Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur
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Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) vorgelegt von Kathrin Kopp (geb. Müller) an der Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie Konstanz, 2011 Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-140615 Tag der mündlichen Prüfung: 01. Juli 2011 1. Referent: Prof. Dr. Christof Hauck 2. Referentin: Prof. Dr. Iwona Adamska Danksagung: An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Christof Hauck, der es mir ermöglichte meine Arbeit in seiner Gruppe anzufertigen und mich mit Rat und Ideen unterstützt hat. Ich möchte mich ganz herzlich bei Frau Prof. Dr. Iwona Adamska bedanken, die sich als Gutachterin bereit erklärt hat, sowie bei Herrn Prof. Dr. Alexander Bürkle für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes. Besonders möchte ich mich auch bei allen Kollegen meiner Arbeitsgruppe für die Unterstützung, den Spaß bei der Arbeit und das nette Arbeitsklima bedanken. Ganz besonderer Dank gilt Frau Susanne Feindler-Boeckh, für ihre tatkräftige Unterstützung und Hilfe bei großen und kleinen Nöten. Ein ebenso großes Dankeschön an Frau Anne Keller, Ruth Hohenberger-Bregger und Claudia Hentschel, für die Erledigung so vieler kleiner und großer Dinge des Laboralltags. Ganz besonders möchte ich mich bei all meinen Freunden in Nah und Fern bedanken, die mich über die gesamte Zeit meiner Promotion begleitet, motiviert und unterstützt haben und immer für mich da sind. Ich danke euch für all den Spaß und die schönen Momente sowie eure stets offenen Ohren, wenn ich euch brauchte! Schließlich möchte ich mich von ganzem Herzen bei meinen Eltern und meinem Bruder bedanken. Danke dafür, dass ihr mich all die Jahre unterstützt habt und immer für mich da seid. Inhaltsverzeichnis ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................................. 7 1 EINLEITUNG ......................................................................................................................... 9 1.1 Protein Arrays ................................................................................................................... 9 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.2 Proteinkopplung an Trägeroberflächen ............................................................10 Detektion der gebundenen Probe......................................................................13 Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays...............................................14 Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen ................................................................................................................... 16 1.2.1 Proteinkinasen .................................................................................................. 17 1.2.1.1 Proteintyrosinkinasen.........................................................................19 1.2.1.1.1 Die Fokale Adhäsionskinase .......................................... 20 1.2.1.1.2 Die Familie der Src-Kinasen ..........................................23 1.2.2 Tyrosinphosphorylierung von Proteinen .......................................................... 25 1.2.3 SH2 Domänen – wichtige Interaktionsdomänen in der zellulären Signalweiterleitung........................................................................................... 26 1.2.3.1 Struktur und Bindungseigenschaften von SH2 Domänen .................27 1.2.3.2 Proteinfamilien mit SH2 Domänen ...................................................28 1.3 Die Familie der CEACAMs ............................................................................................35 1.3.1 1.3.2 1.4 Strukturelle und funktionelle Eigenschaften ....................................................35 CEACAMs als Rezeptoren für humanspezifische Bakterien...........................40 1.3.2.1 Regulation der CEACAM3-vermittelten Phagozytose......................43 Zielsetzungen .................................................................................................................. 46 2 SH2 DOMÄNEN ARRAYS - EINE METHODE ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PHOSPHOTYROSIN-ABHÄNGIGEN PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN .......................... 48 2.1 Einleitung ........................................................................................................................ 48 2.2 Ergebnisse ....................................................................................................................... 49 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.3 Immobilisierung von rekombinanten SH2 Domänen auf einer aldehydbeschichteten Trägermatrix..................................................................49 Blockierung und Beprobung von SH2 Domänen Arrays .................................52 Detektion der an die SH2 Domänen gebundenen Phosphotyrosinproteine mittels spezifischer Antikörper.........................................................................59 Verifikation des SH2 Domänen Arrays – Nachweis zytoplasmatischer Proteintyrosinkinasen ....................................................................................... 63 Diskussion....................................................................................................................... 67 3 BETEILIGUNG VON PROTEINEN MIT SH2 DOMÄNEN AN CEACAM-VERMITTELTEN SIGNALWEGEN ................................................................................................................... 72 3.1 Die Phosphatidylinositol-3’-Kinase als wichtiges Signalprotein in der CEACAM3vermittelten Phagozytose und Abtötung von human pathogenen Bakterien ..................72 3.1.1 3.1.2 Einleitung ......................................................................................................... 72 Ergebnisse ........................................................................................................76 3.1.2.1 Die SH2 Domänen der PI3KR3 assoziieren mit dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 .................................. 76 3.1.2.2 Die SH2 Domänen der PI3KR3 binden phosphorylierungsabhängig an CEACAM3 ................................................................................... 77 3.1.2.3 Die Bindung Opa52-exprimierender Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung der N-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 an den Rezeptor ................................................................................. 80 3.1.2.4 Die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien ist unabhängig von der Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase .......................83 3.1.2.5 Die Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase ist notwendig für die Abtötung CEACAM3-bindender pathogener Bakterien..............85 3.1.3 Diskussion ........................................................................................................ 88 3.2 Das Signalprotein Grb14 ist am CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess beteiligt ......................................................................................................................................... 94 3.2.1 3.2.2 Einleitung ......................................................................................................... 94 Ergebnisse ........................................................................................................97 3.2.2.1 Grb14 interagiert über seine SH2 Domäne direkt mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3 ................................................ 97 3.2.2.2 Grb14 wird in humanen Granulozyten exprimiert...........................100 3.2.2.3 Die Bindung von Opa52-exprimierenden Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung von Grb14 ...................................................102 3.2.2.4 Grb14 ist ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose ..................................................................................... 103 3.2.3 Diskussion ...................................................................................................... 106 3.3 Identifikation Phosphotyrosin-abhängiger Interaktionspartner für den zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 ............................................................................................110 3.3.1 3.3.2 Einleitung ....................................................................................................... 110 Ergebnisse ......................................................................................................111 3.3.2.1 Identifikation von Interaktionspartnern für CEACAM4 mittels SH2 Domänen Array................................................................................111 3.3.2.2 Verifikation und Konkretisierung der mittels SH2 Domänen Array identifizierten Interaktionen für CEACAM4...................................114 3.3.2.3 Die Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne kolokalisiert mit Bakterien-assoziierter CEACAM3/4-Chimäre ................................118 3.3.2.4 Die Überexpression der Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne behindert die CEACAM3/4-vermittelte Phagozytose .....................120 3.3.3 Diskussion ...................................................................................................... 121 4 SCHLUSSBETRACHTUNG .................................................................................................. 126 4.1 Etablierung des SH2 Domänen Arrays .........................................................................127 4.2 Untersuchungen zu SH2 Domänen-abhängigen Protein-Protein Interaktionen bei granulozytischen CEACAMs........................................................................................ 128 5 EIGENABGRENZUNGEN .................................................................................................... 134 6 PUBLIKATIONEN ............................................................................................................... 135 7 MATERIAL ........................................................................................................................ 136 7.1 Bakterien ....................................................................................................................... 136 7.1.1 7.1.2 Neisseria gonorrhoeae-Stämme..................................................................... 136 Escherichia Coli-Stämme...............................................................................136 7.2 Zelllinien ....................................................................................................................... 136 7.3 Nährmedien für Bakterien und Zellkultur.....................................................................136 7.3.1 7.3.2 7.4 Plasmide und Oligonukleotide ......................................................................................137 7.4.1 7.4.2 7.5 Plasmide ......................................................................................................... 137 Oligonukleotide .............................................................................................. 137 Antikörper, Enzyme und Proteine................................................................................. 140 7.5.1 7.5.2 7.6 Flüssigmedien und Agarplatten für Bakterien................................................136 Medien für Zellkultur .....................................................................................137 Antikörper ...................................................................................................... 140 Enzyme und Proteine...................................................................................... 140 Lösungen und Puffer .....................................................................................................141 7.6.1 7.6.2 7.6.3 Lösungen und Puffer für eukaryotische Zellen ..............................................141 Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden............................ 142 Lösungen und Puffer für biochemische Methoden ........................................142 7.6.3.1 Puffer und Lösungen für SDS-PAGE, Coomassiefärbung, Western Blot und Protein Array..................................................................... 142 7.6.3.2 Lösungen und Puffer für die Proteinexpression und –aufreinigung von GST-Fusionsproteinen .............................................................. 143 7.6.4 Chemikalien und Kits ..................................................................................... 144 7.7 Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien .......................................................................144 7.8 Software ........................................................................................................................ 144 8 METHODEN....................................................................................................................... 145 8.1 Molekularbiologische Methoden .................................................................................. 145 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5 8.1.6 8.1.7 8.1.8 8.1.9 8.1.10 8.1.11 8.2 Präparation von Plasmid-DNA (nach Birnboim-Doley) ................................ 145 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA .........................................145 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) .............................................................. 146 In-Fusion Reaktion.........................................................................................146 Cre-Lox-site spezifische Rekombination ....................................................... 147 Restriktionsverdau..........................................................................................148 Ligation ..........................................................................................................148 Agarosegelelektrophorese ..............................................................................148 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ................................149 Präparation von RNA ..................................................................................... 149 Reverse Transkription ....................................................................................149 Biochemische Methoden...............................................................................................150 8.2.1 8.2.2 8.2.3 SDS-Gelelektrophorese .................................................................................. 150 Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen..............................................150 Western Blot................................................................................................... 150 8.2.3.1 Immundetektion von Proteinen........................................................151 8.2.3.2 Strippen von PVDF-Membranen ..................................................... 151 8.2.4 Peptid-Bindeexperiment ................................................................................. 151 8.2.5 Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Bakterien ......152 8.2.5.1 Expression rekombinanter Proteine .................................................152 8.2.5.2 Reinigung von GST-Fusionsproteinen ............................................152 8.2.6 Analyse von Protein Interaktionen mittels ELISA.........................................153 8.2.7 Pull down Experimente mittels GST-Fusionsproteinen .................................153 8.2.8 Phosphorylierung von Proteinen in vitro........................................................ 154 8.3 Herstellung und Beprobung von Protein Arrays...........................................................154 8.4 Zellbiologische Methoden.............................................................................................156 8.4.1 8.4.2 8.4.3 8.4.4 8.5 Herstellung stabiler shRNA-Zelllinien .........................................................................158 8.5.1 8.5.2 8.5.3 8.6 Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Kopräzipitation.............156 Herstellung von Zelllysaten............................................................................156 FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting).................................. 157 Rezeptorfärbung für FACS ............................................................................157 Klonierung von shRNA in den lentiviralen Vektor pLKO.1 .........................158 Produktion lentiviraler Partikel ......................................................................158 Transduktion von Zellen mit lentiviralen Partikeln........................................159 Infektionsexperimente...................................................................................................159 8.6.1 8.6.2 8.6.3 8.6.4 8.6.5 8.6.6 8.6.7 8.6.8 8.6.9 8.6.10 8.6.11 Kultivierung von Neisserien...........................................................................159 Beschichten von Platten für den Gentamicin-Protektions Assay ................... 159 Gentamicin-Protektions Assay ....................................................................... 159 Markierung von Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoffen .................................160 Beschichten von Deckgläsern für Konfokalmikroskopie...............................160 Herstellung von Präparaten für Konfokalmikroskopie...................................160 FACS-Invasionsassay.....................................................................................161 Aufreinigung von Granulozyten aus humanem Blut...................................... 161 Bakterien-Degradations Assay .......................................................................162 Quantifizierung der Phagozytoserate von humanen Granulozyten ................ 162 Messung der Entstehung reaktiver Sauerstoffderivate (Oxidative Burst Messung) in humanen Granulozyten..............................................................163 9 ABKÜRZUNGEN ................................................................................................................. 164 10 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................. 167 Zusammenfassung Zusammenfassung Zur Klärung verschiedenster biologischer Fragestellungen haben Biochips seit nunmehr 20 Jahren einen festen Platz in der Wissenschaft. Die Verwendung von DNA Arrays zur Erstellung von Genexpressionsprofilen im Hochdurchsatzverfahren ist zu einem festen Bestandteil der molekularbiologischen Forschung geworden. Im Gegensatz dazu kann die Untersuchung von Proteinen hinsichtlich ihrer Einbindung in zelluläre Signalnetzwerke bisher nur minimal in parallelen Ansätzen durchgeführt werden. Protein Arrays bieten eine gute Möglichkeit, um auch diese Untersuchungen in großem Maßstab durchführen zu können und somit Einblicke in die Beteiligung einzelner Proteine an verschiedenen Signalwegen zu bekommen. So stellen beispielsweise Protein Arrays mit immobilisierten SH2 Domänen als Affinitätsmatrix eine sehr gute Möglichkeit dar, um Proteine in kürzester Zeit auf Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen mit allen im menschlichen Genom kodierten SH2 Domänen zu untersuchen. Mit der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für eine solche globale Protein-Protein Interaktionsanalyse gelegt. Etwa zwei Dutzend humane SH2 Domänen wurden rekombinant als GST-Fusionsproteine exprimiert, aufgereinigt und auf einer Trägeroberfläche immobilisiert. Durch Verwendung von Aldehydoberflächen als Trägermatrix wurde eine robuste, da kovalente, Bindung der Proteine an die Oberfläche erreicht. Die nicht durch SH2 Domänen abgesättigten Aldehydgruppen der Oberfläche wurden mittels Natriumborhydrid (NaBH4) reduziert, wodurch die unspezifische Bindung von Proteinen der Beprobungslösung effektiv verhindert wurde. Ebenso erfolgreich war auch die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit Ganzzelllysaten und die anschließende Detektion der gebundenen Phosphotyrosinproteine durch spezifische Antiköper. Die erfolgreiche Verwendung unterschiedlicher Antikörper zur Detektion zeigt die breite Anwendbarkeit des SH2 Domänen Arrays zur Untersuchung verschiedenster Proteine und Proteingruppen. In diesem Zusammenhang konnten Membranproteine wie CEACAM3 und CEACAM4, die zytoplasmatisch lokalisierende Fokale Adhäsionskinase (FAK) sowie die Gesamtheit der tyrosinphosphorylierten Proteine einer Zelllinie hinsichtlich ihrer Bindefähigkeit an unterschiedliche SH2 Domänen untersucht werden. Im Zuge der Etablierung des SH2 Domänen Arrays konnten sowohl bereits bekannte als auch bisher unbekannte Interaktionspartner für den phagozytischen Rezeptor CEACAM3 identifiziert werden. Die nähere Analyse der neu identifizierten Interaktionspartner, Grb14 7 Zusammenfassung und Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3K), gaben Einblicke in die Beteiligung dieser Proteine an CEACAM3-vermittelten Signalwegen und bestätigten somit die physiologische Relevanz dieser Interaktionen. So konnte das Signalprotein Grb14 als Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose identifiziert werden, während die PI3K für die Abtötung der internalisierten Pathogene von essentieller Bedeutung ist. Durch die Anwendung des SH2 Domänen Arrays zur Interaktionspartnersuche für CEACAM4, den evolutionären Vorläufer von CEACAM3, konnten sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede im Bindungsverhalten dieser Proteine an verschiedene SH2 Domänen ermittelt werden. Genau wie für CEACAM3 konnten auch für CEACAM4 phosphorylierungsabhängige Assoziationen mit den SH2 Domänen der Src-Kinase Yes, dem Adapterprotein Nck2 und der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K festgestellt werden. Da für CEACAM4 kein natürlicher Ligand bekannt ist, wurden erste funktionelle Untersuchungen nicht mit CEACAM4 selbst, sondern unter Einsatz eines chimären Proteins, durchgeführt. Diese Chimäre bestand aus der OpaCEA-bindenden N-terminalen Domäne des phagozytischen Rezeptors CEACAM3 und dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 und ermöglichte die Beobachtung der Lokalisation sowie Untersuchung der Funktion der neu identifizierten Interaktionspartner im Infektionsverlauf. Neben diesen Gemeinsamkeiten wurden allerdings auch interessante Unterschiede zwischen CEACAM3 und CEACAM4 festgestellt. So konnte weder für den neu identifizierten Negativregulator, der CEACAM3vermittelten Phagozytose, Grb14 noch für den, für die Phagozytose über CEACAM3 essentiellen, Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav eine phosphorylierungsabhängige Assoziation mit CEACAM4 gefunden werden. Diese Befunde deuten trotz enger Verwandtschaft beider Rezeptoren auf abweichende Signalwege hin. 8 Einleitung Protein Arrays 1 1.1 Einleitung Protein Arrays Seit nunmehr 20 Jahren haben DNA Arrays einen festen Platz in der molekularbiologischen Forschung. Sie finden beispielsweise Anwendung bei der Erstellung von Genexpressionsprofilen, der Detektion von Sequenzdeletionen und –mutationen, sowie der Identifikation von Transkriptionsfaktorbindestellen (Bertone and Snyder 2005). Die DNA Arrays können im Hochdurchsatzverfahren angewendet werden, geben jedoch lediglich Auskunft über die Präsenz oder Transkription der untersuchten Gene und nur in einem sehr geringem Umfang Aufschluss über die Funktion der Proteine, für welche sie kodieren (Hall et al. 2007). Bisher gibt es viele verschiedene Methoden, um beispielsweise die Interaktionsund Signaltransduktionseigenschaften von isolierten Proteinen zu untersuchen. Jedoch sind diese Methoden (z. B. Far-Western, pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitation) sehr zeitintensiv und nicht im Hochdurchsatzverfahren sowie in großem Maßstab anwendbar (Wolf-Yadlin et al. 2009). In diesem Zusammenhang stellt die seit einigen Jahren immer mehr an Aufschwung gewinnende Protein Array Technologie eine sehr viel versprechende Alternative dar. Im Gegensatz zu den DNA Arrays ermöglichen die Protein Arrays unter anderem die funktionelle Analyse von Protein-Protein Interaktionen in einem sehr schnellen und großen Maßstab (Bertone and Snyder 2005; Wolf-Yadlin et al. 2009). Weitere Einsatzmöglichkeiten von Protein Arrays ist ihre Verwendung zur Untersuchung von ProteinDNA (Bulyk et al. 1999; Bulyk 2007), Substrat-Enzym (z. B. Proteasen, Peroxidasen, Phosphatasen, Kinasen) (Arenkov et al. 2000; MacBeath and Schreiber 2000; Zhu et al. 2000) oder Protein-Ligand (Bradner et al. 2006) Interaktionen. Ähnlich wie die DNA Arrays enthalten auch die Protein Arrays sehr viel Information auf sehr engem Raum. Dies ist so zu verstehen, dass eine sehr geringe Menge an Protein (im Piko- oder Nanogrammbereich) auf eine sehr kleine Fläche von oft nur wenigen Mikrometern Durchmesser aufgebracht wird. Werden viele verschiedene Proteine auf diese Weise in punktförmigen Mustern (Spots) auf einer speziellen Trägeroberfläche immobilisiert, so wird die Gesamtheit dieser individuell angeordneten Spots als Array bezeichnet. In der Literatur werden in diesem Zusammenhang auch oft die Begriffe „Biochip“ oder Mikroarray verwendet. Diese Bezeichnungen verdeutlichen die Miniaturisierung der Testansätze, bei denen eine hohe Anzahl von Molekülen auf sehr kleinem Raum immobilisiert wird. Heutzutage gibt es beispielsweise DNA Arrays die aus bis zu 200.000 einzelnen Spots pro cm2 bestehen. Durch diese 9 Einleitung Protein Arrays Miniaturisierung der Testansätze ist es möglich, mehrere hundert bis tausend verschiedene Protein-Spots auf eine Trägeroberfläche aufzubringen, die den Maßen eines normalen Mikroskopobjektträgers entspricht. In der Folge können diese Arrays unterschiedlich beprobt werden. Zum einen kann die Beprobung mittels markierter, löslicher Proben (z. B. Fluoreszenz-markierter Proteine) erfolgen. Zum anderen ist aber auch eine Inkubation mit unmarkierten Proben möglich. Bei dieser Beprobungsform wird die gebundene Probe in weiteren Inkubationsschritten mit Hilfe spezifischer Primär- und fluoreszenzgekoppelter Zweitantikörper nachgewiesen. Durch Auslesen der Fluoreszenzintensität kann die Bindung der Probe an jeden einzelnen Spot quantitativ erfasst werden. Mittels dieser Methodik konnte bereits ein Großteil des gesamten Hefe-Proteoms (etwa 5800 Genprodukte) im Array Format aufgetragen und analysiert werden, wobei Protein-Protein und Protein-Lipid Interaktionen im Vordergrund standen (Zhu et al. 2001). Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von Protein Arrays wurde von Jones et al. im Jahr 2006 vorgestellt. Sie zeigten, dass ein funktionaler Proteindomänen Array, auf der Basis von isolierten SH2 Domänen, eine realistische Methodik darstellt, um Bindungseigenschaften von Phosphotyrosin (pTyr)-modifizierten Peptiden quantitativ zu bestimmen (Jones et al. 2006). 1.1.1 Proteinkopplung an Trägeroberflächen Das Aufbringen der Proteine auf speziell beschichteten Mikroskopobjektträgern erfolgt unter Verwendung eines Kontakt-Mikroarraydruckers (MacBeath and Schreiber 2000; Zhu et al. 2001) oder mittels eines kontaktfreien Druckers (Delehanty and Ligler 2003; Delehanty 2004; Jones et al. 2006). Um die Stabilität der Proteine während und auch nach dem Druckvorgang zu gewährleisten, müssen diese vor Austrocknung geschützt werden. Aus diesem Grund wird dem Immobilisierungspuffer eine möglichst hohe Konzentration Glycerin zugesetzt. Zusätzlich sollte der Druckprozess bei einer konstant hohen Luftfeuchtigkeit (circa 70-85 %) durchgeführt werden (MacBeath and Schreiber 2000; Jones et al. 2006; Kaushansky et al. 2010). Zur Proteinimmobilisierung steht eine große Auswahl unterschiedlich behandelter Trägeroberflächen zur Verfügung. Bei der Wahl eines geeigneten Trägers sollte darauf geachtet werden, dass der Kontakt zwischen Protein und Oberfläche keinen negativen Einfluss auf die Proteinkonformation und –funktionalität hat und dass eine maximale Bindekapazität erreicht wird (Zhu et al. 2003). Eine weitere wichtige Überlegung für die Wahl einer geeigneten Oberfläche ist, ob die Proteine in räumlich ungerichteter oder gerichteter Orientierung gebunden werden sollen. 10 Einleitung Protein Arrays Eine Möglichkeit, Proteine in einer einheitlichen räumlichen Orientierung zu immobilisieren, ist die Verwendung von Affinitäts-getaggten Oberflächen. Für diesen Zweck verwendbare Oberflächenvarianten sind zum Beispiel mit Nickelionen beschichtete Glasobjektträger, welche die Immobilisierung von Hexa-Histidin-markierten Proteinen ermöglichen (Zhu et al. 2003). Jedoch ist die Bindung zwischen Nickel-NTA und Histidin-markierten Proteinen weder sehr stark, noch sehr stabil. Im Gegensatz dazu ist die Interaktion zwischen Biotin und Avidin eine der stärksten und stabilsten nicht-kovalenten Bindungen. Im Jahr 2002 veröffentlichten Lesaicherre et al. eine Methode, die es ermöglicht Proteine seiten-spezifisch zu biotinylieren, um sie im folgenden auf einer Avidin-beschichteten Glasoberfläche zu immobilisieren (Lesaicherre et al. 2002). Diese Form eines Protein Arrays bietet, genau wie die Immobilisierung von Histidin-markierten Proteinen auf Nickel-Oberflächen, eine nichtkovalente Bindung und räumlich einheitliche Orientierung der Proteine. Allerdings ist diese Interaktion zwischen Protein und Oberfläche wesentlich robuster und extrem stabil. Für eine nach dem Zufallsprinzip räumlich ungerichtete Proteinimmobilisierung stehen derzeit Glasobjektträger mit Aminosilan-, Aldehyd- oder Epoxybeschichtung zur Verfügung (MacBeath and Schreiber 2000; Kusnezow et al. 2003). Auch die Verwendung von Glasträgern beschichtet mit Nitrozellulose oder Poly-L-Lysin bewirkt eine ungerichtete Immobilisierung der Proteine. Bei diesen beiden Oberflächenbeschichtungen werden die Proteine durch passive Adsorption an die Oberflächen gebunden (Stillman and Tonkinson 2000; Angenendt et al. 2002; Zhu et al. 2003; Charles et al. 2004; Kramer et al. 2004). Bei der Verwendung von Aminosilan-beschichteten Oberflächen erfolgt die Immobilisierung ebenfalls nicht-kovalent durch die Ausbildung von unspezifischen elektrostatischen Ionenbindungen zwischen negativ geladenen Aminosäureseitenketten (z. B. Glutamat oder Aspartat) des Proteins und den positiv geladenen primären Aminen der Oberfläche (Abb. 1.1.1). Abb. 1.1.1 Darstellung der nicht-kovalenten, elektrostatischen Bindung einer Peptidkette an eine Aminosilanoberfläche. Die negativ geladene Aminosäureseitenkette (COO-) eines Peptids/Proteins (R-) geht mit dem positiv geladenen primären Amin (+NH3) eine unspezifische elektrostatische Ionenbindung (Doppelpfeil) ein. Als Beispiel eines negativ geladenen Aminosäurerests wurde Glutamat (Glu) gewählt. Der Bereich der elektrostatischen Bindung ist umrandet. Aus (Müller and Röder 2004). 11 Einleitung Protein Arrays Eine kovalente Alternative der Bindung von Proteinen an „aktivierte“ Glasobjektträger ist die Verwendung von Aldehyd-beschichteten Oberflächen. Zwischen den reaktiven Aldehyden (R-HC=O) der Oberfläche und primären Aminen (R-NH2) der Aminosäureseitenketten des Proteins kommt es durch nukleophile Addition unter Wasserabspaltung (Kondensation) zur Ausbildung von kovalenten C=N Doppelbindungen, die auch als „Schiff’sche Basen“ bezeichnet werden (Abb. 1.1.2). Abb. 1.1.2 Bildung der ‚Schiff’schen Basen’ durch Kondensation zwischen Protein und Aldehydoberfläche. (A) Reaktive Aldehydgruppen der Oberfläche interagieren mit den primären Aminen (-NH2) der Peptide/Proteine. (B) Zwischen dem primären Amin einer Arginin-Seitenkette (Arg) und der Aldehydgruppe (R-HC=O) kommt es zu einer nukleophilen Addition unter Abspaltung von Wasser (H2O). (C) Dadurch entsteht eine kovalente Verbindung (Schiff’sche Base). Aus (Müller and Röder 2004). Die Kondensation findet ohne zusätzliche Energie oder Katalysatoren statt. Ein Vorteil gegenüber den Aminosilanoberflächen besteht neben der kovalenten Bindung darin, dass die Aldehydoberfläche hydrophob ist, wodurch sich die wässrige Proteinlösung nach dem Auftragen nicht so stark ausbreitet und somit wesentlich kleinere Spots erzeugt werden können. Eine dritte Möglichkeit zur Immobilisierung von Proteinen besteht in der Verwendung von Epoxy-modifizierten Glasobjektträgern (Abb. 1.1.3). Epoxy-Ringstrukturen sind sehr reaktive elektrophile Gruppen, welche ebenfalls kovalente Bindungen mit nukleophilen primären Aminen der Proteine ausbilden. Abb. 1.1.3 Bindung von Peptiden und Proteinen an reaktive Epoxyoberflächen. Das positiv geladene primäre Amin (+NH3) einer Aminosäure (Arg) ‚attackiert’ mit einer nukleophilen Addition das CH2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur. Die kovalente Bindung zwischen dem Sauerstoffatom und dem CH2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur wird aufgelöst und es entsteht eine kovalente Bindung zwischen dem Peptid/Protein und der Oberfläche. Aus (Müller and Röder 2004). 12 Einleitung Protein Arrays Dabei wird die kovalente Bindung zwischen dem Sauerstoffatom und dem CH2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur durch nukleophile Addition des positiv geladenen primären Amins aufgelöst. In der Folge entsteht eine kovalente Bindung zwischen dem Stickstoffatom des Proteins und dem Kohlenstoffatom der CH2-Gruppe der Oberfläche. 1.1.2 Detektion der gebundenen Probe Abhängig vom Typ des verwendeten Arrays gibt es viele verschiedene Detektionsmöglichkeiten der gebundenen Probe. So können zum Beispiel Enzym-Substrat Interaktionen mittels Fluoreszenzmarkierung, Chemilumineszenz oder radioaktiver Markierung detektiert werden. Im Allgemeinen wird derzeit die Fluoreszenzmarkierung für Hochdurchsatzanalysen bevorzugt angewendet, da sie mit den gegenwärtig gängigen Modellen von DNA Array-Laserscannern kompatibel ist (Bertone and Snyder 2005). Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von affinitäts- oder photochemisch-markierten Proben (Colca and Harrigan 2004; Mitsopoulos et al. 2004). Ein Beispiel für die Verwendung von affinitätsmarkierten Proben sind die Interaktionsstudien von Huang et al. aus dem Jahr 2004. Ziel dieser Untersuchungen war es, neue chemische Substanzen zu identifizieren, welche den antiproliferativen Effekt von Rapamycin sowohl verstärkend als auch inhibierend modulieren und somit Einfluss auf das target of rapamycin (TOR)-Signalnetzwerk haben. Hierzu wurde ein Hefeproteom Array mit Biotin-markierten chemischen Substanzen inkubiert. Im Anschluss wurden die gebundenen biotinylierten Moleküle mittels Cy3-markiertem Streptavidin nachgewiesen (Huang et al. 2004). Auf gleiche Weise können auch Protein-Protein Interaktionen detektiert werden. Hierzu wird die Proteinprobe vor der Inkubation mit dem Array biotinyliert. Nach der Beprobung des Arrays mit der biotinylierten Proteinprobe wird der Array nach einem Waschschritt mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin inkubiert. Die Bindung des Fluorophor-konjugierten Streptavidins an die gebundenen biotinylierten Proteine ermöglicht somit die Detektion der spezifischen Interaktion mittels eines Mikroarray-Laserscanners. Bei dieser Beprobungsform sollte allerdings sichergestellt werden, dass die Biotinmarkierung der Probe nicht die ProteinProtein Interaktionsdomäne maskiert. Ein wesentlich einfacheres Verfahren besteht darin, dass die zur Beprobung verwendeten Proteine direkt mit einem Fluorophor markiert werden. Die direkte Markierung von Proteinen wird durch die Verwendung von aminreaktiven Farbstoffen gewährleistet. Diese 13 Einleitung Protein Arrays Succinimidylester reagieren mit primären Aminen der Proteine und bilden stabile Konjugate. Um ungebundenen Farbstoff zu entfernen, werden die fluoreszenzmarkierten Proteine dialysiert oder durch Größenausschlußchromatografie aufgereinigt. Auch bei der Beprobung mit direkt markierten Proben erfolgt die Detektion der gebundenen Probe mittels eines Mikroarry-Laserscanners. Ebenso wie bei der Biotinmarkierung ist auch in diesem Fall darauf zu achten, dass der gebundene Fluoreszenzfarbstoff keinen Effekt auf die Protein-Protein Interaktion hat. Neben den bisher beschriebenen Beprobungsmöglichkeiten mit chemischen Substanzen und Proteinen können auch andere Substanzen zur Beprobung eines Protein Arrays verwendet werden, um unterschiedliche molekulare Interaktionen zu untersuchen. Ein Beispiel hierfür sind Untersuchungen zu molekularen Interaktionen zwischen Proteinen und DNA. Bei diesen Versuchsansätzen wird der Protein Array mit fluoreszenzmarkierter DNA beprobt. Dafür wurde die DNA zuvor entweder durch Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden während DNA-Synthese oder durch die Konjugation von aminreaktiven Succinimidylestern an 5-(3-aminoallyl)-dUTPs markiert (Bertone and Snyder 2005). 1.1.3 Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays Mittels Protein Arrays ist es möglich tausende von Proteinen gleichzeitig hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften zu charakterisieren und zu quantifizieren. Protein Arrays werden nicht nur zur Funktionsaufklärung von bislang uncharakterisierten Proteinen genutzt, sondern auch zur Analyse der Funktion bereits bekannter Proteine. Abb. 1.1.4 Anwendungsmöglichkeiten für funktionelle Protein Arrays. Unterschiedliche Beprobungsmöglichkeiten von Protein Arrays. Die Proteine wurden auf sehr kleinem Raum auf beschichteten Mikroskopobjektträgern immobilisiert. Im Anschluss erfolgte die Inkubation des Objektträgers mit fluoreszenzmarktierter Probe. Neben dem hier als Beispiel aufgeführten Fluorophor Cy5 gibt es noch eine große Anzahl anderer Fluorophore, die zur Detektion verwendet werden können. Modifiziert aus (Hall et al. 2007). 14 Einleitung Protein Arrays Protein Arrays finden bereits bei der Aufklärung verschiedenster Fragestellungen Anwendung. Beispiele hierfür sind Untersuchungen auf den Gebieten der Protein-Protein Interaktionen des Hefeproteoms (Zhu et al. 2001), der Protein-Rezeptor Interaktionen, der Protein-DNA Interaktionen (Hall et al. 2004), der Protein-Lipid Interaktionen (Zhu et al. 2001), der Antigen-Antikörper Interaktionen (Michaud et al. 2003) und Interaktionen zwischen Proteinen und chemischen Substanzen (Abb. 1.1.4) (Huang et al. 2004). Weitere Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays sind die Untersuchung von Kinaseaktivitäten (Zhu et al. 2000; Ptacek et al. 2005) oder die Charakterisierung verschiedener humaner Seren hinsichtlich ihrer Antikörperzusammensetzung (Zhu et al. 2006). 15 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen 1.2 Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Die Weiterleitung eines Signals innerhalb der Zelle ist ein sehr komplexer Prozess, an dessen Ende unterschiedliche zelluläre Reaktionen wie zum Beispiel Gentranskription, Proteintransport, Proteindegradation, Zellwachstum, Zellmotilität oder Immunantwort stehen. Um die temporäre, reversible und dynamische Regulation von intrazellulären Signalwegen zu gewährleisten, ist eine Vielzahl fundamentalen Komponenten der unterschiedlicher intrazellulären Mechanismen Signalleitung notwendig. sind Proteine Die und niedermolekulare Stoffe (z. B. die second messenger Ca2+ oder Diacylglycerol). Wenn ein Signal die Zelle erreicht, wird es über einen Rezeptor an nachgeschaltete Proteine weitergegeben. Diesen Proteinen sind wiederum weitere Proteine als nachgeschaltete Effektoren in der Reaktionskette zugeordnet. Auf diesem Weg werden nacheinander viele verschiedene Signalproteine in die Weitergabe eines Signals einbezogen, wodurch sich eine intrazelluläre Signalkette ausbildet. Die wichtigsten Proteinkomponenten der intrazellulären Signalleitung sind Proteinkinasen, Proteinphosphatasen, regulatorische GTPasen sowie Adapter- und Gerüstproteine. Die regulatorischen GTPasen haben die Funktion eines Schalters. Dieser kann in einer aktiven oder inaktiven Form vorliegen. In ihrer aktiven Form können GTPasen Signale an nachgeschaltete Komponenten des Signalwegs weitergeben. In der inaktiven Form ist die Weiterleitung des Signals unterbunden. Die Adapter- und Gerüstproteine vermitteln die Weiterleitung eines Signals zwischen einzelnen Proteinen eines Signalweges. Indem sie die einzelnen Signalproteine der Signalkette in eine nahe räumliche Beziehung bringen, wird eine effektive und spezifische Signalübertragung gewährleistet. Das zentrale Werkzeug zur Weitergabe von Signalen innerhalb einer Zelle stellt jedoch die Proteinphosphorylierung durch Proteinkinasen dar. Der Phosphorylierungsstatus eines Proteins wird durch das Zusammenspiel von Proteinkinasen und Phosphatasen reguliert. Die enzymatischen Prozesse der Phosphorylierung und Dephosphorylierung ermöglichen es, Proteine in reversibler Weise zu aktivieren oder zu inaktivieren. Sowohl Proteinkinasen als auch Proteinphosphatasen sind elementare Bestandteile von Signalwegen. Ihre Aktivität kann auf unterschiedlichste Weise reguliert werden. 16 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen 1.2.1 Proteinkinasen Die Phosphorylierung von Proteinen durch Kinasen ist ein wichtiger Mechanismus in der intrazellulären Signalweiterleitung und reguliert dadurch die verschiedensten zellulären Prozesse. Im menschlichen Genom finden sich circa 600 Gene, welche für Proteinkinasen kodieren, so dass diese Enzymgruppe alleine etwa 2,5 % aller Gene umfasst (Lander et al. 2001). Proteinkinasen werden hinsichtlich ihrer Substratspezifität in drei Familien eingeteilt: Serin-Threonin-Kinasen – verestern einen Phosphatrest mit der alkoholischen Gruppe von Serin- oder Threoninresten Tyrosinkinasen – erzeugen einen Phosphatester mit der phenolischen Hydroxyl (OH)Gruppe von Tyrosinresten Bispezifische Kinasen – phosphorylieren sowohl Serin-/Threoninreste als auch Tyrosinreste (z. B. die Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase, kurz MAPKK oder MEK). Sämtliche Proteinkinasen besitzen eine konservierte katalytische Domäne, welche für den Transfer des -Phosphats von Adenosintriphosphat (ATP) auf Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste des Substratproteins verantwortlich ist. Anhand von Homologiebetrachtungen lässt sich in allen Kinasefamilien ein circa 300 Aminosäuren langer hoch konservierter Abschnitt identifizieren. Im Gegensatz dazu sind die an den homologen Bereich angrenzenden N- und C-terminalen Abschnitte nicht konserviert und in den einzelnen Familien sehr unterschiedlich. Alle Mitglieder der verschiedenen Kinasefamilien haben das gleiche Faltungsmuster wie die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) – eine Serin-Threonin-Kinase und die erste Kinase, die kristallisiert wurde (Knighton et al. 1991). Die katalytische Domäne ist in 12 hoch konservierte Subdomänen unterteilt und hat eine globuläre zweiflüglige Struktur, bestehend aus einem kleinen N-terminalen Flügel und einem größeren C-terminalen Flügel (Abb. 1.2.1). Beide Flügel sind durch einen Peptidabschnitt, der wie ein Scharnier fungiert, verbunden. Der kleine N-terminale Flügel besteht aus einem fünfsträngigen antiparallelem -Faltblatt und (bei den meisten Kinasen) aus einer einzelnen -Helix, der so genannten C-Helix. Diese Nomenklatur ist begründet in der Struktur der PKA, deren N-terminaler Flügel drei -Helices enthält (A-, B- und C-Helix), wovon die C-Helix diejenige ist, welche in allen Proteinkinasen konserviert ist. Der große C-terminale Flügel ist hauptsächlich -helikaler Struktur und 17 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen verantwortlich für die Bindung des zu phosphorylierenden Peptidabschnittes sowie für die Phosphotransferreaktion. Abb. 1.2.1 Struktureller Aufbau der katalytischen Domäne einer Proteinkinase. Repräsentative Bänderdarstellung einer katalytischen Kinasedomäne, basierend auf der Struktur der InsulinrezeptorTyrosinkinase. Der N-terminale Flügel ist in grün dargestellt, der Cterminale Flügel in lila. Die aktivierende Schleife ist gelb gefärbt. Das Substratpeptid, welches mit der Aktivierungsschleife interagiert, ist schwarz dargestellt. Das mit dem N-terminalen Flügel assoziierende ATP-Analog ist rot-blau gefärbt. Die C-Helix (enthält für die Katalyse wichtige Aminosäurereste) und die G-Helix (beteiligt an der Substratbindung) sind durch Beschriftung gekennzeichnet. Modifiziert aus (Pellicena and Kuriyan 2006). Die Bindestelle für das Nukleotidsubstrat ATP befindet sich im N-terminalen Flügel. Durch die Bindung von ATP und Peptid kommen sich N- und C-terminaler Flügel räumlich näher und die Oberfläche beider Flügel formt ein aktives Zentrum. Die Hauptkomponenten dieses aktiven Zentrums sind die Phosphat-bindende Schleife (P-Schleife) des N-terminalen Flügels sowie die katalytische (C-) Schleife und die Aktivierungsschleife (A-), beides Bestandteile des C-terminalen Flügels (Knighton et al. 1991). Die Fixierung des ATP erfolgt über die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen der - und -Phosphatgruppe des ATP und den Aminosäureseitenketten der Glycin-reichen Sequenz der P-Schleife. Für die PhosphotransferReaktion ist es wichtig, dass die drei Phosphatgruppen des ATP linear angeordnet sind – dies wird durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen Mg2+-Ionen und dem - sowie dem -Phosphat gewährleistet. Durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen einem konservierten Lysinrest des N-terminalen Flügels und dem - und -Phosphat des ATP werden die negativen Ladungen dieser Phosphatgruppen neutralisiert. Für die Übertragung der -Phosphatgruppe des ATP auf das Substratprotein ist die C-Schleife von entscheidender Bedeutung. Sie enthält zwei konservierte Aminosäurereste – einen Aspartatrest, essentiell für die Phosphotransfer-Reaktion, und einen basischen Aminosäurerest (Lysin oder Arginin), welcher die negative Ladung der -Phosphatgruppe neutralisiert und somit einen nukleophilen Angriff durch das Substratprotein ermöglicht (Abb. 1.2.2). 18 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Abb. 1.2.2 Interaktionen zwischen dem katalytischen Teil der Proteinkinase, dem ATP und dem zu phosphorylierenden Substrat. (Aminosäurennummerierungen entsprechen der PKA) - Der rote Pfeil kennzeichnet den katalytischen Transfer des ATP-Phosphates auf die Hydroxylgruppe des Substratproteins. Für die Katalyse wichtige Aminosäurereste, die in Kontakt mit dem ATP oder Substrat stehen, sind gelb schraffiert. Sekundärstrukturen und Aminosäurereste, die an der Regulation der katalytischen Aktivität beteiligt sind, sind grau schattiert. Schwarze Doppelpfeile kennzeichnen hydrophobe Interaktionen. Die wichtigsten polaren Kontakte sind durch Punktlinien gekennzeichnet. Modifiziert aus (Kornev et al. 2006). Die Phosphorylierung von Aminosäureseitenketten durch Proteinkinasen ist die am weitesten verbreitete posttranslationale Proteinmodifikation zum Zweck der intrazellulären Signalweiterleitung sowie der Regulation von Enzymaktivitäten. In eukaryotischen Zellen stellen die Serin-Threonin-Kinasen die evolutionär älteste Proteinkinasefamilie dar. Die Enzymklasse der Tyrosinkinasen entstand vermutlich erst nach Verbreitung von Phosphotyrosin erkennenden Proteindomänen, wie Phosphotyrosinbinde (PTB) oder Src homology 2 (SH2) Domänen bzw. deren Vorläufern (Lim and Pawson 2010). Diese regulatorisch bedeutsamen Proteinkinasen haben eine zentrale Funktion bei Wachstums- und Differenzierungsvorgängen und werden im nachfolgenden Kapitel näher beschrieben. 