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Research Collection
Doctoral Thesis
Lipoprotein maturation is required for virulence of
Mycobacterium tuberculosis and is essential for correct
lipoprotein localization
Author(s):
Rezwan, Mandana
Publication Date:
2006
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-005187265
Rights / License:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETH No. 16510
Lipoprotein maturation is required for virulence of Mycobacterium tuberculosis and is
essential for correct lipoprotein localization
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the degree of
DOCTOR OF NATURAL SCIENCES
presented by
MANDANA REZWAN
Dipl. Natw. ETH
born August 20th, 1977
citizen of Wolhusen, Switzerland
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wolf D. Hardt, examiner
Prof. Dr. Annette Oxenius, co-examiner
PD Dr. Peter Sander, co-examiner
Prof. Dr. Erik C. Böttger, co-examiner
Zürich, 2006
Summary
Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis. It is one of the most
devastating pathogens claiming two million deaths every year. M. tuberculosis belongs to the
group of slow-growing mycobacteria with a generation time of approximately 24 hours.
Secreted mycobacterial proteins are putative virulence factors. The aim of this study was the
investigation of two protein secretion pathways in mycobacteria, i.e. the biosynthesis,
transport and localization of lipoproteins and the characterization of the twin-arginine
translocation (TAT) system.
Mycobacterial lipoproteins are secreted, immunodominant proteins. Common to all
lipoproteins is the lipobox, a consensus sequence consisting in four amino acids. Lipoprotein
biosynthesis is mediated by the consecutive activity of pre-prolipoprotein diacyl glycerol
transferase (Lgt) and prolipoprotein signal peptidase (LspA). Lgt transfers a diacyl glycerol
residue on the universally conserved cysteine at the +1 position. LspA cleaves off the Nterminal signal peptide. The gene lspA, encoding the second enzyme in lipoprotein
biosynthesis, was inactivated by allelic replacement techniques in M. tuberculosis. A M.
tuberculosis lspA::aph mutant showed a severely attenuated phenotype with a 3-4 log reduced
number of colony forming units and absence of lung pathology in aerosol infected BALB/c
mice. Likewise, a replication reduction of lspA::aph was observed in mouse macrophages.
These results suggest that LspA is a major determinant of M. tuberculosis virulence. In order
to dissect lipoprotein synthesis and transport, mutants deficient in Lgt and LspA were
generated in M. smegmatis, the mycobacterial model organism. Lipoprotein maturation was
investigated by heterologous expression of the reporter lipoprotein Mpt83, a lipoprotein of M.
tuberculosis with unknown function. In M. smegmatis wild-type extracts, the recombinant
expressed Mpt83 was found in the cell wall. In contrast, in M. smegmatis lspA::hyg extracts,
Mpt83 was found in the cytoplasmic membrane and in lgt::aph extracts, Mpt83 was secreted
into culture supernatant. These results indicate a lipid-dependent transport of mycobacterial
proteins.
In order to investigate the role of TAT- transported proteins for mycobacterial physiology, the
TAT pathway should be inactivated by deleting tatC, which encodes the translocase of the
TAT system. However, it was not possible to disrupt tatC in M. tuberculosis indicating that
tatC is essential in mycobacteria.
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Zusammenfassung
Das Bakterium Mycobacterium tuberculosis ist der Erreger der Tuberkulose. Jährlich sterben
etwa zwei Millionen Menschen an der Tuberkulose. Damit ist die Tuberkulose die häufigste
Todesursache durch einen einzelnen bakteriellen Erreger. M. tuberculosis gehört zur Gruppe
der langsam wachsenden Mykobakterien und hat eine Generationszeit von etwa 24 Stunden.
Sekretierte mykobakterielle Proteine stellen mögliche Virulenzfaktoren dar. Das Ziel dieser
Arbeit ist die Untersuchung von zwei mykobakteriellen Proteinsekretionssystemen. Einerseits
soll die Biosynthese, der Transport und die Lokalisation von Lipoproteinen und andererseits
die Charakterisierung des Twin-Arginine Translokations Systems (TAT) untersucht werden.
Mykobakterielle
Lipoproteine
sind
sekretierte,
immunodominante
Proteine.
Die
Gemeinsamkeit aller Lipoproteine ist die Lipobox, eine Konsensus Sequenz, welche aus vier
Aminosäuren besteht. Die Biosynthese von Lipoproteinen wird durch die aufeinander
folgenden Aktivitäten der Pre-prolipoprotein Transferase (Lgt) und der Prolipoprotein Signal
Peptidase (LspA) katalysiert. Lgt überträgt einen Diacyl-glycerol Rest auf das universal
konservierte Cystein an der +1 Position. LspA schneidet das N-terminale Signalpeptid ab. Das
Gen lspA, welches das zweite Enzym der Lipoprotein Biosynthese kodiert, wurde in M.
tuberculosis durch gezielten Genaustausch inaktiviert. Die M. tuberculosis lspA::aph Mutante
zeigte einen stark abgeschwächten Phänotyp in mit Aerosolen infizierten BALB/c Mäusen,
das heisst, die Anzahl der Bakterien war 3-4 log reduziert und es wurden keine pathologisch
veränderten Lungen beobachtet. Entsprechend wurde eine reduzierte Vermehrung der
lspA::aph Mutante in Maus-Makrophagen beobachtet. Diese Resultate weisen darauf hin,
dass LspA eine wichtige Determinante der Virulenz von M. tuberculosis ist. Um die Synthese
von Lipoproteinen und deren Transport zu untersuchen, wurden Lgt- und LspA- defiziente M.
smegmatis Mutanten generiert. M. smegmatis ist ein Organismus, der als Modellsystem für M.
tuberculosis dient. Die Reifung von Lipoproteinen wurde durch die heterologe Expression
von dem Reporter-Lipoprotein Mpt83, ein Lipoprotein von M. tuberculosis mit unbekannter
Funktion, untersucht. In Extrakten vom Wildtypstamm von M. smegmatis wurde das
rekombinant exprimierte Mpt83 in der Zellwand lokalisiert. Im Gegensatz dazu, wurde das
Mpt83 in Extrakten von der M. smegmatis lspA::hyg Mutante in der cytoplasmatischen
Membran und in Extrakten von der M. smegmatis lgt::aph Mutante im Kulturüberstand
gefunden.
Diese
Resultate
weisen
auf
mykobakteriellen Proteinen hin.
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einen
Lipid-abhängigen
Transport
von
Um die Rolle von TAT-transportierten Proteinen in der Physiologie von Mykobakterien zu
untersuchen, sollte das TAT-System durch die Deletion des Gens tatC, welches die
Translokase des Systems kodiert, inaktiviert werden. Jedoch konnte das tatC von M.
tuberculosis nicht deletiert werden. Dies weist darauf hin, dass das tatC von Mykobakterien
essentiell ist.
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