, Carrington EG, Ashburner PA. 1972. An evaluation of procedures for enumerating bacteria in activated sludge flocs. J. Appl. Bact. 33, 309-321 7-229 7-230 Literatur Poland D. 1974. Recursion relation generation of probability profiles for specific-sequence macromolecules with long-range correlations. Biopolymers. 13, 1859-1871 Pott B, Ludwig W, Kersters K, Schleifer K-H. 1994. Taxonomy of lactic acid bacteria. In: De Vuyst L, Vandamme EJ. Bacteriocins of lactic acid bacteria: Microbiology, genetics and applications. Blackie Academic & Professional, London. 13-90 Präve P, FAust U, Sittig W, Sukatsch DA. 1987. Basic biotechnology - A student´s guide. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim Priest F & Austin B. 1993. Modern bacterial taxonomy. 2nd Ed. Chapman & Hall, London Priest FG, Ramos-Cormenzana A, Tindall BJ (Eds). 1993. Bacterial diversity and systematics. FEMS Symposium No. 75. Plenum Press New York London Ramos DP, Foster G, Collins MD. 1997. Phylogenetic analysis of the genus Actinomyces based on 16S rRNA gene sequences: Description of Arcanobacterium phocae sp. nov., Arcanobacterium bernardiae comb. nov., and Arcanobacterium pyogenes comb. nov. Int. J. System. Bacteriol. 47(1), 46-53 Ramteke PW, Pathak SP, Gautam AR, Bhattacherjee JW. 1993. Association of Aeromonas caviae with sewage pollution. J. Environm. Sci. Health. A28, 859-870 Raymond RL, Jamison VW, Hudson HO. 1976. Beneficial stimulation of bacterial activity in groundwaters containing petroleum products. Water. 73(166), 390-404 Reasoner DJ & Geldreich EE. 1985. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl. Environ. Microbiol. 49(1), 1-7 Reichardt W. 1978. Einführung in die Methoden der Gewässerkunde. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1. Auflage Reichenbach H & Weeks OB (Eds.). 1981. The Flavobacterium-Cytophaga-Group. Proceedings of the International Symposium on yellow-pigmented gram-negative bacteria of the Flavobacterium-Cytophaga-Group. Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH Braunschweig-Stöckheim. Verlag Chemie, Weinheim Riesner D, Henco K, Steger G. 1991. Temperature-gradient gel electrophoresis: A method for the analysis of conformational transitions and mutations in nucleic acids and proteins. Advances in Electrophoresis. 4, 169-250 Rölleke S, Muyzer G, Wawer C, Wanner G, Lubitz W. 1996. Identification of bacteria in a biodegraded wall painting by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Appl. Environm. Microbiol. 62(6), 2059-2065 Rohmann U. 1988. Technische Maßnahmen zur Nitratentfernung aus dem Trinkwasser. Veröffentlichung zum Vortrag anläßlich der 21. Essener Tagung 9.-11.3.88 Rosswall T & Kvillner E. 1978. Principal-components and factor analysis for the description of microbial populations. In: Alexander M (Ed.). Advances in microbial ecology. Vol. 2, Plenum Press, New York, London Ruimy R, Riegel P, Boiron P, Monteil H, Christen R. 1995. Phylogeny of the genus Corynebacterium deduced from analyses of small-subunit ribosomal DNA sequences. Int. J. System. Bacteriol. 