Gentechnische Herstellung und Charakterisierung des DNA
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Diplomarbeit Gentechnische Herstellung und Charakterisierung des DNA Konstruktes pIRESGß zur Untersuchung von GIRK Protein in Brustkrebszellen eingereicht von Sarah Verheyen Geb.Dat.: 06.03.1985 zur Erlangung des akademischen Grades Doktor(in) der gesamten Heilkunde (Dr. med. univ.) an der Medizinischen Universität Graz ausgeführt am Institut für Biophysik unter der Anleitung von Ao.Univ.-Prof. Dr.phil. Wolfgang Schreibmayer Graz, 20.08.2013 (Sarah Verheyen) Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Graz, am 20.08.13 (Sarah Verheyen) i Danksagungen Ich möchte mich an dieser Stelle bei meinem Betreuer Ao.Univ.-Prof. Dr.phil. Wolfgang Schreibmayer für die engagierte Betreuung meiner Diplomarbeit sehr herzlich bedanken. Auch bedanken möchte ich mich bei Astrid Gorischek, für die geduldige und gewissenhafte Vermittlung ihrer Laborkenntnisse. Ich danke auch meinem Mann, meinen Eltern und meiner Oma für Ihre Unterstützung während des Schreibens dieser Arbeit, bei der Kinderbetreuung und bei der Finanzierung meines Studiums mit meinen zwei lieben Kindern. ii Zusammenfassung Brustkrebs ist der am häufigsten diagnostizierte Krebs der weiblichen Bevölkerung. Viele hoch komplexe und teilweise unbekannte Vorgänge der Signalübertragung und des Zellstoffwechsels sind in die Tumorentstehung und den Metastasierungsprozess involviert. In einer vergleichenden Genom-Expressionsanalyse konnte die Überexpression der mRNA für den G-Protein-gekoppelten einwärts-gleichrichtenden Kaliumkanal 1 (GIRK1) in Brustkrebszellen festgestellt werden. Diese Überexpression ist signifikant mit Lymphknotenmetastasen assoziiert. Immunhistochemisch konnte in operativ gewonnenem Brustkrebsgewebe eine signifikante Überexpression des GIRK1 - Proteins nachgewiesen werden. In Brustkrebszelllinien konnte bei Überexpression der mRNA allerdings keine Überexpression des vollständigen Proteins nachgewiesen werden, vermehrt war nur ein GIRK1-Protein mit geringerem Molekulargewicht, welches nicht in der Lage ist funktionsfähige Kanäle zu formen. Als Ionenkanal moduliert GIRK1 die Erregbarkeit von Neuronen und die Herzfrequenz und steuert die Hormonausschüttung endokriner Organe. GIRK1 kann durch die G-Protein-Untereinheit Gß aktiviert werden. Um die Funktionen von GIRK1 in Brustkrebs-Zelllinien weiter charakterisieren zu können, wurde ein Vektor hergestellt, mit welchem es möglich ist, die G-Protein-Untereinheit Gß12 in die Zellen einzubringen und GIRK1 zu aktivieren. Die zwei Teile der G-ProteinUntereinheiten Gß1 und G2 wurden in den Vektor pIRES kloniert. Gß1 ist zur Detektion in der Zelle mit einem Fluoreszenz-Protein (yellow fluorescent protein, YFP) fusioniert. Die erfolgreiche Klonierung der beiden Inserts konnte durch die Sequenzierung der Gene für Gß1 und G2 in pIRES bestätigt werden. Um auch die Funktionsfähigkeit des Konstruktes zu beweisen, wurde der Vektor mit den beiden Inserts Gß1 und G2, pIRESGß1G2, in MCF-7-Zellen transfektiert. Die Proteinexpression der G-Protein-Untereinheit konnte durch die Fluoreszenz von YFP mikroskopisch nachgewiesen und lokalisiert werden. iii Abstract Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer in women. Various and complex partly unknown, pathways lead to cancerogenesis and spreading through metastasis. A comparative genome expression analysis showed that the mRNA of the G-proteincoupled inwardly-rectifying potassium channel 1 (GIRK1) in cells of breast cancer with lymph node metastases was significantly elevated. Interestingly, no elevation of the full GIRK 1 protein follows this elevation in breast cancer cell lines, whereas the amount of GIRK 1 protein, detected by immunostaining in breast cancer tissue, was found to be elevated. In breast cancer cell lines an elevated amount of a truncated GIRK1-protein, which is not able to form functional ion channels, could be detected. GIRK1 is an ion channel which is known e.g. to regulate neuronal excitability, the heart rate and hormone release in endocrine organs. It can be activated by the G-protein-subunit Gß. To investigate the role of GIRK1 in breast cancer cell lines, it is necessary to be able to activate GIRK1 with the G-protein-subunit Gß. For this purpose, the DNA of the two parts of the G-protein subunit, Gß1 and G2 was cloned into the plasmid pIRES. Gß1 is fused with yellow fluorescent protein (YFP) for subsequent detection in cells which express the protein. As the DNA sequencing of Gß1 and G2 in pIRESGß1G2 showed the correct sequences of theses genes, the cloning has been successful. For further investigation, the plasmid was transfected in MCF-7-cells. The protein Gß1G2 could be detected and localized by microscopy. iv Inhaltsverzeichnis Danksagungen ....................................................................................................................... ii Zusammenfassung ................................................................................................................ iii Abstract ................................................................................................................................. iv Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................. v Glossar und Abkürzungen ................................................................................................... vii Abbildungsverzeichnis ....................................................................................................... viii 1 Einleitung ........................................................................................................................ 1 1.1 Hintergründe und Zielsetzung .................................................................................. 1 1.2 Das Mammakarzinom............................................................................................... 4 1.2.1 Definition und Epidemiologie ........................................................................... 4 1.2.2 Heterogenität der Erkrankung ........................................................................... 5 1.2.3 Metastasierung ................................................................................................... 7 1.3 G-Protein-gekoppelte einwärts-gleichrichtende Kaliumkanäle (GIRK-Kanäle) ..... 7 1.4 G-Proteine ................................................................................................................. 9 1.4.1 Struktur und Funktion........................................................................................ 9 1.4.2 G-Proteine und Brustkrebs ................................................................................ 9 1.5 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)........................................................... 10 1.5.1 Die Rolle von GPCRs in der Tumorentstehung .............................................. 10 1.5.2 GPCRs und Metastasierung ............................................................................. 12 2 Material und Methoden ................................................................................................. 13 2.1 Arbeitsprozess ........................................................................................................ 13 2.2 Material ................................................................................................................... 15 2.2.1 pIRES-Vektor .................................................................................................. 15 2.2.2 Inserts Gß1 und G2 ........................................................................................ 15 2.2.3 Zelllinien .......................................................................................................... 16 2.3 Methoden ................................................................................................................ 16 2.3.1 Protokoll 1: Vermehrung des Vektors in XL-1-Zellen .................................... 16 2.3.2 Protokoll 2: Agar-Platten ................................................................................. 17 2.3.3 Protokoll 3: LB-Medium ................................................................................. 17 2.3.4 Protokoll 4: Vektor-Isolierung aus XL1-Zellen mittels Midiprep .................. 18 2.3.5 Protokoll 5: Gelelektrophorese ........................................................................ 19 2.3.6 Protokoll 6: PCR von Gß1 und G2 ............................................................... 20 2.3.7 Protokoll 7: Schneideansatz für Vektor und Insert .......................................... 21 2.3.8 Protokoll 8: Standardreihe, Ligation ............................................................... 23 2.3.9 Protokoll 9: Fällung der Ligationsprodukte..................................................... 24 2.3.10 Protokoll 10: Miniprep .................................................................................. 24 2.3.11 Protokoll 11: Restriktionsanalysen der Ligationsprodukte pIRESG2 und pIRESGß1G2 ............................................................................................... 24 2.3.12 Protokoll 12: Glycerolstock ........................................................................... 26 2.3.13 Protokoll 13: DNA-Aufreinigung.................................................................. 26 2.3.14 Protokoll 14: MCF-7-Zellkultur .................................................................... 26 2.3.15 Protokoll 15: Konfokalmikroskopie .............................................................. 28 3 Ergebnisse – Resultate ................................................................................................... 30 3.1 Primer-Design für die Inserts Gß1 und G2 .......................................................... 30 3.2 Temperaturgradient, PCR-Optimierung, Herstellung PCR-Produkt ...................... 31 3.3 Präparatives Gel mit pIRES und G2 für die folgende Ligation ............................ 32 3.4 Standardreihe, Ligation & Kontrollschnitte von pIRESG2 mit Xba I, Sal I und Cla I ................................................................................................................................ 33 3.5 Präparatives Gel mit pIRESG2 und Gß1 für die folgende Ligation ..................... 37 v 3.6 Standardreihe und Ligation .................................................................................... 