ELISA - Laborbericht
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Praktikumsbericht ELISA Manuela Berger 11. Januar 2010 ELISA – IMMUNBIOLOGIE FRAGE- UND PROBLEMSTELLUNG In diesem Praktikum wurde ELISA (enzyme-linked immunsorbent assay) kennengelernt. Ein Test, der angewendet wird um Antigene festzustellen. In diesem Test werden Antigen-Antikörper-Komplexe ausserhalb des Körpers eingesetzt (mehr zu diesen ist in der Versuchsanleitung nachzulesen). Anhand der im Praktikum gewonnenen Kenntnisse sollte schlussendlich auch klar sein, wie das Vorhandensein eines bestimmten Antikörpers im Blut eines Patienten einen Hinweis auf eine bestehende Krankheit geben kann. VERWENDETE MATERIALIEN UND GERÄTSCHAFTEN Gerätschaften: - Plastikpipetten - 12-well Streifen - Mikrolitterpipette 50µl - viel saugfähiges Papier Materialien: - Körperflüssigkeit (in gelbem Eppendorfröhrchen) - positiv Kontrolle (in violettem Eppi) - negativ Kontrolle (in blauem Eppi) - Waschpuffer (in Becherglas) - Primärantikörper / PA / primary antibody (in grünem Eppi) - Sekundärantikörper / SA / secondary antibody (in orangem Eppi) - Enzym Substrat / SUB / enzyme substrate (in braunem Eppi) DISKUSSION AUSTAUSCH VON KÖRPERFLÜSSIGKEITEN Jeder Praktikumsteilnehmer erhält sein persönliches Eppi, das die Körperflüssigkeit enthält. An diesem Praktikum haben zwölf Leute teilgenommen. Eine oder mehrere dieser Körperflüssigkeiten enthält das Antigen, das mit ELISA zu detektierenden ist. Die Person ist also krank. Der Austausch von Körperflüssigkeiten läuft in 3 „Etappen“ ab. Man mischt seine eigene Körperflüssigkeit jeweils mit einem anderen Praktikumsteilnehmer. Dadurch infizieren sich noch mehr Leute mit dem Virus. 1 Praktikumsbericht ELISA Manuela Berger 11. Januar 2010 ELISA ELISA ist, wie schon erwähnt, ein Test um Antigene festzustellen. Der Wirkungsprozess von ELISA ist in der Versuchsanleitung unter „Einleitung ELISA“ schon sehr ausführlich erklärt. Um dies noch zu unterstreichen, hier eine Grafik: FRAGEN Was ist ein Antigen-Antikörper-Komplex? Es ist eine spezifische Bindung zwischen einem Antikörper und dem Antigen, welches er erkennt. Ein Antikörper enthält zwei Bindungsstellen für Antigene und auch Antigene können an mehrere Antikörper binden. Wie verläuft eine Immunreaktion? Man unterteilt sie in vier Phasen. In der Erkennungsphase nehmen die Makrophasen die „Eindringlinge“ auf und bearbeiten die Antigene, die anschliessend präsentiert werden. Dadurch werden die entsprechenden T-Helferzellen aktiviert, was wiederum die Vermehrung der T-Lymphozyten (Killerzellen) vorantreibt. In der Differenzierungsphase kommt es zu einer vermehrten Teilung der Killerzellen, es entwickeln sich antikörperbildende Plasmazellen und es entstehen Gedächtniszellen. Während der Wirkungsphase reagieren die spezifischen Antikörper mit den Antigenen und es entstehen Immunkomplexe. Diese Immunkomplexe werden von den Killerzellen gesichtet und vernichtet. Die Abschaltphase ist die Phase in der die Immunreaktion unterdrückt wird und alle Antigene beseitigt sind. Dadurch werden auch keine Antikörper mehr produziert und nach einiger Zeit abgebaut. Bei einem wiederholten Kontakt mit den Antigenen kommt es aufgrund der vorhandenen Gedächtniszellen zu einer schnellen und vermehrten Produktion von Antikörpern. Die Immunreaktion ist heftiger und verläuft über einen längeren Zeitraum. (Informationsquelle: http://www.sn.schule.de/~biologie/lernen/genetik/imun.html ) Was passiert beim Impfen? Es gibt zwei verschiedene Arten zu Impfen. Bei der passiven Methode werden Antikörper ins Blut gespritzt. Dieser „vernichten“ die präsenten Antigene mithilfe eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Mit der aktiven Impfmethode verursacht man die Bildung von körpereigenen Antikörpern durch das Spritzen eines abgeschwächten Erregers oder einer kleineren Menge des Erregers. Gleichzeitig mit der Bidlung von Antikörpern entstehen auch Gedächtniszellen, sodass bei erneutem Kontakt mit der Krankheit die Immunantwort schneller erfolgt. Wie können Krankheiten übertragen werden? Durch den Austausch von Körperflüssigkeiten (Blut, Speichel, Tröpfchen, Schleim, etc) oder aber durch Vererbung. Was kann das Immunsystem davon abhalten, korrekt zu arbeiten? Viren sind eine häufige Ursache für Immunschwächen. Sie können die Bildung von Antikörpern gegen eine Bedrohung stoppen oder sogar umkehren. Das leider berühmteste Beispiel hierfür: AIDS! 2 Praktikumsbericht