1.2.1.1 Proteintyrosinkinasen Im humanen Genom finden sich circa 90 Gene, die für Proteintyrosinkinasen (PTKs) kodieren (Lim and Pawson 2010). Tyrosin-spezifische katalytische Domänen finden sich sowohl in Transmembranproteinen, den Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), als auch in zytoplasmatischen PTKs. Die RTKs sind integrale Membranproteine, welche auf der extrazellulären Seite eine Ligandenbindedomäne und auf der zytosolischen Seite eine Tyrosinkinase-Domäne besitzen. Der Proteinabschnitt, welcher die Membran durchquert, ist -helikaler Struktur. Im zytoplasmatische Abschnitt weisen die RTKs neben der konservierten Tyrosinkinase Domäne noch weitere regulatorische Sequenzabschnitte auf, an denen Autophosphorylierung sowie Phosphorylierung durch andere Proteinkinasen stattfinden kann. Von den 90 humanen PTKs gehören 58 zur Familie der RTKs (Manning et al. 2002). Die meisten RTKs werden durch die Bindung eines spezifischen Proteinliganden (z. B. Wachstumsfaktoren und Cytokine) an den 19 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen extrazellulären Teil aktiviert. Die Bindung des Liganden bewirkt die Oligomerisierung mehrerer RTK-Moleküle, gefolgt von der Aktivierung der katalytischen Domäne im zytoplasmatischen Abschnitt des Rezeptors. Diese Aktivierung erfolgt durch Transphosphorylierung von Tyrosinresten in der Aktivierungs (A)-Schleife der katalytischen Domäne. Durch die aktivierte Kinase können zytoplasmatische Proteine in die Nähe des Rezeptors rekrutiert und phosphoryliert werden. Die phosphorylierten Tyrosinreste des Rezeptors bzw. der zytoplasmatischen Proteine sind Bindungsstellen für Proteine mit spezifischen Bindedomänen für Phosphotyrosine. Diese transienten phosphorylierungsabhängigen Protein-Protein Interaktionen resultieren in der Ausbildung von Proteinkomplexen und/oder Aktivierung von Enzymen (Kinasen, Phosphatasen, Lipasen etc.) und ermöglicht somit die Transduktion extrazellulärer Signale durch die Plasmamembran in die Zelle. Im Gegensatz zu den RTKs besitzen die zytoplasmatischen PTKs keine Transmembrandomäne und liegen als lösliche intrazelluläre oder membranassoziierte Proteine vor. Diese zytoplasmatischen PTKs sind intrazelluläre Effektormoleküle, die während des Signalübertragungsprozesses mit spezifischen Substraten interagieren und diese durch Phosphorylierung von Tyrosinresten aktivieren, wodurch die Weitergabe des Signals gewährleistet wird. Viele Funktionen dieser zytoplasmatischen PTKs werden oft in unmittelbarer Nähe zur Zellmembran ausgeführt. Beispiele hierfür sind die Weiterleitung eines Signals von einem aktivierten membranständigen Rezeptor oder die Weitergabe eines Signals von einem membranassoziierten Protein. Aufgrund von Sequenzhomologien bzw. phylogenetischer Analysen werden die 32 humanen zytoplasmatischen PTKs in zehn Unterfamilien (Abl, Ack, Csk, FAK, Fes, Frk, Jak, Src, Tec und Syk) eingeteilt (Robinson et al. 2000). Die verwandten Enzyme innerhalb einer Familie ähneln sich in ihrem Aufbau und ihrer Substratspezifität, zeigen allerdings oft unterschiedliche Aktivitäts- oder Expressionsmuster. 1.2.1.1.1 Die Fokale Adhäsionskinase Die Fokale Adhäsinonskinase (FAK) gehört zur Familie der zytoplasmatischen PTKs, lokalisiert an Integrin-reichen Fokalkontakten und ist durch eine starke Tyrosinphosphorylierung gekennzeichnet (Hanks et al. 1992; Schaller et al. 1992). Als wichtiges Signalprotein ist sie an der Integrin- und Wachstumsfaktorrezeptor-vermittelten Signaltransduktion beteiligt (Hanks and Polte 1997). Die durch die FAK regulierten 20 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Signalwege sind die zellulären Prozesse der Zellmigration (Cary et al. 1996; Hauck et al. 2001), Zelladhäsion (Frisch et al. 1996; Michael et al. 2009), Invasion (Hauck et al. 2001; Chan et al. 2009), Proliferation (Gilmore and Romer 1996; Pirone et al. 2006) sowie Prozesse zur Verhinderung der Apoptose (Frisch et al. 1996; Kurenova et al. 2004; Garces et al. 2006). Die FAK ist evolutionär stark konserviert und wird ubiquitär in fast jedem Zelltyp eines multizellulären Organismus, wie beispielsweise Mensch (Weiner et al. 1993), Maus (Hanks et al. 1992), Huhn (Schaller et al. 1992) oder Drosophila melanogaster (Palmer et al. 1999) exprimiert. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass in einer Vielzahl humaner Krebsarten, wie beispielsweise Brust- oder Darmkrebs, eine gesteigerte FAK-Aktivität bzw. FAK-Expression nachweisbar war (Cance et al. 2000; Yu et al. 2006; Chatzizacharias et al. 2008). Die FAK kann auf Grund von Sequenz- und Strukturanalysen in vier verschiedene Domänen unterteilt werden – eine N-terminale FERM (Band 4.1, Ezrin, Radixin und Moesin)Homologie Domäne, eine zentral lokalisierte Kinasedomäne, drei Prolin-reiche Regionen (zwei in der C-terminalen Hälfte des Moleküls und eine in der N-terminalen Hälfte) und eine C-terminale focal adhesion targeting (FAT) Domäne (Abb. 1.2.3) (Schaller et al. 1992; Hanks et al. 2003; Mitra et al. 2005). Abb. 1.2.3 Domänenstruktur und Phosphorylierungsstellen der Fokalen Adhäsionskinase. FAK beinhaltet eine FERM (Band 4.1, Ezrin, Radixin und Moesin)Homologie Domäne, eine Kinasedomäne und eine FAT (focal adhesion targeting) Domäne. Die FERM-Homologie Domäne vermittelt Interaktionen mit dem EGF- und PDGF-Rezeptor, der ETK Tyrosinkinase und Ezrin. Weiterhin kann die FERM-Homologie Domäne über das Lysin K152 SUMO (small ubiquitin-related modifier)-yliert werden. Die FAT Domäne rekrutiert FAK zu den Fokalkontakten und bindet indirekt über Talin und Paxillin an Integrine. Außerdem ist diese Domäne für die verbesserte Aktivität von Rho-GTPasen verantwortlich, da sie GEFs wie p190RhoGEF bindet und deren GDP/GTPAustauschaktivität erhöht. FAK beinhaltet drei Prolin-reiche Regionen (PRR1 – 3), an welche Proteine mit SH3 Domänen (z. B. p130Cas, GRAF, ASAP1) binden können. Phosphoylierbare (P) Tyrosinreste innerhalb der FAK-Struktur sind die Tyr397, Tyr407, Tyr576, Tyr577, Tyr861 und Tyr925. Diese Phosphotyrosine (pTyr) dienen als Bindestellen für Proteine mit SH2 Domänen (pTyr397: Grb7, Shc, PLCγ, p85 der PI3K, Src, SOCS; pTyr925: Grb2). Die Phosphorylierung von Tyr576 und Tyr577 ist nötig für die maximale Aktivierung der FAK. Im Gegensatz dazu wird die FAK-Aktivität durch die Bindung des Proteins FIP200 (FAK-family interacting protein of 200 kDa) an die Kinasedomäne inhibiert. Modifiziert aus (Mitra et al. 2005). Die N-terminale FERM-Homologie Domäne ist verantwortlich für die Interaktion von FAK mit Integrin- und Wachstumsfaktorrezeptoren. Auch wird vermutet, dass die FERMHomologie Domäne eine Rolle bei der Regulation der Kinaseaktivität von FAK spielt. 21 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Werden Zellen unter Bedingungen kultiviert, bei denen FAK in inaktiver Form vorliegt (z. B. Nicht-Tumorzellen, die in Suspension gehalten werden), so interagiert die FERM-Homologie Domäne direkt mit der Kinasedomäne. Durch diese intramolekulare Interaktion wird die Autophosphorylierung des Tyr397 und somit die maximale FAK-Aktivierung inhibiert. In diesem Zusammenhang wird auf eine Funktion der FERM-Homologie Domäne als intramolekularer Inhibitor der FAK-Aktivität geschlossen (Cooper et al. 2003). An die FERM Domäne schließt sich die zentral gelegene Kinasedomäne an. Die Kinasedomäne besitzt Sequenzähnlichkeiten mit anderen RTKs und zytoplasmatischen PTKs, allerdings gibt es auch strukturelle Unterschiede. So zeigt die Kristallstruktur der FAK Kinasedomäne eine charakteristische Disulfidbrücke im N-terminalen Flügel. Diese Disulfidbrücke ist eher ungewöhnlich für Kinasen, aus diesem Grund wird vermutet, dass sie wahrscheinlich einen Einfluss auf die FAK-Aktivität hat (Nowakowski et al. 2002). Auch die für die FAK-Aktivität wichtige Autophosphorylierungsstelle Tyr397 befindet sich in der Kinasedomäne. In Folge von Integrin-Aktivierung kommt es zur Autophosphorylierung des Tyr397, welches dann als Bindestelle für die SH2 Domäne der Src-Kinase fungiert (Hanks et al. 1992; Ruest et al. 2000). Die Bindung von Src an FAK resultiert in einer gesteigerten SrcAktivität, was zu einer Src-vermittelten Phosphorylierung von Tyr576 und Tyr577 innerhalb der FAK-Kinasedomäne führt. Diese Phosphorylierungen sind essentiell für eine maximale Aktivität der FAK (Ruest et al. 2000). Zusätzlich zur Phosphorylierung der FAK-Tyrosinreste Tyr576 und Tyr577 kann Src noch weitere Tyrosinreste innerhalb des Moleküls phosphorylieren. Diese Phosphotyrosine dienen dann als Bindestellen für Proteine mit SH2 Domänen (Hanks et al. 2003; Parsons 2003). Weitere von Src phosphorylierte Tyrosine sind Tyr407, Tyr861 und Tyr925. Die meisten SH2 Domänen-abhängigen Interaktionen von FAK mit anderen Proteinen sind bisher nur für die Autophosphorylierungsstelle Tyr397 bekannt. SH2 Domänen enthaltende Proteine, die mit diesem Phosphotyrosin interagieren, sind z. B. Src, das Adapterprotein Shc, die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die Phospholipase C (PLC)-, das Adapterprotein Grb7 (Cox et al. 2006) und das Adapterprotein Nck2 (Goicoechea et al. 2002). Die ebenfalls von Src vermittelte Phosphorylierung des Tyr925 in FAK bietet eine Bindestelle für die SH2 Domäne des Adapterproteins Grb2, wodurch eine Verbindung zum ERK/MAP-Kinase Signalweg hergestellt wird (Schlaepfer et al. 1999). Die C-terminale Region von FAK beinhaltet zwei Prolin-reiche Abschnitte (Aminosäuren 712– 723 und 867–882), welche als Bindestelle für Proteine mit Src Homologie 3 (SH3) Domänen fungieren. FAK Interaktionspartner mit SH3 Domänen sind das Adapterprotein p130Cas 22 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen (Ruest et al. 2001), das Rho GTPase-aktivierende Protein (GAP) GRAF oder das Arf GAP ASAP1 (Taylor et al. 1999; Randazzo et al. 2000). Die C-terminal lokalisierte FAT Domäne enthält Bindestellen für die zytoskeletalen Proteine Talin und Paxillin, welche an der Rekrutierung von FAK in die Fokalkontakte beteiligt sind. In den Fokalkontakten sind Talin, Paxillin und FAK zusammen verantwortlich für die Verknüpfung der Integrine mit dem Zytoskelett (Parsons 2003). Ein weiteres Protein, welches mit der FAT Domäne von FAK interagiert, ist der RhoA-spezifische GDP/GTP Austauschfaktor p190RhoGEF. Die Interaktion von FAK und p190RhoGEF fördert die Phosphorylierung von p190RhoGEF und hat eine erhöhte RhoA Aktivität zur Folge (Zhai et al. 2003). 1.2.1.1.2 Die Familie der Src-Kinasen Mit acht Mitgliedern (Fgr, Fyn, Src, Yes, Blk, Hck, Lck und Lyn) ist die Familie der SrcKinasen die größte Unterfamilie innerhalb der zytoplasmatischen PTKs (Robinson et al. 2000). Diese Kinasen besitzen eine konservierte Domänenstruktur, welche sich aus einem Nterminalen Sequenzmotiv für die Membranlokalisation, einer Src Homologie 3 (SH3) Domäne, einer Src Homologie 2 (SH2) Domäne, einer Kinasedomäne und einem Cterminalen regulatorischen Domäne zusammensetzt (Abb. 1.2.4). Abb. 1.2.4 Domänenanordnung und dreidimensionale Sturktur der Src-Kinasen. Die Kinasedomäne enthält wichtige regulatorische phosphorylierbare Tyrosinreste. Diese befinden sich in der aktivierenden Schleife (Tyr416 in Src) und am Cterminalen Ende (Tyr527 in Src). Die Röntgenstruktur von Src in der inaktiven Konformation zeigt, dass das phosphorylierte Tyr527 des C-terminalen Endes mit der SH2 Domäne interagiert und dass die SH2-Kinase-Verbinungsregion in die SH3 Domäne bindet. Modifiziert aus (Bradshaw 2010). Die Aktivität der Src-Kinasen wird durch eine Vielzahl von Mechanismen reguliert. Beispielsweise wird die Inaktivierung der Kinaseaktivität durch mehrere intramolekulare Interaktionen gewährleistet. So kommt es nach Phosphorylierung des Tyrosinrests Tyr527 (durch die C-terminale Src Kinase, Csk) zur intramolekularen Interaktion der SH2 Domäne mit dem pTyr527, wodurch die Kinase in einer inaktiven Konformation gehalten wird. Des Weiteren führt auch die intramolekulare Interaktion zwischen SH3 Domäne und der Prolin23 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen reichen Sequenz in der Verbindungssequenz von SH2 und Kinase Domäne zu einer Proteinkonformation, in der die Kinaseaktivität inhibiert ist. Werden diese intramolekularen Interaktionen aufgehoben, kommt es zu einem Anstieg in der Kinaseaktivität. Die Bindung der SH3 Domäne an die Prolin-reiche Sequenz eines anderen Proteins (Moarefi et al. 1997), die Dephosphorylierung des Tyr527 und die damit verbundene Aufhebung der SH2-pTyr527 Interaktion (Roskoski 2004) sowie die Phosphorylierung des Tyrosinrestes Tyr419 in der Aktivierungs (A)-Schleife der Kinasedomäne (Cooper and Howell 1993) führt zu einer stufenweisen Erhöhung der Kinaseaktivität (Abb. 1.2.5). Durch Einzeluntersuchung dieser Aktivierungsschritte konnte gezeigt werden, dass für eine vollständige Aktivierung der Kinase alle diese Stimuli vorhanden sein müssen (Moarefi et al. 1997). Abb. 1.2.5 Modell der gestaffelten Aktivierung von Src-Kinasen. Für die vollständige Aktivierung der SrcKinasen sind verschiedene aufeinander folgende Schritte nötig (von links nach rechts): Dephosphorylierung des C-terminalen Endes durch Protein-Tyrosin-Phosphatase (PPtase), Phosphorylierung der Aktivierungsschleife, Bindung eines Liganden in die SH2 Domäne und Bindung eines Liganden in die SH3 Domäne. Jeder einzelne dieser Schritte führt zu einer höheren Ebene der Src-Kinaseaktivität. Modifiziert aus (Bradshaw 2010). Die Src-Kinasen sind durch einen N-terminalen Myristinsäurerest in der Plasmamembran verankert und können somit auch als katalytische Untereinheit für Transmembranrezeptoren fungieren, die selbst keine eigene Kinasedomäne besitzen. Diese rezeptorassoziierten PTKs werden in gleicher Weise wie die RTKs durch Liganden-induzierte Oligomerisierung oder Konformationsänderung der Rezeptoren aktiviert. Vor allem in Signalwegen des Immunsystems spielen solche rezeptorassoziierten PTKs eine wichtige Rolle. So ist beispielsweise die Src-Kinase Lyn an Signaltransduktionsprozessen des B-Zellrezeptors beteiligt (Gauld and Cambier 2004) während Lck und Fyn wichtige Src-Kinasen des TZellrezeptor vermittelten Signalweges sind (Palacios and Weiss 2004). Auch bei der Rezeptor-vermittelten Phagozytose durch CEACAM3 (siehe Kapitel 1.3.2.1) spielen Src24 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Kinasen eine wichtige Rolle, indem sie Tyrosinreste in der ITAM-ähnlichen Sequenz des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 phosphorylieren und somit die Signalkaskade für die Aufnahme pathogener Bakterien initiieren (Schmitter et al. 2007b). 1.2.2 Tyrosinphosphorylierung von Proteinen Die Phosphorylierung von Proteinen ermöglicht eine robuste Signalgebung und Signalweiterleitung und ist somit maßgeblich an der Ausbildung und Aufrechterhaltung wichtiger zellulärer Prozesse beteiligt. Zum einen dienen die phosphorylierten Aminosäurereste von Proteinen als Bindestelle für andere Proteine mit spezifischen Interaktionsdomänen. Zum anderen kann aber auch die Aktivität von Enzymen durch Phosphorylierung reguliert werden (Krebs and Beavo 1979). Der Übertrag eines Phosphatrestes auf ein Protein verändert signifikant dessen Ladung und Struktur, so dass das Signal leicht erkannt und verarbeitet werden kann. Die Veresterung eines energiereichen Phosphates und eines Alkohols ist zudem eine leicht ablaufende Reaktion und bildet eine robuste, aber reversible Bindung. Während die Phosphorylierung von Proteinen an Serin- und Threoninresten bereits in den 1950er Jahren als regulierender, physiologischer Mechanismus entdeckt wurde (Fischer and Krebs 1955), dauerte es noch weitere 25 Jahre, bis auch die Phosphorylierung von Tyrosinresten als eine wichtige posttranslationale Modifikation von Proteinen identifiziert wurde (Eckhart et al. 1979). Der Hauptgrund, warum tyrosinphosphorylierte Protein erst so spät entdeckt wurden, ist vermutlich damit zu begründen, dass die Menge von tyrosinphosphorylierten Proteinen nur einen sehr geringen Anteil an der Gesamtmenge der zellulären Phosphoproteine ausmacht. In einer menschlichen Zelle entspricht der Anteil an Serin- und Threoninphosphorylierungen circa 86,4 % und 11,8 %, wohingegen der Anteil an Tyrosinphosphorylierungen lediglich 1,8 % beträgt (Olsen et al. 2006). Genau wie die zeitlichen Unterschiede bei der Entdeckung von Serin-Threonin- und Tyrosin- phosphorylierungen gab es auch Unterschiede bei der zeitlichen Entstehung dieser posttranslationalen Modifikationen. Ursprünglich wurden Serin- und Threoninreste durch Phosphorylierung ihrer freien Hydroxylgruppe modifiziert. Diese Art der Phosphorylierung findet sich bereits in den primitivsten Organismen (Prokaryoten). Erst später entstand die Phosphorylierung von Tyrosinresten, zunächst durch ungerichtete Enzymaktivität von SerinThreonin-Kinasen (Lim and Pawson 2010). Zu diesem Zeitpunkt konnten die Tyrosinphosphorylierung bereits durch Phosphatasen beseitigt werden, da sie auf dieser Stufe noch 25 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen keinen signalgebenden Effekt entfalten konnte. Erst durch die Entstehung spezifischer pTyr Bindedomänen (z. B. SH2 und PTB Domänen) wurde die Tyrosinphosphorylierung zu einem nützlichen Werkzeug der Signalweiterleitung. Die rasante Entstehung und Radiation der PTKs lässt darauf schließen, dass die Tyrosinphosphorylierung bzw. ihre Nutzung als Signal ein durchschlagender Erfolg war. 1.2.3 SH2 Domänen – wichtige Interaktionsdomänen in der zellulären Signalweiterleitung Die Interaktion von Signalproteinen mit einem Phosphotyrosinprotein ist abhängig von ganz bestimmten Interaktionsdomänen, welche spezifisch phosphorylierte Tyrosinreste erkennen. Diese speziellen Bindedomänen sind die so genannten SH2 und Phosphotyrosinbinde (PTB) Domänen. Während die PTB Domänen auch auch konstitutiv und mit hoher Affinität an ihre unphosphorylierten Zielproteine binden, sind die auf SH2 Domänen basierenden ProteinProtein Interaktionen von Tyrosinphosphorylierungsprozessen abhängig (Schlessinger and Lemmon 2003). Die Abkürzung SH2 steht für Src Homologie 2 und ist abgeleitet von der membranassoziierten PTK Src, welche in mutierter Form als Onkoprotein im Sarkomavirus des Huhnes gefunden wurde. Diese Src-Kinase besitzt bestimmte Aminosäuresequenzen, welche in homologer Form auch in vielen anderen Signaltransduktionsproteinen gefunden wurde. Diese homologen Src Domänen sind: SH1, eine Domäne, welche die Kinasedomäne von Src umfasst SH2, eine Protein-Protein Interaktionsdomäne, welche mit Aminosäuresequenzen interagiert, die einen phosphorylierten Tyrosinrest besitzen SH3, eine Protein-Protein Interaktionsdomäne, die mit Prolin-reichen Sequenzen der Abfolge -Pro-X-X-Pro- interagieren. Während mittlerweile über 200 verschiedene SH3 Domänen identifiziert werden konnten, sind bisher nur knapp über 100 verschiedene SH2 Domänen bekannt. SH2 Domänen sind kompakte, circa 100 Aminosäuren umfassende, regulatorische ProteinProtein Interaktionsmodule der intrazellulären Signaltransduktionskette. Sie binden mit hoher Selektivität und Affinität an phosphorylierte Tyrosinreste in Proteinen und steuern dadurch die transiente und selektive Assoziation von intrazellulären Signalkomplexen in mehrzelligen Lebewesen (Pawson et al. 2001). Die Spezifität von SH2 Domänen wird nicht nur durch den 26 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen phosphorylierten Tyrosinrest bestimmt, sondern auch durch den Aminosäurekontext welcher das Phosphotyrosin umgibt. Somit erkennen SH2 Domänen in der Regel nur ein begrenztes Spektrum an Phosphotyrosin-modifizierten Proteinen (Bradshaw and Waksman 2002). 1.2.3.1 Struktur und Bindungseigenschaften von SH2 Domänen Alle SH2 Domänen bestehen aus einem großen zentralen antiparallelen β-Faltblatt (bestehend aus drei bis vier β-Strängen), welches von zwei kurzen α-Helices flankiert wird. Der strukturelle Aufbau folgt dem Muster β-α-β-β-β-β-β-α-β (Abb. 1.2.6). Abb. 1.2.6 Struktureller Aufbau der Src-Kinase SH2 Domäne. Strukturen von acht verschiedenen SH2Phosphopeptide-Komplexen, dargestellt als Überlagerung (mittels Programm „O“). Der für die Überlagerung verwendete Referenzpunkt war die Region vom Anfang des βA-Strangs bis zum Ende des αA-Strangs. Die verwendeten Strukturen waren die SH2 Domänen von Src, Lck, C-terminale p85 SH2 (PI3KR1-C), C-terminale PLC1 SH2 (PLCG1-C), Fyn, Grb2, SAP, N-terminale SH2 von Syp. Modifiziert aus (Schlessinger and Lemmon 2003). Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeiten aller SH2 Domänen wurde eine allgemeine Nomenklatur zur Kennzeichnung der β-Stränge und α-Helices eingeführt (Eck et al. 1993). Die β-Stränge werden mit βA bis βG gekennzeichnet, die α-Helices mit αA und αB. Der phosphorylierte Tyrosinrest bindet in eine konservierte, positiv geladene Bindetasche auf der SH2 Domäne. Durch Größe/Tiefe und Struktur ist diese Bindetasche für kürzere Seitenketten, wie Phosphoserine und –threonine, nicht zugänglich, wodurch die Spezifität der SH2 Domäne für phosphorylierte Tyrosine gewährleistet wird (Waksman et al. 1992; Lee et al. 1994). Die Interaktion zwischen Phosphotyrosin und SH2 Bindetasche wird durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen dem Phosphatrest und dem invariablen Arginin im βB-Strang des zentralen β-Faltblattes hergestellt. Gleichzeitig vermitteln die Schleifen zwischen βE und βF (EF) sowie zwischen αB und βG (BG) die Interaktion mit spezifischen Aminosäuresequenzen, die zwei bis sechs Reste C-terminal vom Phosphotyrosin liegen. Aufgrund der individuellen Aminosäureabfolge verschiedener SH2 Domänen wird somit die Erkennung unterschiedlicher Phosphotyrosinsequenzen ermöglicht. Dadurch wird eine hohe Bindespezifität von verschiedenen SH2 Domänen für unterschiedliche Phosphotyrosinsequenzen gewährleistet (Shoelson 1997; Pawson et al. 2001). So bindet zum Beispiel die 27 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen SH2 Domäne der Src-Kinase bevorzugt an ein Sequenzmotiv mit geladenen Aminosäureresten an den Positionen +1 und +2 und einem hydrophoben Rest an Position +3 C-terminal vom Phosphotyrosin (pYEEI) (Kuriyan and Cowburn 1997; Shoelson 1997; Pawson et al. 2001). Im Gegensatz dazu interagieren die beiden SH2 Domänen der Phospholipase Cγ mit aliphatischen Resten an den Positionen +1 bis +5 C-terminal des Phosphotyrosins (Pascal et al. 1994). Zusätzlich zur Bindungsspezifität ist das Sequenzmotiv, C-terminal vom Phosphotyrosin, auch für die Bindungsaffinität der SH2 Domäne mit der Phosphotyrosinsequenz verantwortlich. Individuelle SH2 Domänen binden ihre spezifischen Sequenzmotive typischerweise mit einer Dissoziationskonstante im Bereich von 0,2 bis 1µM (Domchek et al. 1992; Piccione et al. 1993; Case et al. 1994; Ladbury et al. 1995). Im Gegensatz dazu weisen SH2 Domänen eine 20- bis 50-fach niedrigere Affinität zu rein zufällig gewählten tyrosinphosphorylierten Sequenzmotiven auf (Shoelson 1997; Maina et al. 2001). Ergänzend dazu zeigten Ottinger et al., dass Proteine mit zwei SH2 Domänen in Folge (Tandem) eine stark erhöhte Bindungsaffinität und –spezifität zu ihren zweifach tyrosinphosphorylierten Bindungspartnern haben (Kd = 0,5–3 nM), verglichen mit einfachen Interaktionen (Kd = 0,2–1 µM). So binden zum Beispiel die Tandem SH2 Domänen der ZAP-70 PTK sehr viel stärker an das spezifische Sequenzmotiv pYxxLx6-8pYxxL der ε- und ζ-Ketten des TZell-Rezeptors als die untersuchten Einzel-SH2 Domänen (Ottinger et al. 1998). 1.2.3.2 Proteinfamilien mit SH2 Domänen Es gibt sehr viele verschiedene Proteinfamilien mit SH2 Domänen, die an den unterschiedlichsten zellulären Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind (Abb. 1.2.7). Im Folgenden sollen einige dieser Familien näher beschrieben werden. Enzyme Viele verschiedene Enzyme (z. B. Kinase, Phosphatasen, Phospholipasen) besitzen eine oder zwei SH2 Domänen. Zusätzlich dazu weisen diese Proteine meist auch noch andere ProteinProtein oder Protein-Lipid Interaktionsdomänen, wie z. B. SH3 oder Pleckstrin homology (PH) Domänen, auf. Bekannte Vertreter hierfür sind Proteintyrosinkinasen (z. B. Src, Btk, ZAP-70), Proteintyrosinphosphatasen (z. B. PTPN6/Shp-1 und PTPN11/Shp-2), die Phospholipase-Cγ (PLC-γ) und das Ras-GTPase aktivierende Protein (RASA1/p120GAP). So führt zum Beispiel die Bindung der PLC-γ SH2 Domäne an den autophosphorylierten EGF28 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen oder FGF-Rezeptor zur Translokation der PLC-γ an die Plasmamembran. Die räumliche Nähe der Phospholipase zu ihrem Substrat, dem Membranbestandteil Phosphatidylinositol-4,5bisphosphat (PI(4,5)P2) ermöglicht somit die Synthese der second messenger Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3). Abb. 1.2.7 Proteinfamilien mit SH2 Domänen. Klassifizierung und Domänenanordnung der 110 humanen SH2 Domänen besitzenden Proteine. Modifiziert aus (Liu et al. 2006). 29 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Im Bezug auf die FGF-abhängige Aktivierung der PLC-γ und die damit verbundene second messenger Produktion konnten Mohammadi et al. zeigen, dass dafür die Interaktion der PLC-γ SH2 Domäne mit dem phosphorylierten Tyr766 des FGF-Rezeptors unabdingbar ist (Mohammadi et al. 1992). In der Proteinfamilie der Kinasen sorgen die SH2 Domänen oft auch für intramolekulare autoinhibitorische Interaktionen und kontrollieren dadurch die enzymatische Aktivität dieser Proteine (Hubbard et al. 1998). Ein Beispiel dafür stellt die membranassoziierte PTK Src dar. Sowohl durch die SH2 als auch durch die SH3 Domäne wird die Src-Kinase in einer inaktiven autoinhibierten Konfiguration gehalten. Dabei bindet die SH2 Domäne an den phosphorylierten Tyr527-Rest im C-terminalen Abschnitt der Kinase. Gleichzeitig interagiert auch die SH3 Domäne mit dem PxxP-Motiv in der Verbindungsregion zwischen SH2 Domäne und Kinasedomäne (Sicheri et al. 1997; Xu et al. 1997). Durch diese intramolekularen Interaktionen und den damit verbundenen Konformationsänderungen sind die SH2 und SH3 Domänen sowohl für die Unterdrückung der Kinaseaktivität als auch für das Fernhalten dieser Interaktionsdomänen von exogenen Bindepartnern verantwortlich. Diese autoinhibierende Konformation kann durch verschiedene Mechanismen aufgebrochen werden, wodurch die Src-Kinase wieder aktiv wird. Diese Mechanismen sind die Dephosphorylierung des Tyr527 durch Tyrosinphosphatasen, sowie die Bindung von zellulären Proteinen, mit höherer Affinität für die SH2 und SH3 Domänen. Letzteres hat somit auch zur Folge, dass die Kinase in die Nähe ihres Substrats rekrutiert wird (Nakamoto et al. 1996; Schaller et al. 1999). Adapterproteine Eine weitere Proteinfamilie bilden, die so genannten Adapterproteine (z. B. Grb2, Nck und Crk). Sie bestehen aus einer einzelnen SH2 Domäne sowie mehreren SH3 Domänen und besitzen keinerlei intrinsische enzymatische Aktivität. Mitglieder dieser Proteinfamilie nutzen ihre SH2 und SH3 Domänen für die Ausbildung von Signalproteinkomplexen, welche die Weiterleitung eines Signals innerhalb der Zelle ermöglichen. Die Entstehung solcher Signalproteinkomplexe ist oft die Folge einer aktivierten Tyrosinkinaseaktivtät, welche durch extrazelluläre Stimuli induziert wird (Schlessinger and Ullrich 1992; Kuriyan and Cowburn 1997; Shoelson 1997; Pawson et al. 2001). Die Adapterproteine binden über ihre SH2 Domäne an tyrosinphosphorylierte Proteine und interagieren über ihre SH3 Domänen mit Prolin-reichen Sequenzen in nachgeschalteten Effektorproteinen. Ein Beispiel dafür ist das 30 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Adapterprotein Grb2, welches aus einer SH2 Domäne besteht, die von zwei SH3 Domänen flankiert wird (Lowenstein et al. 1992). Das Wachstumsfaktorrezeptor-bindende Protein Grb2 (Growth factor receptor binding protein 2) bindet über seine SH2 Domäne das pYxN Motiv des aktivierten EGF-Rezeptors. Über die N-terminale SH3 Domäne wird die Interaktion mit der Prolin-reichen Sequenz des Ras-Guaninnukleotid-Austauschfaktors son of sevenless (SOS) vermittelt, wodurch der Ras/MAP-Kinase-Signalweg, welcher die Zellproliferation und –differenzierung reguliert, aktiviert wird. Gleichzeitig kann die C-terminale SH3 Domäne mit der Prolin-reichen Sequenz des Docking Proteins Gab1 interagieren und somit den PI3K/Aktabhängigen Signalweg, welcher das zelluläre Überleben regelt, aktivieren (Schlessinger and Lemmon 2003). Dieses Beispiel zeigt sehr deutlich, dass ein Adapterprotein mehrere verschiedene SH3-bindende Proteine rekrutieren und somit ein einzelnes Phosphotyrosin mehrere verschiedene zelluläre Signalwege regulieren/beeinflussen kann (Pawson et al. 2001). Eine weitere Gruppe von Proteinen, die über ihre SH2 Domäne pTyr-abhängig an aktivierte Wachstumsrezeptoren binden, bilden die Mitglieder der Grb7/10/14-Familie. Allerdings haben die Grb7/10/14-Proteine eine ganz andere Domänenstruktur und Funktionsweise als Grb2. Eine ausführliche Beschreibung der Mitglieder der Grb7/10/14Familie erfolgt in Kapitel 3.2.1. Gerüstproteine mit SH2 Domänen Ähnlich wie die Adapterproteine regulieren auch die Gerüstproteine die Assemblierung von Signalproteinkomplexen. Sie sind in der Lage, verschiedene Signalwege miteinander zu verknüpfen und/oder Substrate in die räumliche Nähe von Enzymen zu bringen. Betrachtet man lediglich ihre Interaktionsformen oder räumlichen Verteilungsmuster, ist eine klar abgrenzbare Unterscheidung zwischen Adapter- und Gerüstproteinen nur sehr schwer möglich (Alexa et al. 2010). Neben den eher passiven Eigenschaften wie der Rekrutierung von Signalproteinen und deren Verknüpfung mit anderen Proteinen spielen die Gerüstproteine auch eine „aktive“ Rolle in der Signalweiterleitung. Dies unterscheidet sie von den Adapterproteinen. Die Gerüstproteine besitzen genau wie die Adapterproteine, keine intrinsische enzymatische Aktivität, können aber beispielsweise die Konformation oder Aktivität von Enzymen beeinflussen. Die Modulation der Enzymaktivität ist die Folge von allosterischen Effekten, welche durch die Bindung des Enzyms an das Gerüstprotein hervorgerufen werden (Bhattacharyya et al. 2006; Montell 2007; Good et al. 2009; Smock and Gierasch 2009). 31 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Ein bekanntes Beispiel eines Gerüstproteins ist Slp76 (SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa). Dieses Protein wird durchgehend in allen Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert (Clements et al. 1998). Das Protein besteht aus drei modularen Domänen. Diese umfassen eine saure N-terminale Region (mit drei Tyrosinphosphorylierungsmotiven), eine zentrale Prolin-reiche Domäne und eine C-terminale SH2 Domäne (Jackman et al. 1995). Die drei phosphorylierbaren Tyrosinreste dienen als Bindestellen für die SH2 Domänen des Guaninnukleotid-Austauschfaktors Vav, des Adapterproteins Nck, der p85 Untereinheit der PI3K und die Proteintyrosinkinase ITK (Onodera et al. 1996; Tuosto et al. 1996; Wu et al. 1996; Raab et al. 1997; Bubeck Wardenburg et al. 1998; Su et al. 1999; Wunderlich et al. 1999; Shim et al. 2004). Über die Prolin-reiche Domäne wird die Interaktion mit den SH3 Domänen der PLC-γ und des Grb2-verwandten Adapterproteins (Grap2/GADS) vermittelt (Liu et al. 1999). Durch die SH2 Domäne kann Slp76 mit den tyrosinphosphorylierten Formen der Hämatopoetischen Vorläuferkinase 1 (HPK1) und dem adhäsions- und degranulationsfördernden Adapterprotein (ADAP) interagieren (da Silva et al. 1997; Musci et al. 1997; Sauer et al. 2001). Wie das Gerüstprotein Slp76 all diese Proteine miteinander in einem Signalkomplex verknüpft, soll im Folgenden kurz beschrieben werden (Abb. 1.2.8). Abb. 1.2.8 Die Rolle von Slp76 bei der T-Zellrezeptor-vermittelten Signalweiterleitung. Die Aktivierung des T-Zellrezeptors (TZR) resultiert in der stufenweisen Aktivierung der Src-Kinase Lck und der ζKetten-assoziierten Proteinkinase von 70 kDa (ZAP70). In der Folge phosphoryliert ZAP70 verschiedene nachgeschaltete Signalproteine, inklusive LAT (linker for activation of B cells) und Slp76 (SH2 Domänenenthaltendes Leukozytenprotein von 76 kDa). Slp76 wird, durch die konstitutive Interaktion mit Grap2 (Grb2-related adaptor) an das membrangebunde LAT rekrutiert. Zusammen bilden Slp76 und LAT einen Signalkomplex, welcher eine Vielzahl von unterschiedlichen zellulären Prozessen, wie beispielsweise Calcium-Einstrom, Aktivierung von MAP-Kinasen, Integrinaktivierung und Umlagerung des Zytoskeletts in Gang setzt. Modifiziert aus (Koretzky et al. 2006). Nach Aktivierung des T-Zellrezeptors kommt es zur Aktivierung der Proteintyrosinkinasen Lck und Zap-70. Die aktivierte Zap-70 phosphoryliert das membranverankerte Dockingprotein LAT an mehreren Tyrosinen. Über diese phosphorylierten Tyrosinreste erfolgt unter anderem die Interaktion mit der SH2 Domäne von Grap2, welches seinerseits über seine Prolin-reiche Domäne mit dem Adapterprotein Slp76 interagiert. Diese Interaktionen führen 32 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen zur Ausbildung des LAT-Grap2-Slp76 Komplexes an der Zellmembran (Jordan et al. 2003). Gleichzeitig assoziiert auch die PLC-γ mittels ihrer SH2 Domäne mit LAT, während über die SH3 Domäne eine Interaktion mit der Prolin-reichen Sequenz von Slp76 stattfindet. Der dadurch entstandene membranständige LAT-PLC-γ-Slp76 Komplex ist verantwortlich für die Aktivierung der PLC-γ. Das Reaktionsprodukt der PLC-γ Aktivität, Inositoltrisphosphat, bewirkt eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Dies wiederum aktiviert die MAP-Kinase, wodurch die MAP-Kinase Kaskade in Gang gesetzt wird (Yablonski et al. 1998; Jordan et al. 2003). Gleichzeitig haben beide Komplexe auch Einfluss auf die Umstrukturierung des Zytoskeletts, was durch die Interaktion des tyrosinphosphorylierten Slp76 mit den SH2 Domänen von Vav und Nck induziert wird (Zeng et al. 2003). Proteine mit regulatorischen Untereinheiten Eine vierte Gruppe von Proteinen mit SH2 Domänen sind Proteine, die sowohl Eigenschaften von Adapterproteinen besitzen und auch als regulatorische Untereinheiten oder allosterische Regulatoren von separaten katalytischen Untereinheiten fungieren. Ein Beispiel hierfür ist die regulatorische Untereinheit p85 der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K). Diese regulatorische Untereinheit besteht aus einer N-terminalen SH3 Domäne, gefolgt von einer Rho-GAP (Rho-GTPase aktivierendes Protein) Domäne, beidseitig flankiert von einer Prolinreichen Sequenz. Angrenzend an diese Domänen besitzt die p85 Untereinheit im C-terminalen Teil des Proteins eine Bindestelle für die katalytische Untereinheit p110 der PI3K. Diese p110 Bindestelle wird von beiden Seiten durch eine SH2 Domänen flankiert (Abb. 1.2.9) (Vanhaesebroeck et al. 2001; Hawkins et al. 2006; Vanhaesebroeck et al. 2010). Abb. 1.2.9 Domänenstruktur der mammalischen Phoshatidylinositol-3-Kinasen Klasse I. Modifiziert aus (Vanhaesebroeck et al. 2010). Im inaktivierten Zustand liegt die regulatorische Untereinheit p85 in einem konstitutiv assoziierten Komplex mit der katalytischen Untereinheit p110 vor. Dieser Komplex ist im Zytoplasma lokalisiert. Bindet die p85 Untereinheit über ihre SH2 Domänen an einen tyrosinphosphorylierten Rezeptor oder tyrosinphosphorylierte membrangebundene Proteine, transloziert der p85-p110 Komplex an die Zellmembran, wo sich sein Substrat 33 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P2) befindet. Weiterhin kommt es durch die Bindung der p85 an tyrosinphosphorylierte Proteine zu einer Konformationsänderung in der Proteinstruktur, wodurch die autoinhibitorische Konformation der PI3K aufgehoben wird und somit die katalytische Aktivität der Kinase stimuliert wird (Vanhaesebroeck et al. 2001; Hawkins et al. 2006; Vanhaesebroeck et al. 2010). Zusätzlich zu seinen Funktionen als Adapter (Rekrutierung der PI3K an die Zellmembran) und als allosterischer Regulator der PI3K Aktivität fungiert die p85 Untereinheit auch als Gerüstprotein, in dem sie über ihre SH3 Domäne mit Prolin-reichen Sequenzen anderer zellulärer Proteine interagieren kann. 34 Einleitung Die Familie der CEACAMs 1.3 Die Familie der CEACAMs Die Familie der carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) gehört zusammen mit den pregnancy specific glycoproteins (PSGs) zur CEA Genfamilie. Beim Menschen besteht diese Genfamilie aus 29 Genen, welche auf dem Chromosom 19 lokalisiert sind (Beauchemin et al. 1999), und stellt eine Untergruppe der Immunglobulinverwandten Glykoproteine dar. Die Untersuchungen der CEA Genfamilie begannen in den 1960er Jahren, als CEA (CEACAM5) als Tumor-assoziiiertes Antigen in Darmkrebspatienten entdeckt wurde (Gold and Freedman 1965). Auch heute noch dient der CEA-Spiegel im Blut als wichtiges Prognose- und Diagnosemerkmal nach der operativen Entfernung von Darmtumoren. Im Laufe der Jahre wurden beim Menschen immer mehr CEA-verwandte Gene entdeckt. Diese Proteine werden auch im gesunden Organismus exprimiert und sind dort an der Ausbildung von homo- und heterophilen Zell-Zell Kontakten beteiligt und steuern verschiedenste zelluläre Prozesse (z. B. Formung und Aufbau von Geweben, Regulation der Insulin-Homöostase oder T-Zellproliferation). Neben diesen Eigenschaften wurden die CEACAMs auch als Rezeptoren für einige humanpathogene Bakterien identifiziert. So können beispielsweise Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis mittels ihrer Opa (colony opacity-associated proteins)-Proteine an verschiedene CEACAMs binden und dadurch selbst nicht-phagozytische Zellen zu einem Endozytoseprozess anregen (Hauck and Meyer 2003; Hauck 2006). 1.3.1 Strukturelle und funktionelle Eigenschaften Bis heute konnten beim Menschen 12 verschiedene CEACAM-Mitglieder identifiziert werden (Abb. 1.3.1). Alle diese Moleküle sind Membranproteine und besitzen in ihrem extrazellulären Abschnitt zwei verschiedene Arten von Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domänen. Die aminoterminale Domäne ist eine stark konservierte variable Ig-ähnliche (Igvähnlich) Domäne. Ihr folgen bis zu sechs konstante Ig-ähnliche (Igc-ähnliche) Domänen. An die extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen schließt sich eine Transmembranregion an, die in eine zytoplasmatische Region übergeht (CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM18 bis 21), oder die extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen sind über einen Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker in der Zellmembran verankert (CEACAM5 bis 8). Das erst kürzlich entdeckte CEACAM16 stellt eine Ausnahme innerhalb der CEACAM-Familie dar, 35 Einleitung Die Familie der CEACAMs da es lediglich als sekretiertes Protein vorkommt und im Gegensatz zu den anderen CEACAMs zwei statt einer Igv-ähnlichen Domäne besitzt (Zebhauser et al. 2005). Abb. 1.3.1 Die humane CEACAM-Familie. Modifiziert nach (Kuespert et al. 2006), aktualisiert mittels UniProt Daten für die CEACAM20 und 21 Splicevarianten, sowie die Gewebeverteilung der CEACAMs. Als posttranslationale Modifikation weisen alle CEACAMs eine starke Glykosylierung an Asparaginresten der Ig-ähnlichen Domänen auf. Diese Kohlenhydratketten können bis zu 50 % des Molekulargewichts ausmachen (Yamashita et al. 1987). Einige der transmembranären Isoformen besitzen in ihren zytoplasmatischen Abschnitten ImmunrezeptorTyrosin-basierte Inhibitorische oder Aktivierende Motive (ITIM oder ITAM) (Chen et al. 2001; Schmitter et al. 2004). Solche Sequenzmotive spielen bei der pTyr-abhängigen Weiterleitung verschiedener Signale in die Zelle eine wichtige Schlüsselrolle. ITAMs und ITIMs Nicht jeder Tyrosinrest in einem Protein ist für eine Phosphorylierung zugänglich oder geeignet. Der Aminosäuresequenzkontext entscheidet darüber, ob und welche Kinase eine Phosphatgruppe auf den Tyosinrest übertragen kann, zumeist sind die flankierenden 3-5 Aminosäuren entscheidend für die Spezifität. Während in vielen Proteinen einfache Sequenzmotive zu finden sind, die eine Phosphorylierung erlauben, gibt es unter diesen Motiven auch solche, die sich einer bestimmten Funktion zuordnen lassen, nämlich die ITAMs und ITIMs. Sie sind beispielsweise Bestandteil verschiedener Immunrezeptoren und haben aktivierende (ITAM) oder inhibierende (ITIM) Eigenschaften. So sind beispielsweise ITAMs für die Signaltransduktionsprozesse von B- und T-Zellen von entscheidender Bedeutung. Ein 36 Einleitung Die Familie der CEACAMs typisches ITAM ist durch eine spezifische Aminosäurekonsensussequenz der Form YxxI/Lx(6-12)YxxI/L charakterisiert. So tragen beispielsweise die ξ-Kette des T-Zellrezeptors und der B-Zellrezeptor eine ITAM-Sequenz, welche nach Ligandenbindung an den Rezeptor durch PTKs der Src-Familie phosphoryliert wird. Das zweifach phosphorylierte ITAM dient als Bindestelle für die Tandem-SH2 Domänen von PTKs der Syk-Familie (Syk oder Zap-70). Die damit verbundene Aktivierung von Syk und/oder Zap-70 resultiert in der tyrosinphosphorylierungsabhängigen Aktivierung verschiedener nachgeschalteter Signalwege, welche beispielsweise Aktivierungs-, Proliferations-, Differenzierungs- und Überlebensprozesse steuern (Cambier 1995). Rezeptoren mit ITIM-Konsensussequenzen sind evolutionär konservierte Membranproteine, die bereits in den einfachen Metazoen zu finden sind (Daeron et al. 2008). Die erstmalige Beschreibung der inhibitorische Funktion ITIM-tragender Rezeptoren erfolgte anhand des niedrig-affinen Immunglobulin G (IgG) Rezeptors Fcγ-Rezeptor IIB (Daeron et al. 1995). Die ITIM-Konsensussequenz hat die charakteristische Abfolge S/I/V/LxYxxI/V/L. Durch molekulare Analysen konnte gezeigt werden, dass nach Ligandenbindung an den Rezeptor das ITIM durch PTKs der Src-Familie phosphoryliert wird. Das Phosphotyrosin dient dann als Bindestelle für die SH2 Domänen von Phosphotyrosinphosphatasen (z. B. SHP-1 und SHP-2) oder 5’-Inositol-Phosphatasen (z. B. SHIP1 und SHIP2). Die aktivierten Phosphatasen dephosphorylieren tyrosinphosphorylierte Proteine oder Inositolphospholipide, wodurch anderen aktivierenden Signalprozessen entgegengewirkt wird. Dies hat zur Folge, dass beispielsweise aktivierende ITAM-Signale abgeschwächt werden. Somit haben die ITIMs im Vergleich zu den ITAMs eine negativ regulierende Funktion in den Signalprozessen des Immunsystems. Neben den beschriebenen B-, T-Zellrezeptoren und Fc-Rezeptoren besitzen auch einige CEACAMs ITAM- bzw. ITIM-Konsensussequenzen in ihren zytoplasmatischen Abschnitten. Drei dieser Rezeptoren (CEACAM1, CEACAM3 und CEACAM4) sollen im Folgenden näher beschrieben werden. CEACAMs mit Immunrezeptor-Tyrosin-basierten Motiven CEACAM1 ist das CEACAM-Familienmitglied mit der größten Gewebeverteilung und der höchsten strukturellen Variabilität. Dieser Rezeptor ist nicht nur auf der Oberfläche von Epithelzellen zu finden, sondern auch auf verschiedenen Leukozyten. Ferner kann seine Expression auch in anderen Zellen wie beispielsweise T-Zellen und Endothelzellen induziert 37 Einleitung Die Familie der CEACAMs werden. Von CEACAM1 sind zwölf Splicevarianten bekannt, die sich nicht nur in einer teilweise unterschiedlichen Anzahl der extrazellulären Domänen unterscheiden, sondern auch in der Länge ihrer zytoplasmatischen Abschnitte (siehe: http://www.carcinoembryonicantigen.de/). Es gibt CEACAM1 Isoformen mit einem langen (CEACAM1-L) oder einem kurzen (CEACAM1-S) zytoplasmatischen Abschnitt. CEACAM1-L besitzt in seinem 74 Aminosäuren langem zytoplasmatischen Abschnitt mehrere phosphorylierbare Serin-, Threonin- und Tyrosinreste, durch welche eine Beteiligung von CEACAM1-L an verschiedenen Signalprozessen und Protein-Protein Interaktionen gewährleistet wird. Im Gegensatz dazu enthält CEACAM1-S in seinem lediglich 10 Aminosäuren umfassenden zytoplasmatischen Abschnitt keine phosphorylierbaren Aminosäurereste. Die lange CEACAM1 Form besitzt phosphorylierbare Tyrosinreste, die in zwei ITIMs eingebettet sind. Durch diese phosphroylierbaren Tyrosinreste ist CEACAM1-L an wichtigen intrazellulären Signalübertragungsprozessen beteiligt (Gray-Owen and Blumberg 2006). Ein Beispiel hierfür ist die Beteiligung von CEACAM1-L bei der Regulierung des Insulin-Signalweges. Als ein direktes Phosphorylierungssubstrat des aktivierten Insulinrezeptors fördert die tyrosinphosphorylierte CEACAM1-L Isoform die Endozytose des Insulinrezeptor-Insulin Komplexes und den Abbau des Insulins im Lysosom (Najjar 2002). Allerdings moduliert CEACAM1 nicht nur Insulin-vermittelte Signalprozesse, sondern ist auch an Aufbau und Formung von endothelialen Geweben beteiligt. Studien zeigten, dass der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) die Expression von CEACAM1 in Endothelzellen erhöht und dass in diesem Zusammenhang die Verwendung von monoklonalen CEACAM1 Antikörpern die VEGF-induzierte endotheliale Gefäßneubildung blockiert (Ergun et al. 2000). Auch im Hinblick auf die Tumorgenese wird CEACAM1 intensiv untersucht. Im Gegensatz zu CEA oder CEACAM6 besitzt CEACAM1 die Funktion eines Tumorsupressors (Singer et al. 2000). Der negative Einfluss von CEACAM1 auf das Tumorwachstum erklärt sich dadurch, dass es die Zellproliferation verlangsamt und proapoptotisch wirkt. Allerdings wirkt nur die lange Isoform (CEACAM1-L) proliferationshemmend, da nur diese das ITIM besitzt, welches nach Phosphorylierung als Bindestelle für die SH2 Domänen der Proteinphosphatase SHP oder der Inositolphosphatase SHIP dient. Die Folge der Assoziation dieser Phosphatasen mit dem aktivierten, phosphorylierten CEACAM1-L ist eine Absenkung des Aktivierungszustandes der Zelle (Obrink et al. 2002). Im Gegensatz dazu wurde eine verstärkte Expression der verkürzten Isoform (CEACAM1-S) in Lungentumoren festgestellt (Wang et al. 2000). Neben seiner Rolle bei den verschiedensten physiologischen Prozessen 38 Einleitung Die Familie der CEACAMs sowie der Entstehung von Tumoren wurde CEACAM1 sowohl in Mäusen (Dveksler et al. 1993) als auch im Menschen als Pathogenrezeptor beschrieben. Allerdings ist die Aufnahme von Humanpathogenen unabhängig von Tyrosinphosphorylierungen der ITIM-Sequenzen im zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM1. Zwei weitere Mitglieder der CEACAM-Familie, die ebenfalls phosphorylierbare Tyrosinreste in ihrem zytoplasmatischen Abschnitt enthalten, sind CEACAM3 und CEACAM4. Eine Besonderheit dieser beiden Proteine liegt darin, dass sie ausschließlich auf Granulozyten von Primaten exprimiert werden. Beide Moleküle sind Transmembranproteine mit lediglich einer extrazellulären Ig-ähnlichen Domäne, welche dem variablen Typ zu zuordnen ist. Genau wie CEACAM1 weisen die zytoplasmatischen Abschnitte von CEACAM3 und CEACAM4 zwei phosphorylierbare Tyrosinreste auf. Bei CEACAM3 sind diese Tyrosine in eine ITAMähnliche Sequenz eingebettet, während das tyrosinphosphorylierbare Sequenzmotiv in CEACAM4 einem echten ITAM entspricht (Abb 1.3.2). Abb. 1.3.2 Vergleich der ITAMKonsensussequenz (Cambier 1995) mit den Tyrosin-phosphorylierbaren Sequenzen von CEACAM3 und CEACAM4. Grau hinterlegte Aminosäuren sind konserviert. Genau wie die Tyrosine in den ITIMs von CEACAM1, können auch die Tyrosine in der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 durch spezifische PTKs phosphoryliert werden und als Bindemotive für Proteine mit SH2 Domänen dienen. Neben dieser ITAM-ähnlichen Sequenz besitzt CEACAM3 in seinem zytoplasmatischen Abschnitt noch eine Prolin-reiche Sequenz sowie mehrere potentiell phosphorylierbare Serinreste (Abb. 1.3.3). Auch CEACAM4 besitzt potentiell phosphorylierbare Serine und eine Prolin-reiche Sequenz im zytoplasmatischen Abschnitt. Im Gegensatz zu CEACAM1 können weder CEACAM3, noch CEACAM4 homophile und heterophile interzelluläre Interaktionen eingehen. Im Jahr 1996 identifizierten Chen und Gotschlich CEACAM3 als einen Rezeptor auf Granulozyten, welcher verantwortlich ist für die Opsonin-unabhängige Aufnahme von Opa Protein exprimierenden Neisseria gonorrhoeae (Chen and Gotschlich 1996). Auch die stabile Transfektion von HeLa Zellen mit CEACAM3 cDNA ermöglichte es diesen Zellen N. gonorrhoeae zu erkennen und zu internalisieren. Im Gegensatz zu CEACAM1 ist für die CEACAM3-vermittelte Phagozytose die Intaktheit der phosphorylierbaren Tyrosinreste in der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 von essentieller Bedeutung. 