Entwicklung neuer Verfahren zur simultanen Elimination von

BMBF Verbund-Projekt mit China 02 WT 0704
Entwicklung neuer Verfahren zur simultanen
Elimination von organischen Schadstoffen (Pestizide)
und Nitrat aus Trinkwasser unter Verwendung
biologisch abbaubarer Festsubstrate
Abschlussbericht
des Teilziels 1.2.2
KIT Campus Nord
Koordinative Projektleitung: Prof. Dr.-Ing. Wolfgang H. Höll
Wissenschaftliche Projektleitung: Prof. Dr. Ursula Obst, Dr. Thomas Schwartz
Administrative Projektleitung: Dr. Rainer Schuhmann (KIT Campus Süd)
Projektbearbeitung: Dipl.-Biol. Anja Karolewiez
Berichterstattung: Dr. Thomas Schwartz
1
Inhaltsverzeichnis
Seite
Zusammenfassung der Ergebnisse
3
1. Einleitung
4
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.5.1
1.5.2
Zielsetzung des Teilvorhabens 1.2.2
Konzeption und Zielsetzung des gesamten Forschungsvorhabens
Biologische Nitratelimination
Molekulare Grundlagen der Denitrifikation bei Bakterien
Molekularbiologische / mikrobiologische Untersuchungen des Teilprojekt
Populationsanalysen
Genexpressionsanalysen
4
4
5
7
7
7
9
2.
Material und Methoden
10
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
Isolierung von genomischer DNA aus Bakterienlösungen für die PCR
Vermessung von RNA/DNA mit dem Nanodrop-Photometer
Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
Agarose-Gelelektrophorese
Isolierung von RNA aus Bakterien
TaqMan PCR zum quantitativen Nachweis von funktionellen Genen
Nachweis spezifischer mRNA mittels Reverser Transkriptase TaqMan PCR
DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten mittels ABI 310
Denaturierende Gradienten Gelelektrophorese (DGGE)
Kultivierung von Bakterien
Nachweis der Gesamtzellzahl und Anzahl aktiver Bakterien
10
10
11
13
14
15
16
17
19
22
23
3
Ergebnisse
25
3.1
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.5
3.6
Kultivierung von Bakterien unter denitrifizierenden Bedingungen
Molekularbiologische Untersuchung des nitrathaltigen Grundwassers
Populationsanalyse eines Nitrat belasteten Grundwassers
Mikroskopische Untersuchungen der PCL Materialien
Untersuchungen mit dem Lichtmikroskop
Untersuchungen mit dem ESEM
Wachstum von Biofilmen auf den PCL-Aufwuchsmaterialien
Populationsanalysen der Biofilme aus den verschiedenen Reaktoren
aus Stuttgart, Rotherst sowie der Laborreaktoren Karlsruhe
3.7
Populationdynamiken in Biofilmen auf PCL Materialien des Stuttgarter
Rotobioreaktors und Dyna-Sand Reaktors
3.8
Kultivierung und Identifizierung von Biofilmbakterien des
Rotobioreaktors und des Dynasandreaktors in Stuttgart
3.9
Nachweis von Pilzen auf PCL der Stuttgarter Reaktoren
3.10 Populationsanalysen von PHB-Compounds aus einem heterogenen
Reaktor für Abwasser der Universität Halle-Wittenberg
3.11 Identifizierung von kultivierten Bakterien aus Biofilme von
Gelatine Compounds aus der Universität Halle-Wittenberg
3.12 Expression von funktionellen Genen der Denitrifikation in Referenzbakterien
und Biofilmen
3.12.1 PCR Primer für Gene für die Denitrifikation und Primerdesign
3.12.2 Expressionsanalyse der Nitratreduktase
3.12.3 Expressionsanalysen für die Nitritreduktase
25
25
27
29
29
30
31
34
38
41
42
43
44
45
47
50
52
4
Diskussion
54
5
Literatur
59
6
Anhang
64
2
Zusammenfassung der Ergebnisse
Verschiedene biologisch abbaubare Polymere auf der Basis von ε-Polycaprolacton (PCL)
wurden
zunächst
im
Batch-Verfahren
eingesetzt,
um
ein
Biofilmwachstum
unter
denitrifizierenden Bedingungen nachzuweisen. Ein Biofilmwachstum konnte auf den
Polymeren mit molekularbiologischen und mikrobiologischen Methoden nachgewiesen
werden. Diese Biofilme zeigten auf allen eingesetzten Polymeren einen Nitratabbau, wobei
sowohl die Biofilmbildung als auch das denitrifizierende Potential beim Gebrauch von
porösem Aufwuchsmaterial am höchsten nachgewiesen wurde. Die Biofilme entwickelten
sich bei diesen Batch-Versuchen mit frischem, unbewachsenem PCL innerhalb von ca.1-2
Wochen. Als Maß der Biomassenentwicklung diente der DNA-Gehalt der Biofilmbakterien
auf den Polymeren. Der DNA-Gehalt bei Biofilmen aus Batch-Versuchen betrug
durchschnittlich 25 µg/g PCL nach 10 Monaten Inkubation; dies entsprach einer
Bakterienzahl von c. 8.0 x 109 Bakterien. In technischen Reaktoren in Stuttgart und Rotherst
waren die Biofilme auf PCL etwas stärker entwickelt und zeigten einen durchschnittlichen
DNA-Gehalt von 40-65 µg/g PCL, was einer Bakteriendichte von 1.2-2.0x1010 Zellen
entsprach. Der prozentuale Anteil metabolisch aktiver Bakterien betrug 7-10% der
Gesamtzellzahl. Für Trinkwasser hygienisch relevante, kultivierbare Bakterien wurden in den
Biofilmen und im Wasser der Reaktoren nicht nachgewiesen.
Populationsanalysen der Biofilme auf PCL belegten die Anwesenheit von denitrifizierenden
Mikroorganismen.
Denitrifizierende
Mikroorganismen
der
gleichen
taxonomischen
Zuordnung konnten auch in den Nitrat belasteten Grundwässern nachgewiesen werden. Die
Sublasse der β-Proteobakterien war in den Biofilmen aller Reaktoren als dominante
Bakteriengruppe vorzufinden. Vertreter der α- und γ- Proteobakterien waren weniger häufig
nachgewiesen worden. Weiterhin konnte über molekularbiologische Fingerprintanalysen
gezeigt werden, dass die Biofilmpopulationen in ihrer Zusammensetzung über Monate in
dem
Rotobioreaktor
und
Dynasandreaktor
Stuttgart
stabil
vorlagen.
Periodische
Schwankungen im DNA-Gehalt dieser Biofilme konnten gemessen werden, sind aber somit
nicht auf Veränderungen in der Population zurückzuführen.
Neben Bakterien konnten auch denitrifizierende Pilze (Hefen, Schimmelpilze, etc.) in den
Biofilmen nachgewiesen werden, deren Anteil am Nitratabbau nur schwer abzuschätzen ist.
Auf Transkriptionsebene konnten Nachweissystem für die Expression der Gene der Nitratund Nitritreduktasen etabliert werden, die an Referenzbakterien und realen Biofilmen
erfolgreich getestet wurden. Limitierend bei diesen Genexpressionsanalysen zeigten sich der
geringe RNA-Gehalt der Reaktorbiofilme und die komplexe Mischkultur der Biofilme für die
Entwicklung
eines
Spezies-übergreifendes
Nachweissystems.
Dennoch
konnte
die
Genexpression der Nitratreduktasen NarG und NapA und der Nitritreduktasen NirK und NirS
in den Biofilmen sichtbar gemacht werden.
3
1
Einleitung
1.1
Zielsetzung des Teilvorhabens 1.2.2
In diesem Teilvorhaben soll eine Nitratelimination durch Bakterien auf Polymeroberflächen
(Biofilmen) untersucht werden, Bei diesem Abbauprozess dient das biologisch abbaubare
Polymer ε-Polycaprolacton als Aufwuchsträger für Bakterien und gleichzeitig als Substrat
(Kohlenstoffquelle). Dazu sind mikrobiologische und molekularbiologische Untersuchungen
der auftretenden Mikroorganismen nötig, um diese zu charakterisieren und den
Denitrifikationsprozess auf molekularer Ebene zu überwachen.
Das Ziel der molekularbiologischen/mikrobiologischen Untersuchungen ist die Identifizierung
und Charakterisierung von Biofilmen und deren Aktivitäten im Nitratabbau auf den polymeren
Festsubstraten.
1.2
Konzeption und Zielsetzung des gesamten Forschungsvorhabens
Allgemeines Ziel des Vorhabens ist es, ein Verfahren zur gekoppelten Entfernung von Nitrat
und organischen Schadstoffen (POPs, Persistant Organic Pollutants) insbesondere von
Pestiziden zu entwickeln, das auf der Anwendung von biologisch abbaubaren Polymeren
(BAP) beruht. Dabei wirken diese Polymere sowohl als Substrat für die Mikroorganismen, die
unter anoxischen Bedingungen anaerob Nitrat als terminalen Elektronenakzeptor veratmen,
als auch als Sorbens für gelöste Pestizide. Das Verfahren soll einen Beitrag zur
Trinkwasserversorgung in landwirtschaftlich genutzten Gegenden liefern, in denen die
Grundwässer sowohl Nitrat als auch mit organischen Substanzen belastet sind.
Der Grundwasserstrom ist Teil des natürlichen Wasserkreislaufs. Schadstoffe können auf
zwei Wegen in Grundwässer gelangen: zum einen durch die Mobilisierung und
Auswaschung von geogenen Substanzen, wie etwa Metallspezies, und zum zweiten durch
Verfrachtung mit dem in den Untergrund einströmenden oder einsickernden Wasser. Auf die
letztere Weise greift der Mensch in den natürlichen Kreislauf des Wassers ein.
Grundwasser besitzt gegenüber Oberflächenwässern den Vorteil, dass es durch die
natürliche Bodendecke relativ gut vor anthropogenen Einflüssen geschützt ist. Durch eine
intensive landwirtschaftliche Bodennutzung besteht jedoch die Gefahr, anthropogene
Verunreinigungen in den Grundwasserkörper einzubringen. Direkte Einflüsse durch
Stoffzufuhr resultieren z.B. aus der Ablagerung oder Entsorgung von festen und flüssigen
Abfallstoffen und Bewirtschaftungsmitteln, durch Nährstoffzufuhr, durch Klärschlammausbringung
und
durch
den
Einsatz
von
Pflanzenbehandlungs-
und
Schädlings-
bekämpfungsmitteln. Indirekte Einflüsse kommen aus Bodenbearbeitung, Bewässerungsmaßnahmen und Nutzungswandel.
Die Qualität des aus Grundwasser gewonnenen Trinkwassers wird bestimmt durch die
Aufbereitung und den Belastungsgrad des jeweiligen Rohwassers. Aufgrund der
4
aufwendigen Aufbereitungsmethoden für ihre Entfernung bei der Trinkwassergewinnung,
sind als vornehmlich kritische Parameter neben Nitrat besonders die persistenten polaren
organischen Schadstoffe (POPs: persistent organic pollutants) zu nennen (Deutsche
Forschungsgemeinschaft 1995, Frimmel 1995, Umweltbundesamt 1997, Knepper et al.
1999). Diese so genannten grund- bzw. trinkwassergängigen Stoffe, zu deren Gruppe auch
die Pestizide und Pestizidmetaboliten zählen, haben eine hochgradige Mobilität im Untergrund und werden biologisch nur langsam abgebaut.
Dem Forschungsvorhaben liegt die Idee zugrunde, die in anoxischem Milieu ablaufende
biologische Nitratreduktion und den Abbau von PBSM in einer Prozessstufe zu vereinigen.
Dabei wird ausgenutzt, dass die eingesetzten Substrate für die Nitratelimination PBSM
adsorbieren und sich damit anreichern können. Als Substrate / Adsorbentien sollen
insbesondere solche synthetischen Polymersubstanzen verwendet werden, die im strikt
anaerobem Zustand nicht abbaubar sind. Hierzu zählen Stoffe wie Poly-β-Caprolacton
(PCL). Die Leistungsfähigkeit der synthetischen Substrate kann durch Einbau von
Spurennährstoffen gezielt gesteigert werden, ohne dass diese in flüssiger Form zu dosieren
sind. In ihrer Konsistenz sollten diese Festsubstrate bevorzugt eine offenporige Struktur
aufweisen.
Infolge der Adsorption an dem Festsubstrat findet ein zumindest teilweiser co-metabolischer
Abbau der organischen Schadstoffe in dem die Substratpartikel umschließenden Biofilm
statt. Wie Voruntersuchungen gezeigt haben, führt eine PBSM-Sorption im Substrat bei
einem Festbett über lange Zeit nicht zu einer Beeinträchtigung der Nitratelimination. Mit
zunehmender Beladung durch Schadstoffe kann der biologische Abbau allerdings weitgehend zum Stillstand kommen, was auch und vor allem durch die Abbauprodukte der PBSM
hervorgerufen wird (Muller 2000).
In mehreren Regionen in Deutschland werden Kontaminationen sowohl mit Nitrat als auch
mit PBSM im Grundwasser angetroffen, die Nitratgehalte von zu 80 mg/L und gleichzeitig
Belastungen mit Atrazin, Desethylatrazin, Diuron und Ethidemuron aufweisen (Rutten 2004,
Huber 2004).
1.3
Biologische Nitratelimination
Nitrationen
gehören
zu
den
anorganischen Wasserinhaltsstoffen,
die
sich
durch
mikrobiologische Umsetzungen entfernen lassen. Grundlage der biologischen Nitratreduktion
sind biochemische Redoxreaktionen in anaerobem und anoxischem Milieu, bei denen Nitrat
als Oxidationsmittel fungiert. Bei der so genannten heterotrophen Denitrifikation benötigen
die Bakterien hierzu eine organische Kohlenstoffquelle. In der Regel handelt es sich dabei
um gelöste Stoffe.
5
Die
nitratreduzierenden
Mikroorganismen
bei
den
in
der
Trinkwasseraufbereitung
eingesetzten Verfahren sind in der Regel sessile Bakterien, die auf Oberflächen einen
Biofilm bilden, dessen Dicke im Verlauf des Prozesses anwächst.
Biofilme kommen ubiquitär in allen wässrigen Systemen vor und stellen die dominante
Lebensform der Bakterien dar. Biofilme entstehen, wenn Mikroorganismen sich an
Grenzflächen zwischen Gas- und Flüssigphasen (z. B. bei freiem Wasserspiegel), Flüssigund Festphasen (z. B. Kies an der Gewässersohle) oder an Flüssig-/Flüssigphasen (z. B.
Öltröpfchen im Wasser) ansiedeln. Die weitaus überwiegende Zahl an Mikroorganismen lebt
in der Natur in Form von Biofilmen. Untersuchungen zeigten, dass ungefähr 95% der
Bakterien, die im Trinkwasserverteilungssystem vorkommen, im Biofilm leben, nur 5% sind
als planktonisch lebend nachgewiesen (Flemming und Wingender, 2001).
Als vorteilhaft bei Biofilmen gilt deren Eigenschaft zur Selbstreinigung von Gewässern oder
zur Wasseraufbereitung für Trinkwasser. Diese Eigenschaft wurde bereits in der
Wasserindustrie erkannt und soll auch in diesem Forschungsvorhaben zum Abbau von
unerwünschten Wasserinhaltsstoffen wie Nitrat genutzt werden. In der bisher praktizierten
technischen Verwirklichung der Denitrifikation werden als Trägermaterialien benutzt: Sand,
Blähton, Bims, Kugeln aus Polymeren, gekörnte Aktivkohle, u.ä..
Das im Vorhaben entwickelte neue Verfahren weist gegenüber herkömmlichen Verfahren der
Denitrifikation mit gelösten Substraten erhebliche Vorteile auf. Während bei der
konventionellen Denitrifikation für die Zudosierung der löslichen Kohlenstoffquelle ein
erheblicher regelungstechnischer Aufwand getrieben werden muss, um eine Überdosierung
zu vermeiden, ist dies bei dem neuen Verfahren nicht erforderlich, da es sich hier um ein
selbst-regulierendes
System
handelt.
Es
soll
sich
ein
Gleichgewicht
zwischen
Enzymproduktion und Substratfreisetzung einstellen.
Auf molekularer Ebene sind die beteiligten Prozesse der biologischen Nitrateliminierung für
spezielle Mikroorganismen weitgehend verstanden. Die beteiligten Enzyme sind: (1) die
Nitratreduktasen, die entweder Membran gebunden (Nar), periplasmatisch (Nap) oder
cytoplasmatische vorliegen können; (2) die Nitritreduktase (Nir); (3) die Nitritoxireduktase
(Nor); (4) Lachgasreduktase (Nos).
NO3-
1
NO2-
2
NO
3
N2O
4
N2
6
1.4
Molekulare Grundlagen der Denitrifikation bei Bakterien
Unter Denitrifikation versteht man die Umwandlung des im Nitrat (NO3−) gebundenen
Stickstoffs zu molekularem Stickstoff (N2) durch bestimmte heterotrophe und einige
autotrophe Bakterien, die danach als Denitrifizierer bezeichnet werden. Bei diesem Vorgang,
der den Bakterien zur Energiegewinnung dient, werden bei Mangel an molekularem
Sauerstoff (O2) verschiedene oxidierbare Stoffe (Elektronendonatoren), wie organische
Stoffe, Schwefelwasserstoff (H2S) und molekularer Wasserstoff (H2), mit Nitrat als Oxidans
oxidiert. Der Vorgang ist eine Möglichkeit des Energiestoffwechsels.
Der Prozess der Denitrifikation ist an Membranen der Bakterien gebunden. In seinem Verlauf
wird Energie in Form eines Protonen-Konzentrationsunterschieds zwischen den durch die
Membran getrennten Räumen gespeichert. Es handelt sich daher um eine Form der
anaeroben Atmung, die auch als Nitratatmung bezeichnet wird. Da die Redoxpotentiale aller
Einzelschritte
der
Denitrifikation
positiv
sind,
können
diese
Bakterien
Nitrat
als
Elektronenakzeptor (Oxidationsmittel) für ihren oxidativen Energiestoffwechsel (oxidative
Phosphorylierung) nutzen, wenn kein oder nur begrenzt gelöster molekularer Sauerstoff (O2)
verfügbar ist (anoxische beziehungsweise hypoxische Verhältnisse).
Die verwendeten Reduktionsäquivalente (e−), die aus der Oxidation der organischen oder
anorganischen Stoffe stammen, unterscheiden sich zwischen den unterschiedlichen
Enzymen
und
Bakterien;
in
der
Regel
dienen
Chinone
und
Cytochrome
als
Elektronenüberträger. Durch die chemiosmotische Kopplung des Elektronentransports mit
der ATP-Synthese führt die Denitrifikation schließlich zur Energiekonservierung (Zumft;
1997).