37 3.7 Kontrollschnitte von pIRESGß1G2 mit EcoR I und Nhe I................................... 38 3.8 Ergebnisse der Sequenzierung ................................................................................ 39 3.9 Nachweis des funktionsfähigen Konstrukts mittels Fluoreszenzmikroskopie ....... 46 4 Diskussion ..................................................................................................................... 49 5 Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 51 vi Glossar und Abkürzungen Amp ATCC CCR7 CFP CXCR4 DNA eCFP ECMV EDTA ER FBS GDP GIRK GPCR GTP Gß Gß1 G2 HBBS HER2 hGIRK LPA MCF-7 MCS mRNA Neo NSCLC PAR P CMV IE PCR pIRES RNA RPM SEER SDF1 siRNA S1P TAE Tris YFP Ampicillin American Type Culture Collection CC-Motif Chemochinrezeptor 7 cyan fluorescent protein CXC-Motif Chemochinrezeptor 4 Deoxyribonucleic acid enhanced CFP Encephalo-Myokarditis-Virus Ethylendiamintetraessigsäure estrogen receptor, Östrogenrezeptor fetal bovine serum Guanosindiphosphat G-protein activated inwardly rectifying potassium channel, G-Protein aktivierter einwärts-gleichrichtender Kaliumkanal G-protein coupled receptor, G-Protein gekoppelter Rezeptor Guanosintriphosphat G- Protein-Untereinheit ß G-Protein-Untereinheit ß1 G-Protein-Untereinheit 2 Hank’s Balanced Salt Solution human epidermal growth factor receptor 2 human G-protein inwardly rectifying potassium channel lysophosphatic acid Michigan-Cancer-Foundation-7, Brustkrebszelllinie multiple cloning site messenger Ribonucleic acid Neomycin non-small cell lung cancer Protease aktivierter Rezeptor cytomegalievirus-immediate early promoter polymerase chain reaction Plasmid Internal Ribosome entry site (Vektor) Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure rotations per minute Surveillance Epidemiology and End Results Stromal cell derived factor 1 small interferring Ribonucleic acid Sphingosin-1-Phosphat Tris Acetate EDTA Tris(hydroxymethyl-)aminoethan yellow fluorescent protein vii Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 SEER cancer statistics, National Cancer Institute, Howlader et al. 2013. ....... 5 Abbildung 2 Einteilung Brustkrebsformen, ermittelt durch Clusteranalyse. Reis-Filho et Pusztai, 2011.................................................................................................................. 6 Abbildung 3 GIRK-Kanal Untereinheit, GIRK-Kanal, Dascal, 1997. .................................. 8 Abbildung 4 Schematische Darstellung eines GPCRs. Dorsam et Gutkind, 2007.............. 11 Abbildung 5 Arbeitsprozess ................................................................................................ 14 Abbildung 6 pIRES, Clontech 2008. ................................................................................... 15 Abbildung 7 Konfokales Laser Scanning Mikroskop, Nwaneshiudu et al., 2012............... 29 Abbildung 8 Temperaturgradient für PCR von Gß1. .......................................................... 31 Abbildung 9 Analytisches Gel der PCR-Produkte Gß1 und G2. ....................................... 32 Abbildung 10 Präparatives Gel der PCR-Produkte Gß1 und G2. ...................................... 32 Abbildung 11 Verdünnungsreihe zur Abschätzung der DNA-Menge des Inserts G2. ...... 33 Abbildung 12 Verdünnungsreihe zur Abschätzung der DNA-Menge des Vektors pIRES. 33 Abbildung 13 Kontrollschnitte von 12 pIRESG2-Proben mit Xba I und Sal I. ................ 34 Abbildung 14 Berechnete Schnittstellen in pIRESG2 bei Cla I Kontrollschnitt ............... 35 Abbildung 15 Kontrollschnitt von pIRESG2 mit Cla I. .................................................... 36 Abbildung 17 Kontrollschnitt von pIRESG2 mit Cla I. .................................................... 36 Abbildung 16 Vermutete Schnittstellen pIRESG2 bei Cla I Kontrollschnitt .................... 36 Abbildung 18 Präparatives Gel von Gß1 und pIRESG2 für die folgende Ligation. ......... 37 Abbildung 19 Verdünnungsreihe zur Abschätzung der DNA-Menge des Inserts Gß1 und des Vektors mit dem Insert G2, pIRESG2. .............................................................. 38 Abbildung 20 Kontrollschnitt von pIRESGß1G2 mit EcoR I. .......................................... 39 Abbildung 21 Kontrollschnitt von pIRESGß1G2 mit Nhe I.. ........................................... 39 Abbildung 22 Ergebnis der Sequenzierung von pIRESG2. ............................................... 40 Abbildung 23 Gegenüberstellung der erwarteten und der erhaltenen Sequenz von G2. ... 41 Abbildung 24 Ergebnis der Sequenzierung von Gß1YFP aus pIRESGß1G2, Teil 1. ....... 41 Abbildung 25 Ergebnis der Sequenzierung von Gß1YFP aus pIRESGß1G2, Teil 2. ....... 42 Abbildung 26 Ergebnis der Sequenzierung von Gß1YFP aus pIRESGß1G2, Teil 3. ....... 42 Abbildung 27 Vergleich des Ergebnisses der Sequenzierung von YFP mit der erwarteten Sequenz........................................................................................................................ 44 Abbildung 28 Vergleich des Ergebnisses der Sequenzierung von Gß1 mit der erwarteten Sequenz........................................................................................................................ 45 Abbildung 29 MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2. Links: Fluoreszenz durch das an Gß1 gekoppelte YFP ........................................................................................................... 46 Abbildung 30 MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2. Links: Fluoreszenz durch das an Gß1 gekoppelte YFP ........................................................................................................... 47 Abbildung 31 MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2 und GIRK4............................................ 47 Abbildung 32 MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2 und GpI. ................................................ 48 Abbildung 33 MCF-7-Zellen mit pIRES Gß1G2 und Srß. ............................................... 49 viii 1 Einleitung 1.1 Hintergründe und Zielsetzung Brustkrebs ist in der weiblichen Bevölkerung der meist diagnostizierte Krebs und weltweit die häufigste durch Krebs bedingte Todesursache. 1.38 Millionen Frauen erkrankten 2008 weltweit neu an Brustkrebs (23% aller Krebs-Neuerkrankungen) und 458.400 Frauen starben in diesem Jahr daran (14% der durch Krebs verursachten Todesfälle) (Jemal et al., 2011). Durch die Einführung des Mammographie-Screenings profitieren Frauen von einer 20%igen Risikoreduktion an Brustkrebs zu sterben. 19 % der diagnostizierten Karzinome sind allerdings überdiagnostiziert und werden dementsprechend auch abgeklärt und behandelt, was eine schwere und unnötige Belastung für viele der betroffenen Frauen darstellt (Marmot et al., 2012). Für die Entwicklung differenzierterer Diagnosemöglichkeiten und möglicher Therapien ist die Charakterisierung der Tumorpathogenese durch die Grundlagenforschung von großer Bedeutung. Da es Hinweise gibt, dass der G-Protein einwärts gleichrichtende Kaliumkanal 1 (GIRK1) eine Rolle in der Tumorpathogenese des Mammakarzinoms spielt, insbesondere bei der Metastasierung (Stringer et al. 2001), wird die Funktion dieses Ionenkanals in Krebszelllinien im Rahmen zweier Projekte am Institut für Biophysik in Graz genauer untersucht (FWF:P22974; KLIF182). Das Ziel meiner Diplomarbeit ist es, einen Vektor herzustellen, mit dessen Hilfe man in weiterer Folge die ß1- und 2- Untereinheiten eines heterotrimeren G-Proteins in MCF-7Zellen transfektieren und durch deren Expression GIRK1 in Brustkrebszellen aktivieren kann. Das Produkt meiner Arbeit ist Teil eines Projektes dessen Ziele im Folgenden kurz zusammengefasst werden (lt. Studienprotokoll). Identifikation von GIRKs durch elektrophysiologische Messungen in Brustkrebszelllinien unterschiedlicher Malignität, in GIRK überexprimierenden Zelllinien sowie in Zelllinien in denen GIRK-Gene durch small interfering RNA (siRNA) gesilenced wurden 1 Charakterisierung der messenger RNA (mRNA) und Protein- Isoformen der GIRK Untereinheiten in Brustkrebszellen Einfluss von Umweltfaktoren, welche die Tumorprogression beeinflussen (mechanischer Stress, Hypoxie), auf die Expressionslevels Beobachtung des Einflusses von Überexprimierung/Silencing von GIRK-Varianten auf Zellfunktionen wie Proliferation, Zelladhäsion und Migration Beobachtung der intrazellulären Verteilung von GIRK-Varianten in MCF10A und MCF7-zellen in Abhängigkeit von Umweltfaktoren, Phosphorylierungsstatus und Vorhandensein von Signalmolekülen, um auf die mögliche Rolle des GIRKStoffwechsels der Zelle, das Tumorwachstum und die Progression betreffend, zu schließen Die Entstehung von Tumoren verschiedener Gewebe geht mit genetischen Veränderungen auf DNA-Ebene, aber auch mit quantitativen Veränderungen der Genexpression einher. In einer vergleichenden Expressionsanalyse konnte nachgewiesen werden, dass die mRNA für GIRK1 in Brustkrebszellen von invasiven Mammakarzinomen im Vergleich zu gesundem Brustgewebe derselben Patientin vermehrt ist. Diese Beobachtung trifft auf etwa 30 % aller Mammakarzinome zu, die Überexpression ist signifikant mit Lymphknotenmetastasen assoziiert (P<0.0029). In 50 % (13/26) der invasiven Karzinome mit Lymphknotenmetastasen ist GIRK1 überexprimiert. In invasiven Karzinomen ohne Lymphknotenmetastasen konnte die Überexpression nur in 13 % (4/30) der Proben festegestellt werden. In Bezug auf Tumorgröße, Tumorgrad und Östrogenrezeptorstatus konnte kein signifikanter Zusammenhang mit einer GIRK-Überexpression festgestellt werden (Stringer et al., 2001). In einer weiteren Expressionsanalyse mit Gewebeproben von 72 PatientInnen mit nichtkleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC), die eine chirurgische Therapie erhielten, konnte ebenfalls ein signifikanter Zusammenhang zwischen hoher GIRK1 Expression, Lymphknotenmetastasierung und Staging festgestellt werden. Die staging-unabhängigen Überlebensraten und die Überlebensraten in Stadium 1 waren für Karzinome mit hoher GIRK1-Expression signifikant schlechter. In Stadium 2 und 3 gab es diesbezüglich keinen signifikanten Zusammenhang. (Takanami et al., 2004). Immunhistochemisch konnte an Gewebsproben von 33 primär invasiven duktalen Mammakarzinomen, verglichen mit gesundem Brustgewebe, welches großteils aus 2 denselben Mastektomien gewonnen wurde, eine signifikante Überexpression von GIRK1Protein nachgewiesen