Allgemeine Grundlagen Replikation - Ruhr

Replikation
Allgemeine Grundlagen
• Replikation
• Transkription
• Translation
• Signaltransduktion
• Trennung der Doppelhelix
(Mutterstrang) in ihre 2
1. Allgemeines
•
DNA dient als Matrize, d.h. als Vorlage für die
Vervielfältigung und Weitergabe der genetischen Information
•
Stränge sind zueinander komplementär
•
z.B. 5‘-AGCGTTAGCGATCAT-3‘
•
Replicon: DNA-Abschnitt, der von Replikationsursprung aus
repliziert wird
•
Eukaryoten besitzen mehrere Replicons
•
Origin: Ursprung /Startpunkt der Replikation
3‘-TCGCAATCGCTAGTA-5‘
2. Meselson-Stahl-Experiment
(Beweis der semikonservativen Replikation der DNA)
• Meselson und Stahl, 1957
Einzelstränge
• Kultivierung von E.coli
• Y-Figur mit doppelsträngigem
• Stickstoffquelle 15N („schweres“
Stamm
Isotop)
• Synthese der Tochterstränge
• Trennung der 15N-DNA von der
ausgehend von
14N-DNA
einzelsträngigen Bereichen mit
mittels CsCl-
Dichtegradient
Hilfe spezifischer Enzyme
• Kultivierung auf 14N-Nährboden;
Abb.: semikonservative Replikation der DNA
3. Replikationsmöglichkeiten
1. Semikonservativ (Tochterstrang
besteht jeweils aus einem ElternDNA-Strang und einem TochterDNA-Strang)
15N-DNA
diente als Elternmolekül
4. Replikationselemente
• Replikationsgabel
2. Konservativ (Eltern-DNADoppelstrang wir komplett kopiert;
es entsteht ein kompletter ElternDNA-Strang und ein identischer
Tochter-DNA-Strang)
3. Dispers (Eltern-DNA-Strang
zerbricht in Einzelstücke; es
entstehen 2 Stränge, die
abwechselnd aus Eltern- und
Tochter-DNA bestehen)
• Multi-Enzym-Komplex:
Topoisomerase: Entspiralisieren/Entwinden der Doppelhelix
Helicase: Aufspalten des DNA-Doppelstrangs durch Lösen der
Wasserstoffbrücken
•1
• ssBP: Einzelstrang-bindendes Protein (Stabilisierung)
• Übersicht Replikationskomplex
• Primase: Synthese des Primers (kurze RNA-Sequenz)
• DNA-Polymerase: Synthese des komplementären Stranges in
5‘-3‘-Richtung
• RNase: Abbau der RNA-Primer
• Ligase: Verbinden der einzelnen DNA-Stücke
• DNA-Polymerisation
• Voraussetzungen für Polymerisation: Matrize (Eltern-DNAStrang) und Primer (mit freier 3‘-OH-Gruppe am Ende)
• Korrekturlesefunktion: Entfernung falsch eingebauter Nucleotide
•2
•3
•4
Dnarepli.swf
5. Mechanismus
•
Synthese kurzer Primersequenzen (ca. 10 nt) durch RNAPrimase; Verlängerung durch DNA-Polymerase zu
Okazaki-Fragment (ca. 1000 nt) bis zum 5‘-Ende des
vorherigen Fragmentes
•
Topoisomerase entspannt die superhelikale Struktur der
DNA (Spaltung der DNA, Entwinden, Verschliessen)
•
Helicase trennt die Doppelhelix in 2 Einzelstränge durch
Lösen der Wasserstoffbrücken zwischen A/T bzw. G/C
•
Abbau der Primer durch RNase; Auffüllen der Lücken
durch DNA-Polymerase
•
Primase synthetisiert RNA-Primer als Startpunkt für die
DNA-Polymerase (freies 3‘-OH-Ende)
•
DNA-Ligase verbindet aufeinandertreffende 3‘-und 5‘Enden zu kontinuierlichem Strang
•
Polymerase synthetisiert komplementären Tochterstrang
ausgehend vom 3‘-Ende des Primers
•
•
kontinuierliche Synthese am Leitstrang (5‘-3‘-Richtung)
Beenden (Termination) der Replikation durch Bindung des
Proteins Tus (terminator utilization substance) an DNA;
Blockieren der Helicase
•
Folgestrang: Polymerase muss in entgegengesetzter
Richtung zur Helicase arbeiten
•
Topoisomerase trennt den restlichen unreplizierten
Abschnitt
Übungsaufgaben: Replikation
1. Das menschliche Genom besteht aus ca. 3 x 109 bp. Die
DNA-Polymerase arbeitet mit einer Geschwindigkeit von
ca. 50 bp/s. Wie lange würde demzufolge ein
Replikationszyklus dauern, wenn angenommen wird, dass
nur ein Replicon existiert?