39 Einleitung Die Familie der CEACAMs Abb. 1.3.3 Aufbau von CEACAM3. (A) Primärstruktur von CEACAM3. CEACAM3 ist ein Typ 1 Transmembranprotein von 252 Aminosäuren (AS) Länge. Nach Abspaltung des aminoterminale Signalpeptids (34 AS lang) besteht der extrazelluläre Abschnitt (121 AS lang) aus: der Igv-ähnlichen Domäne (108 AS) und einer 13 AS langen Verbingungsregion zur 21 AS langen Transmembrandomäne TM. Der zytoplasmatische Abschnitt von CEACAM3 umfasst 76 AS. (B) Sequenzmotiv des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3. Das charakteristischste Merkmal des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 ist eine Immunrezeptor Tyrosin-basiertes Aktivierungsmotiv (ITAM)-ähnliche Sequenz (unterstrichen). Dieses Sequenzmotiv gleicht sehr stark der typischen ITAM-Konsensussequenz. Die Tyrosinreste (Y230 und Y241) dieses Sequenzmotives werden durch Mitglieder aus der Familie der Src-Kinasen phosphoryliert. Neben diesen Tyrosinen gibt es auch einige Serine, die potentiell phosphoryliert werden können (Kennzeichnung: fett und unterschtrichen) (Vorhersage mittels NetPhos http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/; (Blom et al. 1999)). PKA, PKC und PKG sind mögliche Kinasen, die diese Serinreste phosphorylieren könnten. Eine Prolin-reiche Sequnez (Kasten) ist ein potentielles Bindemotiv für Proteine mit SH3 Domänen. Modifiziert aus (Pils et al. 2008). Die Rolle der ITAM-ähnliche Sequenz von CEACAM3 bei der Phagozytose von Humanpathogenen wird im Kapitel 1.3.2.1 näher beschrieben. CEACAM4 wurde erstmalig im Jahr 1991 beschrieben (Kuroki et al. 1991). Allerdings konnte für CEACAM4, im Gegensatz zu CEACAM3, bisher weder ein Ligand identifiziert werden noch wurde die Funktion dieses Rezeptors näher untersucht. Die bereits beschriebene Verwandtschaft zu CEACAM3 und insbesondere die Ähnlichkeit des zytoplasmatischen Abschnittes, welcher bei CEACAM3 von essentieller Bedeutung für den Phagozytoseprozess ist, lässt eine gleichartige Funktion von CEACAM4 vermuten. Allerdings wurde CEACAM4 seit seiner erstmaligen Beschreibung im Jahr 1991 bisher nur sehr wenig untersucht. 1.3.2 CEACAMs als Rezeptoren für humanspezifische Bakterien Die Gram-negativen, humanspezifischen Bakterien Neisseria gonorrhoeae (N. gonorrhoeae) und Neisseria meningitidis sind ein sehr gutes Beispiel dafür, wie gut sich diese Mikroorganismen an ihren Wirtsorganismus, den Menschen, anpassen können. Um das 40 Einleitung Die Familie der CEACAMs Weiterbestehen ihrer Art zu sichern entwickelten sie im Laufe der Evolution eine Vielzahl von molekularen Mechanismen, die es ihnen ermöglichen die vielfältigen Abwehrbarrieren des menschlichen Körpers zu umgehen. Beispiele dieser Anpassungsfähigkeit sind die Sekretion einer IgA1-spezifischen Serinprotease, die Sialylierung von Lipooligosacchariden der äußeren Bakterienmembran sowie die Entwicklung einer enormen Variabilität von verschiedenen bakteriellen Oberflächenstrukturen (Meyer 1999; Dehio et al. 2000). Sowohl Gonokokken als auch Meningokokken besitzen eine Familie von Oberflächenproteinen, welche phasenvariabel exprimiert werden können. Diese Oberflächenproteine sind die sogenannten Opa (colony opacity-associated proteins) -Proteine. Durch die Opa Proteine können die Bakterien in engen Kontakt mit ihren verschiedenen Wirtszellen treten. Sie werden entsprechend ihrer Interaktionspartner auf der Wirtszelle in zwei Gruppen unterteilt. Die eine Gruppe umfasst Opa Proteine, welche mit Heparansulfatproteoglykanen interagieren und deshalb als OpaHS bezeichnet werden. Die zweite Gruppe umfasst Opa Proteine, welche mit hoher Affinität und Selektivität an unterschiedliche CEACAMs binden (Hauck and Meyer 2003). Diese als OpaCEA bezeichneten Oberflächenproteine binden an Igv-ähnliche Domänen der CEACAMs und ermöglichen somit den engen Kontakt zwischen Pathogen und Wirtszelle (Billker et al. 2000). Bis heute konnten unter den humanen CEACAMs vier Mitglieder identifiziert werden, welche mit den OpaCEA-Proteinen von pathogenen Neisserien interagieren können – diese sind CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5 und CEACAM6 (Virji et al. 1996a; Bos et al. 1997; Chen et al. 1997; Gray-Owen et al. 1997b) (Tab. 1.3.1). Zelluläre Rezeptoren für die Opa Proteine von Neisseria gonorrhoeae Neisserien-Stamm MS11 MS11 MS11 MS11 MS11 MS11 MS11 MS11 MS11 MS11 Opa Protein 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Zellulärer Rezeptor CEACAM5 CEACAM1/3/5/6 CEACAM1 CEACAM1/5 CEACAM5 CEACAM5 CEACAM1/3/5/6 CEACAM1/3/5/6 CEACAM1/5 CEACAM1/3/5/6 Tab. 1.3.1 Zusammenstellung der Opa Proteine von Neisseria gonorrhoeae und ihren zellulären Rezeptoren. Modifiziert aus (Dehio et al. 1998). 41 Einleitung Die Familie der CEACAMs Durch die Bindung der Bakterien an die CEACAMs wird eine Signalkaskade ausgelöst, die unter anderem die Phagozytose der Bakterien zur Folge hat (Hauck and Meyer 2003). Es wurde gezeigt, dass die einzelnen CEACAMs Zelltyp-spezifisch exprimiert werden (Hammarstrom 1999). So sind sowohl CEACAM1 und CEACAM5 als auch CEACAM6 auf verschiedenen Epithelien zu finden. Hier lokalisieren sie auf der apikalen Seite der Epithelzellen und sind somit für die auf den Schleimhäuten vorkommenden Bakterien leicht zugänglich. Es konnte beispielsweise nachgewiesen werden, dass diese CEACAMs auf der apikalen Zellseite von polarisierten T84 Epithelzellen lokalisieren, wo sie die Invasion sowie die Transzytose von OpaCEA-exprimierenden Gonokokken vermitteln (Wang et al. 1998). Diese Fakten lassen den Schluss zu, dass es den CEACAM-bindenden Bakterien auf diesem Weg ermöglicht wird, die menschlichen Schleimhäute effizient zu besiedeln. Während CEACAM1 ein Transmembranprotein ist, sind CEACAM5 und CEACAM6 über einen GPI-Anker in der Zellmembran verankert. Die Internalisierung von OpaCEAexprimierenden Bakterien über diese drei CEACAM-Mitglieder ist abhängig von ihrer Lokalisation in Membranmikrodomänen, den sogenannten lipid rafts (Schmitter et al. 2007b; Muenzner et al. 2008). Weiterhin konnte für CEACAM1 festgestellt werden, dass die Phagozytose der Bakterien unabhängig ist vom zytoplasmatischen Abschnitt und dem darin lokalisierten ITIM (Muenzner et al. 2008). In diesem Zusammenhang konnten Muenzner et al. zeigen, dass CEACAM1 mit deletiertem zytoplasmatischen Abschnitt, OpaCEA-exprimierende Neisserien in gleicher Weise aufnimmt wie die Wildtypform von CEACAM1, und dass dieser Aufnahmeprozess unabhängig vom Aktinzytoskelett erfolgt. Ein weiterer sehr interessanter Effekt der Interaktion von OpaCEA-exprimierenden Neisserien mit CEACAM1 ist eine verstärkte Adhäsion der Epithelzellen an die extrazelluläre Matrix, hervorgerufen durch eine erhöhte Integrin-Aktivierung (Muenzner et al. 2010). Dieser Mechanismus wirkt der Exfoliation, einem Schutzmechanismus zur Abstoßung infizierter Zellen, entgegen und ermöglicht somit den Neisserien die effiziente Besiedlung der Epithelzellen. Die Expression von CEACAM1 und CEACAM6 ist, im Gegensatz zu CEACAM5, nicht nur auf Epithelzellen beschränkt. Diese beiden Proteine werden auch auf der Oberfläche von Granulozyten exprimiert. Gleiches gilt auch für CEACAM3, welches allerdings ausschließlich auf Granulozyten exprimiert wird. Die CEACAM3-vermittelte Phagozytose von Bakterien ist, im Unterschied zu den drei vorher beschriebenen CEACAMs, nicht durch Cholesterolchelatoren und der damit verbundenen Zerstörung von Membranmikrodomänen beeinflussbar (Schmitter et al. 2007b). CEACAM3 stellt einen neuartigen phagozytischen 42 Einleitung Die Familie der CEACAMs Rezeptor der angeborenen Immunantwort dar. Untersuchungen zeigten, dass die Interaktion OpaCEA-exprimierender Gonokokken mit diesem Rezeptor zu einer effizienten Phagozytose und Abtötung der Bakterien führt. Im Gegensatz zu CEACAM1 spielen dabei die beiden Tyrosinreste Tyr230 und Tyr241 der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 eine wichtige Rolle (Schmitter et al. 2004). In diesem Zusammenhang zeigten bereits frühere Studien, dass die CEACAM-abhängigen Interaktionen zwischen Granulozyten und Gonokokken eine Vielzahl von zellulären Effekten seitens der Granulozyten zur Folge haben. Diese Effekte stehen unter anderem in enger Relation mit den signalgebenden Mechanismen der Tyrosinphosphorylierung. Nachgewiesen wurde die Stimulation zytoplasmatischer PTKs, die Reduktion der Aktivität von Tyrosinphosphatasen, die verstärkte Phosphorylierung zellulärer Proteine sowie die Stimulation der kleinen GTPase Rac (Hauck et al. 1998; Hauck et al. 1999). Aus diesem Grund ist es naheliegend, dass diese biochemischen Prozesse innerhalb der infizierten Zelle auch die CEACAM3-vermittelte Phagozytose von Bakterien regulieren. 1.3.2.1 Regulation der CEACAM3-vermittelten Phagozytose Wie bereits in den vorangegangenen Kapiteln erwähnt, ist CEACAM3 ein phagozytotischer Rezeptor auf neutrophilen Granulozyten. Diese phagozytischen Zellen erkennen und eliminieren OpaCEA-exprimierende Gonokokken in einer Opsonin-unabhängigen Weise. Das heißt die Bakterien werden in Abwesenheit von spezifischen Antikörpern oder Komplementfaktoren von den Granulozyten erkannt und eliminiert. Dabei ist die Erkennung und Phagozytose der Gonokokken abhängig von der Bindung der Opa Proteine an die CEACAMs auf der Granulozytenoberfläche (Chen and Gotschlich 1996; Virji et al. 1996a; Gray-Owen et al. 1997a; Hauck et al. 1998). Die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Gonokokken verläuft wesentlich schneller und effizienter als die CEACAM1- und CEACAM6-vermittelte, obwohl die Affinität der Rezeptoren zu den Bakterien vergleichbar ist. Auch in Bezug auf den Aufnahmemechanismus unterscheidet sich CEACAM3 deutlich von den anderen CEACAMs. Die CEACAM3vermittelte Phagozytose von Gonokokken erfolgt in Abhängigkeit von Umlagerungsprozessen des Aktinzytoskeletts. Dieser Unterschied ist auf die ITAM-ähnliche Sequenz im zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 zurückzuführen (Billker et al. 2002). Um herauszufinden, ob die molekularen Mechanismen der CEACAM3-inudizierten Phagozytose abhängig sind von Phosphorylierungsprozessen innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3, wurden verschiedene CEACAM3-Mutanten untersucht. Die analysierten 43 Einleitung Die Familie der CEACAMs Mutanten waren CEACAM3-Varianten, bei denen die phosphorylierbaren Tyrosinreste des YxxLx(7)YxxM Motivs im zytoplasmatischen Abschnittes durch nicht phosphorylierbare Phenylalaninreste (F) substituiert wurden. Die Punktmutationen der Tyrosine Tyr230 und/oder Tyr241 führten zu einer reduzierten CEACAM3-abhängigen Aufnahme der Bakterien (Billker et al. 2002; McCaw et al. 2003; Schmitter et al. 2004). Diese Tyrosinreste der ITAMähnlichen Sequenz dienen als Phosphorylierungsstellen für PTKs aus der Familie der SrcKinasen, welche nach Bindung von OpaCEA-exprimierenden Bakterien an CEACAM3, aktiviert werden (McCaw et al. 2003). Untersuchungen mit Src, Yes und Fyn defizienten Fibroblasten (SYF Zellen) zeigten, dass diese Zellen OpaCEA-exprimierender Bakterien nicht CEACAM3-abhängig phagozytieren können. Dieser Effekt konnte allerdings durch die Reexpression von c-Src aufgehoben werden (Schmitter et al. 2007b). Ebenso konnte gezeigt werden, dass die SH2 Domäne von c-Src mit dem phosphorylierten Rezeptor assoziiert (Schmitter et al. 2007b). Allerdings wird c-Src in humanen Granulozyten lediglich sehr schwach exprimiert. Im Vergleich dazu wird die sehr eng verwandte Proteintyrosinkinase Hck in hämatopoetischen Zellen wesentlich stärker exprimiert. Bereits in früheren Untersuchungen konnte eine verstärkte Hck-Aktivität beim Zusammentreffen von OpaCEA-exprimierenden Bakterien und Phagozyten nachgewiesen werden (Hauck et al. 1998). Weiterführende Analysen zeigten, dass auch diese Kinase über ihre SH2 Domäne mit dem phosphorylierten CEACAM3 assoziieren kann und verstärkt an die Membranabschnitte rekrutiert wird, wo Interaktionen zwischen Rezeptor und Bakterien stattfinden (Schmitter et al. 2007b). Diese Beobachtungen unterstützen die Theorie einer Beteiligung der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 bei der Aufnahme von Bakterien. Interessanterweise ist die zytoplasmatische Proteintyrosinkinase Syk, welche für die ITAM-abhängige Aufnahme von Bakterien über den Fcγ-Rezeptor verantwortlich ist, nicht nötig, um die CEACAM3-initiierte Phagozytose von OpaCEA-exprimierenden Gonokokken zu stimulieren (Sarantis and Gray-Owen 2007). Diese Beobachtung erweiterte die Ergebnisse einer früheren Studie, bei der die Stimulierung von CEACAMs mit OpaCEA-exprimierenden Bakterien keinen aktivierenden Einfluss auf die Proteintyrosinkinase Syk hatte (Hauck et al. 1998). Eine Erklärung dafür, dass Syk für diesen Phagozytoseprozess entbehrlich ist, liefert die Tatsache, dass der zytoplasmatische Abschnitt von CEACAM3 direkt mit dem Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav interagieren kann (Schmitter et al. 2007a). Diese direkte Interaktion erfolgt über die SH2 Domäne von Vav mit dem phosphorylierten Tyrosinrest Tyr230 in der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Bereits früher Studien zeigten, dass die Bindung OpaCEA-exprimierender Bakterien an 44 Einleitung Die Familie der CEACAMs CEACAM3 sehr schnell in einer verstärkten Aktivierung der kleinen GTPase Rac resultiert (Schmitter et al. 2004). Durch die direkte Bindung von Vav an CEACAM3 entfällt die für den Fcγ-Rezeptor typische Syk-induzierte Signalkaskade, die nach Aktivierung von Rac durch Vav zu einer Umlagerung des Aktinzytoskeletts und somit zur Phagozytose der Bakterien führt (Review siehe: (Joshi et al. 2006). Dieser stark verkürzte Signalweg ermöglicht somit die sehr schnelle Internalisierung der Gonokokken. Dies deutet darauf hin, dass sich die Opsonin-unabhängige CEACAM3-vermittelte Phagozytose durch Granulozyten als Abwehrmechanismus des menschlichen angeborenen Immunsystems gegen CEACAMbindende Bakterien entwickelt hat. Dieser angeborene Abwehrmechanismus stellt somit einen effektiven Schutz für den menschlichen Körper dar, durch den die Bakterien trotz ihrer Antigenvariation und ihrer Fähigkeit, der erworbenen Immunantwort zu entgehen, schnell und effizient eliminiert werden können. 45 Einleitung Zielsetzungen 1.4 Zielsetzungen Um die temporäre, reversible und dynamische Regulation unterschiedlichster zellulärer Signalwege zu gewährleisten, sind verschiedenste Protein-Protein Interaktionen erforderlich. Viele an intrazellulären Signalprozessen beteiligte Proteine besitzen kleine Domänen, durch welche sie konstitutiv und/oder signalreguliert mit anderen Proteinen assoziieren. Eine sehr effiziente und gut regulierbare Form der Protein-Protein Interaktion beruht auf der transienten Tyrosinphosphorylierung von Proteinen. Um die Vielzahl an zellulären Signalwegen und ihre Vernetzung untereinander verstehen zu können, ist die Identifizierung und Charakterisierung Phosphotyrosin-abhängiger Protein-Protein Interaktionen unerlässlich. Etablierung einer Methode zur schnellen und parallelen Analyse Phosphotyrosinabhängiger Protein-Protein Interaktionen Aufgrund des hohen Zeit- und Arbeitsaufwand erlauben die bisherigen biochemischen Methoden (pull down Experimente und Koimmunpräzipitation) zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen nur die Betrachtung relativ kleiner Gruppen von möglichen Interaktionspartnern. Die Etablierung eines Protein Arrays, auf der Basis von immobilisierten SH2 Domänen, würde die parallele Untersuchung großer Gruppen von Interaktionspartnern erlauben. Unter Zuhilfenahme eines kontaktlosen MikroarrayDruckers und eines Sets ausgewählter SH2 Domänen sollten die optimalen Immobilisierungs-, Blockierungs- und Beprobungsbedingungen für einen solchen Protein Array etabliert werden. Verschiedene Detektionsmodi wurden zur Demonstration der Stabilität und flexiblen Verwendbarkeit eingesetzt. Charakterisierung neu identifizierter SH2 Domänen-abhängiger Protein-Protein Interaktionen für CEACAM3 Mittels des zuvor etablierten SH2 Domänen Arrays wurden die SH2 Domänen der Lipidkinase PI3K und des Gerüstproteins Grb14 als Interaktionspartner von CEACAM3 identifiziert. Diese Interaktionen sollten mit herkömmlichen Methoden verifiziert werden. Biochemische, mikroskopische und funktionelle Untersuchungen sollten die Rolle dieser Signalproteine im CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess klären. 46 Einleitung Zielsetzungen Welche Phosphotyrosin-abhängigen Interaktionen finden am zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 statt und welche Rolle spielen sie in der Funktion dieses Rezeptors? Der anfangs etablierte SH2 Domänen Array bietet die Möglichkeit, viele SH2 Domänen parallel auf ihre Interaktionen mit einem definierten Phosphotyrosinprotein zu untersuchen. Für CEACAM4 wurde bisher noch kein natürlicher Ligand beschrieben, jedoch besitzt CEACAM4 eine ITAM-ähnliche Sequenz, die als Vorfahre der entsprechenden CEACAM3 Signalsequenz gilt. CEACAM4 wurde daher auf seine Funktionsfähigkeit als phagozytischer Rezeptor untersucht. Da kein natürlicher Ligand für die Igv-ähnliche Domäne von CEACAM4 bekannt ist, wurde eine Chimäre aus der Igv-ähnlichen Domäne von CEACAM3 und dem Transmembran- und zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 verwendet, um mit gut etablierten Liganden die Aktivität der signalgebenden Bestandteile von CEACAM4 untersuchen zu können. Eine initiale Analyse der Bindungspartner des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM4 sollte erste Einblicke in Parallelen und Abweichung der beiden Moleküle geben. Infektionsexperimente mit mikroskopischer Analyse sowie Betrachtung der Phagozytoserate sollten die funktionelle Relevanz der gefundenen Interaktionen untersuchen. 47 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen 2.1 Einleitung Die Phosphorylierung von Tyrosinresten ist eine Form der posttranslationalen Modifikation von Proteinen in mehrzelligen Lebewesen. Dieser Vorgang wird von spezifischen Proteintyrosinkinasen (PTKs) bewerkstelligt und ist von entscheidender Bedeutung bei der intrazellulären Signalweiterleitung. Die reversible Phosphorylierung von Tyrosinresten reguliert wesentliche zelluläre Prozesse wie Genexpression, Differenzierung, Proliferation und Überleben. Da eine Phosphatgruppe eine stark negative Ladung besitzt, hat die Tyrosinphosphorylierung eines Proteins oft auch Konformationsänderungen der Proteinstruktur zur Folge. Abhängig von seinem Phosphorylierungsstatus kann ein Protein somit in zwei möglicherweise funktionell verschiedenen Formen vorliegen. Dies ist beispielsweise bei der Aktivitätsregulierung von Enzymen von entscheidender Bedeutung, die durch Tyrosinphosphorylierungen, je nach Einzelfall, aktiviert oder inaktiviert werden. Eine weitere Form der Steuerung zellulärer Abläufe durch Tyrosinphosphorylierungen besteht darin, dass die resultierenden Phosphotyrosine (pTyr) als Bindestelle für spezielle Interaktionsdomänen dienen. Diese Phosphotyrosin-Interaktionsdomänen sind die sogenannten Src homology 2 (SH2) und Phosphotyrosinbinde (PTB) Domänen. Ursprünglich wurden diese beiden Domänen als Protein-Protein Interaktionsmodule identifiziert, die phosphorylierte Tyrosinreste in Rezeptortyrosinkinasen und andern Signalproteinen erkennen und binden. Im Laufe der Zeit zeigten Studien, dass die SH2-abhängigen Protein-Protein Interaktionen sehr streng durch Tyrosinphosphorylierungsprozesse reguliert werden, während die meisten PTB Domänen auch konstitutiv und mit hoher Affinität an ihre unphosphorylierten Zielproteine binden (Schlessinger and Lemmon 2003). Viele wichtige zelluläre Signalproteine, wie beispielsweise Adapter- und Gerüstproteine, GuaninnukleotidAustauschfaktoren oder Kinasen und Phosphatasen besitzen SH2 Domänen, durch welche sie phosphorylierungsabhängig an andere Proteine rekrutiert oder untereinander vernetzt werden können. Die daraufhin folgende Assemblierung von Proteinkomplexen ermöglicht die Weiterleitung von Signalen innerhalb der Zelle (Pawson et al. 2001). Im menschlichen Genom sind insgesamt 115 verschiedene SH2 Domänen kodiert. Diese Proteindomänen bestehen aus ca. 100 Aminosäuren und erkennen pTyr-Reste innerhalb einer spezifischen 48 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Konsensussequenz, die ca. 3-6 AS um den pTyr-Rest umfasst (http://smart.emblheidelberg.de/smart/do_annotation.pl?DOMAIN=SH2). Die Analyse der Tyrosinphosphorylierung von Proteinen und der daraus resultierenden Protein-Protein Interaktionen beruht gegenwärtig vor allem auf der Untersuchung individueller Proteine mittels konventioneller Techniken wie Koimmunpräzipitation, GSTpull-down und nachgeschalteter Analyse mittels Western Blot. Diese Techniken stellen sehr gute Methoden dar, sind jedoch sehr zeitintensiv und können nicht in großem Maßstab angewandt werden. Ein anderer Weg, um gezielt spezifische pTyr-abhängige Protein-Protein Interaktionen zu identifizieren, besteht in der Verwendung von immobilisierten SH2 Domänen als Affinitätsmatrix. In diesem Zusammenhang stellt ein Proteindomänen Array eine viel versprechende Alternative zu den Präzipitationsmethoden dar. Es wurden bereits funktionale Protein Arrays auf der Basis von isolierten SH2 Domänen hergestellt und zur Bestimmung der Bindungskonstanten von pTyr-modifizierten ErbB-Rezeptor Peptiden eingesetzt (Jones et al. 2006). Als methodische Weiterentwicklung der bereits existierenden Ansätze wurde in der vorliegenden Arbeit ein Proteindomänen Array entwickelt, der es ermöglicht, bisher unbekannte pTyr-abhängige Protein-Protein Interaktionen zu analysieren. Zur Etablierung dieser Methode wurden die gut charakterisierten Interaktionen zwischen verschiedenen humanen SH2 Domänen und dem humanen Oberflächenrezeptor CEACAM3 sowie der zytoplasmatischen Fokalen Adhäsionskinase (FAK) benutzt. 2.2 Ergebnisse 2.2.1 Immobilisierung von rekombinanten SH2 Domänen auf einer aldehydbeschichteten Trägermatrix Als Trägermatrix zur Immobilisierung der SH2 Domänen in punktförmigen Mustern (Spots) wurden aldehydbeschichtete Glasobjektträger (Aldehydslides) verwendet. Die Aldehydoberflächen stellten sich wegen ihrer leichten Handhabung im Hinblick auf die Immobilisierung als am geeignetsten heraus. Als Alternativen wurden zuvor noch die nichtkovalente Immobilisierung der Proteine auf Nickel-beschichtete Oberflächen und Aminosilanoberflächen getestet. Allerdings erfolgt die nicht-kovalente Bindung eines Proteins auf einer Aminosilanoberflächen lediglich durch elektrostatische Wechselwirkungen 49 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen zwischen den Aminosilan-Seitenketten der Oberfläche und negativ geladenen Aminosäureseitenketten (z. B. Aspartat oder Glutamat). Im Vergleich zur kovalenten Bindung der Proteine auf den aldehydbeschichteten Oberflächen immobilisierte eine wesentlich geringere Menge Protein auf der Aminosilanoberfläche. Gegen die Verwendung von Nickelbeschichteten Oberflächen sprachen zwei Gründe. Erstens, die SH2 Domänen mussten als 6fach Histidin-markierte (His6)-Proteine exprimiert und aufgereinigt werden. Dies war nur sehr bedingt möglich, da durch die Expression in E. coli alle His6-SH2 Domänen unlöslich waren und unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt werden mussten. Dadurch konnte die Funktionalität der SH2 Domänen nicht mehr gewährleistet werden. Der zweite Grund, der gegen die Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen sprach, war (genau wie bei den Aminosilanoberflächen) die nicht-kovalente Bindung zwischen Protein und Oberfläche. Auch bei der Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen war es nicht möglich, eine ausreichende Menge an immobilisiertem Protein nachzuweisen. Im Gegensatz zu den Aminosilan- und Nickeloberflächen ist die Bindung von Proteinen an eine Aldehydoberfläche kovalenter Natur und erfolgt über die reaktiven Aldehyd-Gruppen (R-CH=O) der Oberfläche mit primären Aminen (R-NH2) des Proteins. Durch nukleophile Addition primärer Amine kommt es, unter Abspaltung von Wasser (Kondensation), zur Ausbildung kovalenter C=N Doppelbindungen, welche als ‚Schiff’sche Basen’ bezeichnet werden. Aus Gründen der besseren Löslichkeit wurden die zur Etablierung des Arrays verwendeten SH2 Domänen in Form von GST-Fusionsproteinen (GST-SH2) in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatografie über eine GSH-Sepharose-Säule aufgereinigt. Die Funktionalität der gereinigten GST-SH2 Domänen wurde mittels pull-down Experimenten (Abb. 2.2.1) überprüft. Hierzu wurden die bereits bekannten pTyr-abhängigen Interaktionen des Membranproteins CEACAM3 mit verschiedenen Mitgliedern aus der Familie der SrcKinase verifiziert (vgl. auch (Schmitter et al. 2007b)). Das Aufbringen der GST-SH2 Domänen auf die Aldehydoberfläche erfolgte mittels eines kontaktlosen Mikroarray-Druckers (Nano-Plotter 2.1, Fa. GeSim). Als Puffer für die Immobilisierung wurde PBS mit 10 % Glycerin verwendet, da auch bereits die gereinigten GST-SH2 Domänen gegen diesen Puffer dialysiert und bei –80 °C gelagert worden waren. Das im Immobilisierungspuffer enthaltene Glycerin soll zum einen die Stabilität der Proteine während der Verarbeitung gewährleisten und zum anderen die Viskosität der Lösung erhöhen, damit gleichmäßige und scharf begrenzte Spots erzielt werden und außerdem der Spot-Durchmesser relativ klein gehalten werden kann. 50 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Abb. 2.2.1 Die rekombinanten GST-SH2 Domänen sind funktionell. (A) Die angegebenen rekombinanten GST-SH2 Domänen wurden mit Ganzzelllysaten von HEK293T Zellen, in denen GFP (als Kontrollprotein) oder GFP-fusioniertes CEACAM3 in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimiert wurde, inkubiert. Das Präzipitat wurde mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper auf den Gehalt von CEACAM3-GFP (obere Reihe) untersucht. Der Einsatz von gleichen Mengen an GST-Fusionsproteinen oder GST allein wurde mittels Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft. (B) Die für das pull-down Experiment verwendeten Ganzzelllysate wurden durch Western Blot Analyse hinsichtlich Phosphorylierung und gleichmäßiger Expression von CEACAM3-GFP überprüft. Zunächst wurde die optimale Proteinkonzentration für die Generierung gleichmäßiger Spots ermittelt. Hierzu wurde jeweils ein konstantes Volumen (7,5 nl pro Spot) einer Proteinlösung mit steigender Proteinkonzentration in Triplikaten gedruckt. Zur Detektion der immobilisierten Proteine wurde der Array nach dem Blockieren der freien Aldehydgruppen (dieses Verfahren wird im nachfolgenden Kapitel 2.2.2 beschrieben) mit monoklonalem antiGST Primärantikörper und anschließend mit einem fluoreszenzmarkierten (Cy3) Sekundärantikörper inkubiert. Die dadurch fluoreszenzmarkierten Spots wurden mittels eines Mikroarray-Scanners (LS400 Reloaded, Fa. Tecan) detektiert. Abb. 2.2.2 Bestimmung der optimalen Proteinkonzentration zur Generierung gleichmäßiger Spots. (A) Unterschiedliche Proteinmengen von GST, GST-Src-SH2 oder GST-Slp76-SH2 Domänen wurden in dreifacher Ausführung als punktförmige Muster immobilisiert. Die Detektion der immobilisierten Proteine erfolgte mittels eines monoklonalen anti-GST Primärantikörpers, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper. Die Fluoreszenzsignale der einzelnen Spots wurden mittels eines Mikroarray-Scanners detektiert. (B) Grafische Darstellung der unter (A) ermittelten Fluoreszenzsignale. Die Nettosignalintensität ergibt sich aus Subtraktion des unspezifischen Hintergrunds vom gemessenen Fluoreszenzsignal. Dargestellt sind die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts von Triplikaten. 51 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Die konzentrationsabhängigen Fluoreszenzsignale der gedruckten Proteine sind in Abbildung 2.2.2 dargestellt. Die maximale Fluoreszenzintensität ist ab einer Proteinkonzentration von 1,0 ng/spot erreicht (Abb. 2.2.2B). Bis zu einer Proteinmenge von 1,6 ng/spot wurden distinkte Spots erzielt (Abb. 2.2.2A). Somit konnte die optimale Proteinkonzentration für den Druckvorgang auf einen Bereich von 1,0–1,6 ng/spot eingegrenzt werden. Für alle nachfolgenden Experimente wurde eine Proteinkonzentration von 1,3 ng/spot verwendet. Pro Versuchsdurchführung wurde eine individuelle Anordnung (Array) verschiedener GST-SH2 Domänen in mehrfacher Ausführung auf eine Aldehydoberfläche gedruckt. Die in Abbildung 2.2.2A gezeigte Anordnung der Proteine ist ein Beispiel für einen solchen Array. Jeweils 16 solcher Arrays konnten auf einem Standard-Glasobjektträger aufgebracht und separat beprobt werden. Um die erfolgreiche Immobilisierung der GST-SH2 Domänen nachweisen zu können, wurde bei jeder Versuchsdurchführung ein Array nach dem Blockieren der freien Aldehydgruppen nicht mit phosphorylierter Probe, sondern mit antiGST Primärantikörper und anschließend mit fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper inkubiert. Dieser Array wurde auch dazu verwendet, die relativen Mengen an immobilisierten GST-SH2 Domänen über die Fluoreszensintensität der Spots zu ermitteln. Allerdings ist diese Art der Mengenermittlung nur indirekt über die Fluoreszenzintensität der einzelnen Spots möglich, da die Anzahl der Aldehydgruppen pro Fläche, laut Herstellerangaben, unbekannt ist. Dennoch können die Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Spots dazu verwendet werden, die immobilisierten Mengen der unterschiedlichen GST-SH2 Domänen untereinander anzugleichen. Dies ermöglicht somit das Normalisieren der detektierten Phosphotyrosinabhängigen Bindungssignale auf die Menge an immobilisierten SH2 Domänen innerhalb eines Arrays. 2.2.2 Blockierung und Beprobung von SH2 Domänen Arrays Die Bildung der ‚Schiff’schen Basen’ zwischen Amino- und Aldehydgruppen erfolgt spontan ohne Energiezufuhr oder Katalysatoren. Somit war es unumgänglich vor der Beprobung der Arrays die noch freien Aldehydgruppen der Oberfläche abzusättigen, um unspezifische Bindungen des zu untersuchenden Protein Interaktionspartners an noch vorhandene freie Aldehydgruppen zu verhindern. Hierzu wurde eine 1%ige BSA-Lösung in PBS verwendet, die noch zusätzlich mit Ethanolamin (Endkonzentration 0,2 M) angereichert war. Die anschließende Beprobung des Arrays erfolgte als erstes mit rekombinanten, in vitro phosphorylierten Proteinen. 52 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Abb. 2.2.3 Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit dem fluoreszenzmarkierten und in vitro phosphorylierten zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3. (A) Rekombinantes, fluoreszenzmarkiertes CEACAM3zyto wurde mittels rekombinatem v-Src in vitro phosphoryliert und via Western Blot unter Verwendung eines monoklonalen anti-pTyr Antikörpers auf erfolgreiche Phosphorylierung überprüft (obere Reihe). Unter Einsatz eines monoklonalen anti-GST Antikörpers wurden die Phosphorylierungsansätze auf den gleichen Gehalt von GST-CEACAM3zyto überprüft (untere Reihe). (B) Zehn verschiedene GST-SH2 Domänenkonstrukte oder GST allein wurden in sechsfacher Ausführung, mit einer Proteinkonzentration von 1,3 ng/spot, auf einer aldehydbeschichteten Oberfläche immobilisiert. Die erfolgreiche Immobilisierung der GST-Proteine wurde mittels monoklonalem anti-GST Primärantikörper, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper überprüft (vgl. auch (C) linke Spalte unten). (C) Auf zwei aldehydbeschichteten Objektträgern wurden jeweils acht identische Arrays aufgebracht (linke Spalte unten, weiß umrandet; unter (B) beschrieben). Im Folgenden wurden jeweils zwei Arrays mit unterschiedlichen Konzentrationen des unter (A) beschriebenen in vitro phosphorylierten GST-CEACAM3zyto beprobt. Als Negativkontrolle wurden zwei Arrays mit unphosphoryliertem GST-CEACAM3zyto inkubiert (linke Spalten, oben). Um eine Autofluoreszenz der immobilisierten GST-SH2 Domänen auszuschließen, blieben zwei Arrays unbeprobt (rechte Spalte unten). 53 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Hierzu wurde zunächst der zytoplasmatische Abschnitt des humanen Oberflächenrezeptors CEACAM3 als GST-Fusionsprotein (CEACAM3zyto) hergestellt und mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin markiert. Anschließend wurden verschiedene Konzentrationen von CEACAM3zyto mittels gereinigter Src-Kinase in vitro phosphoryliert. Die Phosphorylierung wurde mittels Western Blot überprüft (Abb. 2.2.3A). Die zur Beprobung verwendeten Arrays umfassten zunächst lediglich ein kleines Repertoire von zehn verschiedenen GST-SH2 Konstrukten sowie GST und PBS als Negativkontrollen. Auf zwei aldehydbeschichtete Objektträger wurden jeweils acht identische Arrays gedruckt. Ein Array umfasste dabei die zur Untersuchung herangezogenen GST-SH2 Domänen sowie die GST- und PBS-Kontrollen in sechsfacher Ausführung (Abb. 2.2.3B). Die erfolgreiche Immobilisierung der GST-SH2 Domänen wurde durch anti-GST Primärantikörper, wie im Abschnitt 2.2.1 beschrieben, überprüft (Abb. 2.2.3B). Es wurden jeweils zwei Arrays mit einer definierten Konzentration des in vitro phosphorylierten CEACAM3zyto (pCEACAM3zyto) inkubiert (Abb. 2.2.3C). Die Beprobung erfolgte automatisiert mit Hilfe einer Mikroarray-Hybridisierstation (HS 400 ProTM, Fa. Tecan). Nach der Beprobung wurden beide Objektträger mit derselben elektronischen Nachverstärkung des Messsignals ausgelesen. Für die Arrays, welche mit unphosphoryliertem CEACAM3zyto beprobt wurden sowie für die unbeprobten Arrays waren keine Bindungssignale detektierbar (Abb. 2.2.3C). Somit kann ausgeschlossen werden, dass GST-CEACAM3zyto phosphorylierungsunabhängig mit den GST-SH2 Domänen interagiert bzw. die immobilisierten GST-SH2 Domänen durch Autofluoreszenz falsch positive Bindungssignale liefern. Die Nettosignalintensitäten der Bindungen an die N-terminale und die Tandem (NC)-SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p85 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3KR1) sind bei allen vier pCEACAM3zyto Konzentrationen gleich (Abb. 2.2.4A). Dies lässt darauf schließen, dass diese GST-SH2 Domänen bereits ab einer Konzentration von 1,57 µg mit pCEACAM3zyto abgesättigt sind. Betrachtet man allerdings die einzelnen Signalintensitäten im Verhältnis zum unspezifischen Hintergrund des Arrays, so ist dieses Verhältnis umso größer, je weniger pCEACAM3zyto zur Beprobung des Arrays verwendet wird (Abb. 2.2.4B). Die ausschließliche Bindung von pCEACAM3zyto an die GST-SH2 Domänen PI3KR1-N- und PI3KR1-NC legte die Vermutung nahe, dass möglicherweise noch andere Faktoren (Inkubationsdauer, Inkubationstemperatur und/oder „molecular crowding“ Effekte) für die Interaktion mit anderen SH2 Domänen wichtig sein könnten. Dies wurde überprüft, indem in einem ersten Versuchsdurchlauf die Inkubationsdauer mit pCEACAM3zyto von 1 h bis auf 4 h 54 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen erhöht wurde. Als diese Änderung in der Versuchsdurchführung keinen Effekt zeigte, wurde die Inkubationstemperatur schrittweise von 20 °C über 25 °C bis auf 30 °C angehoben. Allerdings führte auch diese Modifikation in der Beprobung zu keiner Änderung der Ergebnisse. Abb. 2.2.4 Grafische Darstellung der Fluoreszenzsignale, die durch die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit unterschiedlichen Konzentrationen von in vitro phosphoryliertem GST-CEACAM3zyto ermittelt wurden. (A) Grafische Darstellung der phosphorylierungsabhängigen Bindung von GSTCEACAM3zyto an die immobilisierten GST-SH2 Domänen nach Abzug des unspezifischen Hintergrundsignals. Die Grafik zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von Sechsfachbestimmungen. (B) Grafische Darstellung der Verhältnisse Fluoreszenzsignal der Spots zu unspezifischem Hintergrundfluoreszenzsignal. Die Grafik zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von Sechsfachbestimmungen. Dies gilt ebenfalls für den Versuch, einen „molecular crowding“ Effekt in der Beprobungslösung zu erzeugen. Hierfür wurden der Lösung von pCEACAM3zyto verschiedene Konzentrationen (0,5 %, 1 % bzw. 1,5 %) BSA zugesetzt. Unabhängig von den verschiedentlich variierten Inkubationsparametern blieb es bei der ausschließlichen Bindung von pCEACAM3zyto an PI3KR1-N- und -NC-SH2. Ebenso erfolglos blieben auch die Versuche, den relativ starken Hintergrund durch Variation der Beprobungs- und Waschparameter zu verringern. Dies legte die Vermutung nahe, dass möglicherweise freier Fluoreszenzfarbstoff aus der Beprobungslösung an immobilisiertes BSA (welches zum 55 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Blockieren verwendet wurde) gebunden hatte. Eine weitere Möglichkeit ist, dass sich bei der Beprobung überschüssiges pCEACAM3zyto unspezifisch auf der Oberfläche ablagerte und durch die Waschschritte nicht effizient genug entfernt wurde. Aufgrund der Tatsache, dass die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit rekombinantem pCEACAM3zyto, hinsichtlich der Detektion von Bindungssignalen, nur mäßig erfolgreich war, wurde das System modifiziert. Durch die Verwendung von Ganzzelllysaten zur Beprobung wurde der Versuchsaufbau dahingehend verändert, dass es ähnlich einem pull-down Experiment auch den Einfluss zellulärer Proteine auf die Interaktion berücksichtigt. Durch diese Modifikation der Beprobung ist es zwar nicht mehr möglich, ausschließlich direkte Interaktionen zwischen den SH2 Domänen und dem zu untersuchenden tyrosinphosphorylierten Protein nachzuweisen, es können aber dennoch Aussagen über eine indirekte Assoziation zwischen beiden Proteinen getroffen werden. Der hier angestrebte Versuchsaufbau ist im Hinblick auf Versuchsdurchführung und –dauer wesentlich unkomplizierter, als die bisher zu Interaktionsstudien verwendeten pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitationen. Des Weiteren können sehr viel mehr SH2 Domänen auf ihre Interaktion mit einem tyrosinphosphorylierten Protein untersucht werden als es im Maßstab eines pull-down Experimentes oder einer Koimmunpräzipitation möglich wäre. Die im weiteren Versuchsaufbau zur Beprobung verwendeten Ganzzelllysate enthielten CEACAM3 und v-Src. Beides wurde zuvor in HEK293T Zellen koexprimiert. CEACAM3 wurde als GFP-Fusionsprotein mit zusätzlicher Hämagglutininepitop (HA)-Markierung (CEACAM3-HA-GFP) exprimiert. Die GFP-Fusion ermöglichte es, die verschiedenen Lysate auf den gleichen Gehalt an CEACAM3 einzustellen. Das Angleichen der einzelnen Lysate erfolgte dabei durch Auslesen der GFP-Fluoreszenz mittels des Varioskan Flash (Firma Thermo Scientific). Zusätzlich zur GFP-Fusion besaß CEACAM3 noch eine Peptidsequenz aus dem Hämagglutinin (HA) des Influenz A Virus. Diese HA-Sequenz war nötig, um das auf dem Array gebundene CEACAM3 detektieren zu können. Die Detektion erfolgte mittels eines spezifischen monoklonalen Primärantikörpers gegen die HA-Sequenz, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper. Zur Beprobung wurden drei verschiedene Lysatverdünnungen getestet, wobei die Lysate immer auf die gleiche Konzentration von phosphoryliertem und unphosphoryliertem CEACAM3 eingestellt wurden (Abb. 2.2.5A). Verglichen mit den Beprobungen, bei denen Fluoreszenzfarbstoff-markiertes, rekombinantes GST-CEACAM3zyto verwendet wurde, konnte bei der Verwendung von Ganzzelllysaten ein Rückgang des unspezifischen Hintergrundsignals beobachtet werden (Abb. 2.2.5C). 56 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Abb. 2.2.5 Evaluierung verschiedener Blockierungs- und Beprobungsparameter für den SH2 Domänen Array. (A) CEACAM3-HA-GFP wurde in An- oder Abwesenheit von v-Src in HEK293T Zellen exprimiert. Die Zellen wurden lysiert und hinsichtlich gleichmäßiger Expression von CEACAM3-HA-GFP und Phosphorylierung mittels Western Blot Analyse überprüft. (B) Auf einem aldehydbeschichteten Objektträger wurden 14 identische Arrays, bestehend aus 15 unterschiedlichen GST-SH2 Domänen und GST allein, in jeweils vierfacher Ausführung gedruckt (Anordnung innerhalb eines Arrays siehe Tabelle). Bei einem Array wurden die nach dem Drucken noch freien Aldehydgruppen mittels 0,25%iger Natriumborhydrid (NaBH4)-Lösung reduziert. Bei einem zweiten Array erfolgte die Absättigung der noch freien Aldehydgruppen mittels einer 1%igen BSA-Lösung. Anschließend wurden beide Arrays zur Detektion der immobilisierten GST-Proteine unter den gleichen Bedingungen mit anti-GST Primär- und Cy3-markiertem Sekundärantikörper inkubiert. (C) Abbildung von 12 SH2 Domänen Arrays, deren nach dem Drucken noch freie Aldehydgruppen, wie unter (B) 57 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen beschrieben, mittels BSA abgesättigt oder NaBH4 reduziert wurden. Die Arrays wurden mit Ganzzelllysaten (siehe (A)) beprobt, die zuvor mittels PBS auf eine Proteinkonzentration von 0,25mg/ml, 0,5mg/ml bzw. 1,0mg/ml verdünnt wurden. Die Dektektion von gebundenem CEACAM3-HA-GFP erfolgte mittels monoklonalem anti-HA Primärantikörper, gefolgt von Cy3-markiertem Sekundärantikörper. (D) Grafische Darstellung der unter (C) detektierten und in Relativwerte umgerechneten Bindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Vierfachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten. Wie bei der Beprobung mit Fluoreszenz-markiertem rekombinantem GST-CEACAM3zyto, konnte auch für die mit BSA blockierten und mit Ganzzelllysaten beprobten Arrays kein anderes Bindungsverhalten von CEACAM3 an einzelne SH2 Domänen detektiert werden. Auch in diesem Fall konnte lediglich die Bindung von CEACAM3 an die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 detektiert werden (Abb. 2.2.5C). Wurden die freien Aldehydgruppen der Oberfläche jedoch nicht mit BSA abgesättigt, sondern mittels 0,25%iger Natriumborhydridlösung (NaBH4) reduziert, konnten bei anschließender Beprobung der Arrays mit den gleichen Ganzzelllysaten Bindungssignale an bis zu 10 verschiedene SH2 Domänen detektiert werden (Abb. 2.2.5C). Die Behandlung der Aldehydoberfläche mit dem Reduktionsmittel NaBH4 reduziert freie Aldehydgruppen in nicht reaktive Alkoholgruppen. Dies verhindert die Ausbildung von ‚Schiff’schen Basen’ mit Proteinen der Beprobungslösung. Außerdem reduziert NaBH4 auch die Doppelbindungen der ‚Schiff’schen Basen’ der immobilisierten GST-SH2 mit der Aldehydoberfläche zu stabilen sekundären Aminoverbindungen, wodurch die GST-SH2 fester an die Oberfläche gebunden werden. Auch die Detektion der an die Oberfläche gebundenen GST-SH2 ist im Falle der mit NaBH4 reduzierten Arrays wesentlich gleichmäßiger als für die Arrays, die mit BSA blockiert wurden (Abb. 2.2.5B). Aus diesem Grund wurden alle weiteren Arraybeprobungen unter Ausschluss von BSA durchgeführt. Auch in Bezug auf die Gesamtproteinmenge des zur Beprobung verwendeten Zelllysates wurde phosphorylierungsabhängigem festgestellt, Bindungssignal dass und sich das Verhältnis unspezifischem zwischen Hintergrundsignal verbesserte, je stärker das Lysat verdünnt wurde. Dadurch konnten die Bindungssignale von phosphoryliertem CEACAM3 an die verschiedene GST-SH2 Domänen deutlicher detektiert und ausgewertet werden (Abb. 2.2.5D). Für alle drei Lysat-Verdünnungsstufen (0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml und 1,0 mg/ml Proteingehalt im Lysat) wurden Interaktionen von phosphoryliertem CEACAM3 mit den SH2 Domänen von verschiedenen Signalproteinen identifiziert. Auch blieben die Verhältnisse der Bindungssignale über die einzelnen Verdünnungsstufen gleich. Dies war in Bezug auf die Versuchsdurchführung ein sehr positiver Effekt, da die Verdünnung der Lysate lediglich auf die Reduktion des unspezifischen Hintergrundsignals Einfluss hatte und nicht auf die Interaktion des zu untersuchenden pTyr58 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Proteins mit den einzelnen SH2 Domänen. Wie erwartet, zeigten die Negativkontrollen (GST und GST-Slp76-SH2) keine Interaktion mit phosphoryliertem CEACAM3. Im Hinblick auf die Identifizierung neuer Interaktionspartner für CEACAM3 wart deutlich zu erkennen, dass der Rezeptor in seiner phosphorylierten Form eine sehr starke Interaktion mit der SH2 Domäne der Src-Kinase Yes, des Signalproteins Grb14 und der N-terminalen SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K (PI3KR3) aufwies. Auch für die SH2 Domäne des Adapterproteins Nck2, der Proteintyrosinkinase Lck und die C-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 konnten Bindungssignale detektiert werden, diese entsprachen in etwa den Signalstärken der Positivkontrollen Hck und Vav. Zwei dieser neu identifizierten, potentiellen Interaktionspartner für CEACAM3 werden in den Kapiteln 3.1 und 3.2 verifiziert und hinsichtlich ihrer Funktion näher untersucht. 2.2.3 Detektion der an die SH2 Domänen gebundenen Phosphotyrosinproteine mittels spezifischer Antikörper Im Folgenden sollten zur Erweiterung des Detektionsspektrums unterschiedliche Antikörper gegen einen spezifischen Epitop-Tag des gebundenen Phosphotyrosinproteins getestet werden. Dadurch war es möglich, verschiedene bereits existierende Plasmidkonstrukte zur Expression in HEK293T Zellen zu verwenden. Neben dem bisher verwendeten monoklonalen anti-HA Primärantikörper wurde im Folgenden auch ein polyklonaler anti-GFP Primärantikörper zur Detektion des gebundenen CEACAM3-HA-GFP verwendet. Abb. 2.2.6 Detektion von gebundenem Phosphotyrosinprotein mittels monoklonalem anti-HA Antikörper und polyklonalem anti-GFP Antikörper. Vier identische SH2 Domänen Arrays wurden mit Ganzzelllysaten von HEK293T Zellen beprobt. Die für die Herstellung der Ganzzelllysate verwendeten HEK293T Zellen exprimierten CEACAM3-HA-GFP in An- oder Abwesenheit von v-Src. Das mit den SH2 Domänen interagierende CEACAM3-HA-GFP wurde zum einen mittels monoklonalem anti-HA Primär- und Cy3markierten Ziege-anti-Maus Sekundärantiköper nachgewiesen (linke Spalte), zum anderen wurde das gebundene CEACAM3-HA-GFP mittels polyklonalem anti-GFP Primärantikörper, gefolgt von Cy3-markiertem Ziege-anti-Kanninchen Sekundärantikörper nachgewiesen (rechte Spalte). Zu Zwecken der Vergleichbarkeit wurden jeweils zwei identische Arrays mit dem gleichen Lysat von phosphoryliertem und unphosphoryliertem CEACAM3-HA-GFP inkubiert und alle vier Arrays mit der gleichen Signalverstärkung ausgelesen. Die Detektion des mit den SH2 59 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Domänen interagierenden CEACAM3-HA-GFP erfolgte mittels anti-HA bzw. anti-GFP Antikörper (Abb. 2.2.6). Mit beiden Antikörpern konnte gebundenes, phosphoryliertes CEACAM3 detektiert werden. Das leicht erhöhte Hintergrundsignal des GFP-Antikörpers lässt sich durch Herabsetzung der Verstärkungsspannung reduzieren. In einem weiteren Schritt sollten, unter Verwendung von monoklonalem anti-Phosphotyrosin (pTyr) Primärantikörper, alle an die SH2 Domänen gebundenen, tyrosinphosphorylierten Proteine des Zelllysates nachgewiesen werden. Mit dieser Form der Detektion können SH2 abhängige Bindungsstudien durchgeführt werden, die das gesamte endogene Phosphotyrosinproteom der Zelle umfassen. Im Detail bedeutet dies, dass zum Beispiel Zelllysate in An- und Abwesenheit spezifischer PTKs auf eine Veränderung im Phosphotyrosin-abhängigen Bindungsmuster untersucht werden können. Um die Funktionalität des verwendeten anti-pTyr Primärantikörpers zu testen, wurden in einem ersten Schritt Ganzzelllysate verwendet, in denen zuvor CEACAM3 und v-Src koexprimiert wurden. Dieser Versuch zeigte eine effiziente Detektion der auf dem Array gebunden Proteine durch den anti-pTyr Primärantikörper (Abb. 2.2.7A). Abb. 2.2.7 Detektion gebundener Phosphotyrosinproteine mittels spezifischem anti-Phosphotyrosin Antikörper. (A) Repräsentative Abbildung von zwei identischen SH2 Domänen Arrays, die mit phosphorylierten oder unphosphorylierten Ganzzelllysaten beprobt wurden. Die verwendeten Ganzzelllysate wurden aus HEK293T Zellen hergestellt, die CEACAM3-HA-GFP in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimierten. Die Detektion von Phosphotyrosinproteinen, die mit den einzelnen SH2 Domänen interagieren, erfolgte mittels monoklonalem anti-pTyr Primär- und Cy3-markierten Sekundärantikörper. Die Anordnung der Proteine innerhalb des Arrays ist in der Tabelle dargestellt. (B) Grafische Darstellung der unter (A) detektierten und in Relativwerte umgerechneten Bindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Vierfachbestimmungen. 