b) MUSTER FÜR EIN NEU BEANTRAGTES TEILPROJEKT

FECHNER
TP A5N
Allgemeine Angaben zum Teilprojekt A5N
Titel:
Bedeutung der Parvovirus B19 (B19)-Rezeptoren und der B19-Latenz in der Pathogenese der
kardioendothelialen B19-Infektion
Relevance of Parvovirus B19 (B19) Receptors and B19 Latency in the Pathogenesis of Cardioendothelial B19 Infections
Fachgebiete und Arbeitsrichtung:
Innere Medizin, Virologie
Leiter/in:
DR.
MED. VET.
H E N RY F E C H N E R , *23.06.1965
Medizinische Klinik II - Kardiologie und Pulmologie,
Charité Centrum 11 für Herz-, Kreislauf- und Gefäßmedizin,
Campus Benjamin Franklin,
Charité – Universitätsmedizin Berlin, Hindenburgdamm 30, 12200 Berlin
Telefon: 030 - 8445 - 4527
Telefax: 030 - 8445 - 4582
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Parvovirus B19 (B19) ist ein kardio-endotheliotropes Virus, welches mit dem Krankheitsbild der
inflammatorischen dilatativen Kardiomyopathie (DCMi) und endothelialer Dysfunktion
assoziiert ist. Ziel des Projekts ist es, durch Analyse der einzelnen Schritte des B19Replikationszyklus in endothelialen Zellen und der Untersuchung möglicher viraler Ko-Faktoren
den Infektionsverlauf und die Pathomechanismen der B19-Infektion des Herzens besser zu
verstehen. Im Detail sollen dazu B19-Rezeptor abhängige- und unabhängige B19Aufnahmemechanismen sowie die Post-Entry-Replikationsschritte analysiert werden. Zusätzlich
soll ermittelt werden, ob Adenoviren, die im Zusammenhang mit kardialen B19-Infektionen
detektiert wurden, die endotheliale B19-Infektion aktivieren können.
Weiterführende Zusammenfassung
Parvovirus B19 (B19) gilt als Erreger einer Reihe von Erkrankungen des Menschen, wie
Ringelröteln, aplastische Anämien, Hydrops fetalis und Polyarthritiden. Neben diesen seit
langem bekannten Infektionsverläufen haben Untersuchungen der letzten Jahre gezeigt, dass B19
ein kardiotropes Virus ist und im Herzen akute Myokarditiden mit zum Teil fatalen Folgen
auslösen kann. Aber auch chronische Verläufe mit dem Bild einer inflammatorischen
Kardiomyopathie (DCMi) mit endothelialer Dysfunktion können mit einer B19-Infektion
assoziiert sein. Die primäre Zielzelle des B19 im Myokard ist die Endothelzelle der kleinen
Gefäße der Endstrombahn, wobei bisher über die endothelialen B19-Infektionswege, insbesondere über Rezeptor-abhängige und mögliche Rezeptor-unabhängige Aufnahme-
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mechanismen wenig bekannt ist. Im Herzen von chronisch mit B19 infizierten DCMi-Patienten
kann B19-DNA über Monate, möglicherweise Jahre nachgewiesen werden, ohne dass bisher der
Nachweis einer B19-Replikation oder der Expression von B19-Genen geführt werden konnte.
Die Ursachen dieser Persistenz bzw. Latenz von B19 im Herzen sind insgesamt wenig
verstanden. Ebenso ist nicht bekannt, ob und durch welche Faktoren die Latenz überwunden
werden kann. Dieses Projekt soll einen Beitrag leisten, um diese Fragen zu beantworten.
Projektteil A:
Hier sollen Rezeptor-abhängige B19-Aufnahmemechanismen endothelialer Zellen untersucht
werden. Dazu wird eine Analyse der endothelialen Expression der B19-Rezeptoren und -KoRezeptoren P-Antigen, α5ß1-Integrin und Ku80-Autoantigen in vitro und in endomyokardialen
Herzmuskelbiopsien von Patienten vorgenommen. Diese Daten sollen zusätzlich in Abhängigkeit vom Zellzyklus erhoben und anschließend mit der B19-Aufnahme im Rahmen von Bindungs- und Internalisierungsstudien korreliert werden. Nach Modulation der Rezeptorexpression
durch Vektor-vermittelte RNA-Interferenz und cDNA-Überexpression sowie durch die Antikörper-vermittelte Inhibierung der Rezeptorfunktion soll dann die funktionelle Notwendigkeit
der B19-Rezeptoren für die endotheliale B19-Infektion ermittelt werden. In Fortführung dieser
Experimente soll eine Kartierung der B19 bindenden Proteindomänen des vor kurzem erstmalig
beschriebenen B19-Ko-Rezeptors Ku80-Autoantigen vorgenommen und eine mögliche Beteiligung des mit Ku80 heterodimerisierenden Proteins Ku70 an dieser Ko-Rezeptor-Funktion
untersucht werden.
Projektteil B:
Neben der Rezeptor-abhängigen wird in den letzten Jahren verstärkt die Rezeptor-unabhängige,
durch B19-Antikörper vermittelte B19-Internalisierung als Aufnahmemechanismus in nichtpermissiven Zellen diskutiert. Dieses als Antibody Dependent Enhancement (ADE) bezeichnete
Phänomen soll im Projektteil B näher charakterisiert werden. Dazu werden B19 aus Seren von
Patienten mit akuter B19-Infektion und rekombinante B19-Virionen verwendet. Die B19Aufnahme und -Replikation in Endothelzellen wird in Gegenwart und Abwesenheit B19spezifischer Antikörper analysiert. Ziel ist es, herauszufinden, ob ADE als alternativer
Infektionsmechanismus bei der endothelialen B19-Infektion eine Rolle spielen kann.
