ketogenese - Ruhr-Universität Bochum

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KETOGENESE
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
Ketogenese in Abhängigkeit vom Stoffwechselzustand
Unter Ketogenese versteht man einen Stoffwechselzustand, bei dem aus Acetyl-CoA Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure in der Leber gebildet und an das Blut abgegeben
werden. Diese beiden Säuren werden als Ketonkörper bezeichnet, zu denen außerdem
Aceton gezählt wird, das durch spontane Decarboxylierung der Acetessigsäure entsteht.
Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure werden über das Blut zu den peripheren
Geweben transportiert, wo sie aufgenommen und über den Zitronensäurezyklus oxidiert
werden. Die Konzentration der Ketonkörper im Blut beträgt normalerweise 80 - 200 µmol/l.
Im Hunger (48 Std.) steigt der Ketonkörperspiegel als Folge erhöhten Abbaus von freien
Fettsäuren auf Werte von 600 - 2200 µmol/l an (davon sind 15% Acetessigsäure und 85% ßHydroxybuttersäure).
Das Gehirn kann - im Gegensatz zum Muskel - seinen Energiebedarf nicht durch Abbau von
Fettsäuren decken, es fehlt diesem Organ die "langkettige" 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase. Im
Verlauf einer Hungerperiode deckt das Gehirn daher seinen Energiebedarf zu einem immer
größer werdenden Anteil aus der Oxidation der Ketonkörper (Abb. 1). Durch erhöhte
Ketogenese in diesem Stoffwechselzustand (physiologische Ketose) kann der gesteigerte
Bedarf des Gehirns an Ketonkörpern gedeckt werden.
Abb. 1 Energiequellen von Muskel und Gehirn in verschiedenen
Stoffwechselsituationen
Stoffwechselzustand
zur Deckung des Energiebedarfs
aufgenommene Substanzen
Muskel
Gehirn
Nahrungsresorption aus
Magen/Darm
Glucose 50%
Fettsäure 50%
Glucose
Hunger
Fettsäuren
(Ketonkörper)
Ketonkörper 40 %
Glucose 60 %
40
ROLLE DES CARNITINS, ß-OXIDATION UND HYDROXYMETHYLGLUTARYL-COA-ZYKLUS
Im Hunger werden aus Fettgewebe vermehrt Fettsäuren mobilisiert. Fettsäuren werden über
das Blut zur Leber transportiert. Die Enzyme der ß-Oxidation der Fettsäuren zu Acetyl-CoA
und der Acetessigsäurebildung aus Acetyl-CoA über den Hydroxymethylglutaryl-CoA-Zyklus
sind in der Matrix der Mitochondrien lokalisiert.
Die Aktivierung der Fettsäure zu Acyl-CoA durch die Acyl-CoA-Synthetase (Thiokinase)
erfolgt an den äußeren Mitochondrienmembranen (Abb. 3). Langkettige Acyl-CoA-Derivate,
z.B. Palmityl-CoA, können nur dann in die Matrix der Mitochondrien gelangen, wenn Carnitin
(3-Hydroxy-4-(trimethylamino)-Buttersäure) als Carrier für Fettsäurereste zur Verfügung
steht. Carnitin stimuliert die Oxidation der langkettigen Fettsäuren, da die Aktivität der
Carnitin-Palmityltransferase (Abb. 2) erhöht wird, die die Übertragung des Acylrestes von
Coenzym A auf die OH-Gruppe des Carnitins katalysiert.
Abb. 2 Funktion der Carnitin-Palmityltransferase
In Mitochondrien gibt es eine "äußere" und eine "innere" Acyltransferase. Die "äußere"
Acyltransferase überträgt im Raum zwischen der inneren und äußeren Mitochondrienmembran Acylreste von Acyl-CoA-Estern auf Carnitin. Die "innere" Acyltransferase katalysiert die umgekehrte Reaktion an der inneren Mitochondrienmembran (Abb. 3).
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Abb. 3 Aktivierung der Fettsäuren und Transport des Acyl-CoA in die Matrix der
Mitochondrien
Aktivierte Fettsäuren (Acyl-CoA-Thiolester) werden durch sukzessive Abspaltung von AcetylCoA-Molekülen (ß-Oxidation) abgebaut. Z.B. entstehen aus einem Molekül Palmityl-CoA
nach siebenmaligem Durchlauf des ß-Oxidationszyklus acht Moleküle Acetyl-CoA. Aufgrund
eines gesteigerten Abbaus von Fettsäuren entsteht vermehrt aktivierte Essigsäure.