60 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Beim Vergleich der relativen Nettobindungssignale (Abb. 2.2.7B) ist zu erkennen, dass die meisten der Signale in etwa den relativen Nettobindungssignalen aus Abbildung 2.2.5C entsprechen. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Bindungssignale zu einem großen Teil auf das rekombinant exprimierte CEACAM3 zurückzuführen sind. Bei dieser vergleichenden Betrachtung lassen sich allerdings auch Unterschiede erkennen. So konnte für die SH2 Domäne des Adapterproteins Grb2 bei der Verwendung des anti-pTyr Antikörpers ein stärkeres Bindungssignal detektiert werden als beim direkten Nachweis von CEACAM3 mittels anit-HA Antikörpers. Dieser Unterschied lässt auf die Interaktion der Grb2-SH2 Domäne mit tyrosinphosphorylierten endogenen Proteinen schließen. Insgesamt zeigt dieses Experiment, dass die Detektion von gebundenen tyrosinphosphorylierten Proteinen auch mittels monoklonalem anti-pTyr Antikörpern möglich ist. In einem weiterführenden Versuchsaufbau sollte überprüft werden, ob der SH2 Domänen Array auch zur Betrachtung des gesamten pTyr-Proteoms eines Zelllysats auf der Ebene von endogenen Proteinen angewendet werden kann. Hierzu sollte das pTyr-abhängige Interaktionsmuster eines Zelltyps in Abhängigkeit von An- und Abwesenheit einer endogenen PTK untersucht werden. Für diese Untersuchungen wurde die humane kolorektale Karzinomzelllinie DLD1 verwendet. Bisher zeigten zahlreiche Studien, dass pathologische Migrationsvorgänge, wie die Tumormetastasierung, auf verstärkte Tyrosinphosphorylierungsprozesse zurückzuführen sind. In diesem Zusammenhang konnte für verschiedene humane Krebsarten eine gesteigerte FAK-Expression bzw. FAK-Aktivität nachgewiesen werden (Cance et al. 2000; Yu et al. 2006; Chatzizacharias et al. 2008). Die Unterdrückung der FAKExpression in einer Karzinomzelllinie sollte somit einen Effekt auf die Tyrosinphosphorylierungen dieses Zelltyps haben. Es wurde erwartet, dass die Unterdrückung der FAK-Expression eine reduzierte Menge an tyrosinphosphorylierten Proteinen zur Folge hat. Diese Unterschiede, zwischen den wildtypischen Karzinomzellen und den Zellen mit reduzierter FAK-Expression sollten auf Ebene des gesamten pTyr-Proteoms mittels des SH2 Domänen Arrays untersucht werden. Arbeiten an unserem Lehrstuhl zeigten, dass die humane kolorektale Karzinomzelllinie DLD1 eine starke FAK-Expression und ein hohes Migrationspotential aufweist. Die Unterdrückung der FAK-Expression in diesem Zelltyp mittels der shRNA-Methodik bewirkte die Aufhebung dieses hohen Migrationspotentials. Aus diesem Grund wurde diese Zelllinie für weitere Untersuchungen verwendet. Ziel dieses Versuchsaufbaus war es, ein verändertes Bindungsverhalten endogener pTyr-Proteine an die SH2 Domänen zu visualisieren, wenn die Expression von endogener FAK unterdrückt ist. Zu 61 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen diesem Zweck wurden zwei stabile DLD1 Zelllinien verwendet. Die eine Zelllinie exprimierte eine short-hairpin (sh)RNA gegen die FAK, während die andere Zelllinie eine ungerichtete (scrambled) shRNA exprimierte und somit DLD1-Wildtyp Eigenschaften aufwies. Nach einem 24 stündigen Serumentzug wurden die Zellen lysiert. Die Lysate wurden in einem Western Blot hinsichtlich der Expression von endogener FAK untersucht (Abb. 2.2.8A). Abb. 2.2.8 Die unterdrückte Expression von endogener FAK in DLD1 Zellen resultiert in verändertem Bindungsverhalten von endogenen tyrosinphosphorylierten Proteinen an verschiedene SH2 Domänen. (A) DLD1 Zellen mit stabiler Expression von shRNA gegen FAK oder ungerichteter shRNA (shRNA-scrambled) wurden durch Western Blot Analyse auf endogene FAK-Expression überprüft. Zum Nachweis der FAKExpression wurde ein monoklonaler anti-FAK Antikörper verwendet. (B) Repräsentative Abbildung von zwei identischen Arrays, die mit DLD1 Ganzzelllysaten (siehe (A)) beprobt wurden. Die an die SH2 Domänen gebundenen endogenen Phosphotyrosinproteine wurden mittels monoklonalem anti-Phosphotyrosin Primärantikörper und Cy3-markiertem Sekundärantikörper nachgewiesen. Die Anordnung der GST-Proteine innerhalb eines Arrays ist tabellarisch dargestellt. (C) Grafische Darstellung der unter (B) detektierten und in Relativwerte umgerechneten Nettobindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Vierfachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten. 62 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Um vergleichbare Bindungssignale der Lysate mit und ohne FAK-Expression zu gewährleisten, wurden die Lysate vor der Beprobung der Arrays auf einen Gesamtproteingehalt von 0,5 mg/ml eingestellt. Anschließend wurden die Lysate zur Beprobung zweier identischer Arrays benutzt und die gebundenen, endogenen Phosphotyrosinproteine mittels anti-pTyr Primärantikörper nachgewiesen. Vergleicht man die relativen Signalintensitäten des DLD1 Lysates mit der scrambled shRNA mit den Signalintensitäten des Lysats mit der reduzierten FAK-Expression, ist ein Rückgang der Bindung an verschiedene SH2 Domänen zu erkennen (Abb. 2.2.8B und C). Für die SH2 Domänen der PI3KR1 (N-terminale und Tandem (NC)-SH2 Domäne) und Hck beträgt dieser Rückgang mehr als 60 %. Für die Interaktionen mit der C-terminalen SH2 Domäne von PI3KR1 ist bei herunterregulierter FAK-Expression nur ein mäßiger Rückgang zu verzeichnen – ebenso für die SH2 Domänen der Adapterproteine Nck1, Nck2, Grb2, der Src-Kinase Hck und des GuaninnukleotidAustauschfaktors Vav1. Die Abwesenheit von FAK zeigte keine Veränderung bei der Bindung von pTyr-Proteinen an die SH2 Domäne von Tensin-1 (TNS1), welches ein wichtiges Protein in Fokalkontakten ist und eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration spielt (Le Clainche and Carlier 2008). Auch die SH2 Domänen der bekannten FAKInteraktionspartner Src, Phospholipase-Cγ-1 (PLCG1; N- und C-terminale SH2 Domäne) und SHC zeigten keine Unterschiede im pTyr-abhängigen Bindungsverhalten bei herunterregulierter FAK-Expression. Allerdings bewegten sich die Bindungssignale in einem sehr niedrigen Detektionsbereich, wodurch eine exakte Auswertung dieser Signale nicht gewährleistet werden konnte. Durch diesen Versuchsaufbau ist es gelungen, nicht nur die Bindung überexprimierter, sondern auch endogener Phosphotyrosinproteine an die SH2 Domänen nachzuweisen. Zusammenfassend betrachtet zeigen diese Ergebnisse, dass der SH2 Domänen Array durch Verwendung unterschiedlicher monoklonaler und polyklonaler Antikörpern gegen EpitopTags oder spezifische Strukturen wie Phosphotyrosine zur Beantwortung verschiedener Fragestellungen herangezogen werden kann. 2.2.4 Verifikation des SH2 Domänen Arrays – Nachweis zytoplasmatischer Proteintyrosinkinasen Der in den vorangegangenen Kapiteln entwickelte SH2 Domänen Array stellt eine sehr gute Methodik dar, um pTyr-abhängige Protein-Protein Interaktionen zu analysieren bzw. neue Interaktionspartner zu identifizieren. Die bisher beschriebene Etablierung dieses Systems 63 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen erfolgte anhand des membranständigen, phagozytischen Rezeptors CEACAM3. In einem weiteren Schritt sollte überprüft werden, ob der SH2 Domänen Array auch für Interaktionsstudien von zytoplasmatischen Proteinen verwendet werden kann. Aus diesem Grund wurde in dem vorliegenden Kapitel die Funktionalität des SH2 Domänen Arrays anhand bereits bekannter Interaktionen zwischen SH2 Domänen und der humanen Fokalen Adhäsionskinase (FAK) verifiziert. Zu diesem Zweck wurden mehrere identische Arrays mit den SH2 Domänen bekannter FAK Interaktionspartner gedruckt. Jede SH2 Domäne wurde in vierfacher Ausführung auf der Aldehydoberfläche immobilisiert. In Abbildung 2.2.9A ist die Anordnung der GST-SH2 Domänen im Array tabellarisch dargestellt. Zur Beprobung der Arrays wurden HEK293T Ganzzelllysate verwendet, welche entweder phosphorylierte oder unphosphorylierte FAK enthielten. Nach der Beprobung wurde die an die GST-SH2 Domänen gebundene FAK mit einem monoklonalen anti-HA Primärantikörper und einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper detektiert und mit Hilfe des Fluoreszenzscanners ausgelesen (Abb. 2.2.9C). Die zur Beprobung verwendeten Ganzzelllysate wurden mittels Western Blot Analyse auf den gleichmäßigen Gehalt von FAK-HA überprüft (Abb. 2.2.9B). Um die detektierten Fluoreszenzsignale grafisch darstellen zu können, wurden die Signalintensitäten unter Verwendung eines internen Standards normalisiert. Dieser Standard entspricht der Fluoreszenzintensität einer definierten Menge eines monoklonalen Antikörpers, welcher in vierfacher Ausführung auf die Aldehydoberfläche gedruckt und durch den Cy3markierten Sekundärantikörper erkannt wurde. Im vorliegenden Experiment wurde ein monoklonaler anti-Myc Antikörper mit einer Konzentration von 0,07 ng/Spot als interner Standard verwendet. Die Fluoreszenzsignalintensität des immobilisierten anti-Myc Antikörpers war für beide Arrays (beprobt mit phosphorylierten und unphosphorylierten FAK-HA Lysaten) gleich. Es ist eine phosphorylierungsabhängige Interaktion der FAK (pFAK) mit den SH2 Domänen von Nck1, Nck2, Grb2, SHC1, Csk, der N-terminalen SH2 Domäne der p85-Untereinheit der PI3K (PI3KR1-N) und der Tandem-SH2 Domäne der PI3KR1 (PI3KR1-NC) zu erkennen (Abb. 2.2.9D). Ebenso wurden auch für die C-terminale SH2 Domäne der Phospholipase-Cγ-2 (PLCG2-C), die SH2 Domänen der PTKs Src, Csk und Hck und die SH2 Domäne von Vav Bindungssignale detektiert. Im Vergleich dazu konnten keine phosphorylierungsabhängigen Interaktionen der FAK mit den Tandem-SH2 Domänen der Phospholipase-Cγ-2 (PLCG2-NC) sowie der C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR1 ermittelt werden. 64 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Abb. 2.2.9 Die Fokale Adhäsionskinase interagiert tyrosinphosphorylierungsabhängig mit den SH2 Domänen verschiedener Signalproteine. (A) Tabellarische Darstellung der Anordnung von 14 verschiedenen GST-SH2 Domänen und GST allein sowie anti-Myc Antikörper (als interner Standard) in einem Array. (B) Western Blot Analyse der verwendeten HEK293T Ganzzelllysate auf Gehalt von FAK und v-Src. (C) Repräsentative Abbildung von drei identischen Arrays. Je ein Array wurde mit unphosphoryliertem (links oben) und phosphoryliertem (links unten) Ganzzelllysat beprobt. Die an die SH2 Domänen gebunde FAK-HA wurde durch monoklonalen anti-HA Primär- und Cy3-markierten Sekundärantikörper nachgewiesen. Ein dritter Array wurde zum Nachweis der erfolgreichen Immobilisierung der GST-SH2 Domänen und GST allein verwendet. Die Detektion erfolgte mittels monoklonalem anti-GST Primär- und Cy3-markiertem Sekundärantikörper. (D) Grafische Darstellung der unter (C) detektierten und in Relativwerte umgerechneten Nettobindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Vierfachbestimmungen. Um die erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen, wurde ein pull-down Experiment durchgeführt. Hierzu wurde eine kleine Auswahl von GST-SH2 Domänen an GSH-Sepharose gekoppelt und mit Ganzzelllysaten, welche phosphorylierte oder unphosphorylierte FAK enthielten, 65 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen inkubiert. Zur Herstellung dieser Ganzzelllysate wurde FAK-HA in An- oder Abwesenheit von v-Src in HEK293T Zellen exprimiert. Mittels Western Blot Analysen wurden die Lysate auf den Gehalt gleicher Mengen von FAK-HA sowie auf Tyrosinphosphorylierung überprüft (Abb. 2.2.10B). Abb. 2.2.10 Die Fokale Adhäsionskinase interagiert phosphorylierungsabhängig mit den SH2 Domänen von Nck2, Grb2, Hck, PI3KR1-N und PI3KR1-NC. (A) Die angegebenen rekombinanten GST-SH2 Domänen oder GST allein wurden mit Ganzzelllysaten von HEK293T Zellen, in denen HA-markierte FAK in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimiert wurde, inkubiert. Das Präzipitat wurde mit monoklonalem anti-HA Antikörper auf den Gehalt von FAK-HA (obere Reihe) untersucht. Der Einsatz von gleichen Mengen an GSTFusionsproteinen oder GST allein wurde mittels Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft. (B) Die für das pull-down Experiment verwendeten Ganzzelllysate wurden durch Western Blot Analyse hinsichtlich Phosphorylierung und gleichmäßiger Expression von FAK-HA überprüft. Das Ergebnis des pull-down Experiments zeigte, dass die GST-SH2 Domänen von Nck2, Grb2, Hck, PI3KR1-N und PI3KR1-NC die FAK phosphorylierungsabhängig präzipitieren (Abb. 2.2.10A). Allerdings assoziierte die unphosphorylierter FAK schwächer mit der HckSH2 Domäne als dies anhand des SH2 Domänen Arrays erwartet wurde. Ein weiterer interessanter Befund war die Interaktion der PI3KR1-C-SH2 Domäne mit unphosphorylierter FAK, nicht aber mit der phosphorylierten Form (Abb. 2.2.10A). Auch dies ist ein, im Vergleich zum SH2 Domänen Array, abweichendes Resultat. Insgesamt betrachtet bestätigten die Ergebnisse des pull-down Experiments die zuvor im SH2 Domänen Array identifizierten Interaktionen. Um die abweichenden Resultate zwischen SH2 Domänen Array und pull-down Experiment näher zu beleuchten, sollten weitere Untersuchungsmethoden, wie Far-Western oder Koimmunpräziptiation herangezogen werden. 66 2 2.3 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Diskussion Die Analyse von Protein-Protein Interaktionen erfolgt gegenwärtig vor allem durch Anwendung konventioneller Techniken wie GST-pull-down oder Koimmunpräzipitation mit nachgeschalteter Western Blot Analyse. Allerdings sind diese Techniken sehr zeitintensiv und können nicht in größerem Maßstab angewendet werden. Durch den Einsatz von Protein Arrays ist es möglich, Protein-Protein Interaktionen in einem wesentlich schnelleren und größeren Maßstab zu analysieren. Gerade im Hinblick auf die intrazelluläre Signalweiterleitung sind Protein-Protein Interaktionen und die damit verbundene Assemblierung von Signalkomplexen von entscheidender Bedeutung. Ein sehr fein regulierter Mechanismus in der Signalweiterleitung innerhalb der Zelle ist die Phosphorylierung spezifischer Tyrosinreste einzelner Signalproteine. Diese phosphorylierten Tyrosinreste (pTyr) dienen ihrerseits als Bindestelle für andere Proteine, welche SH2 Domänen als spezifische Interaktionsdomänen tragen. In diesem Zusammenhang konnten durch die Anwendung eines funktionellen SH2 Domänen Arrays Bindungseigenschaften von Phosphotyrosin-modifizierten Peptiden quantitativ bestimmt werden (Jones et al. 2006; Kaushansky et al. 2010). Die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik der Analyse von Interaktionen zwischen pTyr-Proteinen und SH2 Domänen stellt eine Kombination und somit auch Weiterentwicklung der bereits existierenden Ansätze (SH2 Domänen Array und pull-down Experiment) dar. Zur Herstellung eines SH2 Domänen Arrays steht eine große Auswahl unterschiedlich beschichteter Trägeroberflächen zur Verfügung. Die Möglichkeiten, die SH2 Domänen auf einer Oberfläche zu immobilisieren, reichen von unspezifischer Adsorbtion der SH2 Domäne an die Trägersubstanz, über elektrostatische Wechselwirkung zwischen SH2 Domäne und Oberfläche, bis hin zur kovalenten Bindung der SH2 Domäne an die Trägeroberfläche. Diese drei Möglichkeiten haben gemeinsam, dass die SH2 Domänen in ungerichteter räumlicher Orientierung auf der Oberfläche der Trägersubstanzen immobilisieren. Die Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen ermöglicht die Immobilisierung von 6-fach Histidinmarkierten (His6) SH2 Domänen in einer einheitlichen räumlichen Orientierung. Allerdings konnte die Funktionalität der His6-SH2 Domänen, aufgrund der Aufreinigung unter denaturierenden Bedingungen, nicht gewährleistet werden. Aus diesem Grund wurden die SH2 Domänen als GST-Fusionsproteine exprimiert und aufgereinigt. Ein aldehydbeschichteter Objektträger zur kovalenten Immobilisierung der GST-SH2 Domänen ist trotz der variablen räumlichen Orientierung der gebundenen Proteine die optimale Oberfläche zur 67 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Herstellung des SH2 Domänen Arrays. Die Immobilisierung der GST-SH2 Domänen erfolgt durch Ausbildung ‚Schiff’scher Basen’ zwischen primären Aminen des Proteins und der Aldehydgruppe der Oberfläche. Im Vergleich zu den anderen Methoden, die eine ungerichtete Immobilisierung erlauben, ist die Verwendung von Aldehydoberflächen die einzige Möglichkeit, die eine kovalente Verknüpfung des Proteins mit der Oberfläche bewerkstelligt. Diese ohnehin sehr stabile Bindung wird durch den Einsatz von Natriumborhydrid zur Reduktion freier Aldehydgruppen vor der Beprobung des Arrays weiter begünstigt, da das Natriumborhydrid die Doppelbindungen der ‚Schiff’schen Basen’ zu stabilen sekundären Aminoverbindungen reduziert, wodurch die GST-SH2 noch fester an die Oberfläche gebunden werden. Wie gezeigt werden konnte, hatte die Verwendung dieses Reduktionsmittels keinen negativen Einfluss auf die Bindungseigenschaften der SH2 Domänen für ihren pTyr-Interaktionspartner (CEACAM3). Nach der Verwendung von Natriumborhydrid konnten deutlichere Bindungssignale für phosphoryliertes CEACAM3 (pCEACAM3) an einzelne SH2 Domänen detektiert werden. Im Gegensatz dazu hatte die Absättigung freier Aldehydgruppen durch BSA einen negativen Effekt auf die Interaktion von pCEACAM3 mit einzelnen SH2 Domänen. Dies scheint auf den ersten Blick verwunderlich, wurden doch in bisherigen Publikationen die freien Aldehydgruppen der Trägeroberfläche mittels BSA abgesättigt (Jones et al. 2006; Kaushansky et al. 2010). Allerdings wurden in diesen experimentellen Ansätzen nicht vollständige Proteine, sondern lediglich 13-17 Aminosäuren lange Peptide zur Beprobung des SH2 Domänen Arrays verwendet. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten GST-SH2 Domänen haben alle eine ungefähre Größe von ungefähr 40 kDa. Somit ist es nicht auszuschließen, dass durch die Verwendung des circa 60 kDa großen BSA die Zugänglichkeit einzelner SH2 Domänen für das pCEACAM3 deutlich erschwert ist. In diesem Zusammenhang konnte auch durch die Verwendung des 30 kDa großen und in vitro phosphorylierten zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 (CEACAM3zyto) keine Interaktion mit den GST-SH2 Domänen erreicht werden. Im Gegenteil, mit diesem Versuchsaufbau wurden sogar nachteilige Effekte erzielt. Da CEACAM3zyto, aus Gründen der besseren Löslichkeit ebenfalls als GST-Fusionsprotein exprimierte werden musste, war die Detektion des gebundenen GST-CEACAM3zyto nur durch vorherige Fluoreszenzmarkierung möglich. Dies hatte zur Folge, dass sich das unspezifische Hintergrundsignal deutlich erhöhte. So führte beispielsweise die Erhöhung der Menge an eingesetztem pCEACAM3zyto zu keiner Verbesserung der Stärke des detektierbaren Fluoreszenzsignals, wohl aber zu einem Rückgang im Verhältnis von Bindungs- zu Hinter68 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen grundsignal. Zurückzuführen ist dieser Effekt möglicherweise auf die Ablagerung von ungebundenem phosphoryliertem CEACAM3zyto (pCEACAM3zyto) auf der Oberfläche. Solche Effekte der Erhöhung des Hintergrundsignals durch die unspezifischen Adsorbtion von fluoreszenzmarkierten Proteinen sind nicht unwahrscheinlich und wurden auch schon in früheren Arbeiten festgestellt (Haab et al. 2001). Ebenso wurde auch bei der Beprobung mit Zelllysaten ein Rückgang des unspezifischen Hintergrundsignals erreicht, je stärker die Probe verdünnt wurde. Dies zeigt, dass die Detektion der Bindungssignale in einem nicht unerheblichen Maß von der Proteinkonzentration der Beprobungslösung abhängt. Insgesamt betrachtet, ist die Inkubation des SH2 Domänen Arrays mit Zelllysaten, welche das auf Interaktion zu testende Phosphoprotein enthalten, einem pull-down Experiment sehr ähnlich und berücksichtigt auch einen möglichen Einfluss anderer zellulärer Proteine auf die Interaktion. Der Nachweis von gebundenen pTyr-Proteinen mit spezifischen Antikörpern gegen einen Epitop-Tag ist wesentlich unkomplizierter und effektiver als der Nachweis über direkte Fluoreszenzmarkierung des pTyr-Proteins. Ein weiterer Vorteil ist, dass durch die Verwendung von Antikörpern zur Dektektion das Spektrum der zur Beprobung verwendbaren Konstrukte sehr schnell erweitert werden kann, da die langwierigen Prozesse der Proteinexpressionen, -aufreinigungen und -fluoreszenzmarkierung entfallen. Vielmehr können bereits vorhandene Plasmidkonstrukte zur Expression in eukaryotischen Zellen verwendet werden. Auch durch die Verwendung von pTyr-Antikörpern zur Detektion der gebundenen pTyrProteine konnte die Einsatzmöglichkeit des SH2 Domänen Arrays erweitert werden. Durch diese Form der Detektion konnten SH2-abhängige Bindungsstudien durchgeführt werden, die das gesamte endogene Phosphotyrosinproteom der Zelle umfassen. Grundlage hierfür ist die Tatsache, dass Proteine bzw. Proteinkomplexe teilweise mehrere phosphorylierbare Tyrosinreste besitzen, die in ihrer phosphorylierten Form nicht ausschließlich Bindemotive sind, sondern beispielsweise auch regulatorische Funktion haben und somit für den pTyrAntikörper frei zugänglich sind. Somit war es möglich, einen Einblick in das Bindungsverhalten von endogenen Proteinen an verschiedene SH2 Domänen zu erhalten. In der Tat zeigte die vergleichende Untersuchung von DLD1-Zelllysaten, in An- und Abwesenheit von endogener FAK, eine Veränderung im pTyr-abhängigen Bindungsverhalten endogener Proteine an die immobilisierten SH2 Domänen. Durch diesen Versuchsaufbau konnte gezeigt werden, dass nicht nur überexprimierte Phosphoproteine, sondern auch 69 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen endogene Proteine auf Interaktion mit den SH2 Domänen untersucht werden können. Der erfolgreiche Nachweis endogener Proteine eröffnet zudem die Möglichkeit einer methodischen Weiterentwicklung des Ansatzes. So wäre es beispielsweise möglich, durch die Verwendung proteinspezifischer Antikörper, endogene Proteine auf ihre Interaktion mit verschiedenen SH2 Domänen zu untersuchen. Dieser Versuchsaufbau könnte auch dahin gehend ausgeweitet werden, dass verschiedene endogene Proteine eines Zelllysates, durch parallele Beprobung mehrerer idenitischer Arrays auf Interaktion mit den SH2 Domänen untersucht werden. Weiterhin bietet dieser Versuchsaufbau die Möglichkeit, gezielt SH2 Domänen-vermittelte Interaktionen von endogenen Proteinen aus Zellen mit veränderter Kinase- oder Phosphataseexpression bzw. -aktivität zu untersuchen. Zur Etablierung des SH2 Domänen Arrays wurde der membranständige phagozytische Rezeptor CEACAM3 als Phosphotyrosinprotein verwendet. Im Zuge dieser Arbeiten konnten sowohl bekannte Interaktionen zwischen diesem Rezeptor und einzelnen SH2 Domänen bestätigt werden, als auch neue Interaktionen identifiziert werden. Die Charakterisierung der Interaktion zwischen diesen SH2 Domänen-Proteinen und CEACAM3 sowie Untersuchungen hinsichtlich der physiologischen Relevanz dieser Interaktionen erfolgt in Kapitel 3.1. Im Zuge der Etablierung einer neuen Methode müssen auch Untersuchungen hinsichtlich der Übertragbarkeit auf andere Phosphoproteine durchgeführt werden. Da zur Etablierung des Systems der membranständige phagozytische Rezeptor CEACAM3 verwendet wurde, wurde für den Übertragbarkeitstest die im Zytoplasma lokalisierende Fokale Adhäsionskinase (FAK) gewählt. Mittels des SH2 Domänen Arrays konnten die bereits bekannten Interaktionen der tyrosinphosphorylierten FAK mit den SH2 Domänen von Nck2, Grb2, Shc1, Src, PLCγ und der regulatorischen Untereinheit p85 der PI3K reproduziert werden. Durch diesen Versuchsansatz konnte gezeigt werden, dass das System sowohl für zytoplasmatische als auch membranständige Phosphoproteine zur Interaktiospartnersuche angewendet werden kann und dass der SH2 Domänen Array eine gute Methodik darstellt, einzelne pTyr-Proteine hinsichtlich einer möglichen Interaktion mit verschiedenen SH2 Domänen in großem Maßstab bei gleichzeitig sehr geringem Zeit- und Materialaufwand zu untersuchen. Zusammengefasst stellt die in diesem Kapitel erarbeitete Methode eine Möglichkeit dar, um Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen zu untersuchen. Neben der leichten und schnellen Durchführbarkeit zeichnet sich diese Methode dadurch aus, dass im Gegensatz zu den bisherigen Untersuchungsmethoden, wie Koimmunpräzipitation, Far-Western oder pull-down Experimenten eine große Anzahl unterschiedlicher SH2 Domänen-Proteine in 70 2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen kurzer Zeit und unter sehr geringem Materialaufwand hinsichtlich der Interaktion mit tyrosinphosphorylierten Proteinen untersucht werden kann. Der SH2 Domänen Array kann somit einerseits zur Identifikation neuer pTyr-abhängiger Interaktionen angewendet werden, andererseits könnte auch der Einfluss von spezifischen Proteintyrosinkinasen oder -phosphatasen auf Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen durch Untersuchung des pTyr-abhängigen Bindeverhaltens von endogenen Proteinen an die immobilisierten SH2 Domänen analysiert werden. 71 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAMvermittelten Signalwegen 3.1 Die Phosphatidylinositol-3’-Kinase als wichtiges Signalprotein in der CEACAM3-vermittelten Phagozytose und Abtötung von human pathogenen Bakterien 3.1.1 Einleitung Das Gram-negative, humanspezifische Bakterium Neisseria gonorrhoeae (Ngo) ist ein Beispiel für die Anpassungsfähigkeit von Mikroorganismen. Während der Koevolution mit seinem einzigen natürlichen Wirt, dem Menschen, hat dieses Bakterium verschiedene Mechanismen entwickelt, welche es ihm ermöglichen, die vielfältigen Abwehrbarrieren des menschlichen Körpers zu umgehen. Neben der Expression einer IgA-Protease zur aktiven Störung der Erkennung durch das Immunsystem kann Neisseria gonorrhoeae die Strukturen seiner Oberfläche stark variieren. Dies erfolgt durch RecA-abhängige Antigenvariation, z. B. von Piluskomponenten, oder Phasenvariation von distinkten Oberflächenproteinen. Ein Beispiel für eine Familie von phasenvariablen Oberflächenproteinen sind die so genannten Opa Proteine (colony opacity-associated proteins), welche eine enge Kontaktaufnahme mit verschiedenen Wirtszellen ermöglichen (Hauck and Meyer 2003). Es werden bis zu 12 verschiedene opa Gene vom Chromosom der Gonokokken kodiert und konstitutiv transkribiert. Dabei wird die unabhängige Expression eines jeden Opa Proteins durch eine pentamere Sequenzwiederholung in der 5’-kodierenden Region eines jeden Transkripts reguliert. Die Anzahl dieser repetitiven Elemente entscheidet darüber, ob das Opa Protein in seiner vollen Länge translatiert wird oder ob es aufgrund von Leserasterverschiebungen zu einer verfrühten Termination der Translation durch ein Stopp-Codon kommt und daher nur ein bruchstückhaftes, nicht funktionelles Protein entsteht (Stern et al. 1986). Interessanterweise binden die meisten Opa Proteine von Gonokokken an verschiedene Familienmitglieder der karzinoembryonalen Antigen-verwandten Zelladhäsionsmoleküle (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules; CEACAMs). Die CEACAMs gehören zur Gruppe der Immunglobulindomänen enthaltenden Glykoproteine und finden sich auf vielen humanen Zellen (Kuespert et al. 2006). 72 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen CEACAMs besitzen jeweils mindestens eine N-terminal gelegene, der variablen Immunglobulindomäne (Igv) ähnliche Domäne, welche von CEACAM-bindenden Opa Proteinen (OpaCEA Proteine) erkannt wird (Chen and Gotschlich 1996; Virji et al. 1996b). Die Bindung der OpaCEA Proteine an den Wirtsrezeptor ist eine direkte Protein-Protein Interaktion (Billker et al. 2000) und artspezifisch. Das heißt, dass OpaCEA Proteine lediglich an humane CEACAMs, nicht aber an Orthologe anderer Säugetiere binden können (Voges et al. 2010). Von den 12 im Menschen exprimierten Mitgliedern der CEACAM Familie (Zebhauser et al. 2005) konnte bisher nur für vier eine Assoziation mit OpaCEA Proteinen von Gonokokken beobachtet werden. Diese Mitglieder sind CEACAM1, CEACAM3, CEA (das Translationsprodukt des ceacam5 Gens) und CEACAM6 (Virji et al. 1996a; Chen et al. 1997; Gray-Owen et al. 1997b; Bos et al. 1998; Popp et al. 1999). Die meisten der bis jetzt charakterisierten OpaCEA Proteine binden lediglich an CEACAM1 oder CEA (z. B. Opa56 des MS11-Stammes, welches lediglich an CEA bindet). Im Gegensatz dazu kann eine kleine Gruppe von OpaCEA Proteinen (wie z. B. Opa52 des MS11-Stammes) alle vier Opa-bindenden CEACAMs, inklusive CEACAM3, erkennen (Bos et al. 1997; Gray-Owen et al. 1997b; Kuespert et al. 2007). Dieses auffällige Ungleichgewicht von CEACAM-Erkennungseigenschaften kann am besten durch die Betrachtung der gewebespezifischen Expressionsmuster der menschlichen CEACAMs erklärt werden. CEACAM1, CEA und CEACAM6 finden sich auf der apikalen Oberfläche von polarisierten Epithelzellen, wo diese Rezeptoren von pathogenen Neisserien zur effizienten Besiedlung der Schleimhautoberfläche ausgenutzt werden (Muenzner et al. 2005; Muenzner et al. 2010). Im Gegensatz dazu wird der Oberflächenrezeptor CEACAM3 ausschließlich von humanen Granulozyten exprimiert und ist ein sehr effizienter, Opsonin-unabhängiger Rezeptor zur Phagozytose von CEACAM-bindenden Bakterien (Pils et al. 2008). Aus diesem Grund wird vermutet, dass diese Bakterien, trotz Antigenvariation, über ihre CEACAM-bindenden Eigenschaften von Zellen der angeborenen Immunantwort erkannt und in Schach gehalten werden. Es ist somit auch nicht überraschend, dass der CEACAM3-vermittelte Phagozytoseprozess, verglichen mit dem der epithelialen CEACAMs, ein sehr effizienter Prozess ist, welcher sich auch in mechanistischer Hinsicht von dem der epithelialen CEACAMs (CEACAM1, CEA, CEACAM6) unterscheidet (McCaw et al. 2004; Schmitter et al. 2007b). Der mechanistische Unterschied besteht darin, dass der von epithelialen CEACAMs vermittelte Endozytoseprozess nicht von den zytoplasmatischen Elementen dieser Rezeptoren, wohl aber von Cholesterin- und Sphingolipid-reichen Membranmikrodomänen 73 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen abhängig ist (Schmitter et al. 2007b; Muenzner et al. 2008). Im Gegensatz dazu hat die Reduktion des Cholesterolgehalts der Zellmembran keinen Einfluss auf die CEACAM3vermittelte Phagozytose von Pathogenen durch humane Granulozyten. Allerdings ist ein intakter zytoplasmatischer Abschnitt von CEACAM3 unabdingbar für den effizienten Aufnahmeprozess (Schmitter et al. 2004; Schmitter et al. 2007b). In unterschiedlichen biochemischen und funktionellen Studien mit wildtypischen bzw. mutierten CEACAM3-Varianten konnte bereits gezeigt werden, dass die Bindung von Opa52exprimierenden Bakterien an CEACAM3 die Phosphorylierung spezifischer Tyrosinreste im zytoplasmatischen Abschnitt des Rezeptors auslöst. Diese Tyrosinphosphorylierung erfolgt durch Proteintyrosinkinasen (PTKs) der Src-Familie, welche während des Phagozytoseprozesses vorübergehend mit CEACAM3 assoziieren (Hauck et al. 1998; McCaw et al. 2003; Schmitter et al. 2007b; Buntru et al. 2009). Die phosphorylierbaren Tyrosinreste des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 sind Bestandteil einer spezifischen Aminosäureabfolge, welche sehr hohe Ähnlichkeiten zu einem immunoreceptor tyrosine based acitvation motif (ITAM) aufweist. Dies lässt vermuten, dass die Funktionsweise von CEACAM3 ähnlich der der gut charakterisierten Fcγ-Rezeptoren (FcγR) ist, welche die Aufnahme von mit Antikörpern opsonisierten Partikeln vermitteln (Billker et al. 2002). Obwohl es Ähnlichkeiten im Hinblick auf die Beteiligung von PTKs der Src-Familie gibt, scheint CEACAM3 in abweichender Art und Weise mit den nachgelagerten Signalkomponenten verbunden zu sein, als dies für den FcγR der Fall ist. Dies wird zum Beispiel darin deutlich, dass durch die Koexpression der Proteintyrosinkinase Syk die FcγR-vermittelte Phagozytoserate transfizierter Zellen deutlich erhöht wird, während die Koexpression von Syk keinen Einfluss auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Neisseria gonorrhoeae hat (Indik et al. 1995; Sarantis and Gray-Owen 2007). Darüber hinaus dient einer der Tyrosinreste in der ITAM-änlichen Sequenz von CEACAM3 (Tyrosinrest 230; Tyr230) als Bindestelle für den Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav, eine direkte Interaktion, die nicht für den FcγR nachgewiesen werden konnte (Hall et al. 2006; Schmitter et al. 2007a). Während der FcγR-vermittelten Phagozytose bindet Vav über seine SH2 Domäne an die PTK Syk (Deckert et al. 1996), welche ihrerseits direkt über ihre SH2 Domänen an die phosphorylierte ITAM-Sequenz des FcγR bindet (Darby et al. 1994; Greenberg et al. 1996). Die direkte Bindung von Vav an das phosphorylierte Tyr230 von CEACAM3, mittels seiner SH2 Domäne, erklärt die starke Stimulation der kleinen GTPase Rac, die man sowohl in primären Granulozyten als auch in CEACAM3-exprimierenden 74 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Zelllinien nach der Infektion mit Opa-exprimierenden Gonokokken beobachten kann (Hauck et al. 1998; Schmitter et al. 2004). Sowohl der Austausch des Tyr230 in CEACAM3 durch Phenylalanin als auch die Koexpression von dominant-negativem Vav und CEACAM3 beeinträchtigen die CEACAM3-vermittelte Phagozytose (Schmitter et al. 2007a). Auch die Mutation des zweiten Tyrosinrestes Tyr241 innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 führt zu einer reduzierten Phagozytose von Opa Protein exprimierenden Gonokokken (McCaw et al. 2003; Schmitter et al. 2004). Der Tyrosinrest Tyr241 ist Bestandteil des Aminosäuremotivs YxxM, welches als hoch affines Erkennungsmotiv für die SH2 Domäne der Lipidkinase Phosphatidylinositol-3’-Kinase Klasse I (PI3K) beschrieben ist (Piccione et al. 1993). Im Gegensatz zu den Enzymen der Klassen II und III sind die PI3Ks der Klasse I Heterodimere, welche sich aus einer regulatorischen Untereinheit (p85 oder p50-55) und einer von drei möglichen katalytischen Untereinheiten (p110, oder ) zusammensetzen. Die Aktivierung der PI3Ks erfolgt durch unterschiedliche Typen von Oberflächenrezeptoren und resultiert in der Generierung von Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PI(3,4,5)P3), welches von einer Vielfalt von Effktorproteinen erkannt werden kann (Cullen et al. 2001). Tatsächlich konnte auch in Bezug auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-exprimierenden Gonokokken eine Anreicherung von PI(3,4,5)P3 während des Phagozytoseprozesses nachgewiesen werden (Booth et al. 2003). Allerdings ist bis jetzt noch nicht bekannt, ob nach Bindung der Bakterien an CEACAM3 die PI3K zum Rezeptor rekrutiert wird und ob diese Lipidkinase direkt oder indirekt mit dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 assoziiert. In den nachfolgenden Kapiteln wurde die Fragestellung der Interaktion zwischen PI3K und CEACAM3 sowie die Beteiligung dieser Lipidkinase an der Eliminierung phagozytierter Bakterien untersucht. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass die SH2 Domänen der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K direkt mit dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 interagieren. Ein weiterer wesentlicher Befund war, dass die Inhibierung der PI3K-Aktivität, durch einen pharmakologischen Inhibitor die CEACAM3-vermittelte Phagozytose weder in transfizierten Zellen noch in primären humanen Granulozyten beeinträchtigt, aber selektiv die Bildung von reaktiven Sauerstoffderivaten in Phagozyten und somit die Degradation der Bakterien verhindert. 75 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen 3.1.2 Ergebnisse 3.1.2.1 Die SH2 Domänen der PI3KR3 assoziieren mit dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 Die in Kapitel 2.2.2 beschriebene Interaktion von phosphoryliertem CEACAM3 mit den SH2 Domänen der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3KR3) sollte im Folgenden biochemisch durch ein ELISA basiertes Interaktionsexperiment verifiziert werden. Bei dieser Methodik werden rekombinant exprimierte und gereinigte GST-SH2 Domänen auf ELISA-Platten immobilisiert und mit CEACAM3 enthaltenden Ganzzelllysaten beprobt. Anschließend erfolgt eine ELISA-basierte Quantifizierung mit einem monoklonalen Antikörper gegen einen spezifischen Epitop-Tag von CEACAM3. Abb. 3.1.1 Phosphoryliertes CEACAM3 assoziiert mit den SH2 Domänen der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase. (A) HEK293T Zellen wurden mit einem leeren Kontrollvektor (GFP) oder einem Vektor, kodierend für GFP-fusionierte CEACAM3-HA-Varianten, in An- oder Abwesenheit von v-Src kotransfiziert. Gleiche Mengen an Ganzzelllysat wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot, mit monoklonalen anti-GFP (obere Reihe), anti-Phosphotyrosin (mittlere Reihe) oder anti-v-Src (untere Reihe) Antikörpern analysiert. (B) Die angegebenen GST-SH2 Domänen oder GST alleine wurden in einer 96-well Platte immobilisiert und mit verschiedenen Ganzzelllysaten inkubiert. Diese Ganzzelllysate wurden aus Zellen hergestellt, welche GFP-fusioniertes Wildtyp CEACAM3-HA (CEACAM3 WT) oder eine um den zytoplasmatischen Abschnitt verkürzte CEACAM3-HA-Variante (CEACAM3 CT) in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimierten. Als Negativkontrolle dienten Lysate von Zellen, in welchen GFP und vSrc koexprimiert wurden. Das gebundene HA-markierte CEACAM3 WT oder CEACAM3 CT wurde mittels monoklonalem anti-HA Antikörper in einem ELISA-basierten Interaktionsassay nachgewiesen. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von Triplikaten. Für den hier vorgestellten Versuchsaufbau wurden HA-GFP fusioniertes Wildtyp CEACAM3 (CEACAM3 WT-HA-GFP), CEACAM3 mit Deletion der zytoplasmatischen Domäne (CEACAM3 ΔCT-HA-GFP) oder GFP in An- oder Abwesenheit von viraler Src-Kinase (v76 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Src) in HEK293T Zellen exprimiert und Zelllysate hergestellt. Durch Western Blot Analyse wurde die Expression von CEACAM3 und dessen Phosphorylierung in Gegenwart von v-Src überprüft (Abb. 3.1.1A). Die Zelllysate wurden auf gleiche Mengen der exprimierten CEACAM3-HA-GFP Konstrukte eingestellt. Die zu untersuchenden GST-fusionierten PI3KR3-SH2 Domänen sowie die GST-Hck-SH2 als Positiv- und GST-Slp76-SH2 bzw. GST allein als Negativkontrolle wurden in gleichen Mengen auf einer 96-well Platte immobilisiert. Im Anschluss wurden die wells mit jeweils gleichen Mengen an CEACAM3 WT-HA-GFP, CEACAM3 ΔCT-HA-GFP und GFP Lysat inkubiert. Der mit den SH2 Domänen assoziierte Rezeptor wurde über einen monoklonalen anti-HA Primärantikörper, gefolgt von einem Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper und anschließender TMB-Reaktion, detektiert (Abb. 3.1.1B). Das unphosphorylierte CEACAM3 WT interagierte mit keiner der SH2 Domänen. Im Gegensatz dazu assoziierte phosphoryliertes CEACAM3 sowohl mit der N- als auch mit der C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3, sowie mit der SH2 Domäne von Hck (Abb. 3.1.1B). Die in Gegenwart von v-Src exprimierte, verkürzte Form von CEACAM3 (CEACAM3 ΔCT) assoziierte wie die unphosphorylierte CEACAM3 WT Form mit keiner der immobilisierten SH2 Domänen (Abb. 3.1.1B). Dies ist ein Hinweis darauf, dass diese Interaktion durch den zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 vermittelt wird. Zusammengefasst lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass beide SH2 Domänen der PI3KR3 mit den phosphorylierten Tyrosinresten des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 assoziieren können. 3.1.2.2 Die SH2 Domänen der PI3KR3 binden phosphorylierungsabhängig an CEACAM3 Der zytoplasmatische Abschnitt von CEACAM3 besitzt zwei Tyrosinreste, welche innerhalb eines ITAM-ähnlichen Aminosäuresequenzmotives liegen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass diese ITAM-ähnliche Sequenz für die Funktion von CEACAM3 als phagozytischer Rezeptor verantwortlich ist (Schmitter et al. 2004; Schmitter et al. 2007a; Schmitter et al. 2007b). Um herauszufinden, ob diese Tyrosinreste ebenfalls für die Interaktion mit den PI3KR3-SH2 Domänen wichtig sind, wurden die SH2 Domänen mit verschiedenen CEACAM3-Konstrukten in einem pull-down Experiment getestet. Für diesen Versuch wurde in HEK293T Zellen die virale Src-Kinase (v-Src) mit einem Kontrollprotein (GFP), CEACAM3 WT oder verschiedenen CEACAM3-Mutanten koexprimiert. Die Mutanten waren CEACAM3-Varianten, bei denen die zu untersuchenden Tyrosinreste des ITAM77 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen ähnlichen Sequenzmotivs gegen Phenylalanin ausgetauscht waren. Es wurden sowohl die einzelnen Tyrosine (CEACAM3 Y230F und CEACAM3 Y241F) als auch beide Tyrosinreste (CEACAM3 Y230/241F) mutiert. Auch für dieses Experiment wurde die Deletionsmutante CEACAM3 ΔCT verwendet. Abb. 3.1.2 Die SH2 Domänen der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase interagieren mit den phosphorylierten Tyrosinen der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. (A) HEK293T Zellen wurden mit einem leeren Kontrollvektor (GFP) oder verschiedenen GFP-fusionierten CEACAM3-Varianten, Wildtyp (WT), Y230F, Y241F, Y230/241F oder CT zusammen mit oder ohne v-Src transfiziert und nach 2 Tagen lysiert. Die Ganzzelllysate wurden durch Western Blot Analyse hinsichtlich Phosphorylierung und gleichmäßiger Expression der CEACAM3-Varianten überprüft. (B) und (C) Die Ganzzelllysate wurden für ein pull-down Experiment mit den angegebenen GST-SH2 Domänen oder GST allein verwendet. Die präzipitierten CEACAM3-Varianten wurden mit monoklonalem anti-GFP Antikörper (obere Reihe) nachgewiesen. Die Verwendung von gleichen Mengen an GST-Fusionsproteinen oder GST allein wurde mittels Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft. Sowohl der Wildtyp als auch die Mutanten waren in den Zelllysaten in annähernd gleichen Mengen enthalten (Abb. 3.1.2A). Mit diesen CEACAM3-Lysaten wurde, unter Verwendung der GST-fusionierten SH2 Domänen von Hck, Slp76 und PI3KR3 sowie GST allein, ein pulldown Experiment durchgeführt. Das durch v-Src phosphorylierte CEACAM3 WT wurde durch die Hck-SH2 Domäne präzipitiert, während die SH2 Domäne von Slp76 nicht fähig war das phosphorylierte CEACAM3 aus dem Lysat herauszuziehen (Abb. 3.1.2B und C). In ähnlicher Weise wie die Hck-SH2 Domäne konnten sowohl die N-terminale (PI3KR3-N) (Abb. 3.1.2B) als auch die C-terminale (PI3KR3-C) (Abb. 3.1.2C) SH2 Domäne der PI3KR3 das phosphorylierte CEACAM3 WT präzipitieren. Weiterhin lässt sich aus Abbildung 3.1.2B erkennen, dass die PI3KR3-N-SH2 Domäne die CEACAM3 Y241F-Mutante in annähernd gleicher Menge wie den CEACAM3 WT aus dem Lysat präzipitiert. Im Gegensatz dazu wird durch die Mutation des Tyr230 die Assoziation zwischen CEACAM3 und der PI3KR3-N-SH2 Domäne unterbunden. Ebenso bewirkt auch die gleichzeitige Mutation beider Tyrosinreste (Tyr230 und Tyr241) sowie die Deletion des zytoplasmatischen Abschnitts den völligen Verlust 78 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen der Interaktion. Diese Beobachtung lässt darauf schließen, dass die Interaktion der Nterminalen SH2 Domäne von PI3KR3 durch den phosphorylierten Tyrosinrest Tyr230 des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 vermittelt wird. Im Gegensatz dazu wird die Interaktion der PI3KR3-C-SH2 mit CEACAM3 erst durch die Mutation beider Tyrosinreste (Tyr230 und Tyr241) sowie der Deletion des gesamten zytoplasmatischen Abschnitts unterbunden (Abb. 3.1.2C). Allerdings kann die SH2 Domänen vermittelte Interaktion von Proteinen aus Zelllysaten auch indirekter Natur sein. Somit ist es notwendig zu untersuchen, ob die SH2 Domänen der PI3KR3 direkt an CEACAM3 binden und diese Interaktion somit unabhängig von zusätzlichen zellulären Komponenten ist. Diese Untersuchung wurde mit einer semisynthetischen Methodik durchgeführt. Hierfür wurden 15 Aminosäuren lange Peptide als individuelle Punkte auf einer Zellulosemembran synthetisiert (Frank 1992). Jedes Peptid enthielt jeweils einen der beiden Tyrosinreste der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 und wurde sowohl in unphosphorylierter (Y) als auch in phosphorylierter (pY) Form synthetisiert (Abb. 3.1.3). Die Membranen wurden mit rekombinanten GST-fusionierten SH2 Domänen der PI3KR3 (GST-PI3KR3-N-SH2 und GST-PI3KR3-C-SH2) inkubiert. Um die Interaktion von GST mit den Peptiden auszuschließen, wurde als Negativkontrolle eine Membran mit GST inkubiert. Die an die Peptide gebundenen GST-SH2 Fusionsproteine wurden mit einem anti-GST Primärantikörper und einem Peroxidase-gekoppeltem Sekundärantikörper nachgewiesen. Abb. 3.1.3 Die SH2 Domänen der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase binden direkt an das phosphorylierte Tyr230 der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Membranen, auf denen phosphorylierte (pY) und unphosphorylierte (Y) synthetische Peptide der ITAM-ählichen Sequenz von CEACAM3 immobilisiert waren, wurden mit der GST-fusionierten N- oder C-terminalen SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K oder GST allein inkubiert. Die gebundenen GSTFusionsproteine wurden mittels monoklonalem anti-GST Antikörper detektiert (untere Reihe). Die immobilisierten synthetischen Peptide wurden durch Bromphenolblau-Färbung nachgewiesen (obere Reihe). Sowohl GST-PI3KR3-N-SH2 als auch GST-PI3KR3-C-SH2 binden ausschließlich an den phosphorylierten Tyrosinrest Tyr230 (pTyr230) von CEACAM3 (Abb. 3.1.3). Für die GSTPI3KR3-N-SH2 entspricht dieses Ergebnis exakt dem Resultat des pull-down Experiments. Auch in diesem Fall ist keine phosphorylierungsabhängige Bindung der N-terminalen SH2 Domäne an das pTyr241-Peptid nachweisbar. In gleicher Weise konnte auch für das 79 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Kontrollprotein (GST) keine Bindung an eines der Peptide detektiert werden (Abb. 3.1.3). Für die C-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 konnte ebenfalls eine phosphorylierungsabhängige Bindung an den Tyrosinrest Tyr230, nicht aber an den Tyrosinrest Tyr241, nachgewiesen werden. Allerdings hat die GST-PI3KR3-C-SH2 Domäne in geringerer Menge an pTyr230 gebunden als die GST-PI3KR3-N-SH2 Domäne. Zusammengefasst lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass sowohl die N-terminale als auch die C-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 spezifisch an den phosphorylierten Tyrosinrest Tyr230 der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 binden können. Dabei scheint die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 eine höhere Affinität für diesen Tyrosinrest zu haben als die C-terminale SH2 Domäne. 