Projektteil C:
Ziel dieses Projektteils ist es, durch Analyse der Post-Entry-Schritte der B19-Infektion deren
unterschiedliche Verlaufsformen in nicht permissiven endothelialen Zellen und permissiven
Zellen besser zu verstehen, um daraus Rückschlüsse auf die B19-Persistenz bei kardioendothelialer B19-Infektion zu ziehen. Dazu werden Untersuchungen zur Freisetzung der viralen
Kapside aus den Endosomen, ihres Transport zum und in den Nukleus, der Freisetzung des
einzelsträngigen viralen Genoms (Uncoating) bis hin zur Bildung eines Transkriptionskompetenten DNA-Doppelstranges durchgeführt.
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Projektteil D:
Exogene Faktoren, wie die Ko-Infektion mit anderen Viren, können zur Aktivierung latenter
viraler Infektionen führen, sowohl auf der Ebene der Genexpression als auch auf der Ebene der
Genomreplikation. Adenoviren besitzen einen ausgeprägten Helfereffekt bei der Replikation der
helferabhängigen Parvoviren, der Adeno-assoziierten Viren (AAV), und wurden auch zusammen
mit B19 im Herzen nachgewiesen. Daher sollen ein möglicher adenoviraler Helfereffekt für B19
und die daran beteiligten adenoviralen und B19-Funktionen einer detaillierten Analyse unterzogen werden.
Ausgangssituation des Teilprojekts
Stand der Forschung
Die Bedeutung der Parvovirus B19-Infektion für die Entstehung kardialer Dysfunktionen
Durch molekularbiologische Nachweisverfahren konnte in den letzten Jahren ein umfassendes
Bild über das Vorkommen viraler Infektionen im Herzen erstellt werden. Dabei zeigte sich, dass
neben den schon länger als Auslöser einer inflammatorischen dilatativen Kardiomyopathie
(DCMi) bekannten Enteroviren auch Infektionen mit Adenoviren, verschiedenen Herpesviren,
humanem Immundefizienzvirus (HIV), Influenzaviren, Mumpsvirus, Rötelnvirus, Hepatitis-CVirus (HCV) und vor allem mit Parvovirus B19 (B19) mit dieser Erkrankung assoziiert sein
können. In einer größeren Studie mit 3.219 Patienten mit klinisch vermuteter Myokarditis und
DCM wurde bei fast der Hälfte der Patienten Virus-DNA in Myokardbiopsien nachgewiesen (1),
wobei der mit Abstand höchste Prozentsatz (36,7 %) auf B19 entfiel. B19 kann im Rahmen einer
akuten B19-Infektion akute Myokarditiden induzieren (2) und stellt auch in aktuellen
Untersuchungen das am häufigsten nachgewiesene kardiotrope Virus bei der DCMi dar (3).
Allerdings kann der Nachweis von B19 im Herzen mittels molekularbiologischer
Nachweisverfahren nicht per se als Beweis für die Ätiologie und pathogenetische Beteiligung
der B19-Virusinfektion am Krankheitsgeschehen herangezogen werden. Insbesondere für
chronische Verlaufsformen mit Viruspersistenz ist noch weitgehend ungeklärt, welche
Bedeutung das Virus in der Pathogenese spielt. Dies wird auch dadurch unterstrichen, dass bei
einem Großteil (bis zu 40 %) der Patienten mit positivem Virusbefund eine entzündliche
Begleitaktivität fehlt, somit also eine latente Viruspersistenz ohne nachweisbare pathogenetische
Auswirkungen vorliegt.
Parvovirus B19-Infektionen des Herzens
Erste konkrete Hinweise für eine mögliche ätio-pathogenetische Bedeutung einer B19-Infektion
für die Entwicklung einer kardialen Dysfunktion ergaben sich aus in situ-Hybridisierungsstudien
(4). Bei der akuten B19-Infektion der Herzens wiesen insbesondere Endothelzellen der kleinen
intramyokardialen Arteriolen und postkapilläre Venolen und Venen eine hohe Viruslast auf.
Infolge dieser Infektion wurde eine ausgeprägte Inflammation beobachtet, die mit massiver
Infiltration des Herzmuskels mit CD3-positiven T-Lymphozyten und aktivierten Makrophagen
einherging. Im Zuge dieser Infektion wurden nekrotische Veränderungen an den Myozyten
beobachtet. Offensichtlich handelte es sich dabei um direkte Folgeerscheinung einer durch die
Endothelschädigung induzierten koronaren Mikrozirkulationsstörung. Bei der DCMi mit B19Nachweis persistiert das Virus in den Endothelien der Kapillaren, und die Inflammation des
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Herzens stellt sich vornehmlich als makrophagenreiche Entzündungsreaktion dar (4). Diese
Daten belegen, dass B19 einen ausgeprägten Tropismus zu Endothelzellen der Endstrombahn
hat, und legen die Vermutung nahe, dass die klinische Symptomatik bei Patienten mit kardialer
B19-Infektion eine Folge der B19-Infektion des kardialen Endothels ist.
Endothelien haben eine wichtige physiologische Funktion als Barriere und sind wesentlich an
der Regulation des transvasalen Flüssigkeitstransportes beteiligt. Eine endotheliale
Virusinfektion kann über eine Aktivierung von Interferon-abhängigen Signalkaskaden
(JAK/STAT- und Map-Kinase-Signalweg) und reaktiver Infiltration des Gewebes mit
Leukozyten unter Beteiligung von Selektinen, Integrinen und Adhäsionsmolekülen (5) zu einer
Dysfunktion des Endothels und letztendlich zu einem Zusammenbruch der Endothelbarriere
führen (6). Für die B19-Infektion des Herzens wird ein solcher Zusammenhang vermutet.