3x 109 bp / 50 bp x s-1 ⇒ 6 x 107 s ⇒ etwa 695 Tage
(ca. 2 Jahre)
2. Aus der Lösung der Aufgabe 1 ist ersichtlich, dass die
Replikation des menschlichen Genoms an mehreren
Orten gleichzeitig starten muss, da sie für das gesamte
Genom etwa 20 h dauert. Wieviele Origins müssen
demnach auf dem Genom mindestens vorhanden sein?
⇒833 Origins
1 Origin: Replikation dauert 6 x 107 s = 1 Mio min
= 16 666,7 h / 20 h
= 833,3 Origins
•5
3. Weshalb findet die Replikation ausschliesslich in 5‘-3‘Richtung statt?
Elternmoleküle
15N
⇒ Die DNA-Polymerase benötigt das 3'-OH-Ende, um
15N
DNA der ersten
Nukleotide anhängen zu können. Damit ist die Richtung
Generation
der Replikation definiert.
14N
15N
15N
14N
4. Worin liegt der Unterschied in der Funktion einer
Topoisomerase und einer Helicase?
2. Generation
⇒ Die Topoisomerase überwindet die Superwindung der
14N 14N
14N 15N
15N 14N
14N 14N
DNA, indem sie den einen Strang spaltet, abwickelt und
wieder verschliesst. Damit macht sie die DNA der Helicase
3. Generation
zugänglich, die nun die Stränge voneinander trennen kann.
14N
14N
14N
14N/15N
14N/15N 14N
14N
14N
Transkription
Informationsfluss
1. Allgemeines
Transkription
DNA
RNA
Zellkern
Prokaryoten
•
Translation
1 RNA-Polymerase
bestehend aus Core (Kern)
mit den Untereinheiten α2,
β und β‘ sowie dem σFaktor
Protein
•
erster Schritt der
Proteinbiosynthese
•
Basensequenz der DNA
wird in mRNA (Botenoder messenger-RNA)
umgeschrieben
•
dabei auch Bildung von tRNA (Transfer- oder Transport-RNA)
und rRNA (ribosomale RNA)
•
tRNA: Transport aktivierter Aminosäuren zu Ribosomen
•
rRNA: Bestandteil der Ribosomen
Cytoplasma
Eukaryoten
• 3 RNA-Polymerasen aus bis
zu 12 Untereinheiten
• RNAP I synthetisiert rRNA
• RNAP II und III
synthetisieren mRNA und
tRNA
2. Initiation (Start)
•
RNA-Polymerase bewerkstelligt Abschreiben eines Gens
•
Verwendung von DNA als Substrat sowie den RibonucleotidTriphosphaten ATP, UTP, CTP und GTP führt zu einem zum
DNA-Strang komplementären mRNA-Strang
•
Polymerase bindet an bestimmte Nucleotidsequenz
(Promotor)
•
Prokaryoten: 10 Nucleotide vor dem Transkriptionsstart
(Pribnow-Schaller-Box); Erkennung dieser Sequenz durch σFaktor, der nach der Bindung an die DNA abdissoziiert
•
Eukaryoten: unmittelbar vor dem Startpunkt (GoldbergHognes-Box); Sequenz: TATAA
RNA-Polymerasen benötigen keinen Primer und haben keine
Reparaturfunktion!