45(4), 740-746 Scheuermann PR, Schmidt JP, Alexander M. 1988. Factors affecting the survival and growth of bacteria introduced into lake water. Arch. Microbiol. 150, 320-325 Schink B. 1989. Mikrobielle Lebensgemeinschaften in Gewässersedimenten. Naturwissenschaften. 76, 364-372 Schlegel HG. 1981. Allgemeine Mikrobiologie. 5.Auflage, Thieme, Stuttgart, New York Schmider F. 1985. Denitrifizierende Mikroflora in Kläranlagen und Gewässern. Stuttgarter Berichte zur Siedlungswasserwirtschaft, Band 88. Kommissionsverlag R. Oldenbourg, München Literatur Schmider F &Ottow JCG. 1981. Quantitative Differenzierung der denitrifizierenden Flora in unterschiedlich belasteten Biotopen (Gewässer, Böden und Abwasser). Landwirtschaftliche Forschung. Zeitschrift des Verbandes Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten. Sonderheft 38. Kongreßband 1981. JD Sauerländer´s Verlag, Frankfurt. 667-677 Schönborn W. 1992. Fließgewässerbiologie. Gustav Fischer Verlag, Jena, Stuttgart Schröter W, Lautenschläger K-H, Bibrack. 1982. Chemie - Fakten und Gesetze. VEB Fachbuchverlag, Leipzig Segers P, Vandamme P, Steyn PL, Mannheim W, Willekens H, Bauwens M, De Ley J, Kersters K. 1993. Phylogenetic studies of Flavobacterium and related organisms by DNA-rRNA hybridizations. In: Jooste PJ (Ed.). Advances in the taxonomy and significance of Flavobacterium, Cytophaga and related bacteria. University of the Orange Free State Press, Bloemfontein, South Africa. 129-136 Seiler H. 1973. Beurteilung von Kläranlagen durch Bakterienanalytik. 3. Symp. Tech. Mikrobiol. Berlin. 255-260 Seiler H & Busse M. 1978. Die mikrobielle Entlastung eines Vorfluters duch Inbetriebnahme einer biologischen Klärstufe. Forum Städte Hygiene. 29, 169-173 Seppänen H & Wihuri H (Eds.). 1988. Groundwater microbiology: Problems and biological treatment. Proceedings of an IAWPRC Symposium held in Kuopio, Finland, 4-6 August 1987. Water Sci. Technol. 20(3) Sheffield VC, Cox DR, Lerman LS, Myers RM. 1989. Attachment of a 40-base-pair G + C rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 232-236 Sneath PHA & Sokal RR. 1965. Numerical taxonomy. The principles and practice of numerical classification. W.H. Freeman Company, USA, San Francisco Sneath PHA & Sokal RR. 1973. Numerical taxonomy. W.H. Freeman Company, USA, San Francisco Sneath PHA. 1974. Phylogeny of microorganisms. In: Evolution in the microbial world. 24th Symposium of the Society for General Microbiology, held at Imperial College London April, 1974, Cambridge University Press, London Soeder CJ. 1988. Biologische Abwasserreinigung und biologische Trinkwasseraufbereitung. In: Forschungsergebnisse und ihre Anwendung 1988. Kernforschungsanlage Jülich GmbH, Institut für Biotechnologie Sokal RR & Sneath PHA. 1963. Principles of numerical taxonomy. WH Freeman, San Francisco Sommer K & Ottow JCG. 1985. Denitrifikation mit Cellulose als einzigem Wasserstoffdonator. Z. Allg. Mikrobiol. 