B19-Virusreplikation und Zelltropismus
B19 gehört zur Gruppe der Erythroviren innerhalb der Familie der Parvoviridae. Es ist ein
kleines (18-22 nm), nicht umhülltes Virus mit einem ikosaedrischen Kapsid, welches ein
einzelsträngiges DNA-Molekül von 5.7 kb mit positiver oder negativer Polarität umschließt. Das
Genom von B19 umfasst 2 offene Leserahmen für die Nichtstruktur- (NS) und Strukturproteine
(VP), die von 5’ und 3’ lokalisierten Invertierten Terminalen Wiederholungen (ITRs) begrenzt
werden (7). Unmittelbar an die linke ITR schließt sich der einzige B19-Promotor an, der auf
Grund seiner Genomposition als P6 bezeichnet wird und die Transkription von neun alternativ
gespleißten und teilweise überlappenden mRNAs initiiert. Neben einer Reihe von kleineren
Proteinen mit noch unbekannter Funktion werden von diesen Transkripten das NichtStrukturprotein 1 (NS1) und die beiden Kapsidproteine VP1 und VP2 translatiert. NS1
transaktiviert die B19-Genexpression und ist essentiell für die Replikation des B19-Genoms. Es
induziert eine Caspase-3-abhängige Apoptose verbunden mit einer erhöhten Produktion von
Interleukin-6 (8). VP2 bildet 96 % des viralen Kapsids und bindet an das Erythrozyten PAntigen (Globosid, P-Antigen), den zellulären Rezeptor für B19 (9). VP1 unterscheidet sich von
VP2 durch 226 zusätzliche Aminosäuren am Amino-terminalen Ende, die auf der Außenseite des
Kapsids lokalisiert sind und entscheidende Bedeutung bei der Induktion Virus-neutralisierender
Antikörper und damit für die Eliminierung des Virus aus dem Körper haben. Diese Region
enthält ein in vielen Parvoviren konserviertes Phospholipase-A2-Motiv, das an der Freisetzung
der B19-Virionen in das Zytoplasma beteiligt ist (10). VP2 induziert nur eine ineffiziente
Immunantwort. Allerdings können VP2-abgeleitete Peptide kreuz-reaktive Autoantikörper gegen
Kreatin, Kollagen und Cardiolipin induzieren und eine entscheidende Rolle bei chronischen
B19-Infektionen spielen, bei denen immunpathogenetische Mechanismen im Vordergrund
stehen.
B19 besitzt einen stark restriktiven Zelltropismus. Der primäre Ort der Virusreplikation ist das
Knochenmark. Eine produktive, lytische Infektion findet ausschließlich in erythroiden
Vorläuferzellen statt. Daneben konnten Haut- und Synovialfibroblasten sowie Endothelzellen als
B19-Zielzellen identifiziert werden, jedoch erfolgt in diesen Zellen nach übereinstimmenden
Ergebnissen keine Virusreplikation (1).
B19-Rezeptoren und -Ko-Rezeptoren
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Die Aufnahme von Viren in die Zielzelle wird durch zelluläre Oberflächenrezeptoren vermittelt.
Dieser Prozess vollzieht sich bei vielen Viren in zwei Schritten. In einer ersten Phase adsorbiert
das Virus an zelluläre Attachment-Rezeptoren, in einer zweiten erfolgt dann die Internalisierung
durch Ko-Rezeptoren. Inzwischen wurde für viele Viren gezeigt, dass für unterschiedliche
Zielzellen auch Zelltyp-spezifische Ko-Rezeptoren an der Internalisierung beteiligt sein können.
Als ursprünglicher Rezeptor für B19 wurde das Erythrozyten-P-Antigen, bei dem es sich um ein
neutrales Glykolipid handelt, identifiziert. Es wird hauptsächlich auf erythroiden Vorläuferzellen
und roten Blutzellen, den hauptsächlichen Zielzellen von B19, aber auch auf Megakaryozyten
und Endothelzellen gefunden (9). Patienten mit erblicher P-Antigen-Defizienz sind resistent
gegen eine B19-Infektion. Daneben kann P-Antigen in der Plazenta und im fetalen Myokardium
gefunden werden. Nachdem P-Antigen über lange Zeit als einziger B19-Rezeptor angesehen
wurde, zeigten Untersuchungen der letzten Jahre, dass P-Antigen lediglich die Bindung von B19
an die Zelloberfläche vermittelt, während die Internalisierung, ähnlich wie bei anderen Viren,
durch Ko-Rezeptoren erfolgt.
Als erster Ko-Rezeptor für B19 wurde α5β1-Integrin identifiziert (11). So waren ausgereifte
Erythrozyten, die eine hohe Expression des P-Antigens, aber kein α5ß1-Integrin auf ihrer
Oberfläche aufwiesen, zwar in der Lage, B19 zu binden, jedoch erfolgte keine Aufnahme der
Viruspartikel. Hingegen kommt es in primären humanen erythroiden Vorläuferzellen, die
zusätzlich zum P-Antigen noch funktionelles α5ß1-Integrin exprimieren, zu einer effizienten
Internalisierung von B19. α5ß1-Integrin wird in einer Reihe von Zelltypen exprimiert, darunter
auch in endothelialen Zellen, in denen es als Rezeptor für Fibrinogen fungiert. Untersuchungen
hinsichtlich einer möglichen Ko-Rezeptor-Funktion für B19 in Endothelzellen stehen bisher aber
noch aus.
Neben dem α5ß1-Integrin wurde mit dem Ku80-Autoantigen ein weiterer potentieller B19-KoRezeptor identifiziert (12). Ku80 ist Bestandteil eines als Ku bezeichneten heterodimerischen
Proteinkomplexes mit Ku70 als Bindungspartner. Während Ku lange Zeit als ausschließlich
zellkernassoziiertes Protein mit zentralen Funktionen bei DNA-Reparaturprozessen, der
Erhaltung der Telomer-Länge und der Apoptose betrachtet worden war (13), konnte es in den
letzten Jahren auch im Zytoplasma und in der Zellmembran von verschiedenen Zelltypen
nachgewiesen werden. Die unterschiedlichen Befunde bezüglich seiner subzellulären
Lokalisation scheinen dabei aus der Verwendung unterschiedlicher Zelltypen und Spezies mit
unterschiedlichen Zellzyklusphasen, Differenzierungs- und Aktivierungszuständen sowie der
unterschiedlichen Sensitivität der verwendeten Nachweismethoden zu resultieren. Ku80 wurde
auch in der Zellmembran von B19-sensitiven Blutvorläuferzellen des Knochenmarks in vivo
nachgewiesen. Inzwischen konnte gezeigt werden, dass Ku70 und Ku80 an Zell-ZellInteraktionen beteiligt sind. So fungiert Ku80 als Adhäsionsrezeptor für Fibronectin und TypIVKollagen und nimmt durch Interaktion mit der Metalloproteinase 9 (MMP-9) an der
Zellmembran auch an der Regulation des „Remodeling“ der extrazellulären Matrix teil.