werden (Brevet et al., 2008). Wagner et al. untersuchten 2010 die Auswirkungen der Überexpression der mRNA von human GIRK1 (hGIRK 1) auf die Proteinexpression in Brustkrebszelllinien. Es wurde gezeigt, dass die mRNA-Menge von hGIRK1 in Zellen der Brustkrebszelllinie MCF7 um ein Vielfaches höher ist als in Zellen der Brustepithelzelllinie MCF10-A und der Brustkrebszelllinie MDA-MB-453. Die Menge der mRNA von hGIRK4 betreffend, konnten in diesen drei Zellinien keine größeren Unterschiede beobachtet werden. Dem gegenüber wurde die tatsächliche Proteinexpression gestellt. Im Gegensatz zur Verteilung der Menge der mRNA konnten die größten Mengen des vollständigen GIRK1-Proteins in den zwei nicht-malignen Brustepithellinien MCF10A und MCF 12A mittels Westernblot nachgewiesen werden. Geringe Mengen wurden auch in den malignen Zelllinien MCF7, MDA-MB-453 und SKBR3 gefunden. GIRK4-Protein war hingegen in den benignen Brustepithelzelllinien nicht nachweisbar. Möglicherweise bildet GIRK 1 mit einer anderen GIRK-Untereinheit funktionsfähige Kanäle. Die Menge der mRNA und die tatsächliche Proteinmenge korrelieren also nicht miteinander. In MCF7-, SKBR3- und T47D-Zellen (maligne) wurde vermehrt ein GIRK1-Protein mit geringerem Molekulargewicht nachgewiesen. Hierbei handelt es sich um ein verstümmeltes Protein bzw. ein Protein einer der anderen drei in MCF-7-Zellen nachgewiesenen Splicevarianten außer hGIRK1a, also hGIRK1c, d oder e. Begleitend war auch GIRK4-Protein vermehrt. Nur hGIRK 1a besitzt die volle Proteinlänge und kann mit hGIRK4 funktionierende Kanäle formen (Wagner et al., 2010). Im Folgenden werden die wesentlichen Grundlagen erläutert. 3 1.2 Das Mammakarzinom 1.2.1 Definition und Epidemiologie Das Mammakarzinom entsteht durch eine maligne Proliferation der epithelialen Auskleidung von Milchgängen und Läppchen der Brustdrüse, welche mit einer klonalen Vermehrung einer maligne gewordenen Zelle, nach Auftreten von somatischen oder Keimbahnmutationen, beginnt. Seit der Einführung der Vorsorgeuntersuchung inklusive Mammagraphie ist ein deutlicher Anstieg der Inzidenz zu beobachten (Lippmann, 2008). Das Erkrankungsrisiko für Brustkrebs zeigt von 1983 bis 2010 einen kontinuierlichen Anstieg, wie Daten der Statistik Austria zeigen. Das Erkrankungsrisiko bis zum 75. Lebensjahr stieg von 5.8% im Jahr 1983 auf 7.6% im Jahr 2010. Die altersstandardisierte Rate betrug im Jahr 1983 56.4/100.000 Einwohner, kontinuierlich ansteigend auf 70.6/100.000 im Jahr 2010, bezogen auf die Weltbevölkerung (Statistik Austria, 2012). Einen wesentlichen Anteil am Anstieg der Brustkrebsinzidenz hat die Einführung der Mammographie. Da bei der Mammographie vor allem Karzinome in situ und solitäre, nicht metastasierte Tumore auffallen, haben sich diese, wie von Bleyer und Welch 2012 aufgezeigt, seit der Einführung des Mammographiescreenings verdoppelt (234 Tumore/100.000 Frauen /Jahr statt 112/100.000), während eine Reduktion von Tumoren im fortgeschrittenen Stadium von 8 % (94 statt 102 Tumore/100.000 Frauen pro Jahr) festzustellen ist. Demnach wird geschätzt, dass bis zu 31% aller Karzinome überdiagnostiziert sind. “Überdiagnostiziert” bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Tumor in der verbleibenden Lebenszeit der Patientin zu keinen Komplikationen geführt hätte, wäre er nicht diagnostiziert worden (Bleyer et Welch, 2012). In England profitieren Frauen zwischen 50 und 70 Jahren, die alle 3 Jahre zur Mammographie eingeladen werden, von einer 20%igen Risikoreduktion an Brustkrebs zu sterben. 43 von 10.000 50-jährigen Frauen die 20 Jahre lang zum Screening geladen werden, würden nicht an Brustkrebs sterben. Dafür hat eine von 77 Frauen, welche 20 Jahre lang zu diesem Screening eingeladen wurde, ein überdiagnostiziertes Karzinom, welches dementsprechend abgeklärt und behandelt wird (Marmot et al., 2012). Inzidenzdaten der US-Bevölkerung zeigen einen Anstieg der Diagnosestellung von Brustkrebs vom Jahr 1975 bis 1999. Anschließend ist bis 2010 wieder ein leichter Abfall 4 zu erkennen. Trotz Weiterentwicklung der Therapiemöglichkeiten in diesem Zeitraum sinkt die Brustkrebsmortalität von 1975 bis 2010 nur geringfügig (siehe Abb. 1) (Howlader et al. 2013). Abbildung 1 SEER cancer statistics, National Cancer Institute, Howlader et al. 2013. 1.2.2 Heterogenität der Erkrankung Das Mammakarzinom galt vor der Durchführung von Microarrayuntersuchungen als eine Krankheit mit unterschiedlichen histologischen und klinischen Ausprägungen. Reis-Filho et Pusztai zeigten in einem Review 2011 die Heterogenität dieser Erkrankung auf, angefangen mit der Entstehung durch unterschiedliche genetische Veränderungen. Die Risikofaktoren, die klinische Ausprägung, die Histologie, die Prognose und das Ansprechen auf verschiedene Therapien sind bei unterschiedlichen Mammakarzinomen ganz unterschiedlich. Ein wichtiges Kriterium zur Klassifizierung ist der Östrogenrezeptorstatus. Östrogenrezeptor (ER) -positive und ER-negative Karzinome sind sowohl auf Transkriptionsebene, als auch klinisch als zwei unterschiedliche Erkrankungen zu betrachten. Die Prognose von ER-positiven Tumoren ist von der Expression von Genen, welche die Proliferation beeinflussen, abhängig. Im Übrigen ist auch das Ansprechen auf eine Chemotherapie von der Expression von Proliferationsgenen abhängig, da damit vor allem stark proliferierende Zellen angegriffen werden. 5 Therapieentscheidungen werden aufgrund der prognostischen Parameter Tumorgröße, Lymphknotenmetastasen, histologische Differenzierung, Östrogen-und Progesteronrezeptorstatus sowie Expression von human epidermal growth factor receptor 2 (HER2, ERBB2) getroffen. Tumorgröße, Lymphknotenbefall und histologische Differenzierung sind drei von der Genexpression unabhängige prognostische Parameter. Für eine individualisierte Therapie und eine sicherere Prognostik wurden mehrere Microarray-basierte Prognostic Signatures entwickelt, welche unterschiedliche Gene untersuchen. Das Outcome kann jedoch nach der Studienlage laut Jorge S Reis-Filho et al. nur durch Expression von Proliferationsgenen vorhergesagt werden. Je höher die Expression ist, desto schlechter ist die Prognose. Ansonsten ist die Aussage neben der semiquantitativen Analyse von ER, PR (Progesteronrezeptor), HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) und KI67 limitiert. Es wird auch bis jetzt, abgesehen von Studien, nicht diagnostisch verwendet. Durch hierarchische Clusteranalysen von Genen maligner Brusttumoren wurden mindestens 4 molekulare Subtypen definiert: Luminal, HER2 positiv, basal-like und normal breast-like (Reis-Filho et Pusztai, 2011). Abbildung 2 Einteilung Brustkrebsformen, ermittelt durch Clusteranalyse. Reis-Filho et Pusztai, 2011. 6 1.2.3 Metastasierung Um den Mechanismus der Metastasierung besser zu verstehen und Ansätze für neue Diagnosemöglichkeiten und Therapien zu finden, wird Comparative genomic profiling eingesetzt. Durch diese Methode konnte gezeigt werden, dass im Zuge der Metastasierung eine klonale Expansion einer Zellsubpopulation im Primärtumor stattfindet. Diese Zellsubpopulation erlangt durch verschiedene genomische Veränderungen das Potential zur Invasivität. Im Folgenden wird kurz zusammengefasst welche Arten von DNA-Veränderungen für die Metastasierung eine Rolle spielen: DNA-Veränderungen in Brustkrebszellen, welche im Laufe der Metastasierung auftreten, können die Anzahl bestimmter Gen-Kopien (Copy number) oder die Gene an sich, in Form von DNA-Mutationen und Methylierung, betreffen. Zu unterscheiden sind “driver” und “passenger”-Mutationen, wobei “driver”-Mutationen eine Funktion im Pathomechanismus der Metastasierung haben, “passenger”-Mutationen jedoch im Zuge der genomischen Instabilität auftreten, der Tumorentwicklung aber nicht dienlich sind und somit auch keinen Angriffspunkt für potentielle Therapien darstellen. Aber auch Veränderungen der Genexpression und der Proteinexpression spielen im Zuge der Metastasierung eine Rolle (Adriana Priscila Trape et Gonzales-Angulo, 2012). Ein Beispiel für eine Veränderung in der Genexpression ist die anfangs erwähnte Vermehrung der mRNA für GIRK1 in Zellen von Brustkrebs mit Lymphknotenmetastasen, beschrieben bei Stringer et al. 2001. 1.3 G-Protein-gekoppelte einwärts-gleichrichtende Kaliumkanäle (GIRK-Kanäle) GIRK-Kanäle (GIRKs) gehören zu einer von sieben Gruppen, einwärts-gleichrichtender Kalium Kanäle (Kir) (Mark et Herlitze, 2000). GIRKs haben Funktionen in verschiedenen Geweben des menschlichen Körpers. Sie sind an der Senkung der Herzfrequenz und der Schmerzwahrnehmung beteiligt. Des weiteren hyperpolarisieren sie Neurone in Folge einer Aktivierung durch verschiedene G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und steuern so deren Erregbarkeit (Lüscher et Slesinger, 2010). Sie inhibieren auch die Hormonausschüttung aus endokrinen Zellen (Kurachi et al. 2003). Bei Säugetieren, inklusive dem Menschen, existieren vier verschiedene Genloci, welche für Isoformen von Untereinheiten (GIRK1-4, bzw. Kir3.x, x=1-4) codieren, die Homo7 oder Heterotetramere bilden und funktionsfähige Kanäle formen können. Allerdings können Untereinheiten des Typus GIRK1 keine funktionstüchtigen Homotetramere bilden und kommen daher nur in Kombinationen mit GIRK2, 3 oder 4 vor. In Xenopus Oozyten wurde GIRK5, das Frosch Ortholog zu GIRK4, gefunden (Mark et Herlitze, 2000). Je nach Gewebe und Zellart variiert die Zusammensetzung der Untereinheiten von GIRKKanälen. In Kardiomyozyten kommen Kanäle aus GIRK1 (Kir3.1) und GIRK4 (Kir3.4) vor, in neuronalen Zellen hingegen dominieren GIRK2- Homotetramere oder Kombinationen von GIRK1 und GIRK2 (Kir3.2) bzw. GIRK1 und GIRK3 (Mark et Herlitze 2000, Kurachi et al.2003). Eine Untereinheit besteht aus zwei transmembranären Bestandteilen (M1 und M2) und einer kanalformenden Region (H5), welche ein Glycin-Thyrosin-Glycin-Motiv enthält, das für die Selektivität für K+-Ionen verantwortlich ist. Der Bestandteil, der cytosolisch den Kanal formt, enthält das C- und das N-terminale Ende des Proteins (siehe Abb.3). Abbildung 3 Links: GIRK-Kanal Untereinheit, rechts: GIRK-Kanal, Dascal, 1997. Jede Untereinheit des Kanals besitzt an dieser Stelle auch eine Gß-Bindungsstelle. GIRKs können direkt durch die ß-Untereinheit von pertussistoxinsensitiven G-Proteinen aktiviert werden (Kurachi et al., 2004). Die Bindung von Gß an GIRK-Kanäle begünstigt eine Konformationsänderung, beschrieben im Monod-Wyman-Changeux-Allosterie Modell (Changeux et Edelstein, 2005). Die Untereinheiten eines Kanals haben immer denselben Zustand, A (=available) 8 oder U (=unavailable)), und ändern diesen gleichzeitig. Je mehr Gß vorhanden ist, desto mehr Kanäle sind in einem aktivierten Zustand (A). Die Kanäle im Zustand A haben eine höhere Affinität zu Gß. Durch die Allosteriekonstante L wird ein Gleichgewicht zwischen den Zuständen A und U aufrechterhalten (Kurachi et al., 2004). GIRKs werden durch G-Proteine aber auch durch Phosphatidylinositol, 4,5-Bisphosphate, intrazelluläres Natrium, Alkohol und mechanische Reize moduliert (Mark et Herlitze, 2000). 