Dengue NS1 Antigen DxSelect™ (Deutsch)
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Dengue NS1 Antigen DxSelect™ (Deutsch) REF EL1510 Rev. C ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) zum Nachweis des NS1Antigens in Humanserum In-vitro-Diagnostikum ANWENDUNGSBEREICH Der Dengue NS1 Antigen DxSelect™-Assay von Focus Diagnostics ist für den frühen Nachweis des Denguevirus-NS1-Antigens in Humanserum bestimmt. Dieser Test kann die Früherkennung von Dengueviren in Humanserum vor dem Auftreten von IgM oder IgG-Antikörpern erleichtern. Der Assay ist nicht zum Screening von Blut oder Blutbestandteilen bestimmt. Der Assay ist nur zur Verwendung durch Fachkräfte bestimmt. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTVERFAHRENS Denguefieber (DF) ist eine akute, selbstlimitierte virale Erkrankung, die durch biphasisches Fieber, Kopf- und Gliederschmerzen, Hautausschlag, Lymphadenopathie und Erschöpfung gekennzeichnet ist. Bei Vorliegen der schlimmsten Form einer Denguefieber-Infektion, dem Hämorrhagischen Denguefieber (HDF), leidet der Patient unter hohem Fieber und Nierenversagen, was zum häufig tödlichen Dengue-Schocksyndrom (DSS) führt.1 Schätzungen zufolge sind weltweit etwa zwei Milliarden Menschen dem Risiko einer DF-Infektion ausgesetzt und über eine Million Menschen werden pro Jahr infiziert.2 Zusammen mit den hunderttausenden von DSS-Fällen stellen diese Zahlen den Grund dafür dar, dass Dengue heute weltweit als eine der wichtigsten durch Arboviren hervorgerufenen Krankheiten gilt.2 Das Denguevirus (DV) ist ein Flavivirus und eng verwandt mit dem Gelbfiebervirus, dem Japanische-Enzephalitis-Virus und anderen Arboviren der Gruppe B. Die Mitglieder dieser Gruppe bestehen aus einzelsträngiger RNA in einem ikosaedrischen Nukleokapsid, welches von einer 10 nm dicken Lipidhülle umgeben ist.3 Es gibt vier Denguevirus-Stämme, die sich alle serologisch unterscheiden. Eine Infektion mit einem bestimmten Stamm schützt den Wirt nicht vor einer Infektion mit anderen Stämmen. Vielmehr deutet ein Bericht darauf hin, dass DHF und DSS besonders häufig bei Personen auftreten, die zuvor durch einen anderen Stamm infiziert worden sind.4 Das Vorhandensein zirkulierender, nichtneutralisierender, kreuzreaktiver DV-Antikörper kann die Infektion immunologisch offenbar verstärken.4 Nichtneutralisierende, kreuzreaktive Antikörper gegen andere Flaviviren (außer DV) bewirken jedoch keine immunologische Verstärkung der Infektion.4 In der ganzen Welt wurden regelmäßig Denguefieber-Epidemien gemeldet. Die größten Epidemien traten im Süden der Vereinigten Staaten (1922; wobei über eine Million Menschen betroffen waren), in Australien (1925 und 1942), in Griechenland (1927) und in Japan (1942–45) auf.2 Von Behörden aus Peru und vom US-amerikanischen Center of Disease Control (CDC) wurde ein größerer Ausbruch von DF mit den Erregern DV Typ 1 und Typ 4 zwischen März und Juli 1990 gemeldet.5 Das epidemiologische Zentrum befand sich in der Gegend um Iquitos, Peru. Dies war das erste Mal, dass eine einheimische Übertragung von Dengue in Peru durch Laborbefunde bestätigt werden konnte.5 Denguevirus kann überall da übertragen werden, wo die Mückenvektoren Aedes aegypti und Aedes albopictus vorkommen. A. aegypti tritt hauptsächlich auf dem tropischen und subtropischen amerikanischen Kontinent auf und ist im Süden der USA einheimisch.2 Der Hauptvektor für DF in Asien ist A. albopictus. Diese Stechmückenart ist in den USA mittlerweile nördlich bis nach Zentral-Illinois vorgedrungen. Eine Übertragung von Dengueviren wurde hiermit jedoch bis jetzt nicht in Verbindung gebracht.2 Das Dengue-NS1 (Nichtstruktur)-Protein ist ein hoch konserviertes