25 Spott D. 1995. Zur Entwicklung der Wasserbeschaffenheit der mittleren Elbe. Wasserwirtschaft - Wassertechnik Stackebrandt E. 1985. Phylogeny and phylogenetic classification of procaryotes. In: Schleifer KH & Stackebrandt E (Eds.). Evolution of prokaryotes. Academic Press, London. 309-334 Stackebrandt E. 1988. Phylogenetic relationships vs. phenotypic diversity: how to achieve a phylogenetic classification system to the Eubacteria. Can. J. Microbiol. 34, 552-556 Stackebrandt E, Goebel BM. 1994. Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 846-849 Stackebrandt E, Koch C, Gvozdiak O, Schumann P. 1995. Taxonomic dissection of the genus Micrococcus: Kocuria gen. nov., Nesterenkonia gen. nov., Kytococcus Dermacoccus gen. nov., and Micrococcus Cohn 1872 gen. emend. Int. J. System. Bacteriol. 45(4), 682-692 7-231 7-232 Literatur Stackebrandt E & Rainey FA. 1995. Partial and complete 16S rDNA sequences, their use in generation of 16S rDNA phylogenetic trees ands their implications in molecular ecological studies. Mol. Microb. Ecol. Man. 3.1.1, 1-17. Stahl DA, Devereux R, Amann RI, Flesher B, Lin C, Stromley J. 1989. Ribosomal RNA based studies of natural microbial diversity and ecology. In: Hattori T, Ishida Y, Maruyama Y, Morita TY, Uchida A (Eds). Recent advances in microbial ecology. Japan Scintific Societies Press, Tokyo Stahl DA & Kane MD. 1992. Methods of microbial identification, tracking and monitoring function. Curr. Opin. Biotechnol. 3, 244-252. Staley JT. 1974. Diversity of aquatic heterotrophic bacterial communities. Aquatic microbial ecology. 321-323 Staley JT & Konopka A. 1985. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol.39, 321-346 Statusbericht BMFT. 1995. Die Belastung der Elbe-Nebenflüsse mit Schadstoffen. Erste Ergebnisse. Statusberichte 1994 der vom Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie (BMFT) geförderten Elbe-Nebenflüsse Verbundvorhaben. Herausgeber: Forschungszentrum Karslruhe GmbH, Projektträger Wassertechnologie und Schlammbehandlung (PtWT), Karlsruhe. Stetzenbach D, Kelley LM, Sinclair NA. 1986. Isolation, identification, and growth of well-water bacteria. Ground Water. 24(1), 6-10 Stevens AM, Shoemaker NB, Li L-Y, Salyers AA. 1993. Tetracycline regulation of genes on Bacteroides conjugative transposons. J. Bacteriol. 175, 6134-6141 Streit, B. 1980. Ökologie: Ein Kurzlehrbuch. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York Su J-J & Kafkewitz D. 1994. Utilization of toluene and xylenes by a mitrate-reducing strain of Pseudomonas maltophilia under low oxygen and anoxic conditions. FEMS Microbiol. Ecol. 15, 249-258 Suggs SV, Hirose T, Miyake T, Kawashima EH, Johnson MJ, Itakura K, Wallace RB. 1981. Use of synthetic oligodeoxynucleotides for the isolation of specific cloned DNA sequences. In: Brown D, Fox CF (Eds.), Developmental biology using purified genes, Academic Press, New York. 638-693 Sussman M, Collins CH, Skinner FA, Stewart-Tull DE (Eds). 1988. The release of genetically-engineered micro-organisms. Academic Press, London, 77-88 Swings J & Hayward AC. 1989. Taxonomy. Chapter I.6. In: Klement Z, Rudolf K, Sands DC (Eds.). Methods in phytobacteriology. Akademiai Kiado, Budapest Swings J. 1993. IUBS, IUMS, Scope Workshop, August 1993. In: Priest FG, Ramos-Cormenzana A, Tindall BJ (Eds). Bacterial diversity and systematics. FEMS Symposium No. 75. Plenum Press New York London. 