1.4 G-Proteine 1.4.1 Struktur und Funktion Heterotrimere G-Proteine bestehen aus einer -Untereinheit und einer ß- Untereinheit. Wenn ein in der Zellmembran sitzender G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR, G-protein coupled receptor) durch Bindung eines Transmitters eine Konformationsänderung erfährt, katalysiert er den Austausch von Guanosindiphosphat (GDP) zu Guanosintriphosphat (GTP) an der -Untereinheit. Dadurch dissoziiert die -Untereinheit von dem ß-Dimer und beide Entitäten (GTP- und ) können weitere Signalkaskaden in Gang bringen. Gß kann direkt an GIRKs binden und diese somit aktivieren. Wird GTP an der -Untereinheit hydrolysiert, kann diese wieder an eine ß- Untereinheit binden und ist wieder inaktiviert. Eine weitere Möglichkeit der Aktivierung von Ionenkanälen durch G-Proteine besteht über Second-Messenger, welche z.B. zu einer Phosphorylierung des Kanals führen. Diese Form der Aktivierung dauert jedoch wesentlich länger (Mark et Herlitze, 2000). Die Wirkungsmechanismen von G-Proteinen sind in Abb. 4 schematisch dargestellt. 1.4.2 G-Proteine und Brustkrebs In einer Studie von Xiaoyun Tang et al. wurde die Rolle der Gß- Untereinheit von GProteinen auf das Tumorwachstum und die Metastasenbildung bei Brustkrebs untersucht. Es wurde in vitro gezeigt, dass die Blockade von Gß mit mittels Lentivirus in die Zellen eingebrachtem G oder kleinen inhibitorischen Molekülen, die Tumorzellproliferation und die Zellmigration, induziert durch GPCRs, hemmt. Die Expression von G in MDA-MB231-zellen hemmt auch in vivo die primäre Tumorbildung und verzögert das Wachstum 9 von bereits existierenden Brusttumoren in Nacktmäusen. Auch das Auftreten von Lungenmetastasen wurde deutlich reduziert. Die Blockade von Gß beeinflusst auch das Micromilieu, welches die Tumorprogression begünstigt. Es wurde eine verminderte Leukozyteninfiltration und Angiogenese bei Primärtumoren beobachtet. Die Funktion von Gß ist wesentlich für das Wachstum von Brusttumoren, jedoch nicht für das Wachstum gewöhnlicher Brustepithelzellen. Die Blockade von Gß verhindert selektiv die durch diverse GPCR-Agonisten induzierte Brustkrebszellmigration (Tang et al., 2011). 1.5 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) 1.5.1 Die Rolle von GPCRs in der Tumorentstehung In vielen Tumortypen werden GPCRs überexprimiert. Einige Beispiele dafür sind Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs), Chemokinrezeptoren und Rezeptoren für bioaktive Lipide wie lysophosphatic acid (LPA) und Sphingosin-1-phosphat (S1P). PAR1 ist in hoch invasiven Mammakarzinomen überexprimiert (Dorsam et Gutkind, 2007). Auch die Chemokinrezeptoren CXC-Motif Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) und CC-Motif Chemokinrezeptor 7 (CCR7) sind GPCRs, und sind in Brustkrebszellen hochreguliert. Brustkrebs- und Stromazellen produzieren auch vermehrt Agonisten für GPCRs. Einige von ihnen sind mit einer chronischen Leukozyteninfiltration der Tumore assoziiert, welche wiederum zu einem Überfluss von tumorfördernden Faktoren wie z.B. MatrixMetalloproteasen, Angiogenetische Faktoren, Wachstumsfaktoren, immunsuppressive Zytokine und Chemokine, führt (Tang et al., 2011). Die Familie der GPCRs beinhaltet mehr als 800 verschiedene Mitglieder, deren Gene mehr als 2% des menschlichen Genoms ausmachen. Die Rezeptoren haben Funktionen in der Neurotransmission, Hormon- und Enzymfreisetzung endokriner und exokriner Drüsen, innerhalb der Immunantwort, Herz- und Muskelkontraktion sowie auch innerhalb der Blutdruckregulation, um nur einige zu nennen. GPCRs sind Sieben-Transmembrandomänen-Rezeptoren, was bedeutet dass sie aus 7 Alpha-Helices bestehen, welche die Zellmembran durchspannen. Bei Bindung eines Agonisten wird das intrazellulär mit dem Rezeptor in Interaktion stehende G-Protein aktiviert, GDP dissoziiert von der Alpha-Untereinheit und wird durch GTP ersetzt, 10 wodurch wiederum die Alpha- Untereinheit von der Gß-Untereinheit dissoziiert. Beide Untereinheiten setzen weitere Signalkaskaden innerhalb der Zelle in Gang (Dorsam et Gutkind, 2007). Abbildung 4 Schematische Darstellung eines GPCRs, welcher verschiedene Signalkaskaden über Gß und G in Gang setzt. Unter anderem ist die Wirkung von Gß auf Ionenkanäle wie GIRK1, aber auch auf die Genexpression, erkennbar. Dorsam et Gutkind, 2007. Tumorzellen nutzen die physiologischen Funktionen der überexprimierten GPCRs und deren Signalkaskaden. Auch autokrine und parakrine Aktivierung durch ein Übermaß an lokal, durch Tumor- und Stromazellen, produzierten oder zirkulierenden Agonisten führt zur autonomen Proliferation, zum Immunescape, zur Gewebeinvasion und Dissemination in andere Organe, sowie zur Steigerung der Nährstoff- und Sauerstoffzufuhr. GPCRs haben eine zentrale Rolle in der Neoangiogenese und der Zellmigration von Tumorzellen, welche möglicherweise auch in der Metastasierung zum Tragen kommt (Dorsam et Gutkind, 2007). 11 1.5.2 GPCRs und Metastasierung Die organspezifische Metastasierung, wie sie bei den meisten Karzinomen vorkommt, ist oft durch G-Protein gekoppelte Chemokinrezeptoren vermittelt, welche sensitiv für Chemokine der Zielorgane sind. Auch die Migration von Leukozyten und deren Vorläuferzellen zwischen Blut und lymphatischen Geweben sowie zu Entzündungsgebieten ist chemokin-vermittelt. Stromazellen, Makrophagen, tumorinfiltrierende Leukozyten oder die Tumorzellen produzieren Chemokine, für welche Tumorzellen verschiedene Chemokinrezeptoren exprimieren. Durch diese wird die Motilität und das Überleben der Tumorzellen positiv beeinflusst. Tumorzellen verschiedenster Karzinome, wie auch des Mammakarzinoms, exprimieren CXC-Motif Chemochinrezeptor 4 (CXCR4), der im Gegensatz zu den meisten anderen Chemokinrezeptoren sehr selektiv nur einen Liganden, stromal cell-derived factor 1 (SDF1), bindet. Die Organe, in denen sich am häufigsten Metastasen finden, Lymphknoten, Lunge, Knochenmark und Leber, exprimieren SDF1. Karzinome, deren Zellen CXCR4 exprimieren, haben ein erhöhtes Risiko zur Metastasierung und demzufolge eine schlechtere Prognose. In 30% der Mammakarzinome ist HER2 überexprimiert. Diese Überexpression führt zu einem verminderten Abbau von CXCR4 und resultiert dementsprechend in einer schlechteren Prognose. Auch die Expression von PAR1 in Brustkrebszellen korreliert direkt mit dem Risiko zur Metastasierung. In der Neoangiogenese spielen verschiedene GPCRs ebenfalls eine Rolle, wie zum Beispiel Thrombin-, Prostaglandin- oder S1P-Rezeptoren, aber auch die Chemokinrezeptoren CXCR2 und CXCR4 (Dorsam et Gutkind, 2007). 12 2 Material und Methoden 2.1 Arbeitsprozess Der Arbeitsprozess der Klonierung der DNA der beiden G-Protein-Untereinheiten Gß1 bzw. G2 in den bicistronischen Vektor pIRES, ein Plasmid, welches die zwei multiple cloning sites MCS A und B enthält, wird in der folgenden Abbildung dargestellt. Jeweils hinter einer kurzen Beschreibung der Arbeitsschritte ist auf die genaue Dokumentation der Methoden (Protokoll 1-13) und der Resultate (Resultate 3.1-3,9) verwiesen (siehe Abb.5). 13 Abbildung 5 Arbeitsprozess 14 2.2 Material 2.2.1 pIRES-Vektor Als Vektor verwendete ich den bicistronischen pIRES (Clontech). Bicistronisch bedeutet, dass dieses Plasmid zwei multiple cloning sites (MCS A und MCS B) besitzt, in welche 2 Gene kloniert werden können. Zwischen den multiple cloning sites liegt die internal ribosome entry site (IRES) des Encephalo-Myokarditis-Virus (ECMV). Die Expression wird durch den cytomegalovirus-immediate-early-promoter (P CMV IE) innitiiert. Der Vektor besitzt eine Ampicillin- (Amp’) und eine Neomycin-Resistenz (Neo’). So können die Zellen, welche den Vektor enthalten, selektiv gezüchtet werden (Clontech, 2008). Abbildung 6 pIRES, Clontech 2008. Gß1 wurde in MCS A kloniert und G2 in MCS B. 2.2.2 Inserts Gß1 und G2 Die beiden Inserts sind die zwei Untereinheiten des G-Protein-Dimers Gß1G2. Gß1: Die kodierende Sequenz besteht aus 1022 Basen. 717 Basen kommen dazu, da Gß1 mit Yellow fluorescent protein (YFP) fusioniert ist, somit ergeben sich für dieses Insert 1739 Basen, welche in den Vektor pIRES eingefügt werden. 15 G2: Die kodierende Sequenz für G2 besteht aus 215 Basen, es handelt sich um ein sehr kleines Insert. 2.2.3 Zelllinien 2.2.3.1 MCF-7-Zellen Unterschiedliche Brustkrebszellinien zeigen, wie auch verschiedene Brustkrebsarten, eine Genomvariabilität. MCF-7-Zellen sind Östrogen- und Progesteronrezeptor positiv. Sie stammen aus einem invasiven duktalen Karzinom einer 69-jährigen kaukasischen Frau. (Neve et al. 2006) Die verwendete Zelllinie war ursprünglich von der American Type Culture Collection (ATCC), die Zellkultur sollte bei 37°C und 5% C02 erfolgen. 2.2.3.2 XL-1 Blue Competent Cells Die XL1-Blue kompetenten Zellen (Stratagen) entstammen einem Bakterienstamm, welcher für die Arbeit mit Plasmidvektoren gut geeignet ist. Die Stabilität der Inserts ist durch die mangelnde Bereitschaft dieser Zellen zur Rekombination gewährleistet. Die Herstellung von Minipreps funktioniert aufgrund des Fehlens von Endonukleasen sehr gut. Die Zellen sind Tetracyclin-resistent. (Stratagene, 2004) 2.3 Methoden 2.3.1 Protokoll 1: Vermehrung des Vektors in XL-1-Zellen Vorbereitung: Die Elektroporationsküvetten (Firma Biozym) werden im Gefrierschrank gekühlt. Zwei Agarplatten werden im Brutschrank bei 37°C angewärmt. Die gefrorenen elektrokompetenten Zellen (XL1 blue electrocompetent cells, Stratagen) werden aus dem Gefrierschrank (-70°C) geholt und auf Eis aufgetaut. SOC (Nährmedium, Super Optimal broth with Catabolite repression, siehe Anhang 1) wird vollständig aufgetaut. Schüttler und Inkubator werden auf 37°C eingestellt. 16 Der Elektroporator (Biorad, Modell 2000/200) wird eingeschalten, 2-3 Testladungen bzw. Entladungen werden durchgeführt. Für die Elektroporation von Minipreps werden 1l Plasmid und 9l Aqua dest. gemischt, für die Elektroporation von Midipreps werden 1l Plasmid und 99l Aqua dest. gemischt. 