Userguide - Hellma Analytics

Userguide
No 031 I BioPhotometer plus
Verwendung der Mikrolitermesszellen von Hellma®
TrayCell™ oder Implen® LabelGuard™ im BioPhotometer
plus für Nukleinsäurebestimmungen
Martin Armbrecht, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Zusammenfassung
Die Verwendung der Mikrolitermesszellen von Hellma und Implen in Kombination mit dem BioPhotometer plus
ermöglicht sehr hohe DNA bzw. RNA Konzentrationen in kleinsten Volumina zu bestimmen. Durch die einfache
Handhabung und die komfortable Auswertung liegt eine preiswerte Alternative zu Spektrophotometern vor,
welche auch in diesem Bereich messen können. Dieser UserGuide soll in erster Linie dazu dienen, den Umgang
mit den Mikrolitermesszellen für reproduzierbare Ergebnisse zu optimieren.
Einleitung
Nach der Isolierung und Aufreinigung von DNA und RNA ist
es meist notwendig für weitere Anwendungen die Konzentration der Nukleinsäure zu bestimmen. In der Regel erfolgt
dieses photometrisch in einem Spektrophotometer. Da die
Nukleinsäuren nach einer Isolierung meist in sehr hohen
Konzentrationen und somit oberhalb des Messbereiches im
Photometer liegen, ist es erforderlich, die Proben zunächst
zu verdünnen.
Die einzelnen Verdünnungsschritte müssen dabei sehr
genau erfolgen, da ansonsten die Berechnung der Ausgangskonzentration schnell fehlerhaft werden kann. Problematisch ist, dass die Proben nach der Verdünnung meist
unbrauchbar sind.
Eine bequeme Alternative ist, Proben direkt ohne zusätzliche Verdünnung mittels so genannter Mikrolitermesszellen
im BioPhotometer plus zu messen. Für die Messung sind
nur wenige Mikroliter ausreichend (0,7 µl – 5 µl). Dabei
werden hochkonzentrierte Proben mit einem sehr kleinen
Lichtweg, wie z.B. 0,2 mm bzw. 1 mm statt der üblichen 10
mm Lichtweg gemessen. Bei einem verkürzten Lichtweg
kann das Licht bei einer bestimmten Wellenlänge selbst bei
hohen Konzentrationen die Probe durchdringen und reproduzierbar gemessen werden.
Da beim BioPhotometer plus keine Aufwärmzeiten vorhanden sind, können die Messzellen direkt nach dem Einschalten für DNA bzw. und RNA-Messungen verwendet werden.
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Messprinzip
Abbildung 1 zeigt eine Übersicht des Messprinzips. Das
Licht (a) des Photometers gelangt über ein Fenster (e) in
das innere der Messzelle und wird über einen Spiegel (b)
nach oben geleitet und gelangt durch ein weiteres Fenster
(e) durch die Probe (c). Im Deckel wird das Licht über einen
Spiegel (b) wieder in die Messzelle zurückgeleitet und über
einen weiteren Spiegel aus der Küvette hinausgeleitet. Der
Detektor des Photometers vermisst die verbleibende Lichtmenge (Absorption). Die für die Messung wichtige optische
Schichtdicke (f) ergibt sich aus der Distanz zwischen Spiegel und oberen Austrittsfenster der Messzelle, welcher für
die Konzentrationsbestimmung der Probe wichtig ist. Die
optische Schichtdicke wird über den Deckel bestimmt: Je
nach Konzentration und Probenvolumen können Deckel mit
0,2 bzw. 1 mm Lichtweg verwendet werden. Die Mikrolitermesszellen werden immer mit beiden Deckeln ausgeliefert
(Abbildung 2a bzw. 2b), wobei der jeweilige verwendete
Lichtweg auf dem Deckel der Traycell bzw. Labelguard
gekennzeichnet ist (1).
Abbildung 1: Schematischer Aufbau der Mikrolitermesszelle von
Hellma (TrayCell) bzw. Implen (Labelguard).
a) Licht, b) Spiegel c) Probe, d) Deckel, e) Fenster f) optische
Schichtdicke.
2a) Deckel für 0,2 mm Lichtweg.
2b) Deckel für 1 mm Lichtweg
Konzentrationsbereich
Sowohl für den 0,2 mm als auch den 1 mm Deckel empfiehlt es sich in einem Extinktionsbereich zwischen 0,1 bis maximal
1,5 E zu arbeiten. Wie in Tabelle 1 dargestellt wird ergeben sich daraus für die verschiedenen Nukleinsäuren folgende Konzentrationsbereiche im Vergleich zu einer Standardküvette mit 10 mm Lichtweg.
Tabelle 1: Nukleinsäure-Konzentrationen bei Verwendung der empfohlenen Extinktionsbereiche (0,1 - 1,5 E)
Nukleinsäure
Faktor
1 mm Deckel [ng/µl]
0,2 mm Deckel [ng/µl]
Küvette mit 10 mm
Lichtweg [ng/µl]
dsDNA
50
50 - 750
250 – 3750
5 – 75
ssDNA
37
37 - 555
185 – 2775
3,7 – 55,5
RNA
40
40 – 600
200 – 3000
4 – 60
Oligo
33
33 - 495
165 – 2475
3,3 – 49,5
Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, lassen sich deutlich höhere Konzentrationen mit den Mikrolitermesszellen bestimmen als in
Küvetten mit 10 mm Lichtweg.