302 Tesar M, Hoch C, Moore E, Timmis KN. 1996. Westprinting: Development of a rapid immunochemical identification for species within the genus Pseudomonas sensu stricto. System. Appl. Microbiol. 19, 577-588 Teske A, Wawer C, Muyzer G, Ramsing NB. 1996. Distribution of sulfate-reducing bacteria in a stratified fjord (Mariager Fjord, Denmark) as evaluated by most-probable-number counts and denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified ribosomal DNA fragments. Appl. Environm. Microbiol. 62(4), 1405-1415 Tibayrenc M. 1996. Towards a unified evolutionary genetics of microorganisms. Annu. Rec. Microbiol. 50, 401-429 Tindall BJ. 1994. Chemical analysis of archaea and bacteria: A critical evaluation of ist use in taxonomy andidentification. In: Priest FG, Ramos-Cormenzana A, Tindall BJ (Eds). Bacterial diversity and systematics. FEMS Symposium No. 75. Plenum Press New York London. 243-258 Literatur Umweltbundesamt (Hrsg.). 1992. Ökologisches Sanierungs- und Entwicklungskonzept. Leipzig / Bitterfeld / Halle / Merseburg. Band A1: Umweltbereiche, Umweltforschungsplan des Bundesministers für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit - Luftreinhaltung - Forschungsbericht 104 02 803, UBA-FB 92-030/2. Umweltbundesamt Berlin Van der Meer JR. 1992. Molecular mechanisms of adaptation of soil bacteria to chorinated benzenes. Proefschrift, Landbouwuniversiteit te Wageningen. Van der Meer JR, De Vos WM, Harayama S, Zehnder AJB. 1992. Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobiotic compounds. Microbiol. Review. 56(4), 677-694 Van Landschoot A, Rossau R, De Ley J. 1986. Intra- und intergeneric similarities of the ribosomal ribonucleic acid cistrons of Acinetobacter. Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 150-160 Vandamme P, Pot B, Gillis M, De Vos P, Kersters K, Swings J. 1996. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev. 60(2), 407-438 Wallnöfer PR & Engelhardt G. 1984. Aromatic and heterocyclic structures. Biotechnology. Verlag Chemie, Weinheim. 277-237 Watve Mg, Gangal RM. 1996. Problems in measuring bacterial diversity and a possible solution. Appl. Environm. Microbiol. 62(11), 4299-4301 Wawer C & Muyzer G. 1995. Genetic diversity of Desulfovibrio spp. in environmental samples analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis of [NiFe] hydrogenase gene fragments. Appl. Environm. Microbiol. 61(6), 2203-2210 Wayne LGD, Brenner DJ, Colwell RR, Grimont PAD, Kandler O, Krichevsky MI, Moore LH, Moore WEC, Murray RGE, Stackebrandt E, Starr MP, Truper HG. 1987. Report of the Ad Hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics. Int. J. Syst. Bacteriol. 37, 463-464 Wilken R-D, Christiansen H, Fanger H-U, Greiser N, Haar S, Puls W, Reincke H, Spott D, Vollmer M. 1991. Fakten und Hypothesen zum Schwebstoff- und Schadstofftransport in der Elbe. Vom Wasser. 