Glykoprotein. Es spielt vermutlich eine Rolle bei der Replikation der viralen RNA. NS1 ist stark immunogen und ruft die Bildung von komplementbindenden Antikörpern hervor. Das NS1-Antigen kann während einer akuten Dengue-Infektion im Serum nachgewiesen werden. Es ist ab dem ersten Tag und bis zu neun Tage nach dem Ausbruch des Fiebers in Proben von primär oder sekundär mit Dengue infizierten Patienten nachweisbar. TESTPRINZIP Der Dengue NS1 Antigen DxSelect™-Assay ist ein hoch sensitiver Assay. Er basiert auf einem enzymatisch verstärkten Sandwich-Immunassay im Zweischrittverfahren zum Nachweis geringer Konzentrationen von NS1 in Serum. Beim Dengue NS1 Antigen DxSelect™-Assay werden Kontrollen und Serummessproben in Probenverdünnungspuffer, der sekundäre Antikörper enthält, verdünnt und in den Kavitäten einer Miktrotiterplatte inkubiert. Diese Kavitäten sind mit Antikörper gegen NS1 beschichtet. In den Proben vorhandene NS1-Antigene werden dann wie in einem "Sandwich" zwischen dem Fänger-Antikörper und dem sekundären Antikörper festgehalten. Die Anwesenheit des NS1-Antigens wird kolorimetrisch mit einem HRP-Enzymkonjugat und einer TMB-Substratlösung bestätigt. Nachdem die Reaktion mit Hilfe einer sauren Stopplösung beendet worden ist, wird der enzymatische Substratumsatz durch Absorptionsmessung bei 450 nm bestimmt. Um das Vorhandensein des NS1-Antigens festzustellen, werden die Optische-Dichte (OD)-Werte der Patientenproben mit den OD-Cut-Off-Werten der Referenzproben verglichen. Hinweis: Ein Satz Negativ-, Positiv- und Cut-off Kontrollen wird als interne Kontrollen zur Überprüfung der Qualität der Kitkomponenten mitgeliefert. Dengue NS1 Antigen DxSelect™ Seite 2 MITGELIEFERTES MATERIAL Der Dengue NS1 Antigen DxSelect™-Kit enthält ausreichend Reagenzien für jeweils eine Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (12 x 8 Streifen). Das gesamte gelieferte Material ist ungeöffnet und bei einer Lagerung bei 2 bis 8 °C bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfalldatum haltbar. REF EL1541 Ab NS1 Dengue NS1 Coated Microtiter Strips (Beschichtete Mikrotiterstreifen), 96 Kavitäten 12 Polystyren-Mikrotiterstreifen mit je acht Reaktionskavitäten auf einem Halterahmen. Jede Kavität ist mit anti-Dengue NS1-Antikörper beschichtet. Dengue NS1 Negative Control (Negativkontrolle), 300 µl REF EL1542 CONTROL Ein Röhrchen Humanserum als Negativkontrolle. Vor Gebrauch kurz zentrifugieren, um eventuelle Ausfällungen zu sedimentieren. Dengue NS1 Positive Control (Positivkontrolle), 300 µl REF EL1543 CONTROL + Ein Röhrchen mit rekombinantem NS1 als Positivkontrolle. Vor Gebrauch kurz zentrifugieren, um eventuelle Ausfällungen zu sedimentieren. Dengue NS1 Cut-Off Control (Cut-off Kontrolle), 300 µl REF EL1544 CONTROL CO Ein Röhrchen mit rekombinantem NS1 als Cut-off-Kontrolle. Vor Gebrauch kurz zentrifugieren, um eventuelle Ausfällungen zu sedimentieren. Dengue NS1 Sample Diluent (Probenverdünnungslösung), 15 ml REF EL1545 DIL SPE Ein Fläschchen mit Dengue NS1-Antikörperlösung zur Verdünnung der Proben. Enthält Proclin (0,02-0,03% ) als Konservierungsstoff. 100x Dengue NS1 Conjugate (Konjugat), 150 µl REF EL1546 CONJ Ab Ein Fläschchen Meerrettichperoxidase (HRP)-markierter Antikörper. Vor Gebrauch gut mischen. Bei 2 bis 8C bis zum Verfalldatum aufbewahren. Dengue NS1 Conjugate Diluent (Konjugat-Verdünnungslösung), 12 ml REF EL1547 CONJ Verdünnungslösung für das 100x-Konjugat. Enthält Thimerosal (0,01% ) als Konservierungsstoff. Das 100x-Konjugat wird zur Verdünnung direkt in diese Lösung gegeben. Nach dem Verdünnen des 100x-Konjugats mit dieser Lösung kann das jetzt gebrauchsfertige Konjugat für 2 Wochen bei 2 bis 8°C aufbewahrt werden, bevor es entsorgt werden sollte. 