1.5
Molekularbiologische / mikrobiologische Untersuchungen des Teilprojekts
1.5.1 Populationsanalysen
Durch die Entwicklung von Gensonden für eine Vielzahl von Umweltbakterien ist es möglich,
eine bakterielle Population umfassend zu beschreiben oder Bakterien mit kennzeichnenden
funktionellen Eigenschaften zu identifizieren, ohne eine kulturelle Voranreicherung
durchführen zu müssen. Mittels
Gradienten
Gelelektrophorese
Polymerase-Ketten Reaktion (PCR) und der Dichte
(DGGE)
können
Populationsshifts
der
bakteriellen
Populationen aufgezeigt, sowie das Auftreten von spezifischen Bakterien untersucht werden.
Die Zusammensetzung der natürlichen Bakterienpopulationen lassen sich anhand
unterschiedlicher DGGE-Muster darstellen und vergleichen. Die Amplifikation der relevanten
16S
rRNA-Abschnitte
erfolgt
mittels
Polymerase-Ketten-Reaktion
(PCR).
Als
Ausgangsmaterial können entweder Bakterien direkt aus dem natürlichen Habitat oder aus
zuvor
isolierter
DNA
zur
PCR
eingesetzt
werden.
Dabei
werden
verschiedene
7
Oligonukleotide ausgehend von der 16S rRNA als Primer verwendet, die sich für eine
taxonomische Charakterisierung der Bakterienpopulation aus aquatichen Kompartimenten
eignen. Durch die Zugabe von eubakteriellen Primern in den PCR-Ansätzen erfolgte die
Vervielfältigung der DNA-Fragmente. Die PCR-Produkte werden anschließend auf einem 1%
Agarosegel mit einer Elektrophorese zur Größenbestimmung der Gesamtamplifikate
aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die amplifizierte 16S rDNA wird mit einer
weiteren speziellen Elektrophoresetechnik, der DGGE, nach DNA-Sequenz aufgetrennt. Das
Prinzip der DGGE basiert auf einer unterschiedlichen Laufgeschwindigkeit während der
Elektrophorese aufgrund des unterschiedlichen Schmelzverhaltens von DNA-Fragmenten
mit gleichen Längen aber
verschiedener Sequenzen.
Dazu verwendet
man ein
Polyacrylamidgel mit einem denaturierenden Gradienten, in dem die DNA-Stränge chemisch
getrennt
werden.
Als
chemisches
Denaturierungsmittel
wird
Harnstoff
eingesetzt.
Voraussetzung für eine Separation von DNA-Strängen mit Hilfe der DGGE ist die
Verwendung einer G(uanin)-C(ytosin)-Klammer am 5´-Ende eines verwendeten Primers, um
ausreichende thermische Stabilität der PCR-Produkte zu gewährleisten. Nach der
Elektrophorese werden die DNA-Banden in den Gelen mit SYBR Green gefärbt. Das
Resultat der DGGE ist ein Bandenmuster, wobei jede Bande einer Bakterienart entspricht.
Zur genaueren Identifizierung der einzelnen Spezies werden DGGE-Banden aus dem Gel
ausgeschnitten, die DNA extrahiert, mittels PCR reamplifiziert und aufgereinigt. Die Reinheit
der PCR Produkte wird nochmals mittels DGGE überprüft und schließlich sequenziert. Über
einen Vergleich mit zugänglichen DNA-Datenbanken wird eine präzise Zuordnung der
sequenzierten DNA-Bande ermöglicht. In der nachfolgenden Abbildung ist die gewählte
Strategie
zur
Charakterisierung
von
Populationen
und
Bakterienspezies
aus
unterschiedlichen Habitaten dargestellt.
Belastetes Rohwasser:
natürliche Population
Amplifikation der
Gesamt-DNA
PCR
Reaktoren:
Selektion auf Denitrifikanten
Gesamt-DNA
PCR
DNA
PCR
Charakterisierung von Bakterien mit molekularbiologischen Methoden
DGGE und Sequenzierung
Bakterien (allgemein)
Speziell für
Denitrifikation
Abbildung 1: Prinzip der molekularbiologischen Populationsanalyse
8
1.5.2 Genexpressionsanalysen
Eine Genexpressionsanalyse bezeichnet eine Untersuchung der Umsetzung der genetischen
Information
(Genexpression)
mit
molekularbiologischen
Methoden.
Die
Genexpressionsanalyse ermöglicht qualititive/quantitative Aussagen über die Aktivität
verschiedener Gene.
Die DNA für die Proteine steuert die Proteinsynthese nicht selbst, sondern nutzt RNA als
molekulare Zwischenstufe. Sobald die Zelle ein bestimmtes Protein braucht, wird die
Nukleotidsequenz
abgeschrieben
des
entsprechenden
(Transkription).
Diese
Bereichs
des
RNA-Abschnitte
Genoms
dienen
zunächst
als
Matrize
in
für
RNA
die
Proteinsynthese. Je mehr Protein benötigt wird, desto mehr Matrizen werden hergestellt.
Daher dient die Anzahl der Matrizen als Indikator für die Anzahl der hergestellten Proteine.
Zuerst wird die Gesamt-RNA der Bakterien isoliert und wieder in DNA umgeschrieben
(cDNA). Dann wird eine Real-Time-PCR oder Acylamidgelelektrophorese mit dieser cDNA
für das Zielgen mit spezifischen Primern durchgeführt.
Die Real-Time-PCR ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Durch die dem
Reaktionsgemisch zugesetzten Farbstoffe wird die Konzentration des Produktes während
der PCR verfolgt. Durch die Auswahl bzw. Design von neuen Primersequenzen für Gene, die
in der Denitrifikation eine wichtige Rolle spielen, wird die Genaktivität spezifisch in einer
RealTime-PCR quantifiziert und damit Potentiale der Nitratelimination sichtbar gemacht. Das
Prinzip der Genexpressionsanalyses ist in nachfolgender Abbildung sichtbar gemacht.
Gesamt-RNA
cDNA
RealTime-PCR
Abbildung 2: Prinzip der Genexpressionsanalyse
9
2.
Material und Methoden
2.1
Isolierung von genomischer DNA aus Bakterien für die PCR
Qiagen Genomic-Mini tip 20/G oder Midi tip 100/G (25) Nr. 10243, 242,- (Qiagen)
Genomic DNA Buffer Set Nr. 19060, 102,- (Qiagen)
RNase A Nr. 19101, 199,- (Qiagen) Konz. 100mg/mL
Proteinase K, Nr. 19133, 299,- (Qiagen) gebrauchsfertig
Lysozym Nr. L7651 (Sigma) Stocklösung 100mg/mL
Ethanol (70%) kalt
Isopropanol Nr. I-9516 (Sigma)
Î Dieser Test wird benutzt, wenn in der Lösung viel DNA zu erwarten ist
Î Der Test besteht aus folgenden Schritten:
Ö Aufbrechen der Zellen in Puffer 1mit Lysozym und Proteinase K unter
Anwesenheit von RNase bei 37°C in
Ö Denaturierung von DNA-bindenden Proteinen bei 50°C mit Puffer 2
Ö Aufbringen der Lösung auf die Harzsäule (Genomic-tip) und dabei Bindung der
DNA durch Gravitationskräfte an das Harz
Ö Waschen der Säule mit Puffer QC
Ö Elution der DNA durch Puffer QF
Ö Auffangen der Lösung mit isolierter DNA
Ö Fällung der DNA durch Isopropanol; zentrifugieren und waschen der gefällten
DNA mit kaltem 70%-igem Ethanol
Ö Lufttrocknen des Pellets und aufnehmen in dest. Wasser (Achtung: Zu lange
Trocknungszeiten machen das Auflösen des Pellets schwieriger)
Î siehe Vorschrift im Handbuch (Seite 40) von Qiagen, Bemerkungen dazu:
Ö Wasserbäder auf 37°C und auf 50°C erwärmen
Ö Bei verschmutzten Proben kommt es schnell zur Verstopfung der Säule; eventuell
Probe vorher von Schwebstoffen durch Faltenfilter reinigen
Ö Der Punkt 5B. wird angewendet
2.2
Vermessung von RNA/DNA mit dem Nanodrop-Photometer
Die Konzentration von DNA bzw. RNA in Lösung kann photometrisch bestimmt werden.
Nukleinsäuren adsorbieren Licht der Wellenlänge 260nm und Proteine von 280nm. Dabei
gilt der folgende Zusammenhang:
Î Extinktion bei 260nm von 1 OD entspricht:
50µg/mL ds DNA
37µg/mL ssDNA
40µg/mL RNA
Î hohe Reinheit, wenn Extinktion bei 280nm (=Proteine) gering
Î hohe Reinheit, wenn Extinktion bei 260nm (=DNA) hoch
Î liegt Verhältnis der Extinktion 260 nm und 280 nm bei etwa 1,8 und 2,2 ist die
Nukleinsäure ausreichend rein
10
Î liegt das Verhältnis zwischen Extinktion 260 nm und 280 nm bei unter 1,6 wird eine
erneute Aufreinigung der Nukleinsäure empfohlen
Î 30 ng DNA entspricht 5pmol DNA
Î Das „DNA-Photometer“ NanoDrop von Peqlab benötgt 2µl Probenvolumen
Ö Zeigt die Extinktion in einem Wellenlängebereich von 220nm bis 350nm.
Ö Errechnet die Konzentration der DNA bzw RNA ng/µL und pmol/µL
Ö Der Messbereich liegt zwischen 2 und 3000 ng/µl, so dass eine Verdünnung selten
notwendig ist.
Ö Für RNA Messunng Linse vorher in 0,5% SDS inkubieren, dazu 5µl auftragen und
Detektorarm herunterdrücken
Ö Nach dem Start der Software unter eigenem Account anmelden und zu
vermessende Lösungsklasse (z.B. Nucleic Acid) wählen.
Ö Für die Initialisierung des Gerätes 2µL H2O auf Linse auftragen und „OK“ drücken.
Ö Blind/Blank-Wert mit jeweiligem Lösungsmittel der Nukleinsäure setzen, dazu
dieses auf Linse auftragen und „Blank“ drücken
Ö Messwerte mit 2 µl Nukleinsäurelösung messen, dazu dieses auf Linse auftragen,
Detektorarm herunterdrücken und „Measurement“ drücken
Ö Nach der Messung Dektektorarm wieder hochdrücken, Reste der
Nukleinsäurelösung mit einem staubfreien Kimwipe von Detektorarm und Linse
abwischen, Gerät ist nun bereit für die nächste Messung
Ö Für wiederholte Messungen erneut 2µl auftragen, nicht gleiche Lösung zweimal
messen, ist wegen Verdunstung ungenau
Ö Daten werden als Excel kompatibles Dokument automatisch im jeweiligen User
Account gespeichert.
2.3
Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
HotStarTaq DNA Polymerase benötigt zum Starten ihrer Aktivität einen Hitzeschritt von 15
Minuten bei 95°C. Dies ermöglicht einen unkomplizierten PCR-Ansatz bei Raumtemperatur.
Thermocycler
MicroAmp 96-WellTray
MicroAmp96-WellBase
sterile PCR-Reaktionsgefäße 0,2 mL, DNA frei
HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen Nr. 203203:Kit enthält PCR-Puffer 10x konz.,
incl. MgCl2)
dNTP Set, 100 mM Solutions ( dATP, dGTP, dTTP, dCTP) (Pharmacia): Stammlösung
10 µL je dNTP, ad 100µL mit aqua dest. (Endkonz.: 10mM)
Primer 1 (x pmol/µL)
Primer 2 (x pmol/µL)
steriles aqua dest.oder gekauftes PCR-Wasser
Î Der erste Schritt beim Ansatz der PCR ist das Zählen der Ansätze und damit
verbunden die Berechnung des PCR-Mastermix
Ö Herstellen eines PCR-Mastermix:
•
•
•
• Anzahl der Proben
+ Anzahl der Positiv-Kontrollen
+ Anzahl der Negativ-Kontrolle
11
•
•
= Anzahl der Ansätze insgesamt( n)
wegen Pipettenungenauigkeiten wird für den Mastermix⇒n+1 angesetzt
ein PCR-Ansatz erfolgt im 50µL oder 100µL-Volumen, die unten
aufgeführte Tabelle bezieht sich auf 100µL (entspricht der Hälfte der
Komponenten beim 50µL-Ansatz)
Komponenten
Volumen
PCR-Puffer 10x konz.
incl. MgCl2
dNTP-Lösung
primer 1
primer 2
HotStarTaq DNA Polymerase
Aqua dest.
10µL
2µL
xµL
xµL
0,5µL
xµL
Konzentration der
Stammlösungen
Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4,
15mM MgCl2; pH 8.7 (20°C)
10mM je dNTP
100mpol/µL
100pmol/µL
5U/µL
Gesamtvolumen incl. Target
soll 100µL betragen !
Endkonzentration
im Ansatz
Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4,
1.5mM MgCl2; pH 8.7 (20°C)
200 µM je dNTP
x pmol (meist 30 – 50 pmol)
x pmol (meist 30 – 50 pmol)
2,5 U
Î MicroAmp 96-WellTray auf MicroAmp96-WellBase legen, Anzahl der benötigten
Reaktionsgefäße einstecken
Î Target-DNS (als Negativkontrolle entspechendes Volumen aqua dest. aus der
verwendeten Charge) im Reaktionsgefäß vorlegen (bei Bakterienlösungen 10µL im
100µL Ansatz) und gut gemischten PCR-Reaktionsmix zugeben (Target-DNA und
PCR-Reaktionsmix insgesamt 100µL Volumen)
Î 96WellTray mit Reaktionsgefäßen in Thermocycler einsetzen, Deckel schließen und
PCR-Programm starten.
PCR-Protokolle zum Nachweis der von Genen der Denitrifikation
Nitratreduktasen NarG mit Primer NarG1F und NarG1r und NapA mit Primer PAE NapA2f
und PAE NapA2r:
Thermocyclerprofil für NarG: das Amplicon besitzt eine Größe von 500 bp
95°C
95°C
50°C
72°C
72°C
15 min
30 sec
30 sec
1 min
10 min
30X
Thermocyclerprofil für NapA: das Amplico besitzt eine Größe von 66 bp
95°C
95°C
48°C
72°C
72°C
15 min
30 sec
30 sec
1 min
10 min
30X
Nitritreduktasen: NirK mit den Primern F1aCu undR3Cu und nirS mit den Primern Cd3aF und
R3Cd:
Thermocyclerprofil für NirK: das Amplicon besitzt eine Größe von 437-450 bp
95°C
95°C
57°C
72°C
72°C
15 min
30 sec
1 min
1 min
10 min
28X
12
Thermocyclerprofil für NirS: das Amplicon besitzt eine Größe von 425 bp
95°C
95°C
52°C
72°C
72°C
2.4
15 min
30 sec
1 min
1 min
10 min
28X
Agarose-Gelelektrophorese
Elektrophorese-Kammer (Renner)
Netzgerät (Biometra)
Transilluminator (Vilber-Lourmat,)
Kunststoffwanne, Größe entsprechend dem Gel
Dispensier-Pipette (Eppendorf Comforpette mit Vorsatz für 10µL Spitze)
Handschuhe
Erlenmeyerkolben ca. 500 mL
Multipurpose-Agarose (Appligene)
Ethidiumbromid (Sigma): Stammlösung 10 mg/mL in aqua dest.
TAE-Puffer:
Tris
(Lauf-Puffer)
Na-Acetat
EDTA
Eisessig
Längenstandard 100 bp DNA Ladder (Roche)
Probenpuffer (“blauer Gelauftragspuffer”: EDTA 50 mM pH 8,0, 20 % Ficoll, 0,25 % Bromphenolblau,
0,25 % Xylen-Cyanol-> 0,4g Ficoll, 5mg Bromphenolblau, 5mg Xylen-Cyanol+ 2mL EDTA )
0,4 N NaOH (16 g NaOH in 1 L aqua dest.)
Herstellen des TAE-Puffers (100x, 1 Liter)
• 484,4 g (4M) Tris Base (Sigma 7-9)
• 82,0 g (1M) Natriumacetat
• 37,2 g (0,1M) EDTA
•
Î einwiegen, 500mL aqua dest. zugeben, ca. 100mL Eisessig zufügen, etwa 5 Minuten
im Ultraschallbad bestrahlen, zwischendurch umrühren, ca. pH 8 mit ca. 40mL
Eisessig einstellen; rühren lassen, um
• 1) die noch kristallinen Stoffe in Lösung zu bringen
• 2) die auf ca. 40°C erwärmte Lösung abzukühlen,
Î pH-Wert mit Eisessig exakt auf 8,0 einstellen, auf 1Liter mit aqua dest. auffüllen.
Î Zur Herstellung des 1 x TAE-Gebrauchspuffers 25 mL TAE-Puffer (100x) und 2475
mL aqua dest. mischen
Herstellen eines 1%igen Agarose-Gels
• 2 g Agarose
• 200 mL TAE Gebrauchspuffer
• 0,4 gAgarose
• 40mL TAE Gebrauchspuffer
•
Î im Erlenmeyerkolben mischen
→ für den ”großen ”Schlitten
→ für den ”kleinen” Schlitten
Î in Mikrowelle (höchste Stufe, ca. 3 min) kurz aufkochen, es sollten beim
Umschwenken der Lösung keine Schlieren mehr zu sehen sein
Î auf ca. 55 °C abkühlen lassen (entweder im Wasserbad oder unter fließend Wasser)
und 20 µL (”großer” Schlitten) bzw. 4µL (”kleiner” Schlitten) einer 1 % Ethidiumbromid
13
Stammlösung (Endkonzentration im Gel: 1µg/mL) zugeben. Vorsichtig durch leichtes
Schwenken des Kolbens mischen
Î Elektrophoresetank in der Horizontalen justieren, so dass das Gel eben gegossen
werden kann
Î Gelschlitten mit Kämmen und Begrenzungsleisten bestücken, eventuell mit
Klebestreifen abdichten und auf den Deckel der Elektrophorese-Apparatur stellen
Î Gel langsam und luftblasenfrei in die Mitte des Gelschlittens gießen, eventuell
enstandene Luftblasen z. B. mit Eppendorfpipettenspitze entfernen
Î mind. 20 Minuten bis zum Erstarren abwarten (im Kühlschrank zu beschleunigen),
Klebeband entfernen und Kämme durch leichte Zitterbewegung (Vorsicht, sonst Risse
am Gelboden) herausnehmen
Elektrophoreselauf
Î Elektrophorese-Tank mit ca. 2 L 1x TAE-Puffer füllen und Schlitten mit Gel einsetzen
(kleines Gel eventuell mit Klebeband am Rand fixieren)
Î für jedes Amplifikat in gekennzeichneten PCR-Caps mit Comforpette 1 µL (oder 2µL)
Probenpuffer vorlegen
Î je 10 µL (oder 20µL) Amplifikat zugeben (Praktisch: verwendete Spitze im tube für
späteres Pippetieren in die Geltasche belassen)
Î pro Geltasche 11 µL (oder 22µL) Amplifikat-Puffer-Gemisch pipettieren, Reihenfolge
dokumentieren
Î Längenstandard (Konzentration laut Beschreibung) nicht vergessen, günstige Position
wählen
Î Kammer schließen und Elektrophorese starten (50 - 100 Volt)
Î nach geeigneter Zeit (30Minuten- 4Stunden) Gerät abschalten, Gel auf Gelträger
vorsichtig aus der Kammer nehmen und auf Transilluminator ”rutschen” lassen,
entweder
Î Banden auf Transilluminator auswerten, eventuell Polaroidfoto anfertigen
Î Bedienung der Kamera:
Ö Film einlegen (für 10 Aufnahmen)
Ö Blende (z.B. 8) und Belichtungszeit(z.B. 4) einstellen
Ö Tubus über Gel stülpen, Kamera auf Tubus stecken
Ö Auslöser betätigen, Papierstreifen erscheint, diesen herausziehen, zweiter
Papierstreifen erscheint, an diesem befindet sich das Foto, ebenfalls
herausziehen
Ö Foto 30 Sekunden entwickeln lassen, Folie abziehen
Î oder Gel mit dem Lumi-Imager von Roche Diagnostics auswerten
2.5
Isolierung von RNA aus Bakterien
RNeasy® Mini Kit Nr.74104(50 Spin Columns),350DM, Fa. Qiagen
TE-Puffer (10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH= 8,0)
14,5 M ß-Mercaptoehtanol
Ethanol abs..