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Einstellungen am BioPhotometer plus
Die Mikrolitermesszellen können direkt ohne Verdünnungsfaktoren eingesetzt werden. Voraussetzung hierfür ist, dass
die optischen Schichtdicken der Deckel in den Parametereinstellungen am BioPhotometer plus angepasst werden.
Die Einstellungen werden nur für die jeweilige verwendete
Methode gespeichert. Bei der Berechnung der Konzentration wird der verwendete Lichtweg automatisch berücksichtigt. Abbildung 3 zeigt die notwendigen Anpassungen
am BioPhotometer plus für die direkte Verwendung des 0,2
bzw. 1 mm Deckels.
a)
b)
Abbildung 3: Einstellung des Lichtweges auf 0,2 mm (a) bzw. 1 mm
(b) (Bsp. dsDNA). Abhängig vom verwendeten Deckel müssen die entsprechenden optischen Schichtdecken im Parametermodus modifiziert
werden.
Zur Änderung der optischen Schichtdicken in den Geräteeinstellungen wählen Sie eine Methode in einer Methodengruppe aus (Bsp. Methode „dsDNA“ in der Gruppe „DNA“).
Wenn der Pfeil im Display auf die gewünschte Methode
zeigt, drücken Sie im Bedienfeld auf „parameter“. Drücken
Sie die Pfeiltasten, bis im Display „Küvette“ erscheint, und
wählen Sie die jeweilige optische Schichtdicke aus (s. Abbildung 3).
Einstellung am BioPhotometer 6131
Bei Verwendung des BioPhotometers 6131 kann die optische Schichtdicke von 0,2 mm nicht direkt am Gerät eingestellt werden. Zur direkten Verwendung ohne Umrechnung
kann dafür alternativ bei Verwendung des voreingestellten
10 mm Lichtweges eine virtuelle 50-fache Verdünnung
eingegeben werden. Drücken Sie hierfür auf „Dilution“
und geben Sie für „Sample“ 1 µl und für „Diluent“ 49 µl
ein. Diese Einstellungen führen ebenfalls zu dem korrekten
Ergebnis.
Umgang und Reinigung
Es empfiehlt sich, während der Messungen Handschuhe
zu tragen um Verschmutzungen am Lichteintritts- bzw.
Austrittsfenster zu vermeiden. Vor jeder Messung sollte die
Küvette immer bis zum Anschlag in den Küvettenschacht
gedrückt werden. Positionsabweichungen der Messzelle im
Schacht können somit zu Messabweichungen führen.
Wie bei Messungen in Standardküvetten mit 10 mm Lichtweg sollten Proben (falls vorher gefroren) immer komplett
aufgetaut sind und anschließend ausreichend durchmischt
werden.
Zwischen zwei Messungen müssen der Spiegel im Deckel
sowie das Fenster auf der Oberseite der Messzelle gereinigt werden. Hierfür kann man herkömmliche Wattestäbchen oder auch normale Papiertaschentücher verwenden.
Verbleibende Fussel sollten mit Druckluft entfernt werden.
Druckluft ist im Bürobedarfsladen erhältlich. Bei stärkeren
Verunreinigung muss der Spiegel auf der Deckelinnenseite
(Abbildung 1 b) und das Fenster auf der Oberseite (Abbildung 1 e) mit 60 % Isopropanol gereinigt werden.
Nähere Informationen zur Reinigung können bei der Firma
Hellma (www.hellma-worldwide.com) erfragt werden.
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Volumina
Als einzusetzendes Volumen empfiehlt der Hersteller 3-5 µl
für den 1 mm Deckel bzw. 0,7-3 µl für den 0,2 mm Deckel.
Bei Verwendung des 0,2 mm Deckels mit sehr kleinen
Flüssigkeitsmengen wie etwa 1 µl kann es vorkommen,
dass sich im Lichtweg kleine Luftblasen bilden, wodurch
Schwankungen bei Messungen der gleichen Probe auftreten können. Für sehr geringe Volumina unter 2 µl
empfiehlt es sich daher, die Probe direkt auf den Spiegel
in der Deckelinnenseite zu pipettieren (Abb.4b), statt wie
sonst üblich auf das obere Messfenster (Abb. 4a). Da hier
immer mit sehr kleinen Volumina gearbeitet wird, muss darauf geachtet werden, sehr genau zu pipettieren. Das gilt
natürlich auch, wenn die „Blank“-Lösung pipettiert wird.
Messablauf
1. Tragen Sie während des gesamten Messvorganges
Handschuhe, um Verunreinigungen an der Messzelle zu
vermeiden.
optische
Schichtdicke

2. Wählen Sie für Ihre Messung den Deckel mit der
optischen Schichtdicke aus, der dem Konzentrationsbereich Ihrer Probe am ehesten entspricht (s. Tabelle 1).