76, 167-189 Wilken M, Cornelsen B, Fabarius G, Jager J. 1993. Bodenbelastung mit halogenorganischen Schadstoffen im Raum Bitterfeld / Wolfen. In: Hille, Ruske, Scholz, Walkow (Hrsg.). Schadstoffe und Umwelt. Bitterfeld. Modellhafte ökologische Bestandsaufnahme einer kontaminierten Industrieregion Beiträge der 1. Bitterfelder Umweltkonferenz. Erich Schmidt Verlag. 133-179 Wilken R-D, Kuballa J, Jantzen E. 1994. Organotins: their analysis and assessment in the Elbe river system, Northern Germany. Fresenius J. Anal. Chem. 350, 77-84 Willems A, Goor M, Thielemans S, Gillis M, Kersters K, De Ley J. 1992. Transfer of several phytopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov., comb. nov., Acidovorax avenae subsp. citrulli, Acidovorax avenae subsp. cattleyae, and Acidovorax konjaci. Int. J. Syst. Bacteriol. 42(1), 107-119 Williams ST & Gray TRG. 1973. General principles and problems of soil sampling. In: Board RG, Lovelock DW (Eds.). Sampling - Microbiological monitoring of environments. Soc. Appl. Bacteriol. Techn. Ser. 7, 111-121 Wilson JT, McNabb JF, Balkwill DL, Ghiorse WC. 1983. Enumeration and Characterization of bacteria indigenous to a shallow water-table aquifer. Ground Water. 21(2), 134-142 Woese CR, Stackebrandt E, Macke TJ, Fox GE. 1985. A phylogenetic definition of the major eubacterial taxa. System. Appl. Microbiol. 6, 143-151 Woese C R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, 221-271 Yokota A, Takeuchi M, Sakane T, Weiss N. 1993. Proposal of six new species in the genus Aureobacterium and transfer of Flavobacterium esteroaromaticum Omelianski to the genus Aureobacterium as Aureobacterium esteroaromaticum comb. nov. Int. J. System. Bacteriol. 43(3), 555-564 7-233 7-234 Literatur Zuckerkandl E & Pauling L. 1965. Molecules as documents of evolutionary history. J. Theor. Biol. 8, 357-366 Anhang 8 Anhang 8.1 Medien Verwendet wurden Medien der Fa. Merck, Chemikalien der Fa. Sigma und Fluka. Feste Medien werden mit Agar Agar oder mit Gelrite Gellan Gum (Kelco Division of Merck & Co., Inc, CA) hergestellt. Gelrite ist ein hochreines, natürliches anionisches Heteropolysaccarid, daß von Bakterien nicht abgebaut wird und daher insbesondere zur Anreicherung von Bakterien auf Minimal-Medium geeignet ist. Soweit nicht anders angegeben werden die Medien bei 121°C 20 min. autoklaviert. 8.1.1 Komplexmedien Nährbouillon (NB / NB10 / NA) 5.0 g 3.0 g ad 1 l Pepton Fleischextrakt Aqua dest. Festes Medium (NA): 15 g Agar/l, bzw. 1 g MgSO4 x 7 H2O und 7.5 g Gelrite hinzufügen. Für Vorversuche zur Bestimmung optimaler Wuchsmedien wurde NB 1:10 verdünnt (N10). Reasoner-2-Medium (R2 / R2A) Medium nach Reasoner & Geldreich [1985]. Primär entwickelt zur Kultivierung und quantitativen Bestimmung von nicht-coliformen Bakterien in natürlicherweise oligotrophen (“nahrungsarmen”) Gewässern. 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.3 0.3 0.05 ad 1 g g g g g g g g l Hefeextrakt Proteose Pepton Casaminosäuren D(+)Glukose Stärke, löslich Na-Pyruvat K2HPO4 MgSO4 x 7 H2O Aqua dest. pH 7.2 Festes Medium (R2A): 15 g Agar/l, bzw. 1 g MgSO4 x 7 H2O und 7.5 g Gelrite hinzufügen. 