Obwohl davon ausgegangen wird, dass Ku70 und Ku80 in der Regel als Heterodimere vorliegen,
ist nicht klar, ob ihre Funktionen generell an die Heterodimerisierung gebunden sind. Ein
Hinweis auf differentielle Funktionen von Ku70 und Ku80 ergibt sich durch die Beobachtung,
dass Ku80 unabhängig von Ku70 in den Zellkern transportiert werden kann. Die
Heterodimerisierung scheint jedoch wesentlich zur Stabilisierung beider Ku-Untereinheiten
beizutragen. Ku70 und Ku80 werden in vielen Organen, wie Herz, Lunge, Leber, Niere und
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Gehirn exprimiert, wobei das Expressionsmuster zwischen Maus und Mensch relativ einheitlich
ist.
Bei der Identifizierung von Ku80 als neuem B19-Ko-Rezeptor konnte zusätzlich zu einer
direkten Bindung von B19 an Ku80 Antigen auf der Zelloberfläche gezeigt werden, dass HeLaZellen, die zwar P-Antigen und α5ß1-Integrin, aber kein Ku80 auf der Zelloberfläche besitzen,
durch die Expression von rekombinantem Ku80 in der Lage sind, B19 effektiv zu internalisieren
(12). Im Gegenzug kann durch eine Reduktion der Ku80-Expression in B19-permissiven
KU812Ep6-Zellen die Aufnahme von B19 inhibiert werden. Offensichtlich ist also die
Expression aller drei B19-Rezeptoren bzw. -Ko-Rezeptoren (P-Antigen, α5ß1-Integrin und
Ku80) eine entscheidende Voraussetzung für eine effiziente B19-Aufnahme. Inwieweit sich
diese Erkenntnisse auch auf andere Zellen, wie z. B. Endothelzellen, übertragen lassen, ist
allerdings offen. Interessanterweise konnte bei Patienten mit einer symptomatischen B19Infektion ein „Single-Nukleotid“-Polymorphismus (SNP) im Ku80-Gen nachgewiesen werden
(14).
Antikörper-abhängige Verstärkung (ADE) der Virusreplikation
Eine Antikörper-abhängige Verstärkung (ADE) der viralen Replikation wurde erstmalig für
Flaviviren beschrieben und in der Folge bei einer Reihe von anderen Viren, wie den
Influenzaviren, HIV-1, dem Tollwutvirus und auch bei einem Vertreter der Parvoviren, dem
AMDV (Aleutian mink disease parvovirus) in vitro und in vivo nachgewiesen. Beim
Denguevirus, einem humanpathogenen Vertreter der Flaviviren, spielt ADE nach dem bisherigen
Erkenntnisstand eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese des Dengue Schock Syndroms
(DSS) und muss als mögliche Komplikation bei der Entwicklung einer wirksamen Vakzine
Berücksichtigung finden. ADE wird bei Virusinfektionen primär durch die Wechselwirkung des
Fc-Anteils von virusspezifischen Antikörpern der IgG-Klasse mit Fc-Rezeptoren auf der
Oberfläche von Makrophagen vermittelt und führt zu einer verstärkten Internalisierung der
Antikörper-komplexierten Viren. Kürzlich konnte ADE erstmals für das Parvovirus B19 in der
Monozyten-Zelllinie U937 nach Gabe von gereinigten IgG-Fraktionen aus B19-Antikörperpositiven Patienten nachgewiesen werden (15). Fcγ-Rezeptoren werden auch auf einer Reihe von
endothelialen Zellen exprimiert, und Fcγ-Rezeptoren der Klasse IIa auf Kardiomyozyten sind
möglicherweise an der Vermittlung der negativ-inotropen Effekte von Autoantikörpern bei der
Pathogenese der dilativen Kardiomyopathie (DCM) beteiligt (16). Diese Befunde eröffnen die
Möglichkeit, dass B19 nicht nur spezifisch über die bereits beschriebenen Rezeptoren und KoRezeptoren in endotheliale Zellen des Myokards aufgenommen wird, sondern nach Bildung von
B19-Antikörpern im Verlauf der Infektion auch unspezifisch internalisiert werden kann.
Post-Entry-Schritte der viralen Replikation
Wie bei anderen Parvoviren umfasst der produktive Vermehrungszyklus von B19 im Anschluss
an die primäre Adsorption an die Zielzelle und die darauf folgende Aufnahme eine ganze Reihe
von weiteren Schritten. Dazu gehören die Freisetzung des Kapsids aus den Endosomen in das
Zytosol, die Translokation des Genoms an die Kernporen und in den Zellkern, die Konvertierung
zum DNA-Doppelstrang, die Transkription und die Replikation des viralen Genoms, die
Assemblierung des Kapsids und die damit assoziierte Enkapsidierung des Genoms sowie
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schließlich die Freisetzung der reifen Viruspartikel durch Lyse der infizierten Zelle (7). Da es in
nicht-permissiven Zellen zu keiner detektierbaren Replikation des B19-Genoms kommt, wird der
ausgeprägte Zelltropismus von B19 möglicherweise nicht nur durch die vorhandenen Rezeptoren
und Ko-Rezeptoren, sondern auch durch die nachfolgenden Prozesse bis zur Bildung eines
Transkriptions-kompetenten DNA-Doppelstranges determiniert. Alle Parvoviren werden in
einem relativ schnellen Schritt durch Rezeptor-vermittelte Endzytose, höchstwahrscheinlich
unter Beteiligung von „clathrin-coated pits“, internalisiert. Im Gegensatz dazu ist die folgende
Freisetzung aus den späten Endsosomen oder frühen Lysosomen ein langsamer Prozess, der in
Kulturzellen mehrere Stunden in Anspruch nehmen kann. Für diesen Schritt ist im Parvovirus
des Schweins (PPV) ein im VP1-spezifischen Amino-Terminus der Kapsidproteine lokalisiertes
Motiv für eine sekretierte Phospholipase-A2-Aktivität (sPLA2) erforderlich. Eine sPLA2Aktivität wurde auch für die entsprechende Region im VP1 des Parvovirus B19 nachgewiesen.