3.1.2.3 Die Bindung Opa52-exprimierender Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung der N-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 an den Rezeptor Es ist bereits bekannt, dass die PI3-Kinasen (PI3Ks) der Klasse I essentiell für die FcRezeptor-vermittelte Phagozytose von opsonisierten Partikeln durch Makrophagen der Maus sind (Swanson and Hoppe 2004). Auch in Bezug auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien konnte gezeigt werden, dass die PI3Ks in diesen Prozess involviert sind (Booth et al. 2003). Deshalb sollte im Folgenden untersucht werden, ob die PI3-Kinasen auch am CEACAM3-vermittelten Aufnahmeprozess von Opa52-exprimierenden N. gonorrhoeae beteiligt sind. In diesem Zusammenhang musste als erstes die Frage geklärt werden, ob die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der Klasse I PI3K (PI3KR3) in die Nähe von CEACAM3 rekrutiert wird, wenn dieser Rezeptor mit Opa52-exprimierenden Gonokokken interagiert. Hierfür wurden HEK293T Zellen mit GFP-fusioniertem CEACAM3 (CEACAM3 WT-GFP) oder einer verkürzten Form von CEACAM3, bei der der zytoplasmatische Abschnitt deletiert war (CEACAM3 CT-GFP), transfiziert. Zusätzlich wurde noch die mKate-fusionierte N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 (mKate-PI3KR3-N-SH2) transfiziert. Als Positivkontrolle diente ein Kotransfektionsansatz von CEACAM3 WT-GFP mit der mKate-fusionierten SH2 Domäne der Src-PTK Hck (mKate-Hck-SH2). Es ist bereits bekannt, dass die Proteintyrosinkinase Hck über ihre SH2 Domäne mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3 kolokalisiert und direkt interagiert (Hauck et al. 1998; 80 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Schmitter et al. 2007b; Buntru et al. 2009). Die Zellen wurden mit Pacific Blue-gefärbten N. gonorrhoeae infiziert, welche entweder keine Opa-Proteine (Ngo Opa-) oder Opa52 (Ngo Opa52) exprimierten. Anschließend wurden die Zellen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. In Zellen, die mit Opa52-exprimierenden Gonokokken infiziert waren, akkumulierte die mKate-Hck-SH2 Domäne in der Nähe des Bakterien-gebundenen CEACAM3 (Abb. 3.1.4). Abb. 3.1.4 Die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol3’-Kinase wird in die Nähe des Gonokokken-gebundenen CEACAM3 rekrutiert. HEK293T Zellen wurden mit den angegebenen mKate-fusionierten SH2 Domänen und mit Plasmiden, kodierend für GFP-fusioniertes Wildtyp CEACAM3 (CEACAM3 WT) oder der verkürzten CEACAM3-Variante ohne den zytoplasmatischen Abschnitt (CEACAM3 CT) kotransfiziert. Die Zellen wurden für 30 min mit einer MOI = 30 mit Opa52exprimierenden (Ngo Opa52) N. gonorrhoeae oder mit N. gonorrhoeae, welche keine Opa Proteine (Ngo Opa-) exprimieren, infiziert, fixiert und mittels Konfokalmikroskopie analysiert. Die Rekrutierung der SH2 Domäne in Bereiche, wo CEACAM3 mit Ngo interagiert, ist durch weiße Pfeilköpfe gekennzeichnet. Die Maßbalken repräsentieren 10 µm. 81 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen In gleicher Weise kolokalisierte auch mKate-PI3KR3-N-SH2 mit CEACAM3, wenn Opa52exprimierende Gonokokken mit dem Rezeptor assoziierten (Abb. 3.1.4). Im Gegensatz dazu erfolgte keine Rekrutierung von mKate-PI3KR3-N-SH2 in Zellen, die CEACAM3 CT-GFP exprimierten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass dieser CEACAM3-Variante die ITAMähnliche Sequenz fehlt, welche für die Bindung von SH2 Domänen verantwortlich ist. Um zu überprüfen, ob die PI3KR3-N-SH2 Domäne generell mit CEACAM3 assoziiert, wurden Zellen mit Gonokokken infiziert, welche keine Opa-Proteine (Opa-) exprimieren und deshalb nicht an CEACAM3 binden. Somit war es nicht überraschend, dass lediglich eine sehr geringe Anzahl von Bakterien mit CEACAM3-exprimierenden Zellen assoziierten (Abb. 3.1.4). Weiterhin ist auch zu erkennen, dass weder der Rezeptor selbst noch die PI3KR3-N-SH2 Domäne verstärkt an die Stellen der Zellmembran rekrutiert werden, an denen der Kontakt mit den Bakterien stattfindet. Dieses Ergebnis zeigt, dass die PI3K in Abhängigkeit der Bindung von Opa52-exprimierenden Gonokokken an den stimulierten Rezeptor rekrutiert werden kann. In diesem Zusammenhang wurde eine weitere Kontrolle durchgeführt, um die Spezifität der Rekrutierung der PI3KR3-N-SH2 Domäne an CEACAM3 zu überprüfen. Hierfür wurden HEK293T Zellen mit CEACAM3 WT-GFP und der mKatefusionierten SH2 Domäne des Adapterproteins Slp76 (mKate-Slp76-SH2) kotransfiziert. Die Slp76-SH2 Domäne zeigte in biochemischen Analysen keine Interaktion mit CEACAM3 (Schmitter et al. 2007b). Auch die vorliegende konfokalmikroskopische Analyse zeigte, dass die SH2 Domäne von Slp76 nicht an den durch Gonokokken stimulierten Rezeptor rekruiert wird (Abb. 3.1.4). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die PI3Ks der Klasse I über die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 spezifisch an den zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 rekrutiert werden. Diese Rekrutierung ist dabei abhängig von der Bindung Opa52-exprimierender Gonokokken an den Rezeptor. Die bereits in den Kapiteln 3.1.2.1 und 3.1.2.2 vorgestellten Ergebnisse der in vitro Experiment deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen CEACAM3 und der PI3KR3-NSH2 Domäne direkter Natur ist und über die phosphorylierten Tyrosinreste der ITAMähnlichen Sequenz des Rezeptors vermittelt wird. Um zu überprüfen, ob diese Interaktion auch in intakten Zellen stattfindet, wurden Untersuchungen auf Grundlage des FluoreszenzResonanzenergietransfers (FRET) durchgeführt. Beim FRET wird Energie eines angeregeten Farbstoffes (Donor) auf einen zweiten Farbstoff (Akzeptor) übertragen. Der Energietransfer findet dabei strahlungsfrei, d. h. ohne Abgabe oder Aufnahme von Photonen, statt. Dieser strahlungsfreie Energietransfer kann allerdings nur stattfinden, wenn sich Donor und 82 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Akzeptor in sehr enger räumlicher Nähe (wenige Nanometer) zueinander befinden (Clegg 1995). Sollen zwei Proteine auf eine direkte Interaktion untersucht werden, muss ein Molekül mit einem Donorfluorophor und das andere mit einem passenden Akzeptorfluorophor markiert werden. Um die Interaktion zwischen CEACAM3 und der PI3KR3-N-SH2 Domäne mittels der FRET Methode untersuchen zu können, wurde der Rezeptor an seinem CTerminus mit dem FRET-Donor CyPet fusioniert und die PI3KR3-N-SH2 Domäne mit dem FRET-Akzeptor YPet. Sowohl in Ganzzelllysaten als auch in intakten Zellen, welche CEACAM3-CyPet und die YPet-PI3KR3-N-SH2 Domäne koexprimierten, konnte ein FRET gemessen werden (siehe (Buntru et al. 2011)). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die PI3Ks der Klasse I über die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 direkt an den tyrosinphosphorylierten, zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 binden. Dabei ist diese Interaktion auf die Stellen der Zelle beschränkt, an denen Opa52-exprimierende Gonokokken über CEACAM3 mit der Wirtszelle in Kontakt treten. 3.1.2.4 Die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien ist unabhängig von der Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase Bisher konnte gezeigt werden, dass die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K spezifisch an CEACAM3 rekrutiert wird und direkt an den Rezeptor bindet. Somit wirft sich die Frage auf, welche funktionelle Relevanz diese ProteinProtein Interaktion im Bezug auf die Aufnahme und Abtötung von Opa52-exprimierenden Gonokokken hat. CEACAM3 wird ausschließlich auf humanen Granulozyten exprimiert und vermittelt die Opsonin-unabhängige Phagozytose von CEACAM-bindenden Bakterien (Schmitter et al. 2004). Um eine Beteiligung der PI3K an diesem Prozess zu untersuchen, wurden humane Granulozyten mit zwei verschiedenen PI3K-Inhibitoren behandelt und mit CSFE-markierten Gonokokken infiziert. Im Anschluss wurde die Menge an phagozytierten Bakterien mittels einer speziellen Methodik der Durchflusszytometrie ermittelt. Bei dieser Methode wird das Fluoreszenzsignal aller extrazellulären Bakterien durch Zugabe von Trypanblau unterdrückt. In der Folge kann mit Hilfe des Durchflusszytometers die Menge an internalisierten Bakterien bestimmt werden (Pils et al. 2006). Die humanen Granulozyten wurden vor der Infektion mit 200 nM Wortmannin oder mit 50 µM LY294002 behandelt. Beide Substanzen sind Inhibitoren der PI3K-Aktivität. Interessanterweise hatten beide Inhibitoren keinen Einfluss auf die Phagozytose der Bakterien (Abb. 3.1.5A). Um zu 83 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen verifizieren, dass dieses Ergebnis spezifisch ist, wurde der Einfluss beider Inhibitoren auf die Fcγ-Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Ig-opsonisierten Bakterien durch Mausmakrophagen untersucht. Es ist bekannt, dass die PI3Ks für die Fcγ-Rezeptor-vermittelte Phagozytose essentiell sind (Araki et al. 1996). Die Mausmakrophagen wurden vor der Infektion mit LY294002 oder unterschiedlichen Konzentrationen von Wortmannin behandelt. Anschließend erfolgte die Inkubation mit CSFE-markierten Gonokokken, welche keine Opa Proteine exprimierten. Um die Aufnahme über den Fcγ-Rezeptor zu gewährleisten, wurden die Bakterien zuvor opsonisiert. Die Menge der internalisierten Bakterien wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS-Invasions Assay) ermittelt. Abb. 3.1.5 Die Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase ist entbehrlich für die CEACAM3-vermittelte Phagozytose von Bakterien. (A) Humane Granulozyten wurden mit verschiedenen Konzentrationen Wortmannin (W; 200 nM) oder LY294002 (LY; 50 µM) inkubiert. Die Granulozyten wurden mit CSFEmarkierten Gonokokken, welche keine Opa Proteine (Ngo Opa-) oder Opa52 Protein (Ngo Opa52) exprimieren, (MOI = 25) infiziert oder blieben uninfiziert. Nach 15 min wurde die Phagozytoserate mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Hierfür wurde die Fluoreszenz der extrazellulären, adhärierten Bakterien durch die Zugabe von Trypanblau gequencht. Die Grafik zeigt die Werte eines repräsentativen Experiments. Mit frisch isolierten Granulozyten von drei verschiedenen Spendern wurden gleichwertige Ergebnisse erzielt. (B) Raw 264.7 Mausmakrophagen wurden mit den angegebenen Konzentrationen Wortmannin (W) präinkubiert und anschließende mit opsonisierten CSFE-markierten Opa- Gonokokken (MOI = 50) infiziert. Nach 30 min wurde die Phagozytoserate, wie unter (A) beschrieben, ermittelt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten. (C) Humane Granulozyten wurden mit 100 nM Wortmannin (W) oder 50 µM LY294002 (LY) präinkubiert und anschließend mit opsonisierten CSFEmarkierten Opa- Gonokokken (MOI = 50) infiziert. Nach 15 min wurde die Phagozytoserate, wie unter (A) beschrieben, ermittelt. Die Grafik zeigt die Mittelwerte von Triplikaten eines repräsentativen Experiments. Experimente mit frisch isolierten Granulozyten von drei verschiedenen Spendern erzielten gleichwertige Ergebnisse. Im Gegensatz zur CEACAM3-vermittelten Phagozytose von Opa52-exprimierenden Gonokokken wurde die Aufnahme von opsonisierten Bakterien über den Fcγ-Rezeptor durch die Behandlung mit PI3K-Inhibitoren negativ beeinflusst (Abb. 3.1.5B). Interessanterweise war die Phagozytose von Ig-opsonisierten, Opa negativen Gonokokken durch Granulozyten unabhängig von der PI3K-Aktivität (Abb. 3.1.5C). Dies lässt vermuten, dass die Sensitivität 84 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen des Phagozytoseprozesses gegenüber PI3K-Inhibitoren nicht nur durch Unterschiede im Phagozytoserezeptor, sondern auch durch den Zelltyp bestimmt wird. Insgesamt betrachtet lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass die PI3Ks keine Rolle bei der CEACAM3-vermittelten Aufnahme von Opa52-exprimierenden Gonokokken spielen. Allerdings besteht, die Möglichkeit, dass diese Kinasen zur Abtötung der internalisierten Bakterien beitragen. 3.1.2.5 Die Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase ist notwendig für die Abtötung CEACAM3-bindender pathogener Bakterien Die Ergebnisse des vorangegangenen Kapitels zeigen, dass die Phagozytose von Opa52exprimiernden Gonokokken unabhängig von der PI3K-Aktivität erfolgt. Allerdings spielen die Reaktionsprodukte der PI3K-Aktivität eine wichtige Rolle bei der Assemblierung des NADPH-Oxidase Komplexes in Phagozyten. Somit sind sie an der Generierung reaktiver Sauerstoffderivate (oxidative burst) beteiligt (Hawkins et al. 2007). Aus diesem Grund wurde untersucht, ob die Aktivität der PI3K bei der Abtötung phagozytierter Gonokokken eine Rolle spielt. Hierfür wurde die Produktion reaktiver Sauerstoffderivate in Granulozyten gemessen, während diese mit CEACAM-bindenden Gonokokken infiziert wurden. Für die Infektion der Granulozyten wurden CEACAM3bindende, Opa52-exprimierende Gonokokken verwendet. Als Kontrollen dienten Gonokokken, welche kein Opa Protein exprimierten (Opa-), sowie Gonokokken, welche Opa56exprimierten. Das Opa56 Protein wird durch keines der auf Granulozyten exprimierten CEACAMs erkannt (vgl. Tab. 1.3.1, siehe auch (Dehio et al. 1998)), wodurch eine Aufnahme und Abtötung dieser Bakterien nicht zu erwarten war. Sämtliche Infektionsexperimente wurden in Abwesenheit von opsonisierenden Reagenzien, wie beispielsweise spezifischen Antikörpern oder anderen Komplementfaktoren, durchgeführt. Die Inkubation der Granulozyten mit Opa- bzw. Opa56-exprimierenden Gonokokken bewirkte keine Erhöhung in der Generierung von reaktiven Sauerstoffderivaten (Abb. 3.1.6A und B). Wurden die Granulozyten allerdings mit Opa52-exprimierenden Gonokokken infiziert, resultierte dies in einer signifikant erhöhten Produktion reaktiver Saurstoffderivate (Abb. 3.1.6A und B). Die Inhibierung der PI3K-Aktivität mittels Wortmannin hatte einen negativen Effekt auf die Produktion reaktiver Sauerstoffderivate. Bereits die Verwendung von 1 nM Wortmannin ergab eine um 45 % verringerte Produktion dieser bakterientötenden Sauerstoffverbindungen. 85 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Abb. 3.1.6 Die Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase ist notwendig für die Generierung reaktiver Sauerstoffderivate in Granulozyten und die Abtötung der über CEACAM3 internalisierten Gonokokken. (A) Humane Granulozyten wurden mit Ngo Opa-, Ngo Opa52 oder Ngo Opa56 infiziert oder blieben uninfiziert. Die Entstehung reaktiver Sauerstoffderivate (Oxidativer burst) wurde über einen Zeitraum von 100 min gemessen. Die Grafik zeigt ein repräsentatives Experiment. Experimente mit frisch isolierten Granulozyten von drei verschiedenen Spendern ergaben gleichwertige Ergebnisse. (B) Der Oxidative Burst wurde wie unter (A) beschrieben, gemessen. Um den gesamten Oxidativen burst zu bestimmen, wurde die Fläche unter den Kurven berechnet. Die Grafik zeigt ein repräsentatives Experiment. Experimente mit frisch isolierten Granulozyten von drei verschiedenen Spendern ergaben gleichwertige Ergebnisse. (C) Humane Granulozyten wurden mit den angegebenen Konzentrationen Wortmannin (W) präinkubiert. Die Zellen blieben uninfiziert oder wurden mit Ngo Opa- oder Ngo Opa52 infiziert und der Oxidative burst wurde, wie in (B) beschrieben, gemessen und quantifiziert. Die Grafik zeigt ein repräsentatives Experiment. Experimente mit frisch isolierten Granulozyten von drei verschiedenen Spendern ergaben gleichwertige Ergebnisse. (D) Humane Granulozyten wurden mit Ngo Opa52 oder Ngo Opa56 (MOI = 1) für 60 und 240 min in An- oder Abwesenheit von Wortmannin infiziert. Der Abbau der Opa Proteine wurde durch Lyse der Zellen und anschließenden Western Blot mittels monoklonalem anti-Opa Antikörper analysiert. (E) Gonokokken, welche Opa52 oder Opa56 exprimieren, wurden für 60 und 240 min in An- oder Abwesenheit von Trypsin inkubiert. Der Abbau der Opa Proteine wurde, wie unter (D) beschrieben, analysiert. 86 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Wurde die Wortmannin-Konzentration auf 10 nM erhöht, bewirkte dies eine vollständige Inhibierung der Produktion reaktiver Sauerstoffverbindungen (Abb. 3.1.6C). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass in Folge der Bindung Opa52-exprimierender Gonokokken an CEACAM3 die schnelle Rekrutierung und Aktivierung der PI3K bei der Generierung reaktiver Sauerstoffderivate eine wichtige Rolle spielt. Im Folgenden sollte deshalb überprüft werden, ob die Aktivität der PI3K mit dem Abbau phagozytierter Bakterien in Zusammenhang steht. In der Mikrobiologie werden solche Experimente üblicherweise mittels der etablierten Methode des Gentamicin-Protektions Assays durchgeführt (Elsinghorst 1994). Bei diesem Assay werden nach der Infektion eukaryotischer Zellen alle extrazellulären Bakterien mit Hilfe des Antibiotikums Gentamicin abgetötet. Da Gentamicin nur sehr schwer membrangängig ist, werden alle intrazellulären Bakterien vor der Abtötung geschützt. Die intrazellulär überlebenden Bakterien werden anschließend durch sanfte Lyse der eukaryotischen Zellen freigesetzt und durch Erstellung von Verdünnungsstufen mit anschließender Keimzahlbestimmung, quantifiziert. Dieses Verfahren des Gentamicin-Protektions Assays kann für Infektionsexperimente mit Granulozyten nicht angewendet werden, da bei der Lyse der Granulozyten alle internalisierten Bakterien durch die Freisetzung der granulären Enzyme abgetötet würden. Um die Beteiligung der PI3K bei der Abtötung der Gonokokken dennoch untersuchen zu können, wurde ein indirektes Nachweisverfahren angewandt. Ziel dieses Versuchsaufbaus war es, durch die Degradation des bakteriellen Oberflächenproteins Opa52 den Abbau der Bakterien durch die Granulozyten und damit indirekt die Abtötung der Mikroben nachzuweisen. Hierfür wurden humane Granulozyten mit einem Verhältnis von einer Gonokokke pro Granulozyt (MOI = 1) infiziert. Nach 60 oder 240 min Inkubationszeiten wurden die Ansätze lysiert und die Menge an intaktem Opa Protein durch Western Blot Analyse nachgewiesen. Die für die Infektionsexperimente verwendeten Gonokokken exprimierten entweder Opa52 oder Opa56. Wie bereits im vorangegangenen Kapitel beschrieben, bindet das Oberflächenprotein Opa56 nur an CEA, welches nicht von Granulozyten exprimiert wird, so dass Opa56-exprimierende Gonokokken unter diesen Bedingungen nicht phagozytiert werden. Desweiteren kann die Stimulation der Produktion reaktiver Saurstoff-Derivate durch diese Gonokokken ausgeschlossen werden. Aufgrund dessen stellen die Opa56-exprimierende Gonokokken eine ideale Negativkontrolle dar. Die Western Blot Analyse in Abbildung 3.1.6D zeigt sehr deutlich, dass zu beiden Zeitpunkten das intakte Opa56 in jeweils gleichen Mengen detektierbar war. Im Gegensatz dazu war das Opa52 Protein nach 240min 87 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen nahezu vollständig degradiert. Dies lässt vermuten, dass die Bakterien dieses Infektionsansatzes phagozytiert und abgebaut wurden (Abb. 3.1.6D). Kontrollansätze, in welchen Opa52- und Opa56-exprimierende Gonokokken mit Trypsin inkubiert wurden, zeigten, dass diese Oberflächenproteine in vergleichbarem Maß sensitiv gegenüber Proteasen sind (Abb. 3.1.6E). Wurden die Infektionsansätze mit Wortmannin behandelt, führte dies zur Inhibierung des Abbaus von Opa52 durch die Granulozyten (Abb.3.1.6D). Dabei war der Abbau von Opa52 zeitabhängig, denn nach 60 min waren, unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Wortmannin, noch gleiche Mengen von Opa52 im Infektionsansatz vorhanden. Im Gegensatz dazu war nach 240 min, im Infektionsansatz ohne Wortmannin, fast alles Opa52 Protein degradiert, während die Menge an Opa52 in den mit Wortmannin behandelten Ansätzen unverändert blieb. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die CEACAM3-induzierte Rekrutierung und Aktivierung der PI3K nicht nur essentiell für die Produktion reaktiver Sauerstoffderivate ist, sondern in diesem Zusammenhang auch an der effektiven Abtötung CEACAM-bindender Bakterien beteiligt ist. 3.1.3 Diskussion Mehrere, an den Menschen angepasste Pathogene benutzen Mitglieder der CEACAMFamilie, um die Schleimhautoberflächen ihres Wirtes zu besiedeln. Im Gegenzug verfügt das angeborene Immunsystem des Menschen mit CEACAM3 über einen spezialisierten Rezeptor, der die Opsonin-unabhängige Erkennung und Eliminierung von CEACAM bindenden Bakterien ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass der granulozytische Rezeptor CEACAM3 nicht nur die Bindung und Phagozytose von bakteriellen Pathogenen bewerkstelligt, sondern auch die Produktion bakterizider Sauerstoffverbindungen einleitet. Die schnelle Synthese von reaktiven Sauerstoffderivaten durch Granulozyten erfolgt als Antwort auf CEACAM-bindende Mikroben und hängt von der Aktivität der an die dicht gedrängten CEACAM3 Moleküle rekrutierten PI3K ab. Die direkte, SH2-vermittelte Bindung der regulatorischen Untereinheit der PI3K an den phosphorylierten Tyr230 (pTyr230) der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 liefert eine Erklärung für die Geschwindigkeit und Effizienz, mit der die oxidative Antwort der Granulozyten auf nicht opsonisierte N. gonorrhoeae erfolgt. Gleichzeitig ist dies auch ein Hinweis darauf, dass die CEACAM3vermittelte, angeborene Immunantwort dabei hilft, die Ausbreitung von CEACAM-bindenden Bakterien in ihrem menschlichen Wirt einzudämmen. 88 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass beide SH2 Domänen der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K (PI3KR3) fähig sind direkt an das pTyr230, nicht aber an das pTyr241 der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 zu binden. Das pull-down Experiment zeigte, dass die Interaktion der C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 und phosphoryliertem CEACAM3 auch dann noch stattfindet, wenn das Tyr230 gegen Phenylalanin ausgetauscht ist. Dieses Ergebnis kann allerdings durch vergleichende Betrachtung der Ergebnisse des pulldown Experiments und des CEACAM3-Peptid-Bindeexperiments (Abb. 3.1.3) erklärt werden. Das pull-down Experiment zeigte, dass die Mutation des Tyr230 von CEACAM3 die Assoziation der N-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 mit phosphoryliertem CEACAM3 vollständig unterbindet. Im Gegensatz dazu konnte erst die Mutation beider Tyrosine von CEACAM3 die Assoziation mit der C-terminalen SH2 Domäne aufheben. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass die C-terminale SH2 Domäne an beide Phosphotyrosine, die Nterminale SH2 Domäne allerdings nur an den pTyr230 binden kann. Für die Tatsache, dass die Interaktion der C-terminalen SH2 Domäne mit beiden Phosphotyrosinen nicht im CEACAM3-Peptid-Bindeexperiment nachweisbar war, gibt es zwei mögliche Erklärungsansätze. Zum einen ist es möglich, dass für die Bindung der PI3KR3-C-SH2 Domäne an den pTyr241 die dreidimensionale Struktur des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 wichtig ist. Zum anderen wäre es auch denkbar, dass die C-terminale SH2 Domäne eine höhere Bindungsaffinität für den pTyr230 hat als für den pTyr241. Diese These wird durch das pull-down Experiment mit der PI3KR3-C-SH2 Domäne unterstützt, aus dem zu erkennen ist, dass die Mutation des Tyr230 einen stärkeren Effekt zeigt, als die Mutation des Tyr241. Insgesamt zeigen die Ergebnisse aber auch, dass die Bindungsaffinität der Cterminalen SH2 Domäne für den pTyr230 geringer ist als die Bindungsaffinität der Nterminalen SH2 Domäne für diesen pTyr-Rest. Bereits frühere Studien zeigten, dass zwei SH2 Domänen eines Proteins unterschiedliche Bindungsaffinitäten für das gleiche Phosphotyrosinprotein haben können. So konnten beispielsweise Jones et al. mittels eines SH2 Domänen Arrays nachweisen, dass die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 eine vierfach höhere Bindungsaffinität für den phosphorylierten ErbB-Rezeptor hat als die C-terminale SH2 Domäne (Jones et al. 2006). Somit scheint es in dem hier vorliegenden Fall nicht unwahrscheinlich, dass die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 aufgrund ihrer höheren Bindungsaffinität für den pTyr230 von CEACAM3 an diesen bindet und in der Folge die Cterminale SH2 Domäne mit dem pTyr241 interagiert. Durch auf der Oberflächenplasmonresonanz Methodik basierende Untersuchungen könnte diese Theorie näher analysiert 89 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen werden. Weiterhin wäre es in diesem Zusammenhang sehr interessant, auch die Tandem-SH2 Domänen (GST-Fusion des Proteinabschnittes vom Anfang der N-terminalen bis zum Ende der C-terminalen SH2 Domäne) der PI3KR3 hinsichtlich des Bindungsverhaltens an phosphoryliertes CEACAM3 zu untersuchen. Interessanterweise dient das pTyr230 in der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 auch als Bindungsstelle für den Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav (Schmitter et al. 2007a). Des Weiteren ist dieser Tyrosinrest in eine YxxL Sequenz eingebettet, welche als Bindemotiv für SH2 Domänen von PTKs der Src-Familie identifiziert wurde (Songyang et al. 1993). Bisher unveröffentlichte Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass auch die gut dokumentierten Interaktionen von CEACAM3 mit PTKs der Src-Familie, wie Hck und Yes, ebenfalls am pTyr230 stattfinden (Schmitter et al. 2007b; Buntru et al. 2009). Diesen Sachverhalt betreffend existieren einige, sich nicht gegenseitig ausschließende Möglichkeiten, die Assoziation eines einzelnen Aminosäurerestes mit mehreren, für die CEACAM3vermittelte Signaltransduktion erforderliche Faktoren zu erklären. Einerseits führt die Bindung der multivalenten Bakterien eindeutig zur Bündelung mehrerer CEACAM3 Moleküle in einem räumlich eng begrenzten Bereich der Zelle (Schmitter et al. 2004; Buntru et al. 2009). Dies würde es allen pTyr230 bindenden Komponenten ermöglichen, sich gleichzeitig in derselben Region der Zelle anzureichern. In diesem Fall würde ein Teil der phosphorylierten Rezeptoren mit jeweils einem SH2 Domänen enthaltenden Protein im Komplex vorliegen. Die Größe der Anteile würde sich hier durch die Affinitäten und relativen lokalen Konzentrationen der vorhandenen Bindungspartner ergeben. Andererseits sind die Interaktionen des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 und seiner zytoplasmatischen Bindungspartner nur vorübergehender Natur. Durch Lebendzellmikroskopie wurde herausgefunden, dass nach Bindung von OpaCEA-exprimierenden N. gonorrhoeae und anschließender Bündelung mehrer CEACAM3 Moleküle die SH2 Domäne von Hck sehr schnell an den Rezeptor rekturiert wird und dann binnen 5-10 min wieder verschwindet (Buntru et al. 2009). Demzufolge könnte eine Hierarchie der zytoplasmatischen Faktoren existieren, die in einer zeitlich geordneten Abfolge mit dem intrazellulären Abschnitt von CEACAM3 interagieren. Weitere Untersuchungen mittels Lebendzellmikroskopie unter Einsatz von unterschiedlich markierten SH2-Domänen sowie die biochemische Ermittlung der Dissoziationskonstanten von CEACAM3 und einer Reihe von SH2 Domänen würden zur Klärung dieses Sachverhalts beitragen. 90 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Ein überraschendes Ergebnis ist der Befund, dass die Rekrutierung und direkte Assoziation der PI3K für den durch CEACAM3 ausgelösten Phagozytoseprozess entbehrlich zu sein scheint. Die Aktivität der PI3K wird offenbar weder in CEACAM3-transfizierten Zelllinien noch in primären humanen Granulozyten, welche diesen Rezeptor endogen exprimieren, für die Aufnahme der Bakterien benötigt. Diese Ergebnisse zeigen einen großen Unterschied zur dokumentierten, essentiellen Rolle der PI3K-Aktivität bei der Opsonin-vermittelten Aufnahme von Partikeln durch den Fcγ Rezeptor (Araki et al. 1996). Untersuchungen mit nicht natürlich vorkommenden Phagozyten, die durch transiente Expression von funktionellen Fcγ Rezeptoren in COS-1 Zellen generiert wurden, zeigten, dass der Phagozytoseprozess von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen durch diese Zellen hochempfindlich gegen die Behandlung mit Wortmannin ist (Indik et al. 1995). Weiterführende Beobachtungen ergaben, dass die Inhibierung der Phagozytose durch Wortmannin von der Größe der Partikel abhängig ist. So können IgG-beschichtete Latex-Kügelchen mit einem Durchmesser von unter 2 µm über einen PI3K-unabhängigen Prozess aufgenommen werden (Cox et al. 1999). Für gewöhnlich beträgt die Größe der Diplokokken von N. gonorrhoeae 1-2 µm, was nahelegt, dass dieses Bakterium unter der kritischen Größe für die PI3K-Abhängigkeit der Aufnahme liegt. Unsere Experimente mit Mausmakrophagen und humanen Granulozyten zeigen jedoch, dass IgG-opsonierte Gonokokken von diesen zwei Zelltypen in mechanistisch unterschiedlicher Art und Weise aufgenommen werden. Offensichtlich bestimmt in diesem Fall nicht nur die Größe oder die Opsonisierung des mikrobiellen Partikels, sondern auch der Zelltyp darüber, ob die Aufnahme in Abhängigkeit von der PI3K oder unabhängig davon erfolgt. Die Opsonin unabhängige Internalisierung von OpaCEA exprimierenden Gonokokken durch humane Granulozyten ist offenkundig nicht von der Aktivität der PI3K abhängig. Auf den ersten Blick stehen die Ergebnisse, welche eine PI3K-unabhängige Aufnahme von OpaCEA exprimierenden Gonokokken zeigen, im Widerspruch zu einer früher veröffentlichten Arbeit, die zeigte, dass der Einsatz von Wortmannin das Verhältnis von internalisierten und insgesamt an die Zelle gebundenen Bakterien um rund 40 % reduziert (Booth et al. 2003). Allerdings war die Anzahl der zellassoziierten Bakterien in diesem experimentellen System durch die Behandlung mit Wortmannin um rund 50 % erhöht, während die absolute Anzahl der internalisierten Gonokokken unverändert blieb (siehe Abb. 2 in (Booth et al. 2003)). In den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit konnte weder in CEACAM3 transfizierten HEK293T Zellen noch in humanen Granulozyten eine Veränderung in der Gesamtzahl der zellassoziierten Bakterien nach Inhibierung der PI3K festgestellt werden. Diese Diskrepanz 91 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen könnte darauf zurückzuführen zu sein, dass durch die von Booth et al. verwendetet mikroskopische Auswertung der Bakterienaufnahme lediglich eine kleine Anzahl von Zellen untersucht werden konnte. Im Gegensatz dazu wird durch die in dieser Arbeit angewandte Methode des FACS-Invasions Assays eine viel größere Zellzahl (ca. 1x104) hinsichtlich der Bakterienaufnahme untersucht. Trotz der Tatsache, dass die Aktivität der PI3K für die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-exprimierenden N. gonorrhoeae nicht benötigt wird, bringt die direkte Interaktion ihrer regulatorischen Untereinheit mit dem lokal angehäuften CEACAM3 die Lipidkinase in die Nähe ihres Substrates in der Zellmembran. In der Tat wurde durch die Rekrutierung von fluoreszenzmarkierten PH-Domänen ein starker Anstieg des PI(3,4,5)P3-Spiegels in den Membranabschnitten beobachtet, in denen CEACAM3 mit den Bakterien assoziiert (Booth et al. 2003). Neben der Reorganisation des Aktinzytoskeletts durch die Rekrutierung von Guaninnukleotid-Austauschfaktoren für RhoGTPasen, wie z.B Vav oder Tiam, oder der Aktivierung von Kinasen wie PKB oder Tec erfüllt PI(3,4,5)P3 auch eine zentrale Rolle in der Regulation von Effektorfunktionen von Granulozyten (Dewald et al. 1988; Arcaro and Wymann 1993; Hawkins et al. 2006). Insbesondere der NADPH-Oxidase-Komplex in Neutrophilen, der aus zwei membrangebundenen Untereinheiten (Cytochrom b558/gp91phox und p22phox) und vier löslichen Proteinen (p67phox, p47phox, p40phox und GTP-beladenes Rac2) besteht, unterliegt einer strikten Regulation und benötigt die Stimuli von 3’-phosphorylierten Phosphatidylinositolen in mehreren Abschnitten seiner Funktion (Bokoch and Diebold 2002; Hawkins et al. 2007). Beispielsweise wird PI(3,4,5)P3 benötigt, um den Rac2 Guaninnukleotid-Austauschfaktor P-Rex1 an die Membran zu rekrutieren und zu aktivieren (Welch et al. 2002; Zhao et al. 2007). Darüber hinaus kann PI(3,4,5)P3 von Lipidphosphatasen zu PI(3)P umgesetzt werden, welches allerdings auch direkt durch Phosphatidylinositol-3’Kinasen der Klasse III generiert werden kann (Vanhaesebroeck et al. 2001). Dieses 3’phosphorylierte Phosphatidylinositol ist essentiell für die Rekrutierung und allosterische Aktivierung von p40phox und somit an der FcγR-vermittelten Produktion reaktiver Sauerstoffderivate beteiligt (Ellson et al. 2006; Suh et al. 2006). Da Wortmannin und LY294002 die Phosphatidylinositol-3’-Kinasen der Klassen I und III gleichermaßen inhibieren, ist es nicht möglich, die individuellen Beiträge dieser Enzymklassen für die durch CEACAM3 ausgelöste Produktion der reaktiven Sauerstoffderivate zu beurteilen. Dennoch erscheint die Annahme plausibel, dass die maximale Aktivierung der NADPH-Oxidase, als Antwort auf CEACAM3-bindende Bakterien, eine koordinierte Aktivität beider Klassen von 92 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Phosphatidylinositol-3’-Kinasen benötigt. Die intrazelluläre Zerstörung phagozytierter Bakterien ist dabei offenkundig von der Aktivität der PI3K, über den Zeitraum von einigen Stunden, abhängig. Dies weißt auf eine koordinierte Prozessierung der internalisierten Gonokokken durch reaktive Sauerstoffderivate und proteolytische Enzyme des Wirtes hin. Interessanterweise besitzen ausser N. gonorrhoeae noch einige andere Gram-negative, an den Menschen angepasste Pathogene, wie N. meningitidis, Haemophilus influenzae und Moraxella catarrhalis, Adhäsine, um an CEACAMs zu binden (Gray-Owen and Blumberg 2006). Ähnlich wie die Gonokokken besitzen auch diese Pathogene die Fähigkeit der erworbenen Immunantwort durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. die Sekretion von Immunglobulin-Proteasen oder Variation ihrer Oberflächenstrukturen, zu entgehen. Die Expression von CEACAM3 auf Granulozyten scheint eine spezifische Anpassung des humanen, angeborenen Immunsystems zu sein, um einen in der Keimbahn verankerten Rezeptor zur effizienten Phagozytose und Abtötung von CEACAM-bindenden Bakterien bereit zu stellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des molekularen Netzwerkes der ITAM-ähnlichen Sequenz im zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 für die Koordination dieser Prozesse und geben Impulse für die weitere Erforschung dieses besonderen phagozytischen Rezeptors. 93 3 3.2 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Das Signalprotein Grb14 ist am CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess beteiligt 3.2.1 Einleitung Verschiedene, an den Menschen angepasste Gram-negative Bakterien besitzen die Fähigkeit, an Mitglieder der CEACAM-Familie zu binden und können dadurch die Schleimhautoberflächen ihres Wirtes auf äußerst effiziente Art und Weise besiedeln. Im Gegenzug verfügt das angeborene Immunsystem des Menschen mit CEACAM3 über einen spezialisierten Rezeptor, welcher die Opsonin-unabhängige Erkennung und Eliminierung von CEACAM bindenden Bakterien ermöglicht. Dabei hängt die Funktionalität von CEACAM3 entscheidend von einer Phosphorylierung durch Mitglieder der Src-Kinase Familie ab (McCaw et al. 2003; Schmitter et al. 2007b). Es konnte bereits gezeigt werden, dass sich die Aktivität dieser Kinasen stark erhöht, wenn Opa-exprimierende Bakterien mit der Wirtszelle assoziieren (Hauck et al. 1998). Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass in Bezug auf die effektive Aufnahme und Abtötung von OpaCEA-exprimierenden Gonokokken die beiden Tyrosinreste (Tyr230 und Tyr241) des ITAM-ähnlichen Sequenzmotivs von CEACAM3 eine entscheidende Rolle spielen (Schmitter et al. 2004; Schmitter et al. 2007a; Buntru et al. 2011). Für Tyr230 konnte gezeigt werden, dass der Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav über seine SH2 Domäne direkt an diesen, durch Src-Kinasen phosphorylierten Tyrosinrest bindet (Schmitter et al. 2007a). In der Folge stimuliert Vav die kleine GTPase Rac, einen wichtigen Regulator des Aktinzytoskeletts, wodurch die Umordnung des Aktinzytoskeletts ausgelöst und somit die Aufnahme der Gonokokken eingeleitet wird. Genau wie für den Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav (Schmitter et al. 2007a), wurde auch für die regulatorische Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3KR3) eine Rekrutierung und direkte Assoziation mit Bakterien ligiertem CEACAM3 gefunden (Kapitel 3.1, (Buntru et al. 2011)). In weiterführenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 direkt mit dem phosphorylierten Tyr230 (pTyr230) interagiert (Kapitel 3.1, (Buntru et al. 2011)). Ebenso zeigen bisher unveröffentlichte Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe, dass auch die gut dokumentierten Interaktionen von CEACAM3 mit PTKs der Src-Familie, wie Hck und Yes, ebenfalls am pTyr230 stattfinden (Schmitter et al. 2007b; Buntru et al. 2009). 94 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Diese Fakten deuten darauf hin, dass die effektive Funktionsweise von CEACAM3 auf die Beteiligung unterschiedlichster SH2 Domänen tragender Signalproteine zurückzuführen ist. Aus diesem Grund ist nicht auszuschließen, dass weitere, bisher unbekannte Signalproteine mit SH2 Domänen an diesem Prozess beteiligt sind. Um dies in Bezug auf eine größere Anzahl von verschiedenen SH2 Domänen-tragenden Proteinen untersuchen zu können, bietet sich der in Kapitel 2 etablierte SH2 Domänen Array als ein effizientes Werkzeug an. Wie bereits in Kapitel 2.2.2 beschrieben, wurde mittels des SH2 Domänen Arrays das Signalprotein Grb14 als möglicher Interaktionspartner für CEACAM3 identifiziert. Grb14 gehört zur Familie der Wachstumsfaktorrezeptor-bindenden 7/10/14 (growth factor receptorbound; Grb7/10/14) Proteine. Diese Wachstumsfaktorrezeptor-bindenden Signalproteine unterscheiden sich in Struktur und Funktion grundlegend von dem namensgleichen Wachstumsfaktorrezeptor-bindenden Adapterprotein Grb2. Die Familie der Grb7/10/14Proteine umfasst drei Mitglieder (Grb7, Grb10 und Grb14), welche ursprünglich als Interaktionspartner von aktivierten Wachstumsfaktorrezeptoren entdeckt wurden (Han et al. 2001; Holt and Siddle 2005). Die Interaktion von Rezeptor und Grb7/10/14 erfolgt dabei über die Bindung der Grb7/10/14-SH2 Domäne an die phosphorylierten Tyrosinreste des aktivierten Rezeptors. Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass die Mitglieder der Grb7/10/14-Familie durch die Bindung an aktivierte Wachstumsrezeptoren unterschiedliche zelluläre und physiologische Prozesse beeinflussen und regulieren. Durch unterschiedliche Gen-Deletionsstudien konnten Einblicke in die biologische Rolle von Grb10 und Grb14 gewonnen werden. Im Vergleich zu Mäusen mit normaler grb10 Expression sind Mäuse mit gewebespezifischer, deaktivierter grb10 Expression (grb10 knock out) ca. 30 % größer und haben unverhältnismäßig große Lebern (Charalambous et al. 2003). Des Weiteren zeigen ausgewachsene grb10 knock out Mäuse eine verbesserte Glukosetoleranz sowie erhöhte Muskelmasse und reduzierte Fettleibigkeit (Smith et al. 2007; Wang et al. 2007). Auch grb14 knock out (Grb14-/-) Mäuse weisen eine verbesserte Glukosetoleranz auf sowie eine verbesserte Insulin-induzierte Signalweiterleitung in Muskel und Leber. Hinsichtlich Körpergröße und –gewicht unterscheiden sich die Grb14-/- Mäuse allerdings nicht von wildtypischen Mäusen (Cooney et al. 2004). Diese in-vivo Studien zeigen, dass sowohl Grb10 als auch Grb14 wichtige gewebespezifische Negativregulatoren von Insulin-induzierten Signalwegen sind. Hinsichtlich ihres Aufbaus zeigen alle drei Mitglieder der Grb7/10/14-Proteinfamilie die gleiche Domänenstruktur. Diese besteht aus einer N-terminalen Prolin-reichen (P) Region, 95 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen gefolgt von einer Ras-assoziierenden (RA) Domäne, einer Pleckstrin-Homologie (PH) Domäne, einer Src-Homologie 2 (SH2) Domäne sowie einer zwischen PH und SH2 liegenden BPS Domäne (Abb. 3.2.1) (Holt and Siddle 2005). Abb. 3.2.1 Schematische Darstellung der Grb7/10/14Proteinfamilie. Alle drei Mitglieder haben eine Nterminale Prolin-reiche Domäne (P), eine Ras-assoziierende Domäne (RA), eine PleckstrinHomologie Domäne (PH), eine SH2 Domäne sowie eine BPS (between PH and SH2) Domäne. Strukturelle Homologien zwischen den Domänen der Familienmitglieder sind in Prozent (%) angegeben. Modifiziert aus (Holt and Siddle 2005) Der Name der BPS (between PH and SH2 domain; BPS) Domäne ist auf ihre Lokalisation zwischen der PH und der SH2 Domäne zurückzuführen (He et al. 1998). Die BPS Domäne umfasst circa 80 Aminosäuren und zeigt eine 56-64%ige Sequenzidentität bei alle drei Familienmitgliedern, hat aber keine Homologien zu anderen bekannten Protein Interaktionsdomänen (Holt and Siddle 2005). Für Grb10 und Grb14 konnte nachgewiesen werden, dass die BPS Domäne durch direkte Bindung in die Kinasedomäne die katalytische Aktivität des aktivierten Insulinrezeptors inhibiert (Stein et al. 2001; Bereziat et al. 2002; Depetris et al. 2005), während die C-terminal gelegenen SH2 Domäne an die tyrosinphosphorylierte Aktivierungsschleife des Rezeptors bindet. Neben diesen direkten Interaktionen von BPS und SH2 Domäne mit dem Rezeptor sind die RA und die PH Domäne für die Rekrutierung der Grb7/10/14 Proteine an die Zellmembran notwendig. Die RA Domäne assoziiert mit aktivierten kleinen GTPasen, welche durch Aktivierung des Wachstumsrezeptors in erhöhter Konzentration in der Nähe des Rezeptors lokalisieren. Ebenso resultiert die Wachstumsfaktor-induzierte Signalkaskade auch in einer erhöhten Konzentration von Phosphatidylinositolphosphaten (PIPs), welche als Liganden für die PH Domänen der Grb7/10/14-Proteine dienen. Weiterhin können die Grb7/10/14 Proteine über ihre Interaktionsdomänen auch mit anderen intrazellulären Proteinen interagieren und dadurch verschiedene zelluläre Prozesse wie Metabolismus, Phosphorylierung, Ubiquitinylierung und 96 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Proteindegradation regulieren (Holt and Siddle 2005). So konnte beispielsweise nachgewiesen werden, dass Grb14, im phosphorylierungsabhängigen Komplex mit aktiviertem Wachstumsrezeptor, über seine Prolin-reiche Region mit der SH3 Domäne der Phospholipase Cγ (PLCγ) interagieren kann und dadurch die Aktivierung der Lipase verhindert (BrowaeysPoly et al. 2010). Weiterhin zeigen Studien, dass die Interaktion der BPS Domäne von Grb14 mit dem Proteinkinase Cζ (PKCζ) interagierenden Protein ZIP Phosphorylierungsprozesse reguliert (Cariou et al. 2002). Aus diesen Grund ist es sehr interessant, die mittels des SH2 Domänen Arrays gefundene Interaktion zwischen Grb14 und CEACAM3 zu verifizieren, um in der Folge eine mögliche Beteiligung von Grb14 an CEACAM3-vermittelten Signalprozessen eingehender untersuchen zu können. 