3. Wählen Sie Ihre Mess-Methode (Bsp.: dsDNA).
4. Verändern Sie ggf. die voreingestellten Parameter im
BioPhotometer plus (s. Einstellung am BioPhotometer
plus, Abb. 3a bzw. Abb. 3b).
Abbildung 5: Eingangsdisplay vor Blank-Messung
5. Führen Sie eine Nullwertbestimmung (Blank) mit der
Flüssigkeit durch, in der Ihre Probe gelöst bzw. verdünnt
ist. Pipettieren Sie hierfür den „Blank“ auf das obere
Messfenster der Probe (Abb.4a) oder bei Verwendung
des 0,2 mm Lichtweges auf den Spiegel in der Deckelinnenseite (Abb. 4b)
a)
b)
Abbildung 6. Blank-Messung
6. Vor der „Blank“-Messung werden voreingestellte
Parameter wie der verwendete Lichtweg im Display
angezeigt (Abb. 5). Legen Sie den Deckel auf die Messzelle
entsprechend der Einkerbung am Deckel und drücken Sie
die Taste „Blank“ am BioPhotometer plus (Abb. 6).
Abbildung 4: Beladung der Messzelle bei 1 mm Lichtweg (a) bzw. 0,2
mm Lichtweg (b)
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7. Das Ergebnis der Blankmessung sollte 0 betragen
(s. Abbildung 7).
10. Tragen Sie Ihre Probe wie in Abb. 4 für die „BlankMessung“ beschrieben auf und betätigen Sie die „Sample“Taste (Abb. 10). Das Ergebnis (Abb. 11) wird automatisch
im Display angezeigt. Dabei wird der verwendete Lichtweg
automatisch mit einbezogen.
Abbildung 7: Ergebnis der Blankmessung
8. Entfernen Sie anschließend alle Flüssigkeitsreste mit
einem Wattestäbchen oder Papiertaschentuch von der
Deckelinnenseite (Abb. 8a) und vom Messfenster
(Abb. 8b).
a)
b)
Abbildung 10: Betätigen der „Sample“-Taste
Abbildung 8: Reinigung des oberen Messfensters (a) und der
Deckelinnenseite (b)
9. Entfernen Sie ggf. Fussel oder Staub mit einem Druckluftsprayer von dem Spiegel (Abb. 9a) und dem Messfenster
(Abb. 9b).
a)
b)
Abbildung 11: Ergebnis-Beispiel
11. (Optional) Wenn erforderlich, kann die Probe vom
oberen Messfenster mit einer Pipette abgenommen und
somit wieder gewonnen werden.
12. Entfernen Sie anschließend alle Flüssigkeitsreste mit
einem Wattestäbchen oder Papiertaschentuch von der
Deckelinnenseite (Abb. 8a) und vom Messfenster
(Abb. 8b).
Abbildung 9: Entfernen von Fusseln oder Staub von der Deckelinnenseite (a) und oberen Messfenster (b) mittels Druckluftsprays
13. Säubern Sie ggf. beide Bereiche zusätzlich mit 60 %
Isopropanol.
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Literatur
[1] Chris Voolstra, Anja Jungnickel, Lars Borrmann, Roland Kirchner, Andrea Huber
Spektrophotometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren - Der LabelGuardTM ermöglicht die Quantifizierung von
Probenmengen im Submikroliter-Bereich mit handelsüblichen Spektrophotometern, Application Note – Implen GmbH,
www.implen.com
Produkt
Bestellnummer
BioPhotometer plus 230 V / 50-60 Hz Netzstecker Europa,
weitere Netzanschlussvarianten erhältlich
6132 000.008
Thermodrucker DPU 414 Inkl. Netzteil und Druckerkabel 230 V
6131 011.006
Thermopapier 5 Rollen
0013 021.566
Bestellinformationen – Hellma GmbH & Co. KG
Product
Bestellnummer
Hellma TrayCell, 68,5 mm, 8,5 mm, (inkl. Deckel für Schichtdicken
von 0,2 mm und 1 mm)
105.800-UVS Z 8.5 mm
Deckel für TrayCell, optische Schichtdicke 1,0 mm
665.703
Deckel für TrayCell, optische Schichtdicke 0,2 mm
665.704
Bestellinformationen - Implen GmbH
Produkt
Bestellnummer
LabelGuard Mikroliter Messzelle, Paket mit 0,2 und 1 mm Pfadlänge
Deckel, 0,7 - 5 μl Probenvolumen
LG100UV-G
LabelGuard Mikroliter Messzelle, Deckel mit 1 mm Pfadlänge, 3-5 μl
Probenvolumen
LG100UV
LabelGuard Mikroliter Messzelle, Deckel mit 0,2 mm Pfadlänge, 0,7 - 4 μl
Probenvolumen
LG101UV
Implen® ist eine eingetragene Marke der Implen GmbH
LabelGuardTM ist eine geschützte Marke der Implen GmbH
Hellma® ist eine eingetragene Marke der Hellma GmbH & Co.KG
TrayCellTM ist eine geschützte Marke der Hellma GmbH & Co.KG
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