Lysozym
RNase-freie Eppendorfspitzen (blau, gelb, kristall)
14
Lysozym-Stammlösung (gelöst in Wasser):
Für Bakterien: 50 mg/mL Lysozym
TE-Puffer mit Lysozym:
Für Bakterien: 6µL Lysozym-Stammlösung (s.o.) pro 100 µL TE-Puffer
Anzüchten der Bakterien
Die Bakterien in einer Flüssigkeitskultur anzüchten (z.B.: BHI) und in der exponentiellen
Phase ernten: 3-5 min bei 8000 rpm zentrifugieren . Überstand verwerfen.
Ca. 5 x 108 Zellen in 100 µL Lysozym / TE-Puffer resuspensieren, gut vortexen.
•
Lyse mit Hilfe von Puffer RLT
350µL Puffer RLT (enthält ß-ME) zugeben, Probe gut vortexen!! (evtl. 2 min bei max.
Drehzahl zentrifugieren, nur Überstand weiterverwenden).
•
•
Herstellung der Bindungsbedingungen
Zugabe von 250 µL Ethanol abs., mit der Pipette gut mischen, nicht zentrifugieren.
Auftragen auf die Säule
Probe (ca 700 µL) auf den Spin Column auftragen (evtl. entstandene Präzipitate auch
auf die Säule laden), Spin Column muß in einem „Collection tube“ sitzen. Für 15 sec bei
>10.000 rpm zentrifugieren.
•
Waschen
700 µL Puffer RW1 auf die Säule geben und für 15sec bei mehr als 10.000 rpm
waschen.
Säule in einen neuen „Collection tube“ überführen und 500 µL Puffer RPE auftragen, für
15 sec bei mehr als 10.000 rpm waschen, Durchlauf verwerfen.
Erneut 500 µL Puffer RPE auftragen und 2 min bei maximaler Geschwindigkeit die
Säule trocknen (wenn nötig Säule durch nochmaliges zentrifugieren für 1min bei max.
Geschwindigkeit trocknen, zur Vermeidung einer evt. Puffer RPE-Kontamination).
•
Elution
Säule in ein 1,5 mL Eppendorf-cap geben (wird mitgeliefert) und 30-50 µL RNase-freies
Wasser direkt auf die Membran geben. Zur Elution für 1min bei mehr als 10.000 rpm
zentrifugieren.
•
Lagerung
Die so gewonnene RNA kann bei –20°C/-70°C bis zu 1 Jahr gelagert werden.
2.6
TaqMan PCR zum quantitativen Nachweis von funktionellen Genen
Für die quantitative PCR wurde ein Reaktionsvolumen von 50 µl verwendet.
pro Ansatz
2 x uMM Buffer
Vorwärts-Primer 5µM
Rückwärts-Primer 5µM
Sonde 5µM
Template
Wasser
25 µl
3 µl
3 µl
2 µl
10 µl
7 µl
15
Thermocycler-Bedingungen
40 x
50°C
95°C
95°C
60°C
4°C
2:00
10:00
0:15
1:00
∞
2.7
Nachweis spezifischer mRNA mittels Reverser Transkriptase TaqMan PCR
Durch Verknüpfung von Reverser Transkriptase-Reaktionen mit einer quantitativen TaqManPCR bietet sich eine weitere sensitive Möglichkeit zur Quantifizierung der Genexpression. Im
ersten Schritt erstellte die reverse Transkritase nach Hybridisierung eines Primers mit der
Zielsequenz der mRNA eine cDNA-Kopie. Im zweiten Schritt wurde diese cDNA in einem
TaqMan-Ansatz amplifiziert und quantifiziert. Da die mRNA dem codogenen Strang der DNA
entspricht und in 5´-3´-Richtung synthetisiert wird, kann die Transkription nur mit einem
Primer durchgeführt werden, der in der Sequenz einem Abschnitt des komplementären
Stranges entspricht (Rückwärtsprimer). In der reversen Transkription werden somit
komplementäre mRNA Kopien des Gens transkribiert. Die gebildete cDNA dient als
Template für die nachfolgende TaqMan-PCR. Als Polymerase zur Ausführung der Reversen
Transkription wurde die Multiscribe Reverse Transcriptase (Applied Biosystems) eingesetzt.
Pipettierschema für einen 50 µl Ansatz:
10x TaqMan RT Puffer (Applied Biosystems)
25 mM MgCl2
deoxyNTPs Mixture (Applied Biosystems)
Primer (2,5 µM)
5 µl
11 µl
10 µl
2,5 µl
RNase Inhibitor
1,0 µl
MultiScribe (Applied Biosystems)
1,25 µl
ad 40 µl
RNA
10 µl
Thermocycler-Bedingungen für die Reverse Transkriptase-Reaktion
(Inkubation
nur bei random
hexamers)
(25°C
10 min)
Reverse Transkription
Inaktivierung der
Polymerase
48°C
30 min
95°C
5 min
4°C
∞
Zur Quantifizierung der gebildeten cDNA wurden 10 µl Lösung aus der Reversen
Transkriptase-Reaktion zur TaqMan-PCR unter Standard-Bedingungen entnommen.
16
2.8
DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten mittels ABI 310
Die DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten erfolgt nach dem Sanger Prinzip. In einem
PCR-ähnlichen Ansatz sind in einer Pufferlösung neben einem Primer, einer Polymerase und
dNTPs auch ddNTPs beigefügt. Die verschiedenen ddNTPs sind mit unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Als Target für den Primer dient meist ein PCR-Produkt. Bei
der Extension werden zufällig ddNTPs eingebaut und die Polymerase-Reaktion bricht ab.
Beim Einsatz eines Primers der vorherigen PCR-Reaktion entstehen dadurch DNAFragmente mit 3´-terminaler Fluoreszenzmarkierung der Längen Primer+1 Nukleotide bis zur
Größe des PCR-Produktes. In einer Kapillarelektrophorese am ABI 310 werden die Produkte
nach Größen getrennt. An Hand der Abfolge der Fluoreszenzfarben kann dann die
Nukleotidsequenz gelesen werden. Die Leseweite kann bis zu 500 bp betragen.
DNA-Vorbereitung
Herstellen der Templates für die Sequenzierung durch PCR
Aufreinigen der Amplifikate
durch “ExoSAP-IT® For PCR Product Clean-Up” (Best-Nr: 78200 (100rxn),Fa. Usb)
o ExoSAP-IT aus Kühlschrank nehmen, auf Eis lagern
o Zu 5 µL PCR-Produkt 2µL ExoSAP-IT geben (im PCR-tube)
o Inkubation: 37°C fur 15 min (Enzymreaktion)
o Dann Inkubation: 80°C für 15 min (Inaktivierung der Enzyme)
o Aufgereinigtes PCR-Produkt kann direkt in die Sequenzierung eingesetzt
werden.
durch Auftragen der DNA auf ein Agarosegel
o
o
(auch bei Fragmenten unter 70bpmöglich)
Banden ausschneiden mit 50-100µL dH2O über Nacht inkubieren oder für 2h
auf dem Schüttler (die DNA diffundiert ins dH2O)
Messung des DNA-Gehaltes (Angabe in ng/ µL)
Menge an doppelsträngiger DNA = A260 * 50ng/µL
Sequenzierreaktion
Sequenzier-Kit (incl. Premix): BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit, Best-NR.
4336774, Fa. Applied Biosystems
Rezept für einen 10µL-Ansatz:
Komponenten
Premix
DNA-template
Primer (Achtung: nur 1 Primer!!)
dH2O
Total
Menge [µL]
2µL
x
y
10-(x+y)-4
10
Endkonzentration
*
5 pmol
10-200bp:
0,5-1,5 ng
200-500bp: 1,5-5 ng
500-1000bp: 2,5 -10 ng
Thermocycling (ca. 1h)
(Reaktionsvolumen auf 20µL einstellen!!)
96°C
96°C
Primerabhängig
60°C
5min
10sec
5sec
1min
25X
17
4°C
Target
16s
∞
Bezeichnung
517R
Annealing
55°C
Aufreinigung:(um überschüssige Dye Terminator zu entfernen)
DyeEx2.0 Spin Kit (250), Best-NR. 63206, Fa. Qiagen/ Hilden
Fällungs- Protokoll für Dye Ex Ersatz:
- Probenvorbereitung wie gehabt mit SAP- Verdau und Sequenzierreaktion
- dann folgendes Protokoll mit der Sequenzierprobe:
- in 1,5ml Eppi:
- 10µl Sequenzierprobe,10µl PCR- H2O, 2µl 3M NaAc (pH= 4,6), 50µl EtOH (96%)
zusammen geben und vortexen
für 15min bei Zimmertemperatur inkubieren (geht auch länger, z.B. über Nacht bei
4°C)
- Bei 13.000rpm für 15- 20min bei Zimmertemperatur zentrifugieren
- Überstand komplett abnehmen und verwerfen
- Mit 250µl EtOH (70%) waschen und vortexen
- Bei 13.000rpm für 5min bei Zimmertemperatur zentrifugieren
- Überstand komplett abnehmen und verwerfen
- Sediment trocknen (z.B 1min bei 90°C auf Heizblock)
Wichtig: es darf sich kein Ethanol mehr im Reaktionsgefäß befinden Æ Eppi- Deckel
offen lassen
-
Aufnehmen in 10µl PCR- H2O oder TE- Puffer (pH= 8 )
Zur Sequenzierung einsetzen (3µl Probe, 12µl HiDi)
Elektrophorese im ABI Prism 310 Genetic Analyser (Sequenzierung)
Die Sequenzierung kann mit 47cm Kapillaren (und POP4) oder mit 61cm Kapillaren (und
POP6) durchgeführt werden. Allerdings sind Sequenzierungen mit der 47cm Kapillare (mit
POP4) wesentlich schneller als die Sequenzierungen mit 61cm Kapillare (mit POP6). Je
langsamer die Elektrophorese (abhängig vom Polymer und der Elektrophoresespannung)
und je länger die Auftrennstrecke, umso höher ist die erreichbare Leseweite (von ca 300 bis
max 600 bp).
Buffer 10x with EDTA 25mL: Applied Biosystems Best.Nr. 402824
Hi-Di formamide, 25mL : Applied Biosystems Best.Nr. 4311320
POP4 Polymer5mL : Applied Biosystems Best.Nr. 402838
47cmx50µm Capillaries: Applied Biosystems Best. Nr. 402839
LiChroSolvWasser 1L : VWR Best.Nr. 1.15333.1000
Polymer und Puffer bereitstellen zum temperieren (ca. 30min)
Sequenzer einschalten
Computer einschalten
Kapillare einsetzen (Kapillare länger als Elektrode)
Autosampler kalibrieren (Probentray vorher rausnehmen)
Spritze mit Polymer äquilibrieren, mit Polymer füllen (luftblasenfrei!)
10x Puffer verdünnen (→1x Puffer) und einsetzen (Anode und Katode)
Spritzenstempel auf Position bringen (zuerst Syringe home, dann:
Syringe down 600: bis der Spritzenstempel die Spritze erreicht; dann Syringe up 5)
18
Block mit Polymer füllen
System Start
Sample Sheet erstellen und speichern:
ABI Prism Collection Software: File/ New/ Sequence Sample Sheet (48 tubes)
• 4 Dyes
• Dye Set /Primer: DT310 POP4{BD}v1.mob
• Matrix File:Matrix_Seq_E
• File Save as…
• Injection List erstellen
• Sample Sheet:
• Injection 1: Seq. Fill Capillary (ohne Matrix) (“edit/ insert”)
• Injection 2: Test CCD 4 Color (ohne Matrix) (“edit/ insert”)
Module für Proben:
Modul:
Injection time
Electrophorese voltage
Collection time
EP voltage
Heat plate temperature
Syringe pumping time
P4rapidSeqSilke(1mL)E.md4
10 sec
15 KV
20 min
15 KV
50 °C
240 sec
P4StdSeq(1mL)E.md4
30 sec
1 KV
32 min
11,3 KV
50 °C
240 sec
• Letzte Injection: Seq Fill Capillary (ohne Matrix) (“edit/ add”)
Sample in Tray einsetzen
Start
Auswertung:
2.9
Denaturierende Gradienten Gelelektrophorese (DGGE)
Acrylamide/ bis- Acrylamide 40% Solution, Sigma, A 7168
Formamide, AppliChem,A 0871,0500
Urea, Sigma, U- 5378
TEMED ultra pure grade, amresco, 0761
Tris- Base, Sigma7-9, Sigma, T 1378
Acetic acid glacial, A 6283
EDTA, Riedel-de-Haën, 27285
Ammonium persulfate ACS grade,APS, amresco 0486
SYBR Gold, Molecular Probes; S-11494
Bromphenolblau, Sigma, B-8026
Xylene Cyanole, Sigma, X-4126
Verwendete Oligonukleotide als Primer in PCR
Oligonukleotide Organismus
Sequenz nach E. coli ( 5´ Î 3´)
Zielsequenz
GC 27 F
Eubacteria
(GC-Clamp)AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
8-27
517 R
Eubacteria
ATTACCGCGGCTGCTGG
534-517
GC-Clamp: 5´-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCG CCC CCG CCC C-3´
19
Verwendete Lösungen für die DGGE
10 x / 50 x TAE Puffer (1 Liter)
Chemikalien
Tris-Base
Essigsäure
0,5 M EDTA-Lösung
10 x TAE Puffer
11,42 ml
20 ml
50 x TAE-Puffer
242,0
57,1 ml
100 ml
auf < 1 Liter mit bidest Wasser auffüllen
•
pH auf 8,5 einstellen und dann auf 1 Liter mit bidest. auffüllen autoklavieren
0,5 M EDTA-Lösung (100 ml)
• 18,612 g EDTA einwiegen
• in < 100 bidest. lösen
• pH auf 8,0 einstellen und auf 100 ml auffüllen
1 x TAE Running Buffer (7 L), pH= 8,5
• 140 ml 50 x TAE Puffer mit 6,860 Liter bidest. mischen
10% APS-Solution (1 ml)
• 0,1 g Ammoniumpersulfate-APS
• in 1 ml bidest lösen, bei -20°C lagern
Dye Solution (10 ml
• 0,05 g Bromphenol Blau, Sigma
• 0,05 g Xylene Cyanole, Sigma
• in 10 ml 1 x TAE-Puffer lösen, bei RT lagern
20
0%, 40% und 70% Acrylamid Lösungen (100 ml)
Chemikalien
40% Acrylamide/Bis 37,5:1
50 x TAE-Puffer
Formamide,deionized
Urea,
Bidest. H2O
0%
18,8 ml
2,0 ml
------------auf 100 ml
40%
18,8 ml
2,0 ml
16 ml
16,8 g
auf 100 ml
70%
18,8 ml
2,0 ml
28 ml
29,4 g
auf 100 ml
Durchführung der PCR
Die Proben werden entweder direkt in die PCR eingesetzt oder die DNA wird aus den
Biofilmproben extrahiert (QIAamp® DNA MiniKit-50, Qiagen).
Mit Hilfe der PCR wird ein definierter Abschnitt eubakterieller 16S rDNA vervielfältigt. Die
Zugabe der Primerkombination GC27F / 517R ergibt 527bp- Fragmente.
PCR-Reaktionsansatz:
Gesamtvolumen: 100 µl
2,5 U of HotStar Taq-DNA polymerase (Qiagen, Germany)
30 pmol Primer
1 x PCR buffer
200 µM dNTP
5 und/oder10 µl Probe-DNA von den Biofilmsuspensionen.
Tempraturprogramm des Thermocyclers:
1.
95°C
PCR; Annealing bei 55°C:
15min
94°C
55°C
72°C
30 sec
30sec
1:00min
72°C
10:00min
35x
Durchführung der DGGE
Für die Primerkombination GC27F/517R wird ein denaturierender Gradient von 40 bis 70%
Harnstoff verwendet. Je nach Intensität des PCR-Produkts werden 5-15 µl DNA mit 2-3µl
Ladepuffer gemischt und in die Tasche des Gels eingefügt.
DGGE Gel gießen
¾ Glasplatten mit Isopropanol reinigen, 0,2mmSpacer zwischen kleine und große
Glasplatte legen, mit weißer Plastikkarte ausrichten und mit Schraubleisten fixieren
(Unterkanten müssen absolut plan sein, sonst Auslaufmodell!)„Sandwich“ in den
Gießstand stellen, Kammhöhe mit Filzstift markieren.
¾ Je 20 ml HDL (z.B. 70% Acrylamide-Lösung) und LDL (z.B. 40%Acrylamide-Lösung)
in zwei Bechergläser blasenfrei pipettieren
¾ HDL mit 300 µl Dye- solution (blauer Puffer) versetzen
¾ je 180 µl APS (10%) und 18 µl TEMED zu den HDL- und LDL- Lösungen zugeben
und blasenfrei mischen
¾ beide Spritzen mit jeweils 15ml HDL und LDL füllen
¾ HDL- Spritze hinten und LDL- Spritze vorne am Gradient Former festschrauben
¾ Schläuche an beiden Spritzen fest schrauben, Kanüle mittig am Glasplattensandwich
mit Klebeband befestigen und Lösungen über Bewegen des Mischrades einfüllen
¾ Trenn- Gel bis zur markierten Füllhöhe gießen, evtl. Luftblasen „rausklopfen“
21
¾
¾
¾
¾
¾
¾
überschüssiges Acrylamide in ein Becherglas, Schlauch und Spritzen mit Wasser
spülen
nach dem Gießen ca. 300µl Isopropanol aufs Gel geben (verhindert die
Austrocknung des Gels), mind. 30 min. auspolymerisieren lassen
Isopropanol dekantieren
mit dest. Wasser nachspülen und mit Kimwipes trocknen
Zugabe des Sammelgels ( pro Gel 5ml 0% Acrylamaid-Lösung mit 45µl APS und
4,5µl TEMED), Kamm einsetzen, polymerisieren lassen
mindestens 4h bis zum Lauf warten oder das Gel in feuchtes Papier (Filterpapier,
Zellstoff )und Folie einwickeln und über Nacht in den Kühlschrank stellen
Gel beladen:
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
vorheizen von 1x TAE-Running-Puffer (7 L) auf 56 °C im Elektrophorese- Tank
vor dem Beladen vorsichtig den Kamm ziehen
Gele in Halter („gascet“) einsetzen und in den Tank hängen
Taschen mit Puffer spülen
Taschen mit Hamiltonspritze beladen (Gesamtvolumen max.25µl)
Gesamte DGGE-Einheit in Isolierbox stellen
Pumpe anstellen und bei 70 Volt stellen und 16h (über Nacht) bei 56°C laufen lassen
Färben der Gele mit SYBR Gold
¾ Färbelösung: 300ml 1xTAE- Puffer ph 8,0 (Agarosegel- Elektrophoresepuffer) mit
30µl SYBR Gold in abgedunkelter Plastikflasche mischen
¾ Glasplatten lösen, Orientierung des Gels markieren (Ecke abtrennen)
¾ Gel in Färbeschale 10 min. mit Färbelösung abgedunkelt färben (Wanne auf
Schwenktisch bei geringer Bewegung )
¾ Gel mit Klarsichthülle aus der Färbelösung fischen und auf Acrylplatte gleiten lassen
¾ Auswertung im LumiImager, SYBR520nm einstellen, 2-3 sec. Belichten
¾ benutzte Färbelösung durch Faltenfilter mit Aktivkohle abfiltrieren, entsorgen
Identifizierung der Banden
¾ Gel mit Acrylplatte auf den UV- Tisch legen, max. 70%UV einstellen.