8-235 8-236 Anhang 8.1.2 Sediment-Extrakt-Medien Medium nach Williams & Gray [1973] Sediment-Extrakt (SE) 500 g Oberflächen-Sediment 250 ml Aqua dest. Autoklavieren bei 121°C, 45 min. In Portionen über GF/F-Filterpapier und mehrere Lagen Mull abfiltrieren. pH-Wert bestimmen. Ein zweites mal Autoklavieren bei 121°C, 20 min. Festes Medium (SA): SE 1:1 mit Aqua dest. verdünnen, 15 g Agar/l bzw. 1 g MgSO4 x 7 H2O und 7.5 g Gelrite hinzufügen, bei 121°C, 20 min. autoklavieren. Für Vorversuche zur Bestimmung optimaler Wuchsmedien wurde SE unverdünnt (2S), 1:3 mit Aqua dest. verdünnt (S4), 1:3:4 mit Aqua dest. und NB (NS), N10 (N10S), R2 (RS) oder Minimalmedium (MS) verdünnt zur Produktion von Festmedien verwendet. Reasoner-2-Medium mit Sediment-Extrakt (RS) Alternativ für NB zur Flüssigkultur von SA-Isolaten verwendet. 125 ml Sediment-Extrakt 500 ml R2 ad 1 l Aqua dest. Reasoner-2-Medium mit Sediment-Extrakt und Nähr-Bouillon (RNS) Alternativ für NB zur Flüssigkultur von SA-Isolaten verwendet. 125 ml SE 500 ml R2 375 ml N10 8.1.3 Xenobiotika-Minimal-Medien 20xPufferlösung 140 g 20 g ad 1 l pH 7.2 - 7.4 Na2HPO4 x 12 H2O KH2PO4 Aqua dest. Anhang 100xSalzlösung 50 10 0.5 50 ad 400 g g g ml ml (NH4)2SO4 MgSO4 x H2O Ammonium-Fe(III)-Citrat, grün Spurenelementlösung Aqua dest. 2.5 g Ca(NO3)2 in 100 ml Aqua dest. getrennt lösen und autoklavieren, hinzufügen. Spurenelementlösung nach Pfennig 1.3 70 100 62 190 17 24 36 ad 1 ml mg mg mg mg mg mg mg l 25% HCl ZnCl2 MnCl2 x 4 H2O H3BO3 CoCl2 x 6 H2O CuCl2 x 2 H2O NiCl2 x 6 H2O NaMoO4 x 2 H2O Aqua dest. H2O-Agar 7.5 g 0.6 g ad 1 l Gelrite MgSO4 x 7 H2O Aqua dest. oder: 20 g ad 1 l Agar Aqua dest. Autoklavieren und direkt verarbeiten - kann nicht wieder erwärmt werden. Minimal-Agar 10 ml 100x Salzlösung 100 ml 20x Pufferlösung Die Lösungen werden steril mit heißem H2O-Agar ad 1 l gemischt und Platten gegossen. 8.1.3.2 Xenobiotika-Mischplatten (4CS, 5CS, 24D, 3CB, βHN) 10 ml 100x Salzlösung 100 ml 20x Pufferlösung Sowie eines der folgenden Xenobiotika: 8-237 8-238 Anhang 20 20 40 4 8 ml ml ml ml ml 100 mM 4-ChlorSalicylat (4CS) 100 mM 5-ChlorSalicylat (5CS) 50 mM 2,4-DiChlorPhenoxyEssigsäure (24D) 500 mM 3-ChlorBenzoat (3CB) 250 mM β-HydroxyCarboxyNaphthalin (βHN) Die Lösungen werden steril mit heißem H2O-Agar ad 1 l gemischt und Platten gegossen. 8.1.3.3 Xenobiotika-Verdunstungsplatten (Etb, Tol, oXy, mXy, pXy, Bip, Nap) Pro Platte wurde eines der folgenden Xenobiotika appliziert: 20 µl 50 µl 20 µl 20 µl 20 µl ca. 30 mg ca. 30 mg Ethylbenzol, >99.9% Toluol, >99.5% o-Xylol, >99% (Etb) (Tol) (oXy) m-Xylol, >99% p-Xylol, >99% Biphenyl, >98% Naphthalin, >98% (mXy) (pXy) (Bip) (Nap) Bei Raumtemperatur flüchtige Xenobiotika werden in den Deckel von Minimal-Agar-Platten (Petrischalen) gegeben und diese, mit Parafilm verschlossen über Kopf unter dem Abzug gelagert. Flüssige Xenobiotika werden mit gelben Eppendorf-Pipettenspitzen aufgezogen, kurz durch die offene Flamme gezogen und dann in den Deckel gelegt. 