10 X Wash Buffer (Waschpuffer), 120 ml REF EL1548 BUF WASH Eine Flasche Waschpuffer zur Verwendung gemäß den Anweisungen im Abschnitt "Testverfahren". Liquid TMB Substrate (TMB-Substrat-Lösung), 12 ml REF EL1549 SUBS TMB Eine Flasche mit gepuffertem Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid. Gemäß den Anweisungen im Abschnitt "Testverfahren" verwenden. Hinweis: Dieses Substrat ist lichtempfindlich und sollte in der Originalflasche aufbewahrt werden. Stop Solution (Stoplösung), 6 ml REF EL1551 SOLN STOP Eine Flasche mit Schwefelsäure als Stopplösung für die Reaktion. Gemäß den Anweisungen im Abschnitt "Testverfahren" verwenden. Achtung: Dies ist eine starke Säure. Schutzhandschuhe, Maske und Schutzbrille tragen. Alle Materialien den Sicherheitsvorschriften und -bestimmungen entsprechend entsorgen. ERFORDERLICHES, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL 1. ELISA-Spektralphotometer für Absorptionsmessungen bei einer Wellenlänge von 450 nm 2. Hochreines Wasser 3. Vakuumpumpe 4. Automatische Plattenwaschvorrichtung 5. 37°C-Inkubator 6. 1–10 µl Einkanalpipetten, 50–200 µl Einzel- und Mehrkanalpipetten 7. Polypropylen-Röhrchen oder Verdünnungsplatten mit 96 Kavitäten 8. Parafilm 9. Kurzzeitmesser 10. Vortex-Mixer HALTBARKEIT UND HANDHABUNG 1. Alle Kits und Kit-Reagenzien sind bei einer Lagerung bei 2 bis 8°C bis zum Monatsende des auf dem Etikett angegebenen Verfalldatums stabil. 2. Reagenzien bei 2 bis 8°C lagern. 3. Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfalldatums nicht mehr verwenden. 4. Reagenzien während der Lagerung oder Inkubation vor starkem Lichteinfall schützen. 5. Alle Reagenzien vor Gebrauch auf 20 bis 25°C erwärmen lassen. 6. Alle Komponenten nach dem erstmaligen Gebrauch in den Kühlschrank stellen (2 bis 8°C), wo sie für einen Monat bzw. bis zum Verfalldatum (falls dieses bereits früher eintritt) aufbewahrt werden können. Eine Ausnahme bildet die Konjugat-Lösung. Diese Lösung kann bei 2 bis 8 C bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden. Nach Ablauf der 2 Wochen sollte die Konjugat-Lösung entsorgt werden und nicht mehr in diesem Assay verwendet werden. 7. Verwendete Reagenzien nicht in die Originalbehälter zurückgießen. 8. Keine kontaminierten Reagenzien verwenden. 9. Reagenzien in ihren Originalbehältnissen aufbewahren. 10. Reagenzien nicht mit Komponenten anderer Kit-Chargen oder Reagenzien anderer Hersteller mischen oder untereinander austauschen. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Alle Materialen humanen Ursprungs, die für die Herstellung der Kontrollen verwendet wurden, waren in Tests negativ für Antikörper gegen HIV 1&2, Hepatitis C und das Hepatitis B-Oberflächenantigen. Keine Testmethode kann jedoch eine 100%ige Effizienz gewährleisten. Daher sind alle humanen Kontrollen und Antigene als potenziell infektiöses Material zu behandeln. Die US-amerikanischen Center for Disease Control und National Institutes of Health empfehlen, dass potenziell infektiöse Materialien gemäß Biosicherheitsstufe 2 gehandhabt werden. 2. Ein genaues Verständnis dieser Packungsbeilage ist für den erfolgreichen Einsatz dieses Produkts notwendig. Zuverlässige Ergebnisse sind nur bei Anwendung präziser Labormethoden und bei sorgfältiger Befolgung der Angaben in dieser Packungsbeilage zu erzielen. 3. Innerhalb eines Assays keine Kit-Komponenten aus verschiedenen Chargen zusammen verwenden. 4. Komponenten nicht nach Ablauf des auf dem Etikett angegebenen Verfalldatums verwenden. 5. Reagenzien während der Lagerung und Inkubation vor übermäßiger Hitze oder direkter Sonneneinstrahlung schützen. 