¾ Banden mit sauberen Skalpell ausschneiden, in steriles Reaktionsgefäß
transferieren und mit 20- 50 µl PCR-H2O bedecken, mindestens 4h kühl stellen. (DNA
diffundiert ins Wasser)
¾ Aus dem Überstand neue PCR mit GC-Primern ansetzen, PCR- Produkt auf
Agarosegel überprüfen, zweites DGGE- Gel starten
¾ Im Idealfall ist jetzt nur noch eine Bande pro Spur sichtbar, ansonsten die deutlichste
Bande ausschneiden und reamplifizieren.
¾ Diesen PCR- Ansatz quantitativ auf Agarosegel abschätzen (5µl auftragen, Foto)
¾ DNA- Gehalt im Gene-Quant messen und am ABI 310 sequenzieren.
2.10
Kultivierung von Bakterien
Für die mikrobiologischen Untersuchungen wurden jeweils 100 ml Grundwasser und Wasser
aus den Kammern des RBR Rotherst filtriert. Der Filter wurde je nach Nachweis auf einen
geeigneten Agar (Nährboden) überführt. Für Koloniezahl wurde jeweils 10ml, 1ml, 100µl und
10µl auf 100ml mit sterilem Wasser verdünnt und dann filtriert. Die verwendeten Filter
(Satorius, Whatmann) und Nährböden (Merck, Sifin) können der nachfolgenden Tabelle
entnommen werden. Ebenso sind die Bebrütungstemperaturen angegeben. Alle Filter
wurden nach 24 und 48h ausgewertet (Zählen der KBE = Kolonien-bildende Einheiten). Nicht
eindeutige Kolonien wurden gepickt, in jeweils 100 µL steriles Wasser überführt und für die
spätere Identifizierung mittels PCR, DGGE und Sequenzierung bei -20°C gelagert.
22
Tabelle 1: Angaben zum kulturellen Nachweis von Bakterien im Wasser:
Nachweis für
Agar
Filter / Porengröße
Temp.
Salmonella Selektiv
Cellulose-Mischester / 0,2µm
37°C
McConkey
Cellulose-Mischester / 0,2µm
37°C
Lactose-TCC
Cellulose-Nitrat / 0,45µm
36°C
Cetrimide
Cellulose-Mischester / 0,2µm
37°C
Slanetz-Bartley
Cellulose-Mischester / 0,45µm
37°C
Chromocult
Cellulose-Mischester / 0,45µm
37°C
McConkey
Cellulose-Mischester / 0,2µm
37°C
Salmonellen
Salmonella Selektiv
Cellulose-Mischester / 0,2µm
37°C
Clostridien
TSC
Cellulose-Nitrat / 0,2µm
37°C
Kolonienzahl
R2A
Cellulose-Mischester / 0,2µm
20°C
E. coli / Coliforme
Pseudomonaden
Enterokokken
2.11
Nachweis der Gesamtzellzahl und Anzahl aktiver Bakterien
Zum Nachweis der Gesamtzellzahl und der metabolischen Aktivität im Wasser wurde das
Wasser über einen Polycarbonatfilter (0,2 µm, 25 mm Durchmesser, Whatman) abfiltriert.
Der Filter wurde anschließend mit CTC-Lösung (5-Cyano-2,3-ditolylchlorid, Polyscience,
Inc.) überschichtet und für 4h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. CTC ist ein
Tetrazoliumsalz, das durch Dehydrogenaseaktivität der Bakterien zu einem
wasserunlöslichen, rot fluoreszierenden Formazan reduziert wird. Für die CTC-Lösung
wurden für jede Probenahme 20 mL einer 50 mM Stocklösung frisch angesetzt (303 g CTC
wurden in 20 mL sterilem dH2O gelöst).
Anschließend wurde der Filter mit 1 mL DAPI-Lösung (4',6-Diamidino-2-phenylindol,
Applichem) in der Konzentration 1 µg/mL überschichtet. DAPI ist ein Fluoreszenz-Farbstoff,
der in die doppelsträngige DNA interkaliert und bei Anregung mit ultraviolettem Licht im
sichtbaren Bereich mit blauer bis cyaner Farbe fluoresziert. Nach 5 min Inkubation im
Dunkeln wurde die DAPI-Lösung abfiltriert und der Filter auf einem Glasobjektträger mit
Klebestreifen fixiert. Für die Floureszenzmikroskopie wurde der Filter mit einem Tropfen
Citiflour (anti fading) benetzt, mit einem Deckglas versehen und am Mikroskop mit 1000facher Vergrößerung und entsprechenden Filtern ausgewertet. 10 Gesichtsfelder CTC und
DAPI wurden ausgezählt. Tabelle 5 gibt Informationen zu den Filtern und zur Auswertung.
23
Tabelle 2: Informationen zum Mikroskop und Auswertung für die DAPI-/ CTC-Versuche.
Filter im
Mikroskop
DAPI: Filter BP365/FT395/LP397 (blau)
Daten
Gezählter Ausschnitt: 0,0156 mm2 Æ gezählte Keime
CTC: Filter BP546/FT580/LP590 (rot)
Gesamter Filter (Filtrationsfläche): 300 mm2
Auswertung
300 mm2 / 0,0156 mm2 x Mittelwert der gezählten Keime
= Keime / g PCL
24
3
Ergebnisse
3.1
Kultivierung von Bakterien unter denitrifizierenden Bedingungen
Für den Denitrifikationsprozess im kleinen Maßstab wurde eine
Anlage eingerichtet, in
welcher Bakterien unter Zugabe von Nitrat, Mineralien, Spurenelementen und Ethanol als CQuelle das Nitrat vollständig zu Stickstoff verstoffwechselten. Dabei vermehrten sie sich und
bildeten auf Siporax®, einem keramischen Substrat, welches speziell für die Denitrifikation
im aquatischen Bereich eingesetzt wird, einen Biofilm. Das Gefäß faste 1 Liter Suspension,
welche durch eine Kreiselpumpe in Bewegung gehalten wurde. Beimpft wurde die Anlage
zuerst zu Testzwecken mit Bakterien aus Bodenkompartimenten, indem etwas Erde mit
Leitungswasser vermischt wurde und nach dem Absetzten der groben Partikel 3 mL davon in
30mL LB-Medium + 10mM KNO3 2 Tage bei 22°C inkubiert wurde. Um den Ansatz anaerob
zu halten wurde er mit Paraffin überschichtet. Ein Volumen von 1 mL dieser Lösung wurde in
den befüllten Reaktor gegeben. Nach 2 Tagen wurde der Nitratgehalt mit einem
kommerziellen Schnelltest überprüft.
Abbildung 3: Behälter mit Bakteriensuspension, Siporax-Füllung und Kreiselpumpe
3.2
Molekularbiologische Untersuchung des nitrathaltigen Grundwassers
Für die Analyse natürlicher Bakterienzusammensetzung wurde in Zusammenarbeit mit dem
Kooperationspartner DVGW-Technologiezentrum Wasser (TZW) nitrathaltiges Grundwasser
aus der Meßstelle F3 WSG Bruchsal entnommen. Die Nitratkonzentration dieses belasteten
Grundwassers betrug 50-70 mg/L.
Der Laborreaktor wurde mit 1 Liter Grundwasser befüllt. Die Sauerstoffkonzentration lag bei
13,5%. In den nächsten 3 Tagen änderten sich die Parameter nicht, daher wurden 100 mL
Mineralmedium 10x konzentriert, 10 mL Spurenelement Lösung 100x konzentriert und 10 mL
25
EtOH 99,8% als C-Quelle zugegeben (siehe Tabelle 3). Nach 4 Stunden konnte Nitrit
nachgewiesen werden. Nach 24 Stunden war eine deutlich Trübung zu sehen, der
Sauerstoffgehalt lag nur noch bei 2,7% und es konnten weder Nitrat noch Nitrit gemessen
werden. Dieser Vorgang wurde mehrfach wiederholt, indem jedes mal 10 mL Nitratlösung
10x konzentriert zugegeben wurde.
Tabelle 3: Zusammensetzung der verwendeten Lösungen zur Einstellung denitrifizierender
Bedingungen im Laborreaktor
Nitratlösung 10x
Mineralmedium 10x
Spurenelemente 100x
36 g/L KNO3
468 mg/L NaH2PO4 x 2H2O
30 mg/L FeCl2 x 4H2O
300 mg/L MgSO4
10 mg/L ZnSO4 x 7H2O
11 mg/L MnCl2 x 4H2O
6 mg/L H3BO3
2.25 mg/L Co(NO3)2 x 6H2O
0.4 mg/L CuSO4 x 6H2O
2.8 mg/L NiSO4 x 6H2O
50 mg/L Na2MoO4 x 2H2O
Für eine Populationsanalyse wurde dem Reaktor für die DNA-Extraktion eine Probe
entnommen. Parallel dazu wurden 10 Liter des Grundwassers über Polykarbonat-Filter
filtriert und die DNA aus den natürlicherweise vorhandenen Bakterien für eine
Populationsanalyse extrahiert. Um die DNA Menge für die molekularbiologischen
Untersuchungen zu erhöhen wurde eine enzymatische Vervielfältigung der
ganzen
bakteriellen Genoms der vorhandenen Bakterien durch Repli G-Mini-Kit (Qiagen, Hilden,
Deutschland) nach Vorschrift durchgeführt.
Aufgrund der Ergebnisse wurden weitere Experimente mit verschiedenen PCR-Bedingungen
durchgeführt, wie z.B. Touch-Down-PCR, Gradienten-PCR, Auffüllreaktion. Auf diese Weise
können Umweltproben auch unangereichert und ohne ein Hochamplifizieren der GesamtDNA mittels einer DGGE untersucht werden.
Da die PCR die Grundlage für die nachfolgenden molekularbiologischen Populationsanalyse
ist, wurde überprüft, ob die extrahierte DNA-Menge und –Qualität für die PCR ausreichend
ist. Mit einem Primerset für das ribosomale 16S Gen (27F/517R) konnte aus verschiedenen
Aufbereitungsansätzen das spezifische ca. 500 bp große Fragment vervielfätigt werden. In
Abbildung 4 sind die PCR-Produkte aus Nitrat belasteten Grundwasserproben nach
anaerober Anreicherung gezeigt.
26
500 bp
Abbildung 4: 1% Agarosegel nach Optimierung der PCR durch Zugabe von 6 % DMSO als
denaturierenden Zusatz
Die Ergebnisse der PCR-Analysen lassen wie folgt zusammenfassen:
•
Die Primer 27F/517R und das zugehörige PCR-Programm können verwendet
werden.
•
Eine PCR direkt aus Nitrat belasteten Grundwasserproben war aufgrund der geringen
Biomasse bzw. Inhibitoren der PCR nicht möglich. Durch eine vorgeschaltete
enzymatische Genomvervielfältigung konnte dieses Problem gelöst werden.
3.3
Populationsanalyse eines Nitrat belasteten Grundwassers
Für die molekularbiologische Populationsanalyse mittels Denaturierender Gradienten
Gelelektrophorese (DGGE) wurden PCR Produkte der verschiedene Proben untersucht
(amplifizierte Genome aus Bakterien des Grundwasser, DNA aus kultivierten Keimen des
Grundwassers (Referenzbakterien) und DNA aus Anreicherungskulturen des Grundwassers
unter denitrifizierenden Bedingungen). Abbildung 5 gibt einen Überblick über die
Vorgehensweise der molekularbiologische Populationsanalyse bestehend aus DNA
Extraktion, PCR, DGGE, Sequenzierung Datenbank-Vergleich.
27
DNA
PCR
Identifikation per Datenbank
DGGE
Sequenzierung
Abbildung 5: Prinzip der molekularbiologischen Populationsanalyse zur Charakterisierung
von Bakterien bzw. bakteriellen Gemeinschaften
amp.Genome Referenzbakterien Reaktor
Abbildung 6: DNA-Bandendiversitäten von Proben aus angereicherten Kulturen (Reaktor),
kultivierten Bakterien aus originalem Grundwasser und amplifizierten bakteriellen Genomen
aus dem originalen Grundwasser ohne Anreicherung.
Die Abbildung 6 zeigt das Polyacrylamidgel einer DGGE-Analyse mit den oben genannten
Proben. Folgende Ergebnisse lassen sich aus dieser DGGE Populationsanalyse ableiten:
™ Aus nitrathaltigem Grundwasser kultivierte Bakterien wurden in Reaktoren unter
denitrifizierenden Bedingungen wieder gefunden. Das bedeutet, dass das System für
die Identifikation denitrifizierende Bakterien geeignet ist.
28
™ Die Bandenmuster der Referenzbakterien und ihrer amplifizierten Genome
unterscheiden sich nur minimal, was bedeutet, dass die Güte der hochamplifiziertern
DNA für eine Populationsanalyse sehr gut ist. Somit können auch Umweltproben mit
geringer Biomasse untersucht werden.
Die dominanten DNA Banden konnte aus dem DGGE-Acrylamidgel ausgeschnitten und für
die Sequenzierung vorbereitete werden. Nach Sequenzierung wurden die ribosomalen
Sequenzen mit Datenbanken der NCBI zur taxonomischen Zuordnung der Bakterien
verglichen.
Im nitrathaltigen Grundwasser wurden Rhodobacter (Stickstofffixierung) und Cytophaga
gefunden. Ein Großteil der natürlich vorkommenden Bakterien war den Proteobakterien
zugeordnet, ohne eine genauere Identifizierung zu erreichen, d.h. es handelt sich um bisher
noch nicht bekannte Mikroorganismen.
Durch die Populationsanalyse des angereicherten Grundwassers konnten verschiedene
Bakterien wie z.B. auch Nitratreduzierer identifiziert werden. Zudem zeigt sich hier in der
DGGE die höchste Bandendiversität.
Die angezüchteten Bakterien aus dem Grundwasser bestanden aus Azospira, Acidovorax
(Nitratabbau), Aeromonas, Bacillus und Enterobacter.
3.4
Mikroskopische Untersuchungen der PCL Materialien
3.4.1 Untersuchungen mit dem Lichtmikroskop
Um einen ersten Eindruck von der Morphologie der Biofilme auf bewachsenem PCL zu
bekommen, wurde bewachsenes PHBCAPA 3070-1 aus Halle und bewachsenes CAPA 787
aus Stuttgart, sowie unbewachsenes PCL 6500 mit dem Mikrotom in dünne Scheiben
geschnitten und unter dem Lichtmikroskop angeschaut. Schon beim Schneiden fiel auf, dass
der Kunststoff zu klebrig und zu weich ist, um einen ausreichend dünnen Schnitt für das
Mikroskop herzustellen. Um den Bewuchs besser sichtbar zu machen, wurde das
bewachsene PCL mit 2 verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt: zum einen mit CTC
für die metabolische Aktivität und zum anderen mit DAPI, welche die Gesamt-DNA in
Bakterien färbt. Da PCL im entsprechenden UV-Bereich der verwendeten Fluorochrome eine
Eigenfluoreszenz zeigte, konnte der Biofilm mir dieser Methode nicht untersucht werden.
29
3.4.2 Untersuchungen mit dem ESEM
Um
die
Struktur
der
Aufwuchsträger
zu
untersuchen,
wurde
bewachsenes
und
unbewachsenes PCL mit dem ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope)
untersucht. Das ESEM hat den Vorteil, dass die Proben nicht im Hochvakuum vorliegen
müssen und die Biofilme dafür nicht extra vorbehandelt werden müssen.
Im linken Bild (untern) ist ein keramisches Material (Siporax) zu sehen, welches im
aquatischen Bereich als Aufwuchsträger für denitrifizierende Bakterien verwendet wird.
Rechts daneben ist dieses Material mit 50-facher Vergrößerung zu sehen. Es fallen die
zahlreichen großen Poren auf, welche die Oberfläche vergrößern und es zahlreichen
Bakterien ermöglichten, sich anzusiedeln.
Im linken Bild (unten) ist CAPA 6500 zu sehen, ein Material mit recht glatter Oberfläche. In
der Mitte ist dieses Material in 50-facher Vergrößerung zu sehen. Man kann hier die glatte
Oberfläche durchzogen von einzelnen Rissen sehen. Bakterien werden hier weniger dichte
Biofilme bilden können. Und tatsächlich zeigt sich im Experiment, dass sich Biofilme auf
diesem Material nur sehr langsam bildeten.
Im rechten Bild ist bewachsenes CAPA 787, ein von der Struktur her ähnliches Material, in
einer Vergrößerung von 50–fach zu sehen. Man kann Dellen erkennen, die durch den Abbau
der Bakterien oder aber durch Abrieb im Reaktor entstanden sein können.
Im linken Bild (unten) ist das Polymer PHBCAPA 3070-1 zu sehen. Dies ist ein relativ
poröses Material, was auch im Bild rechts daneben bei einer Vergrößerung von 50-fach
erkennbar ist. Es zeigten sich viele kleine Poren, die ähnlich dem keramischen Material den
30
Bakterien genug Oberfläche bieten können. Beobachtungen zeigten, dass sich Biofilme im
Vergleich zu CAPA 6500 auf diesem Material schneller bildeten.
3.5
Wachstum von Biofilmen auf den PCL-Aufwuchsmaterialien
Um das Wachstum von Biofilmen auf den verschiedenen Aufwuchsträgern zu untersuchen,
wurden PCL 6500, BC 30_70 ES (1), PCL1_8/2_6506SW und PHBCp1_8/1SW jeweils in
einem Laborreaktor mit einer Spurenelement- und Nitratlösung versetzt und mit bereits
bewachsenem
keramischen Material beimpft.