Die B19-VP1-sPLA2-Aktivität kann die Aufnahme von Ca2+ in die Zelle stimulieren und damit
möglicherweise zum Pathomechanismus von B19 bei der DCM beitragen (17). Wie
Untersuchungen mit dem Caninen Parvovirus (CPV) gezeigt haben, wird der Transport der
freigesetzten Kapside zu den Kernporen wahrscheinlich durch Mikrotubuli und das Motorprotein
Dynein vermittelt. Die parvoviralen Kapside werden in intakter Form durch den Nukleären
Poren Komplex (NPC) in den Zellkern transloziert, wobei es durch Konformationsänderungen
des Kapsids zur Exposition von Kernlokalisations-Signalen (NLS) in den VP-Proteinen kommt.
An der Translokation des B19-VP2-Kapsidproteins in den Zellkern ist dabei ein basisches
Aminosäure-Motiv beteiligt, welches nicht der NLS-Konsensus-Sequenz entspricht. 20 bis 30
Nukleotide des 5’-Endes des viralen Genoms mit einem kovalent gebundenen NS1-Protein
werden außerhalb der parvoviralen Kapside exponiert, und die DNA könnte bei ihrer Freisetzung
eine Pore an der 5-fach Symmetrieachse der Kapsidstruktur passieren. Sowohl nach
Hitzebehandlung als auch nach pH-Änderungen, die der Ansäuerung im Endosom entsprechen
(pH 6,5 bis 5,0), kann eine Externalisierung der DNA ohne eine parallele Desintegration der
Kapsidstruktur erfolgen. Möglicherweise kann die Initiation der DNA-Replikation und der
Zweitstrangsynthese jedoch in Kapsid-assozierter Form erfolgen, da durch partielle
Desintegration des Kapsids auch das 3’-Ende des Genoms außerhalb des Kapsids exponiert
werden kann. Während die Zweitstrang-Synthese bei den helferabhängigen Adeno-assozierten
Parvoviren und vor allem bei den davon abgeleiteten rekombinanten Vektoren (rAAVs) einen
entscheidenden limitierenden Faktor bei der Genexpression darstellt, ist sie beim Parvovirus B19
bisher nicht systematisch untersucht worden.
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3.3.2
Eigene Vorarbeiten
Schwerpunkte der Tätigkeit von Henry Fechner stellen neben den seit längerer Zeit
durchgeführten Untersuchungen zum Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) und den Adenovirus-Ko-Rezeptoren αVβ3- und αvβ5-Integrin am Herzen (9, 11,12,14) Studien zu Mechanismen
der kardio-endothelialen B19-Infektion dar. Dabei beschäftigt er sich im Rahmen eines seit
11/2006 durch die DFG (Az. FE 785/1-1) geförderten Projekts insbesondere mit der Interaktion
von B19 mit seinen Rezeptoren und den B19-Aufnahmemechanismen in endothelialen Zellen.
Zusätzlich arbeitet Henry Fechner seit vielen Jahren auf dem Gebiet der Gentherapie; er war mit
dieser Thematik als Projektleiter in der ersten SFB/TR 19-Förderungsperiode für das Teilprojekt
C5 verantwortlich. Schwerpunkte waren dabei die Entwicklung neuer viraler Vektoren (2), gentherapeutischer Strategien zur Behandlung der Herzinsuffizienz (3) und die Entwicklung von
Therapiekonzepten zur Behandlung kardialer Virusinfektionen (4). Hierzu zählen auch gentherapeutische Konzepte unter Verwendung von RNAi-Technologien zur Behandlung der B19Infektion, welche in Zusammenarbeit mit den Teilprojekten B5, C1 und C5 des SFB/Transregio
durchgeführt werden. Diese Arbeiten erfolgten teilweise in Kooperation mit dem Ko-Antrags-
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steller. Stefan Weger untersucht die Wechselwirkungen des helferabhängigen Parvovirus AAV-2
(Adeno-assoziiertes Virus) mit zellulären Faktoren und die Bedeutung dieser zellulären Faktoren
für verschiedene Schritte des viralen Replikationszyklus' (5,7,10,13). Darüber hinaus leitet er die
AAV-Vektor-Core-Facility am Institut für Virologie, die hochgereinigte AAV-Vektoren für
klinische Fragestellungen und Anwendungen entwickelt und in großem Maßstab produziert.