6. Bei einigen Reagenzien können leichte Ausfällungen auftreten. Vor dem Gebrauch vorsichtig durchmischen. 7. Unvollständiges Waschen beeinträchtigt das Ergebnis und die Genauigkeit des Assays. 8. Um mögliche systematische Abweichungen der Assay-Ergebnisse aufgrund unterschiedlicher Substratinkubationszeit zu verringern, ist darauf zu achten, dass die Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit wie die TMB-Lösung in die Kavitäten pipettiert wird. 9. Die mikrobielle Kontamination von Reagenzien, insbesondere des gebrauchsfertigen HRP-Enzymkonjugats für den NS1-Assay vermeiden. Kontamination der TMB-Substratlösung mit dem HRP-Enzymkonjugat vermeiden. 10. Bei der Durchführung des Assays Schutzkleidung, Sicherheitsbrille und Einmalhandschuhe tragen. Anschließend die Hände gründlich waschen. 11. Für jedes Reagens, jeden Standard und jede Kontrolle oder Probe eine saubere Einweg-Pipettenspitze verwenden. Dengue NS1 Antigen DxSelect™ Seite 3 12. Arbeitsbereich mit absorbierendem Einmalpapiertuch abdecken. 13. Dieses Kit kann Reagenzien enthalten, die aus Humanserum oder -plasma hergestellt wurden. Sofern nicht anders angegeben, wurde das verwendete Serum bzw. Plasma hitzeinaktiviert. Alle verwendeten Seren und Kits sind als potenziell infektiöse Stoffe zu behandeln. Bei der Durchführung aller Verfahren sind die etablierten Vorsichtsmaßnahmen für mikrobiologische Gefahren zu beachten und Standardverfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung von Proben zu befolgen. 14. Sicherheitsdatenblätter (SDB) sind für alle Komponenten dieses Kits erhältlich. Vor der Durchführung dieses Assays sollten alle relevanten SDB eingesehen werden. Während des Tests ist jeder Kontakt zwischen den Händen und den Augen bzw. Schleimhäuten zu vermeiden. Falls es zum Kontakt kommt, sollte das entsprechende SDB bezüglich der angemessenen Behandlung konsultiert werden. PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG 1. Für diesen Assay muss Humanserum verwendet werden. Die Reagenzien wurden nicht für Vollblut oder Plasma optimiert oder getestet; daher können diese nicht direkt getestet werden. 2. Um Hämolyse zu vermeiden, sollte das Serum so schnell wie möglich von den koagulierten roten Blutkörperchen getrennt werden. 3. Die Testung sollte so bald wie möglich im Anschluss an die Serumgewinnung erfolgen. Seren nicht für längere Zeit bei Raumtemperatur stehen lassen. 4. Es ist Serum zu verwenden und die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für die Venenpunktion sind zu beachten. Die Proben können bei 2 bis 8°C bis zu 7 Tage aufbewahrt werden oder bei –20°C oder niedrigeren Temperaturen bis zu 30 Tage eingefroren werden. Zur Gewährleistung einer langfristigen Haltbarkeit von Serum müssen die Proben bei –70°C gelagert werden. Das wiederholte Auftauen und Wiedereinfrieren der Proben ist zu vermeiden. 5. Eingefrorene Proben sind vor der Verwendung auf Raumtemperatur zu bringen und durch vorsichtiges Schwenken oder Invertieren gründlich zu durchmischen. Vor dem Gebrauch stets kurz anzentrifugieren. 6. Wenn Seren verschickt werden sollen, sind sie in Übereinstimmung mit den behördlichen Bestimmungen für den Transport infektiöser Materialien zu verpacken. 