Nach mehrmonatiger
Inkubation mit
regelmäßigen Mediumwechsel und Nitratzugabe wurde die Denitrifikation beobachtet. Diese
konnte mit kommerziellen Teststäbchen nur grob bestimmt werden. Das Biofilmwachstum
wurde über die DNA-Menge bestimmt, die aus den Biofilmbakterien der Aufwuchsmaterialien
isoliert werden konnte. Je höher die DNA-Konzentration desto mehr Bakterien waren auf der
Oberfläche angesiedelt.
Zusätzlich wurden Proben des Rotobioreaktors in Rotherst und Proben der Reaktoren aus
Stuttgart untersucht. Die Ergebnisse gibt die nachfolgende Tabelle wieder.
Das poröse Material BC 30_70 ES (1) wie im Labormaßstab eine sehr gute
Denitrifikationsrate bei einer relativ geringen DNA-Menge auf, wohingegen die Probe aus
dem Rotobioreaktor Rotherst eine mäßige Denitrifikation bei einer erhöhten DNA-Menge hat.
Demzufolge korrlierte ein verstärktes Biofilmwachstum nicht unbedingt mit einer guten
Denitrifikationsleistung der vorliegenden Bakterien.
31
Tabelle 4: Biofilmwachstum auf PCL Materialien im Labormaßstab und in den Reaktoren der
Standorte Rotherst und Stuttgart
Bezeichnung
Alter der
DNA-Menge
Denitrifikation
Biofilme
PCL 6500
1 Jahr
1.8 μg/g
wenig
BC 30_70 ES (1)
1 Jahr
4 μg/g
Sehr gut
PCL1_8/2_6506SW
7 Monate
1,2 μg/g
kaum
PHBCp1_8/1SW
7 Monate
1,3 μg/g
kaum
RBR Rotherst
3-7 Monate
Kammer 1: 10 μg/g
mäßig
RBR Rotherst
5-9 Monate
Kammer 1: 13 μg/g
Kammer 2: 8 μg/g
mäßig
Kammer 1: 16 μg/g
RBR Stuttgart
unbekannt
Kammer 2: 13 μg/g
nicht getestet
Kammer 3: 8 μg/g
Zusätzlich zu den Biofilmuntersuchungen wurden bei einer Probennahme des RBR Rotherst
im November 08 und Januar 09 die Anzahl der Koloniebildenden Einheiten (KBE:
kultivierbare Bakterien) und der Anteil physiologisch aktiver Bakterien im Wasser der
Kammer bestimmt. Die Kultivierung erfolgte auf R2A-Agar und der Nachweis der
metabolischen Aktivität im Epifluoreszenz-Mikroskop. Dazu wurde die Gesamtzellzahl mittels
DAPI, einem DNA bindenden Fluorochrom, bestimmt. Die Anzahl der aktiven Bakterien
wurde mittels CTC Verfahren ausgezählt. Dieses Tetrazolium-Salz wird von aktiven
Bakterien aufgenommen und enzymatisch in ein rot fluoreszierenden Formazan-Molekül
umgesetzt. Der prozentuale Anteil aktiver Bakterien wird über die Gesamtzellzahl DAPI
gefärbter Bakterien ermittelt.
32
Tabelle 5: Nachweis kultivierbarer und metabolische aktiver Bakterien an verschiedenen
Probenahmestellen des RBR Rotherst.
Zeitpunkt der
Stelle
KBE
Anteil
physiologisch
aktiver Bakterien
Nov. 08
Kammer 3
108/100ml
10%
Jan. 09
Kammer 3
107/100ml
8%
Jan. 09
Kammer 2
8x106/100ml
6%
Jan. 09
Kammer 1
8x106/100ml
6%
Jan. 09
Grundwasser
102/100ml
nicht nachweisbar
Probennahme
Es wurde deutlich, dass das Kammerwasser eine um mehrere Log-Stufen höhere
Bakterienanzahl aufwies als das entsprechende Grundwasser, mit dem die Kammern
befüllte wurde. Ebenso waren 6-10% der Bakterien physiologisch aktiv, wobei davon
auszugehen ist, dass der prozentuale Anteil aufgrund der Nachweisgrenze des CTCVerfahrens deutlich höher liegt. Im Grundwasser selbst lag die enzymatische Aktivität
offensichtlich unterhalb der Nachweisgrenze.
Diese Ergebnisse zeigten, dass es zu einer signifikanten Anreicherung von Bakterien im
Reaktorprozess kam. Eine unerwünschte Anreicherung von hygienisch relevanten Bakterien
sollte dabei vermieden werden, um in nachfolgenden Aufbereitungs- und Verteilungssytemen
Kontamination zu vermeiden.
Um ein mögliches Kontaminationpotential mit hygienisch relevanten Keimen abzuschätzen,
wurde
das
Kammerwasser
mit
spezifischen
mikrobiologischen
standardisierten
Anreicherungsverfahren für insgesamt 8 trinkwassergängige Pathogene untersucht. In keiner
Wasserprobe wurden die in Tabelle 7 aufgelisteten Mikroorganismen nachgewiesen,
lediglich auf PCL-Material konnte mittels molekularbiologischem PCR-Ansatz ein Signal für
Enterokokken und Pseudomonas aeruginosa nachgewiesen werden.
33
Tabelle 7: Nachweis hygienisch relevanter Bakterien im Reaktor Rotherst
Mikrooganismen
Mikrobiologischer PCR-Nachweis
Nachweis
Escherischia coli
negativ
n.n.
Coliforme Bakterien negativ
n.n.
Enterokokken
negativ
nur auf PCL
P. aeruginosa
negativ
nur auf PCL
Campylobacter
negativ
n.n.
Shigellen
negativ
n.n.
Salmonellen
negativ
n.n.
Clostridien
negativ
n.n.
n.n.: nicht nachgewiesen
3.6
Populationsanalysen der Biofilme aus den verschiedenen Reaktoren aus
Stuttgart, Rotherst sowie der Laborreaktoren Karlsruhe
Identifizierte
Bakterien
der
Biofilme
und
des
umgebenden
Wassers
in
den
Versuchsreaktoren der ISWA Stuttgart, des Rotobioreaktors Rotherst und in den
Laborreaktoren im IFG wurde in der nachfolgenden Tabelle 8 zusammengestellt. Grundlage
dieser Ergebnisse sind Untersuchungen mittels DGGE und Sequenzierung von DNA-Banden
aus den DGGE Auftrennungen der PCR-Produkte.
Es wurden verschiedene Denitrifikanten, aber auch Eisen- und Manganreduzierer aus der
Gruppe der Proteobakterien gefunden. Auffallend ist, dass in allen Reaktoren mit PCL als
Kohlenstoffquelle die β-Proteobakterien überwogen. Außerdem trat die Gattung Acidovorax
gehäuft auf. Viele der sequenzierten DNA-Banden aus der DGGE von Biofilmproben konnten
im Datenbank-Vergleich nicht eindeutig zugeordnet werden, da es sich um bisher
unbekannte Bakterienspezies handelte. Diese werden in nachfolgenden Tabellen als
„Uncultured“ bezeichnet. Eindeutig Bakterienspezies zuordenbare Sequenzdaten sind
nachfolgend aufgelistet.
Diese Ergebnisse waren für die Auswahl der Testorganismen ausschlaggebend, mit welchen
molekularbiologisch auf Denitrifikationsleistung untersucht wurde.
34
Tabelle 8: Auflistung und Zuordnung der identifizierten Bakterien aus Biofilmen der
Reaktoren
Laborreaktor
Acidovorax temperans
Karlsruhe (ohne
PCL mit Ethanol)
β-Proteobacteria
Dentrifikanten
Acidovorax sp.
Acidovorax sp.
Aquaspirillum sp.
Zoogloea sp.
Denitrifikanten
Oxalobaceriaceae
RBR Stuttgart
β-Proteobacteria
Dechloromonas sp.
CAPA 787
Leptothrix sp.
Mangan-
und
Eisen-
Oxidierer
Ferribacterium limneticum Eisen(III)-Reduzierer
Uncultured bacteria
Reaktor Karlsruhe
CAPA 6500
Klebsiella sp.
Enterobakterium
Acidovorax sp.
Denitrifikanten
γ-Proteobacteria
β-Proteobacteria
Uncultured bacteria
Pseudoxanthomonas sp.
γ-Proteobacteria
Nitratreduzierer
Acidovorax delafieldii
Acidovorax sp.
Denitrifikanten
Aquaspirillum sp.
RBR Achern
Hydrogenophaga sp.
Leptothrix sp.
β-Proteobacteria
H2-Oxidierer
Mangan-
und
Eisen-
Oxidierer
Uncultured bacteria
Uncultured bacteria
γ-Proteobacteria
35
Nach diesem Überblick über die biologische Zusammensetzung war nun eine genauere
Analyse notwendig. Vor allem sollte untersucht werden, wie sich die Population im Biofilm
einer Reaktorkammer zur Population des Wassers der Kammer verhält und ob es
Unterschiede zwischen den Kammern gibt.
Dazu wurden Proben aus dem Rotobioreaktor Rotherst, dem Rotobioreaktor Stuttgart und
dem Dynasandreaktor Stuttgart untersucht. Es wurde jeweils das PCL, sowie das Wasser
der einzelnen Kammern beprobt.
Die Ergebnisse sind in den folgenden beiden Tabellen dargestellt:
Rotobioreaktor Rotherst
Es fiel auf, dass im Reaktor Rotherst in allen Kammern wiederum die β-Proteobakterien auf
PCL Material überwogen. Es gibt jedoch Unterschiede in der bakteriellen Zusammensetzung
zwischen PCL und Wasser der jeweiligen Kammern. Die α-Proteobakterien kamen
überwiegend im Wasser vor, während einige der β-Proteobakterien nur auf PCL anwuchsen.
Dies deutete auf eine selektive Ansiedelung von Bakterienspezies auf dem PCL-Material im
Reaktor hin.
Tabelle 9: Untersuchungen der jeweiligen Kammern des Rotobioreaktors Rotherst
PCL
Uncultured 1
Uncultured 2
Burkholderiales
Comamonadaceae 1
Comamonadaceae 2
Comamonadaceae 3
β-Proteo Comamonadaceae 4
Comamonadaceae 5
Aquaspirillum sp. 1
Aquaspirillum sp. 2
Uncultured
ε-Proteo Uncultured
α-Proteo
Wasser
K1 K2 K1 K2 K3
+
+
+ +++ +++
++ +
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++ ++ ++ ++ ++
+
+
+
++
+++ ++ ++
Die Kürzel K1 bis K3 bezeichnen die einzelnen Kammern des Reaktors. Die Anzahl der „+“
gibt die Bandenstärke im Bild der jeweiligen DGGE (nicht gezeigt) wieder. Die Bandenstärke
steht in Abhängigkeit von der Häufigkeit des Bakteriums in der untersuchten Probe und kann
so als indirekter Indikator für die Menge des Bakteriums im untersuchten Medium gewertet
werden.
36
Populationsanalyse des Rotobioreaktors und Dynasandreaktors Stuttgart
Auch hier überwogen wiederum die β-Proteobakterien. Allerdings zeigten sich hier keine so
deutlichen Unterschiede in der Population wie im Vergleich von Biofilm- und Wasseranalysen
des Reaktor Rotherst. Die einzelnen Kammern unterschieden sich nur gering voneinander
und auch zwischen PCL und Wasser war kein deutlicher Unterschied erkennbar.
Tabelle 10: Untersuchungen der jeweiligen Kammern und Reaktoren der ISWA Stuttgart. Die
Kürzel K1 bis K3 bezeichnen die einzelnen Kammern des Reaktors, die Abkürzung Dyna
steht für den Dynasandreaktor.
βProteo
γProteo
δProteo
εProteo
Acidovorax sp. 1
Acidovorax sp. 2
Uncultured 1
Uncultured 2
Uncultured 3
Uncultured 4
Uncultured 5
Uncultured 6
Uncultured 7
Uncultured 8
Uncultured
Xanthomonas sp.
Pseudomonas sp.
Uncultured
Uncultured
PCL
K1 K2
K3
++
++
+
+
+
+
+++ +++ +++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+++ +++ +++
+++ +++ +++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
++
++
Dyna K1
+++
+
++
++
+++ +++
++
+
++
++
++
+
+++
++
+++
++
+
+
+
+
+
+
+
++
++
++
Wasser
K2
Dyna
+
+++
++
++
+++ +++
+
+
++
++
+
+
++
+++
++
+++
+
+
+
+
+
+
++
+
++
++
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
37
Populationdynamiken in Biofilmen auf PCL Materialien des Stuttgarter Rotobioreaktors und Dyna-Sand Reaktors
K2 K1 D K3 K2 K1 D K3 K2 K1 D K3 K2 K1
6.3.-18.3.
1
2
K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2 K3
27.3.-21.4.
K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2 K3
30.4.-28.5.
K1 K2 K3 K1 K2 K3
4.6.-12.6.
Abbildung 7: PCR-DGGE Analysen der Biofilme auf PCL des Rotobioreaktors Stuttgart in mehrmonatiger wöchentlicher Beprobung. K1-K3
bezeichnet die Kammern des Reaktors; D steht für den Stutgarter Dynasandreaktor. Die Zahlen in der Abbildung zeigen die DNA-Banden, die
sequenziert wurden: (1) β-Proteobacteria, (2) Acidovorax spp. (Denitrifikant) (3) Pseudomonas spp. (Denitrifikant), (4) Cytophaga spp
(Polymerdegradierer). Zwischen den DGGE-Spuren der jeweiligen Beprobungszeiten sind DNA-Markerspuren aufgetragen.
D K3 K2 K1 D K3
25.2.-6.3.
3
4
damit eine hohe taxonomische Stabilität der Biofilme.
38
dem Dynasandreaktor (in Abbildung mit „D“ gekennzeichnet). Auch hier zeigten sich keine Unterschiede in der Biofilmzusammensetzung und
PCL-Material, was eine Voraussetzung für eine stabile Denitrifikationsleistung ist. Verglichen wurde auch die Populationen des Rotobioreaktor mit
Kammern der Rotobioreaktors zu den jeweiligen Probenahmen vergleichbar. Diese Ergebnisse belegten die Stabilität der Populationen auf dem
hinweist, da jede Bande für eine Bakterienspezies charakteristisch ist. Von geringen Abweichungen abgesehen waren die Bandenmuster der drei
sind in Abbildung 7 dargestellt. Es war deutlich zu sehen, dass die Vielfalt der DNA-Banden auf eine heterogene Biofilmzusammensetzung
DNA aus den vorliegenden Biofilmen extrahiert und Populationsanalysen mittels PCR-DGGE durchgeführt. Die Bilder aus den Elektrophoresen
Am Rotobioreaktor, der aus drei Kammern aufgebaut war, wurden wöchentlich über einen mehrmonatigen Zeitraum PCL Material entnommen, die
3.7
Um die Populationen der Biofilme des Dynasandreaktors besser miteinander vergleichen zu
können, sind die DGGE Bandenmuster von Biofilmen einer mehrwöchigen Zeitreihe in
Abbildung 8 nebeneinander gezeigt. Es zeigte wie schon beim Rotobioreaktor eine hohe
Stabilität in der Biofilmzusammensetzung bei gleich bleibender Diversität im DNA
Bandenmuster.
Dyna: 27.3.-5.8.
Abbildung 8: Mehrwöchige Biofilmuntersuchungen des Dynasandreaktors
Untersuchungen zum DNA-Gehalt der Biofilme als Indikator für Biomasse auf PCL-Material
zeigten, dass zu Beginn der Messungen der DNA-Gehalt in einen Bereich von 20 bis 55 µg/g
PCL unabhängig vom Reaktortyp oder der untersuchten Kammer des Rotobioreaktors. Am
Ende der mehrmonatigen Versuchsreihe zeigte sich eine Zunahme der DNA-Mengen aus
Biofilmen auf eine Konzentration von 60 bis 90 µg/g PCL. Ausgehend vom DNA-Gehalt einer
Bakterienzelle war es möglich, über den Biofilm DNA-Gehalt auf die Bakterienzahl
umzurechnen. Durchschnittlich waren ein Gramm der PCL-Materialien mit 1.2–2.0x1010
Bakterien bewachsen.
In Abbildung 9 sind die DNA Konzentrationen über die Zeit für die jeweiligen Probestellen
aufgeführt. Die regelmäßig auftretenden Schwankungen bei den DNA-Konzentrationen
konnten mit keinem anderen Prozessparameter korreliert werden. Abbildung 10 zeigt die
Regressionsgeraden der DNA-Konzentrationen, die aus den jeweiligen Biofilmen extrahiert
werden konnte. Während die Geraden der Kammern 1 und 2 des Rotobioreaktors sowie des
Dynasandreaktors fast deckungsgleich waren, was auf eine ähnlich hohe Besiedlungsdichte
hinweist, verläuft die Regressionsgerade der Messwerte aus Kammer 3 des Rotobioreaktors
deutlich unterhalb der Messwerte der anderen Probestellen. In Kammer 3 wurde demzufolge
eine geringere Biofilmansiedlung nachgewiesen.
39
DNA µg/g PCL
100,0
90,0
DNA [µg/gPCL]
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
8.
4.
09
15
.4
.0
9
22
.4
.0
9
29
.4
.0
9
6.
5.
09
13
.5
.0
9
20
.5
.0
9
27
.5
.0
9
3.
6.
09
10
.6
.0
9
25
.2
.0
9
4.
3.
09
11
.3
.0
9
18
.3
.0
9
25
.3
.0
9
1.
4.
09
0,0
Zeitpunkt der Probennahme
K1
K2
K3
Dyna
Abbildung 9: DNA-Konzentration aus Biofilme des PCL Materialien der Kammern des
Rotobioreaktors (K1-3) und Dynasandreaktors (Dyna).
DNA µg/g PCL
100,0
90,0
DNA [µg/gPCL]
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
3.
6.
09
10
.6
.0
9
6.
5.
09
13
.5
.0
9
20
.5
.0
9
27
.5
.0
9
8.
4.
09
15
.4
.0
9
22
.4
.0
9
29
.4
.0
9
25
.2
.0
9
4.
3.
09
11
.3
.0
9
18
.3
.0
9
25
.3
.0
9
1.
4.
09
0,0
Zeitpunkt der Probennahme
K3
K2
Dyna
K1
Abbildung 10: Regressionsgeraden der DNA-Konzentrationen aus den Biofilmen der beiden
Reaktoren
40
3.8
Kultivierung und Identifizierung von Biofilmbakterien des Rotobioreaktors und
des Dynasandreaktors in Stuttgart
Reaktorwasser und suspendierte Biofilme von PCL des Dynasandreaktors und der 3
Kammern
des
Rotobioreaktors
wurden
auf
verschiedenen
Nährmedien
auf
Bakterienwachstum getestet. Die erhaltenen Bakterienkolonien wurden in Reinkultur
gebracht. Diese Reinkulturen wurden durch Sequenzierung der ribosomalen DNA
taxonomisch charakterisiert und zusätzlich wurde deren Denitrifikationspotential im bereits
beschriebenen Laboransatz getestet. In Tabelle 11 sind die Ergebnisse zusammengefasst.