•6
3. Elongation (Kettenverlängerung)
•
•
Polymerase synthetisiert mRNA-Strang, der komplementär
zum Matrizen-DNA-Strang ist
•
Nucleotide: ATP, UTP (anstelle von TTP), CTP und GTP
•
Synthese erfolgt in 5‘-3‘-Richtung
Entwindung der DNA durch RNA-Polymerase-ProteinKomplex, Synthese der mRNA und sofortiges
Verschliessen der DNA
4. Termination (Ende der Transkription)
•
3 Stop-Signalsequenzen in der DNA: ATT, ATC, ACT
•
vorgelagerte GC-reiche Sequenzen, die Haarnadelschleifen
ausbilden können ⇒ Transkriptionsabbruch
•
Beteiligung von Proteinen: Rho-Protein führt unter ATPSpaltung zur Freisetzung der mRNAs
Modifikationen der mRNA
•
Aufbereitung der mRNA für den Transport aus dem Zellkern
durch die Kernporen in das Cytoplasma; erfolgt noch vor dem
Spleißen
•
Capping (cap = Kappe): Anhängen einer Art Kappe aus
mehreren Methylguaninmolekülen (Veränderung des Guanins)
an das 5‘-Ende; wichtig für die Bindung an das Ribosom
während der Translation
•
Polyadenylation: Anhängen einer bis zu 200 Nucleotide
langen Sequenz aus Adenylatresten (Poly-A-Schwanz) an das
5‘-Ende; vermutlich Stabilisierung der mRNA
•
am Ende wird die mRNA mit Hilfe von Proteinen aus dem
Zellkern in das Cytoplasma zu den Ribosomen transportiert
Reifung der RNA (Processing)
•
Unterteilung
eukaryotischer Gene in
Exons (codierende
Sequenzen) und Introns
(nichtcodierende
Sequenzen)
•
pro Gen bis zu 50 der 65
bis 100000 nt langen
Introns möglich
•
Spleißen: Entfernen der
Intronsequenzen, erfolgt
im Zellkern
•
Beteiligung von Proteinen
Codogen – Codon - Anticodon
•7
Der Genetische Code
•
„Sprache der Gene“ wird mit Hilfe der Ribosomen in die
„Sprache der Proteine“ übersetzt
•
deutsche Sprache: 26 Buchstaben; Computersprache: 2
Zeichen (0 und 1) ⇒ Speicherung von Informationen durch
Kombination der Zeichen, d.h. Wörter und Sätze
•
genetische Sprache: 4 Buchstaben (A, T, C, G)
•
Proteinsprache: 20 Buchstaben (Aminosäuren)
•
Triplett-Code: Verschlüsselung der 20 Aminosäuren durch
unterschiedliche Kombination der 4 Basen: 43 = 64
Möglichkeiten
•
61 Tripletts codieren für Aminosäuren; 3 sind Stop-Codone,
für die es keine Aminosäure gibt; Proteinsynthese bricht an
der Stelle ab
•
eindeutig: eine bestimmte Nucleotidsequenz legt eine
bestimmte Aminosäuresequenz fest
•
degeneriert: die Mehrzahl der AS wird durch mehr als ein
Triplett codiert
•
kommafrei: die Tripletts schliessen lückenlos aneinander
•
nicht überlappend: ein Nucleotid ist immer nur Bestandteil
eines Tripletts
•
universell: der genetische Code gilt für alle Organismen
gleichermassen
Translation
1. tRNA und Ribosomen
•
an der Translation beteiligt:
Enzyme, Proteine, Ribosomen, mit
Aminosäuren beladene tRNAs und
die mRNA
•
tRNA = Übersetzermolekül, trägt
an einem Ende die spezifische AS
und am anderen Ende das
Anticodon (passend zur mRNA)
•
Anticodon-Schleife zum Abtasten
der mRNA; D- und T-Schleife
dienen der Anheftung an das
Ribosom
Das Enzym Aminoacyl-tRNA-Synthase belädt die tRNA im
Cytoplasma mit den Aminosäuren.