7. Seren nicht verwenden, wenn Anzeichen von Bewuchs zu beobachten sind. TESTVERFAHREN Vor ihrer Verwendung sind alle Kit-Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur (ca. 25°C) zu bringen. Vor Gebrauch sind die Reagenzien sowie die Proben durch vorsichtiges Invertieren gründlich zu durchmischen. Vorbereitung der Reagenzien Herstellung des 1x-Waschpuffers: Der 10x-Waschpuffer ist mit hochreinem Wasser auf die 1-fache Konzentration zu verdünnen. Um eine 1x-WaschpufferLösung herzustellen, sind 120 ml 10x-Waschpuffer mit 1080 ml destilliertem (oder deionisiertem) Wasser zu mischen. Gründlich mischen, um die Auflösung jeglicher Niederschläge und die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Die verdünnte 1x-Lösung kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate aufbewahrt werden. Vor dem Gebrauch ist die Lösung auf eventuelle Kontaminationen zu prüfen. Bei Verdacht einer Kontamination entsorgen. Mikrotitrations-Kavitäten: Die für den Assay benötigte Anzahl beschichteter Kavitäten auswählen. Die verbleibenden, unbenutzten Kavitäten sind umgehend mit dem mitgelieferten Trockenmittel neu zu verpacken und bei 2 bis 8°C bis zur Verwendung bzw. bis zum Verfalldatum zu lagern. Herstellung der Konjugat-Lösung: 120 µl des 100x-Konjugats für den Dengue NS1-ELISA direkt in die 12-ml-Flasche mit der Konjugat-Verdünnungslösung für Dengue NS1 geben (1 Teil auf 100 Teile). Durch wiederholtes Invertieren der Lösung mischen. Diese Lösung kann bei 2 bis 8 °C bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden. Nach Ablauf der 2 Wochen sollte die Konjugat-Lösung entsorgt werden und nicht mehr in diesem Assay verwendet werden. Testverfahren 1. Positiv-, Negativ- und Cut-off-Kontrollen sollten jeweils als Doppelbestimmung (und auf jeder Platte jedes Mal, wenn der Assay durchgeführt wird) getestet werden. Messproben können in einfacher Ausführung getestet werden. (Es wird jedoch empfohlen, Proben als Doppelbestimmung zu testen, solange der Anwender mit dem Assay noch nicht vertraut ist.) Auf jeder Platte können 90 Messproben in einfacher Ausführung getestet werden. 2. Mit einer Einkanal- oder Mehrkanalpipette 50 μl der Probenverdünnungslösung für den Dengue NS1-ELISA in jede der gewünschten Kavitäten pipettieren. 3. 50 μl von jedem unverdünnten Serum (Messproben und Kontrollproben) direkt in die Mitte der die Probenverdünnungslösung enthaltenden Kavitäten pipettieren. Platte vorsichtig fünf Mal schaukelnd hin und her bewegen. 4. Die Plattenoberseite mit Parafilm abdecken. Überstehenden Parafilm entfernen. Hinweis: Dies gewährleistet eine gleichmäßige Temperaturverteilung in allen Kavitäten von unten und von den Seiten; überstehender Parafilm kann abgeschnitten werden, sobald die Oberseite zur Verhinderung von Verdunstung abgedichtet ist. Hinweis: Platten nicht aufeinander stapeln. Sie sollten immer nur eine Lage bilden. Dies ist entscheidend für eine gleichmäßige Temperaturverteilung. Kein CO2 oder andere Gase verwenden. Platten nicht in Kontakt mit nassen Materialien bringen, wie z.B. feuchte Papiertücher usw. Dengue NS1 Antigen DxSelect™ Seite 4 RICHTIGE METHODE 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Platte in einem Inkubator bei 37°C für 1 Stunde inkubieren. Platte nach der Inkubation 6-mal mit 1x-Waschpuffer in einer automatischen Waschvorrichtung waschen. Bei jedem Waschzyklus 300 µl in jede Kavität geben. Die Konjugat-Lösung herstellen (120 µl 100x-Konjugat auf 12 ml Konjugat-Verdünnungslösung) und mit einer Mehrkanalpipette 100 µl dieser Konjugat-Lösung in jede Kavität pipettieren. Restliche Konjugat-Lösung verwerfen oder bis zu 2 Wochen bei 2 bis 8C aufbewahren. Platte wie oben abgebildet mit Parafilm abdecken und in einem Inkubator bei 37°C für 30 Minuten inkubieren. Platte nach der Inkubation 6-mal mit 1x-Waschpuffer in der automatischen Waschvorrichtung waschen. Jeweils 100 µl TMB-Substrat-Lösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Kavität pipettieren. Platte für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Jeweils 50 µl Stopplösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Kavität pipettieren. Platte 1 Minute ohne Abdeckung bei Raumtemperatur stehen lassen. Werte für