3.2.2 Ergebnisse 3.2.2.1 Grb14 interagiert über seine SH2 Domäne direkt mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3 Die in Kapitel 2.2.2. beschriebene Assoziation von phosphoryliertem CEACAM3 mit der SH2 Domäne von Grb14 sollte im Folgenden biochemisch verifiziert werden. Mittels des SH2 Domänen Arrays wurde lediglich das Mitglied Grb14 der Grb7/10/14-Familie auf Interaktion mit CEACAM3 untersucht. Aus diesem Grund sollten auch die beiden anderen Mitglieder dieser Proteinfamilie auf Interaktionen mit CEACAM3 untersucht werden. Hierfür wurden die GST-fusionierten SH2 Domänen von Grb7, Grb10 und Grb14 an GSH-Sepharose gebunden und anschließend in einem pull-down Experiment mit Zelllysaten, die entweder phosphoryliertes oder unphosphoryliertes CEACAM3 enthielten, verwendet. Zur Herstellung der Zelllysate wurden HEK293T Zellen mit einem v-Src-kodierenden Plasmid und einem Kontrollplasmid (GFP) oder einem CECAM3-GFP-kodierenden Plasmid kotransfiziert und nach 48 Stunden lysiert. Die Lysate wurden auf den Gehalt gleicher Mengen von GFP und CEACAM3-GFP sowie hinsichtlich der Tyrosinphosphorylierung von CEACAM3-GFP mittels Western Blot überprüft (Abb 3.2.2A). Es wurden jeweils gleiche Mengen an GST oder GST-SH2 Domänen von Grb7, Grb10 und Grb14 sowie PI3KR3-N und Slp76, gekoppelt an GSH-Sepharose, mit phosphoryliertem oder unphosphoryliertem CEACAM3 Lysat inkubiert (Abb. 3.2.2B Coomassie-Färbung). Die Ansätze mit der PI3KR3-N-SH2 Domäne dienten dabei als Positiv-, die mit der Slp76-SH2 Domäne als Negativkontrolle. Der lediglich GST 97 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen enthaltende Ansatz diente als weitere Negativkontrolle, um eine Interaktion von CEACAM3 mit dem GST-Fusionsprotein auszuschließen. Wie erwartet, präzipitiert die rekombinante GST-fusionierte PI3KR3-N-SH2 Domäne phosphoryliertes CEACAM3 aus dem Ganzzelllysat (Abb. 3.2.2B). Dies ist übereinstimmend mit früheren Beobachtungen, welche sowohl Kolokalisation als auch direkte Interaktion der PI3KR3-N-SH2 Domäne mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3 zeigten (vgl. Kapitel 3.1 sowie (Buntru et al. 2011)). Abb. 3.2.2 Die SH2 Domänen der Grb7/10/14-Familienmitglieder assozzieren mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3. (A) In HEK293T Zellen wurden GFP (als Kontrollprotein) oder GFPfusioniertes CEACAM3 in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimiert. Die Zellen wurden nach 2 Tagen lysiert und durch Western Blot hinsichtlich Tyrosinphosphorylierung und gleichmäßiger CEACAM3-Expression überprüft. (B) Die Ganzzelllysate wurden für ein pull-down Experiment mit den angegebenen GST-SH2 Domänen oder GST allein verwendet. Die präzipitierten CEACAM3-Varianten wurden mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper (obere Reihe) nachgewiesen. Die Verwendung von gleichen Mengen an GSTFusionsproteinen oder GST allein wurde durch Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft. Auch die SH2 Domänen aller drei Mitglieder der Grb7/10/14-Familie sind fähig, phosphoryliertes CEACAM3 aus dem Lysat zu präzipitieren (Abb. 3.2.2B). Betrachtet man die Mengen an präzipitiertem CEACAM3, sind deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen SH2 Domänen zu erkennen. Während die SH2 Domäne von Grb7 nur in sehr geringem Maß mit CEACAM3 assoziiert, präzipitieren die strukturell ähnlicheren SH2 Domänen von Grb10 und Grb14 (Scharf et al. 2004) phosphoryliertes CEACAM3 wesentlich stärker. Jedoch sind auch bei diesen beiden SH2 Domänen noch Unterschiede in der Menge des präzipitieren CEACAM3 zu erkennen. Die Grb14-SH2 Domäne interagiert, verglichen mit den SH2 Domänen von Grb7 und Grb10, am stärksten mit phosphoryliertem CEACAM3. Im Gegensatz dazu können weder GST noch die SH2 Domäne von Slp76 das phosphorylierte CEACAM3 aus dem Lysat präzipitieren (Abb. 3.2.2B). Um zu überprüfen, ob diese phosphorylierungsabhängige Interaktion auch dann noch stattfindet, wenn beide Proteine in voller Länge vorliegen, wurde eine Koimmunpräzipitation 98 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen durchgeführt. Hierfür wurden GFP-Grb14 und CEACAM3-HA-mKate in Anwesenheit von v-Src in HEK293T Zellen koexprimiert. Die Zellen wurden lysiert und mittels Western Blot auf gleichmäßige Proteinexpression überprüft (Abb. 3.2.3A). Für die Koimmunpräzipitation wurde das in den Lysaten enthaltene CEACAM3-HA-mKate mittels eines polyklonalen antimKate Antikörpers präzipitiert. Im Anschluss wurden die Präzipitate durch Western Blot Analyse unter Verwendung eines monoklonalen anti-GFP Antikörpers auf den Gehalt an GFP-Grb14 überprüft (Abb. 3.2.3B). Es ist deutlich zu erkennen, dass GFP-Grb14 durch CEACAM3-HA-mKate kopräzipitiert wird. Diese Interaktion ist spezifisch, da GFP-Grb14 nicht unspezifisch durch mKate alleine aus dem Lysat herausgezogen wird (Abb. 3.2.3B). Abb. 3.2.3 Das Grb14 Protein interagiert mit phosphoryliertem CEACAM3. (A) In HEK293T Zellen wurden konstitutiv aktives virales Src (v-Src) zusammen mit CEACAM3-HA-mKate in An- oder Abwesenheit von GFP-Grb14 koexprimiert. Die Zellen wurden nach 2 Tagen lysiert und hinsichtlich gleichmässiger Proteinexpression und Tyrosinphosphorylierung untersucht. (B) Die Zelllysate wurden mit polyklonalem antimKate Antikörper inkubiert, um das enthaltene CEACAM3-HA-mKate zu präzipitieren. Die Analyse der Präzipitate auf den Gehalt an GFP-Grb14 erfolgte mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper (obere Reihe). Zur Überprüfung der Präzipitate auf den gleichmäßigen Gehalt von CEACAM3-HA-mKate wurde ein monoklonaler anti-HA Antikörper verwendet (untere Reihe). Die Ergebnisse des SH2 Domänen Arrays, des pull-down Experiments und der Koimmunpräzipitation zeigen, dass Grb14 über seine SH2 Domäne mit phosphoryliertem CEACAM3 interagiert kann. In seinem zytoplasmatischen Abschnitt besitzt CEACAM3 zwei phosphorylierbare Tyrosinreste (Tyr230 und Tyr241), die in eine ITAM-ähnliche Sequenz eingebettet sind. Diese Tyrosine wurden schon früher als essentiell für die phagozytische Funktion von CEACAM3 beschrieben. In diesem Zusammenhang wurde das phosphorylierte Tyr230 als Bindemotiv für verschiedene Signalproteine mit SH2 Domänen beschrieben. Diese Signalproteine sind entscheidend am Prozess der CEACAM3-vermittelten Phagozytose von Pathogenen beteiligt (Schmitter et al. 2004; Schmitter et al. 2007a; Schmitter et al. 2007b). Unter Verwendung eines semi-synthetischen Versuchsaufbaus sollte herausgefunden werden, ob auch die Assoziation von phosphoryliertem CEACAM3 mit der SH2 Domäne von Grb14 auf einen dieser beiden Tyrosinreste zurückzuführen ist. Da dieses Experiment in 99 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Abwesenheit sämtlicher zellulärer Komponenten erfolgt, können somit auch Rückschlüsse gezogen werden, ob diese Interaktion direkter Natur ist. In einem ersten Schritt wurden Peptide der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 als einzelne Punkte auf einer Zellulosemembran synthetisiert (Frank 1992). Die Peptide enthielten jeweils einen der beiden Tyrosinreste (Tyr230 bzw. Tyr241) sowie die jeweils sieben Aminosäuren, welche das Tyrosin N- und C-terminal umgeben. Die Tyrosine wurden sowohl in phosphorylierter (pY) als auch in unphosphorylierter (Y) Form synthetisiert (Abb. 3.2.4). Im zweiten Schritt wurden die freien Proteinbindestellen der Zellulosemembran durch eine Casein-haltige Lösung blockiert. Anschließend erfolgte die Beprobung der Zellulosemembran mit der rekombinanten, GST-fusionierten SH2 Domäne von Grb14. Als Negativkontrolle diente eine Membran, welche lediglich mit GST inkubiert wurde. Die GST-Grb14-SH2 Domäne band selektiv an das phosphorylierte Tyr230, nicht aber an das phosphorylierte Tyr241 oder eines der unphosphorylierten Tyrosine von CEACAM3 (Abb. 3.2.4). Abb. 3.2.4 Die SH2 Domäne von Grb14 bindet direkt an das phosphorylierte Tyr230 der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Membranen, auf denen phosphorylierte (pY) und unphosphorylierte (Y) synthetische Peptide der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 immobilisiert waren, wurden mit der GST-fusionierten SH2 Domäne von Grb14 oder GST allein inkubiert. Die gebundenen GSTFusionsproteine wurden mittels monoklonalem anti-GST Antikörper detektiert. Auch für das Kontrollprotein GST konnte keine Bindung an die Peptide festgestellt werden. Dieses Ergebnis demonstriert, dass die Interaktion zwischen CEACAM3 und der SH2 Domäne von Grb14 spezifisch durch den phosphorylierten Tyrosinrest Tyr230 vermittelt wird. Gleichzeitig konnte auch gezeigt werden, dass diese Interaktion unabhängig von anderen zellulären Komponenten stattfinden kann und somit direkter Natur ist. 3.2.2.2 Grb14 wird in humanen Granulozyten exprimiert Bisher konnte nachgewiesen werden, dass eine physische Interaktion zwischen Grb14 und CEACAM3 möglich ist. Für eine physiologische Relevanz dieser Interaktion müssen beide Proteine im selben Zelltyp vorkommen. Da CEACAM3 ausschließlich von Granulozyten exprimiert wird, ist es nötig, diesen Zelltyp hinsichtlich der Expression von Grb14 zu untersuchen. Leider war es nicht möglich, endogenes Grb14 mittels Immunpräzipitation aus humanen Granulozyten zu isolieren. Auch der direkte Nachweis von Grb14 in komplettem Granulozytenlysat durch Western Blot Analysen war nicht möglich. Eine mögliche Erklärung 100 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen hierfür ist, dass durch die Lyse der Granulozyten sämtliche proteolytischen Enzyme aus den Granulae freigesetzt werden. Die Freisetzung dieser Enzyme bewirkt in der Folge eine sehr schnelle Degradation der zellulären Proteine. Dadurch werden sowohl Immunpräzipitationen als auch Western Blot Analysen stark erschwert. Aus diesem Grund wurde die Expression von Grb14 indirekt, auf mRNA-Ebene, nachgewiesen. Hierfür wurde die RNA aus frisch isolierten humanen Granulozyten mittels der Phenol-Chloroform Methode extrahiert. Die in der Gesamtheit der isolierten RNA enthaltene mRNA wurde unter Verwendung von Oligo-dT-Primern mit der Reversen Transkriptase M-MuLV in cDNA umgeschrieben. Im Anschluss wurde das cDNA-Gemisch mit Hilfe einer qualitativen PCR auf das Vorhandensein von cDNA für Grb7, Grb10 und Grb14 sowie Aktin überprüft. Abb. 3.2.5 Nachweis der mRNA von Grb7/10/14-Familienmitgliedern in humanen Granulozyten, HEK293T und Hela Zellen. Isolation der RNA aus humanen Granulozyten, HEK293T oder Hela Zellen. Anschließend wurde die isolierte RNA mittels reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Das jeweilige cDNA-Gemisch aus Granulozyten (obere Reihe), HEK293T Zellen (zweite Reihe von oben) und Hela Zellen (dritte Reihe von oben) wurde mit spezifischen Primern auf den Gehalt von Grb7-, Grb10- Grb14- oder Aktin-cDNA untersucht. Die Bindefähigkiet der spezifischen Grb7/10/14-Primer wurde mit gekaufter cDNA für Grb7, Grb10 und Grb14 überprüft (untere Reihe). Der Nachweis von Aktin-cDNA diente als Positivkontrolle. Für den qualitativen Nachweis wurden jeweils spezifische Primer für die einzelnen Grb7/10/14-Familienmitglieder verwendet. Die Primer wurden so gewählt, dass sie jeweils in unterschiedlichen Exonen lagen, so dass der Nachweis von translatierbarer mRNA möglich war. Um die Bindefähigkeit der verwendeten Primer zu überprüfen, wurde zusätzlich eine qualitative PCR mit gekauften cDNAs für Grb7, Grb10 und Grb14 durchgeführt (Abb. 3.2.5 untere Reihe). In humanen Granulozyten konnte die mRNA von Grb10 und Grb14 sowie die mRNA des ubiquitär exprimierten Proteins Aktin nachgewiesen werden (Abb. 3.2.5 obere Reihe). Da ein großer Teil der nachfolgenden Interaktions- und Infektionsexperimente auch in HEK293T und HeLa Zellen durchgeführt wurde, wurden auch diese Zellen hinsichtlich ihres mRNA-Gehalts für Grb7, Grb10 und Grb14 untersucht (Abb. 3.2.5). Sowohl HEK293T als auch HeLa Zellen 101 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen wurden positiv auf Grb14-mRNA getestet (Abb. 3.2.5). Im Gegensatz dazu konnte die Transkription der beiden anderen Familienmitglieder, Grb7 und Grb10, weder in HEK293T noch in HeLa Zellen nachgewiesen werden. Die Expression von Grb14 in HEK293T und HeLa Zellen konnte zusätzlich auch durch Western Blot Analysen bestätigt werden. 3.2.2.3 Die Bindung von Opa52-exprimierenden Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung von Grb14 Für CEACAM3 ist bekannt, dass die Bindung von Opa52-exprimierenden Gonokokken an diesen Rezeptor die Phosphorylierung der Tyrosinreste Tyr230 und Tyr241 induziert. In der Folge werden verschiedene Signalproteine über ihre SH2 Domänen an den phoshporylierten Rezeptor rekrutiert. In diesem Zusammenhang sollte untersucht werden, ob die Bindung von Gonokokken an CEACAM3 zur Rekrutierung von Grb14 an diesen Rezeptor führt. Abb. 3.2.6 Sowohl die isolierte SH2 Domäne von Grb14 als auch das komplette Grb14 wird in die Nähe von Gonokokken-gebundenem CEACAM3 rekrutiert. HEK293T Zellen wurden mit einem Plasmid, kodierend für mKate-fusioniertes CEACAM3 und den angegebenen GFP-Fusionsproteinen (Grb14-SH2 oder 102 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Grb14) kotransfiziert. Die Zellen wurden für 30 min mit Pacific Blue-markierten Opa52-exprimierenden N. gonorrhoeae (Ngo Opa52) infiziert, fixiert und mittels Konfokalmikroskopie analysiert. Die Interaktion von CEACAM3 mit Ngo Opa52 induziert die Rekrutierung der Grb14-SH2 Domäne sowie des kompletten Grb14 (Pfeile) in diese Bereiche, bewirkt aber keine Rekrutierung von GFP oder der GFP-Slp76-SH2 Domäne (Pfeilköpfe). Die Maßbalken repräsentieren 20 µm. Hierfür wurden HEK293T Zellen mit CEACAM3-mKate und einem leeren GFPExpressionsvektor, GFP-Slp76-SH2, GFP-Grb14-SH2 oder GFP-Grb14 kotransfiziert. Die Zellen wurden mit Pacific Blue-markierten Opa52 Gonokokken infiziert und mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Die Assoziation der Gonokokken mit CEACAM3-mKate zeigt keine Rekrutierung der Slp76-SH2 Domäne oder GFP an den Rezeptor (Abb. 3.2.6, Pfeilköpfe). Im Gegensatz dazu führt die Bindung der Bakterien an CEACAM3 zu einer lokalen Akkumulation sowohl der Grb14-SH2 Domäne als auch des kompletten Proteins in der Nähe des Rezeptors (Abb. 3.2.6, Pfeile). Dies zeigt, dass Grb14 spezifische an die Stellen der Zelle rekrutiert wird, an denen ein Kontakt zwischen CEACAM3 und Opa52-exprimierenden Gonokokken stattfindet. 3.2.2.4 Grb14 ist ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose Um zu überprüfen, ob Grb14 bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose von Gonokokken eine Rolle spielt, wurden stabil transfizierte, CEACAM3-exprimierende HeLa Zellen (HeLaCEACAM3) verwendet. In Bezug auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEAexprimierenden Gonokokken und der Phosphorylierung der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 verhalten sich diese Zellen wie Granulozyten (Billker et al. 2002; McCaw et al. 2003). In diesen Zellen sollte mittels der short hairpin RNA (shRNA)-Technik die Expression von endogenem Grb14 dauerhaft unterdrückt werden. Für die Reduktion der Genexpression von Grb14 (Grb14 knock down; Grb14-kd) in HeLa-CEACAM3 Zellen wurde ein Lentivirusbasiertes System verwendet. Hierfür wurden Viruspartikel produziert, welche einen lentiviralen Vektor (pLKO.1) enthielten, der die spezifsche shRNA für Grb14 (shRNAGrb14) kodierte. Desweiteren wurden Virenpartikel hergestellt, welche lediglich den leeren Vektor pLKO.1 (Leervektor) enthielten, dieser diente als Kontrolle. Die HeLa-CEACAM3 Zellen wurden mit Virenpartikeln transduziert, die entweder die Grb14 shRNA oder den Leervektor enthielten. Anschließend erfolgte die Selektion der transduzierten Zellen mittels 1,0 µg/ml Puromycin. Die Funktionalität der transduzierten shRNA gegen Grb14 wurde im Western Blot unter Verwendung eines polyklonalen anti-Grb14 Antikörpers analysiert 103 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen (Abb. 3.2.7A). Die Expression der shRNA gegen Grb14 bewirkte eine fast vollständige Unterdrückung der Expression von endogenem Grb14. Im Vergleich dazu zeigten die Zellen, welche mit dem Leervektor transduziert waren, keine Veränderung in der Grb14-Expression. Abb. 3.2.7 Die Unterdrückung der Expression von endogenem Grb14 resultiert in einer erhöhten CEACAM3-vermittelten Phagozytose von Bakterien. (A) Western Blot Analysen der stabil transduzierten HeLa-CEACAM3 Zellen hinsichtlich Grb14 und CEACAM3 Expression mittels polyklonalem anti-Grb14 und monoklonalem anti-CEACAM (CD66 Klon D14HD11) Antikörper. Zur Überprüfung, dass für die Western Blot Analyse gleiche Mengen an Zelllysat verwendet wurden, wurde eine Membran mit monoklonalem anti-Tubulin Antikörper beprobt. (B) Wildtyp HeLa Zellen, HeLa-CEACAM3 Zellen untransduziert oder stabil transduziert mit Leervektor oder shRNA für Grb14, wurden mit CSFE-markierten Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae infiziert (MOI = 20). Nach 60min wurde die Phagozytoserate der Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Hierfür wurde die Fluoreszenz der extrazellulären, adhärierten Bakterien durch Zugabe von Trypanblau gequencht. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen von vier unabhängigen Experimenten. Die HeLa-CEACAM3 Zellen mit unterdrückter Grb14 Expression wurden, nach 60minütiger Infektion mit CSFE-markierten, Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae, hinsichtlich ihres Phagozytoseverhaltens mittels Durchflusszytometrie (FACS-Invasions Assay) untersucht (Abb. 3.2.7B). Als Vergleichsproben dienten HeLa-CEACAM3 Zellen ohne unterdrückte Grb14-Expression. Im Vergleich zu den wildtypischen und den mit Leervektor transduzieren HeLa-CEACAM3 Zellen zeigten Zellen mit unterdrückter Grb14-Expression eine um ca. 30 % erhöhte Phagozytoserate (Abb. 3.2.7B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Grb14 ein Negativregulator der CEACAM3vermittelten Phagozytose ist. Um dies zu bestätigen, müsste die Überexpression von Grb14 einen inhibitorischen Effekt auf die Aufnahme der Bakterien haben. Aus diesem Grund wurden CEACAM3 und Grb14 gemeinsam in HEK293T Zellen koexprimiert und im Anschluß das Phagozytoseverhalten dieser Zellen untersucht. Als Vergleichsprobe dienten HEK293T Zellen, welche lediglich CEACAM3 exprimierten. Nach 60minütiger Infektion mit CSFE-markierten Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae wurde die Anzahl der 104 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen internalisierten Bakterien mittels Durchflusszytometrie (FACS-Invasions Assay) bestimmt. Zellen, die CEACAM3 und Grb14 koexprimieren, zeigten im Vergleich zu den Zellen, welche lediglich CEACAM3 exprimierten eine um 30 % reduzierte Phagozytoserate (Abb. 3.2.8A). Abb. 3.2.8 Die Überexpression von Grb14 hat inhibierenden Einfluss auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien. (A) In HEK293T Zellen wurden Cerulean und mKate, CEACAM3-Cerulean und mKate oder CEACAM3-Cerulean und mKate-Grb14 koeexprimiert. Jeweils gleiche Zellzahlen wurden mit CSFE-markierten Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae infiziert (MOI = 20). Nach einer Infektionszeit von 60min wurden die Phagozytoseraten der Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Hierfür wurde die Fluoreszenz der extrazellulären, adhärierten Bakterien durch Zugabe von Trypanblau gequencht. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten. (B) Ein Teil der in (A) verwendeten Zellen wurde lysiert und mittels Western Blot Analyse hinsichtlich gleichmäßiger Expression von Cerulean bzw. CEACAM3-Cerulean sowie mKate bzw. mKateGrb14 überprüft. Hierzu wurden monoklonaler anti-GFP Primärantikörper (Nachweis von Cerulean) und polyklonaler anti-mKate Primärantikörper (Nachweis von mKate) verwendet. Zur Überprüfung, dass für die Western Blot Analyse gleiche Mengen an Zelllysat verwendet wurden, wurde eine Membran mit monoklonalem anti-Tubulin Antikörper beprobt. (C) Ein Teil der in (A) verwendeten Zellen blieb uninfiziert und wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von monoklonalem anti-CEACAM (CD66acde Klon IH4Fc) Primärantikörper und Cy2-markierten Sekundärantikörper auf die Lokalisation von CEACAM3 auf der Zelloberfläche überprüft. Repräsentative Darstellung einer durchflusszytometrischen Messung. Zwei weitere Messungen erzielten gleichwertige Ergebnisse. Dass Unterschied in der Phagozytoserate nicht auf eine ungleichmäßige CEACAM3Expression oder -Lokalisation auf der Zelloberfläche zurückzuführen ist, ist aus Abbildung 3.2.8B und C zu erkennen. In beiden Zellpopulationen wurde CEACAM3 in 105 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen gleichen Mengen exprimiert (Abb. 3.2.8B) und konnte in gleichem Maße auf der Zelloberfläche beider Populationen nachgewiesen werden (Abb. 3.2.8C). Dieses Ergebnis des FACS-Invasions Assays stützt die zuvor aufgestellte These, dass Grb14 ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose ist. 3.2.3 Diskussion Im Zuge der Etablierung des SH2 Domänen Arrays konnte die bisher unbekannte phosphorylierungsabhängige Interaktion zwischen dem humanen phagozytischen Rezeptor CEACAM3 und dem SH2 Domänen tragenden Signalprotein Grb14 identifiziert werden. Die Funktionsweise von CEACAM3 zur effektiven Eliminierung von humanen Pathogenen beruht auf den signalgebenden Prozessen der Tyrosinphosphorylierung von Proteinen. Der Rezeptor selbst wird, durch die initiale Bindung von Pathogenen, von Mitgliedern der SrcKinasenfamilie tyrosinphosphoryliert. Diese Phosphotyrosine dienen als Bindemotive für die SH2 Domänen von nachgeschalteten Effektorproteinen. So konnten bisher für den Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav und die Phosphatidylinositol-3’-Kinase Klasse I eine direkte Bindung an tyrosinphosphoryliertes CEACAM3 nachgewiesen werden. Auch die Mitglieder der Grb7/10/14-Familie sind bekannt für ihre direkte Interaktion mit tyrosinphosphorylierten Rezeptoren. Ursprünglich wurden alle Mitglieder dieser Familie durch ihre Bindung an autophosphorylierte epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFRs) entdeckt. Kurze Zeit später wurden weitere, SH2 Domänen-abhängige Interaktionen dieser Proteine mit tyrosinphosphorylierten Rezeptoren und Proteintyrosinkinasen identifiziert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass nach Stimulation der Rezeptoren durch externe Liganden die Grb7/10/14-Familienmitglieder an die aktivierten Rezeptoren binden. In der vorliegenden Arbeit konnte auch für den tyrosinphosphorylierten phagozytischen Rezeptor CEACAM3, unter Verwendung des SH2 Domänen Arrays, die Interaktion mit der SH2 Domäne von Grb14 nachgewiesen werden. Diese Interaktion konnte mittels eines pulldown Experimentes sowie einer Koimmunpräzipitation verifiziert und durch einen semisynthetischen Versuchsaufbau auf das phosphorylierte Tyr230 eingegrenzt werden. Des Weiteren konnte durch das pull-down Experiment gezeigt werden, dass die SH2 Domäne von Grb14 eine höhere Affinität für phosphoryliertes CEACM3 aufweist, als die SH2 Domänen von Grb7 und Grb10. Um diese Ergebnisse zu untermauern und näher zu beleuchten, wäre es interessant, auch tyrosinmutierte Varianten von CEACAM3 auf Interaktion mit Grb7, Grb10 106 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen und Grb14 zu untersuchen. Hierzu könnten sowohl die isolierten SH2 Domänen als auch die vollständigen Proteine für pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitationen herangezogen werden. Neben diesen biochemischen Untersuchungen konnten auch erste Hinweise auf die Assoziation von CEACAM3 und Grb14 während des Infektionsprozesses festgestellt werden. Konfokalmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass Grb14 innerhalb der Zelle spezifisch an die Stellen rekrutiert wird, an denen CEACAM3 mit Opa52exprimierenden Gonokokken interagiert. Da dieser Effekt auch bereits für andere Signalproteine, die bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose und Abtötung von Bakterien eine Rolle spielen, festgestellt wurde (Schmitter et al. 2007a; Buntru et al. 2011), liegt die Vermutung nahe, dass Grb14 durch direkte Interaktion mit dem Rezeptor am CEACAM3vermittelten Phagozytoseprozess beteiligt ist. In diesem Zusammenhang stellen FluoreszenzResonanzenergietransfers (FRET)-basierte Interaktionsstudien eine gute Möglichkeit dar, um eine direkte Interaktion beider Proteine während des Infektionsprozesses zu untersuchen. Als ein wichtiger Punkt hinsichtlich einer möglichen physiologischen Relevanz der Interaktion zwischen CEACAM3 und Grb14 konnte die Expression von Grb14 in humanen Granulozyten auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang sind allerdings weitere Untersuchungsschritte wünschenswert, anhand derer die Expression auch auf Proteinebene nachgewiesen werden kann. Die Untersuchung der Phagozytoserate von CEACAM3-HeLa Zellen mit unterdrückter Grb14 Expression zeigte eine um 30 % erhöhte Aufnahme von Bakterien. Dieses Ergebnis lässt eine negativ regulierende Rolle von Grb14 bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose vermuten. Gestützt wird diese Vermutung durch die Tatsache, dass die Überexpression von Grb14 einen inhibierenden Effekt auf die Aufnahme von Bakterien hatte. Da Grb14 als Negativregulator für verschiedene rezeptorvermittelte Signalprozesse bekannt ist, scheint solch ein negativ regulierender Einfluss von Grb14 auch für den CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess denkbar. In den letzten Jahren wurden intensive Studien betrieben, anhand derer ein umfassendes Bild über die Rolle von Grb14 in rezeptorvermittelten Signalwegen gewonnen werden konnte. Für den Insulinrezeptor (IR) wurde gezeigt, dass Grb14 phosphorylierungsabhängig an den aktivierten Rezeptor rekrutiert wird und in der Folge durch Inhibierung der IR-Kinaseaktivität verschiedene Signalprozesse reguliert. In diesem Zusammenhang zeigten strukturelle und funktionelle Studien, dass Grb14 über seine SH2 Domäne direkt an die tyrosinphosphorylierte Aktivierungsschleife der IR-Kinasedomäne bindet (Depetris et al. 2005). Weiterhin konnte 107 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen gezeigt werden, dass Grb14 über seine RA Domäne mit der aktivierten GTPase Ras assoziiert und dass die PH Domäne an Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PI(3,4,5)P3) bindet. Untersuchungen zur Rekrutierung von Grb14 an die Zellmembran zeigten, dass dieser Prozess unabhängig von der Aktivität der PI3K ist (Depetris et al. 2009). Durch Bestimmung der Dissoziationskonstanten für die PH und RA Domäne konnten Depetris et al. zeigen, dass Grb14 eine sehr viel höhere Affinität für aktiviertes Ras als für PI(3,4,5)P3 hat (Depetris et al. 2009). Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass die RA Domäne die Rekrutierung von Grb14 an die Zellmembran in die Nähe des Rezeptors vermittelt und in der Folge die Bindung an den Rezeptor durch die Grb14-SH2 Domäne möglich wird. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Grb14-SH2 Domäne direkt an tyrosinphosphoryliertes CEACAM3 bindet. Bisherige Untersuchungen zur CEACAM3vermittelten Phagozytose zeigten, dass die Aktivität der PI3K für den Aufnahmeprozess keine Rolle spielt (Kapitel 3.1, und (Buntru et al. 2011)) und dass es während der Phagozytose zur verstärkten Aktivierung der kleinen GTPase Rac kommt (Hauck et al. 1998; Schmitter et al. 2004). Im Hinblick auf die Interaktion von Grb14 mit CEACAM3 wäre es in diesem Zusammenhang auch sehr interessant, zu überprüfen, ob die die Grb14-RA Domäne auch mit aktiviertem Rac interagieren kann und somit an der Translokation von Grb14 in die Nähe von CEACAM3 beteiligt ist. Dies könnte beispielsweise auf der Basis von Koimmunpräzipitationen oder pull-down Experimenten unter Verwendung von konstitutiv aktiviertem Rac analysiert werden. Der negativ regulierende Effekt von Grb14 auf die Insulin-induzierten Signalprozesse wird der Grb14-BPS Domäne zu geschrieben. Es ist bekannt, dass die BPS Domäne als Pseudosubstrat in die Kinasedomäne des Insulinrezeptors bindet und somit die Phosphorylierung nachgeschalteter Effektorproteine verhindert, wodurch die Insulininduzierte Signalweiterleitung beendet wird (Stein et al. 2001; Bereziat et al. 2002). Ein ähnlicher Effekt der Signalregulierung durch die BPS Domäne wäre auch für CEACAM3 denkbar. Zwar besitzt CEACAM3 keine eigene Kinasedomäne, jedoch wird es, als Folge der Bindung von Bakterien, durch membranassoziierte PTKs der Src-Familie phosphoryliert, wodurch der Phagozytoseprozess in Gang gesetzt wird. Es ist somit denkbar, dass die Bindung von Grb14 an phosphoryliertes CEACAM3 einen negativ regulierenden Einfluss auf die Aktivität der rezeptorassoziierten Src-Kinasen und somit auch auf den Phagozytoseprozess hat. Die erhöhte Phagozytoserate bei unterdrückter Grb14 Expression sowie die reduzierte Phagozytoserate bei verstärkter Grb14-Expression könnten erste 108 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Hinweise in diese Richtung sein. Die hierfür notwendige Interaktion der Grb14-BPS Domäne mit der Kinasedomäne von Src-Kinasen könnte durch Präzipitationsexperimente mit der isolierten BPS Domäne untersucht werden. Desweiteren ist es interessant, zu überprüfen, ob Zellen mit unterdrückter Grb14-Expression während des Infektionsprozesses eine erhöhte Tyrosinphosphorylierung von CEACAM3 aufweisen. Dies könnte durch eine CEACAM3-spezifische Immunpräzipitation mit anschließender Western Blot Anlyse unter Verwendung eines anti-Phosphotyrosin Antikörpers analysiert werden. Davon ausgehend, dass für die Inhibierung der rezeptorassoziierten Src-Kinasen Grb14 direkt über seine SH2 Domäne an CEACAM3 binden muss, sollte die Deletion dieser Domäne den gleichen Effekt auf die Phagozytose haben wie die Unterdrückung der Expression des vollständigen Proteins. Auch in diesem Fall sollte eine erhöhte Phagozytoserate die Folge sein. In Bezug auf die Notwendigkeit einer Negativregulierung des CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozesses kann in diesem Zusammenhang nur spekuliert werden. So ist es beispielsweise denkbar, dass ein Gleichgewicht hergestellt werden muss zwischen der Anzahl an internalisierten Bakterien und der enzymatischen Kapazität der NADPH-Oxidase. Zur Überprüfung dieser Theorie könnten Bakterien-Degradations Assays durchgeführt werden, welche den Abbau von Bakterien durch Granulozyten nachweisen. In diesem Fall sollten phagozytierte Bakterien in Zellen mit unterdrückter Grb14-Expression eine erhöhte Überlebensrate haben gegenüber Zellen mit normaler Grb14-Expression. Da sich humane Granulozyten schwer bis gar nicht genetisch manipulieren lassen, ist diese Untersuchung in diesem Zelltyp nicht durchführbar. Jedoch könnten sich Granulozyten, die kein Grb14 mehr aber humanes CEACAM3 exprimieren, im Mausmodell herstellen lassen. Die hierfür nötigen Mäuse könnten durch Kreuzung von Grb14-/- Mäusen mit CEACAM3-transgenen Mäusen generiert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse bestätigen die mittels SH2 Domänen Array gefundene Interaktion zwischen Grb14 und CEACAM3. Es konnte gezeigt werden, dass das Signalprotein Grb14 phosphorylierungsabhängig mit dem phagozytischen Rezeptor CEACAM3 interagiert und dass diese Interaktion direkter Natur ist. In Bezug auf die physiologische Relevanz dieser Interaktion gibt es erste Anhaltspunkte, dass Grb14 einen negativ regulierenden Einfluss auf den CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess hat. Jedoch sind diesbezüglich weitere Untersuchungen notwendig, um diese Theorie eingehender zu analysieren. 109 3 3.3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Identifikation Phosphotyrosin-abhängiger Interaktionspartner für den zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 3.3.1 Einleitung Das ausschließlich auf Granulozyten exprimierte Transmembranprotein CEACAM4 wurde erstmalig im Jahr 1991 beschrieben (Kuroki et al. 1991). Es ist in seinem strukturellen Aufbau dem ebenfalls auf Granulozyten exprimierten CEACAM3 sehr ähnlich. Wie bereits, in den Kapiteln der Einleitung (Kapitel 1.3), beschrieben, ist CEACAM4 nicht fähig, OpaCEAexprimierende Bakterien zu binden. Bis heute konnte für dieses Protein noch kein Ligand identifiziert werden. Im Gegensatz dazu ist CEACAM3 ein Rezeptor für OpaCEAexprimierende Bakterien und ein Paradebeispiel für die Anpassungsfähigkeit des menschlichen Körpers zur effizienten Eliminierung pathogener Bakterien. Sowohl strukturelle Untersuchungen als auch Sequenzanalysen und Genlociuntersuchungen lassen darauf schließen, dass CEACAM3 eine natürliche Chimäre aus CEACAM4 und einem anderen OpaCEA-bindenden CEACAM (z. B. CEACAM1, CEACAM5 oder CEACAM6) ist (Pils et al. 2008). Die N-terminalen Igv-ähnlichen Domänen von CEACAM3 und CEACAM4 weisen lediglich eine 49%ige Aminosäuresequenzidentität auf. Betrachtet man allerdings die Aminosäureabfolge des C-terminal gelegenen zytoplasmatischen Abschnittes, so lässt sich eine Sequenzidentität von 73 % erkennen (Pils et al. 2008). Genau wie CEACAM3 besitzt auch CEACAM4 in seinem zytoplasmatischen Abschnitt phosphorylierbare Tyrosinreste. Allerdings sind die Aminosäureabfolgen, in welche diese Tyrosinreste eingebettet sind, für CEACAM3 und CEACAM4 nicht zu 100 % identisch. Das Sequenzmotiv von CEACAM4 (TPIYEELLYSDANIYCQI) entspricht der ITAM Konsensussequenz (YxxL/Ix6-8YxxL/I), während das von CEACAM3 (ASIYEELLKHDTNIYCRM) lediglich ITAM-ähnlich ist (vgl. Abb. 1.3.2). Die Phosphorylierung der Tyrosine in CEACAM3 wird durch die Bindung von Opa52-exprimierenden Bakterien induziert und erfolgt, wie bei den ITAM-tragenden Immunrezeptoren, durch Kinasen der Src-Familie. Bisher unveröffentlichte Infektionsexperimente aus unserem Labor zeigen, dass auch der zytoplasmatische Abschnitt von CEACAM4 tyrosinphosphoryliert werden kann. Da bis jetzt noch kein Ligand für CEACAM4 bekannt ist, wurde für diese Experimente eine Chimäre aus CEACAM3 und CEACAM4 (CEACAM3/4) verwendet. Diese Chimäre setzt sich aus der Igvähnlichen Domäne von CEACAM3 und 110 der Transmembrandomäne und dem 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 zusammen. Durch die Igv-ähnliche Domäne von CEACAM3 ist die CEACAM3/4 Chimäre in der Lage, Opa52-exprimierende Neisserien zu binden. Durch Infektionsexperimente mit HEK293T Zellen, die diese Chimäre transient exprimierten, konnten wir zeigen, dass diese Zellen Opa52-exprimierende Neisserien phagozytieren und das CEACAM3/4 während des Infektionsprozesses deutlich tyrosinphosphoryliert wird. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass die Internalisierung der Neisserien von der Intaktheit der ITAM-Sequenz im zytoplasmatischen Abschnitt abhängig ist. Wurden die Tyrosine des ITAMs gegen Phenylalanin ausgetauscht, betrug die Phagozytoserate, im Vergleich zur intakten Chimäre, nur noch ca. 30 %. Die bereits beschriebene Verwandtschaft zu CEACAM3 und insbesondere die Ähnlichkeit des zytoplasmatischen Abschnittes, welcher bei CEACAM3 von essentieller Bedeutung für den Phagozytoseprozess ist, lässt eine gleichartige Funktion von CEACAM4 vermuten. In diesem Zusammenhang ist es sehr interessant, herauszufinden, welche zellulären SH2Proteine mit den phosphorylierten Tyrosinen des ITAMs von CEACAM4 interagieren können. Gerade im Hinblick auf die bereits beschriebene Verwandtschaft zu CEACAM3 ist es sehr interessant, zu untersuchen, ob die für CEACAM3 bekannten SH2 DomänenInteraktionspartner auch mit den phosphorylierten Tyrosinen von CEACAM4 interagieren können. In der vorliegenden Arbeit konnten unter Verwendung des in Kapitel 2 etablierten SH2 Domänen Arrays mehrere, bereits für CEACAM3 bekannte Interaktionspartner für CEACAM4 identifiziert und verifiziert werden. Neben der direkten Bindung an die phosphorylierten Tyrosine der ITAM-Sequenz von CEACAM4 deuten erste Untersuchungen darauf hin, dass diese Proteine auch am Phagozytoseprozess beteiligt sind. 3.3.2 Ergebnisse 3.3.2.1 Identifikation von Interaktionspartnern für CEACAM4 mittels SH2 Domänen Array Da für tyrosinphosphoryliertes CEACAM4 bisher keine Interaktionspartner bekannt sind, bietet der in Kapitel 2 etablierte SH2 Domänen Array eine sehr gute Möglichkeit, in einem zeitlich sehr schnellen und methodisch unkomplizierten Versuchsaufbau mehrere SH2 111 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Domänen unterschiedlicher Signalproteine auf eine mögliche Interaktion mit phosphoryliertem CEACAM4 zu untersuchen. Ein SH2 Domänen Array bestand aus 14 verschiedenen rekombinanten GST-SH2 Domänen, die jeweils in vierfacher Ausführung auf einem aldehydbeschichteten Objektträger immobilisiert wurden. Abb. 3.3.1 CEACAM4 interagiert phosphorylierungsabhängig mit den SH2 Domänen von Nck2, Hck, Yes, Lck und der N-terminalen SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K – identifiziert mittels SH2 Domänen Array. (A) Verschiedene GST-SH2 Domänen (siehe Tabelle) wurden mit einer Konzentration von 1,3ng/spot auf einer Aldehydoberfläche immobilisiert. Ein Array umfasste 14 verschiedene GST-SH2 und GST allein in vierfacher Ausführung. Als interner Standard wurden pro Array 0,9ng/spot eines polyklonalen anti-GST Antikörpers, in zweifacher Ausführung, immobilisiert. Die erfolgreiche Immobilisierung der GST-Proteine wurde mittels monoklonalem anti-GST Primärantikörper, gefolgt von einem Cy3-markierten Sekundärantikörper, überprüft. (B) Repräsentative Abbildung von zwei mit Ganzzelllysaten beprobten SH2 Domänen Arrays (vgl. (A)). Ein Array war inkubiert mit CEACAM4-GFP enthaltenden HEK293T-Ganzzelllysaten (oberer Bildteil). Für die Inkubation des zweiten Arrays wurden Ganzzelllysate von HEK293T Zellen verwendet, in denen CEACAM4-GFP und v-Src koexprimiert waren. Für die Detektion von gebundenem CEACAM4-GFP wurde ein polyklonaler anti-GFP Primärantikörper verwendet, gefolgt von einem Cy3-markierten Sekundärantikörper. Der Cy3-markierte Sekundärantikörper detektierte auch den immobilisierten polyklonalen anti-GST Antikörper, wodurch der interne Standard visualisiert, quantifiziert und zur Berechnung der relativen Nettobindungssignale verwendet werden konnte. (C) Grafische Darstellung der unter (B) detektierten Bindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Vierfachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten. 112 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Pro Array wurde zusätzlich eine definierte Menge (0,9ng/spot) eines polyklonalen anti-GST Antikörpers, in zweifacher Ausführung, immobilisiert. Diese Spots dienten als interner Standard und ermöglichten es, die Fluoreszenzsignale mehrerer verschiedener Arrays nach der Beprobung mit Lysaten miteinander zu vergleichen. Die Immobilisierung der GST-SH2 Domänen wurde mittels monoklonalem anti-GST-Primärantikörper, gefolgt von Cy3gekoppeltem Sekundärantikörper nachgewiesen (Abb. 3.3.1A). Zur Beprobung der Arrays wurden verschiedene Ganzzelllysate verwendet. Hierfür wurde CEACAM4-GFP in An- oder Abwesenheit von v-Src in HEK293T Zellen exprimiert und diese anschließend lysiert. Ein Array wurde mit dem phosphorylierten CEACAM4-GFP Lysat beprobt und ein weiterer als Negativkontrolle mit dem unphosphorylierten CEACAM4-GFP Lysat. Nach drei Waschschritten mit PBS-T wurde der an die SH2 Domänen gebundene Rezeptor mittels polyklonalem anti-GFP Primärantikörper, gefolgt von Cy3-gekoppeltem Sekundärantikörper, nachgewiesen. Wie erwartet assoziierte unphosphoryliertes CEACAM4 mit keiner der SH2 Domänen (Abb. 3.3.1B). Im Gegensatz dazu war eine phosphorylierungsabhängige Interaktion von CEACAM4 mit fünf verschiedenen SH2 Domänen zu erkennen. Die relativen Signale der Interaktion von phosphoryliertem CEACAM4 mit den verschiedenen SH2 Domänen sind in Abbildung 3.3.1C grafisch dargestellt. CEACAM4 assoziierte phosphorylierungsabhäng mit den SH2 Domänen von Nck2, Hck, Yes, Lck und der N-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3. Beim Vergleich der einzelnen Signalintensitäten ist erkennbar, dass CEACAM4 deutlich stärker mit der SH2 Domäne von Yes assoziierte als mit den SH2 Domänen der beiden anderen Src-Kinasen Hck und Lck. Auch für die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K (PI3KR3) ist eine deutliche, phosphorylierungsabhängige Assoziation mit CEACAM4 zu erkennen. Für die C-terminal gelegene SH2 Domäne der PI3KR3 konnte im Array keine Interaktion mit CEACAM4 nachgewiesen werden. Vergleicht man die gemessenen Signalintensitäten der Assoziation von phosphoryliertem CEACAM4 mit den SH2 Domänen der Adapterproteine Nck2 und Grb2, ist für die Interaktion mit der GST-Nck2-SH2 Domäne das stärkste Signal zu erkennen. Die Ergebnisse dieser SH2 Domänen Arrays lassen eindeutig darauf schließen, dass CEACAM4 phosphorylierungsabhängig mit den SH2 Domänen verschiedener Signalproteine interagieren kann. 113 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen 3.3.2.2 Verifikation und Konkretisierung der mittels SH2 Domänen Array identifizierten Interaktionen für CEACAM4 Um die im vorangegangenen Kapitel identifizierten phosphorylierungsabhängigen Interaktionen von CEACAM4 mit den verschiedenen SH2 Domänen zu bestätigen, wurden die GST-fusionierten SH2 Domänen auch für pull-down Experimente verwendet. Der Unterschied zwischen dem SH2 Domänen Array und einem pull-down Experiment besteht darin, dass bei den Arrays die GST-SH2 Domänen auf sehr engem Raum fest an eine Oberfläche gebunden sind. Im Gegensatz dazu sind die SH2 Domänen im pull-down Ansatz frei beweglich, wodurch für ihre Interaktionspartner mehr Platz zur Verfügung steht. Für die in den pull-down Experimenten verwendeten Ganzzelllysate wurden HEK293T Zellen mit einem v-Src-kodierenden Plasmid und einem Kontrollplasmid (GFP) oder einem CEACAM4-GFP-kodierenden Plasmid kotransfiziert und nach 48 Stunden lysiert. Die Lysate wurden auf den Gehalt gleicher Mengen von GFP und CEACAM4-GFP sowie auf Tyrosinphosphorylierung von CEACAM4-GFP mittels Western-Blot überprüft (Abb 3.3.2A). Mit den GST-fusionierten SH2 Domänen von Hck, PI3KR3-N und -C, Grb14, Lck, Slp76, Nck1, Nck2 und Yes wurden pull-down Experimente mit CEACAM4-enthaltenden Ganzzelllysaten durchgeführt (Abb. 3.3.2B, 3.3.2C und 3.3.2D). Da die verschiedenen Ansätze nicht alle auf ein SDS-Gel geladen werden konnten, wurde zum besseren Vergleich auf jedem Gel ein pull-down Ansatz der GST-Hck-SH2 Domäne aufgetragen. Ansätze, in welchen phosphoryliertes CEACAM4 mit GST inkubiert wurde, dienten als Negativkontrolle, um eine Interaktion von phosphoryliertem CEACAM4 mit dem GST-Protein auszuschließen. Als weitere Negativkontrolle diente der Versuchsansatz, bei dem die GST-Hck-SH2 Domäne mit Ganzzelllysaten, welche GFP und v-Src enthielten, inkubiert wurde. Durch diese Kontrolle wurde ausgeschlossen, dass GFP phosphorylierungsabhängig mit der SH2 Domäne interagiert. Der in Abbildung 3.3.2B dargestellte pull-down Ansatz bestätigt die Ergebnisse des SH2 Domänen Arrays für die SH2 Domänen von Hck und PI3KR3. Sowohl die GSTHck-SH2 Domäne als auch die GST-PI3KR3-N-SH2 Domäne präzipitierten CEACAM4 phosphorylierungsabhängig. Verglichen mit dem Versuchsaufbau des SH2 Domänen Arrays, zeigte die C-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 im pull-down eine leicht erhöhte Assoziation mit CEACAM4. Dieser Unterschied lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass die PI3KR3-C-SH2 Domäne nur eine sehr geringe Affinität für phosphoryliertes CEACAM4 hat und somit die sehr geringe Interaktion zwischen beiden Proteinen in dem 114 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen räumlich sehr eng begrenzten SH2 Domänen Array nicht mehr detektierbar war. Ebenso wie die SH2 Domänen von Hck und PI3KR3 kann auch die SH2 Domäne der Src-Kinase Lck CEACAM4 phosphorylierungsabhängig präzipitieren (Abb. 3.3.2C). Vergleicht man die Signalintensitäten der Ansätze mit GST-Hck-SH2 und GST-Lck-SH2 Domäne, scheint es, dass CEACAM4 durch die Hck-SH2 Domäne in höherem Maß aus dem Lysat herausgezogen wird als durch die Lck-SH2 Domäne. Abb. 3.3.2 Die SH2 Domänen von Hck, Lck, Yes, Nck2 und PI3KR3 assozzieren mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM4. (A) HEK293T Zellen wurden mit einem leeren Kontrollvektor (GFP) oder GFP-fusioniertem CEACAM4 in An- oder Abwesenheit eines v-Src kodierenden Plasmids kotransfiziert und nach 2 Tagen lysiert. Die Ganzzelllysate wurden, mittels Western Blot Analyse hinsichtlich Tyrosinphosphorylierung und gleichmäßiger Expression der CEACAM4 überprüft. (B), (C) und (D) Die Ganzzelllysate wurden für ein pull-down Experiment mit den angegebenen GST-SH2 Domänen oder GST allein verwendet. Präzipitiertes CEACAM4 wurden mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper (obere Reihe) nachgewiesen. Die Verwendung von gleichen Mengen an GST-Fusionsproteinen oder GST allein wurde durch Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft. Betrachtet man allerdings die Mengen an GST-SH2 Domäne (Abb. 3.3.2C CoomassieFärbung), ist zu erkennen, dass die eingesetzte Menge GST-Lck-SH2 Domäne im Vergleich zur GST-Hck-SH2 Domäne deutlich geringer war. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache kann davon ausgegangen werden, dass die Lck-SH2 Domäne CEACAM4 stärker bzw. in gleichem Maße wie die Hck-SH2 Domäne präzipitiert. Im Gegensatz dazu sind die SH2 Domänen von Grb14 und Slp76 nicht fähig, CEACAM4 zu präzipitieren (Abb. 3.3.2C). Die 115 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen in Abbildung 3.3.2D gezeigten pull-down Ergebnisse für die GST-SH2 Domänen von Nck1, Nck2 und Yes zeigen, dass sowohl die Yes-SH2 Domäne als auch die Nck2-SH2 Domäne in der Lage war, CEACAM4 phosphorylierungsabhängig zu präzipitieren. Die SH2 Domäne von Nck1 war nur in sehr geringem Maß fähig, CEACAM4 aus dem Lysat herauszuziehen. Vergleicht man die Mengen an präzipitiertem Protein, ist deutlich erkennbar, dass die SH2 Domäne der Src-Kinase Yes wesentlich weniger CEACAM4 aus dem Lysat präzipitierte als die SH2 Domäne der Src-Kinase Hck. Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu den Ergebnissen des SH2 Domänen Arrays. Das Signal der Assoziation zwischen der Yes-SH2 Domäne und phosphoryliertem CEACAM4 war bei der Analyse mittels SH2 Domänen Array sechsmal stärker, verglichen mit dem Signal der Interaktion von phosphoryliertem CEACAM4 und der Hck-SH2 Domäne. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse der pull-down Experimente die bereits im SH2 Domänen Array identifizierten, phosphorylierungsabhängigen Interaktionen der SH2 Domänen von Hck, Yes, Lck, Nck2 und PI3KR3-N mit CEACAM4. Allerdings kann die SH2 Domänen vermittelte Bindung von Proteinen in Ganzzelllysaten auch durch indirekte Protein-Protein Interaktionen hervorgerufen werden. In diesem Zusammenhang war es wichtig zu untersuchen, ob die einzelnen SH2 Domänen direkt an die tyrosinphosphorylierte ITAM-Sequenz von CEACAM4 binden können und diese Interaktion somit unabhängig von anderen zellulären Komponenten ist. Um dies zu überprüfen, wurden, parallel zu den pull-down Experimenten, einige SH2 Domänen in einem semi-synthetischen Versuchsaufbau untersucht. Für diese direkte Interaktionsanalyse wurden die SH2 Domänen ausgewählt, welche durch die Ergebnisse des SH2 Domänen Arrays am interessantesten erschienen – die Src-Kinase Yes, die Lipidkinase PI3K und das Adapterprotein Nck2. Um die SH2 Domänen dieser Proteine auf eine direkte Interaktion mit den phosphorylierbaren Tyrosinresten der ITAM-Sequenz von CEACAM4 zu untersuchen, wurden 15 Aminosäuren lange Peptide als individuelle Punkte auf einer Zellulosemembran synthetisiert (Frank 1992). Jedes Peptid enthielt jeweils einen der beiden Tyrosinreste der ITAM-Sequenz von CEACAM4 und wurde sowohl in unphosphorylierter (Y) als auch in phosphorylierter (pY) Form synthetisiert (Abb. 3.3.3). Als erster Schritt wurden alle freien Proteinbindestellen der Zellulosemembran zunächst mit einer Casein-haltigen Lösung abgesättigt. Anschließend wurde je eine Membran mit den rekombinanten GST-fusionierten SH2 Domänen von Yes, Nck2, der N- oder C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 inkubiert. Als Negativkontrolle wurde eine Membran mit GST inkubiert, um Interaktionen von GST mit den Peptiden 116 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen auszuschließen. Die an die Peptide gebundenen GST-SH2 Fusionsproteine wurden mit einem anti-GST Primärantikörper und einem Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper nachgewiesen. Abb. 3.3.3 Die SH2 Domänen der p55 Untereinheit der Phosphatidylinositol-3’Kinase (PI3KR3), Nck2 und Yes binden direkt an beide phosphorylierten Tyrosinreste der ITAM-Sequenz von CEACAM4. Membranen, auf denen phosphorylierte (pY) und unphosphorylierte (Y) synthetische Peptide der ITAM- Sequenz von CEACAM4 immobilisiert waren, wurden mit der GST-fusionieren SH2 Domäne von Nck2, Yes, der N- oder C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 oder GST allein inkubiert. Die gebundenen GST-Fusionsproteine wurden mittels monoklonalem anti-GST Antikörper detektiert. Für das Kontrollprotein (GST) konnte keine Bindung an eines der Peptide detektiert werden (Abb. 3.3.3). Ebenso konnte auch keine Interaktion der getesteten SH2 Domänen mit den unphosphorylierten Tyrosinresten nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu banden alle getesten SH2 Domänen phosphorylierungsabhängig sowohl an den Tyrosinrest Tyr222 (pTyr222) als auch an Tyr233 (pTyr233) der ITAM-Sequenz von CEACAM4. Jedoch zeigten alle SH2 Domänen eine stärkere Bindung an pTyr222 als an pTyr233. Ebenso interagierten auch beide SH2 Domänen der PI3KR3 direkt mit beiden phosphorylierten Tyrosinresten. Allerdings interagierten die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 wesentlich stärker mit dem pTyr222 als die C-terminale SH2 Domäne. Dieses Ergebnis bestätigte das pull-down Experiment, welches ebenfalls eine stärkere Assoziation von CEACAM4 mit der PI3KR3-NSH2 Domäne zeigte. Auch für die SH2 Domänen von Nck2 und Yes konnte eine direkte Bindung an die beiden phosphorylierten Tyrosinereste (pTyr222 und pTyr233) nachgewiesen werden. Auch in diesem Fall interagierte die Nck2-SH2 Domäne wesentlich schwächer mit dem pTyr233 als mit dem pTyr222. Lediglich die SH2 Domäne der Src Kinase Yes interagierte mit gleicher Affinität mit beiden phosphorylierten Tyrosinresten. Insgesamt demonstrieren diese Ergebnisse, dass die SH2 Domänen von Yes, Nck2 und der PI3KR3 direkt mit den phosphorylierten Tyrosinresten der ITAM-Sequenz im zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 interagieren können. Dabei sind die Affinitäten der SH2 Domäne von Nck2 sowie der N- und C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 für Tyr222 höher als für Tyr233. Im Gegensatz dazu bindet die SH2 Domäne von Yes mit annähernd gleicher Affinität sowohl an Tyr222 als auch an Tyr233. 117 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen 3.3.2.3 Die Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne kolokalisiert mit Bakterien-assoziierter CEACAM3/4-Chimäre Die bisherigen in vitro Experimente zeigten, dass die SH2 Domänen von Yes, Nck2 und die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 direkt mit dem phosphorylierten zytoplasmatischen Abschitt von CEACAM4 interagieren können. Wie bereits in Kapitel 3.3.1 beschrieben, zeigten Infektionsexperimente mit einer CEACAM3/4-Chimäre eine Phosphotyrosinabhängige Phagozytose von Opa52-exprimierenden Gonokokken. In diesem Zusammenhang war es von Interesse, die Beteiligung dieser SH2 Domänen am CEACAM3/4-vermittelten Phagozytoseprozess zu untersuchen. In einem ersten Schritt sollte die Frage geklärt werden, ob die SH2 Domänen von Yes, Nck2 und PI3KR3-N in intakten Zellen während der Infektion mit Opa52-exprimierenden Bakterien in die Nähe der CEACAM3/4-Chimäre rekrutiert werden. Hierfür wurde die GFP-fusionierte CEACAM3/4-Chimäre (CEACAM3/4-GFP) zusammen mit der jeweils zu untersuchenden SH2 Domäne in HEK293T Zellen koexprimiert. Die SH2 Domänen wurden als mKateFusionsproteine (mKate-SH2) exprimiert. Als Negativkontrolle diente ein Ansatz, in welchem CEACAM3/4-GFP zusammen mit dem leeren mKate-Vektor exprimiert wurde. Durch diese Kontrolle sollte eine unspezifische Interaktion von mKate mit CEACAM3/4-GFP ausgeschlossen werden. Ein weiterer Ansatz umfasste die Koexpression von CEACAM3/4-GFP und der mKate-fusionierten SH2 Domäne des Adapterproteins Slp76. Die Slp76-SH2 Domäne hatte zuvor weder im SH2 Domänen Array noch im pull-down Experiment eine Assoziation mit CEACAM4 gezeigt und wurde, wie in den entsprechenden Untersuchungen von CEACAM3, als Negativkontrolle herangezogen. Die Zellen wurden für 45 min mit Opa52-exprimierenden Gonokokken infiziert, fixiert und mittels Konfokalmikroskopie analysiert. Dabei war eine deutlich Rekrutierung von CEACAM3/4-GFP an die Abschnitte der Zellmembran zu erkennen, an welchen die CEACAM-bindenden Gonokokken mit der Zelle interagierten (Abb. 3.3.4). Die gleichmäßige Verteilung von mKate innerhalb der Zelle wurde durch die Bindung der Bakterien und die damit verbundene Rezeptorrekrutierung nicht beeinflusst (Abb.3.3.4 oberste Reihe). Im Gegensatz dazu akkumulierten die mKatefusionierten SH2 Domänen von Yes, Nck2 und die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 verstärkt in den Bereichen der Zelle, in denen Bakterien und CEACAM3/4 interagierten (Abb. 3.3.4; Pfeile). 