MUTAGENESE

MUTAGENESE
1
Mutation = Veränderung des Erbgutes
1) Genom-Mutation
= Veränderung der Chromosomenzahl pro Genom
("Aneuploidie")
2) Chromosomen-Mutation
= Veränderung an einzelnen Chromosomen
(Chromosomenbrüche = "Klastogenese"
Verlust oder Anlagerung von Chromosomenteilen)
3) Gen-Mutation
= Veränderungen in der Nukleotid-Sequenz der DNA
("Mutation" im engeren Sinn)
(Punkt-, Rasterverschiebungsmutationen,
Genamplifikation, -Verlust, -Translokation)
2
1
Folgen von Mutationen
Mutation
Körperzellen
(Somazellen)
Keimzellen
Tod
Embryo:
Missbildungen
Tod
Erbkrankheit
Krebs
Zellalterung
Zelltod
3
Ursachen für Mutationen
endogene Ursachen
endogene reaktive
Metabolite, reaktive
Sauerstoffspezies
Polymerasefehler
exogene Ursachen
Depurinierungen
synthetische +
natürliche chemische
Substanzen
Strahlen
Viren
DNA - SCHÄDIGUNG
unvollständige D N A - R E P A R A T U R
ZELL - REPLIKATION
MUTATION
4
2
Wie wirken Gen-Mutationen?
Punktmutation:
THE
NUN
SAW
OUR
CAT
EAT THE
RAT
VorwärtsRückwärtsmutation
mutation
THE SUN SAW OUR
CAT
EAT THE
RAT
Rasterverschiebungsmutation (frame shift):
THE
NNS
AWO URC
ATE
ATT HER
ATx
THE
NUN
SAW
OUR
CAT
EAT THE
RAT
THE
NUN
NSA
WOU RCA TEA TTH
Deletion:
Insertion:
ERAT
5
Wichtige gentoxische Effekte
Doppelstrangbruch
Strangvernetzung
3´
3´
5´ P
5´
Depurinierung
C
G
Addukt
A
A
r
o
t
e
i
n
T
G
X
G
A
C
T
T
5´
C
DNA-Protein-
5´
3´
3´
Pyrimidin-
Verbindung
Einzelstrangbruch
Dimerisierung
6
3
Charakterisierung der Mutagenität
von DNA-reaktiven Verbindungen
 Sind in der Regel bei einmaliger Exposition mutagen.
 Meist bei niedrigen (d.h. subtoxischen) Dosen
mutagen (krebsauslösend).
 Können additive oder synergistische Wirkungen haben.
 Durch Modifikation der Biotransformationswege kann
die mutagene Aktivität drastisch verändert werden.
7
Entstehung von Mutationen aus DNA Addukten.
Bedeutung der DNA Replikation
+CH
3
G
C
Adduktbildung
MeG
C
1. Replikation
MeG
T
G
C
normal
2. Replikation
MeG
T
A
T
Mutation
GC
AT - Transition
8
4
Tests auf Gentoxizität
Organismen
in vitro:
Endpunkte
Bakterien
Genmutationen
Pilze
Warmblüterzellen
menschliche Zellen
Genom- /
Chromosomenmutationen
Methode
biologisch
(Koloniebildung)
morphologisch
in vivo:
DNA-Schädigung
chemisch
(Strangbrüche, Adduktbildung)
Nager
Nager
Induktion von
DNA-Reparatur
biologisch
Fruchtfliege
(Drosophila)
dominante Lethalität
biologisch
Nager
Fellfleckentest
morphologisch
9
Substanzprüfung auf Mutagenität: Der Ames-Test
Ames BN, Mccann J, and Yamasaki E (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with
the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Research 31, 347.
HisMutante
in Histidin-haltigem Medium
His-
in H
His-
istid
in-fr
eiem
andere Mutationen
- Ampicilinresistenz
- Reparaturdefekt
- dünnere
Polysaccharidhülle
His+
Salmonella
typhimurium
(Wildtyp)
Wachstum
Med
ium
His+Mutagen
Rückmutation
kein Wachstum
His+
His+
Wachstum
10
5
Versuchsablauf beim Ames Test
1) Testsubstanzlösung
2) Bakteriensuspension
3) Leberhomogenat
(S9-Mix)
Enthält Enzyme
aus Säugerleber
für metabolische
Aktivierung der
Testsubstanzen
11
Ames-Test: Vorteile
 billig
 schnell (Versuch: 2 Tage + Auswertung ca 1 Woche)
 großer Substanzdurchsatz
 leicht erlernbar
 Metabolite kommen direkt mit Testzellen in Kontakt
 Korrelation zwischen Mutagenität in vitro und
Kanzerogenität im Tierversuch
bei direkten Mutagenen besser als bei
indirekten (zu aktivierenden Mutagenen)
 hohe Zahl geprüfter Substanzen (> 3500)
 Gut geeignet, um unbekannte Stoffgemische zu untersuchen
12
6
Ames-Test: Nachteile
1. Falsch negative Befunde durch
 toxische Substanzen (Antibiotika, chlorierte Pestizide)
 unzureichendes S9-Mix (falsch oder zu lange Lagerung)
 Unterschiede im Metabolismus von Mikrosomen und Leber in vivo
 Metalle und einige Steroide werden nicht erkannt
2. Falsch positive Befunde durch
 mangelnde Konjugationsreaktion in Mikrosomen:
keine Glukuronidierung, Sulfatierung, Acetylierung wegen
mangelnder Kofaktoren.
 Anreicherung aktiver Metabolite
 Substanzmetabolismus durch bakterienspezifische Enzyme
13
Chromosomenmutationen
Metaphasenchromosomen
aus dem Knochenmark
eines chinesischen Hamsters.
Keine Substanzexposition
Chromosomenaberrationen nach
Behandlung mit einer mutagenen Substanz:
Ringchromosom
Chromosomenbruch
Chromosomentranslokation
14
7
Gentoxische Chemikalien
Beispiele chromosomenbrechender Chemikalien (Klastogene)
Benzol
H
H
C C
H
Cl
Vinylchlorid
O
H3C O P O CH 3
O CH3
Trimethylphosphat
15
Prüfung auf Chromosomenmutation:
Der Mikrokerntest
Chromosomenbruch
klastogene
Chemikalie
normal
Zellteilung
Kernausstoßung
Erythrozyten
abnormal
Erythroblast
Chromosomenfragment
Kernteilung
16
8