die bei 450 nm gemessene Optische Dichte (OD450) mit einem Mikroplatten-Reader ablesen. LEERWERTE ODER LEERE KAVITÄTEN NICHT SUBTRAHIEREN ODER NORMALISIEREN. Die OD450-Rohwerte aufzeichnen und den Probenstatus wie im Abschnitt "Qualitätskontrolle" angegeben, bewerten. QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Kit enthält Positiv-, Negativ- und Cut-off-Kontrollproben. Eine ausreichende Diskriminationskapazität (R ) muss erreicht sein, um die Validität der PC/NC Assay-Ergebnisse zu gewährleisten. Die Negativ- und Positivkontrollen dienen der Erfassung schwerwiegender Reagenzienfehler; die Positivkontrolle )-Wert zu niedrig ist oder wenn gewährleistet keine Präzision im Cut-off-Bereich des Assays. Der Test ist ungültig und muss wiederholt werden, wenn der (R PC/NC die Kontrollproben nicht den Vorgaben entsprechen. Wenn der Test ungültig ist, können die Ergebnisse nicht verwendet werden. Die Vorgaben für die Qualitätskontrolle müssen den lokalen und nationalen Bestimmungen oder Akkreditierungsvorgaben sowie den laborinternen Qualitätskontrollstandards genügen. Dem Anwender wird empfohlen, einschlägige Dokumente, wie z.B. CLSI C24-A3 und 42 CFR 493.1256 als Leitlinie für angemessene Qualitätskontrollverfahren zu konsultieren. Die unten aufgeführten Ergebnisse dienen ausschließlich der Orientierung und gelten nur für spektralphotometrische Messungen. Zuerst wird der R PC/NC berechnet, wie im Beispiel gezeigt. Beispiel Berechnung der durchschnittlichen Negativkontrolle (NC): Beispiel: OD der Negativkontrolle Nr. 1 0,108 Nr. 2 0,084 Gesamt 0,192 Mittelwert der Negativkontrolle = 0,192 ÷ 2 = 0,096 Berechnung der durchschnittlichen Positivkontrolle (PC): Beispiel: OD der Positivkontrolle Nr. 1 1,112 Nr. 2 1,089 Gesamt 2,201 Mittelwert der Positivkontrolle = 2,201 ÷ 2 = 1,101 Berechnung des Verhältnisses (Ratio) von Positiv- und Negativkontrolle (RPC/NC): Beispiel: (R ) = 1,101 ÷ 0,096 = 11,47 PC/NC Vorgaben für die Qualitätskontrolle Als Nächstes muss sichergestellt werden, dass die in der nachstehenden Tabelle aufgelisteten Vorgaben für die Qualitätskontrolle erfüllt sind. Dengue NS1 Antigen DxSelect™ Seite 5 Beispiel Kontrolle Vorgabe Positive Probe OD ≥ 0,500 Negative Probe OD < 0,200 Cut-off-Probe OD > Negative Probe RPC/NC ≥ 8,00 Zusammenfassung: Die Ergebnisse in der obenstehenden Tabelle müssen erreicht sein, damit der Assay als gültig gilt. Die Nichterfüllung dieser Kriterien ist ein Zeichen für einen Verfall der Reagenzien oder für einen Fehlers im Testverfahren und der Assay muss wiederholt werden. ASSAY-BERECHNUNGEN Für die Ermittlung des Status der Messprobe wird zunächst der Cut-off-Wert des Assays berechnet und anschließend das Verhältnis von optischer Dichte (OD450) und Cut-off-Wert berechnet. Berechnung des Cut-off-Werts: Der Cut-off-Wert wird basierend auf den durchschnittlichen mit der Cut-off-Kontrollprobe erhaltenen OD-Werten berechnet. Beispiel Berechnung der durchschnittlichen Cut-off-Kontrolle: Beispiel: OD der Cut-off-Kontrolle Nr. 1 0,152 Nr. 2 0,189 Gesamt 0,341 Mittelwert der Cut-off-Kontrolle = 0,341 ÷ 2 = 0,171 Cut-off-Wert in diesem Beispiel: 0,171 Beispiel Hinweis: Es wird empfohlen, den Cut-off mit Seren aus einer geografisch relevanten Population zu verifizieren. Berechnung des Indexwerts: Der Wert wird aus dem Verhältnis der mit der Messsprobe erhaltenen optischen Dichte (OD) und des errechneten Cut-off-Werts berechnet. Der Indexwert ist für jede Messprobe zu berechnen. Beispiel Berechnung des Indexwerts für jede Probe: Beispiel: OD der Messprobe OD der Messprobe 0,431 Indexwert der Messprobe = OD der Messprobe ÷ Cut-off-Wert Indexwert der Messprobe = 0,431 ÷ 0,171 = 2,52 Berechnung des