118 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Abb. 3.3.4 Die isolierten SH2 Domänen von Yes, Nck2 sowie die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3KR3-N) werden in die Nähe des mit Gonokokken assoziierenden CEACAM3/4 rekrutiert. HEK293T Zellen wurden mit einem Plasmid, kodierend für die GFP-fusionierte Chimäre aus CEACAM3 und CEACAM4 (CEACAM3/4) und den angegebenen mKate-SH2 Domänen oder mKate allein kotransfiziert. Die Zellen wurden für 30 min mit Pacific Blue-markierten Opa52-exprimierenden N. gonorrhoeae (Ngo Opa52) infiziert (MOI = 50), fixiert und durch Konfokalmikroskopie analysiert. Die Interaktion von CEACAM3/4 mit Ngo Opa52 induziert die Rekrutierung der SH2 Domänen von Yes, Nck2 und PI3KR3-N (Pfeile) in diese Bereiche, bewirkt aber keine Rekrutierung von mKate oder der mKate-Slp76-SH2 Domäne (Pfeilköpfe). Die Maßbalken repräsentieren 20 µm. Im Gegensatz dazu zeigte die SH2 Domäne von Slp76 keine Kolokalisation mit der Bakterien-gebundenen CEACAM3/4-Chimäre (Abb.3.3.4 oberste Reihe; Pfeilköpfe). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Proteine Yes, Nck2 und PI3K, über ihre SH2 Domänen, an den 119 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen zytoplasmatischen Abschnitt der CEACAM3/4-Chimäre rekrutiert werden können. Diese Rekrutierung ist dabei abhängig von der Bindung Opa52-exprimierender Gonokokken an den Rezeptor. 3.3.2.4 Die Überexpression der Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne behindert die CEACAM3/4-vermittelte Phagozytose Wenn die durch die SH2 Domänen vermittelte Rekrutierung der Signalproteine Yes, Nck2 und PI3K eine funktionelle Relevanz bei der Phagozytose von Bakterien hat, müsste ein Überschuss der isolierten SH2 Domänen einen inhibitorischen Effekt auf die Aufnahme der Bakterien haben. Diese Theorie basiert auf der Idee, dass der Überschuss an isolierter SH2 Domäne das entsprechende endogene Protein aus dem Signalkomplex verdrängt und somit die CEACAM3/4-vermittelte Signalweiterleitung unterbrochen wird. Um diese Theorie genauer zu untersuchen, wurden weitere Infektionsexperimente durchgeführt. Hierfür wurde die CEACAM3/4-Chimäre jeweils mit der SH2 Domänen von Yes, Nck2, PI3KR3-N oder Slp76 in HEK293T Zellen koexprimiert und der Einfluss der jeweiligen SH2 Domäne mittels Gentamicin-Protektions Assays untersucht. Die Western-Blot Analysen in Abbildung 3.3.5C zeigen, dass in den verschiedenen Ansätzen sowohl der chimäre Rezeptor CEACAM3/4 als auch die einzelnen SH2 Domänen in gleichen Mengen exprimiert wurden. Die Überexpression der SH2 Domänen von Nck2, Yes und der N-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Bindung der Bakterien an die CEACAM3/4-exprimierenden Zellen (Abb. 3.3.5B). Im Gegensatz dazu führte die Überexpression der SH2 Domänen zu einer reduzierten Aufnahme der Gonokokken (Abb. 3.3.5A). Im Einzelnen betrachtet bewirkte die Überexpression der SH2 Domänen von Yes und Nck2 eine Reduktion der Phagozytoserate von circa 20 %. Eine wesentlich dramatischere Inhibierung der Aufnahme von Bakterien wurde durch Überexpression der PI3KR3-N-SH2 Domäne erzielt, hier betrug der Rückgang der Aufnahme rund 45 %. Auch die Überexpression der SH2 Domäne von Slp76 resultierte in einer reduzierten Aufnahme von Gonokokken, verglichen mit den Zellen, welche lediglich die CEACAM3/4-Chimäre exprimierten. Diese Beobachtung ist in sofern interessant, da für die SH2 Domäne von Slp76 weder eine phosphorylierungsabhängige Assoziation mit CEACAM4 (vgl. Abb. 3.3.1 und 3.3.2C) noch eine Kolokalisation mit der CEACAM3/4-Chimäre während der Infektion mit Opa52-exprimierenden Gonokokken (vgl. Abb. 3.3.4) nachgewiesen werden konnte. 120 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Abb. 3.3.5 Die Überexpression der isolierten Yes-, Nck2-, Slp76 oder PI3KR3-N-SH2 Domäne beeinflusst die CEACAM3/4-vermittelte Phagozytose von Bakterien. (A) HEK293T Zellen wurden mit einem Leervektor (pCDNA) oder Plasmiden, die für GFP oder die GFP-fusionierte CEACAM3/4-Chimäre kodieren, transfiziert. Zusätzlich wurden diese Zellen, wie angegeben, noch mit Plasmiden, kodierend für mKate allein oder mKatefusionierte SH2 Domänen von Yes, Nck, PI3KR3-N oder Slp76 kotransfiziert. Die transfizierten Zellen wurden für 60min mit Opa52-exprimierenden N. gonorrhoeae (Ngo Opa52) infiziert (MOI = 20). Mittels GentamicinProtektions Assays wurde die Anzahl der internalisierten Bakterien bestimmt. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Dreifachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten. (B) Die Anzahl der zellassoziierten Bakterien des unter (A) beschriebenen Experiments wurde durch einen Adhärenz Assay ermittelt. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Dreifachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten. (C) Die unter (A) und (B) verwendeten Zellen wurden mittels Western Blot Analyse hinsichtlich der Expression von CEACAM3/4-Chimäre-GFP und mKate-SH2 Domänen überprüft. Hierzu wurden ein polyklonaler anti-GFP bzw. ein monoklonaler anti-mKate Primärantikörper verwendet. Die Signifikanzen für (A) und (B) wurden mittels zweisitigem, ungepaarten Student-t-Test ermittelt; ** p < 0,01 und *** p < 0,005. Neben der reduzierten Aufnahme resultierte die Überexpression der isolierten Slp76-SH2 Domäne auch in einer verringerten Anzahl zellassoziierter Bakterien (Abb. 3.3.5B). Die Gentamicin-Protektions Assays lassen den Schluss zu, dass die Proteine Yes, Nck2 und PI3K über ihre SH2 Domänen am CEACAM3/4-vermittelten Phagozytoseprozess von Neisseria gonorrhoeae beteiligt sind. Die reduzierte Aufnahme von Gonokokken, bedingt durch die Überexpression der Slp76-SH2 Domäne, könnte möglicherweise auf eine indirekte CEACAM3/4-Assoziation dieses Proteins im Signalkomplex zurückzuführen sein. 3.3.3 Diskussion Das ausschließlich auf Granulozyten exprimierte Mitglied der CEACAM-Familie, CEACAM4, wurde seit seiner erstmaligen Beschreibung im Jahr 1991 (Kuroki et al. 1991) bis zum heutigen Zeitpunkt nur sehr ungenügend hinsichtlich seiner Funktion untersucht. Dies mag vor allem darin begründet liegen, dass gegenwärtig noch kein Ligand für die extrazelluläre Igv-ähnliche Domäne identifiziert wurde. Bisher wurde CEACAM4 lediglich für Vergleichsstudien mit den anderen Mitgliedern der CEACAM-Familie herangezogen. Einige dieser Untersuchungen deuten darauf hin, dass der 121 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen sehr effiziente phagozytische Rezeptor CEACAM3 von CEACAM4 abstammt. Grundlage dieser Annahme ist, dass beide Proteine sowohl auf DNA Ebene eine ähnliche Exon/Intron Struktur aufweisen, als auch die Abfolge der Aminosäuren in ihrem zytoplasmatischen Abschnitt zu 73 % identisch ist (Pils et al. 2008). Sowohl CEACAM3 als auch CEACMA4 besitzen in ihrem zytoplasmatischen Abschnitt phosphorylierbare Tyrosinreste, die in ITAM Konsensussequenzen eingebettet sind. Für CEACAM3 wurde bereits eingehend untersucht, dass die Phosphorylierung dieser Tyrosinreste essentiell für die CEACAM3-vermittelte Phagozytose von Bakterien ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein Teil der bereits für CEACAM3 identifizierten phosphoylierungsabhängigen Interaktionspartner auch mit den phosphorylierten Tyrosinen von CEACAM4 interagieren kann. Unter Einsatz des SH2 Domänen Arrays wurden SH2 Domänen-tragende Proteine, die auch bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose eine Rolle spielen, auf Interaktion mit phosphoryliertem CEACAM4 untersucht. Durch diese Methode konnten die Src-Kinasen Hck, Yes und Lck sowie das Adapterprotein Nck2 und die Lipidkinase PI3K als mögliche Interaktionspartner für CEACAM4 identifiziert werden. Diese Phosphotyrosin-abhängigen Interaktionen konnten auch mittels GST-SH2 Domänen pull-down Experimenten verifiziert werden. Die nähere Untersuchung dieser pull-down Ergebnisse zeigte, dass alle untersuchten SH2 Domänen direkt an beide phosphorylierten Tyrosinreste (Tyr222 und Tyr233) der ITAMSequenz von CEACAM4 binden können. Im Gegensatz dazu konnten für die ITAM-ähnliche Sequenz von CEACAM3 bisher nur direkte Bindungen an einen Tyrosinrest, nämlich das phosphorylierte Tyr230, nachgewiesen werden (vgl. Abb. 3.1.3 und Abb. 3.2.4 sowie (Schmitter et al. 2007a)). Auch im Fall der Src-Kinase Yes zeigen bisher unveröffentlichte Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe eine direkt Bindung an das phosphorylierte Tyr230, nicht aber an Tyr241 von CEACAM3. Während die Aminosäuresequenz Y233CQI von CEACAM4 der Konsensussequenz entspricht, wie sie in klassischen ITAMs (YxxL/I) vorkommt, ist das Motiv Y241CRM von CEACAM3 nicht dieser klassischen Aminosäureanordnung zuzuordnen. Dies deutet darauf hin, dass bereits minimale Veränderungen in der ITAM-Konsensussequenz, wie der Austausch einer Aminosäure, zu erheblichen Abweichungen im Bindungsverhalten von SH2 Domänen führen können. In diesem Zusammenhang wäre es sehr interessant, zu untersuchen, ob der Austausch des Ile236 in der ITAM-Sequenz von CEACAM4 gegen Methionin die Interaktion der SH2 Domänen negativ beeinflusst. Neben den Untersuchungen zur direkten Bindung der SH2 122 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Domänen von Nck, Yes und PI3K an phosphoryliertes CEACAM4 wurde auch ihre Beteiligung an CEACAM4-vermittelten Signalprozessen analysiert. Infektionsexperimente mit Opa52-exprimierenden Ngo zeigten, dass die SH2 Domänen von Nck2, Yes und die Nterminale SH2 Domäne der PI3KR3 spezifisch in die Nähe der mit Bakterien-assoziierten CEACAM3/4-Chimäre rekrutiert werden. Dies deutet darauf hin, dass diese Proteine über ihre SH2 Domänen an der CEACAM4-vermittelten Aufnahme von Bakterien beteiligt sein könnten. Erste Hinweise, die diese Theorie stützen, konnten durch weitere Infektionsexperimente erbracht werden. HEK293T Zellen, welche die CEACAM3/4-Chimäre zusammen mit der SH2 Domäne von Yes, Nck2 oder der N-terminalen SH2 Domäne von PI3KR3 exprimierten, zeigten nach Infektion mit Opa52-exprimierenden Bakterien eine deutlich reduzierte Anzahl intrazellulärer Bakterien. Die adäquate Überprüfung der Hypothese, dass diese Proteine am Phagozytoseprozess beteiligt sind, könnte durch zwei verschiedene Versuchsansätze erbracht werden. Eine Möglichkeit wäre die gezielte Inhibierung der Aktivität von endogener Yes-Kinase und PI3K. Eine zweite Möglichkeit besteht in der stabilen oder transienten Expressionsreduktion von endogener Yes, PI3K bzw. Nck2 durch shRNA oder siRNA. Die bisherigen Beobachtungen zur Rekrutierung der isolierten SH2 Domänen an den Rezeptor und ihr Einfluss auf die Phagozytose stehen im Einklang mit den bisherigen Erkenntnissen für den CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess. Auch für CEACAM3 konnte die spezifische Bakterien-abhängige Rekrutierung der SH2 Domänen von Src-Kinasen (Schmitter et al. 2007b; Buntru et al. 2009), der PI3K (vgl. Abb. 3.1.4, (Buntru et al. 2011)) und des Adapterproteins Nck (Pils et al., Manuskript in Revision) gezeigt werden. Ebenso zeigten auch CEACAM3-exprimierende Zellen eine reduzierte Anzahl intrazellulärer Bakterien, wenn die isolierten SH2 Domänen von Src-Kinasen oder Nck überexprimiert wurden. Neben diesen Gemeinsamkeiten zwischen CEACAM3- und CEACAM4-vermittelten Signalprozessen konnten allerdings auch Unterschiede festgestellt werden. Einer dieser Unterschiede ist, dass die Überexpression der isolierten SH2 Domäne von Slp76 sowohl die Adhäsion der Bakterien an die Zelle, als auch die CEACAM3/4-vermittelte Phagozytose negativ beeinflusste, während dies bei CEACAM3 nicht der Fall ist (Pils et al., Manuskript in Revision). Allerdings zeigte die Slp76-SH2 Domäne weder im SH2 Domänen Array noch im pull-down Experiment eine phosphorylierungsabhängige Assoziation mit CEACAM4. Auch konnte für diese SH2 Domäne keine Bakterien-abhängige Rekrutierung zur CEACAM3/4-Chimäre beobachtet werden. Aufgrund dieser unterschiedlichen 123 Ergebnisse sind weitere 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen Untersuchungen nötig, um die mögliche Beteiligung von Slp76 am Phagozytoseprozess eingehender zu analysieren. Ein weiterer sehr interessanter Unterschied zwischen CEACAM3 und CEACAM4 betrifft die Beteiligung des Adapterproteins Nck an diesen Signalprozessen. Für CEACAM3-vermittelte Phagozytoseprozesse wurde festgestellt, dass Nck über seine SH2 Domäne am CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess beteiligt ist (Pils et al., Manuskript in Revision). Allerdings deuten bisher unveröffentlichte Beobachtungen darauf hin, dass dieser SH2 Domänen-vermittelte Einfluss von Nck nicht auf einer direkten Bindung der NckSH2 Domäne an das phosphorylierte CEACAM3 beruht. Dies steht im Gegensatz zu den Interaktionsstudien der Nck2-SH2 Domäne, welche in einem zellfreien System eine direkte Interaktion mit beiden phosphorylierten Tyrosinen der ITAM-Sequenz von CEACAM4 zeigte. Ob diese Interaktion auch in lebenden Zellen stattfindet, könnte beispielsweise durch FRET-basierte Interaktionsstudien untersucht werden. Interessanterweise konnten sowohl für Grb14 als auch den Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav keine SH2 Domänen vermittelte Assoziation mit phosphoryliertem CEACAM4 festgestellt werden. Dies ist insofern interessant, als das diese Proteine direkt über ihre SH2 Domäne an CEACAM3 binden und bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose eine Rolle spielen. Ein Vergleich der ITAM-Konsensussequenzen beider Rezeptoren zeigt, dass die ITAMSequenz von CEACAM4 einem klassischen ITAM, wie es beispielsweise in T-Zellrezeptoren (TZR) und Fcγ-Rezeptoren (FcγR) vorkommt, sehr viel ähnlicher ist, als dies für die ITAMähnliche Sequenz von CEACAM3 der Fall ist. Während die Phagozytose über den FcγR von der Aktivierung der PTK Syk abhängt, welche über ihre SH2 Domänen direkt an das phosphorylierte ITAM bindet, ist der CEACAM3-vermittelte Phagozytoseprozess Sykunabhängig (Hauck et al. 1998; Sarantis and Gray-Owen 2007). Bis heute konnte auch noch keine direkte Interaktion zwischen den phosphorylierten Tyrosinen von CEACAM3 und den Syk-SH2 Domänen nachgewiesen werden. Auch im Fall von CEACAM4 wurde im Array keine phosphorylierungsabhängige Interaktion mit den SH2 Domänen von Syk gefunden. Allerdings sollte dies zum Beispiel durch pull-down Experimente mit Tyrosin-mutierten CEACAM4-Varianten und Peptid-Bindeexperimente, zum Nachweis einer direkten Interaktion, eingehender untersucht werden. Funktionelle Unersuchungen unter Einsatz pharmakologischer Syk Inhibitoren oder Überexpression dieser Kinase sollten weitere Gemeinsamkeiten oder Unterscheide zum CEACAM3 Signalweg aufzeigen können. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse Gemeinsamkeiten, aber auch Unterschiede im Bindungsverhalten von SH2 Domänen-tragenden Proteinen an 124 3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen CEACAM3 und CEACAM4. Die Unterschiede in den Signalnetzwerken, die auf die Abweichungen in den tyrosinbasierten Signalmotiven dieser Rezeptoren beruhen, sollten ebenfalls detailierter untersucht werden. Hierdurch könnten sich interssante Einblicke in die evolutionäre Veränderung von Signalwegen ergeben, die zunächst zum selben Ergebnis, in diesem Fall der Phagozytose von gebundenen Partikeln, führen. 125 Schlußbetrachtung 4 Schlussbetrachtung Die Phosphorylierung von Proteinen spielt eine essentielle Rolle in fast allen intrazellulären Signaltransduktionsprozessen. Neben der Regulierung von physiologischen Mechanismen durch die Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten spielt die Phosphorylierung von Tyrosinresten eine essentielle Rolle bei der Signaltransduktion in mehrzelligen Tieren. Die reversible Phosphorylierung von Tyrosinresten ist eine weit verbreitete und evolutionär erfolgreiche posttranslationale Modifikation von Proteinen zum Zwecke der intrazellulären Signaltransduktion. Nach Entstehung der ersten Phosphotyrosin-erkennenden Domänen expandierten sowohl die Proteine, die solche Domänen zur Erkennung enthielten, wie auch die Kinasen, die hochspezifisch die Phosphorylierung eines in einen bestimmten Sequenzkontext eingebetteten Tyrosinrestes bewerkstelligten. Das meistverbreitete Modul zur Erkennung von Phosphotyrosinen sind SH2 Domänen. Da viele Singalnetzwerke in tierischen Zellen auf Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen basieren, spielen Proteine, die diese Phosphotyrosin-spezifischen Erkennungsmodule besitzen, eine wichtige Rolle bei der intrazellulären Signaltransduktion. Um die Vielzahl an zellulären Signalwegen und ihre Vernetzung untereinander verstehen zu können, ist die Identifizierung Phosphotyrosin-abhängiger Protein-Protein Interaktionen unerlässlich. Gegenwärtig erfolgt die Charakterisierung von SH2-vermittelten Protein-Protein Interaktionen vor allem durch konventionelle Techniken wie Koimmunpräzipitationen oder pull-down Experimente mit nachgeschalteter Western Blot Anlayse. Jedoch sind diese Methoden zum Zwecke der breit gefächerten Analyse von Bindungspartnern mit einem hohen Zeit- und Materialaufwand verbunden. Eine effiziente Methode um in kurzer Zeit eine große Anzahl von SH2 Domänen zu untersuchen, besteht in der Kombination dieser konventionellen Methoden mit der „Biochip“ Technologie. Mit der Etablierung des SH2 Domänen Arrays wurde ein Werkzeug geschaffen, welches die parallele Analyse vieler SH2 Domänen auf ihre Interaktionskapazität mit einem definierten Phosphotyrosinprotein ermöglicht. Die Etablierung mittels Neu-Evaluierung zum Teil bekannter Interaktionen bot die Möglichkeit, den Array als zuverlässige Methode sowie die bekannten Interaktionen zu verifizieren. 126 Schlußbetrachtung 4.1 Etablierung des SH2 Domänen Arrays Um einen funktionellen SH2 Domänen Array zu etablieren, bedurfte es diverser Analysen. Zum einen mussten sowohl die optimale Expressionsmethode als auch das bestmögliche Aufreinigungsverfahren für die SH2 Domänen ermittelt werden. Zum anderen musste parallel die geeignetste Methode zur Immobilisierung der isolierten SH2 Domänen gefunden werden. Diese Fragestellungen stehen insofern zueinander in Bezug, als die Aufreinigungsmethode Einfluss auf die Möglichkeiten zur Immobilisierung haben kann. Die SH2 Domänen wurden rekombinant als Fusionsproteine mit 6fachem Histidin-Tag (His-Tag) oder als GSTFusionsprotein in E. coli exprimiert. Der His-Tag böte die Möglichkeit der gerichteten Immobilisierung der SH2 Domänen auf einem Nickel-beschichteten Objektträger. Allerdings sind die SH2 Domänen mit diesem Peptid-Tag unlöslich und müssen denaturierend aufgereinigt und in vitro renaturiert werden, was die Funktionalität von Domäne zu Domäne unterschiedlich beeinflussen kann. Darüber hinaus ist die Bindung über Koordination der freien Elektronenpaare des His-Tags an die kationische Oberfläche des Objektträgers nicht robust genug, um die Beprobung zu überstehen. Auch die anderen getesteten Immobilisierungsverfahren ohne kovalente Kopplung der Proteine zeigten dieses Problem. Im Laufe der Vorversuche stellten sich Aldehydoberflächen als die am besten geeignetste Affinitätsmatrix zur Immobilisierung der Proteine heraus. Durch die Ausbildung von stabilen, kovalenten Bindungen (Schiff’sche Basen) zwischen primären Aminen des Proteins und den Aldehydgruppen der Oberfläche wurden die Domänen dauerhaft auf dem Objektträger immobilisiert. Allerdings sind die so fixierten Proteine nach dem Zufallsprinzip in räumlich ungerichteter Orientierung auf der Oberfläche angeordnet. Aus Gründen der bessseren Löslichkeit wurden die SH2 Domänen als GST-Fusionsproteine exprimiert und über eine GSH-Sepharosesäule aufgereinigt. Die ungerichtete Immobilisierung der Proteine auf der Aldehydoberfläche sollte von diesem Fusionsprotein ebenfalls profitieren, da die GST-Fusion mit ca. 26 kDa im Vergleich zu den ca. 10 kDa großen SH2 Domänen relativ groß ausfällt. Somit ist die Wahrscheinlichkeit einer Immobilisierung der Proteine über das GST größer als die Reaktion des Aldehyds mit einer in der SH2 Domäne befindlichen primären Aminogruppe. Da nicht alle Aldehydgruppen der Oberfläche durch eine Reaktion mit dem zu immobilisierenden Protein abgesättigt wurden, mussten zur Vermeidung von unspezifischen Bindungssignalen die noch freien Aldehydgruppen der Oberfläche blockiert und inaktiviert werden. Die Blockierung mit BSA erwies sich, auch nach 127 Schlußbetrachtung Zusatz von Ethanolamin, als nicht optimal. Eine Reduktion der Aldehydgruppen mit dem starken Reduktionsmittel Natriumborhydrid (NaBH4) führte zu einem besseren Signal-zuHintergrund Verhältnis. Zur Beprobung des Arrays wurde anfänglich fluoreszenzmarkiertes und in vitro phosphoryliertes rekombinantes Protein verwendet, was leider zu einem hohem Hintergrundsignal führte. Dieser starke Hintergrund ist wahrscheinlich auf eine unvollständige Entfernung des überschüssigen Fluoreszenzfarbstoffes vor der Beprobung oder Abspaltung des Farbstoffes während der Beprobung zurückzuführen und konnte auch durch stringentes Waschen nicht reduziert werden. Die Beprobung mit Ganzzelllysaten und die nachgeschaltete Detektion des Zielproteins mit Antikörpern zeigte robuste Signale mit wenig Hintergrund. Die Verwendung von verschiedenen, spezifischen Antikörpern gegen EpitopTags oder Proteine verlief ebenfalls erfolgreich und zeigte die breite Anwendbarkeit der Methode auf verschiedenste Fragestellungen. Kleinere Optimierungen und Korrekturen bleiben noch offen, da sich teilweise nicht alle Interaktionen in gleichem Maße mit herkömmlichen Methoden rekapitulieren ließen. Dies könnte an den unterschiedlichen Bindungsbedingungen liegen. Während in einer Lösung sämtliche Orientierungen der Bindungspartner realisierbar sind, ist dies auf dem Array mit seinen kovalent gebundenen Proteinen nur in einem engen Rahmen möglich. Eine Maßnahme, diesen möglichen Nachteil abzumildern, wäre der Einsatz eines Verbindungstückes, das zunächst an die Aldehydgruppen gebunden und anschließend selbst zum Aldehyd oxidiert werden müsste. Hierfür würde sich die Stoffklasse der Omega-Aminoalkanole anbieten. 4.2 Untersuchungen zu SH2 Domänen-abhängigen Protein-Protein Interaktionen bei granulozytischen CEACAMs Mittels des neu etablierten SH2 Domänen Arrays konnten mehrere tyrosinphosphorylierte Proteine auf mögliche Interaktionen mit SH2 Domänen-tragenden Signalproteinen untersucht werden. Von besonderem Interesse waren hier zwei Mitglieder der CEACAM-Familie, die ausschließlich auf Granulozyten exprimiert werden und ITAM-ähnliche Signalmotive in ihren zytoplasmatischen Abschnitten tragen. Die zu untersuchenden Rezeptoren waren CEACAM3 und sein evolutionärer Vorläufer, CEACAM4. CEACAM3 ist ein phagozytischer Rezeptor, der für die Eliminierung von CEACAMbindenden Pathogenen verantwortlich ist. Bisher wurden bereits diverse Bindungen von SH2 128 Schlußbetrachtung Domänen-tragenden Proteinen an die funktionsrelevante ITAM-ähnliche Sequenz von CEACAM3 beschieben. Sowohl der Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav (Schmitter et al. 2007a) wie auch die Kinasen der Src-Familie (unveröffentlichte Beobachtung) binden über ihre SH2 Domäne direkt an den phosphorylierten zytoplasmatischen Abschnitt dieses Rezeptors. Mit dem SH2 Domänen Array konnten diese bekannten Interaktionen verifiziert werden. Zusätzlich zu den bekannten SH2 Domänen wurden noch andere SH2 Domänen hinsichtlich ihrer Assoziation mit CEACAM3 untersucht. Auf diesem Weg wurden zwei neue, potentielle Bindungspartner für CEACAM3 identifiziert. Der Rezeptor zeigte eine deutliche phosphorylierungsabhängige Assoziation mit der Nterminalen SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K sowie mit der SH2 Domäne des Signalproteins Grb14. Beide Interaktionen konnten durch herkömmliche pull down Experimente bestätigt und in einem semi-synthetischen Versuchsaufbau auf das phosphorylierte Tyr230 der ITAM-ähnlichen Sequenz eingegrenzt werden. So finden sich für CEACAM3 bisher nur SH2 Domänen-Interaktionspartner für das Tyr230, wohingegen bisher keine Bindungspartner für das Tyr241 identifiziert werden konnten. Allerdings wurden gegenwärtig nur gut 20 SH2 Domänen auf eine phosphorylierungsabhängige Assoziation mit CEACAM3 untersucht. Die Darstellung der restlichen ca. 90 SH2 Domänen ist zurzeit noch nicht abgeschlossen, so dass ein umfassenderer Suchlauf noch aussteht. Ein interessanter Aspekt der bisher identifizierten Interaktionen ist, dass das pTyr230 der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 auch als Bindungsstelle für den GuaninnukleotidAustauschfaktor Vav dient (Schmitter et al. 2007a). Des Weiteren ist dieser Tyrosinrest in eine YxxL Sequenz eingebettet, welche als Bindemotiv für SH2 Domänen von PTKs der SrcFamilie identifiziert wurde (Songyang et al. 1993). Bisher unveröffentlichte Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass die gut dokumentierten Interaktionen von CEACAM3 mit PTKs der Src-Familie, wie Hck und Yes, ebenfalls am pTyr230 stattfinden (Schmitter et al. 2007b; Buntru et al. 2009). Diesen Sachverhalt betreffend existieren einige, sich gegenseitig nicht ausschließende Möglichkeiten, die die Assoziation eines einzelnen Phosphotyrosins mit mehreren, für die CEACAM3-vermittelte Signaltransduktion erforderlichen Faktoren erklären könnten. Einerseits führt die Bindung der Bakterien eindeutig zur Bündelung mehrerer CEACAM3 Moleküle in einem räumlich eng begrenzten Bereich der Zelle (Schmitter et al. 2004; Buntru et al. 2009). Dies würde es allen pTyr230 bindenden Komponenten ermöglichen, sich gleichzeitig in derselben Region der Zelle anzureichern. In diesem Fall würde ein Teil der phosphorylierten Rezeptoren mit jeweils einem SH2 Domänen enthaltenden Protein im 129 Schlußbetrachtung Komplex vorliegen. Die Größe der Anteile würde sich hier durch die Affinitäten und relativen lokalen Konzentrationen der vorhandenen Bindungspartner ergeben. Andererseits sind die Interaktionen des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 und seiner zytoplasmatischen Bindungspartner nur transienter Natur. Diesbezüglich wurde konnte durch Lebendzellmikroskopie herausgefunden werden, dass nach Bindung von OpaCEAexprimierenden Bakterien und anschließender Bündelung mehrer CEACAM3 Moleküle die SH2 Domäne von Hck sehr schnell in der Nähe des Rezeptors akkumuliert und binnen 5-10 min wieder verschwindet (Buntru et al. 2009). Demzufolge könnte eine Hierarchie der zytoplasmatischen Faktoren existieren, die in einer zeitlich geordneten Abfolge mit dem intrazellulären Abschnitt von CEACAM3 interagieren. Weitere Untersuchungen mittels Lebendzellmikroskopie unter Einsatz von unterschiedlich markierten SH2 Domänen sowie die biochemische Ermittlung der Dissoziationskonstanten von CEACAM3 und einer Reihe von SH2 Domänen könnten zur Klärung dieses Sachverhalts beitragen. Trotz der noch ungeklärten Mechanismen, wie mehrere SH2 Domänen an ein Phosphotyrosin binden können, geben die neu identifizierten Interaktionspartner für CEACAM3 Anlass zu detaillierteren Untersuchungen. So ist beispielsweise die PI3K bei Phagozytoseprozessen diverser ITAM-tragender Rezeptoren von essentieller Bedeutung (Fruman and Cantley 2002; Joshi et al. 2006). Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse zeigen jedoch, dass der CEACAM3-vermittelte Phagozytoseprozess von der Aktivität dieser Lipidkinase unabhängig ist. Doch der Umstand, dass die Degradation der aufgenommen Bakterien nur dann erfolgt, wenn die PI3K enzymatisch aktiv ist, wirft ein neues Licht auf diese direkte Assoziation und unterstreicht die Unterschiede in Signaltransduktionsprozessen, die durch ITAM-ähnliche (CEACAM3) und klassische ITAM (z. B. Fcγ- oder T-Zell-Rezeptor) Sequenzen vermittelt werden. Im Gegensatz zur PI3K spielt Grb14, der zweite neu identifizierte Interaktionspartner für CEACAM3, bei der Rezeptor-vermittelten Aufnahme von Bakterien eine Rolle. Die Daten der vorliegenden Arbeit deuten daraufhin, dass Grb14 den Phagozytoseprozess negativ reguliert. Grb14 wurde bereits als Negativregulator für Wachstumsfaktor-vermittelte Signalprozesse beschrieben. Dieser negativ regulierende Effekt ist auf die BPS Domäne zurückzuführen, die als Pseudosubstrat die Kinasedomäne des Rezeptors blockiert und somit die Phosphorylierung natürlicher Effektoren unterbindet. Zwar besitzt CEACAM3 keine eigene Kinasedomäne, wird jedoch als Folge der Bindung von Bakterien durch rezeptorassoziierte PTKs der Src-Familie phosphoryliert, wodurch der Phagozytoseprozess in 130 Schlußbetrachtung Gang gesetzt wird. Es ist somit denkbar, dass die Bindung von Grb14 an phosphoryliertes CEACAM3 einen inhibitorischen Effekt auf die Aktivität der rezeptorassoziierten SrcKinasen und somit auch auf den Phagozytoseprozess hat. In Bezug auf die Notwendigkeit einer solchen Negativregulierung des CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozesses kann in diesem Zusammenhang nur spekuliert werden. So ist es beispielsweise denkbar, dass ein Gleichgewicht zwischen der Anzahl an internalisierten Bakterien und der enzymatischen Kapazität der NADPH-Oxidase hergestellt werden muss. Weitere Untersuchungen mit definierten Deletions- oder Punktmutanten von Grb14 sollten die Rolle, die dieses Protein in der CEACAM3-vermittelten Phagozytose übernimmt, ergründen. Für CEACAM4, den evolutionären Vorläufer von CEACAM3, konnten keine Anhaltspunkte für eine direkte Bindung des Signalproteins Grb14 an den zytoplasmatischen Abschnitt gefunden werden. Eine Analyse der Bindungspartner des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM4 ergab noch weitere Unterschiede zu CEACAM3. Diese erstreckten sich sowohl auf die identifizierten Bindungspartner als auch deren Bindungsverhalten in Bezug auf das erkannte Tyrosinmotiv. Während bei CEACAM3 alle gefunden Bindunsgpartner an den Tyrosinrest im YEEL Sequenzmotiv binden, fanden sich bei CEACAM4 auch Interaktionen mit dem im YCQI Sequenzkontext stehenden Tyrosinrest. Der entsprechendene Tyrosinrest im YCRM Kontext von CEACAM3 zeigte keinerlei Interaktionen mit den überprüften SH2 Domänen. Jedoch fanden sich nicht nur Abweichungen in den Mustern der erkannten Tyrsoninreste, sondern auch in den bindenden SH2 Domänen. So zeigten Grb14 und Vav, für die eine starke Interaktion mit CEACAM3 gefunden wurde (Kapitel 3.2 und (Schmitter et al. 2007a)), keine Interaktion mit CEACAM4. Dies ist zunächst verwunderlich, da die Sequenzmotive um die Tyronsinreste 230 (CEACAM3) und 222 (CEACAM4) sehr ähnlich sind. Für die Bindung sind normalerweise die 3-4 das Tyrosin flankierende Aminosäuren verantwortlich. Eine signifikante Abweichung findet sich allerdings nur in der -2 Position (Serin vs. Prolin) oder in der +5 Position (Lysin vs. Tyrosin). Welcher der Reste für das stark abweichende Bindungsverhalten verantwortlich ist, könnte durch Punktmutationen in den beiden Sequenzen untersucht werden. Die direkte Bindung könnte hierfür im Peptid-Bindeexperiment relativ schnell und unkompliziert ermittelt werden. Die N-terminale, Igv-ähnliche Domäne von CEACAM4 weist nur wenig Sequenzähnlichkeit zu anderen CEACAMs auf. In CEACAM3 wurde diese N-terminale Domäne durch eine 131 Schlußbetrachtung OpaCEA-bindende Domäne ersetzt, während die Tramsmembrandomäne und der zytoplasmatische Abschnitt von CEACAM4 beibehalten wurde. Der zytoplasmatische Abschnitt veränderte sich im Laufe der Evolution und wurde ein effizienter phagozytoseauslösender Signalgeber. Ob der zytoplasmatische Abschnitt von CEACAM4 ebenfalls diese phagozytische Funktion hat, konnte nicht mit einem natürlichen Liganden überprüft werden, da ein solcher noch nicht bekannt ist. Eine neu hergestellte Chimäre, welche die OpaCEA-bindende Domäne von CEACAM3 mit der Transmembrandomäne und der zytoplasmatischen Sequenz inklusive des ITAMs von CEACAM4 verbindet, ermöglichte funktionelle Untersuchungen in Hinblick auf die phagozytische Aktivität dieses Rezeptors. In der vorliegenden Arbeit konnte die phagozytische Aktivität der Chimäre nachgewiesen sowie einige am Phagozytoseprozess beiteiligte Faktoren identifiziert werden. Neben den auch bei CEACAM3 beschriebenen Effektoren wie Src Kinasen (Yes) (Hauck et al. 1998; Schmitter et al. 2007b) oder Nck (Pils et al., Manuskript in Revision) zeigt auch die SH2 Domäne der PI3K einen inhibitorischen Effekt auf die Aufnahme. Inwieweit dies an einer enzymatischen Beteiligung der PI3K liegt, oder einfach an der Blockierung der Tyrosinreste für aufnahmerelevante Proteine sollte durch Versuche unter Inhibierung der Kinaseaktivität geklärt werden. Ein überraschender Effekt stellte sich bei Untersuchungen mit der SH2 Domäne von Slp76 ein. Weder in biochemischen, noch in mikroskopischen Untersuchungen assoziierte diese SH2 Domäne mit CEACAM3 oder CEACAM4. Jedoch zeigte die Überexpression der isolierten Slp76-SH2 Domäne einen negativen Einfluss auf die CEACAM3/4-vermittelte Adhärenz und Phagozytose der verwendeten Pathogene. Diese Effekte wurden nicht beim CEACAM3-vermittelten Prozessen beobachtet (Pils et al., Manuskript in Revision). Da die Mengen an exprimiertem CEACAM3/4 in den einzelnen Versuchsansätzen annähernd konstant waren, könnte der Effekt einerseits auf einer schlechteren Oberflächenverfügbarkeit des Rezeptors beruhen. Eine Rezeptorfärbung mit anschließender durchflusszytometrischer Analyse könnte darüber Aufschluss geben. Andererseits fungiert Slp76 in klassischen ITAM-Signalwegen als Gerüstprotein zwischen Tec Kinasen und Vav (Zeng et al. 2003; Andreotti et al. 2010). Interessanterweise wurde, im Gegensatz zu CEACAM3 (Schmitter et al. 2007a), keine Interaktion der Vav-SH2 Domäne mit CEACAM4 gefunden. Diese Tatsachen stützen die These, dass CEACAM3 sich divergent entwickelt hat und der Signalweg zur effizienten Phagozytose angepasst wurde. Die uneindeutigen Ergebnisse zum Einfluss der Slp76-SH2 Domäne erfordern weitere Experiment, um eine mögliche Beteiligung dieses Gerüstproteins im CEACAM4-vermittelten 132 Schlußbetrachtung Signalweg zu untersuchen. Es gab bereits Versuche bakterielle Liganden für CEACAM4 zu finden, allerdings bisher ohne Resultat. Unter der Annahme, dass CEACAM4 im Menschen noch von Nutzen ist, könnte eine Ausweitung der Suche auf andere Fremdkörper wie Pilze oder Parasiten sinnvoll sein. Insgesamt zeigt die hier vorliegende Arbeit sowohl Gemeinsamkeiten wie auch Unterscheide in den CEACAM3- und CEACAM4-vermittelten Signalwegen auf. Die detailiertere Untersuchung dieser Unterschiede verspricht interessante Einblicke in die Entwicklung verschiedener Signalwege, welche zum selben Ziel, der Phagozytose, führen. 133 Eigenabgrenzungen 5 Eigenabgrenzungen Alle in dieser Arbeit dargestellten Experimente wurden, sofern nicht explizit angemerkt, von mir selbst durchgeführt. Das FAK pull-down Experiment (Abb. 2.2.10) wurden von Sebastian Veith (Universität Konstanz) im Rahmen des Vertiefungskurses 2010 am Lehrstuhl für Zellbiologie an der Universität Konstanz unter meiner Betreuung erstellt. Das Experiment wurde von mir geplant und alle Details der Versuchsdurchführung waren mit mir abgesprochen. Die Untersuchung der Kolokalisation der N-terminalen SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (Abb. 3.1.4) wurden von Alexander Buntru (Lehrstuhl für Zellbiologie, Universität Konstanz) durchgeführt. Die Untersuchungen zum Einfluss der Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase auf die CEACAM3-vermittelte Phagozytose (Abb. 3.1.5) und auf die Generierung von reaktiven Sauerstoffderivaten (Abb. 3.1.6A, B und C) wurden ebenfalls von Alexander Buntru (Lehrstuhl für Zellbiologie, Universität Konstanz) durchgeführt. 134 Publikationen 6 Publikationen Buntru, A., Kopp, K., Voges, M., Frank, R., Bachmann, V. and Hauck, C. R. (2011). “Phosphatidylinositol 3'-Kinase Activity Is Critical for Initiating the Oxidative Burst and Bacterial Destruction during CEACAM3-mediated Phagocytosis.” J Biol Chem 286(11): 9555-9566. Schmitter, T., Pils, S., Weibel, S., Agerer, F., Peterson, L., Buntru, A., Kopp, K. and Hauck, C. R. (2007). “Opa proteins of pathogenic neisseriae initiate Src kinase-dependent or lipid raft-mediated uptake via distinct human carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule isoforms.” Infect Immun 75(8): 4116-4126. Pils, S., Peterson, L., Kopp, K. and Hauck, C. R. “The adaptor molecule Nck localizes the WAVE complex to promote actin polymerization during CEACAM3-mediated phagocytosis of bacteria.” Manuskript in Revision. Schreiner, D., Muller, K. and Hofer, H. W. (2006). “The intracellular domain of the human protocadherin hFat1 interacts with Homer signalling scaffolding proteins.” FEBS Lett 580(22): 5295-5300. 135 Material 7 7.1 Material Bakterien 7.1.1 Neisseria gonorrhoeae-Stämme N302 (MS11-B1) PilEB1(S), Opa30-, opaC::cat, (CmR), pTH6a, (TetR), (ErmR) N308 (MS11-B1) PilEB1(S), Opa30-, opaC::cat, (CmR), pTH6a::opa56 (pEMK60), (TetR), (ErmR) N309 (MS11-B1) PilEB1(S), Opa30-, opaC::cat, (CmR), pTH6a::opa52 (pEMK62), (TetR), (ErmR) 7.1.2 Escherichia Coli-Stämme Nova Blue endA1, hsdR17(rk12-mk12+), supE44, th-1, recA1, gyrA96, relA1, lac[F’ proA+B+lacIqZΔN15::Tn10(tetR)], (Novagen) BL21 Rosetta F-, ompT, hsdSB (rB-mB-), gal, dcm pRARE (CamR), (Novagen) BL21 DE3 F-, ompT, hsdSB (rB-) gal, dcm (DE3), (Novagen) 7.2 Zelllinien HEK293T (humane embryonale Nierenzelllinie) DLD1 (humane Kolonkarzinomzelllinie) 7.3 Nährmedien für Bakterien und Zellkultur 7.3.1 Flüssigmedien und Agarplatten für Bakterien LB-Medium 10g Bacto-Trypton, 5g Hefeextrakt, 5g NaCl, pH 7,0, ad 1l mit A.bidest LB-Platten 10g Bacto-Trypton, 5g Hefeextrakt, 5g NaCl, 10ml MgCl2 (1M), 12g AgarAgar ad 1l mit A.bidest GC – Platten 36g GC-Agar, ad 1l mit A.bidest., 10ml Vitaminmix Vitaminmix 20g Dextrose, 2g L-Glutamin, 3,2g L-Cystein, 0,02g Cocarboxylase, 4µg Fe(NO3)3, 0,6µg Thiamin-HCl, 50µg NAD, 2µg VitaminB12, 30µg L136 Material Arginin, 2,6µg p-Aminobenzoesäure, 0,22g LCystin, 0,2g Adenin, 0,1g Uracil, 6µg Guanin, pH 3,5, ad 200ml mit A.bidest., sterilfiltrieren. (10ml auf 1l GC-Agar) Antibiotika Ampicillin: 100 µg/ml Chloramphenicol: 30 µg/ml in LB-Medium, 10 µg/ml in GC-Agar Erythromycin: 7 µg/ml Kanamycin: 30 µg/ml 7.3.2 Medien für Zellkultur DMEM Synthetisches Zellkulturmedium mit L-Glutamin (PAA Laboratories) FCS Fötales Kälberserum (PAA Laboratories) CS Kälberserum (PAA Laboratories) hi CS hitzeinaktiviertes Kalberserum (30 min Inkubation bei 56 °C) 7.4 Plasmide und Oligonukleotide 7.4.1 Plasmide pDNR-Dual oripUC*, loxP, MCS, SD, 6xHis-tag, (CamR), SacB (BD Bioscience) pDNR-CMV oripUC*, loxP, MCS, (CamR), (AmpR), SacB, PCMV (BD Bioscience) pET28a(+)-LoxP ori, lacI, MCS, 6xHis-tag, (KanR) (Novagen) pGEX4T1-LoxP oriBR322, MCS, GST-tag, lacI, (AmpR) (Amersham Pharmacia) pLPS-3´EGFP-LoxP oripUC, loxP, MCS, SA, EGFP, (KanR), (NeoR) (BD Bioscience) 7.4.2 Oligonukleotide Name Sequenz 5’ – 3’ Csk-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACGCCACTGTGCCCTCC Csk-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGGCGTGAAGGCGGGTAC Fgr-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAGGCGTCCTTGGCCAG Fgr-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCTGTTGACTCAATCCAAGC Fyn-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAGGGGGACATTGTGCCTGG Fyn-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCAGTTGACTCTATCCAGGCAG Grb10-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATAAGGCCACTCGGATGC 137 Material Grb10-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACTCTACCCTAAGTACAGTGATTCAC Grb14 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACATGACCACTTCCCTGCAAGATGG GCAGAGC Grb14-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACTAGAGAGCAATCCTAGCAC Grb14-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGCCACAAACATGGCTATCCAC Grb14-shRNA2-anti AATTCAAAAAAAGTGACTTATTAAACTATTGAAGGCTCG AGCCTTCAATAGTTTAATAAGTCAC Grb14-shRNA2-sense CCGGGTGACTTATTAAACTATTGAAGGCTCGAGCCTTCAA TAGTTTAATAAGTCACTTTTTTTG Grb2-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAGTATGTCGGCTGCTGTGG Grb2-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCCAAGAACTACATAGAAATG Grb7-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAGAGGGCCACCCGCGT Grb7-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACAGTGCAGCCATCCACC Hck-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAATCTTTCTCCCAAGGCTTCTGG Hck-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGCCCGCGTTGACTCTC LCK-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAATCCTCCCACCACGGC LCK-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGCGAACAGCCTGGAGC Nck1-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATGATAAATGCTTGACAAGATAT AATTTTTC Nck1-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACAGGCCTTCACTCACTGGAAAG Nck2-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACTGCAGGGCCCTGACG Nck2-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCCTCGTCCAGCGG PI3KR1-N-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAATCCTGTTGGTATTTGGATACTG GGAAGTTATCAGTCGACATGTCCTTACAAGATGCTGAATG G PI3KR1-N-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACATGTCCTTACAAGATGCTGAAT GG PI3KR1-C-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATCGCCTCTGCTGTGCATATAC PI3KR1-C-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCCCATCATGATGAGAAGACA TGG PI3KR3-C-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATCTGCAAAGCGAGGGCATC PI3KR3-C-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGAGGAAGATGAAAACCTGCC PI3KR3-N-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAATCCTGTTGGTATCTGGAC 138 Material PI3KR3-N-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACATGAAGGACAGTTCTGTTTC PLCG1-N-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACTCGTGGGCGTTGGTCTG PLCG1-N-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACAGCACAGAGCTGCACTCC PLCG1-C-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAGCCAATCTTCTCCAGTGC PLCG1-C-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGTCCCACAGACCAACG PLCG2-C-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATATATCTCTTTCCATATTG PLCG2-C-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGACCCTGTGCCCAACCC PLCG2-N-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACGGCTTGGACTCGTGGG PLCG2-N-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACGATATACCCCCTACAGAAC Shc1-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTTCACAGTTTCCGCTCCAC Shc1-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACTCGGTGTCCATGGCTGAGC Slp76-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTCTATGGGTACCCTGCAGCATG Slp76-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCCGCGGAGGAAGAG Src-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACAGGCCCTGAGTCTGC Src-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCCTCCGACTCCATCCAG Syk-N-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACTGCACCCCTTGGG Syk-N-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACATGGCCAGCAGCG Syk-C-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTAACGGCCTCCAAAATTAAC Syk-C-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCTCAGCTGGAGAAGCTG Tec-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATCCTGCAGTGGTGGGTG Tec-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACACGGGAAAGAAATCAAAC TNS1-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTACGATTCATCTGTGGGGTC TNS1-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCGGGCTAAAGTGAAGTTTGTCC Vav1-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATCTCTTTTCAGGCTCCTTG Vav1-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCTCAGGACCTGTCTGTTC Yes-SH2 IF-anti ATGGTCTAGAAAGCTTATGCTAGTCCTTGAGTCTGAGG Yes-SH2 IF-sense GAAGTTATCAGTCGACCCTGCAGATTCCATTCAGG 139 Material 7.5 Antikörper, Enzyme und Proteine 7.5.1 Antikörper Primärantikörper Spezifität CD66 (CEA, human) CD66acde Opa GFP GFP Grb14 GST HA-Epitop His-Epitop myc-Epitop Phosphotyrosin v-Src Typ monoklonal monoklonal monoklonal monoklonal monoklonal polyklonal monoklonal monoklonal monoklonal monoklonal monoklonal monoklonal Name D14HD11 IH4Fc 4B12/C11 JL8 B-14 12CA5 9E10 4G10 EC10 Herkunft Maus Maus Maus Maus Kanninchen Kaninchen Maus Maus Maus Maus Maus Maus Bezugsquelle Genovac Immuno Tools Prof. Achtmann BD Bioscience Serum AG Hauck Epitomics Santa Cruz Hybridom AG Hauck Santa Cruz Hybridom AG Hauck Hybridom AG Hauck Upstate Sekundärantikörper Peroxidase-gekoppelter Ziege-anti-Maus (Jackson Immunoresearch) Peroxidase-gekoppelter Ziege-anti-Hase (Jackson Immunoresearch) Cy2-gekoppelter Ziege-anti-Maus (Jackson Immunoresearch) Cy3-gekoppelter Ziege-anti-Maus (Jackson Immunoresearch) Cy3-gekoppelter Ziege anti-Hase (Jackson Immunoresearch) Cy5-gekoppelter Ziege-anti-Maus (Jackson Immunoresearch) Antikörperunabhängige Farbreagenzien Rhodamin (5-(6)-carboxytetramethylrhodamine-succinimidylester) CSFE (5-(6)-carboxyfluorescein-succinimidylester) 7.5.2 Enzyme und Proteine Restriktionsenzyme (BioLabs und Fermentas), In-Fusion Enzym (BD Bioscience), Trypsin (PAA Laboratories), selbst hergestellte Enzyme: Taq-DNA-Polymerase, Pfu-DNA-Polymerase, Cre-Rekombinase GSH-Sepharose (GE Healthcare), Protein A/G-Plus Sepharose (Santa Cruz Biotechnology) 140 Material 7.6 Lösungen und Puffer 7.6.1 Lösungen und Puffer für eukaryotische Zellen PBS (1x) 24g NaCl, 0,6g KCl, 3,45g Na2HPO4*7H2O, 0,6g KH2PO4, pH 7,4; ad 1l mit A.bidest. PBS++ 1xPBS, 0,35mM CaCl2, 0,25mM MgCl2 Poly-L-Lysin 10mg/ml Fibronektin 2µg/ml Paraformaldehyd 4g PFA in 80ml warmem A.bidest. lösen, 1N NaOH zugeben bis Lösung geklärt, pH 7,4 mit 1N HCl einstellen, 10ml 10xPBS zugeben und mit A.bidest auf 100ml auffüllen Saponinlösung 1 % Saponin in 1xPBS lösen CaCl2-Lösung 2,5M CaCl2 2x HBS 16,4g NaCl, 11,9g Hepes, 0,21g Na2HPO4, in 1l A.bidest. lösen, pH 7,05; sterilfiltrieren RIPA-Puffer 1 % Triton X-100, 50mM Hepes, 10 % Glycerin, 150mM NaCl, 1mM EGTA, MgCl2, 1,5mM 10mM Natriumpyrophosphat, 100mM Natriumfluorid, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 % Deoxycholat, 1mM Natriumorthovanadat, 10µg/ml Leupeptin, 10µg/ml Aprotinin, 10µg/ml Pefabloc, 10µg/ml Pepstatin, 10µM Benzamidin; ad 250ml mit A.bidest. Triton-Puffer 25mM HEPES (pH 7,4), 1% Triton X-100, 150mM NaCl, 20mM MgCl2, 10 % Glycerol, 10mM Natriumphosphat, 100mM NaF, 1mM NaVO4, 10µg/ml Leupeptin, 10µg/ml Aprotinin, 10µg/ml Pefabloc, 10µg/ml Pepstatin, ad 250ml mit A.bidest. FACS-Puffer 1 % hitzeinaktiviertes (F)CS in PBS Phagozytosepuffer 1 x PBS, 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 5 mM Glukose, 1 % hitzeinaktiviertes FC 141 Material 7.6.2 Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden TAE-Puffer (1x) 4,84g Tris-Base, 1mM EDTA, 1,14ml Eisessig, ad 1l mit A.bidest. TE-Puffer 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8 GEBS-Puffer 50mM EDTA, 20 % (v/v) Glycerin, 0,5 % (w/v) Sarcosyl, 0,05 % (w/v) Bromphenolblau dNTPs 1,25mM dNTPs in TE-Puffer pH 8 lösen P1-Puffer 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 100µg/ml RNase A, pH 8,0, 4 °C P2-Puffer 200mM NaOH, 1 % (w/v) SDS, RT P3-Puffer 3M Kaliumacetat, pH 4,8, RT 7.6.3 Lösungen und Puffer für biochemische Methoden 7.6.3.1 Puffer und Lösungen für SDS-PAGE, Coomassiefärbung, Western Blot und Protein Array 2xSDS Probenpuffer 125mM Tris-HCl (pH 6,8), 10 % (v/v)-β-Mercaptoethanol, 5 % (w/v) SDS, 0,1 % (w/v) Bromphenolblau, 20 % (v/v) Glycerin SDS-PAGE Standard 1 % (w/v) Lysozym, 1 % (w/v) Sojabohne-Trypsin-Inhibitor, 1 % (w/v) Peroxidase, 1 % (w/v) BSA, 1 % (w/v) Lipoxidase, 5ml Triton-Puffer, 5ml 2x Probenpuffer Acrylamidlösung 40 % Polyacrylamid Sammelgel-Puffer 0,5M Tris-HCl pH 6,8 Trenngel-Puffer 1,5M Tris-HCl pH 8,8 APS 10 % Ammoniumperoxodisulphat TEMED 0,1 % N,N,N’,N’-Tetramethyldiamin SDS 20 % (w/v) SDS Laufpuffer 25mM Tris-HCl, 192mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS Färbelösung 25 % (v/v) Isopropanol, 10 % (v/v) Eisessig), 0,03 % (w/v) Coomassie-Brillant Blue R250 Entfärbelösung 10 % (v/v) Isopropanol, 10 % (v/v) Eisessig 142 Material Kathoden-Puffer (5x) 125mM Tris-Base, 200mM 6-Aminohexansäure, pH 9,4 Anoden-Puffer (5x) 125mM Tris-Base, pH 10,4 Transferpuffer 6,0g Tris-Base, 28,8g Glycin, 430ml Methanol, 0,1 % (w/v) SDS, ad 2l mit A.bidest. TBS 25mM Tris (pH 7,5), 125mM NaCl TBS-T 25mM Tris (pH 7,5), 125mM NaCl, 0,1 % Tween-20 PBS 24g NaCl, 0,6g KCl, 3,45g Na2HPO4*7H2O, 0,6g KH2PO4, pH 7,4; ad 1l mit A.bidest. PBS-T 24g NaCl, 0,6g KCl, 3,45g Na2HPO4*7H2O, 0,6g KH2PO4, pH 7,4; ad 1l mit A.bidest, 0,01 % Tween-20 Blockierlösung 2 % (w/v) BSA in TBST, 0,05 % (w/v) NaN3 ECL 0,225mM p-Coumaratsäure, 1,25mM Luminol, 0,1M Tris-Base pH 8,5 H2O2-Lösung 30 % (v/v) Wasserstoffperoxid stripping-Puffer 0,8 % (w/v) SDS, 0,8 % (v/v)-Mercaptoethanol, 80mM Tris- HCl, pH 6,8 TMB 0.5 mM 3,3-,5,5-Tetramethylbenzidin, 0,5 % Aceton, 4,5 % Ethanol und 1mM H2O2 in 30mM Kaliumcitrat pH4,1 7.6.3.2 Lösungen und Puffer für die Proteinexpression und –aufreinigung von GST-Fusionsproteinen IPTG 100mM Isopropylthiogalactosid Lysepuffer PBS pH7.4, 2,5mM DTT, 5mM EDTA, Proteaseinhibitoren – 10µM PMSF, 5µg/ml Leupeptin, 10µg/ml Aprotenin, 10µg/ml Pefablock Waschpuffer PBS pH7.4 Elutionspuffer 50mM Tris pH8.0, 10mM GSH Dialysepuffer PBS pH7,4 (+ 10 % Glycerol) 143 Material 7.6.4 Chemikalien und Kits Acrylamid (Roth), Agar-Agar (Roth), Agarose (Roth), Antibiotika (Roth, AppliChem), APS (Roth), BSA (Roth), Ethanol (AppliChem), GC-Agar (Difco), Glycerin (Roth), Glycin (AppliChem), Harnstoff (Riedel-De-Haën), Hefeextrakt (Roth), IPTG (Roth), LY294002 (Calbiochem), Methanol (AppliChem), mounting Medium (Sigma), Natriumchlorid (AppliChem), Nucleotide (BioLabs), Paraformaldehyd (AppliChem), Saccharose (Roth), Saponin (Roth), TEMED (Roth), Tris-Base (AppliChem), Triton-X-100 (Roth), Trypton (Roth), Tween-20 (Roth), β-Mercaptoethanol (Roth), Wortmannin (Calbiochem), Natriumborhydrid (Merck), In-FusionPCR Cloning Kit (BD Bioscience), BD Creator DNA Cloning Kit (BD Bioscience), Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 7.7 Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien Autoklav (Varioklav), Brutschränke (Heraeus, Memmert), Deckgläschen/Objektträger (Knittel), Elektroblot-Apparatur (Peqlab), ELISA-Platten-Wascher (Tecan), FACS-LSRII (Becton Dickinson), FAST Slide Incubation Chamber (Whatman), Gelapparatur für SDS PAGE (Bio Rad), Geldokumentation (Bio Rad), Gelkammern für Agarosegele (Bio Rad), Glaswaren (Schott, VWR, Brand), Heizblöcke (Roth, Grant Boekel), Konfokales Fluoreszenzmikroskop SP5 (Leica), Kühl- und Gefrierschränke (Privileg), Magnetrührer (Ika), Protein Array Aldehydträgeroberflächen „Nexterion Slide AL“ (Peqlab), kontaktloser Mikroarraydrucker NanoPlotter 2.1 (GeSim), Mikroarray-Hybridisierstation HsPro400 (Tecan), Mikroarray-Scanner LS-Reloaded (Tecan), NanoDrop (Peqlab), pH-Meter (Beckman), Pipetten (Gilson), Plastikwaren (Eppendorf, Greiner, Costar), PVDF-Membranen (Millipore), Schüttler (Bühler), Spannungsgeräte (Bio Rad), Sterilbank (Heraeus), Varioskan Flash (Thermo Scientific); Thermomixer (Eppendorf), Vortexer (Ika), Wasserbäder (Memmert, Julabo), Zählkammer (Neubauer), Zentrifugen (Heraeus, Sorvall) 7.8 Software Clone Manager 9 Professional Edition for Windows (SciEd); Software für NanoPlotter 2.1 (Gesim); Array-Pro® Analyzer 4.5 (Media Cybernetics); Facs Diva 6.x (Becton Dickinson); ImageJ 1.4x Public Domain Java Image processor, (Wayne Rasband, NIH, USA); Leica LAS AF (Lite) 1.8.x 2005-2007 (Leica Microsystems CMS GmbH) 144 Methoden 8 8.1 Methoden Molekularbiologische Methoden 8.1.1 Präparation von Plasmid-DNA (nach Birnboim-Doley) Eine Impföse E.coli wurde in 300μl Puffer 1 resuspendiert. Anschließend wurden für die alkalische Lyse der Zellen 300µl Puffer 2 zugegeben und der Ansatz durch Invertieren gemischt, bis die Lösung klar wurde. Im dritten Schritt wurde die Lyselösung durch Zugabe von 300μl Puffer 3 und mehrmaliges Invertieren neutralisiert und anschließend mit 13.000rpm für 10min bei 4 °C abzentrifugiert. 