Part 2

Evolution der Antigenrezeptorgene
RAG1 + 2 ist eine Transposase
Hairpin Formierung: direkte Transesterbildung
wie bei Mu Transposase oder HIV Integrase
RAG1/2 kann in vitro mit RSS exogene DNA attackieren
ohne Sequenzbevorzugung
5 bp staggered ends
Transposition über beide Enden
Evolutionärer Ursprung der
AG-Rezeptorgene
durch Transposoninsertion ?
(Knorpelfische)
Hermes transposon:
Signal ends open,
other end forms hairpin,
similar VDJ recombination
Transposition mit einem Ende
Reversible
Reaktion
Possible chromosomal
translocation by
RAG-promoted
transposition Analogien Rag1/2 Rekombination und Transposons:
Invertierte repeats - DNA Signale
Bindung Transposase an Signalsequenzen
Mechanismus Spaltung: nick ss, Transesterbildung
Hairpin + blunt end
Unterschiede:
Transposase mit herausgespaltenem Fragment attackiert DNA
Insertion des Transposons
5 bp staggered ends
Rag1/2 Rekombination:
nach hairpin + blunt end Bildung
normal weiter dann mit ds-Reparatursystem, Degradierung/
Inversion DNA zwischen Signalsequenzen
aber: in vitro kann auch Insertion mit geringer Häufigkeit
auftreten
Somatische Hypermutation (SH)
Genkonversion (GC) und
Klassenwechsel (class-switch)
-Rekombination (CSR)
gemeinsamer Basismechanismus für SHM, GC, CSR Activation-induced cytidine deaminase
(only lymphocyte-specific factor required for SHM, GC, CSR)
Homologie zu RNA editierendem Enzym
C to U deamination in vitro
vor allem exprimiert in sekundären lymphoiden Organen
Defizienz: keine CSR und SHM
In Chicken/Rabbits keine Genkonversion
direkte Aktivität auf dC in DNA
U-G mismatch Läsionen:
C-T and G-A Transitionen
base excision Reparatur - jedes Nukleotid
mismatch Reparatur mit Polymerase mit hoher Fehlerquote
Template-vermittelte Reparatur mit Sister-Chromatid oder V-Pseudogen
Läsion in switch site: Reparatur mit anderer switch site
Affinitätsreifung
Somatische Mutationen in Ig V Genen
Mutations clustered in CDRs
(complemetarity determining region)
Kd: dissociation constant
Mutationsrate 10-3, 106x höher als normal
hauptsächlich Punktmutationen
Mutationen proportional der Transkriptionsrate
Modell 2002 für somatische Hypermutation:
Promoter bestimmt Region
Enhancer lizensiert Locus
„Mutatorsome“
A. Ig Enhancer bindet Mutator-Faktor (rot)
B. Enhancer-Promoter Interaktion
C. Mutator-Faktor bei TIC
D. Transkription ist wichtig
Mutator-Faktor fährt mit TC mit
E. Assymetrischer DSB (nicht unbedingt notwendig)
F. 5´-end Resektion, 3´-overhang
lagert sich an intaktes Sister Chromatid
Reparatur durch homologe Rekombination
G. DNA Synthese führt zu Punktmutationen
Polymerase mit hoher Irrtumsrate
(wie DNA Pol.-iota)
Modell:
AID Funktion im
ersten Schritt:
Nick und Initiierung des
Doppelstrangbruches
(bei SHM nicht
unbedingt notwendig
- auch andere Mechanismen)
Modell 2006
SHM Modell 2006
BER: base excision repair
MMR: mismatch repair
Unrepaired
1
transition mutation
2
3
uracile-DNA glycosylase
T
A
(eta)
AID: activation-induced cytidine deaminase
Target ist ssDNA
(kleine Regionen ssDNA enstehen transient bei Transkription)
dC - deamination U - G mismatch
- Replication w/o repair: C - T, G - A transition
- BER: base excision repair with error prone Polymerase:
U excised by UNG: Uracil N-Glycosylase
removes the U residue, leaving abasic site
replaced by any other (transition and transversion)
-MMR: mismatch repair machinery
mutations at A/T pairs near UG lesion
Exo1, MSH (homologue of E.coli MutS)
DNA polymerase eta
-ds Bruch:
MRE11 (meiotic recombination 11 homologue)-Rad50 complex
cleaves DNA at abasic site, generates 3´-ends that cannot be
extended by normal DNA polymerase ?
B Zellselektion in
„germinal centers“
der Lymphknoten
und
Differenzierung zu
Ak-sezernierenden
Plasmazellen
Dendritic cell of
non-hematopoietic origin
Klassenwechsel
der schweren
Ketten
„Switch recombination“:
AID und
„germline“ Transkription
führen zu
Doppelstrangbrüchen
in „switch“ Regionen,
(GC-rich regions,
I exon for initiation of germline
transcription,
IL4 – transcription from Iε
bzw. IFN-γ ‒ from I2α)
SHM
CSR
Introduction and
repair of lesions
Distinct set of
repair factors
for SHM and CSR
Hauptwege der Reparatur:
mutations-assoziierte Brüche normalerweise
durch homologe Rekombination repariert
oder
nicht-homologes end-joining: NHEJ
ist Mechanismus bei CSR
CSR und SHM
- AID notwendig:
CSR: ds Bruch
SHM: ss Mutation (und ds Bruch ?)
- verschiedene Reparatur:
CSR durch NHEJ (wie VDJ recombination)
SHM durch BER, MMR (und homol. Rek. ?)
Wichtig für Lymphomagenese
Die meisten Lymphome entstehen in den Germinal Centers
aus B Zellen
50 % zeigen translocation break points innerhalb der
Target-Sequenzen für CSR, die anderen dürften mit Fehlern
bei SHM zusammenhängen
SHM kann auch auf Protoonkogene in Tumorzellen übergreifen,
in gleichen Regionen: Translokationen und Mutationen
auch ohne Translokation
Fehler im Targeting der SHM und CSR Mechanismen
oder in der Reparatur der DNA Brüche ?
N. Bhutani et al., Nature 2010
AID in germ cells,
necessary for reprogramming of
somatic cells to iPS cells,
required for promoter demethylation
and induction of OCT4 and NANOG
M