•8
Ribosomen
•
Orte der Translation
•
Zellen besitzen tausende Ribosomen (E.coli ca. 15 000)
•
in Eukaryoten frei oder gebunden an das Endoplasmatische
Reticulum oder die Kernmembran vorkommend, auch in
Mitochondrien und Chloroplasten zu finden
•
Unterteilung in grosse und kleine Untereinheit
•
Prokaryoten: 70S Ribosomen (50S und 30S Untereinheit)
•
Eukaryoten: 80S Ribosomen (60S und 40S Untereinheit)
Typischer Aufbau eines eukaryotischen Ribosoms
2. Ablauf der Translation
3D-Modell eines E.coli-Ribosoms mit kleiner (gelb) und
grosser (blau) Untereinheit. Die mRNA ist braun, die beiden
tRNA-Moleküle sind magenta und grün.
•
Die Codon-Sequenz der mRNA wird in die Aminosäuresequenz
des Proteins übersetzt
•
mRNA enthält Start- und Stop-Codon (für Beginn und Ende der
Translation wichtig)
•
mRNA fädelt sich in Ribosom ein
•
mit Aminosäuren beladene tRNAs tasten mit ihrem Anticodon
mRNA Stück für Stück ab bis zum fertigen Protein
•
Bildung von Peptidbindungen zwischen den Aminosäuren
•
3 Phasen: Initiation (Start), Elongation (Kettenverlängerung) und
Termination (Ende)
Initiation
•
kleine UE des Ribosoms
und die Start-tRNA (trägt
Methionin) binden an die
mRNA
•
Startcodon: AUG
•
Zwischen Sartcodon AUG
und der Start-tRNA kommt
es zur Basenpaarung durch
Wasserstoffbrücken
•
Methionin: erste AS, trägt
NH2-Gruppe am Ende
•
Anlagerung der grossen UE an die kleine UE; grosse UE besitzt
2 Bindungsstellen für tRNA-Moleküle (Eingang und Ausgang)
•9
Elongation
•
Start-tRNA-Komplex
wandert ein Codon
weiter an den P-Ort
•
A-Ort (Eingang) ist frei
für neue tRNA (Abb.
Prolin)
•
nach Bindung der
Prolin-tRNA an die
mRNA wird zwischen
den AS Methionin und
•
Ribosom „rutscht“ ein
Codon weiter in 5‘-3‘Richtung
•
verbliebene tRNA
wandert dann an den POrt (Ausgang); A-Ort
(Eingang) wird frei
•
Vorgang geht weiter in
5‘-3‘-Richtung
•
immer neue passende, beladene tRNA-Moleküle binden an AOrt, Peptidbindung wird geknüpft, tRNAs rutschen an P-Ort bis
Stop-Codon auftritt
•
Abb.: Basenpaarung desAnticodons der tRNA mit dem Codon
der mRNA sowie die Peptidbindung
Prolin eine Peptidbindung geknüpft
•
tRNA für Methionin verlässt das Ribosom
Termination (Ende)
•
Stop-Codons: UAA, UAG und UGA
•
Abbruch der Synthese, da keine passende tRNA vorhanden
•
Ribosomen-Untereinheiten fallen von der tRNA ab
•
Proteine tragen Signalsequenz am Ende für Transport
Signaltransduktion
Polysomen
•
eine mRNA fädelt sich oft in mehrere Ribosomen
hintereinander
•
gleichzeitige Entstehung von Polypeptidketten (Proteinen) mit
steigender Kettenlänge
2. Signalmoleküle
•
Hydrophile (wasserlösliche) Signalmoleküle (löslich oder auf
Zelloberflächen) – Zelloberflächenrezeptoren
•
Hydrophobe (wasserunlösliche) Signalmoleküle (Steroide,
Vitamine, Tyroxin) – intrazelluläre Rezeptoren
•
Beispiele: Proteine, Peptide, Aminosäuren, Nucleotide,
Steroide (Cortisol, Sexualhormone, Vitamin D),
Fettsäurederivate, Stickstoffmonoxid, Kohlenstoffmooxid
1. Definition
•
Übertragung extrazellulärer (von aussen) Signale ins
Zellinnere bzw. Umwandlung extrazellulärer Signale in