8.1.3.4 Anthracen-Gußplatten (Ant) 200 µl 1% Anthracen in Aceton Die Lösung wird mit dem Drigalski-Spatel auf H2O-Agar ausgestrichen, das Acteon bei Raumteperatur ausdampfen lassen. Die Platten werden direkt mit der Öse beimpft oder (zur Isolation) nach dem Koch´schen-Plattengußverfahren mit einem Aliquot der Probe, gemischt mit 12 ml 40°C warmen H2OAgar, überschichtet. 8.2 Stammlösungen und Puffer für molekularbiologische Arbeiten TE Puffer 1 ml 1 M Tris, pH 8 200 µl 0.5 M EDTA, pH 8 ad 100 ml Aqua dest. Für den Gebrauch 1:100 verdünnen auf 10 mM Tris, 1 mM EDTA. Anhang 10x TBE-Laufpuffer für Sequenzierung, Stammlösung Verwendet werden ausschließlich Chemikalien der Fa. BioRad, München. 108 8.3 55 ad 1 g g g l Tris Na2EDTA x 2 H2O NaBorat Aqua dest. Für den Gebrauch 1:10 verdünnen. 50x TAE-Laufpuffer für Agarose-Gelelektrophorese, Stammlösung 242 57.1 100 ad 1 g ml ml l Trisbase Eisessig 0.5 M EDTA, pH 8 Aqua dest. Für den Gebrauch 1:50 verdünnen. 5x Ladepuffer für Agarose-Gelelektrophorese 25 25 5 1 4 mg mg ml ml ml Bromphenolblau (0.25% w/v) Xylencyanol (0.25% w/v) Glycerin (50% w/v) 50x TAE-Puffer (5x) Aqua dest. 50x MOPS-Laufpuffer für TGGE, Stammlösung 104,64 g 3-MorpholinoPropanSulfonsäure, freie Säure >99% (Fluka) 50 ml 0.5 M EDTA, pH 8 ad 500 ml Aqua dest. Für den Gebrauch 1:50 verdünnen. 10x Ladepuffer für TGGE 5 mg Bromphenolblau (0.05% w/v) 5 mg Xylencyanol (0.05% w/v) 10 ml 10x MOPS-Puffer Acrylamid (60:1) für TGGE-Gele Verwendet werden ausschließlich Chemikalien der Fa. BioRad, München. 1 g 60 g NN´MethylenBisAcrylAmid AcrylAmid 8-239 8-240 Anhang in 120 ml Aqua dest. lösen 30 min. mit 1 Teelöffel Amberlite MB-1 Ionentauscher (Sigma, Deisenhofen) rühren. Ionenaustauscher und ungelöste Teilchen über Nalgene-Filter (0.2 µm ∅ Poren) abfiltrieren und auf 200 ml mit Aqua dest. auffüllen. Lagerung bei 4°C, dunkel - maximal 3 Monate haltbar. Deionisiertes Formamid Formamid mit Amberlite MB-1 Ionenaustauscher (Sigma, Deisenhofer) eine Stunde rühren. Ionenaustauscher durch einen Faltenfilter abfiltrieren. Lagerung aliquotiert à 200 µl bei -20°C. Acrylamid (19:1) für Sequenzierungs-Gele Verwendet werden ausschließlich Chemikalien der Fa. BioRad, München. 4 g BisAcrylAmid 76 g AcrylAmid in 120 ml Aqua dest. lösen 30 min. mit 1 Teelöffel Amberlite MB-1 Ionentauscher (Sigma, Deisenhofen) rühren. Ionenaustauscher und ungelöste Teilchen über Nalgene-Filter (0.2 µm ∅ Poren) abfiltrieren und auf 200 ml mit Aqua dest. auffüllen. Lagerung bei 4°C, dunkel. Lade-Lösung für Sequenzierungsgele 200 µl 50 µl deionisiertes Formamid 50 mM EDTA, pH 8 Lagerung bei 4°C - einige Tage haltbar. Anhang 8.3 Feldprotokoll Datum: __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Uhrzeit: __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Ort: __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Gewässer: __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Probenahme durch: __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Physiographische Verhältnisse Wetter Regen kein vorher keine schwach wechselnd stark 1-2 2-5 5-10 10-20 >20 <0.1 0.1-0.3 0.3-0.5 0.5-1.0 >1 Bewölkung während Hydrologische Daten Breite [m] 1 Tiefe [m] Strömung keine ruhig fließend fließend mit Turbulenz turbulent sehr turbulent geschätzte Strömungsgeschwindigkeit [m/s] <0.2 0.2-0.4 0.4-0.8 >0.8 Wasserführung keine gering normal stark Trübung keine schwach mittel stark Wasserfarbe Geruch unauffälllig unauffälllig auffällig... nach Abwasser chemisch Schaumbildung keine Substratverhältnisse Fels Platten vorherrschend = 1 Geröll Lehm Überwasserpfl. __ __ __ __ __ __ Kies Sand Schwimmblattpfl. __ __ __ __ __ __ __ Faschinen Steinschüttungen Gestein Kalk Torf Holz Schlamm Fallaub Steinpflaster Sandstein und Grauwecke Tonschiefer besiedlungsfeindliche Faktoren Verunreinigungen Hausmüll Reduktionserscheinungen Gewerbemüll Bauschutt Faulschlamm [% der Fläche] keine stark spärlich = 3 Baumwurzeln Moose Fadenalgen __ __ __ __ __ __ __ __ _ Rasenkammersteine Beton Lockergestein ... Eisenocker Sandtreiben Pflanzenabfälle Rohabwasser nicht vorhanden Schwarzfärbung der Steinunterseiten Beschattung (im Mittel) schwach untergeordnet = 2 Unterwasserblütenpfl. __ __ __ __ __ __ __ __ Steinstickung nach H2S keine schwach ≤25 ≤50 >50 teilweise überall mittel stark 8-241 8-242 Anhang Messungen Parameter Wassertemperatur Lufttemperatur pH Wert (bei _ _ _ _ °C) Elektrische Leitfähigkeit (bei 25°C) gelöster Sauerstoff Basenkapazität (Acidität), Umschlag bei pH 4.3 = - m Wert pH 8.2 = - p Wert Säureapazität (Alkalität), Umschlag bei pH 4.3 = + m Wert pH 8.2 = + p Wert Gesamthärte Ammonium Nitrit Nitrat Sulfat Phosphat, gelöst Meßwert Meßbereich / Nachweisgrenze °C °C mS/cm mg/l mmol/l mmol/l °dH mmol/l mmol/l mmol/l Ca mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 0.1 mmol/l 0.1 mmol/l 0.1 mmol/l 1°dH 0.178 mmol/l Ca 0.2-8.0 mg/l / 0.2-3 mg/l 0.005-0.1 mg/l / 0.005-0.02 mg/l 5-140 mg/l / 5-20 mg/l 25-300 mg/l / 25-100 mg/l 0.02-0.4 mg/l / 0.02-0.1 mg/l Probenahme Art und Zweck der Probenahme Konservierungsmaßnahmen Kennzeichnung Bemerkungen __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Danksagung Danke Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. K.N. Timmis der die Durchführung der vorliegenden Arbeit bei der Gesellschaft für biotechnologische Forschung GmbH in der Abteilung Mikrobiologie ermöglichte. Dr. Edward R. B. Moore danke ich für die Unterstützung des interessanten Themas und seine Betreuung. Dr. M. Vancanneyt danke ich besonders für die freundliche Unterstützung, seinen Mitarbeitern im Laboratorium voor Microbiologie der Universiteit Gent, Belgien und Ingrid Brümmer für die Durchführung der FAME-Analysen. Hartelijk dank voor u moeite. Für ihre Kollegialität und Mithilfe, für die mir entgegengebrachte Freundschaft, danke ich allen Mitstreitern in der Abteilung Mikrobiologie. Besonders hervorheben möchte ich unser Labor D.008, Angelika Arnscheidt und Annette Krüger sowie Susanne Baumgarte, Heike Haas und Margit Mau. Letztere haben der ermüdenden Lektüre des Manuskriptes so manche Stunde geopfert und erheblich zur endgültigen Form dieser Arbeit beigetragen.