Cut-off-Werts: Endemische Kontrollseren wurden nicht für die Berechnung des Cut-offs verwendet. Es wird empfohlen, den Cut-off-Wert mit Seren aus einer geografisch relevanten Population zu verifizieren. Interpretation der Testergebnisse: OD-Werte ≥ Cut-off (Indexwerte ≥ 1,00) gelten als Zeichen für die Anwesenheit von zirkulierendem NS1-Antigen. Seren mit OD-Werten in der Nähe des Cut-off-Werts (1,10 > Indexwerte > 0,90) sollten in zweifacher Ausführung wiederholt werden, um den Probenstatus zu überprüfen. Indexwert Interpretation ≥ 1,00 Positiv. Ein Indexwert ≥ 1,00 gilt als Hinweis für die Anwesenheit von zirkulierendem NS1-Antigen. < 1,00 Negativ. Ein Indexwert < 1,00 gilt als Hinweis für die Abwesenheit von zirkulierendem NS1-Antigen. 1,10 > Indexwerte > 0,90 Seren mit OD-Werten in der Nähe des Cut-offs sollten in zweifacher Ausführung wiederholt werden, um den Probenstatus zu überprüfen. Dengue NS1 Antigen DxSelect™ Seite 6 EINSCHRÄNKUNGEN 1. In-vitro-Diagnostikum. 2. Nur für den Export bestimmt. 3. Da es sich bei diesem Assay um eine indirekte Screening-Methode handelt, kann es zum Auftreten falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse kommen. 4. Alle reaktiven Proben müssen mit einem Bestätigungstest überprüft werden. 5. Die in diesem Kit enthaltenen Reagenzien wurden für die Messung von Dengue NS1-Konzentrationen in Serumproben optimiert. 6. Die serologische Kreuzreaktivität innerhalb der Flavivirus-Familie ist stark ausgeprägt. Bestimmte Seren von Patienten, die mit dem JapanischeEnzephalitis-Virus, West-Nil-Virus und/oder Saint-Louis-Enzephalitis-Virus infiziert sind, können falsch positive Ergebnisse liefern. Daher müssen alle Seren, die positiv für Dengue sind, mit anderen Tests überprüft werden. 7. Die Leistungsdaten des Assays für eine visuelle Ergebnisbestimmung wurden nicht etabliert. 8. Die Ergebnisse bei immunsupprimierten Patienten müssen mit Vorsicht interpretiert werden. 9. Die Ergebnisse des Assays sollten nur im Kontext mit anderen Laborbefunden und dem klinischen Gesamtstatus des Patienten interpretiert werden. SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN Prozentuale Positiv-Übereinstimmung (PPA, Positive Percent Agreement) Die prozentuale Positiv-Übereinstimmung wurde von einer externen Stelle durch die Analyse von 34 gut charakterisierten Serumproben beurteilt. Alle 34 Serumproben waren in der RT-PCR positiv. Die prozentuale Positiv-Übereinstimmung (PPA) des Dengue NS1 Antigen DxSelect™-Assays im Vergleich zur RT-PCR beträgt 88,2% (30/34) mit einem 95%-Konfidenzintervall von 73,4–95,3%. Prozentuale Negativ-Übereinstimmung (NPA, Negative Percent Agreement) Die prozentuale Negativ-Übereinstimmung wurde von einer internen Stelle durch die Analyse von 53 gut charakterisierten Serumproben in der präklinischen Phase beurteilt. Alle 53 Serumproben waren in der RT-PCR negativ. Die prozentuale Negativ-Übereinstimmung (NPA) des Dengue NS1 Antigen DxSelect™-Assays im Vergleich zur RT-PCR beträgt 100,0% (53/53) mit einem 95%-Konfidenzintervall von 93,2–100,0%. Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeitsstudie wurde von je zwei verschiedenen Personen an drei verschiedenen Standorten (6 Anwender insgesamt) an 5 aufeinander folgenden Tagen durchgeführt. Die Anwender testeten das gleiche Probenpanel im Dreifachansatz mit derselben Charge des Dengue NS1 Antigen DxSelect™-ELISA-Kits. Die Reproduzierbarkeit des Assays wurde mit einem Probenpanel beurteilt, das Serumproben mit vier unterschiedlichen Konzentrationen sowie die Kontrollen enthielt. Die Daten sind sowohl für die gemessenen OD-Rohwerte als auch für die Indexwerte (Indexwerte – Verhältnis von Proben-OD zum OD-Wert der