zellinterne Signale, Signalverstärkung und Vermittlung
einer spezifischen Zellantwort
•10
Prozesse im Inneren der
Zellen besitzen ein ausgefeiltes System, um auf Signale von aussen
Zelle:
reagieren zu können:
•
GTP-bindende Proteine (wichtige Klasse von Transmembranrezeptoren)
•
Rezeptoren mit enzymatischer Wirkung
(Transmembranproteine, die ausserhalb der Zelle das
Signalmolekül binden und innen die enzymatische Reaktion
auslösen)
•
1. Anhängen von
Phosphatgruppen an
andere Proteine durch
Proteinkinasen
2. Abspaltung von
Phosphatgruppen an
andere Proteine durch
Proteinphosphatasen
Intrazelluläre Rezeptorproteine (Signal gelangt durch die
Zellmembran und verbindet sich mit dem Rezeptor)
Erläuterung zur Abbildung Signaltransduktion:
3. Phasen der Signaltransduktion
1. Ein G-Protein-abhängiger Rezeptor wird durch ein Signal
aktiviert. Dadurch wird ein second messenger aktiviert (Ca2+
oder cAMP). Dieser aktiviert seinerseits Kinasen. Deren
Aktivierung führt zur Expression ganz bestimmter Gene.
Bindung des Signalmoleküls
an Membranrezeptoren
2. Durch ein äußeres Signal dimerisiert der
Tyrosinkinaserezeptor. Im Inneren phosphoryliert er
bestimmte Kinasen. Diese aktivieren dann ganz bestimmte
Transkriptionsfaktoren, die bestimmte Gene exprimieren.
Weiterleitung des Signals
über die Zellmembran
hinweg
3. Ein Steroidhormon diffundiert durch die Zellmembran. Im
Inneren der Zelle verbindet es sich mit einem Rezeptor.
Dieser Komplex kann nun in den Kern diffundieren und dort
die Expression bestimmter Gene auslösen.
Ligand (z.B.) Hormon
durchdringt die Zellmembran
Bindung des Liganden an
einen Rezeptor innerhalb der
Zelle, Weiterleitung des
Signals in der Zelle
Intrazelluläre
Signaltransduktion
Steuerung von Transkription,
Translation, Stoffwechsel, etc.
Abb.:
TransmembranRezeptor
4. Signalübertragung durch Transmembranrezeptoren
•
Übertragung einer Information über die Zellmembran hinweg
•
äusseres Signal (primärer messenger) bindet an einen
Rezeptor auf der Zellmembran und löst im Zellinneren eine
Reaktion aus, z.B.:
•
Einleiten der Genexpression (Transkription, Translation)
•
Veränderung der Aktivität eines Enzyms
•
Umorganisieren des Cytoskeletts der Zelle
•
Veränderung der Durchlässigkeit der Membran
•
äusserer Teil ragt in Extrazellularraum und bindet Signalmoleküle
•
Einleiten der Mitose
•
•
Einleiten der Apoptose (Selbstmord der Zelle)
durch mittleren Teil erfolgt Verankerung des Proteins in der
Zellmembran (z.T. bis zu 7 Membrandurchgänge)
•
innerer Teil ragt ins Cytoplasma und löst eine Reaktion aus
•11
5. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
•
•
cAMP-Weg: Das G-Protein aktiviert die Adenylatcyclase
(Enzym), die cAMP bildet. Das entstandene cAMP (second
messenger, 2. Botenstoff) aktiviert das Zielprotein.
•
Ca2+-Weg: Das G-Protein aktiviert ein Enzym, das seinerseits
die Öffnung von Ionenkanälen für Ca2+(second messenger)
bewirkt. Das freigesetzte Ca2+ aktiviert das Zielprotein.
Wichtige Klasse von Rezeptoren, die einen „second messenger“
(2. Botenstoff im Inneren der Zelle) aktivieren
•12