Auch nach Kultivierung der Bakterien zeigten sich die γ-Proteobakterien als dominante
Bakteriengruppe.
Unter den anliegenden Kulturbedingungen im Laborreaktor zeigten sich isolierten
Bakterienspezies
zur
Denitrifikation
befähigt,
wobei
bei
Brevundimonas
sp.
und
Stenotrophomonas sp. Nitrit im Medium akkumulierte. Die vollständige Denitrifikation mit
einen Nährmedium, das 72 mg/L NaNO3 enthielt, war innerhalb von 1-4 Tagen
abgeschlossen.
Tabelle 11: Identifizierung von kultivierten Bakterien aus Stuttgarter Reaktoren und deren
Denitrifikationsverhalten
Denitrifikation
pH Medium nach
Denitrifikation
Brevundimonas sp.
Nitritbildner
neutral
Cupriavidus sp.
vollständig
basisch
Azospira sp. 1
vollständig
basisch
Azospira sp. 2
vollständig
basisch
Enterobacteriaceae
vollständig
basisch
Stenotrophomonas sp.
Nitritbildner
basisch
Acinetobacter sp.
Nitritbildner
basisch
Aeromonas sp.
vollständig
basisch
Pseudomonas trivialis
vollständig
basisch
Pseudomonas sp. 1
vollständig
basisch
Pseudomonas sp. 2
vollständig
neutral
Pseudomonas sp. 3
vollständig
sauer
Pseudomonas sp. 4
vollständig
neutral
Pseudomonas sp. 5
vollständig
sauer
Klasse
α-Proteo
β-Proteo
γ-Proteo
41
3.9
Nachweis von Pilzen auf PCL der Stuttgarter Reaktoren
Bei mikroskopischen Untersuchungen der bewachsenen PCL Materialien aus den Reaktoren
wurden Hyphen-ähnliche Strukturen gesehen, die auf ein mögliches Vorhandensein von
Pilzen hindeutete. Von daher wurde Biomasse von den PCL Materialien genommen und auf
spezielle Nährböden für Pilze ausgebracht. Es wurden wiederum Reinkulturen der
Mikroorganismen angelegt, Fragmente der ribosomalen DNA mit pilzspezifischen Primern
amplifiziert und zur taxonomischen Zuordnung sequenziert.
Es konnten Hefen, Schlauchpilze und Schimmelpilze spezifisch identifiziert werden (Tabelle
12). Alle diese Organismen wurden im Laboransatz auf Denitrifikation getestet. Auch hier
wurde dem Nährmedium wieder 72 mg/L NaNO3 zugesetzt. Nach 2-5 Tagen war eine
teilweise vollständige Denitrifikation bzw. Nitritakkumulartion erreicht. Auffallend war die
deutliche Ansäuerung des Medium im Laufe der Denitrifikation. Dies war bei Experimenten
mit Bakterien nur teilweise beobachtet wurden (siehe Tabelle 11)
Aus diesen Ergebnissen lies sich erkennen, dass für die Denitrifikation in den Reaktoren
nicht nur Bakterien in Biofilmen verantwortlich sind, sondern auch Pilze eine maßgebliche
Rolle spielen. Deren Anteil am Nitrat-Abbau ist zum jetzigen Zeitpunkt nur schwer
abschätzbar.
Tabelle 12: Identifizierung von kultivierten Pilzen aus Stuttgarter Reaktoren und deren
Denitrifikationsverhalten.
Denitrifikation
pH Medium nach
Denitrifikation
Trichosporon sp.
Nitritbildner
sauer
Rhodotorula mucilaginosa
Nitritbildner
neutral
nein
sauer
Hypocreales
vollständig
sauer
Penicillium sp. 1
vollständig
sauer
Penicillium sp. 2
vollständig
sauer
Penicillium sp. 3
vollständig
neutral
Penicillium sp. 4
Nitritbildner
sauer
Penicillium sp. 5
Nitritbildner
sauer
Klasse
Hefen
Schlauchpilze
Schimmelpilze
Metarhizium anisopliae
42
3.10
Populationsanalysen von PHB-Compounds aus einem heterogenen Reaktor für
Abwasser der Universität Halle-Wittenberg
Für den Kooperationspartner der Universität Halle-Wittenberg wurden molekularbiologische
und
mikrobiologische
Untersuchungen
von
gewachsenen
Biofilmen
und
isolierten
Bakterienkulturen zur Charakterisierung der Zusammensetzungen der Biofilme auf PHBCompounds durchgeführt.
Im Unterschied zu den PCL-Materialien der Reaktoren in Stuttgart und Rotbioreaktors in
Rotherst wurde der Reaktor in Halle nicht Bakterien aus Nitrat-belastetem Grundwasser bzw.
Trinkwasser beimpft, sondern mit einem Abwasser. Dies hat zur Folge, dass das
Bakterienspektrum, das die primäre Besiedlung der PHB-Compounds iniitiert, sich
grundsätzlich von dem Bakterienspektrum der Reaktoren in Stuttgart und Rotherst
unterschieden hat. Ein direkter Vergleich der Populationen ist daher nicht sinnvoll.
Aus den bewachsenen PHB-Componds der Universität Halle-Wittenberg wurde nach
etabliertem Protokoll DNA aus Biofilmen isoliert und die Produkte aus der PCR im DGGEVerfahren aufgetrennt. In Abbildung 11 sind die DGGE-Bandenmuster der Biofilme gezeigt.
De Auswertung ergab, dass sich die Bandenmuster und damit die Zusammensetzung der
Biofilme mit Bakterien deutlich unterschiedlich zu den Biofilmen der Reaktoren aus Stuttgart
und Rotherst waren. Sie zeigten eine deutlich erhöhte Bandendiversität in den Biofilmproben,
d.h. es waren wesentlich mehr Bakterienspezies in diesen Biofilmen vorhanden. Diese
Ergebnisse kann einerseits auf die bereits erwähnte Beimpfung des Reaktors mit Abwasser
zurückgeführt werden, da Abwasser im Vergleich zu Grund- oder Trinkwasser eine höhere
Bakterienzahl und -diversität aufweist. Andererseits ist ein Poly-Hydroxybuttersäure (PHB)Polymer leichter von Bakterien zu verwerten, als Poly-Caprolakton (PCL). Damit ist mit
einem deutlich erhöhten Biofilmwachstum zu rechnen.
Abbildung 11: PCR-DGGE Populationsanalysen von Biofilmen auf PHB-Compounds.
43
Dominante DNA-Banden wurden aus diesen Gelen ausgeschnitten, die DNA nach
Vervielfältigung der 16S ribosomalen DNA Abschnitte sequenziert und die erhaltenen
Sequenzen mit ribosomalen Datenbanken verglichen. Es konnten folgende Bakterienspezies
identifiziert werden: Acidovorax sp., Leptothrix sp., Simplicispira sp., Caulobacter sp.
Oxalobacteriaceae, sowie Acidovorax delafieldii. Auch in diesen Biofilmen waren unter
denitrifizierenden Bedingungen Acidovorax-Spezies vermehrt nachgewiesen worden, die
zum Nitrat-Abbau befähigt sind.
3.11
Identifizierung von kultivierten Bakterien aus Biofilme von Gelatine Compounds
aus der Universität Halle-Wittenberg
Als Reinkultur angereicherte Bakterienisolate wurden uns vom Projektpartner Universität
Halle-Wittenberg für molekularbiologische Untersuchungen zur Identifizierung zur Verfügung
gestellt. Nach DNA-Extraktion und PCR-DGGE sollten im Acrylamidgel für jedes
Bakterienisolat idealerweise nur eine DNA-Bande sichtbar sein. Bei einigen Bakterienproben
waren jedoch Mehrfachbanden in einer Spur sichtbar (Abbildung 12), was auf eine
Verunreinigung mit Fremdbakterien hinwies. Einzel-DNA-Banden wurde zur Sequenzierung
vorbereitet und die Sequenzdaten erneut mit Datenbanken verglichen. Folgende
Bakterienspezies konnten identifiziert werden: Micrococcus luteus, Arthrobacter sp.,
Flavobacterium
sp.,
Pedobacter
sp.,
Acidovorax
sp.,
Lysinibacillus
fusiformis,
Sphingobacterium multivorum, Bacillus cereus, Bacillus sp., sowie Comamonas
testosteroni.
Abbildung 12: PCR-DGGE Bandenmuster kultivierter Bakterien in Reinkultur von GelatineCompounds der Universität Halle Wittenberg.
44
3.12
Expression von funktionellen Genen der Denitrifikation in Referenzbakterien
und Biofilmen
Die Denitrifikation kann als eine Art anoxische oder reduziert oxische Respiration bei
Mikroorganismen verstanden werden. Elektronen aus organischem Material, reduzierten
Schwefelverbindungen,
molekularem
Wasserstoff,
etc.
werden
auf
oxidierte
Stickstoffverbindungen anstelle von Sauerstoff transferiert, um letztlich ATP zu regenerieren.
Bei diesen enzymatischen Prozessen, die nachfolgend dargestellt sind, sind die
Nitratreduktase,
die
Nitritreduktase,
die
Nitritoxireduktase
und
schließlich
die
Lachgasreduktase beteiligt. Di-Stickstoff ist das Endprodukt der Denitrifikation.
Die Denitrifikation kann auch unter aeroben Bedingungen funktionieren, wobei die aerobe
Denitrifikationsleistungen von den Sauerstoffkonzentrationen und von den vorherrschenden
Mikroorganismen abhängt. Die aerobe Denitrifikation ist weniger abhängig von der
Sauerstoffsensitivität der beteiligten Enzyme, als vielmehr von der Regulation von
Sauerstoff- oder Redox-erkennenden Faktoren, die auf Transkriptionsebene (RNA)
regulierend eingreifen. Aus diesem Grunde wurde in dem Forschungsvorhaben die
Transkriptionsaktivität von ausgewählten Genen der Denitrifikation mit molekularbiologischen
untersucht, die im nachfolgenden Überblick rot markiert sind. Diese Genaktivitäten konnten
bei Biofilmen und Referenzbakterien auf Transkriptionsebene (mRNA) untersucht werden.
Grundlage für diese Genexpressionsstudien war die Auswahl bzw. das Design von
Oligonukleotiden, sogenannte Primer, die in einer PCR die Gen-spezifische mRNA bzw.
deren revers transkribierten cDNA quantifizieren können.
NO3-
1
NO2-
2
NO
3
N2O
4
N2
1: Nitratreduktase: Nar, Nap, Nas
2: Nitritreduktase: NirK, NirS
3: Nitritoxidreduktase: Nor (keine einheitlichen Enzyme)
4: Lachgasreduktase: Nos
45
Nitratreduktasen
Nitratreduktasen sind Oxidoreduktasen, die die Reduktion von Nitrat zu Nitrit katalysieren.
Nitratreduktasen spielen eine wichtige Rolle bei der Stickstoffassimilation (assimilatorische
Nitratreduktasen) in Pflanzen und der Nitrat-Atmung (dissimilatorische Nitratreduktasen) in
Bakterien (Denitrifikation) (Flanagan et al., 1999; Henry et al. 2006; Kandeler et al., 2006).
Hinweise auf molybdän-unabhängige
und molybdäninhibierte
Nitratreduktase
NO2-
Nas, assimilatorisch,
N2-Fixierung,
NO3-
Nar, respiratorisch,
ATP-Synthese
NO2Hemmung durch O2
Nap, dissimilatorisch,
Redox-Gleichgewicht,
keine Hemmung durch O2
NO2-
Der gezeigte Überblick über das Spektrum der bekannten Formen der Nitratreduktasen
macht deutlich, dass es schwierig ist, für Mischpopulationen wie sie in natürlichen Biofilmen
vorliegen, ein Spezies-übergreifendes molekularbiologisches Nachweissystem zu etablieren.
Erschwert wird die Situation durch die Tatsache, dass für viele Bakterien DNA-Sequenzen
der Gene für die Nitratreduktasen nicht bekannt sind oder diese so stark in ihrer
Basenabfolge variieren und damit das Primerdesign für die Genexpressionsanalysen nur
bedingt möglich ist.
Nitritreduktasen
Nitritreduktasen sind Enzyme und gehören zu den Oxidoreduktasen. Sie spielen eine
wichtige Rolle in der der Nitratatmung in Bakterien. Nitritreduktasen katalysieren die
Reduktion von Nitrit (NO2−).
NO
Cu-Typ NirK
Cd1-Typ NirS
NO2-
NO
46
Auch bei den Nitritreduktasen sind verschiedene Klassen bekannt, deren Aktivität von
Metallionen (Cu oder Cd) abhängig ist. Es ist bekannt, das jeweils nur eine Enzymklasse in
einer Bakterienspezies vorkommt und Anzahl bzw. Organisation der Gene in verschiedenen
Spezies variieren kann (Braker et al., 1998, 2000; Kandeler et al., 2006; Henry et al., 2005) .
Demzufolge ist eine Vielzahl der in der Literatur beschriebenen Primersequenzen für
molekularbiologische Nachweisverfahren speziesbezogen und auf Mischpopulationen nicht
anwendbar.
3.12.1 PCR Primer für Gene für die Denitrifikation und Primerdesign
Aus der oben genannten Problematik wurden Primersequenzen neu berechnet, welche die
Nitratreduktasen Nar und Nap, sowie die Nitritreduktasen NirS und NirK als Zielregion im
bakteriellen Genom haben. Eine Reihe von bisher veröffentlichten Primerkombinationen, die
in der Tabelle 13 aufgelistet wurde, war in ihrer Anwendung für Bakterienpopulationen aus
Trinkwassermatrizes unbrauchbar. Entweder konnte kein PCR-Produkt generiert werden,
oder das PCR-Produkt hatte eine falsche Größe und wurde somit als falschpositives
Ergebnis gewertet.
Berechnung neuer Primer zur Detektion von Genen der Denitrifikation
Die berechneten Primer für die PCR sind degeneriert, d.h. es handelt sich um ein Gemisch
von Oligonukleotiden, die prinzipiell die gleiche Sequenz, an einigen (degenerierten)
Positionen jedoch verschiedene Basen haben. Sie binden am gleichen Abschnitt des
Genoms, auch wenn dieser Unterschiede an einzelnen Basenpositionen aufweist.
Wieder wurde das Gen für die Nitratreduktase Nar als Zielregion für die PCR gewählt. Es
wurden die Proteinsequenzen der Nitratreduktase von 8 verschiedenen Bakterienspezies
(Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus cereus,
Acidovorax sp., Streptomyces coelicolor, Brucella oris, Paracoccus denitrificans) mit dem
Software-Programm ClustalW verglichen. Die Ausgabe dieses Programms wurde mit
BlockMaker ausgehend von der Aminosäuresequenz in eine DNA-Sequenz umgewandelt
und mit Codehop-Programm weiterbearbeitet. Aus der Ausgabe von Codehop konnten 2
degenerierte zusammenpassende Primer für das Nitratreduktasegen narG herausgesucht
werden:
NarG1f:
5’-CCACCCATGGCGTNAAYTGYAC-3’
NarG1r:
5’-GCAGATCGCAATACCARTCRTARAA-3’
47
Diese Primer bildeten in der PCR mit Pseudomonas aeruginosa und mit einer
Mischpopulation der Biofilme ein spezifisches 500 bp großes Produkt, d.h. die Primer
konnten für eine Expressionsanalyse der NarG-Gens eingesetzt werden.
Dieses Primerdesign-Verfahren wurde auch für die Nitritreduktase NapA eingesetzt. Es
wurden
die
Proteinsequenzen
Bakterienspezies
(Roseobacter
der
Nitratreduktase
denitrificans,
NapA
Pseudomonas
von
7
verschiedenen
stutzeri,
Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Acidovorax caenii, Paracoccus denitrificans, Enterobacter sp.)
eingesetzt.
NapA1f
5´-TTCTTCGGGACCACCAAYHTNGAYMC-3´
NapA1r
5´-GGGCGAAGGTGCCTACYTCNCKNSC-3´
Leider zeigte sich nur bei dem Referenzbakterium ein positiv Ergebnis. Bei den Natürlichen
Biofiolmen konnte kein PCR Produkt für DNA bzw. cDNA nachgewiesen werden.
48
Tabelle 13: Liste aller getesteten Primerkombination zum Nachweis von Genen der
Denitrifikation bzw. deren Aktivitäten in Referenzbakterien und Mischpopulation. Erfolgreich
getestet und verwendete Primer sind grau unterlegt.
Name
Sequenz
Quelle
NarG 2650
TTYTCRTACCABGTBGC
Philipot et al.
NarG 1960f
TAYGTSGGSCARGARAA
(2002)
NarG1f
CCACCCATGGCGTNAAYTGYAC
NarG1r
GCAGATCGCAATACCARTCRTARAA
NosZ-F
CGYTGTTCMTCGACA GCCAG
Throbäck et al.
NosZ1622R
CGCRASGGCAASAAGGTSCG
(2004)
NosZ1F
WCSYTGTTCMTCGACAGCCAG
NosZ1R
ATGTCGATCARCTGVKCRTTYTC
NosZ2F
CGCRACGGCAASAAGGTSMSSGT
NosZ2R
CAKRTGCAKSGCRTGGCAGAA
napA V67 F
TAYTTYYTNHSNAARATHATGTAYGG
napA V67 R
DATNGGRTGCATYTCNGCCATRTT
NapA1f
TTCTTCGGGACCACCAAYHTNGAYMC
NapA1r
GGGCGAAGGTGCCTACYTCNCKNSC
PAE NapA2r
GGATGTTGTAGATCAGGTTG
PAE NapA2f
CGCAAGGTGGTGTCGTTCT
PAE NapA3r
GGCGTGGAAGCCGACTT
PAE NapA3f
GAAACCGCGGAGAAGATCTG
Pserug NapA1f
GGTACCATCCAGGAAAAAGT
Pserug NapA1r
TCTGGATATAGAAGCCGAAG
Acidovorax resp f
GTGGAAGATCTACGTCAAGG
Acidovorax resp r
GCAATACCAGTCGTAAAAGC
Acido assim r
GTCAGGCTGAACGGGTAG
Acido assim f
AGTTTGTGGTGGTGCAAG
Acido assim2 r
TCGTCGCGGTTGGTG
Acido assim2 f
GGCGAGGGCTTCGTG
Cd3F
Ziel
NarG
Diese Arbeit
Phillipot et al.
(2006)
NosZ
Phillipot et al.
(2006)
Smith et al.
(2007)
Diese Arbeit
NapA
Diese Arbeit
(Pseudomonas
aeruginosa PA7)
Nap
Diese Arbeit
Acidovorax sp.
JS42
Nas
GTNAAYGTNAARGARACNGG
Michotey et al.
NirS
Cd4R
ACRTTRAAYTTNCCNGTNGG
(2000)
Cd3aF
GTSAACGTSAAGGARACCGG
Kandeler et al.
R3cd
GASTTCGGRTGSGTCTTGA
(2006)
49
nirSCd3AF
AACGYSAAGGARACSGG
nirR3cd
GASTTCGGRTGSGTCTTSAYGAA
Nirs-Cd3aF
GTSAACGTSAAGGARACSGG
Throbäck et al.