In der Leber kann aktivierte Essigsäure zu 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA)
umgesetzt werden, woraus freie Acetessigsäure abgespalten werden kann. Aus zwei
Molekülen Acetyl-CoA entsteht Acetoacetyl-CoA (Enzym: Acetoacetyl-CoA-Thiolase). Diese
aktivierte Acetessigsäure kondensiert mit einem dritten Molekül Acetyl-CoA zu HMG-CoA
(Enzym: HMG-CoA-Synthase). HMG-CoA-Lyase spaltet HMG-CoA in freie Acetessigsäure
und Acetyl-CoA. In der Bilanz werden also zwei Moleküle Acetyl-CoA zu einem Molekül
Acetessigsäure und zwei Moleküle freiem Coenzym A umgewandelt. Freies Coenzym A
steht zur Aktivierung von Fettsäuren zur Verfügung.
Bilanz des HMG-CoA-Zyklus:
Acetyl-CoA + Acetyl-CoA  Acetoacetyl-CoA + CoASH
Acetoacetyl-CoA + Acetyl-CoA  HMG-CoA + CoASH
Hydroxymet hylglutary l  CoA  Acetessigs äure  Acetyl - CoA
Acetyl - CoA  Acetyl - CoA  Acetessigs äure  2 CoASH
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TRANSPORT DER KETONKÖRPER UND OXIDATION IM PERIPHEREN GEWEBE
In der Leber wird Acetessigsäure durch ß-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase zum größten Teil
zu ß-Hydroxybuttersäure reduziert:
Acetessigsäure + NADH + H+
ß-Hydroxybuttersäure + NAD+
Beide Ketonkörper gelangen in das Blut und so zum peripheren Gewebe (Abb. 4).
Abb. 4 Übersicht: Bildung, Transport und Abbau der Ketonkörper
Leber
Blut
FS
FS
Peripherie
Acetyl-CoA
Acetoacetyl-CoA
-Hydroxybuttersäure
Acetessigsäure
-Hydroxybuttersäure
Acetessigsäure
-Hydroxybuttersäure
Acetessigsäure
Oxidation
Acetyl-CoA
Acetoacetyl-CoA
Im peripheren Gewebe wird ß-Hydroxybuttersäure zu Acetessigsäure reoxidiert und durch
die Succinyl-CoA-Acetoacetyltransferase (Thiophorase) zu Acetoacetyl-CoA aktiviert:
Succinyl-CoA + Acetessigsäure
Succinat + Acetoacetyl-CoA
Acetoacetyl-CoA wird durch die C4-spezifische Acetoacetyl-CoA-Thiolase ("kurzkettige"
Thiolase) zu Acetyl-CoA gespalten, das über den Citronensäure-Zyklus vollständig oxidiert
wird:
Acetoacetyl-CoA + CoASH  2 Acetyl-CoA
PHYSIOLOGISCHE UND PATHOLOGISCHE KETOSEN
Im Hunger ist infolge einer gesteigerten Mobilisation der Fettsäuren aus dem peripheren
Fettgewebe der Fettsäurespiegel im Blut erhöht. Daraus folgt ein erhöhter Einstrom der
Fettsäuren in die Leber und eine Beschleunigung der ß-Oxidation. Die Aktivität der CarnitinPalmityltransferase ist im Hunger ebenfalls erhöht. Durch eine gesteigerte ß-Oxidation wird
vermehrt Acetyl-CoA bereitgestellt, eine Voraussetzung für die erhöhte Ketogeneserate.
Einige Aminosäuren können direkt zu Acetessigsäure abgebaut werden.
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Andere Faktoren, von denen man annimmt, dass sie im Hunger in der Leber zu erhöhtem
intrazellulären Acetyl-CoA-Spiegel führen, sind verminderte Lipogenese und Hemmung der
Endoxidation des Acetyl-CoA (Hemmung der Citratsynthese).
Von der Hungerketose (physiologische Ketose) abzugrenzen ist die pathologische Ketose.
