Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des

Lokalisation von mRNA-Transkripten auf
Gewebeschnitten des Riechepithels der Ratte
durch in situ Hybridisierung
Thomas Hengl
Zusammenfassung
Die olfaktorische Signaltransdukion bei Landwirbeltieren ist in ihren Grundzügen bereits
gut verstanden. Der Ca2+-aktivierte Cl--Kanal, der für den größten Teil der
Erregungsbildung verantwortlich ist, ist jedoch auf molekularer Ebene noch nicht
identifiziert. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb zunächst die in situ Hybridisierung auf
Gewebeschnitten der Rattennase mit Markerproteinen für olfaktorische Rezeptorneurone
und Stützzellen zu etablieren. Bei der Etablierung waren vier Arbeitsschritte entscheidend.
Die richtige Wahl des Objektträgers, der das Gewebe bis zum Versuchsende binden
muss, die Synthese von RNA-Sonden optimaler Länge und Qualität, die Verringerung der
Inkubationszeiten vor der wesentlichen Hybridisierungsreaktion, um eine optimale
Gewebeerhaltung zu garantieren und eine mögliche Degradation der RNA zu verhindern
sowie der Ausschluss von Dextransulfat und Heparin im Hybridisierungspuffer, da dieses
auf den Gewebeschnitten präzipitiert und dadurch das Eindringen der Sonden in das
Gewebe verhindert.
Die in situ Hybridisierung wurde mit OMP, CNG-A2 und Golf als Marker für reife
olfaktorische Rezeptorneurone und mit Crb-2 als Stützzellmarker etabliert. Die Marker für
reife Neuronen zeigten deutliche Färbungen in den ORNs und keine unspezifischen
Signale in anderen Zellen. Mit Hilfe des Stützzellmarkers konnten die gefärbten
Stützzellen klar von den Neuronen unterschieden werden. Ein Bericht von Pfifferi et al.
beschrieb Bestrophin-2 als Kandidat für den olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal.
Diese Behauptung sollte mit einer zellspezifischen Expression von Bestrophin-2 auf
Nasengewebeschnitten untersucht werden. Bestrophin-2 konnte zwar eindeutig in ORNs
des olfaktorischen Epithels nachgewiesen aber auch deutlich in Zellen des
respiratorischen Epithels detektiert werden. Da die Existenz des olfaktorischen
Ca2+-aktivierten Cl--Kanals aber nur in ORNs und nicht in Zellen des respiratorischen
Epithels nachgewiesen ist, muss diese Aussage von Pfifferi et al., in Frage gestellt
werden.
Weitere 32 Kandidaten, die aus dem ciliären Proteomprojekt unserer Arbeitsgruppe
stammen und denen keine physiologischen Funktionen und eindeutige zelluläre
Lokalisation zugewiesen werden können, sollen zukünftig mit der in situ Hybridisierung auf
ihre zellspezifische Expression auf Nasengewebeschnitten untersucht werden.