(2004)
nirS1F
CCTAYTGGCCGCCRCART
nirS6R
CGTTGAACTTRCCGGT
NirK876
ATYGGCCCVCAYGGCGA
NirK1040
GCCTCGATCAGRTTRTGGTT
F1aCu
ATCATGGTSCTGCCGCG
R3Cu
GCCTCGATCAGRTTGTGGTT
nirK 1F
GGMATGGTKCCSTGGCA
nirK 5R
GCCTCGATCAGRTTRTGGTT
NirK 876
ATYGGCGGVCAYGGCGA
NirK 1040
GCCTCGATCAGRTTRTGGTT
3.12.2
Für
die
Braker et al.
(2000)
Henry et al.
(2004)
Throbäck et al.
(2004)
Braker et al.
NirK
(1998)
Henry et al.
(2004)
Expressionsanalyse der Nitratreduktasen
Expressionsanalyse
wurde
zunächst
Pseudomonas
aeruginosa
unter
nitratreduzierenden Bedingungen und unter nicht nitratreduzierenden Bedingungen kultiviert,
jeweils die RNA isoliert und in cDNA mittels Reverser Transkriptase enzymatisch
umgewandelt. Diese cDNAs wurden mit den Primern für das funktionelle Gen narG
quantifiziert. Als Referenz oder „housekeeping“ Gen wurde das 16S ribosomale Gen
ausgewählt und mit den Primern 27f/517r in einer Real-Time-PCR parallel quantifiziert und
als Normierung der Genexpression eingesetzt.
Die Expression der 16S rDNA zeigte, wie erwartet, zwischen induzierten und nicht
induzierten Bedingungen keinen Unterschied, während die Expression von narG erst mit
Einsatz der 100-fachen Menge an cDNA messbar war. Auch zeigte sich zwischen
induzierten und nicht induzierten Bedingungen nur ein geringer Unterschied. Das bedeutet,
dass die Steigerung der Expression von narG unter nitratreduzierenden Bedingungen nur
minimal war (Induktion um Faktor 4.6; siehe Tabelle 14). Diese Ergebnisse wiesen auf eine
niedrige, jedoch konstitutive (gleich bleibende) Expression dieser Nitratreduktase hin. Das
Experiment wurde mehrmals mit teilweise veränderten Parametern wiederholt, jeweils mit
dem gleichen Ergebnis.
Während der Kultivierung der Bakterien im nitrathaltigen Medium fiel auf, dass diese in der
Lage waren, Nitrat zu reduzieren, auch wenn Sauerstoff vorhanden ist. Da diese
Nitratreduktase eigentlich durch Sauerstoff gehemmt werden soll, ist von einer aeroben
50
Denitrifikation unter Beteiligung alternativer Nitratreduktasen auszugehen. In der Literatur
sind 3 Nitratreduktasen beschrieben:
™ Nar ist membrangebunden und für die ATP-Synthese durch Nitrat-Atmung
verantwortlich. Diese Reduktase wird durch Nitrat induziert und durch Sauerstoff
gehemmt.
™ Nas kommt im Cytoplasma vor und ist für den ersten Schritt der Stickstoffassimilation
verantwortlich. Sie wird durch Nitrat induziert, aber durch Sauerstoff nicht beeinflusst.
™ Nap ist periplasmatisch, ist ebenfalls für den ersten Schritt der Stickstoffassimilation
verantwortlich und kommt nur in Gram negativen Bakterien vor. Es wird weder durch
Sauerstoff noch durch Ammonium gehemmt und ist unter (mikro)aeroben
Bedingungen auch zur Nitrat-Atmung fähig.
Das bedeutete, dass das Nitratreduktase-Enzym Nar bei Vorkommen von Sauerstoff bei
Gram negativen Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa, inaktiv und das
Enzym Nap
aktiviert werden kann. Die Bakterien sind dann zur Nitratatmung unter Sauerstoff fähig.
Es ist davon auszugehen, dass während der Kultivierung der Bakterien Restsauerstoff
vorhanden war, und daher vorwiegend das Enzym Nap aktiv war. Daher konnte keine
nennenswerte Erhöhung der Expression von Nar gemessen werden.
Die Konsequenz aus diesem Ergebnis war, dass nicht nur die Expression von Nar, sondern
auch die von Nap gemessen werden sollte.
Um auch eine Expressionsanalyse von Nap durchführen zu können, mussten zuerst
geeignete Primer gefunden werden. Dafür wurden die Proteinsequenzen für Nap von 7
verschiedenen Bakterienspezies mit dem Software-Programm ClustalW und Codeshop
verglichen. Es konnten degenerierte passende Primer berechnet werden (NapA1f und
NapA1r; siehe Tabelle 13), die im PCR-Verfahren auf Effizienz und Spezifität getestet
wurden. Leider ergaben diese Primer mit verschiedenen Testorganismen und Biofilmen kein
Produkt, was wahrscheinlich an der großen Variabilität der innerhalb der DNA Sequenzen
lag. Zusätzlich wurden 3 verschiedene Primersysteme (siehe Tabelle 13) aus der Literatur
negativ getestet .
Es wurden mehrere neu ausgewählte Primer, abgeleitet aus dem Pseudomonas aeruginosa
Genom getestet, bis schließlich ein Primersystem ein eindeutiges Produkt mit Pseudomonas
aeruginosa und Biofilmbakterien aus dem RBR Rotherst ergab. Neben Pseudomonas
aeruginosa wurde auch Acidovorax caeni als Testorganismus verwendet, da die Gattung
Acidovorax in den Reaktoren Stuttgart, Rotherst und Karlsruhe gefunden wurde.
51
Da die benötigte RNA-Menge für eine Genexpressionsanalyse sehr hoch ist, wurde von der
RealTime-PCR zur Acrylamidgeltechnik gewechselt. Hierbei wurde eine PCR mit cDNA und
den Primern des zu untersuchenden Gens und als Referenz mit den Primern für die 16S
rDNA durchgeführt und auf ein 8%iges Acrylamidgel aufgetragen. Während die Bande des
Produktes des ribosomalen Referenzgens in jeder PCR gleich bleibt, änderte sich die Stärke
der Bande des Produktes des zu untersuchenden Gens je nach Stärke der Expression. Die
Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle zusammengefasst:
Tabelle 14: Expression der Nitratreduktase Nar unter denitrifizierenden Bedingungen in
Referenzbakterien und Mischpopulationen aus dem Reaktor Rotherst.
Aktivität der Nitratreduktase Nar
Pseudomonas aeruginosa
Geringe Induktion um Faktor 4.6
Acidovorax caeni
Hemmung um den Faktor 11 nach 45 min bzw.
5 nach 4 Stunden
Keine Änderung der Grundexpression
Mischpopulation Reaktor Rotherst
Auffallend bei diesen Expressionsanalysen war die Hemmung der Nar Genaktivität bei
Acidovorax sp., obwohl eine Induktion der Genexpression bei denitrifizierenden Bedingungen
zu
erwarten
war.
Die
Hemmung
der
Nitratreduktase
wird
auf
eine
mögliche
Nitritakkumulation im Medium zugeführt.
3.12.3
Expressionsanalysen für die Nitritreduktase:
Die Nitritreduktase katalysiert den Schritt von Nitrit zu Stickstoffmonooxid. Es kommen die 2
verschiedene Typen NirK und NirS der Nitritreduktase in Bakterien vor, wobei die Anzahl und
Organisation der Gene in den verschiedenen Spezies variiert. Es gibt eine Vielzahl von
Primern in der Literatur, welche meist Spezies-spezifisch sind. Es wurden mehrere dieser
Primersysteme getestet, bis jeweils ein geeignetes Primersystem für nirK und nirS gefunden
wurden. Diese Primer konnten bei Pseudomonas sp. angewendet werden, jedoch bei
Acidovorax sp., einem Bakterium das in vielen Biofilmen auf PCL nachgewiesen wurde, war
kein PCR Produkt nachweisbar.
Primersysteme für die Nitritreduktasen nirS und nirK sind in Tabelle 13 beschrieben. Die
Aktivität
der
Nitritreduktase
nirS
war
unter
dentrifizierenden
Bedingung
in
dem
Referenzbakterium Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zu nicht induzierenden
Bedingungen gehemmt. Eine nirK Genexpression konnte hier nicht nachgewiesen werden.
Bei Mischpopulationen der Biofilme des Reaktor Rotherst zeigten sich sowohl bei nirS als
auch bei nirK deutliche Aktivitäten in der Genexpression der Nitritreduktasen. Chemisch52
analytische Untersuchungen der Kooperationspartner belegten, dass zum Zeitpunkt der
Probenahme im Reaktor Rotherst eine Nitritakkumulation nachweisbar war, die zu der
deutlichen Induktion der bakteriellen Nitritreduktasen hat führen können.
Die Untersuchungen zur Genexpression in natürlichen Biofilmen aus dem Reaktor Rotherst
belegten,
dass
molekularbiologische,
RNA
basierte
Expressionsanalysen
zur
Charakterisierung von bakteriellen Aktivitäten durchgeführt werden können. Grundlagen für
den erfolgreichen Einsatz war die Testung einer Reihe von Primerkombinationen, um Genspezifische Aktivitäten zu erfassen. Hier wurde auch deutlich, dass Primerkombinationen
teilweise bei natürlichen Mischpopulation besser funktionierten, als bei auswählten
Bakterienspezies, ohne die natürlichen Zusammensetzungen der Biofilme zu kennen. Eine
Zusammenfassung der Ergebnisse der Expression der Nitrat- und Nitritreduktasen ist in
nachfolgender Tabelle wiedergegeben.
Tabelle 15: Zusammenfassung der Expressionsanalysen der Nitrat- und Nitritreduktasen bei
Referenzbakterien bzw. Biofilmen des Reaktor Rotherst.
Nitratreduktasen
Nitritreduktasen
Nar
Nap
NirS
NirK
P. aeruginosa
Induktion
Induktion
Hemmung
n.n.
Acidovorax caeni
Hemmung
n.n.
n.n.
n.n.
Mischpopulation
Grundexpression
n.n.
Induktion
Induktion
Reaktor Rotherst
n.n.: nicht nachweisbar
53
4
Diskussion
Mit steigendem Bedarf an Wasser bei gleichzeitiger zunehmender Wasserknappheit in
einigen Regionen steigt die Notwendigkeit, auch Nitrat belastetes Rohwasser zu Trinkwasser
aufzubereiten. Nitrat ist allerdings eine Verbindung, die durch mikrobielle Prozesse zu Nitrit
in
Verdauungssystem
des
Menschen
umgewandelt
wird
und
kann
zu
einer
Methhämoglobinämie vor allem bei Kindern führen (Blue Baby Syndrom). Der Verbrauch von
Trinkwasser mit hoher Qualität ist kontinuierlich zunehmend, von daher besteht die
Notwendigkeit brauchbare technische Prozesse zu entwickeln, die eine Elimination von Nitrat
ermöglichen, damit die Grenzwerte für Trinkwasser eingehalten werden können. Dies ist vor
allem für Länder der Dritten Welt und Länder mit hohen Anteilen an Agrarflächen und hohem
Düngemittelverbrauch von Relevanz.
Im Hinblick auf die Trinkwasseraufbereitung und die großen Verbrauchszahlen sollten diese
Prozesse einfach, kostengünstig und effektiv sein. Unter den verschiedenen verfügbaren
Methoden (physikalisch, chemisch und biologisch) zur Nitratelimination ist die biologische
Denitrification als die ökonomischste Technik anzusehen, bei der Nitrat über Nitrit zu
Distickstoff reduziert wird. Die heterotrophe Denitrifikation, bei der Mikroorganismen ihre
Energie
und
Kohlenstoffquellen
von
organischen
Verbindungen
beziehen,
zeigte
ökonomische Vorteile gegenüber dem autotrophen Nitratabbau und wurde mehrfach
bevorzugt (Gross et al., 1986; Szilivia Szekeres et al., 2002). Bei der konventionellen
heterotrophen Denitrifikation wurden einige organische Verbindungen als C-Quelle
eingesetzt. Dazu zählen Ethanol (Mohseni-Bandpi et al., 1998), Methanol (Liessens et al.,
1993; Mohseni-Bandpi et al, 1999), Acetat (Liessens et al., 1993) und Sucrose (Sison et al.,
1996). Der große Nachteil dieser konventionellen Prozesse liegt in der kostenintensiven
Prozesssteuerung bzw. -kontrolle, dem Risiko der Überdosierung zugeführter Kohlenstoffe
und einem notwendigen tieferen Verständnis über die Wirkweisen der biologischen Systeme
(Boley et al., 2000).
In den vergangenen Jahren wurde die Idee einer neuen Strategie der Nitratelimination aus
Wasser und Abwasser generiert, bei der Festsubstrate als alternative zu löslichen
Kohlenstoffquellen eingesetzt werden sollten. Eine Reihe von verschiedenen Festsubstraten
darunter auch Altpapier, Baumwolle und Stroh wurden bereits zu diesem Zwecke getestet
Volokita et al., 1996; Soares et al., 1998). Boley et al. (2000) untersuchten die Möglichkeit
biologisch abbaubare polymere Pellets von PHB ([C4H6O2]n) und PCL ([C4H10O2]n) als
Festsubstrate
und
Biofilmaufwuchsträger
für
die
Denitrifikation
in
der
Aquakultur
einzusetzen. Hier zeigte sich, dass die Denitrifikationsraten mit PHB und PCL mit denen der
Acetat geführten Prozesse vergleichbar waren.
An diesem Punkt setzt das abgeschlossenen Forschungsprojekt an, bei dem ausgehend von
den
Ergebnissen
der
Laboruntersuchungen
eine
Expolierungen
auf
Anlagen
im
54
großtechnischen Ansatz mit Effizienztestung und Kosten/Nutzen Beziehungen durchgeführt
werden sollten.
Die Aufgabe des Abteilung Mikrobiologie an Natürlichen und Technischen Grenzflächen des
IFG am KIT Campus Nord bestand darin, ein besseres Verständnisse der Mikrobiologie auf
den Polymeren zu erhalten. Mit molekularbiologischen Methoden der Populationsanalysen
(PCR-DGGE, Sequenzierung) wurden Biofilmbakterien erkannt, die nur begingt mit
klassischen mikrobiologischen Kultivierungsverfahren identifiziert werden können. Der
genetische Fingerabdruck eines Biofilms, den die DGGE-Methode erstellt, resultierte in
einem besseren Verständnis der bakteriellen Zusammensetzung einer Population und ihrer
Stabilität. Ribosomale DNA, die in allen Bakterien vorkommt, wird als Zielregion zunächst
aus der natürlichen Mikroflora ohne Anreicherung der Bakterien vervielfältigt, dann Speziesbezogen in einem Gel aufgetrennt und die jeweiligen Bakterien-spezifischen DNA-Banden
sichtbar gemacht werden. Es ist bekannt, dass im Gegensatz zu dieser Methode die
klassischen Kultivierungsansätze nur maximal 1-10% der Bakterien einer aquatischen Probe
nachweisen
können
und
damit
nicht
geeignet
sind,
eine
Biofilmpopulation
zu
charakterisieren.
Im Rahmen dieser molekularbiologischen Populationsanalysen konnten auf Polymeren der
Versuchsreaktoren in Stuttgart und Rotherst konnte ein deutliches Biofilmwachstum
festgestellt mit eine durchschnittlichen Populationsdichte von 108 bis 1010 Bakterien pro
Gramm PCL-Polymer. Über mikroskopische Aktivitätstest konnten in Populationen dieser
Reaktoren prozentuale Anteile von Stoffwechsel-aktiven Bakterien von bis zu 10%
nachwiesen werden. Bei diesem relativ geringen Wert an aktiven Bakterien muß man
einerseits berücksichtige, dass die Nachweisgrenze der Signal von fluoreszierenden
Bakterien im Mikroskop abhängig vom Metabolismus der Keime ist. In oligotrophen
(Nährstoffmangel) Bereichen, wie im Trinkwasser, ist somit mit einem höheren Anteil an
aktiven Bakterien zu rechnen. Untersuchungen mit nativen Grundwässern zeigten mit
diesem Verfahren z.B. keine Signalgebung, obwohl kultivierbare und damit aktive Bakterien
vorhanden waren. Ein Wert metabolisch aktiver Keime in Biofilme auf PCL-Polymeren von
10% ist somit schon Zeichen für eine erhöhte Stoffwechselaktivität in den Reaktoren.
Spezielle an den Stuttgarter Reaktoren konnte gezeigt werden, dass die gebildeten
Biofilmpopulationen auf PCL in ihrer Zusammensetzung über viele Monate stabil vorlegen.
Es kam weder in dem Rotobioreaktor noch in dem Dynasandreaktor zu signifikanten
Populationsveränderungen, die man in den DGGE-Untersuchungen hätte erkennen können.
Die Sequenzanalyse der 16S rDNA wird aufgrund des konservativen Charakters der 16S
rDNA für taxonomische und phylogenetische Untersuchungen verwendet (Stahl et al., 1988;
55
Amann et al., 1995). Allgemein gilt eine Übereinstimmung von 90-97 % der kompletten 16S
rDNA als typisch für die Arten einer Gattung, an 98 % Ähnlichkeit kann eine Identifizierung
der Art angenommen werden (Ludwig & Schleifer, 1994). Im Gegensatz dazu vermerken
Stackebrandt & Göbel (1994) für die Identifizierung einer Art eine Sequenzähnlichkeit von
>97 % und für die Identifizierung einer Gattung eine Sequenzähnlichkeit von >93 %.
Sequenzuntersuchungen von Denitrifikanten aus Oberflächengewässern zeigten einen
hohen Anteil von γ- und β-Proteobacteria (Ingendahl et al., 2002). Hier wurden vor allem
Stämme der Gattungen Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Aeromonas, Shewanella,
Stenotrophomonas und Kebsiella nachgewiesen. In Gegensatz dazu zeigten sich die
Bakterienzusammensetzungen der Biofilme aus den Reaktoren in Stuttgart und Rotherst
einheitlicher. Eine deutlich Dominanz der β-Proteobakterien-Subklasse und hier vor allen
Vertreter
der
Gattungen
Acidovorax,
Aquaspirillum,
Dechloromonas
konnte
hier
nachgewiesen werden. In deutlich geringerer Frequenz wurden Bakterien der anderen
Subklassen identifiziert. Zusätzlich konnte über die Populationsanalysen gezeigt werden,
dass sich auf den Polymeren des Rotobioreaktors in Rotherst eine Biofilmpopulation etabliert
hatte, die sich in ihrer Zusammensetzung von der Population der freien Wasserphase
unterschieden hat. Demzufolge ist von einer selektiven Besiedelung der Polymere
auszugehen. Bei Untersuchungen der Reaktoren in Stuttgart konnte diese selektive
Besiedelung der Polymere nicht nachgewiesen werden. Die Zusammensetzung der Biofilme
und die Mikroflora des umgebenden Wassers blieben einheitlich.