Dieser Stoffwechselzustand ist ein Symptom des Krankheitsbildes des dekompensierten
Diabetes mellitus und ist charakterisiert durch eine stark gesteigerte Ketogenese bei gleichzeitig hohem Blutzuckerspiegel.
ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN
Fettsäuren, Fette;
Fettsäurebiosynthese und -abbau;
Triacylglycerinbiosynthese und Lipolyse;
Wirkung von Hormonen auf den Stoffwechsel des Fettgewebes;
Ketonkörpersynthese und Verwertung;
Fettverdauung und -resorption;
Blutlipide, Hyperlipoproteinämien;
Regulation des Fettstoffwechsels im Hunger;
Phosphatide und Phosphatidbiosynthese;
Cholesterin und Cholesterinbiosynthese.
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ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
Isolierte Lebermitochondrien sind zur ß-Oxidation von Fettsäuren zu Acetyl-CoA und
nachfolgender Ketonkörperbildung fähig. Der Einfluss folgender Faktoren auf die
Ketogeneserate soll untersucht werden:
a)
Exogen zugesetzte Palmitinsäure;
b)
Aktivierung der Fettsäure zu Acyl-CoA;
c)
Transport des Acyl-CoA in die Matrix der Mitochondrien;
d)
Aktivität des Citronensäure-Zyklus.
Dazu werden die Lebermitochondrien bei 37°C unter Luft inkubiert und nach Reaktionsstopp
wird die gebildete Acetessigsäure als Parameter für die Ketogenese in einem Farbtest bestimmt.
(Acetessigsäure reagiert mit diazotiertem p-Nitroanilin (p-Nitrophenyldiazoniumchlorid) unter
Bildung von N, N-bis-(p-nitrophenyl)-C-acetylformazan). Die Konzentration dieses Farbstoffes
ist der Acetessigsäurekonzentration äquivalent.
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VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
Mitbringliste: Kittel, Taschenrechner
Ketogenese in Abhängigkeit vom Stoffwechselzustand
Lösungen (stehen am Arbeitsplatz)
1.
Standard-Medium (pH 7.5)
50
mM Saccharose
17,115
g
5
mM MgCl2 · 6 H2O
1,016
g
2
mM Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA)
0,744
g
15
mM KCl
1,118
g
10
mM NaF
0,419
g
50
mM Tris (hydroxymethylaminomethan)
6,05
g
Die angegebenen Mengen in ca. 800 ml Wasser lösen, mit konz. HCl am pH-Meter
auf pH 7.5 einstellen und ad 1 l auffüllen.
(NaF
hemmt
ein
in
den
Mitochondrien
vorhandenes
GTP-abhängiges,
fettsäureaktivierendes System.)
2.
10 mM Palmitinsäure
128 mg Palmitinsäure in 50 ml Ethanol lösen
3.
0,1 M D, L-Carnitin
988,3 mg D, L-Carnitin-Hydrochlorid in ca. 40ml lösen, mit 1 N KOH auf pH 7.5
bringen und ad 50 ml auffüllen (Messkolben).
4.
0,1 M ATP
551,15 mg Adenosin-5'-triphosphorsäure-Dinatriumsalz in 8ml H2O lösen, mit 1N
KOH auf pH 7.5 bringen und auf 10ml auffüllen.
5.
0,1 M L-Malat
6.
Trichloressigsäure (TCA) (30%, Gew./Vol.)
7.
0,5% Natriumnitrit (0,5 g/100 ml H2O; täglich neu ansetzen)
8.
0,05% p-Nitroanilin (giftig) (0,05 g in 100 ml (0,05N) HCl-Lösung durch Erhitzen im
Wasserbad)
46
9.
0,2 M Na-Acetat: 2,72 g Natriumacetat/100 ml H2O.
10.
Mischung des Diazo-Reagenzes:
6 ml 0,5% NaNO2 und
40 ml 0,05% p-Nitroanilin
Hierbei tritt infolge Diazotierung des Nitroanilins eine Entfärbung ein. Diese abwarten,
dann die Mischung in Eis stellen, 14ml 0,2M Na-Acetat dazugeben und im Eis stehen
lassen. Das fertige Diazo-Reagenz wird während des Versuchs vom Assistenten
ausgegeben.
11.
1 M Na-Acetat: 13,6g Natriumacetat/100 ml H2O
12.
5 N HCl
13.
Mitochondriensuspension
Alle unter I aufgeführten Reagenzien stehen fertig vorbereitet am Arbeitsplatz.