1 l der Plasmid-Aqua dest.-Mischung wird zu den aufgetauten elektrokompetenten Zellen (80l ) pipettiert und gemischt (mit Pipette), das Ganze wird aufgezogen und in die auf Eis gestellten Elektroporationskuvetten pipettiert. Mit Armschwüngen wird die Flüssigkeit auf den Kuvettenboden gebracht. Die Kuvette wird abgetrocknet und in den Elektroporator gestellt. Es folgt die Entladung und der Stromimpuls. Nach dem Stromimpuls werden 500 l SOC zugefügt und das Ganze mit der Pipette gemischt (2-3-mal aufgezogen). Die Flüssigkeit wird in Falconröhrchen überführt und eine Stunde bei 37C im Schüttler inkubiert. Anschließend werden die Zellen auf zwei vorgewärmte Agarplatten ausplattiert (1.Platte 5l, 2.Platte 200l) und über Nacht bei 37C im Brutschrank (WBT binder) inkubiert. 2.3.2 Protokoll 2: Agar-Platten 5g NaCl, 5g Bactotryptone, 2.5g Bacto-Yeast extract, 7.5g Bacto agar, 500ml H2O, werden im magnetischem Mixer gemixt und 20 min. bei 120°C autoklaviert. Nachdem die Flüssigkeit auf 65°C abgekühlt ist werden 50 g/ml Ampicillin (von 50mg/ml AmpicillinStock) hinzugefügt und das somit fertige Material für die Agarplatten wird in Petrischalen ausgegossen. 2.3.3 Protokoll 3: LB-Medium 5g NaCl, 5g Bactotryptone, 2.5g Bacto-Yeast extract, 500ml H2O werden gemischt und mit dem magnetischem Mixer homogenisiert. Das so entstandene LB-Medium wird in 250 ml Flaschen gefüllt und bei 120°C 20 min. autoklaviert. 1l Ampicillin wird pro 1ml LBMedium der Flasche nach dem Abkühlen hinzugefügt. 17 2.3.4 Protokoll 4: Vektor-Isolierung aus XL1-Zellen mittels Midiprep Vorbereitungen für die Midiprep ausgehend von der Zellkultur auf der Agarplatte nach Elektroporation: 2 Zellkolonien werden mit einer Pipettenspitze von der Agarplatte abgenommen und in 5 ml LB-Medium+Ampicillin in Falconröhrchen im Schüttler vermehrt (1l Ampicillin pro 1 ml LB-Medium (siehe Protokoll3)). Anschließend wird die Zellkultur in ein größeres Gefäß (Erlenmeier-Kolben) überführt, 50 ml des Ampicillin-versetzten LB-Mediums werden hinzugefügt und die Zellkultur wird im Schüttler über Nacht fortgesetzt. 800 l der Kultur werden für den Glycerolstock verwendet (siehe Protokoll 12). Puffer 1 (resuspension buffer, Qiagen) und Puffer 3 (neutralisation buffer, Qiagen) werden auf Eis gestellt. Die Proben werden in 50 ml Falconröhrchen gefüllt und bei 3000 U/min 10 min. in der großer Zentrifuge (Megafuge 1.0 R) zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, die restliche Flüssigkeit wird abrinnen gelassen. Dazu wird das Röhrchen kurz verkehrt auf Papier gestellt. Das Pellet wird in 4 ml Puffer 1 aufgelöst, 4 ml Puffer 2 (lysis buffer, Qiagen) werden zugefügt, das Röhrchen geschwenkt und bei Raumtemperatur 5 min. inkubiert. 4 ml Puffer 3 werden zugefügt, das Röhrchen wird wieder geschwenkt und 15 min. auf Eis gestellt. Danach wird das Röhrchen 30 min. bei 20000 U/min und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Falconröhrchen geleert und erneut 30 min. bei 20000 U/min und 4°C zentrifugiert. 4 ml QBT-Puffer (equilibration buffer, Qiagen) werden auf ein neues Säulchen mit Schablone, welches auf ein neues 50 ml-Falconröhrchen gestellt wird, pipettiert und durchlaufen gelassen. Der Überstand aus dem zentrifugierten Falconröhrchen wird auf dieses Säulchen gekippt und durchlaufen gelassen. Es wird zwei mal mit 10 ml QC-Puffer (wash buffer, Qiagen) gewaschen, anschließend wird das Säulchen auf ein neues 50 ml-Falconröhrchen gestellt. Mit 5 ml QF-Puffer (elution buffer, Qiagen) wird die DNA eluiert. 3.5 ml Isopropanol wird zur DNA hinzugefügt, das Ganze wird 30 min. in den Kühlschrank gestellt. 18 Die Zentrifuge wird vorgekühlt (4°C), die DNA-Lösung in 6 Eppendorfröhrchen umgefüllt und bei 13.200 U 30 Min. bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, die DNA bei Raumtemperatur 15 min. lang getrocknet. Danach wird die DNA der 6 Eppendorfröhrchen mit 50 l Aqua dest. aufgelöst und dabei in ein Eppendorfröhrchen zusammengeführt. 2.3.5 Protokoll 5: Gelelektrophorese 2.3.5.1 Analytisches Gel 0.5g Agarose, 1ml Tris-Acetate-EDTA (TAE) stock (50x) (242g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) und 57.1 ml Essigsäure (CH3COOH)) werden in einem Gefäß auf 50 ml mit Aqua dest aufgefüllt. Dieser Gelansatz wird 3 min. lang in der Mikrowelle erwärmt, die Gelkammer wird vorbereitet. 5 Tropfen Ethidiumbromid werden auf den Kammerboden getropft. Das flüssige Gel wird im Gefäß mit Wasser von außen etwas gekühlt bis die Substanz nicht mehr so flüssig ist. Dann wird es in die vorbereitete Gelkammer gefüllt und der Kamm wird eingesetzt. Nach Festwerden des Gels wird der Kamm entfernt und der Laufpuffer eingefüllt. Laufpuffer: 250 ml H2O, 5ml TAE. 5 Tropfen Ethidiumbromid werden in das untere Ende der Kammer getropft nachdem der Puffer eingefüllt wurde. Danach werden die Proben in die Slots pipettiert. Als Größenstandard wird meist Hind III (New England Biolabs) (10 l ) verwendet. Die Proben werden wie folgt vorbereitet: Probe PCR-Produkt: 5 l Probe + 5 l Probenpuffer (0.25% Bromophenolblau, 30% Glycerol in Aqua bidest.) Midiprep: 1l + 9l Aqua dest. +5 l Probenpuffer Miniprep: 3-5l +5 l Probenpuffer 19 2.3.5.2 Präparatives Gel Das gesamte Ligations- oder PCR-Produkt wird mit 10 l Probenpuffer in Slots gefüllt. Anschließend entspricht das Verfahren der Anleitung für das analytische Gel. Die gewünschten Banden werden unter Sicht mit einem UV-Visier mit einer Skalpellklinge ausgeschnitten, in Eppendorfröhrchen gefüllt, und gewogen. Zuvor werden die Eppendorfröhrchen gewogen um das tatsächliche Gewicht des Gelstückes ausrechnen zu können. Das Produkt wird mit Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System von Promega laut KitAnleitung aus dem Gel herausgelöst und gereinigt. 2.3.6 Protokoll 6: PCR von Gß1 und G2 Der Ansatz erfolgt auf Eis: Primer-Verdünnung auf 100 ng/l: 10l Primer + 90l Aqua dest. Plasmid-Verdünnung auf 10 ng/l: Midi: 1l Midi + 99l Aqua dest. Mini: 1l Mini + 9l Aqua dest. 2l Plasmid (10 ng/l) 1.25l Forward-Primer 1.25l Reverse-Primer 5l Reaction buffer (10x)(Promega) 1.25l dNTP-Mix (Promega) 38.25l Aqua dest. Alles wird gevortext, 1l Pfu-Polymerase (Promega) wird hinzufgefügt und die Eppendorfröhrchen werden in das PCR-gerät gesetzt, welches gleich gestartet wird. 20 2.3.7 Protokoll 7: Schneideansatz für Vektor und Insert 2.3.7.1 Schneideansatz pIRES und PCR-Produkt G2 Zum Schneiden des pIRES-Vektors und des PCR-Produkts G2 für eine folgende Ligation desselben in pIRES werden 2 Schneideansätze vorbereitet. Vektor (pIRES) Insert (G2) 10l pIRES-Midi 50l aufgereinigtes PCR-Produkt 10l Buffer D (Promega) 10l Buffer D 10l BSA verdünnt (100l+900l) 10l BSA verdünnt (100l+900l) (Promega) 4l Xba I (Promega) 4l Xba I 4l Sal I (Promega) 4l Sal I 62l Aqua dest. 22l Aqua dest. Die zwei Schneideansätze werden in zwei verschiedene Eppendorfröhrchen pipettiert und stehen über Nacht bei 37°C im Brutschrank. Zu pIRES x Xba I x Sal I wird vor der Weiterverarbeitung mit dem präparativen Gel noch 1 l Alkaline Phosphatase (Promega) hinzugefügt. Nach der Anfertigung des präparativen Gels erfolgt die PCR-Aufreinigung (siehe Protokoll 13). 2.3.7.2 Schneideansatz pIRES und PCR-Produkt Gß1 Nach der Sequenzierung von pIRESG2 können pIRESG2 und das PCR-Produkt Gß1 geschnitten werden, um diese in weiterer Folge zu ligieren. Das muss in diesem Fall in zwei Schritten geschehen, da die Puffer der zwei Restriktionsenzyme nicht dieselben sind. Zwischen den zwei Schritten erfolgt eine PCR-Aufreinigung (siehe Protokoll 13). 21 Die PCR-Produkte Gß1 und pIRES werden geschnitten: Schritt 1: Vektor (pIRESG2) Insert (Gß1) 50l pIRESG2-Midi 50l aufgereinigtes PCR-Produkt 10l Buffer H (Promega) 10l Buffer H 10l BSA verdünnt (100l+900l) 10l BSA verdünnt (100l+900l) 4l EcoR I (Promega) 4l EcoR I 66l Aqua dest. 26l Aqua dest. Die zwei Schneideansätze werden wieder in zwei verschiedene Eppendorfröhrchen pipettiert und stehen über Nacht bei 37°C im Brutschrank. Nach der PCR-Aufreinigung erfolgt Schritt 2: Vektor (pIRES G2) Insert (Gß1) 50l des aufgereinigten 50l des aufgereinigten Schneideansatzes pIRES G2 Schneideansatzes Gß1 10l Buffer B (Promega) 10l Buffer B 10l BSA verdünnt (100l+900l) 10l BSA verdünnt (100l+900l) 4l Nhe I (Promega) 4l Nhe I 26l Aqua dest. 26l Aqua dest. Vor der Anfertigung des analytischen Gels wird 1l alkaline Phosphatase (Promega) zu dem geschnittenen Vektor hinzugefügt. Danach wird ein präparatives Gel von Vektor und Insert angefertigt. 22 2.3.8 Protokoll 8: Standardreihe, Ligation Nach der Anfertigung eines präparativen Gels und der PCR-Aufreinigung von Vektor und Insert werden die Konzentrationen von Vektor und Insert anhand einer Standardreihe gemessen. Dazu wird eine beliebige Midi verwendet, die wie folgt verdünnt wird: Verdünnungsreihe DNA-Konzentration Verdünnung A 50ng 1l DNA + 19l Aqua dest. B 100ng 1l DNA + 9l Aqua dest. C 250ng 1l DNA + 3l Aqua dest. D 500ng 1l DNA + 1l Aqua dest. E 1000ng 1l DNA Von jeder Verdünnung (A-E) werden 1l mit 5l Probenpuffer vermischt und auf ein Gel (siehe Protokoll 5, analytisches Gel) aufgebracht. Zum Vergleichen werden jeweils 5l von Vektor und Insert mit jeweils 5l Probenpuffer aufgebracht. Nach dem Abschätzen der DNA-Konzentration von Vektor und Insert anhand der Standardreihe erfolgt die Ligation: 3l des verdünnten Vektors in ein Eppendorfröhrchen pipettieren, 3 min. bei 6l des Inserts 50°C in den vorgeheizten Heizstock stellen und 3.5l Aqua dest dann 1 min. auf Eis stellen 2l Ligasepufffer Auf Eis stehend hinzufügen, dann über Nacht in 0.5l Ligase Wasserbad stellen (12°C) 23 2.3.9 Protokoll 9: Fällung der Ligationsprodukte Die Proben werden mit 300l 95%igem Alkohol und 23l Ammoniumpersulfat 30 min. lang eingefroren, danach 30 min. zentrifugiert (13.200 U/min., Zentrifuge vorkühlen auf 4°C) und mit 1 ml 80 %igem Alkohol gewaschen. Die Flüssigkeit wird abpipettiert, die Probe wird 15 min. luftgetrocknet und anschließend in 5 l Aqua dest. aufgelöst. 2.3.10 Protokoll 10: Miniprep Lt. Kit-Anleitung: Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) 2.3.11 Protokoll 11: Restriktionsanalysen der Ligationsprodukte pIRESG2 und pIRESGß1G2 2.3.11.1 Restriktionsanalyse von pIRESG2 mit Sal i und Xba I und Kontrollschnitt mit Cla I 800l von jeder Miniprep werden für das Anfertigen eines Glycerolstocks aufgehoben. Es erfolgt die Anfertigung eines Mastermix (15x), da 12 Proben und einmal der reine Vektor (1l Midi+5l Aqua dest.) gleichzeitig geschnitten werden sollen. Als Kontrolle wird auch der reine Vektor ungeschnitten (1l+19l Aqua dest.) bei 37°C über eine Nacht in den Brutschrank gestellt. Alle Proben werden mittels Gelelektrophorese untersucht. 