Nach
Kultivierung
der
Biofilmbakterien
auf
Nährmedien
mit
anschließender
molekularbiologischer Identifizierung wurden überwiegend γ-Proteobakterien gesehen, die
zur Denitrifikation befähigt waren. Hier wurde deutlich, dass eine unspezifische kulturelle
Anreicherung
einer
natürlichen
Mischpopulation
Verschiebungen
des
natürlichen
Bakterienspektrums zur Folge hat und damit ein ungenaues Abbild der realen Situation
bedingen kann. Nichtsdestotrotz wurden unter den anliegenden Bedingungen in den
Reaktoren verschiedene Bakteriengattungen, die zur Denitrifikation befähig waren, kultiviert.
Pathogene
oder
hygienische
relevante
Keime,
die
zu
einer
Kontamination
von
nachfolgenden technischen Anlagen bzw. Verteilungssytemen hätte führen können, wurden
im Rotobioreaktor nicht nachgewiesen, wenn gleich es zu einer Erhöhung der
Gesamtzellzahl der autochthonen Mikroflora in der freien Wasserphase gekommen ist.
Neben Bakterien wurden in den Biofilmen eine Vielzahl von Pilzen nachgewiesen, die
ebenfalls Nitrat abbauen konnten. Hefen, Schlauchpilze und Schimmelpilze der Gattung
Penicilium wurden identifiziert. Aus der Tatsache, dass neben den Prokrayoten auch
eukaryotische Vertreter an der Denitrifikation in den Reaktoren beteiligt sind, war es
56
schwierig abzuschätzen, welche der Organismengruppe maßgeblich am Nitratabbau beteilt
ist. Aufgrund der Beobachtung, dass die Expression der Gene für die bakteriellen
Denitrifikation nur schwer in Biofilmen der Reaktoren nachweisbar war, ist davon
auszugehen, dass der Anteil der Pilze am Nitratabbau berücksichtigt werden muss.
Bei der Denitrifikation wird Nitrat in Gegenwart von organischen Wasserstoffdonatoren zu
molekularem Stickstoff reduziert. Sie setzt sich aus vier enzymatisch katalysierten
Reaktionen zusammen, die in der Einleitung und im Ergebnisteil detailliert beschrieben sind.
Die vier daran beteiligten Enzyme, deren Gene in vielen Bakterien als Cluster zusammen
liegen, werden sowohl in ihrer Expression als auch in ihrer Aktivität durch Sauerstoff
größtenteils inhibiert. Die Denitrifikation findet zwar überwiegend unter anaeroben
Bedingungen statt, aber die Fähigkeit von denitrifizierenden Bakterien zur aeroben
Denitrifikation ist schon seit längerem bekannt (Robertson & Künen, 1984; Robertson et al.,
1995). Insbesondere die Sauerstoffkonzentration, die Verfügbarkeit von C-Quellen und der
Nitratgehalt
haben neben dem
pH-Wert
und der
Temperatur Einfluss auf
den
Denitrifikationsprozess (Tiedje, 1988). Die meisten Denitrifikanten sind fakultativ anaerobe,
heterotrophe Organismen, die durch die Oxidation von diversen Kohlenstoffquellen die
Redoxäquivalente auf Stickstoffoxide übertragen können, während autotrophe Denitrifikanten
anorganische Schwefelkomponente, Wasserstoff, Ammonium, Eisen oder Nitrit benötigen
(Zumft, 1997).
Es wurde in dem Forschungsprojekt versucht, über Genexpressionanalysen der an der
Denitrifikation beteiligten Gene enzymatische Prozesse in Biofilme der Reaktoren
quantitativ/qualitativ zu beschreiben. Genexpressionsanalysen beruhen auf dem Nachweis
der
mRNA der
entsprechenden Gene aus der
extrahierten Gesamt-RNA.
Viele
Genexpressionsstudien beziehen sich Experimente im Labormaßstab oder Untersuchungen
aus mesotrophen bzw. eutrophen Bereichen (Abwasser, Sedimente etc.), wo mit
ausreichender Biomasse und damit ausreichenden RNA-Konzentrationen gearbeitet werden
kann.
Ein Problem bei den Untersuchungen von Biofilmen aus oligotrophen Bereichen des Rohund Trinkwassers ist die geringe Biomasse und damit verbunden auch der geringe RNAGehalt,
den
man
Expressionsnachweis.
aus
Mit
den
Bakterien
verschiedenen
isolieren
kann,
Methoden
ein
Problem
(RealTime
für
PCR
den
und
Acrylamidgelelektrophorese) wurde versucht eine Expression, sprich Aktivität, von
relevanten Genen nachzuweisen. Vor allem die Elektrophoresetechnik hat sich als sensitiver
erwiesen und benötigte zudem die geringeren Mengen an RNA. Dies zeigte schon bei
Vorversuchen mit Laborreaktoren und Referenzbakterien.
57
Um die Expression von Genen der Denitrifikation in natürlichen Mischpopulationen aus
Biofilmen der Reaktoren (Stuttgart und Rotherst) nachzuweisen, mussten Gensequenzen
erkannt werden, die sich für die Etablierung von PCR-basierten Verfahren eignen. Dies
zeigte sich ebenfalls als limitierender Faktor, da viele dieser Gensequenzen der
Umweltbakterien in Gensequenzdatenbanken nicht vorhanden sind oder aber eine zu hohe
Diversität in der Sequenzabfolge aufwiesen, so dass kein Spezies übergeordnetes
Nachweissystem etabliert werden kann.
Eine Vielzahl von in der Literatur beschriebenen Primersequenzen für die PCR (Tabelle 13)
wurden im Rahmen des Vorhabens getestet. Sie zeigten jedoch schon auf DNA-Ebene, das
sie die Zielgene in den Biofilmen der Reaktoren aufgrund der abweichenden SpeziesSpezifitäten nicht detektieren können. Dennoch ist es im Vorhaben gelungen, durch eigene
Berechnungen von Primersequenzen auf DNA-Ebene Gensequenzen der Nitratreduktase
und Nitritreduktase zu amplifizieren. Bei der Berechnung der Primersequenzen zur PCR
wurde berücksichtigt, dass verschiedene Klassen der Nitrat- und Nitritreduktasen in
Bakterien vorherrschen. Bei der Nitratreduktase konnten Nachweisverfahren für das narGGen und das napA-Gen etabliert werden; für die Nitritreduktase dagegen wurden die Gene
nirK und nirS detektiert. Die Schwierigkeit im Nachweis der Genexpression bestand darin,
dass zwar auf DNA-Ebene die Anwesenheit der Gene in den Populationen sichtbar wurde,
es aber unklar war, ob diese Gene in ihren Trägerorganismen tatsächlich bei der
Denitrifikation aktiviert vorliegen. Erst bei den Untersuchungen der RNA konnte bei Biofilmen
des Reaktors Rotherst Grundexpressionen der narG Nitratreduktase und Induktionen der
Nitritreduktasen nirK und nirS erkannt werden. Die Induktion der beiden Nitritreduktasen
wurde vor allem dann beobachtet, als eine erhöhte Nitritakkumulation im Reaktor analysiert
wurde. Prinzipiell konnte somit gezeigt werden dass Genexpressionsanalysen eine
geeigneter Parameter darstellt, um mikrobiologische Prozesse in realen Systemen qualitativ
und
quantitativ
zu
charakterisieren,
wenn
die
genannte
limitierenden
Faktoren
ausgeschlossen bzw. umgangen werden können.
58
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63
6
Anhang
Angenommenes Abstract zur VAAM Jahrestagung 2009 in Bochum
Molecular biology control of aimed denitrifcation processes for raw water improvement
Anja Karolewiez; Thomas Schwartz, Ursula Obst
Institute of Functional Interfaces, Microbiology of Natural and Technical Surfaces Department Forschungszentrum Karlsruhe, 2
University of Karlsruhe, Competence Center for Material Moisture
Within the framework of this project microbial denitrification acitivities are used for nitrate degradation in contaminated raw water
sources. Adapted bacterial communities are forming biofilms on a non-toxic synthetic material like Polycaprolactone, which is
used as carbon source and substrate for biofilm growth, respectively.
To control the process gene expression analyses are important to evaluate the critical steps during nitrate degradation, and
rDNA based populations analyses are required for the characterization of the biofilm compositions or dynamics.
Therefore different gene expression analyses were performed with specifically designed primers targeting key genes involved in
the denitrification process. Pseudomonas aeruginosa and Acidovorax caeni previously identified as denitrifiers were used as
reference bacteria. The molecular biology tools were applied to natural biofilms grown on Polycaprolactone in an up-scaled
denitrification reactor.
The expressions of two different nitrate reductase genes (nar and nap) and two different nitrite reductase genes (nirS and nirK)
were quantified in specific reference bacteria and in natural biofilm communities.
The results demonstrated no common expression pattern for the reference strains Pseudomonas aeruginosa and Acidovorax
caeni targeting the nitrate reductase. It became obvious that the natural biofilms of the up scaled dentrification reactor exhibited
a constitutive like expression of the nitrate reductase gene and a significant up-regulation of nitrite reductase when nitrite
accumulated in the system.
Angenommenes Abstract zur ASM Biofilms Conference 2009 in Cancun/Mexico
Biofilm formation on biocompounds and their denitrification capacities in raw water reactors
Anja Karolewiez 1,2, Thomas Schwartz 1, Martin Kieninger 3, Angela Boley 3, Ursula Obst 1
1
Institute of Functional Interfaces, Microbiology of Natural and Technical Surfaces Department Forschungszentrum Karlsruhe, 2
University of Karlsruhe, Competence Center for Material Moisture (CMM),
3
Institute for Sanitary Engineering, Water Quality and Solid Waste Management, Stuttgart
Introduction
Nitrate contaminated raw water is a increasing problem in many areas of the world caused by fertilizers. Within the framework
of this project, microbial denitrification activities are used for nitrate degradation in contaminated raw water sources for drinking
water conditioning. Adapted bacterial communities are forming biofilms on a non-toxic synthetic material like Polycaprolactone,
which is used as carbon source and substrate for biofilm growth, respectively. So, there is no need for extra addition of a carbon
source associated with dosing problems.
To monitor biofilm compositions and dynamics on the Polycaprolactone particles, rDNA based populations analyses were
performed at different points of time.
To control the process, gene expression analyses are important to evaluate the critical steps during nitrate degradation,
therefore different gene expression analyses were performed with specifically designed primers targeting key genes involved in
the denitrification process.
Samples were taken from three different reactors for raw water denitrification.
Methods
The population analyses were performed by using 16S rDNA PCR-DGGE and sequencing analyses.
For gene expression analyses Pseudomonas aeruginosa and Acidovorax caeni previously identified as denitrifiers by the
population analysis were used as reference bacteria. The molecular biology tools were applied to natural biofilms grown on
Polycaprolactone in the three denitrification reactors.
The expressions of two different nitrate reductase genes (nar and nap) and two different nitrite reductase genes (nirS and nirK)
were quantified in specific reference bacteria and in natural biofilm communities.
Results
Population analyses revealed that predominantly β-Proteobacteria are involved in the biofilms forming on the Polycaprolactone
particles. Continuous analyses over weeks showed a stable diversity.
The results of the expression analyses disclosed no consistent expression pattern for the nitrate reductase within the reference
strains. The biofilm on the particles exhibited a constitutive like expression of the nitrate reductase gene and a significant upregulation of nitrite reductase when nitrite accumulated in the system.
Conclusion
The stable biofilm diversity is a precondition for a stable denitrification and the safety for the following drinking water
conditioning.
With our methods for expression analyses of genes involved in the denitrification process we have a toolbox to understand and
control this process for optimization and monitoring even in reactors.
64
Molecular biology control of aimed denitrification processes for raw water
improvement
Anja Karolewiez 1,2, Thomas Schwartz 1, Ursula Obst 1,
1 Institute
of Functional Interfaces, Microbiology of Natural and Technical Surfaces Department Forschungszentrum Karlsruhe,
2
University of Karlsruhe, Competence Center for Material Moisture (CMM)
INTRODUCTION
Microbial denitrification acitivities are used for nitrate degradation in contaminated raw water sources. Adapted bacterial communities are forming
biofilms on the synthetic polymere Polycaprolactone, which is used as carbon source and substrate for biofilm growth, respectively. To control
the process different gene expression analyses were performed with specifically designed primers targeting key genes involved in the denitrification
process and rDNA based population analyses were performed to characterize the biofilm compositions.
UPUP-SCALED SYSTEM
Samples were taken from an up-scaled Rotobio reactor (volume of 2 m3), for raw water denitrification
(cooperation with the Water Technology Center Karlsruhe).
The reactor is filled with Polycaprolactone CAPA 6500, a biodegradable non-toxic polymer from the
company Solvay.
POPULATION ANALYSES
The molecular biology analysis (PCR/ DGGE/ sequencing) of
the biofilms grown on the polycaprolactone particles showed
that the main part of bacteria is represented by βProteobacteria, especially with the genus Acidovorax, and γProteobacteria.
Acidovorax caenii and pseudomonades were chosen for
subsequent gene expression analysis.
DGGE profiles of biofilm
samples from different
parts of the reactor.
Population shifts were
observed during raw
water
passage
depending
on
the
location of the sampling
point.
GENE
NO3ENZYME
nar
nap
NO2-
Nitrate
Reductase
nirS
nirK
frequently found bacteria
properties
Acidovorax delafieldii
Acidovorax sp.
Aquaspirillum spp.
Hydrogenophaga sp.
Leptothrix sp.
uncultured bacteria
uncultured bacteria
denitrifying bacteria
β-proteobacteria
H2 oxidizer
mangan and ferrum oxidizer
γ-proteobacteria
Results of the population analysis of the Rotobio reactor
EXPRESSION ANALYSIS
NO
Nitrite
Reductase
N2O
N2
Primers were designed for the two different nitrate reductase
genes nar and nap and for the two different nitrite reductase
genes nirS and nirK.
The primers
16S
- for nar: degenerated and newly designed by an alignment of eight different denitrifying bacteria using ClustalW software.
- for nap: deduced from the nap-sequence of Pseudomonas spp. and designed using Primer3 software.
- for nirS and nirK: taken from the literature (Throbäck et al. 2004, Phillipot et al. 2006).
NirS
RNA was extracted from the biofilms grown on the Polycaprolactone particles in presence and absence of NO3. Due to the
low RNA yield we switched from Real-Time PCR to the acrylamide gel electrophoresis technique. The expression rates of
the genes were normalized with the constitutive expressed 16S rRNA housekeeping gene.
Nitrate
reductases
Nitrite
reductases
Nar
NirS
Nap
NirK
Regulation of the nitrate and
nitrite reductases during
induced conditions in the
Rotobio reactor
d.
ed
uc ot in
n
ind
RESULTS
It became obvious that the natural biofilms of the Rotobio dentrification reactor exhibited a
constitutive like expression of the nar gene (nitrate reductase), a down-regulation of the nap
gene (alternative nitrate reductase) and a significant up-regulation of nitrite reductase when
nitrite accumulated in the system. With this toolbox of molecular biological methods we have a
better view in the process control for sensibel and specific regulation of the process even in upscaled reactors to monitore and optimize the process.
OUTLOOK
Population analysis and expression analysis will be made by two alternative upscaled reactors by a longlong-time test under different conditions to
understand the important factors for biofilm growth and the dynamics of the denitrification capacities.
Also primers for the last step in the denitrification system, the nitrous oxide reductase nos,
nos, should be designed and the expression analysis performed
to extend the molecular toolbox and to evaluate the critical steps.
steps.
This work was funded by a grant of the BMBF.
65
Microbial diversity and control of the denitrification process during
drinking water conditioning using biodegradable polymers
1
Anja Karolewiez 1,2, Thomas Schwartz 1, Martin Kieninger 3, Angela Boley 3, Ursula Obst 1
Institute of Functional Interfaces, Microbiology of Natural and Technical Surfaces Department, Karlsruhe Institute of Technology
2 Competence Center for Material Moisture, Karlsruhe Institute of Technology
3 Institute for Sanitary Engineering, Water Quality and Solid Waste Management, Stuttgart
INTRODUCTION
• Microbial denitrification activities are used for nitrate degradation in contaminated raw water sources for drinking water conditioning. Adapted
bacterial communities are forming biofilms on a biodegradable, non-toxic synthetic material like Polycaprolactone, which is used as carbon
source and substrate for biofilm growth, respectively. Therefore, there is no need for extra addition of a carbon source associated with dosing
problems.
• To monitor biofilm compositions and dynamics on the Polycaprolactone particles, rDNA based populations analyses were performed at different
points of time.
• To control the process, different gene expression analyses were performed with specifically designed primers targeting key genes involved in the
denitrification process.
• Samples were taken from three different raw water denitrification reactors.
METHODS
2
Samples:
• Up-scaled Rotobio reactor (fig. 1) 2 m3 (cooperation with the Water Technology
Center Karlsruhe),
• Rotobio reactor (fig. 2), and Dynasand reactor (fig. 3) 0,05 m3 and 0,8 m3,
respectively (cooperation with the University of Stuttgart)
1
3
Bacterial population analyses:
16S rDNA PCR, DGGE and sequencing techniques.
Gene expression:
and Acidovorax caeni
ENZYME
- and in natural biofilm communities grown on Polycaprolactone in the three
denitrification reactors.
Frequently found bacteria
α-Proteobacteria Rhodobacter sp.
nirS
nirK
nar
nap
NO2-
Nitrate
Reductase
NO
N2O
Expression analyses:
• No consistent expression pattern for the nitrate reductase within the reference strains.
• The biofilm on the particles exhibited a constitutive like expression of the nitrate
reductase gene and a significant up-regulation of nitrite reductase when nitrite
accumulated in the system.
Acidovorax ssp
β-Proteobacteria 9 uncultured species
Aquaspirillum ssp.
16S
uncultured
nirS
γ-Proteobacteria Xanthomonas sp.
Nitrate
reductases
nar
nap
Nitrite
reductases
nirS
nirK
Pseudomonas sp.
σ-Proteobacteria uncultured
ε-Proteobacteria uncultured
Flavobacteria
Flavobacterium sp.
Bacteroidetes
Cytophagales
• Continuous analyses:
Biofilm over 17 weeks showed a stable diversity.
N2
Nitrite
Reductase
RESULTS
• Bacterial population analyses:
Frequently found bacteria are shown in the table
below. Most of them are β-Proteobacteria.
NO3-
i nd
d.
ed
uc ot in
n
Regulation of the nitrate and
nitrite reductases during
induced conditions in the 2 m3
Rotobio reactor
CONCLUSIONS
• The stable biofilm diversity is a precondition for a stable denitrification and for the
safety of the following drinking water conditioning.
• With our methods used for expression analyses of genes involved in the
denitrification process we have a toolbox to understand and control this process for
optimization and monitoring even in reactors.
November 15 - 19, 2009, Cancun, Mexico
GENE
5th ASM Conference on Biofilms
• of 2 different nitrate reductase genes (nar and nap)
• and of 2 different nitrite reductase genes (nirS and nirK)
- were quantified in the specific reference bacteria Pseudomonas aeruginosa
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