Auf jeden Fall werden das Diazo-Reagenz, das Medium, HCl und der Essigsäureethylester
mit der 5ml Kolbenhubpipette (grün) pipettiert.
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Herstellung der Reaktionsansätze
1.
In sieben 50 ml Erlenmeyerkolben werden folgende Reagenzien pipettiert
(6 Reaktionsansätze und ein Null-Referenzansatz):
Pipettierplan:
Erlenmeyerkolben Nr.
1
2
3
4
5
6
NullRef.
ml Medium (pH 7.5)
3,50
3,50
3,50
3,50
3,50
3,50
3,50
ml Palmitinsäure
0,05
-
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
ml ATP
0,05
0,05
-
0,05
0,05
0,05
0,05
ml D,L-Carnitin
0,05
0,05
0,05
-
0,05
0,05
0,05
ml L-Malat (0,1 M)
-
-
-
-
0,05
-
-
ml L-Malat (0,02 M)
-
-
-
-
-
0,05
-
ml Wasser
0,35
0,40
0,40
0,40
0,30
0,30
0,35
ml Lebermitochondrien
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
-
Achtung: Die Mitochondriensuspension soll vor der Verteilung in die einzelnen
Reaktionsansätze
kurz
geschwenkt
werden
(vorsichtig
über
Kopf
drehen).
Die
Mitochondrien werden als letztes in die Erlenmeyerkolben gegeben (Reaktionsstart).
Nach Beschickung der einzelnen Reaktionsansätze werden diese mit Parafilm verschlossen,
mit der jeweiligen Gruppennummer beschriftet, in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmt und
60 Min. unter Schütteln inkubiert.
2.
Während der Inkubation sollen folgende Arbeiten durchgeführt werden:
Es
werden
8x2
Eppendorfgefäße
(2ml
Plastikzentrifugenröhrchen
mit
Schnappdeckel) beschriftet: Je ein Paar für die Reaktionsansätze 1-6, ein Paar für
die Null-Referenz (NR) und das letzte Paar für einen Reagenzienleerwert (RL). Jedes
Röhrchen wird mit 0,1 ml 30% TCA beschickt.
3.
Behandlung der Reaktionsansätze
Die Bildung der Acetessigsäure wird nach 60 Min. in den einzelnen Reaktionsansätzen durch Zugabe von Trichloressigsäure gestoppt (TCA-Fällung).
-
Von den Ansätzen 1 - 6 wird je 1ml aus den Erlenmeyerkolben in die beiden
vorbereiteten Eppendorfgefäße zu der TCA gegeben (Doppelbestimmung
48
Beschriftung mit 1, 1a, 2, 2a, 3, 3a ….) und diese dann sofort auf Eis gestellt
(sonst besteht die Gefahr der spontanen, (Decarboxylierung der Acetessigsäure).
- In den Erlenmeyererkolben des Null-Referenzansatzes wird 1 ml Mitochondriensuspension pipettiert, gemischt und sofort je 1ml in die beiden Eppendorfgefäße zu
der TCA gegeben (Weiterbehandlung wie Ansätze 1 - 6).
- In die beiden Eppendorfgefäße des Reagenzienleerwerts (Eigenfärbung des
Farbreagenzes) kommen zu der TCA je 1 ml Medium (Weiterbehandlung wie
Ansätze 1 - 6).
Die Proben bleiben (zur Fällung des Proteins im Ansatz) 10 Min. auf Eis stehen.
Die gestoppten Reaktionsansätze - alle in Eppendorfgefäßen - werden dann 5 Min.
in der Tischzentrifuge zentrifugiert. In den Überständen wird die gebildete Menge an
Acetessigsäure bestimmt. Dazu werden 500µl jeweils in die vorbereiteten und
beschrifteten Reagenzgläser (Farbtest unter 4.) überführt.
4.
Bestimmung der Acetessigsäure durch einen Farbtest
- 16 Ansätze (je zwei Reagenzgläser für Proben 1 - 6, die Null-Referenz und den
Reagenzienleerwert)
1 M Na-Acetat
0,5 ml
Überstand der jeweiligen
Probe nach der TCA-Fällung
0,5 ml
Diazo-Reagenz (Handschuhe!)
UNTER DEM ABZUG ARBEITEN!