6l DNA 2l Puffer D (Promega) 2l BSA verdünnt (Promega) 0.5l Xba I (Promega) 0.5l Sal I (Promega) Auf 20l mit Aqua dest. auffüllen Zwei Ansätze werden vorbereitet: einer mit pIRESG2, einer mit pIRES als Kontrolle. 1l der pIRES-Midi mit 9 l Aqua dest. werden als 10 l DNA in der Anleitung gewertet. 24 2l Buffer C (Promega) 2l BSA verd. (1+9) Promega 0.5l Cla I (Promega) 10l DNA (pIRES G2, bzw. pIRES) 5.5l Aqua dest. 2.3.11.2 Restriktionsanalyse von pIRESGß1G2 mit EcoRI und Nhe I 12 Proben und zusätzlich pIRESG2 (1l Midi+5l Aqua dest.) als Kontrolle sollen jeweils mit den Restriktionsenzymen Eco R I und Nhe I geschnitten werden. Bei 37°C werden die Proben mit den Restriktionsenzymen über eine Nacht in den Brutschrank gestellt. Die Proben werden wieder mittels Gelelektrophorese untersucht. Ansatz für die Restriktion mit Eco R I 5l DNA 2l Puffer H (Promega) 2l BSA verdünnt (Promega) 0.5l Eco R I (Promega) 0.5l Nhe I (Promega) Auf 20l mit Aqua dest. auffüllen Ansatz für die Restriktion mit Nhe I 5l DNA 2l Puffer D (Promega) 2l BSA verdünnt (Promega) 0.5l Xba I (Promega) 0.5l Sal I (Promega) Auf 20l mit Aqua dest. auffüllen 25 2.3.12 150l Protokoll 12: Glycerolstock Glycerol und 800l der Bakterienkultur werden zusammen in ein Eppendorfröhrchen pipettiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und danach bei -70°C gelagert. 2.3.13 Protokoll 13: DNA-Aufreinigung Lt. Kit-Anleitung: Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) 2.3.14 Protokoll 14: MCF-7-Zellkultur Zur Überprüfung des Konstruktes auf dessen Funktionsfähigkeit wurde pIRESG2G1 in MCF-7 Zellen eingebracht, die Expression von Gß1G2 wurde mikroskopisch nachgewiesen. Dafür erfolgte eine MCF-7-Zellkultur über drei Tage. Tag 1: Das Zellmedium (Minimal Essential Medium Eagle (MEM), PAA Laboratories GmbH, 10% fetal bovine serum (FBS) `Gold’, PAA Laboratories GmbH), in weiterer Folge als „Medium“ bezeichnet, der vorhandenen MCF-7-Zellen wurde abpipettiert und die Zellen wurden mit 1 ml Trypsin EDTA von der Kulturschale gelöst. Die Zellen wurden mit 3 ml Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Lonza) gewaschen. 4 ml Medium wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden in Falkonröhrchen bei 500 U/min 5 min. lang zentrifugiert, worauf am Röhrchenboden ein Zell-Pellet entstand. Das Pellet wurde in 5 ml Medium aufgelöst, und die Zellen anschließend in der Zählkammer gezählt (Resultat: durchschnittlich 75 Zellen/Kästchen). Je 5 ml Zellen und 7,5 ml Medium wurden in 5 Schälchen pipettiert. 2 Plättchen wurden jedem Schälchen zugefügt, und diese wurden über Nacht in den Brutschrank bei 37°C gestellt. Tag 2: 5 Eppendorf-Röhrchen mit je 700l Medium wurden vorbereitet. Es wurde jeweils der Vektor mit den beiden Inserts (pIRESG2G1) dazu pipettiert. 26 In Röhrchen 2 bis 5 wurden auch noch spezifische Marker, welche fluoreszmarkiert waren, hinzugefügt, um die Lokalisation von G1G2 in den MCF-7-Zellen feststellen zu können, in welchen es exprimiert werden sollte. Ansatz 1 beinhaltete nur den Vektor pIRESG2G1. Ansatz 2 enthielt ein Plasmid welches human GIRK4 zur Expression brachte und mit cyan fluorescent protein (CFP) markiert war. GIRK4 ist in Zellmembran und Endoplasmatischem Retikulum (ER) lokalisiert. Ansatz 3 enthielt einen Glycosylphosphatidylinositol-Anker (GpI), abermals mit CFP fluoreszenzmarkiert, welcher nur in der äußersten Zellmembranschicht detektiert werden kann. Ansatz 4 enthielt Srß, welches das Endoplasmatische Retikulum markiert. Somit ergaben sich folgende Ansätze: 1. 3l DNA pIRESG2G1 2. 1.5l DNA pIRESG2G1 +1.5l peCFPC1hG4 3. 1.5l DNA pIRESG2G1 +1.5l GpI-CFP 4. 1.5l DNA pIRESG2G1 +SRß-CFP Jeweils 9 ml TransfastTM (Transfection reagent, Promega) wurde dazugefügt, das Röhrchen wurde gevortext und 10 min. stehen gelassen. Das Medium in den 5 Schälchen wurde abpipettiert und je ein vorbereiteter Ansatz wurde auf die Zellen pipettiert. Diese wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert, 700l Zellmedium wurde zugegeben und die Zellen wurden für eine Nacht in den Brutschrank gestellt. Tag 3: Das Medium wurde abgesaugt, die Zellen mit 1 ml HBSS-Puffer (Lonza) gewaschen, und 2 ml Medium wurde hinzugefügt. 27 2.3.15 Protokoll 15: Konfokalmikroskopie Zur Beurteilung der MCF-7-Zellen wurde ein Konfokales Laser Scanning Mikroskop, DMIRE2, SL2, von Leica verwendet. Es handelt sich um eine Form der Lichtmikroskopie, die Lichtquelle ist in diesem Fall ein Laser. Der Laser wird rasterartig Punkt für Punkt auf eine virtuelle Schnittebene des Objektes, in diesem Fall der MCF-7-Zelle, fokussiert. Das bedeutet, dass eine Schicht in der Zelle bzw. im Gewebe dargestellt werden kann. Der von der Lichtquelle ausgesandte Laserstrahl wird wegen seiner kürzeren Wellenlänge vom dichroitischen Spiegel (Dichroic mirror) reflektiert. Das vom Objekt reflektierte Licht, bzw. das ausgesandte Licht der Fluorochrome, geht durch den dichroitischen Spiegel wegen seiner längeren Wellenlänge durch. Anschließend wird es durch eine Lochblende gefiltert (siehe Abb.5, spatial filter with pinhole). So erreicht nur Licht der Fokusebene den Detektor und Streuungsartefakte werden vermieden. Der Laser kann mit unterschiedlichen Wellenlängen ausgesandt werden, um gesondert bestimmte Fluoreszenzmarker bestimmen zu können. Der Marker yellow fluorescent protein (YFP) wurde zur Detektion von Gß1G2, und enhanced cyan fluorescent protein (eCFP) zur Detektion der Zellstrukturen (Zellmembran, Endoplasmatisches Retikulum) verwendet. (Nwaneshiudu et al. 2012) 28 Abbildung 7 Konfokales Laser Scanning Mikroskop, Nwaneshiudu et al., 2012 29 3 Ergebnisse – Resultate 3.1 Primer-Design für die Inserts Gß1 und G2 Es wurde für Gß1+YFP (yellow fluorescent protein) und G2 jeweils ein forward- und ein reverse-Primer designed um dessen DNA aus bereits vorhandenen Vektoren zu klonieren und anschließend mit PCR zu vervielfältigen. Folgende Primer wurden bei der Firma Sigma bestellt: Primer für G2: Forward (Xba I_Gg2_cdsA-f): 5’-TTA.TCTAGA.ATGGCCAGCAACAACACCGCC-3’ Reverse (Sal I_Gg2_cdsA-r): 5’-TTA.GTCGAC.TTAAAGGATAGCACAGAAAAAC-3’ Primer für Gß1+YFP: Forward (Nhe I_eYFP-cds_f): 5’TTA.GCTAGC.ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ Reverse (EcoRI_Gb1_cds_r): 5’TTA.GAATTC.TTAGTTCCAGATTTTGAGGAAG-3’ Beginn der Sequenzen aller Primer waren die drei Basen TTA, die nur als Andockplatz für die Restriktionsenzyme dienten. Diese Enzyme sollten die PCR-Produkte dahinter schneiden können, um sie auf eine Ligation in pIRES zu einem späteren Zeitpunkt vorzubereiten. Darauf folgte eine sechsbasige Sequenz, die Schnittstellen verschiedener Enzyme darstellte. GCTAGC, für Nhe I, und GAATTC, für EcoR I, wurden für Gß1+YFP verwendet, da diese Enzymschnittstellen im pIRES-Vektor die MCS A flankieren, in die Gß1+YFP ligiert werden sollte. TCTAGA, für Xba I, und GTCGAC, für Sal I, wurden für G2 verwendet, welches zu einem späteren Zeitpunkt in der selben Art und Weise in die MCS B ligiert wurde. Daran wurden dann jeweils 22 Basen der (im Falle der Reverse-Primer komplemetären) Sequenzen, der zu klonierenden G-Protein-Untereinheiten, gehängt, um eine optimal spezifische Bindung zu gewährleisten. Sind die Primer zu kurz, können sie unspezifisch an mehreren Stellen des vorhandenen Vektors binden, sind sie zu lange, können sie möglicherweise an sich selbst binden und somit zur Replikation unbrauchbar werden. 30 Die 22 an G2 und Gß1+YFP bindenden Basen der Forward-Primer beginnen immer mit deren Startcodon ATG, die der Reverse-Primer immer mit den drei komplementären Basen zu deren Stoppkodon TTA. Da Gß1 mit YFP fusioniert ist, folgte nach der Schneidesequenz für Nhe I die Anfangssequenz von YFP. 3.2 Temperaturgradient, PCR-Optimierung, Herstellung PCRProdukt Für Gß1 wurde mithilfe eines Temperaturgradienten (die mittlere Temperatur betrug bei den drei Versuchsdurchgängen 60, dann 55, und schlußendlich 45°C) und anschließender Gelelektrophorese eine optimale Annealing-Temperatur von 47,1°C ermittelt (siehe Abbildung 8). Abbildung 8 Temperaturgradient für PCR von Gß1. Von links nach rechts: Hind III, 6x Gß1 (mit YFP zusammen 1739 Basen groß) bei jeweils 35,1°C, 37,2°C, 41,6°C, 47,1°C, 52,1°C, 55,3°C Das PCR-Programm war wie folgt: 2 min. 95°C, 35x (1 min. 95°C, 1 min. mittlere Temperatur, je nach Versuch, 6 min. 72°C), 10 min. 72°C, 1 min. 14°C. hold 14°C. Für G2 wurde mit der selben Methode eine optimale Temperatur von 57,1°C festgestellt. Die PCR konnte also mit einer zentralen Annealingtemperatur von 50°C für beide Inserts gleichzeitig gefahren werden, wobei Gß1 auf Position 6 (49,4°C) und G2 auf Position 9 (57,1°C) gesetzt wurden. Die PCR für G2 wurde doppelt angesetzt, weil die Banden bei der Bestimmung der Temperatur eher schwach waren (siehe folgende Abbildung). 31 Abbildung 9 Analytisches Gel der PCR-Produkte Gß1 und G2. Von links nach rechts: Hind III, Gß1 (Pfeil), 2xG2 (Pfeil) Es folgte eine PCR-Aufreinigung (siehe Protokoll 13). 3.3 Präparatives Gel mit pIRES und G2 für die folgende Ligation Durch die Anfertigung eines präparativen Gels wurden die Produkte des Schneideansatzes pIRES und G2 (siehe Protokoll 7) zur Ligation vorbereitet (siehe Abb.10). Die geschnittenen PCR-Produkte wurden so gereinigt. Die ausgeschnitten Banden wurden gewogen. Es folgte eine DNA-Aufreinigung mit Kit (siehe Protokoll 13). Abbildung 10 Präparatives Gel der PCR-Produkte Gß1 und G2. Von links nach rechts: Hind III, G2 (Pfeil), pIRES (Pfeil) 32 3.4 Standardreihe, Ligation & Kontrollschnitte von pIRESG2 mit Xba I, Sal I und Cla I Wie in Protokoll 8 beschrieben, wurden pIRES (siehe Abb.12) und G2 (siehe Abb.11) nach der Aufreinigung mit einer Standardreihe verglichen, um die beiden Produkte auf dieselbe Konzentration zu bringen. Nachdem die Bande von G2 der Bande der Standardreihe mit der Konzentration 50 ng entsprach, und die Bande von pIRES ungefähr auf 800 ng geschätzt wurde, wurde 1 μl pIRES mit 15 μl Aqua dest. verdünnt. Vom Insert wurde dann wie üblich die doppelte Menge eingesetzt, das ergab 3l des verdünnten Vektors und 6 l des Inserts, wie auch in Protokoll 8 beschrieben. Abbildung 11 Verdünnungsreihe zur Abschätzung der DNA-Menge des Inserts G2 (Pfeil). Links: Hind III. Die Bande von G2 wurde auf 50 ng geschätzt. Abbildung 12 Verdünnungsreihe zur Abschätzung der DNA-Menge des Vektors pIRES. Links: Hind III. Die Bande von pIRES wurde auf 800 ng geschätzt. 