Bedeutung der B19-Rezeptoren und Ko-Rezeptoren für die B19-Infektion endothelialer
Zellen
Verschiedene Studien der letzten Jahre haben eine Assoziation von kardio-endothelialer B19Infektion mit dem Krankheitsbild der DCMi gezeigt. Obwohl endotheliale Zellen nach allen
bisherigen Befunden die Zielzellen der kardialen B19-Infektion darstellen, gelten sie als nicht
permissiv für eine produktive B19-Infektion. Auf welcher Ebene jedoch der Replikationsblock in
endothelialen Zellen erfolgt und welche Faktoren und Mechanismen daran beteiligt sind
(beispielsweise B19-Aufnahme und Post-Entry-Schritte der Virusreplikation), ist bisher nur
wenig untersucht. Wir haben für eine initiale Charakterisierung der B19-Infektion endothelialer
Zellen in Zusammenarbeit mit dem TP B5 die Endothelzelllinie HMEC-1 mit B19-haltigen
Serumproben infiziert und eine Kinetik der B19-mRNA-Expression mittels B19-Real Time RTPCR erstellt. Die Ergebnisse belegen, dass diese Zellen B19 aufnehmen und das B19-Genom
nach Freisetzung im Nukleus transkribieren können. Ähnliche Ergebnisse wurden mit HUVEC,
einer zweiten endothelialen Zelllinie, erhalten. Um einen möglichen Beitrag der beschriebenen
B19-Rezeptoren (P-Antigen) und -Ko-Rezeptoren (Ku80-Autoantigen und α5β–Integrin) für die
endotheliale B19-Aufnahme bewerten zu können, wurde deren Expressions- und
Verteilungsmuster auf einer Reihe von endothelialen und Kontrollzelllinien untersucht. Mittels
Real Time RT-PCR konnte der Nachweis von Ku80- und α5β-Integrin-mRNA in endothelialen
HUVEC-, HMEC- und EA.hy926-Zellen geführt werden. Da Ku70 aufgrund einer möglichen
Heterodimerisierung mit Ku80 an der Rezeptorfunktion von Ku80 beteiligt sein könnte, wurden
dessen mRNA-Expression ebenfalls bestimmt. Die Expressionsmuster der B19-Rezeptoren und Ko-Rezeptoren auf Protein-Ebene sowie deren subzelluläre Verteilung wurden in EA.hy926Zellen analysiert. Dabei handelt es sich um eine Hybridzelllinie aus HUVEC und A549
(Lungenkarzinomzelllinie) mit endothelialen Zelleigenschaften, die im Vergleich zu HUVEC
eine größere Stabilität aufweist. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte eine hohe
Expression vonα5β-Integrin an der Zellmembran nachgewiesen werden, während Ku80 und
Ku70 ausschließlich Zellkern-assoziiert vorlagen. FACS-Analysen an permeabilisierten und
nicht-permeabilisierten Zellen bestätigten diese Befunde, zeigten jedoch darüber hinaus, dass
sowohl Ku80 als auch Ku70 zusätzlich an der Zellmembran exprimiert werden (Abb. 1). In
Übereinstimmung mit publizierten Befunden konnte neben den B19-Ko-Rezeptoren der primäre
B19-Rezeptor, P-Antigen, auf endothelialen Zellen nachgewiesen werden.
Abb. 1 Nachweis der Expression der B19-Rezeptoren und -Ko-Rezeptoren P-Antigen, α5β-Integrin und Ku80 sowie
von Ku70 mittels FACS-Analysen. Die Untersuchungen wurden an nicht-permeabilisierten bzw.
permeabilisierten (nur Ku70/Ku80 total) EA.hy926-Zellen durchgeführt.
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FECHNER
Um die Notwendigkeit der B19-Rezeptoren und -Ko-Rezeptoren für die Infektion endothelialer
Zellen auf der funktionellen Ebene zu analysieren, sollten zunächst adenovirale Vektoren sowohl
für eine Inhibition dieser Proteine mittels small hairpin (sh) RNA („knock-out“-Ansatz) als auch
mit Expressionskassetten für eine Komplementierung Rezeptor-defizienter Zellen („knock-in“Ansatz) generiert werden. Am weitesten fortgeschritten sind bisher die Arbeiten für den B19Ko-Rezeptor α5β-Integrin. Hier konnte mit einem adenoviralen shRNA-Vektor eine dosis- und
zeitabhängige Inhibition der endogenen α5β-Integrin-mRNA-Expression von über 95 % erreicht
werden. In Ko-Transfektionen wurde auch bereits die Funktionalität der Shuttle-Plasmide für die
Generierung der adenoviralen Vektoren mit den shRNA-Expressionskassetten gegen Ku80 und
Ku70 nachgewiesen. Derzeit wird die Produktion der entsprechenden adenoviralen Vektoren und
auch der adenoviralen Ku70/Ku80-Überexpressionsvektoren durchgeführt. Da das P-Antigen als
neutrales Glykolipid nicht direkt auf Nukleinsäureebene überexprimiert oder inhibiert werden
kann, haben wir shRNAs gegen eines des Schlüsselenzyme des P-Antigen-Syntheseweges, die
Gb3/77 Synthase, generiert. Gegenwärtig wird dabei die Funktionalität der shRNAExpressionsplasmide untersucht.
Post-Entry-Schritte der viralen Replikation
Neben der Adsorption und Internalisierung kann eine Reihe weiterer Faktoren den B19Infektionsverlauf in endothelialen Zellen beeinflussen. Post-Entry-Schritte, wie der Transport
der Virionen in den Zellkern mit anschließender Freisetzung der parvoviralen DANN, spielen
dabei mit Sicherheit eine wichtige Rolle. Beide Antragsteller haben bereits gemeinsam
Untersuchungen zu diesen spezifischen Mechanismen der Transduktion endothelialer und kardialer Zellen mit verschiedenen Serotypen des helferabhängigen Parvovirus AAV durchgeführt.
Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf dem intrazellulären AAV-Infektions-Pathway (1). Es
zeigte sich, dass zusätzlich zur AAV-Serotyp-spezifischen Internalisierung des Vektorgenoms
die Freisetzung der AAV-DNA im Zellkern (Uncoating) einen der limitierenden Schritte bei der
Genexpression in verschiedenen Zelltypen darstellt, während für die Translokation des Viruskapsids in den Zellkern keine signifikanten Unterschiede zwischen den verwendeten Serotypen
und Zelllinien gefunden wurden. Diese Untersuchungen wurden mit selbst-komplementären,
dimerischen AAV-Vektoren durchgeführt, die für eine effiziente Genexpression nicht auf die
Zweitstrangsynthese des einzelsträngigen parvoviralen Genoms angewiesen sind. Die Bedeutung
der Zweitstrangsynthese für die B19-Infektion endothelialer Zellen soll im Rahmen des hier
dargestellten Projekts mit Hilfe rekombinanter B19-Viren, die alternativ einzelsträngige oder
selbst-komplementäre, quasi-doppelsträngige AAV2-Vektor-DNA enthalten, analysiert werden.