3,0 ml
- Die Ansätze werden gemischt und 10 Min. bei 37 °C im Wasserbad geschüttelt.
Der Rest des Überstandes wird im Eisbad aufbewahrt.
-
Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml 5M HCl gestoppt; anschließend wird der
gebildete Farbstoff mit 2,5 ml Essigsäureäthylester (Vorsicht, feuergefährlich!)
ausgeschüttelt (hierbei wird der Farbstoff aus der wässrigen in die obere
organische Phase extrahiert): Dazu werden die zwei Phasen in den Ansätzen mit
einer Plastikpasteurpipette durch Aufsaugen und Ausspülen gründlich vermischt,
bis die wässrige Phase völlig entfärbt ist. Nach Trennung der beiden Phasen (ca. 1
Min.) wird ein Teil des den Farbstoff enthaltenden Essigsäureethylesters (obere
Phase) vorsichtig mit einer Pasteurpipette in eine Küvette überführt und die
Extinktion bei 420nm gemessen. Eichung des Photometers gegen den
49
Reagenzienleerwert. Für die Eichung und alle Messungen wird immer dieselbe
Küvette verwendet. Die Ansätze werden nach ihrer Färbung sortiert und
beginnend mit der schwächsten Färbung gemessen. Jede Probe wird
doppelbestimmt.
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AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
Es soll berechnet werden, wie viel µmol Acetessigsäure von den Mitochondrien aus 1g Leber
gebildet werden (µmol · h-1 · g Leber-1).
:
Extinktionskoeffizient des N, N’-bis-(p-Nitrophenyl)-C-acetyl-formazan ist
 420 = 21,4 · 103 (l · mol-1 · cm-1)
Die Extinktion des Reagenzienleerwerts wird gleich Null gesetzt (Eichung mit diesem Wert,
somit wird hier die Eigenfärbung des Diazo-Reagenzes berücksichtigt). Mit Hilfe der NullReferenz lässt sich abschätzen, wie viel endogenes Acetoacetat (oder andere Substanzen,
die mit dem Diazo-Reagenz umsetzbar sind) in den Reaktionsansätzen vorhanden war.
Die Menge Acetessigsäure, die in 1h von den Mitochondrien aus 1g Leber gebildet wurde,
berechnet sich wie folgt:
Konzentration in der
Küvette

Aktivität
Verdünnungs
faktor der
TCA-Fällung

eingesetzte
Lebermenge

VFäll  VTCA VReakt K Mito 1
 mol 
 nkatal  E 420



 g  h  bzw.  mg     d  VEss 
VFäll
VFarbt VMito t




  
Farbstoffgesamt- Anteil des Reaktions- Normiemenge im Essig- ansatzes, der letztlich rungsfaktor
säureäthylester im Farbtest eingesetzt auf 1h und
wurde
1g Leber

gebildete Gesamtmenge im Reaktionsansatz
E420
:
Extinktion des Messwertes (um den Leerwert korrigiert)
d
:
Schichtdicke der Messküvette = 1 cm
VEss
:
Volumen des zur Extraktion eingesetzten Essigsäureäthylesters
VFäll
:
Volumen, das aus dem Reaktionsansatz in die TCA-Fällung eingesetzt wurde
VTCA
:
Volumen der TCA in der TCA-Fällung
VFarbtt
:
Volumen, das aus der TCA-Fällung in den Farbtest eingesetzt wurde (Tab. 2)
VReakt
:
Volumen des Reaktionsansatzes (Tab. 1)
VMito
:
Volumen der eingesetzten Mitochondriensuspension
51
KMito
:
"Verdünnungsfaktor" der Mitochondrien: Mitochondrien aus 5 g Leber wurden in
75 ml aufgenommen:
K Mito 
t
:
75 ml
5g
Bezugsgröße Zeit (1h)
Aus den für alle Ansätze konstanten Werten kann durch Einsetzen in die Formel ein Faktor
berechnet werden. Man beachte, dass  in l · mol-1 · cm-1 angegeben ist, die Volumina aber
in ml und der resultierende Wert in µmol berechnet werden soll!
,
μ
52
Messwerte und Berechnungen:
Reagenzglasnummer
1
1a
2
2a
3
3a
4
4a
5
5a
6
6a
7
7a
8
8a
420nm
Mol/(g*h)