33 Die erste Ligation (pIRES + G2) wurde wie in Protokoll 8 beschrieben durchgeführt. Nach der Transformation von 2l Ligationsprodukt in 25l XL1-Zellen, und deren Anzucht, wurden 12 von 29 angewachsenen Kolonien weitergezüchtet und daraus 12 Minipreps gewonnen. Bei diesen 12 Proben wurden Kontrollschnitte durchgeführt. Mit Xba I und Sal I wurde G2 wieder aus pIRES hinausgeschnitten und mit Gelelektrophorese dargestellt. Bei drei der 12 Proben war G2 sichtbar. Eine dieser Proben wurde also als Ausgangsvektor für die weitere Ligation von Gß1 ausgesucht und zum Sequenzieren eingeschickt. Abbildung 13 Kontrollschnitte von 12 pIRESG2-Proben mit Xba I und Sal I. Links: Hind III. Bei der 9., 10., und 11. Probe ist das herausgeschnittene Insert G2 zu erkennen (Pfeil). Die zwei Proben ganz rechts sind der geschnittene Vektor pIRES und der ungeschnittene Vektor pIRES als Kontrolle. Ein weiterer Kontrollschnitt der ausgewählten Probe wurde durchgeführt. Cla I (Promega) sollte, wie durch den „Webcutter“ ermittelt, zweimal im pIRES-Vektor (bei Base 2036 und Base 4007), und einmal im G2-Insert (bei Base 81) schneiden. Daraus ergeben sich rein mathematisch folgende 3 Plasmidteillängen: Schnittstelle Schnittstelle an Base pIRES+G2 In G2 81 1752+81=1833(a) pIRES 1. 2036 2036+223=2259(b) pIRES 2. 4007 4007+223=4230(c) 34 Gesamtvektorgröße (Vges) = pIRES+ G2 = 6107+223=6330 Basen Entstehende Plasmidteillängen: B=b-a=426 Basen C=c-b=1971 Basen A=V-(A+B)=3933 Abbildung 14 Berechnete Schnittstellen in pIRESG2 bei Cla I Kontrollschnitt Die Theorie bestätigte sich nicht, der pIRESG2-Vektor wurde nur zweimal geschnitten. Nachdem aber ein leerer pIRES Kontrollvektor auch nur einmal geschnitten wurde, wurde angenommen, dass im Gegensatz zur Dokumentation die von der Firma Clontech zur Verfügung gestellt wurde, im reinen Vektor nur eine Schnittstelle für Cla I zu finden war, also das Insert auch geschnitten und somit im pIRESG2-Vektor enthalten gewesen sei. Auch die erhaltenen Fragmentlängen passten zu einer Schnittstelle im Vektor und einer im Insert. (siehe Abb.15) 35 Abbildung 15 Kontrollschnitt von pIRESG2 mit Cla I. Von links nach rechts: Hind III, pIRESG2 und pIRES geschnitten mit Cla I. pIRESG2 wird von Cla I zwei mal geschnitten, es entstehen 2 Banden. pIRES wirn nur einmal geschnitten, der Vektor ist linearisiert. Abbildung 16 Vermutete Schnittstellen pIRESG2 bei Cla I Kontrollschnitt Eine Midiprep von pIRESG2 wurde hergestellt. Weiterer Kontrollschnitt der fertigen pIRESG2 –Midi mit ClaI: Abbildung 17 Kontrollschnitt von pIRESG2 mit Cla I. Von links nach rechts: Hind III, pIRES und pIRESG2 geschnitten mit Cla I. 36 3.5 Präparatives Gel mit pIRESG2 und Gß1 für die folgende Ligation Ein Schneideansatz von Gß1 und pIRESG2 wurde laut Protokoll 7 angesetzt. Dieser musste schrittweise erfolgen, weil EcoRI und NheI unterschiedliche Puffer benötigen. Ein präparatives Gel mit pIRESG2 und Gß1 nach EcoRI und NheI- Restriktion (siehe Protokoll 7) wurde hergestellt. Präparatives Gel: Abbildung 18 Präparatives Gel von Gß1 und pIRESG2 für die folgende Ligation. Von links nach rechts: Hind III, Gß1 geschnitten mit EcoR I und Nhe I und pIRESG2 (Pfeil) geschnitten mit EcoR I und Nhe I Die Banden wurden ausgeschnitten und gewogen. Es folgte eine DNA-Aufreinigung mit Kit (siehe Protokoll 13). 3.6 Standardreihe und Ligation Das Mengenverhältnis von Gß1 und pIRESG2 entsprach in der dazugehörigen Standardreihe einem Verhältnis von 70:200. 37 Abbildung 19 Verdünnungsreihe zur Abschätzung der DNA-Menge des Inserts Gß1 und des Vektors mit dem Insert G2, pIRESG2. Links: Hind III. Gß1wurde auf 70 ng geschätzt, pIRESG2 auf 200 ng Daher wurde der Vektor vor der Ligation im Verhältnis 1:1.85 mit Aqua dest. verdünnt. Da 3 l vom Vektor für die Ligation gebraucht wurden, wurden 3l des Vektors und 5.55l Aqua dest. gemischt und 3 l davon für die Ligation von Gß1 und pIRESG2 (siehe Protokoll 8) verwendet. Es folgte die Transformation von 2l Ligationsprodukt in 25l XL1-Zellen (Protokoll 1) und die Anzucht auf Agarplatten. 12 angewachsenen Kolonien wurden weitergezüchtet und daraus 12 Minipreps gewonnen. 3.7 Kontrollschnitte von pIRESGß1G2 mit EcoR I und Nhe I Da die Puffer von EcoRI und NheI nicht dieselben waren, wurden die 12 Minipreps aus den weitergezüchteten Kolonien getrennt voneinander mit NheI und EcoRI geschnitten. Alle Proben waren linearisiert. Die errechnete Bandengröße von pIRESGß1G2 beträgt 8069 Basen, welche sich aus pIRES (6107 Basen) + G2 (223 Basen) + Gß1 (1022 Basen) + YFP (717 Basen) ergibt. Als Kontrolle wurde der Vektor ohne das ß-Insert pIRESG2 verwendet, welcher erwartungsgemäß als einzige Probe kleiner war (6330 Basen). Kontrollschnitt mit EcoRI: 38 Abbildung 20 Kontrollschnitt von pIRESGß1G2 mit EcoR I. Von links nach rechts: SM 408, 12 Proben pIRESGß1G2 geschnitten mit EcoR I (8069 Basen) und eine Probe pIRESG2 geschnitten mit EcoR I (6330 Basen). Kontrollschnitt mit NheI: Abbildung 21 Kontrollschnitt von pIRESGß1G2 mit Nhe I. Von links nach rechts: SM 408, 12 Proben pIRESGß1G2 geschnitten mit Nhe I (8069 Basen) und eine Probe pIRESG2 geschnitten mit EcoR I (6330 Basen). 3.8 Ergebnisse der Sequenzierung Eine Midiprep des fertigen Produktes wurde hergestellt und der Vektor wurde zur Sequenzierung eingeschickt. Die Sequenz von G2 aus pIRESG2 entsprach der erwarteten Sequenz. 39 Abbildung 22 Ergebnis der Sequenzierung von pIRESG2. Die Sequenz ist komplementär zur SollSequenz in Abb. 23, das komplementäre Startkodon von G2, TAC, befindet sich in der dritten Zeile, ausgehend vom Pfeil, Leserichtung von rechts nach links. Der Pfeil mit dem Stern markiert eine in der Sequenzierung fehlende Base (Erklärung nach Abb.23). Zur Verdeutlichung der Übereinstimmung der erwarteten und der erhaltenen Sequenz von G2 wurden diese in der folgenden Abbildung noch einmal gegenüber gestellt. (Sequenz G2 erwartet (oben) und Sequenz G2 erhalten (unten) ermittelt in Pubmed (nucleotide blast) (G2, kodierende Sequenz: 118-333) Query 117 AATGGCCAGCAACAACACCGCCAGCATAGCACAAGCCAGGAAACTGGTAGAACAGCTGAA 176 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 204 AATGGCCAGCAACAACACCGCCAGCATAGCACAAGCCAGGAAACTGGTAGAACAGCTGAA 177 GATGGAAGCCAACATCGATAGGATAAAGGTGTCCAAGGCAGCTGCAGATTTGATGGCCTA 145 Query 236 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 144 GATGGAAGCCAACATCGATAGGATAAAGGTGTCCAAGGCAGCTGCAGATTTGATGGCCTA 85 40 Query 237 CTGTGAAGCGCATGCCAAGGAAGATCCCCTCCTGACACCTGTTCCGGCTTCAGAAAACCC 296 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 84 CTGTGAAGCGCATGCCAAGGAAGATCCCCTCCTGACACCTGTTCCGGCTTCAGAAAACCC 297 ATTTAGGGAGAAGAAGTTTTTCTGT 25 Query 321 |||||||||||||||||||| |||| Sbjct 24 ATTTAGGGAGAAGAAGTTTT-CTGT 1 Abbildung 23 Gegenüberstellung der erwarteten (Query) und der erhaltenen (Subject) Sequenz von G2. In der letzten Zeile ist eine fehlende Base in der Sequenzierung rot markiert. In Abbildung 23 fällt bei der Gegenüberstellung der erhaltenen Sequenz mit der SollSequenz auf, dass die Base Thymin an einer Stelle fehlt (rot markiert). Beim Vergleich mit Abbildung 22 ist erkennbar, dass die fehlenden Base, markiert durch den Pfeil mit dem Stern, zum einen am Beginn der Sequenzierung liegt, in einem Bereich in dem Fehler gehäuft zu erwarten sind, und es sich zusätzlich um eines von fünf aufeinanderfolgenden Thymin handelt, was einen weiteren Risikofaktor für einen Lesefehler darstellt. Aus diesen Gründen konnte davon ausgegangen werden, dass es sich um einen vernachlässigbaren Sequenzierungsfehler handelt. Abbildung 24 Ergebnis der Sequenzierung von Gß1YFP aus pIRESGß1G2, Teil 1. Die Pfeile weisen auf Abweichungen der Sequenzierung von der erwarteten Sequenz hin. 41 Abbildung 25 Ergebnis der Sequenzierung von Gß1YFP aus pIRESGß1G2, Teil 2. Die Pfeile weisen auf Abweichungen der Sequenzierung von der erwarteten Sequenz hin. Abbildung 26 Ergebnis der Sequenzierung von Gß1YFP aus pIRESGß1G2, Teil 3. Die Pfeile weisen auf Abweichungen der Sequenzierung von der erwarteten Sequenz hin. Zur Verdeutlichung der Übereinstimmung der erwarteten und der erhaltenen Sequenz von Gß1 und YFP wurden diese in den folgenden zwei Abbildungen gegenüber gestellt. Die tatsächlichen Sequenzen von Gß1 und YFP (oben) und die erwarteten Sequenzen (unten) wurden in Pubmed (nucleotide blast) ermittelt. 42 Query 11 68 Fehlernr. Sbjct 2296 2355 CGA-GAGCTGTTC-CCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGG Query 128 69 CCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCT Sbjct 2415 2356 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCT Query 188 129 GAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTT Sbjct 2475 2416 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTT Query 248 189 CGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCGCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTT Sbjct 2535 2476 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCGCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTT Query 308 249 CAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG Sbjct 2595 2536 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG Query 368 309 CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGA Sbjct 2655 2596 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGA Query 428 369 GCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAA Sbjct 2715 2656 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAA Query 488 429 CTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAA Sbjct 2775 2716 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAA Query 548 489 CTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCA Sbjct 2835 2776 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCA Query 608 549 GAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACTTAAGCTACCA Sbjct 2895 2836 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACTTAAGCTACCA |||1|||||||||2|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGG 43 Query 668 609 GTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGT Sbjct 2955 2896 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGT Query 669 Sbjct 2956 GACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGCTT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGCTT 717 3004 Abbildung 27 Vergleich des Ergebnisses der Sequenzierung von YFP (Query) mit der erwarteten