Cut-off-Kontrolle) dargestellt. Quantitative Reproduzierbarkeit für OD-Rohwerte Varianzkomponenten Probenbezeichnung N Mittelwert Zwischen den Standorten Zwischen den Tagen Zwischen den Anwendern/Läufen Innerhalb des Assays SD %CV SD % CV SD %CV SD %CV SD %CV Gesamt Probe Nr. 1 90 0,598 0,00 0,0 0,02 3,3 0,05 8,0 0,03 4,7 0,06 9,8 Probe Nr. 2 90 0,351 0,01 3,8 0,01 3,0 0,02 7,1 0,02 5,1 0,04 10,0 Probe Nr. 3 90 0,229 0,02 7,8 0,00 0,0 0,02 9,0 0,01 5,4 0,03 13,0 Probe Nr. 4 90 0,106 0,01 9,4 0,00 0,0 0,01 12,2 0,00 4,7 0,02 16,0 (+) Kontrolle 90 1,722 0,15 8,9 0,06 3,7 0,14 8,3 0,09 5,4 0,24 13,8 (-) Kontrolle 90 0,065 0,01 11,1 0,00 0,0 0,01 10,1 0,01 8,6 0,01 17,3 Cut-off-Kontrolle 90 0,121 0,01 10,3 0,00 0,0 0,01 9,4 0,01 4,7 0,02 14,7 Dengue NS1 Antigen DxSelect™ Seite 7 Reproduzierbarkeit für Indexwerte Qualitative Ergebnisse Quantitative Reproduzierbarkeit Varianzkomponenten Probenbezeichnung Alle Positiv Negativ N Mittel wert Zwischen den Standorten Zwischen den Tagen Zwischen den Anwendern/Läufen Innerhalb des Assays Gesamt SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV Probe Nr. 1 90 90 90 5,01 0,35 7,0 0,00 0,0 0,38 7,7 0,24 4,7 0,57 11,4 Probe Nr. 2 90 90 90 2,93 0,16 5,3 0,00 0,0 0,15 5,1 0,15 5,1 0,26 8,9 Probe Nr. 3 90 90 90 1,91 0,03 1,7 0,00 0,0 0,10 5,4 0,10 5,1 0,15 7,7 Probe Nr. 4 90 6 90 0,88 0,03 3,4 0,00 0,0 0,06 6,5 0,04 4,6 0,08 8,7 (+) Kontrolle 90 90 90 14,33 0,00 0,0 0,00 0,0 0,88 6,1 0,79 5,5 1,18 8,3 (-) Kontrolle 90 90 0,54 0,02 3,4 0,00 0,0 0,05 8,6 0,04 7,7 0,07 12,0 90 1,00 0,00 0,0 0,00 0,0 0,00 0,0 0,04 3,7 0,04 3,7 Cut-offKontrolle 84 90 Nicht anwendbar Nachweisgrenze Die Leerwertgrenze und die Nachweisgrenze wurden mit rekombinantem NS1, das in humanes Normalserum geimpft wurde, effektiv ermittelt. Die Nachweisgrenze wurde mit rekombinantem, in humanem Normalserum verdünnten NS1 als 5,2 pg/ml ermittelt. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Cut-off-Probe über dieser Nachweisgrenze liegt. Daher ist nicht zu erwarten, dass Endanwender tatsächlich 5,2 pg/ml NS1 in humanen Proben nachweisen können und OD-Werte oberhalb der Cut-off-Probe erhalten. LITERATUR 1. Halstead, SB. 1980. Immunological parameters of togavirus disease syndromes. p.107-173. In RW Schlesinger (ed.), The Toga Viruses. Academic Press, Inc., New York. 2. Gubler, DJ. 1989. Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease control in the 1990’s: top down or bottom up. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40:571-578. 3. Henchal, EA and JR Putnak. 1990. The Dengue Viruses. Clin. Micro. Rev. #:376-396. 4. Halstead, SB. 1989. Antibody, Macrophages, Dengue Virus Infection, Shock, and Hemorrhage: A Pathogenic Cascade. Rev. of Inf. Dis. 11:S830-S839. 5. MMWR. 1991. 40:v9:145. 6. Gubler, DJ. 1989. Dengue, p.223-260. In T.P. Monath (ed.) The arboviruses: epidemiology and ecology. Vol.2 CRC Press, Inc., Boca Raton, Fl. 7. Halstead, SB and G Papaevangelou. 1980. Transmission of dengue 1 and 2 viruses in Greece in 1928. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29: 625-637. 8. Kuno, G. and I Gomez and DJ Gubler. 1991. An ELISA procedure for the diagnosis of dengue infections. Journal of Virol. Meth. 33: 101-113. 9. NCCLS. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline (NCCLS H18-A2). 2nd ed. (1999). 10. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4.Aufl. und National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). Eine elektronische Version dieser Packungsbeilage ist im Internet unter www.focusdx.com unter dem Reiter "Produkte" zu finden. Eine Papierkopie dieser Packungsbeilage kann kostenfrei angefordert werden. 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