Da beide Arbeitsgruppen seit längerer Zeit monomerische und dimerische AAV-Vektoren für
eine Reihe von therapeutischen Anwendungen entwickeln und in hochgereinigter Form produzieren, ist die für die Generierung rekombinanter B19/AAV-Vektoren notwendige Technologie
bereits gut etabliert. Aus der Charakterisierung von Zielstrukturen der AAV Rep Proteine, der
funktionellen Homologe des B19-NS1-Proteins, stehen eine Reihe von methodischen Werkzeugen zur Analyse der Post-Entry-Schritte der B19-Virusreplikation zur Verfügung. Ebenfalls
bereits etabliert ist eine Real Time PCR zur Quantifizierung der genomischen B19-DNA.
FECHNER
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Untersuchung der Interaktion von Adenovirus mit der endothelialen Parvovirus B19Infektion
Der Nachweis von B19-Genomen in endomyokardialen Biopsien ohne detektierbare Spiegel an
viralen Genprodukten und neu generierten Virionen deutet auf eine latente Virusinfektion hin.
Ob und durch welche Faktoren es zu einer Reaktivierung des latenten B19 mit entsprechenden
patho-physiologischen Auswirkungen kommen kann, ist bisher nicht bekannt. Exogenen
Faktoren, die hier möglicherweise eine wichtige Rolle spielen, sind Superinfektionen mit
anderen Viren. Adenoviren wurden bei DCMi-Patienten mit B19-Infektion nachgewiesen und
besitzen transaktivierende Eigenschaften. Initiale Experimente in endothelialen Zellen zeigten,
dass Adenoviren zu einer signifikanten Steigerung der Expression der B19-Proteine VP1 und
VP2 führen (Abb. 2). Welche adenoviralen Gene hierfür verantwortlich sind und mit welchen
B19-Genom- bzw. Strukturkomponenten sie dabei interagieren, ist jedoch bisher nicht geklärt.
Die beteiligten Komponenten sollen im Rahmen des Projekts im Detail charakterisiert werden.
Spezifische Erfahrungen zur Transaktivierung von Promotoren und der TransKomplementierung viraler Replikation durch die adenoviralen E1A-Gene konnten bereits in
früheren Studien gesammelt werden (6,8,12). Aus diesen Studien steht ferner eine Reihe von
Expressionskonstrukten für die frühen adenoviralen Gene zur Verfügung.
Abb. 2 Adenovirus-vermittelte Induktion der B19-Expression in Endothelzellen. EA.hy926-Zellen wurden mit einem
infektiösen B19-Genom (Plasmid pB19-M20) transfiziert und mit Adenoviren des Serotyps 5 überinfiziert.
Der Nachweis der B19-Strukturproteine VP1 und VP2 erfolgte mittels FACS-Analysen und indirekter
Immunofluoreszenz.
Liste der publizierten einschlägigen Vorarbeiten
Publikationen in wissenschaftlichen Zeitschriften
1.
Sipo I, Fechner H, Pinkert S, Suckau L, Wang X, Weger S, Poller W. Differential internalization and nuclear uncoating of self-complementary adeno-associated virus pseudotype vectors as
determinants of cardiac cell transduction. Gene Ther 2007; 14: 1319-29.
2.
Fechner H, Wang X, Hurtado Pico A, Wildner J, Suckau L, Pinkert S, Sipo I, Weger S, Poller
W. A bidirectional Tet-dependent promotor construct regulating the expression of E1A for tight
control of oncolytic adenovirus replication. J Biotechnol 2007; 127: 560-74.
3.
Fechner H, Suckau L, Kurreck J, Sipo I, Wang X, Pinkert S, Loschen S, Rekittke J, Weger S,
Dekkers D, Vetter R, Erdmann VA, Schultheiss HP, Paul M, Lamers J, Poller W. Highly efficient and specific modulation of cardiac calcium homeostasis by adenovector-derived short
hairpin RNA targeting phospholamban. Gene Ther 2007; 14: 211-8.
4.
Fechner H, Pinkert S, Wang X, Sipo I, Suckau L, Kurreck J, Dorner A, Sollerbrant K, Zeichhardt H, Grunert HP, Vetter R, Schultheiss HP, Poller W. Coxsackievirus B3 and adenovirus infections of cardiac cells are efficiently inhibited by vector-mediated RNA interference targeting
their common receptor. Gene Ther 2007; 14: 960-71.
5.
Weger S, Hammer E, Gotz A, Heilbronn R. Identification of a cytoplasmic interaction partner
of the large regulatory proteins Rep78/Rep68 of adeno-associated virus type 2 (AAV-2). Virology 2007; 362: 192-206.
6.
Hurtado Pico A, Wang X, Sipo I, Siemetzki U, Eberle J, Poller W, Fechner H. Viral and nonviral factors causing nonspecific replication of tumor- and tissue-specific promoter-dependent
oncolytic adenoviruses. Mol Ther 2005; 11: 563-77.
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FECHNER
7.
Weger S, Hammer E, Heilbronn R. SUMO-1 modification regulates the protein stability of the
large regulatory protein Rep78 of adeno associated virus type 2 (AAV-2). Virology 2004; 330:
284-94.
8.