800μl Überstand wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt und nach Zugabe von 560μl 100 % Isopropanol (entspricht 0,7 % Vol.) erfolgte wiederum ein 10minütiger Zentrifugationsschritt bei 13.000rpm und 4 °C. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig abgesaugt, 500μl 70 % Ethanol zum Waschen auf das Pellet gegeben und abermals für 5min mit 13.000rpm bei 4 °C zentrifugiert. Das Ethanol wurde ebenfalls vorsichtig abgesaugt. Nach einem weiteren zweiminütigen Zentrifugations- und letztem Absaugschritt wurde das Pellet bei 37 °C für ca. 10min getrocknet. Zum Schluss wurde das Pellet in 30μl TE-Puffer oder H2O resuspendiert. Sollten die Plasmide anschließend zur Transfektion von eukaryotischen Zellen oder für die Sequenzierung verwendet werden, wurden die Plasmidpräparationen mittels kommerzieller Kits (QIAprep Mini- und Midiprep Kits von Qiagen) durchgeführt. Diese Präparation beruht ebenfalls auf dem Prinzip der alkalischen Lyse der Zellen und erfolgte gemäß den Herstellerangaben. 8.1.2 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA 50 bis 100μl kompetenter Zellen wurden zu den Ligationsansätzen bzw. zu 1 bis 2μg PlasmidDNA gegeben und 30min auf Eis inkubiert. Nach 30sekündigem Hitzeschock bei 42 °C (Wasserbad) wurden 800μl LB-Medium zugegeben. Der Ansatz wurde für ca. 45 bis 60min bei 37 °C unter Schütteln inkubiert (phänotypische Expression). Anschließend wurden die Zellen 3min bei 3.000rpm in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1ml LB-Medium resuspendiert und auf entsprechenden Selektionsplatten ausplattiert. 145 Methoden 8.1.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Die PCR-Methode wurde zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten zu Klonierungszwecken, zur Kontrolle von Plasmiden und zur gerichteten Mutagenese verwendet. Die Amplifizierung für Klonierungszwecke und zur gerichteten Mutagenese erfolgte mittels der Pfu-Polymerase, die neben der 5’-3’-Polymeraseaktivität und 5’-3’-Exonukleaseaktivität zusätzlich über eine 3’-5’ Exonukleaseaktivität verfügt. Diese 3’-5’-Exonukleaseaktivität, als „proof-reading“Funktion bezeichnet, ermöglicht die Erkennung und Beseitigung von falsch eingebauten Nukleotiden und produziert Amplifikationsprodukte ohne Basenüberhang. Bei einem Gesamtvolumen von 50μl enthielten die Reaktionsansätze mit der Pfu- und/oder Taq-Polymerase folgende Komponenten: 5μl 10x Reaktionspuffer mit MgCl2, jeweils 10μM Primer (1,0μl, 10pmol/μl), ca. 5-10ng Template-DNA, 0,2mM dNTPs-Mix (1μl, 10mM) und 1,2U Pfu-Polymerase. Die PCR wurde nach der „Hot Start“-Methode durchgeführt, hierbei wird die Pfu-Polymerase erst nach einem initialen Denaturierungsschritt von ca. 2min bei 94 °C und anschließendem Abkühlen des Ansatzes auf 80 °C zugegeben. Alle PCRs wurden in Thermocyclern der Firma peqlab durchgeführt. Als erstes erfolgte für 2min eine initiale Denaturierung der DNA bei 94 °C, daran schloss sich die Amplifizierung in 30 Zyklen an, die folgende drei Schritte umfasste: I. Denaturierung für 30s bei 94 °C, II. Annealing für 30s bei 55-60 °C (je nach Schmelztemperatur der verwendeten Primer) und III. Elongation bei 72 °C, die Elongationszeit war abhängig von der Länge des zu amplifizierenden Fragments und der verwendeten Polymerase (Pfu – 500bp pro min; Taq – 1000bp pro min). 8.1.4 In-Fusion Reaktion Es wurde das In-Fusion Dry-Down Kit von Becton Dickinson verwendet. In der Anleitung des Herstellers wird ein 10µl Ansatz beschrieben. Da sich die Reaktion in der Praxis allerdings als sehr effizient erwiesen hat, wurde ein Ansatz auf 10 Reaktionen gestreckt. Das molare Verhältnis von Fragment zu Vektor sollte 2:1 betragen. Beispielsweise wurden zu 25ng eines 4kbp großen Vektors 12,5ng eines 1000bp großen Fragmentes gegeben. Nach 30min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion auf Eis gestoppt und direkt im Anschluß in E. coli transformiert. Die transformierten Bakterien wurden auf LB-Agar mit Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Klone wurden einzeln weiter gestrichen, die Plasmide am Folgetag per Mini-Präparation isoliert und überprüft. 146 Methoden 8.1.5 Cre-Lox-site spezifische Rekombination Für die Herstellung von Expressionsvektoren wurde das Clontech Creator DNA Cloning Kit verwendet. Die Rekombination mittels des 38 kDa schweren, aus dem Bakteriophagen P1 stammenden Enzyms erfolgt zielgerichtet an bestimmten DNA-Sequenzen, den sogenannten loxP-Stellen. Eine loxP-Stelle besteht aus zwei palindromischen, 13 Basen langen Sequenzen die durch ein 8 Basen langes Zwischenstück getrennt sind (ATA ACT TCG TAT A NN NNN NNN T ATA CGA AGT TAT). Die Sequenz des Zwischenstückes ist entscheidend für die Ausrichtung des Fragmentes im Akzeptorvektor. Zusätzlich enthält das aus dem Donorvektor übertragene Fragment ein Chloramphenicolresistenzgen ohne Promotor. Der Promotor für dieses Gen liegt im Akzeptorvektor. Daher konnte nach erfolgter Rekombination auf chloramphenicolresistente Klone selektiert werden, da nur korrekte Rekombinanten das benötigte Protein exprimieren sollten. Als zusätzliches, negatives Selektionsmerkmal trägt der Donorvektor das SacB Gen, welches die Sucrase von B. subtilis codiert und Träger dieses Plasmids auf saccharosehaltigem Medium im Wachstum hemmt. Die Rekombinationsreaktion wurde in 10µl Volumen bei Raumtemperatur durchgeführt. Entgegen dem Herstellerprotokoll wurden Donor- und Akzeptorvektor im Verhältnis 1:2 eingesetzt. Rekombinationsansatz: 100ng Donorvektor 200ng Akzeptorvektor 0,5µl Cre-Rekombinase 1µl 10xCre-Rekombinations-Puffer auf 10µl Aqua bidest. Nach 30min Inkubation wurde die Rekombinase, durch Erhitzen des Ansatzes auf 70 °C für 10min, inaktiviert. Nach Hitzeinaktivierung der Rekombinase wurde der Ansatz zur Transformation von kompetenten E. coli Nova-Blue verwendet. Die fertig transformierten Bakterien wurden auf LB-Agar, der 7 % Saccharose und 30µg/ml Chloramphenicol enthielt, ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die gewachsenen Klone auf LB-Platten mit geeignetem Antibiotikum (Resistenz auf Akzeptorvektor) weitergestrichen. Nach erneuter Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden die Plasmide gut angewachsener Klone per Mini-Präparation isoliert und in einem ersten Überprüfungsschritt mittels analytischer Gelelektrophorese auf die korrekte Größe hin untersucht. Plasmide die eine korrekte Größe aufwiesen, wurden durch Restriktionsanalysen weiter überprüft. Klone, deren Plasmide alle Testkriterien erfüllten, wurden weitergestrichen um am nächsten Tag bei 147 Methoden -80 °C eingefroren. Nach einer Plasmidisolierung im größeren Maßstab (Midi-Präparation) konnte das Plasmid zur Transfektion eukaryotischer Zellen eingesetzt werden. Als finale Kontrolle erfolgte die Überprüfung auf Expression des Proteins mittels Fluoreszenzmikroskopie (im Falle von GFP/RFP Fusionsproteinen) sowie Kontrolle auf Expression und korrekte Größe durch SDS-PAGE mit anschließendem Western-Blot. 8.1.6 Restriktionsverdau Für die Klonierung wurde die DNA mittels Restriktionsendonukleasen geschnitten. Dafür wurden 5-10µg DNA, 1-1,5µl 10xReaktionspuffer (entsprechend den verwendeten Reaktionsenzym/en) und 4Units bzw. je 2Units Restriktionsenzym im Fall eines Doppelverdaus in 10 oder 15µl Gesamtvolumen aufgenommen und für 2-4 h bei 37 °C inkubiert. Falls notwendig wurden die Restriktionsenzyme anschließend für 20min bei 85 °C hitzeinaktiviert. 8.1.7 Ligation Bei Ligationen über „sticky ends“ enthielt ein Ansatz mit einem Volumen von 10μl 10fmol Plasmid-DNA, 1μl Ligase-Puffer, 1µl T4-DNA-Ligase und 50-100fmol Insert-DNA. Zuvor wurde die Insert-DNA (Fragmente nach Restriktionsverdau) aus Agarosegelen extrahiert. Alle Ligationen wurden entweder für 2-3h bei 37 °C oder über Nacht bei 16 °C durchgeführt und anschließend zur Transformation von chemokompetenten Bakterien verwendet. 8.1.8 Agarosegelelektrophorese Die Konzentrationen der Agarosegele zur Auftrennung von DNA nach PCR bzw. Restriktionsverdau wurden, abhängig von der Größe der DNA-Fragmente zwischen 0,7 % (>5000bp) und 2 % (<500bp) gewählt. Die entsprechende Menge Agarose wurde in 100ml TAE-Puffer in der Mikrowelle durch Aufkochen gelöst. Nach dem Abkühlen wurde die Agaroselösung in horizontale Plexiglasschlitten gegossen. Die Proben wurden vor dem Auftragen mit GEBS-Puffer versetzt. Die Auftrennung der DNAProben erfolgte bei 90mA in einer mit TAE-Puffer gefüllten Elektrophoresekammer. Anschließend wurde das Gel in einer 0,3%igen Ethidiumbromidlösung gefärbt und die DNABanden mittels UV-Licht detektiert. 148 Methoden 8.1.9 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Die Extraktion von DNA aus Agarosegelen (u. a. zur Reinigung der durch PCR amplifizierten oder durch Restriktionsverdau ausgeschnittenen Fragmente) wurde mit dem „QIA quick gel extraction“-Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Menge und Reinheit des aufgereinigten DNA-Fragments wurde im Anschluss mittels NanoDrop gemessen und mittels Agarosegelelektrophorese visuell überprüft. 8.1.10 Präparation von RNA Die Extraktion von RNA aus eukaryotischen Zellen erfolgt mittels peqGold TriFast der Firma PEQLAB entsprechend den Herstellerangaben. Bei allen Arbeitsschritten wurden ausschließlich RNase-freie Materialien (Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen, Wasser) verwendet. 8.1.11 Reverse Transkription Das Umschreiben von RNA in cDNA wird als reverse Transkription bezeichnet erfolgt mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase aus dem Murine Leukemia Virus (M-MuLV). Analog zu der PCR müssen auch bei der reversen Transkription Primer verwendet werden, die das einzelsträngige RNA-Template binden und somit als Ansatzpunkt für die Polyermisierungsreaktion fungieren. Da mRNA an ihrem 3’-Ende eine polyadenyliert ist, wurden Desoxythymidin-Oligonukleotide (Oligo-dTs) als Primer verwendet. Auch können spezifische Primer eingesetzt werden, um gezielt ein Transkript zu isolieren. Ein Reaktionsansatz von 20 µl beinhaltete: 1-2 µg RNA 1x M-MuLV-Reaktionspuffer 1 mM dNTP-Mix 20 nmol Oligo-dT-Nukleotide 20 U RibuLockTM-RNase-Inhibitor 20 U M-MuLV Reversetranskriptase RNase-freies Wasser Der Reaktionsansatz wurde für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Danach wurde die Reverse Transkriptase für 10 min bei 70 °C inaktiviert. Anschließend wurde der Ansatz direkt verwendet oder bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. 149 Methoden 8.2 Biochemische Methoden 8.2.1 SDS-Gelelektrophorese Es wurden standardmäßig 8×6×0,15cm 8 %, 10 %, 12,5 % und 15 % Polyacrylamidgele verwendet. Das Trenngel hatte dabei folgende Zusammensetzung: 8, 10, 12,5 bzw. 15 % Acrylamidlösung, 375mM Tris-HCl pH8.8, 0,1 % SDS, 0,1 % APS und 5μl TEMED mit H2O auf 10ml aufgefüllt. Das Sammelgel wiederum wurde wie folgt angesetzt: 4 % Acrylamidlösung, 130mM Tris-HCl pH 6.8, 0,1 % SDS, 0,1 % APS und 2,5μl TEMED mit H2O auf 6,5ml aufgefüllt. Die Polymerisationsreaktion wurde durch die Zugabe des TEMED gestartet. Die Proben wurden in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen und unmittelbar vor dem Auftragen auf das Gel 5min bei 95 °C gekocht. Die Gelelektrophorese wurde bei einer Spannung von 100-120V (konstant) und einer Stromstärke von 25mA durchgeführt. 8.2.2 Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen Die Gele wurden für 30-60min in Färbelösung unter Schütteln inkubiert und anschließend in der Entfärbelösung entfärbt. 8.2.3 Western Blot Der Transfer der Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine PVDF-Membran erfolgte durch die Semi-dry-Methode. Bei diesem Verfahren wurden drei mit Anodenpuffer getränkte Filterpapiere und die mit Methanol aktivierte PVDF-Membran übereinander auf eine Graphitanode gelegt. Auf die Membran wurden das mit Kathodenpuffer befeuchtete Gel und drei weitere, mit Kathodenpuffer getränkte Filterpapiere geschichtet. Nach der Entfernung von Luftblasen zwischen Filterpapier, Gel und Membran wurde die Graphitkathode aufgelegt und der Transfer für 1–1,5 Stunden bei einer konstanten Stromstärke von 0,7mA pro cm2 Gelfläche durchgeführt. Nach dem Transfer der Proteine auf die Membran wurde diese mit Färbelösung zur Kontrolle des Transfers und zum Einzeichnen der Markerbanden angefärbt und anschließend wieder mit Entfärber wieder entfärbt. 150 Methoden 8.2.3.1 Immundetektion von Proteinen Nach dem Transfer der Proteine wurde die PVDF-Membran für 1h bei RT bzw. über Nacht bei 4 °C zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen in Blockierlösung inkubiert. Danach wurde die Membran 3 × 10min mit TBS-T gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper (siehe 4.5.1 Antikörper) ca. 1h bei RT oder über Nacht bei 4 °C. Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper wurde die Membran erneut 3 x 10min in TBS-T gewaschen und anschließend mit dem sekundären AK ca. 1h bei RT inkubiert. Als Sekundärantikörper wurde ein mit Meerrettichperoxidase gekoppelter Ziege-anti-Maus (siehe 7.5.1 Antikörper) verwendet. Der sekundäre AK wurde in der Verdünnung 1:3.000 in TBS-T eingesetzt. Nach dem Waschen der Membran wurde der Blot kurz mit ECL-Lösung inkubiert. Zur Detektion der Lumineszenz wurde die Membran einem Röntgenfilm exponiert, welcher abhängig von der Signalstärke für wenige Sekunden bis zu mehreren Minuten aufgelegt wurde. 8.2.3.2 Strippen von PVDF-Membranen Durch Inkubation der Membran in „stripping“-Puffer für 1 min bei 70 °C wurde die Membran von gebundenem Antikörper befreit. Im Anschluss wurde die Membran durch erneutes Blockieren mit einem weiteren Primärantikörper inkubiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion von verschiedenen Proteinen innerhalb derselben Ausgangsprobe. 8.2.4 Peptid-Bindeexperiment Die für dieses Experiment verwendeten Peptid-Membranstreifen wurden von Dr. Ronald Frank (Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig, Forschungsgruppe Chemische Biologie) hergestellt. Die Membranstreifen mit den synthetisierten Peptiden wurden mit Blockierlösung (ein Volumenteil Sigma-Aldrich Casein-basierter Blockierpuffer, vier Volumenteile TBS mit 0,005 % Tween und 5 % Saccharose) für 16 h bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Membranen mit der zu untersuchenden GST-SH2 Domäne oder GST in Blockierlösung für 16 h bei 4 °C inkubiert. Nach drei 15minütigen Waschschritten in TBS-T wurde das GST mittels anti-GST Primärantikörper, gefolgt von einem HRPgekoppelten Sekundärantikörper detektiert und durch die ECL-Reaktion visualisiert (vgl. (Schmitter et al. 2007a)). 151 Methoden 8.2.5 Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Bakterien 8.2.5.1 Expression rekombinanter Proteine 1000ml LB-Medium mit Antibiotikum (abhängig von Bakterienstamm und Plasmid) wurden mit 25ml Übernachtkultur (gleiches Medium) angeimpft und für ca. 4h unter Schütteln (ca. 220 bis 250rpm) bei 30 °C bis zur OD580 von 0,6 bis 0,7 (Ende der logarithmischen Phase) inkubiert. Anschließend wurde die Proteinexpression mit 500µM IPTG induziert Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 30 °C unter Schütteln. Bei Konstrukten, die eine starke Degradation der Fusionsproteine aufwiesen, wurde die Proteinexpression auf 1,5 bis max. 2 Stunden verringert. Anschließend wurde die Bakterienkultur abzentrifugiert und das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. 8.2.5.2 Reinigung von GST-Fusionsproteinen Das Bakterienpellet wurden in 20ml Lysepuffer (1×PBS pH7.4, 2,5mM DTT, 5mM EDTA, Proteaseinhibitoren – 10µM PMSF, 5µg/ml Leupeptin, 10µg/ml Aprotenin, 10µg/ml Pefablock) resuspendiert. Anschließend wurde der Ansatz auf Eis für 2 × 2min mit Ultraschall aufgeschlossen. Das erhaltene Zelllysat wurde 60min bei 16.000 rpm (SS34-Rotor) abzentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45µm filtriert. Im Folgenden wurde das geklärte Lysat auf eine 1ml (bed volume) GS-TrapFF Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,1ml aufgetragen. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule für 1h bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3ml/min mit Puffer A (PBS pH7,4) gewaschen. Anschließend wurde das an die Säule gebundene Protein mittels eines Gradienten von 0 % bis 100 % Puffer B (50mM Tris pH8.0, 10mM GSH) und einer Fließgeschwindigkeit von 0,3ml/min eluiert. Das Eluat wurde mit Hilfe des Fraktionssammlers in Reagenzgläser aufgefangen (10min/pro Fraktion entspricht etwa 3ml). Die einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS-Page und anschließender Coomassie-Färbung auf Proteingehalt überprüft. Die Fraktionen, welche das gereinigte Protein enthielten, wurden vereinigt und in einen Dialyseschlauch überführt. Die Dialyse erfolgte für mindestens 4 x 3 Stunden in je 2 l PBS. Dabei wurde dem PBS beim letzten Dialyseschritt 10 % Glycerol zugesetzt. Nach der Dialyse wurden die Proteinlösungen aliquotiert, im flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert. 152 Methoden 8.2.6 Analyse von Protein Interaktionen mittels ELISA In einem ersten Schritt wurden die GST-Fusionsproteine oder GST in dreifacher Ausführung in den einzelnen Vertiefungen einer ELISA-Platte immoblisiert. Dazu wurden die Proteine in 50 mM Na-Bicarbonat pH9.0 aufgenommen, so dass die Konzentration 20 ng/µl betrug. Davon wurden je 50 μl/pro Vertiefung der ELISA-Platten gegeben und für 5 Stunden oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Immobilisierung der Proteine an die Plastikoberfläche wurde die Lösung wieder von der ELISA-Platte abgesaugt und 480μl Blockierlösung (2 % BSA in PBS-T) pro Vertiefung zugegeben. Das Blockieren der ELISAPlatten erfolgte für 2Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurde die Blockierlösung abgesaugt und die Platten 3-mal mit PBS-T gewaschen. Danach erfolgte die Übernachtinkubation der imoblisierten GST-Fusionsproteine mit verdünnten Ganzzellysaten bei 4 °C. Dazu wurden die Zelllysate in PBS-T (versetzt mit Proteaseinhibitoren und Natriumorthovanadat) auf eine Proteinendkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt. Danach wurden die Platten 3-mal mit PBS-T gewaschen und 50 μl des monoklonaler Maus-anti-HA Antikörper (1:2000 in PBS-T + 2 %BSA) pro Vertiefung zugegeben. Nach 1stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten 3-mal mit PBS-T gewaschen und pro Vertiefung 50 μl Ziege-anti-Maus-IgG (gekoppelt mit Merrettichperoxidase) (1:10.000 in PBS-T) zugegeben. Die Inkubation mit dem Zweitantikörper erfolgte ebenfalls 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Platten erneut 4-mal mit PBS-T gewaschen, 50 μl/well 3,3’,5’5-Tetramethylbenzidine (TMB) zugegeben und 5 bis 15min, je nach Stärke der Reaktion, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl 1 N H2SO4 gestoppt. Die Absorption wurde bei 450 nm mittels des Varioskan Flash der Firma Thermo Scientific gemessen. 8.2.7 Pull down Experimente mittels GST-Fusionsproteinen Für die GST-pull-down Experimente wurden 5 µg gereinigtes GST-Fusionsprotein oder GST mit 100 µl 50%iger Glutathion-Sepharose (in PBS) versetzt und für 4 Stunden bei 4 °C rotierend inkubiert. Anschließend wurde die Sepharose 3-mal mit PBS-T gewaschen (Zentrifugation für 1min bei 4 °C und 2000xg). Das Sepharosepellet wurde im gleichen Volumen PBS resuspendiert und mit 750 µl geklärtem Zelllysat der HEK293T Zellen inkubiert. Für die Zelllysate wurden die HEK293T Zellen 48 Stunden vorher mit den entsprechenden Plasmidkonstrukten kotransfiziert. 153 Diese Plasmidkonstrukte waren Methoden Leervektoren, kodierend für GFP oder kodierten für CEACAM3, CEACAM4 oder v-Src. Die pull-down Proben wurden für 4 Stunden oder über Nacht bei 4 °C unter ständiger Rotation inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze 4-mal mit PBS-T gewaschen (Zentrifugation für 1min bei 4 °C und 2000xg). Das Präzipitat wurde in SDS-Probenpuffer aufgenommen, aufgekocht und mittels Gelelektrophorese, gefolgt von Western Blot Analyse untersucht. 8.2.8 Phosphorylierung von Proteinen in vitro Alle Phosphorylierungen erfolgten im P-Puffer (20mM TEA-HCl pH7.5, 5mM MgCl2, 0,24mM Vanadat, 0,16mM Molybdat). Der Reaktionsansatz enthielt 10 – 20μg rekombinantes Protein, 20μl P-Puffer, 2μl ATP (100mM), 6 μl Kinase und wurde mit H2Odest auf ein Gesamtvolumen von 120µl aufgefüllt. Als Kontrollen dienten Ansätze, welche keine Kinase bzw. kein rekombinantes Protein enthielten. Die Phosphorylierungsreaktion wurde durch die Zugabe der jeweiligen Kinase gestartet und für 30min bei 30 °C inkubiert. Zum Stoppen der Reaktion wurde der Phosphorylierungsansatz mit 1mM EDTA in PBS auf eine Proteinkonzentration von 20ng/µl verdünnt. Für den Nachweis der Proteinphosphorylierung mittels Western-Blot wurde vor dem Abstoppen der Phosphorylierungsrekation ein 20µl Aliquot des Ansatzes in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen, für 5min bei 95 °C inkubiert, auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und auf eine PVDF-Membran transferiert. Das phosphorylierte Protein wurde mittels monoklonalem anti-Phosphotyrosin-Antikörper nachgewiesen. 8.3 Herstellung und Beprobung von Protein Arrays Die zu immobilisierenden Proteine (GST oder GST-SH2 Domänen) wurden mittels Immobilisierungspuffer (PBS, 10 % Glycerol) auf eine Konzentration von 0,173µg/µl eingestellt. Jeweils 50µl dieser verdünnten Proteinlösung wurden in eine Vertiefung einer 96well Platte überführt. Vor dem Drucken der Proteine wurden mittels Zentrifugation (ELISAPlattenhalter, 4000rpm, 2min, 4 °C) alle Luftblasen aus den Ansätzen entfernt. Das Drucken der Proteine auf einen aldehydbeschichteten Objektträger erfolgte mittels des NanoPlotter 2.1 bei einer Luftfeuchtigkeit von 70 %, die 96-well Platte mit den Proteinlösungen wurde auf 4 °C gekühlt. Der Objektträger blieb ungekühlt, um die Bildung von Kondensationswasser auf der Oberfläche zu vermeiden. Zum Drucken der Proteine wurde die Nadel #16335 verwendet. Pro Spot wurden 15 Tropfen mit einem Volumen von 0,5nl/Tropfen gedruckt. Um für die Nadel #16335 das Tropfenvolumen von 0,5nl/Tropfen zu gewährleisten, wurde die Pumpe auf 154 Methoden die Pulsstärke 50µs, Frequenz 100Hz und Spannung 70V eingestellt. Durch diese Einstellungen wurde 1,3 ng Protein pro Spot auf die aldehydbeschichtete Oberfläche des Objektträgers gedruckt. Nach abgeschlossenem Druckvorgang wurde der Protein Array noch für 1h bei Raumtemperatur und einer Luftfeuchtigkeit von 70 % inkubiert. Anschließend wurden alle noch freien Aldehydgruppen der Oberfläche reduziert. Dies erfolgte durch 20minütiger Inkubation des Protein Arrays in 0,25 % Natriumborhydrid in PBS. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-T wurde der Protein Array in die FAST Slide Incubation Chamber eingespannt und die einzelnen Arrays mit rekombinantem Protein oder Zelllysat beprobt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-T wurden die einzelnen Arrays mit spezifischem Primärantikörper für 1h bei 4 °C inkubiert. Die Inkubation mit dem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper erfolgte ebenfalls für 1h bei RT. Sowohl vor als auch nach der Sekundärantikörper Inkubation wurden die Arrays jeweils 3x mit PBS-T gewaschen. Zum Abschluss wurde der gesamte Objektträger nochmals 2x mit PBS gewaschen, um eventuell anhaftendes Tween restlos zu entfernen, da dieses beim Auslesen der Signale störend wirkt. Nach diesem letzten Waschschritt wurde der Objektträger durch Zentrifiugation (4000rpm, 2min, RT) getrocknet. Das Auslesen der Fluoreszenzsignale erfolgte mittels des Mikroarray-Scanner LS-Reloaded der Firma Tecan. Die Intensitäten der Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung der Array-Pro® Analyzer 4.5 Software bestimmt. Um die Fluoreszenzsignale mehrerer Messungen zu verrechnen und grafisch darstellen zu können wurden die Nettobindungssignale in Abhängigkeit der Phosphorylierung bzw. die relativen Nettobindungssignale in Abhängigkeit der Phosphorylierung berechnet. Das jeweilige Nettobindungssignal (NBS) in Abhängigkeit der Phosphorylierung berechnet sich durch Subtraktion des gemittelten NBS des jeweiligen unphosphorylierten Ansatzes vom NBS des jeweiligen phosphorylierten Ansatzes, dividiert durch den Quotienten aus dem gemittelten NBS des jeweiligen immobilisierten GST-Proteins und dem gemittelten NBS aller immobilisierten GST-Proteine. Die so erhaltenen Einzelwerte wurden in Relationswerte umgerechnet. Der hierfür verwendete Referenzwert war entweder die das höchste Singal liefernde SH2 Domäne oder das Signal eines als interner Standard immobilisierten Proteins. 155 Methoden 8.4 Zellbiologische Methoden 8.4.1 Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Kopräzipitation Die gewünschte Menge DNA (1-10µg pro 10cm Schale 293T-Zellen) wurde in 500µl steriles, bidestilliertes Wasser pipettiert. Die eingesetzte DNA stammte für gewöhnlich aus MidiPräparationen. Nach Zugabe von 500µl kaltem 2xHBS wurde unter ständigem Schütteln (Vortexer) 50µl sterile 2,5M CaCl2-Lösung tropfenweise zugegeben. Der Ansatz wurde für 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurde der zu transfizierenden Zellkulturschale 25µM Chloroquin zugegeben und die Schale bis zum Ende der Inkubationszeit wieder im Brutschrank aufbewahrt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Transfektionsansatz tropfenweise, vorsichtig und flächig über die Zellen verteilt. Nach 6-8 Stunden Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 wurde das Medium gegen frisches Zellkulturmedium ausgetauscht und die Zellen weitere 12-20 Stunden inkubiert. 8.4.2 Herstellung von Zelllysaten Um die in den transfizierten Zellen exprimierten Proteine für pull-down und Protein Array Experimente zu verwenden, mussten diese zuvor aus den Zellen freigesetzt werden. Zunächst wurde das Medium von den Zellen abgenommen und die Zellen 2x mit PBS gewaschen, um möglichst alle Mediumsreste zu entfernen, welche vor allem bei den Protein Array Experimenten störend sind. Die Lyse der Zellen einer konfluenten 10cm Schale erfolgte in RIPA-Puffer oder Tritonpuffer. Die dabei verwendete Puffermenge war abhängig von der vorgesehenen Verwendung der Lysate. Zellen, welche für pull-down Experimente verwendet werden sollten, wurden in 1ml RIPA-Puffer lysiert, während Zellen zur Verwendung in Protein Array Experimenten in 300µl Tritonpuffer lysiert wurden. Für Lysate, die der Expressionskontrolle dienten, wurden 1x106 Zellen in einer 6cm Zellkulturschale in 300µl RIPA Puffer lysiert. Das zähflüssige Lysat wurde mittels eines Zellschabers am Rand der Schale gesammelt und mit einer 1ml Spritze samt Einwegkanüle aufgenommen und in ein 1,5ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Um die im Lysat enthaltene DNA mechanisch zu zerstören („scheren“) wurde das Lysat mehrmals durch die Kanüle aufgesogen und ausgeblasen. Es wurden nun 100µl einer Suspension von Sepharose in Triton-Puffer zugegeben, die DNA und andere störende Zellreste bindet. Die Sepharose156 Methoden Kügelchen wurden nach mindestens fünfminütiger Koinkubation unter ständigem Invertieren durch 15 minütige Zentrifugation pelletiert. 100-200µl des Überstandes wurden in ein frisches 1,5ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und mit der gleichen Menge 2xSample Buffer versetzt, bei 95 °C aufgekocht und mittels Western-Blot analysiert. Lysate für Pull-down und Protein Array Experimente sowie Immunpräzipitationen wurden aus konfluenten 10cm Schalen angefertigt. Zum Lysieren wurde 1ml Puffer verwendet. Nach Lyse der Zellen und Klärung des Lysates durch Koinkubation mit Sepharosekügelchen wurde der Überstand aliquotiert und bei -80 °C eingefroren. Ein Aliquot wurde zur Expressionskontrolle mittels Western Blot verwendet. 8.4.3 FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) 1x106 Zellen wurden in 6cm Schalen gesplittet und über Nacht inkubiert. Am Folgetag wurde das Medium abgenommen und die Zellen mittels Trypsin aus den Schalen gelöst. Die Zellen wurden dann für 3min bei 2000 rpm, 4 °C in einer Tischzentrifuge pelletiert und das Zellpellet anschließend 2x in 1ml FACS-Puffer (1 % hitzeinaktiviertes (F)CS in PBS) gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Proben auf jeweils zwei FACS-Probenröhrchen verteilt und bis zur Messung auf Eis abgedunkelt gelagert. 8.4.4 Rezeptorfärbung für FACS Zur quantitativen Kontrolle der Expression von Oberflächenproteinen konnten diese mittels Antikörpern fluoreszenzmarkiert werden. Wie unter 8.4.3 beschrieben wurden die Zellen aus der Schale gelöst, allerdings wurde hierfür das eingesetzte Trypsin 1:5 in PBS verdünnt, um die exponierten Proteine möglichst zu schonen. Nach zweimaligem Waschen in 1ml FACS-Puffer wurden die Zellen in 300µl FACS-Puffer resuspendiert. Zu dieser Suspension wurde der entsprechende Antikörper gegen das nachzuweisende Protein (hier CD66acde der CEACAM1,3,5 und 6 erkennt) 1:200 hinzugegeben und 30 Minuten bei 4 °C unter ständigem Invertieren inkubiert. Danach wurden die Zellen 3x in FACS-Puffer gewaschen und erneut in 300µl FACS-Puffer resuspendiert. Der Cy2-markierte Sekundärantikörper wurde ebenfalls 1:200 eingesetzt und auch für 30 Minuten unter ständigem Invertieren bei 4 °C mit den Zellen inkubiert. Abschließend wurden die Zellen 3x gewaschen, in FACS-Probenröhrchen überführt und bis zur Messung auf Eis und abgedunkelt gelagert. 157 Methoden 8.5 Herstellung stabiler shRNA-Zelllinien 8.5.1 Klonierung von shRNA in den lentiviralen Vektor pLKO.1 Ein Reaktionsansatz für die Annealingreaktion der shRNA-Oligonukleotide enthielt: 1μl shRNA-sense Oligonukleotid (100μM Stammlösung), 1µl shRNA-antisense Oligonukleotid (100μM Stammlösung), 5μl NEB-Puffer 2 43 μl ddH2O. Die Annealingreaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 °C 4 min 24 Zyklen beginnend bei 94 °C, 1 min (pro Zyklus -1 °C) 70 °C 10 min herunterkühlen des Ansatzes von 70 °C auf 4 °C (Temperaturabsenkung -0,1 °C pro min) Der lentivirale Vektor pLKO.1 wurde mittels der Enzyme AgeI und EcoRI über Nacht bei 37 °C verdaut. Anschließend wurden 3-5µg des linearisierten Vektors für 30min bei 37 °C dephosphoryliert. Die Inaktivierung der Phosphatase erfolgte für 10min bei 65 °C. Für die Ligation des linearisierten, dephosphorylierten Vektors mit dem shRNA-Insert wurden 1µl verdauter pLKO.1 (ca. 100ng) mit 1µl shRNA-Insert, 1µl T4 Ligase, 1µl T4 Ligasepuffer und 6µl ddH2O für 4h bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden E.coli Nova Blue mit dem Ligationsansatz transformiert und die Bakterein auf Ampicillin-haltigem Medium ausplattiert. Nach 12h wurden die Klone mittels Agarosegelelektrophorese, PCR und anschließender Sequenzierung überprüft. 8.5.2 Produktion lentiviraler Partikel HEK293T Zellen wurden mit 13 μg pLKO.1 (mit der gewünschten shRNA), 7μg pMD2.G und 10 μg psPAX2 transfiziert. Nach 6h wurde das Medium gegen 6ml DMEM (mit 10 % CS und 10 % Penicillin/Streptomycin) ausgetauscht. Nach 72h wurde der Viren-enthaltende Überstand abgenommen, bei 2000rpm und 4 °C für 7min zentrifugiert. Anschließend wurde der geklärte Überstand durch einen Filter mit der Porengröße von 0,45 µm sterilfiltriert. Die Überstände wurden aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. 158 Methoden 8.5.3 Transduktion von Zellen mit lentiviralen Partikeln Vor der Transduktion wurden 2x106 Zellen in einer 10cm Schale ausgesät. Nach 12h wurden tropfenweise 1ml des lentiviralen Überstandes auf die Zellen gegeben. Der verwendete Vektor pLKO.1 trägt eine Resistenzkassette für Puromycin, welche stabil in das Genom der Wirtszelle integriert, was die Selektion stabil transduzierter Zellen mittels Puromycin ermöglicht. 24 Stunden nach der Transduktion wurde das Medium gegen 10ml frisches Medium mit 1,0 µg/ml Puromycin ausgetauscht. In der Folge überlebten nur die transduzierten Zellen und nach 4-5 Tagen wurden die überlebenden Zellen mittels Western Blot auf unterdrückte Expression des Proteins, gegen die sich die eingefügte shRNA richtet, überprüft 8.6 Infektionsexperimente 8.6.1 Kultivierung von Neisserien Neisseria gonorrhoeae wurde auf GC-Agar kultiviert. Die verwendeten Stämme besitzen spezifische Resistenzen gegen Erythromycin und Chloramphenicol auf dem das rekombinante Opa-Gen tragenden Plasmid. Neisseria gonorrhoeae wurde zwei Tage vor dem Infektionsexperiment aus einer -80 °C Kultur dünn auf GC-Platten mit Antibiotika ausgestrichen. Am folgenden Tag wurden lichtmikroskopisch ein bis zwei Opa Protein exprimierende Kolonien selektioniert und flächig auf GC-Agarplatten (ohne Antibiotikum) ausgestrichen, um eine ausreichende Menge Gonokokken zur Infektion zur Verfügung zu haben. Zum Einsatz für Infektionsexperimente wurden die Bakterien von der Agarplatte abgenommen und in PBS suspendiert. 8.6.2 Beschichten von Platten für den Gentamicin-Protektions Assay Jedes Well der 24-well Platte wurde mit 400µl einer 5µg/ml Fibronektin und 10µg/ml PolyLysin in PBS gefüllt und entweder bei +37 °C für 1-2 Stunden oder über Nacht bei +4 °C inkubiert. 8.6.3 Gentamicin-Protektions Assay 5x105 transfizierte 293T-Zellen wurden pro Well einer 24-Well-Platte eingesät. In eine weitere 6cm Zellkulturschale wurden 1x106 159 Zellen ausgesät, um Lysate zur Methoden Expressionskontrolle herstellen zu können. Die Zellen wurden über Nacht in DMEM+10 % CS bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Bakterien wurden von der Agarplatte abgenommen und in PBS suspendiert. Die optische Dichte wurde bei 550nm bestimmt und 1x107 Bakterien pro Well zur Infektion eingesetzt, was einer multiplicity of infection (MOI) von 20 entsprach. Nach 60min Infektionszeit bei 37 °C 5 % CO2 wurde das Medium abgenommen und durch DMEM+10 % CS ersetzt, welches 50µg Gentamicin pro Milliliter enthielt. Die Gentamycinbehandlung wurde für 45min unter Inkubation zu vorgenannten Bedingungen aufrechterhalten, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Anschließend wurde das Medium restlos abgenommen und die Zellen in genau 1ml 1 % Saponin in PBS lysiert. Hierfür wurde 1ml der steril filtrierten Saponinlösung mit einer Eppendorf-Pipette in die Vertiefung pipettiert und die Zellen zusätzlich durch mehrfaches Aufsaugen und Ausblasen der Lösung auch mechanisch zerstört. Nach 15min Inkubation wurde das Lysat nochmals homogenisiert und anschliessend eine Verdünnungsreihe erstellt. Von den Verdünnungsstufen 1:100 und 1:1000 wurden standardmäßig je zweimal 20µl auf einer GC-Agarplatte ausplattiert. Je nach Experiment wurden auch andere Verdünnungsstufen zusätzlich verwendet. 8.6.4 Markierung von Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoffen Um Bakterien mittels CSFE für den späteren Nachweis via Mikroskopie anzufärben, wurde 1ml einer Bakteriensuspension mit 0,2µ/ml CSFE in PBS versetzt und 20min bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Danach wurde überschüssiger Farbstoff durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. 8.6.5 Beschichten von Deckgläsern für Konfokalmikroskopie Jedes Well einer 24-well Platte wurde mit einem Deckgläschen bestückt und mit 500µl einer Lösung von 10µg/ml Poly-Lysin und 5µg/ml Fibronektin in PBS bedeckt. Die Inkubation erfolgte für 1-2 Stunden bei 37 °C oder bei 4 °C über Nacht. 8.6.6 Herstellung von Präparaten für Konfokalmikroskopie In eine 24-well Platte wurden 5x104-1x105 293T Zellen pro well transfiziert mit Fluoreszenzfusionierten Proteinen eingesät. In jedem well befand sich ein beschichtetes Deckglas. Die Zellen wurden über Nacht in DMEM+10 % CS bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Am 160 Methoden nächsten Tag erfolgte die Infektion mit einer MOI von 50. Vor der Infektion wurden die Bakterien mit CSFE gefärbt (siehe 8.6.4). Die Infektionszeit betrug 60min. Im Anschluss wurde das Medium abgenommen und die Zellen einmal mit PBS++ gewaschen. Nach 30 minütiger Fixierung in 350µl 4 % PFA wurden die Zellen zweimal mit PBS++ gewaschen. Die Deckgläser wurden nun mit einem Tropfen mounting medium (Sigma) versehen und mit der Zellseite nach unten auf einen Objektträger aufgebracht. Überschüssiges Medium wurde abgesaugt und das Präparat mit Nagellack luftdicht umschlossen. Die Lagerung erfolgt bei +4 °C bis zur Betrachtung am Fluoreszenzmikroskop. 8.6.7 FACS-Invasionsassay Für den FACS-Invasionsassay wurden 1x106 am Vortag transfizierte Zellen in einer 6-well Schale ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit CSFE-gefärbten Bakterien (MOI von 50) infiziert und für 1h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 1x mit PBS gewaschen, abtrypsinisiert und wie unter 8.4.3 beschrieben für die FACSAnalyse vorbereitet. Um nur die intrazellulären Bakterien zu messen, wurde die Fluoreszenz der extrazellulären Bakterien mittels Trypanblau gequencht. Dazu wurden die Proben direkt vor der Messung mit Trypanblau im Verhältnis 1:1 versetzt. Die Fluoreszenzintensität ist dabei proportional zur Anzahl intrazellulärer Bakterien. 8.6.8 Aufreinigung von Granulozyten aus humanem Blut Für die Isolierung primärer Granulozyten wurden 20-25 ml frisches humanes Blut mit 3 ml 3,8%iger Citratlösung versetzt. Anschließend wurde das Blut im gleichen Volumen PBS verdünnt. Um die unterschiedlichen Blutbestandteile zu separieren, wurden 15 ml Ficoll mit jeweils 10 ml verdünntem Blut überschichtet. Zur Separierung der Blutbestandteile wurden die Ansätze für 40min bei 460xg ohne Bremse bei 20 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation befanden sich die Granulozyten, zusammen mit den Erythrozyten am Boden des Gefäßes. Die darüberliegenden Schichten konnten nun entfernt werden. Um die Granulozyten von den Erythrozyten abzutrennen, wurde die Lösung mit dem doppelten Volumen an PVA/NaCl-Lösung (1 % PVA 7200 in 0,9 % NaCl) versetzt und 30min bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation sanken die Erythrozyten auf den Grund des Gefäßes ab, die Granulozyten verblieben im Überstand. Die Granulozyten wurden anschließend aus dem Überstand pelletiert. Dafür wurde der Überstand bei 20 °C für 20min bei 300xg, ohne Bremse zentrifugiert. Um die Granulozyten von den noch verbliebenen 161 Methoden Erythrozyten zu säubern, wurde das Pellet zügig in 5 ml A. bidest resuspendiert und unter leichtem Schütteln für 40 Sekunden inkubiert. Dies bewirkte die osmotische Lyse der restlichen Erythrozyten. Anschließend wurde durch die Zugabe von 5 ml 5xPBS wieder eine physiologische Salzkonzentration hergestellt. Die Granulozyten wurden nochmals bei Raumtemperatur für 20min bei 200xg ohne Bremse abzentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in dem für weitere Experimente vorgesehenen Puffer resuspendiert und die Zellzahl ausgezählt. Bis zur Weiterverarbeitung wurden die Zellen auf Eis gelagert. 8.6.9 Bakterien-Degradations Assay Dieser Assay wurde in einem speziellen Phagozytosepuffer durchgeführt. Dieser Puffer bestand aus 1 x PBS versetzt mit 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 5 mM Glukose und 1 % hitze-inaktiviertem FCS. Es wurden 5 x 105 Granulozyten in Phagozytosepuffer aufgenommen und mit 5 x 105 Bakterien für 60 und 240min inkubiert. Die Inkubation erfolgte unter ständigem Rotieren bei 37 °C in der An- oder Abwesenheit von spezifischen Inhibitoren. Anschließend wurden die Ansätze für 3min bei 800xg abzentrifugiert und die pelletierten Zellen in 1xSDS Probenpuffer resuspendiert. Anschließend wurden die Proben ohne zeitliche Verzögerung mittels Gelelektrophorese und Western Blot Analyse untersucht. 8.6.10 Quantifizierung der Phagozytoserate von humanen Granulozyten Die Phagozytoserate wurde mitteles Durchflusszytometrie unter Verwendung von Trypanblau ermittelt (Pils et al. 2006). Hierfür wurden 1 x 106 frische, isolierte Granulozyten in 1 ml Phagozytosepuffer (siehe 6.5.9) resuspendiert und für 30min bei 37 °C in An- oder Abwesenheit spezifischer Inhibitoren inkubiert. Anschließend wurden die Granulozyten mit 2 x 107 CSFE-markierten Bakterien für 15-30min bei 37 °C inkubiert. Die Phagozytose wurde durch Zugabe von eisgekühltem Phagozytosepuffer abgestoppt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben in PBS + 1 % hitze-inaktiviertem FCS + 2 mg/ml Trypanblau resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Um die Anzahl internalisierter Bakterien zu ermitteln, wurde der prozentuale Anteil an CSFEpositiven Granulozyten mit der mittleren Fluoreszenzintensität dieser Zellpopulation multipliziert. 162 Methoden 8.6.11 Messung der Entstehung reaktiver Sauerstoffderivate (Oxidative Burst Messung) in humanen Granulozyten 2 x 105 Granulozyten wurden in Chemilumineszenzpuffer (8 g/l NaCl; 0,2 g/l KCl; 0,62 g/l KH2PO4; 1,14 g/l Na2HPO4; 1 g/l Glukose; 50 mg/l BSA; pH7,2) aufgenommen und mit unterschiedlichen Konzentrationen Wortmannin für 30min bei 37 °C vorinkubiert. Die Granulozyten wurden in dreifacher Ausführung in eine 96-well Platte überführt. Anschließend wurde den Ansätzen Luminol zugesetzt. Die Endkonzentration des Luminol betrug 20 µg/ml pro well. Anschließend wurden die Ansätze mit 1 x 107 Bakterien infiziert oder wurden uninfiziert gelassen. Die Messung der Chemilumineszenz erfolgte alle 2min bei 37 °C mittels des Varioskan Flash der Firma Thermo Scientific. 163 Abkürzungen 9 Abkürzungen % Prozent °C Grad Celsius μg Mikrogramm μl Mikroliter Abb. Abbildung Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfate bp Basenpaar BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) Cam Chloramphenicol cDNA komplementäre DNA CEACAM Carcinoembryonic-antigen related Cell Adhesion Molecule cm Zentimeter C-SH2 C-terminal gelegene SH2 Domäne CS Kälberserum (newborn calf serum) DAG Di-acyl-glycerol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. et alii (und andere) FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FAK Fokale Adhäsionskinase FCS fötales Kälberserum Fn Fibronektin g Gramm GFP grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein) Grb Wachstumsfaktorrezeptor-bindendes Protein (growth factor receptor bound protein) GST Glutathion-S-Transferase h Stunde HA Hämagglutinin HBS Hepes-gepufferte Salzlösung 164 Abkürzungen His6 6-fach Histidin IP3 Inositol-(1,4,5)-trisphosphat ITAM immunoreceptor tyrosine based activation motif ITIM immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif Kd Dissoziationskonstante kbp Kilobasenpaar kDa Kilodalton l Liter LB Luria-Bertani M Molar mA Milliampere mg Milligramm ml Milliliter mM Millimolar N-SH2 N-terminal gelegene SH2 Domäne NC-SH2 Tandem-SH2 Domäne - bei Proteinen mit zwei SH2 Domänen (umfasst den Proteinabschnitt vom Beginn der N-terminalen bis Ende der Cterminalen SH2 Domäne) OD optische Dichte Opa opacity associated PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) Pfu Pyrococcus furiosus PI Phosphoinositol PI3K Phosphatidylinositol-3’-Kinase Klasse I PI3KR3 regulatorische Untereinheit p55 der PI3K PI3KR1 regulatorische Untereinheit p85 der PI3K PIPs Phosphatidylinositolphosphate PI(4,5)P2 Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat PI(3,4,5)P3 Phosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphat PL Polylysin PLCG1 Phospholipase-Cγ-1 PLCG2 Phospholipase-Cγ-2 165 Abkürzungen pmol Picomol PMN polymorphkerniger Granulozyt PTK Proteintyrosinkinase pTyr Phosphotyrosin PVDF Polyvinylidenfluorid RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur RTK Rezeptortyrosinkinase RT-PCR Reverse-Transkriptase-PCR s Sekunde SDS Sodiumdodecylsulfat SDS PAGE SDS Polyacrylamidgelelektrophorese SH2 Src-homology 2 domain SH3 Src-homology 3 domain shRNA short hairpin RNA t Zeit Tab. Tabelle TAE Tris- Acetat- EDTA Taq Thermus aquaticus TEMED Tetramethylethylendiamine rpm Umdrehungen pro Minute u. a. unter anderem ÜN über Nacht UV Ultraviolet V Volt vs. versus (gegen) xg Erdanziehungskraft z. B. zum Beispiel 166 Literaturverzeichnis 10 Literaturverzeichnis Alexa, A.; Varga, J. and Remenyi, A. (2010). "Scaffolds are 'active' regulators of signaling modules." FEBS J 277(21): 4376-4382. Andreotti, A. H.; Schwartzberg, P. L.; Joseph, R. E., et al. (2010). "T-cell signaling regulated by the Tec family kinase, Itk." Cold Spring Harb Perspect Biol 2(7): a002287. Angenendt, P.; Glokler, J.; Murphy, D., et al. (2002). "Toward optimized antibody microarrays: a comparison of current microarray support materials." Anal Biochem 309(2): 253-260. Araki, N.; Johnson, M. T. and Swanson, J. A. (1996). "A role for phosphoinositide 3kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages." J Cell Biol 135(5): 1249-1260. Arcaro, A. and Wymann, M. P. (1993). 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