ELISA Manuela Berger 11. Januar 2010 Wieso sind Immunsuppressoren (Medikamente) notwendig, wenn jemand eine Organtransplantation erhält? Weil der eigene Körper resp. das Immunsystem das neue Körperteil als Eindringling identifizieren würde und beginnen würde es zu bekämpfen/abzustossen. Das hätte fatale Folgen für den Patienten. Durch die Immunsuppressoren wird die Produktion von Antikörpern verhindert und somit auch die Gefahr für den Patienten gehemmt. Wieso ist es sinnvoll, wenn die Exposition gegenüber einem Krankheitserreger so rasch wie möglich entdeckt wird? Durch frühes Entdecken des Krankheitserregers werden früher Antikörper gebildet und die Krankheit kann schon vor ihrem Ausbruchshöhepunkt bekämpft werden. Wieso werden beim ELISA Enzyme genutzt? Enzyme katalysieren die Reaktion. Wozu dienen positive und negative Kontrollen? Um sicher zu gehen, dass die Färbung der Proben auch wirklich bedeutet, dass man infiziert resp. nicht infiziert ist. Funktioniert dies schon bei den Kontrollen nicht, so ist ein Schritt während ELISA fehlgeschlagen und der Versuch muss wiederholt werden. In welchen Fällen treten falsch-Positive und falsch-Negative Ergebnisse auf? Sobald einer der Schritte während ELISA nicht richtig ablief. Zum Beispiel wenn nicht genug vorsichtig gearbeitet wurde und „infizierte“ Pipetten in „nicht-infizierte“ Flüssigkeiten gegeben wurden etc. AUFGABEN 1) Das Kunststoffgefäss bindet innerhalb der Wartezeit (5min) die Proteine. Da Antigene meist auch Proteine sind, werden sie auch ans Gefäss gebunden. 2) Der Waschpuffer hat die Funktion, das Gefäss von allem unnötigen zu säubern, d.h. von allen Proteinen, die keine Antigene sind. Es muss also ein Stoff enthalten sein, der an die „NichtAntigene“ bindet und diese somit vom Kunststoffgefäss lösen. 3) Wenn das Antigen des Grippevirus enthalten war, band der Primärantikörper an dieses. Falls es nicht vorhanden war, wurde der Primärantikörper ans Kunststoffgefäss gebunden, dann aber, mit dem zweiten Waschgang, wieder entfernt. 4) Der Sekundärantikörper band an die Primärantikörper, welche ans Antigen gebunden sind (sofern diese enthalten sind). Wenn diese nicht enthalten waren, verband sich der Sekundärantikörper mit dem Kunststoffgefäss und wurde mit dem dritten Waschgang ebenfalls entfernt. 5) Ja. Natürlich kann man auch zahlreiche Fehler machen während dem Test, sodass entweder die Kontrolle nicht richtig gefärbt wird. Es könnte auch sein, dass die Reaktion, die schlussendlich die Färbung im Falle einer Infektion verursacht nicht funktioniert hat. Man ist also trotz eines „positiven“ Ergebnisses krank. 6) Die dreifache Ausführung des Tests gibt mir eine gewisse Sicherheit und Kontrolle. Denn wenn alle drei Tests dasselbe Resultat zeigen, haben die Reaktionen und Waschgänge bei allen richtig (oder überhaupt nicht ;) ) funktioniert. 7) Das muss nicht unbedingt sein. Ich zum Beispiel hatte keinen direkten Kontakt mit dem als erstes infizierten Schüler, aber die Krankheit wird von allen weitergegeben, die mit der infizierten Person in Kontakt standen. Innerhalb der Bevölkerung kann sich ein Virus also in rasender Geschwindigkeit ausbreiten. Der Initiant / Erstinfizierte ist nicht ermittelbar. 3 Praktikumsbericht ELISA Manuela Berger 11. Januar 2010 DISKUSSION DER ERGEBNISSE Die Grundlage für diesen Teil des Berichtes ist die Tabelle, die wir noch im Praktikum alle zusammen erstellt haben (siehe weiter vorne im Journal). Nur vier Schülern gelang es, gesund aus der „Krisenzone“ zu entkommen. Alle anderen acht wurden infiziert. Diese Zahlen lassen darauf schliessen, dass der Versuch mit nur einem infizierten Schüler begann, und sich der Virus dann innerhalb der Körperflüssigkeitenaustauscherei auf weitere sieben 3 Schüler ausbreitete. Drei Austausche 2 = 8 Infizierte. Um den als erstes infizierten Schüler zu ermitteln, gingen wir nach dem Ausschlussverfahren vor. Die gesunden Personen konnten also nie mit einer infizierten Person in Berührung gekommen sein. Wir gingen die Abfolge der Körperflüssigkeitenaustausche nochmals durch und konnten viele Schüler ausschliessen. Schlussendlich gelang es aber nicht, einen Täter festzustellen, und uns blieben vier Verdächtige (Fabiano, Arian, Silvan und Benjamin S.). Weil sie jeweils zuerst mit ihrem Banknachbarn und anschliessend mit der anderen Gruppe tauschten. Dank Herr Ehms Beobachtung erfuhren wir am Ende doch noch, dass Silvan der Auslöser der Grippewelle war. 4