Fechner H, Wang X, Srour M, Siemetzki U, Seltmann H, Sutter AP, Scherubl H, Zouboulis CC,
Schwaab R, Hillen W, Schultheiss HP, Poller W. A novel tetracycline-controlled transactivatortransrepressor system enables external control of oncolytic adenovirus replication. Gene Ther
2003; 10: 1680-90.
9.
Fechner H, Noutsias M, Tschoepe C, Hinze K, Wang X, Escher F, Pauschinger M, Dekkers D,
Vetter R, Paul M, Lamers J, Schultheiss HP, Poller W. Induction of coxsackievirus-adenovirusreceptor expression during myocardial tissue formation and remodeling: identification of a
cell-to-cell contact-dependent regulatory mechanism. Circulation 2003; 107: 876-82.
10.
Weger S, Hammer E, Heilbronn R. Topors, a p53 and topoisomerase I binding protein, interacts with the adeno-associated virus (AAV-2) Rep78/68 proteins and enhances AAV-2 gene expression. J Gen Virol 2002; 83: 511-6.
11.
Noutsias M, Fechner H, de Jonge H, Wang X, Dekkers D, Houtsmuller AB, Pauschinger M,
Bergelson J, Warraich R, Yacoub M, Hetzer R, Lamers J, Schultheiss HP, Poller W. Human
coxsackie-adenovirus receptor is colocalized with iIntegrins alpha(v)beta(3) and alpha(v)beta(5) on the cardiomyocyte sarcolemma and upregulated in dilated cardiomyopathy:
Implications for cardiotropic viral infections Circulation 2001; 104: 275-280.
12.
Fechner H, Wang X, Wang H, Jansen A, Pauschinger M, Scherubl H, Bergelson JM, Schultheiss HP, Poller W. Trans-complementation of vector replication versus Coxsackie-adenovirusreceptor overexpression to improve transgene expression in poorly permissive cancer cells.
Gene Ther 2000; 7: 1954-68.
13.
Weger S, Wendland M, Kleinschmidt JA, Heilbronn R. The adeno-associated virus type 2 regulatory proteins rep78 and rep68 interact with the transcriptional coactivator PC4. J Virol
1999; 73: 260-9.
14.
Fechner H, Haack A, Wang H, Wang X, Eizema K, Pauschinger M, Schoemaker R, Veghel R,
Houtsmuller A, Schultheiss HP, Lamers J, Poller W. Expression of coxsackie adenovirus receptor and alphav-integrin does not correlate with adenovector targeting in vivo indicating anatomical vector barriers. Gene Ther 1999; 6: 1520-1535.
Ausgewählte Vorträge auf Fachkongressen
Pozzuto T, Größl T, Fechner H. Evidence of human Parvovirus B19 receptors on endothelial
cells. International Parvovirus Meeting 2007, September 1-4, Bari, Italien
Fechner H: Gene therapy for treatment of viral heart diseases - new molecular tools and techniques open new perspectives. ESC Congress, 2007, October 8 - 10, Berlin
Weger S, Hammer E, Heilbronn R. Identification of a novel cytoplasmic protein that interacts
with the large regulatory proteins Rep78/Rep68 of adeno-associated virus type 2 (AAV-2). XIth
Parvovirus Workshop, Les Diablerets, Schweiz, 2006, August 27 -31
Weger S, Westphal J., Hammer E., Heilbronn R. Regulation of AAV gene expression and DNA
replication by the transcriptional coactivator PC4. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie
2006, München, Deutschland, März 15-18
Fechner H: Onkolytische Adenoviren in der Tumorgentherapie
Berliner Gentherapie-Seminar, Januar 12, 2005, Berlin
Fechner H: Neue Ansatzpunkte antiviraler Therapie bei der DCMi
SFB TR Workshop 2004: Kardiomyopathie, August 21-22, Berlin
Fechner H: Pharmacological regulated oncolytic adenoviruses. Jährliche Tagung der Deutschen
Gesellschaft für Virologie 2004, June 30 – Juli 3, Frankfurt
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Weger S, Hammer E, Hüser D, Heilbronn R. Covalent modification of the large Rep proteins of
AAV-2 by the small ubiquitin like modifier (SUMO). Jahrestagung der Gesellschaft für
Virologie 2003, Berlin, Deutschland, März 26-28
Weger S, Hammer E, Heilbronn R. Covalent modification of the large Rep proteins of AAV-2
by the small ubiquitin like modifier (SUMO). IXth Parvovirus Workshop, Bologna, Italien,
2002, August 28 – 31
Ziele des Teilprojekts
Während die kardiotropen Enteroviren überwiegend Myozyten infizieren, sind die primären
Zielzellen der akuten B19-Infektion Endothelzellen der kleinen intramyokardialen Arteriolen
sowie postkapilläre Venolen und Venen. Auch bei einem Nachweis von persistierendem B19 bei
der DCMi findet man das Virus vornehmlich in den Endothelien der Kapillaren. Obwohl
Endothelzellen den primären B19-Rezeptor, das Erythrozyten-P-Antigen, auf ihrer Oberfläche
exprimieren, findet in diesen Zellen nach übereinstimmenden Befunden keine produktive
Virusreplikation statt. Eines der Hauptziele des Projektes ist es daher, in Endothelzellen und in
permissiven erythroiden Vorläuferzellen einen detaillierten Vergleich der Virusaufnahme sowie
der nachfolgenden Schritte des B19-Replikationzyklus' bis zur Bildung eines transkriptionskompetenten DNA-Doppelstranges im Nukleus durchzuführen. Die so erhaltenen Aufschlüsse
über prinzipielle Mechanismen der kardialen B19-Infektion sollten zu einem besseren
Verständnis der abortiven B19-Infektion und der damit verbundenen Etablierung eines latenten
Zustandes des B19-Genoms in Endothelzellen führen. Untersuchungen zur Reaktivierung von
B19 bzw. die Induktion einzelner B19-Genprodukte im latenten Zustand durch eine Überinfektion mit den kardiotropen Adenoviren sollen einen weiteren Schwerpunkt des Projekts bilden.