Sequenz (Sbjct). Query 710 769 Fehlernr. Sbjct 90 149 AGAAGCTTAGTGAACTTGACCAGTTACGGCAGGAGGCCGAACAGCTTAAAAACCAAATTA Query 829 770 GAGATGCTCGGAAGGCGTGTGCAGATGCGACTCTCTCTCAGATCACAAACAACATCGACC Sbjct 209 150 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGATGCTCGGAAGGCGTGTGCAGATGCGACTCTCTCTCAGATCACAAACAACATCGACC Query 889 830 CTGTGGGAAGAATCCAGATGCGCACCAGGAGGACGCTGAGGGGACACTTGGCCAAGATCT Sbjct 269 210 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGTGGGAAGAATCCAGATGCGCACCAGGAGGACGCTGAGGGGACACTTGGCCAAGATCT Query 948 890 ATGCCATGCACTGGGGCACCGACTCCAGGCTTCTAGTCAGTGCCTCGCAG-ATGGTAAAC Sbjct 329 270 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||5||||||||| ATGCCATGCACTGGGGCACCGACTCCAGGCTTCTAGTCAGTGCCTCGCAGGATGGTAAAC Query 1006 949 TTATTATCTGGGACAGCTACACCACAAACAAG-TCCATGCCATCC-TCTGCGCTCCTCGT Sbjct 389 330 ||||||||||||||||||||||||||||||||6||||||||||||7|||||||||||||| TTATTATCTGGGACAGCTACACCACAAACAAGGTCCATGCCATCCCTCTGCGCTCCTCGT Query 1061 1007 GG-TCATGACGTGCGCTTATGCCCCTTCTGGGA-CTACGTGGCCTGTG-AG-CCTG-ATA Sbjct 449 390 ||8||||||||||||||||||||||||||||||9||||||||||||||10|11|||12|| GGGTCATGACGTGCGCTTATGCCCCTTCTGGGAACTACGTGGCCTGTGGAGGCCTGGATA Query 1117 1062 -CATCTGCTC-ATTTACA-TCTGAAAACTCGTGA-GGGAATGTACGTGTGAGTCGTGAGC Sbjct 509 450 13||||||||14||||||15|||||||||||||16|||||||||||||||||||||||| ACATCTGCTCCATTTACAATCTGAAAACTCGTGAAGGGAATGTACGTGTGAGTCGTGAGC Query 1172 1118 TG-CTG-ACACCACAG-TTACCTGTC-TGCTGC-GATTTCTGAATGACCATCAGATTGTT Sbjct 568 510 ||17||18|||19|||20||||||||21||||22|23|||||24||||25|||||||||| TGGCTGGACAC-ACAGGTTACCTGTCCTGCTGCCGTTTTCTGGATGACAATCAGATTGTT |||||3|4|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAAGATGAGTGAACTTGACCAGTTACGGCAGGAGGCCGAACAGCTTAAAAACCAAATTA 44 Query 1173 Sbjct 569 ACCAGCCTCTGGGAGAAACACCCACCCTGTG ||||||26||||27||28||||29||30||| ACCAGC-TCTGG-AGA--CACC-ACC-TGTG 1203 593 Abbildung 28 Vergleich des Ergebnisses der Sequenzierung von Gß1 (Query) mit der erwarteten Sequenz (Sbjct). Interpretation der Sequenzabweichungen von Gß1 und YFP aus pIRESGß1G2: Sequenzabweichungen in YFP: 1: Es fehlt die Base Guanin vor einer weiteren Base Guanin. Die schwarze Auslenkung für das zweite Guanin sieht zweigipfelig aus, was auf ein verstecktes Guanin hinweisen könnte. Da der Fehler zu Beginn der Sequenzierung kurz nach dem grau unterlegten Bereich auftritt, kann er vernachlässigt werden. 2: Im Vergleich (Abb.27) fehlt die Base Adenin. Da aber in Abb.24 eine grüne Auslenkung für Adenin erkennbar ist, kann davon ausgegangen werden, dass die Sequenz in Ordnung ist. Sequenzabweichungen in Gß1: 3&4: Die drei ersten Basen von Gß1 stellen in der Vergleichssequenz das Startcodon ATG dar, tatsächlich finden sich aber die Basen CTT. Es handelt sich um eine Punktmutation in Gß1, welche Resultat der Herstellung des Fusionsproteins Gß1YFP ist und keinen Einfluss auf die biologische Aktivität des Proteins hat. 5&6: In der Gegenüberstellung der Sequenz mit der Sollsequenz (Abb.28) fehlt bei beiden Sequenzabweichungen die Base Guanin. In Abb. 25 jedoch ist erkennbar, dass die schwarzen Auslenkungen für die folgenden Basen, ebenfalls Guanin, schon an der Stelle der fehlenden Base vorhanden ist. Somit handelt es sich wahrscheinlich um einen Lesefehler des Sequenziergerätes. 7&8: Eines von drei Cytosin, bzw. eines von drei Guanin fehlt. Bei mehreren gleichen Basen hintereinander ist ein Lesefehler wahrscheinlicher, zudem ist die Qualität der Sequenz nicht mehr gut. 9: Es fehlt die Base Adenin. Die grüne Auslenkung für das darauffolgende Adenin ist aber sehr breit und beinhaltet vermutlich das Fehlende. Die Sequenzabweichungen 6-30 befinden sich schon im grau unterlegten Bereich. Hier wird die Qualität der Sequenzierung verfahrensbedingt kontinuierlich schlechter, wodurch 45 sich die Häufung der Fehler, insbesondere ab dem Sequenzierungsfehler beschriftet mit 10, in diesem Gebiet erklären lässt. 3.9 Nachweis des funktionsfähigen Fluoreszenzmikroskopie Konstrukts mittels Zur Überprüfung des Konstruktes auf dessen Funktionsfähigkeit wurde der Vektor in MCF-7 Zellen eingebracht und die Expression von Gß1G2 wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Eine Zellkultur der MCF-7-Zellen wurde angelegt (siehe Protokoll 14, Methoden). Die MCF-7-zellen wurden mit einem Konfokalen Lasermikroskop untersucht. (siehe Protokoll 15, Methoden). 1.) pIRES Gß1G2 Abb.29 zeigt eine MCF-7-Zelle welche nur G1G2 zur Expression bringt. Links ist die Fluoreszenz durch das an Gß1 gekoppelte YFP dargestellt. Der typische Aufenthalt von Gß1G2 in der Zellmembran, bei eher niedriger Expression, ist gut zu erkennen. Es handelt sich bei der Einstellung um eine virtuelle Schnittebene in der Nähe des Zellkerns. Abb.30 zeigt eine MCF-7-Zelle mit höherer Expression von Gß1G2. Die virtuelle Schnittebene geht durch den Zellkern. Gß1G2 konnte bei höherer Expression in der gesamten Zelle detektiert werden. 54.1µm Abbildung 29, MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2. Links: Fluoreszenz durch das an Gß1 gekoppelte YFP, rechts: lichtmikroskopische Darstellung der Zelle. 46 46.0µm Abbildung 30, MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2. Links: Fluoreszenz durch das an Gß1 gekoppelte YFP, rechts: lichtmikroskopische Darstellung der Zelle. 2.) pIRES Gß1G2 + hGIRK4eCFP Die MCF-7-Zelle in Abb.31 bringt sowohl Gß1G2 als auch GIRK4, welches mit Cyanfluoreszierendem-Protein (CFP) markiert ist, zur Expression. GIRK4 hält sich in der Zellmembran und im Endoplasmatischen Retikulum auf (rot dargestellt). Abbildung 31 MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2 (grün) und GIRK4 (rot). Rechts unten: Lichtmikroskopische Aufnahme der Zelle. 47 3.) pIRES Gß1G2 + GpIeCFP Neben dem Konstrukt wurde ein fluoreszenzmarkierter GlycosylphosphatidylinositolAnker (GpI) in die Zelle eingebracht (rot). Dieser hält sich in der äußersten Schicht der Zellmembran auf. Abbildung 32 MCF-7-Zelle mit pIRES Gß1G2 (grün) und GpI (rot). Rechts unten: Lichtmikroskopische Aufnahme der Zelle. 4.) pIRES Gß1G2 + SrßeCFP Srß hält sich im Endoplasmatischem Retikulum auf und wird, markiert mit CFP, als Marker für dieses eingesetzt. In Abb.33 ist der Unterschied in der Lokalisation von Gß1G2 (grün dargestellt) bei schwacher (Zelle links in allen 4 Bildern) und starker (Zelle rechts) Expression gut erkennbar. Im Bild links unten ist erkennbar, dass sich bei starker Expression Gß1G2 im Zellkern und im Endoplasmatischen Retikulum aufhält, bei schwacher Expression findet sich die typische Zellmembranverteilung. 48 Abbildung 33 MCF-7-Zellen mit pIRES Gß1G2 (grün) und Srß (rot). Rechts unten: Lichtmikroskopische Aufnahme der Zellen. 4 Diskussion Die Ergebnisse mehrerer Studien legen eine Rolle von GIRK1 in der Brustkrebsentstehung und Metastasierung nahe. Es wurde gezeigt, dass die mRNA von GIRK1 in Brustkrebszellen erhöht, und auch signifikant mit Lymphknotenmetastasen assoziiert ist (Stringer et al., 2001). Die Proteinexpression in Brustkrebsgewebeproben konnte immunhistochemisch als signifikant erhöht eingestuft werden, verglichen mit Gewebeproben von normalem Brustgewebe (Brevet et al., 2008). Es ist dementsprechend von Interesse die Rolle von GIRK1 in der Brustkrebsentstehung und Metastasierung weiter untersuchen zu können. Für weitere Untersuchungen wurde von der Arbeitsgruppe im Institut für Biophysik Graz, eine G-Protein-Untereinheit (Gß1G2) benötigt, mit welcher GIRK-Kanäle in Brustkrebszellinien aktiviert werden können. 49 Der Schwerpunkt meiner Diplomarbeit bestand in der schrittweisen Klonierung von Gß1G2 in den Vektor pIRES. Mit diesem Konstrukt kann Gß1G2 nun in Brustkrebszellinien zur Expression gebracht werden und vorhandene GIRK-Kanäle können aktiviert werden. Nach der Vermehrung von pIRES in XL-1-zellen und der Gewinnung der Inserts G2 und G1 mittels PCR, für welche eigens Primer designed wurden, konnten der Vektor und das erste Insert G2 geschnitten werden. Es folgte die Ligation des Inserts in pIRES. Das halbfertige Konstrukt pIRESG2 wurde in XL1-Zellen vermehrt, Kontrollschnitte und die Sequenzierung von G2 zeigten die erfolgreiche Klonierung des ersten Inserts. Das zweite Insert, G1, wurde nach dem selben Verfahren in pIRES kloniert. Die Sequenzierung des zweiten Inserts G1 zeigte, dass das Konstrukt pIRESGß1G2 wie angenommen G2 und G1 enthält. G1 konnte also ebenfalls erfolgreich in pIRES kloniert werden. Auch die Funktionsfähigkeit des Konstrukts in einer Brustkrebs-Zelllinie konnte bewiesen werden. Eingebracht in MCF-7-zellen wurde die G-Protein-Untereinheit G exprimiert und konnten unter dem Mikroskop lokalisiert werden, da G1 mit YFP fluoreszenzmarkiert ist. Zur genauen Bestimmung des Aufenthaltsortes in MCF-7-Zellen wurden fluoreszenzmarkierte Marker für die Zellmembran, die äußerste Schichte der Zellmembran und das Endoplasmatische Retikulum eingesetzt. Die Lokalisation des Proteins war bei schwach exprimierenden Zellen erwartungsgemäß vor allem in der Zellmembran. Bei stark exprimierenden Zellen konnte keine eindeutige Lokalisation definiert werden, die Fluoreszenz konnte in der gesamten Zelle festgestellt werden. Da die G-Protein-Untereinheit G GIRK-Kanäle aktiviert, kann das Konstrukt nun dazu verwendet werden die Funktionalität von GIRK1-Protein in Brustkrebszellen weiter zu charakterisieren. Eine Limitation des Konstruktes könnte eine mögliche eigenständige Rolle von G in der Tumorpathogenese, beschrieben in Kapitel 1.5.2, darstellen. G wirkt, induziert durch GPCRs, aktivierend auf Tumorzellproliferation, Zellmigration und Metastasierung, und beeinflusst das Micromilieu der Tumorzellen. Ob diese Wirkung durch Aktivierung von GIRK1 zustande kommt oder ob G die Brustkrebszellen unabhängig von GIRK1 beeinflusst bleibt zu untersuchen. 50 5 Literaturverzeichnis Bleyer, A. & Welch, H.G. 2012, ‘Effect of three decades of screening mammography on breast-cancer incidence’, N Engl J Med, 22;367(21):1998-2005 Brevet, M., Ahidouch, A., Sevestre, H., Merviel, P., El Hiani, Y., Robbe, M. & OuadidAhidouch, H. 2008, ‘Expression of K+ channels in normal and cancerous human breast’, Histol Histopathol, 23:965-972 Changeux, J.P. & Edelstein, S. J. 2005, ‘Allosteric Mechanisms of Signal Transduction’, Science, 308:1424-1428 Clontech 2008, pIRES Vectorinformation, Website besucht am 23.05.2013, www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=17708 Dascal, N. 1997, ‘Signalling Via the G Protein-Activated K+ Channels’, Cell.Signal. 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