IDEIA Borrelia burgdorferi IgG [DE]

5. GELIEFERTE REAGENZIEN
96 - Jeder Testkit enthält ausreichend Reagenzien für die
Durchführung des Tests an 96 Patientenproben..
Key Code TSMX7841
5.1. IDEIA
BORRELIA
PACKUNGSINHALT
www.oxoid.com/ifu
Europe +800 135 79 135
CA 1 855 805 8539
US 1 855 2360 190
–
Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten
(12 Streifen mit 8 Mikrokavitäten),
beschichtet mit nativen BorreliaFlagellen. Die Mikrotiterplatte wird
in einem wieder verschließbaren
Plastikbeutel geliefert, in dem
die
ungebrauchten
Streifen
aufzubewahren sind.
IDEIA Borrelia
burgdorferi IgG
DE
Enzymimmunoassay zur Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen
Borrelia burgdorferi sensu lato in Humanserum.
IgG-TESTKIT
REAGENZIEN
UND
8.2.5
Um mikrobielle Kontamination zu vermeiden, ist zum
Verdünnen von Regaenzienkonzentraten genutztes
entionisiertes oder destilliertes Wasser in sauberen
Behältern aufzubewahren.
8.2.6
Kontamination mit Metallionen und Oxidationsmitteln
vermeiden.
8.2.7
Kein Substrat verwenden, das bereits blau gefärbt ist,
ehe es in die Kavitäten gegeben wird.
Messzylinder (2L)
8.2.8
Substrat vor Licht schützen.
Teströhrchen, Fassungsvermögen etwa 5mL
8.2.9
Mikrokavitäten können nicht erneut verwendet werden.
Präzisions-Mikropipetten und Einmal-Spitzen für ein Volumen
von 10-1000µL
8.2.10
Waschvorrichtungen, einschließlich automatischer
Geräte, dürfen nicht mikrobiell kontaminiert sein. Sie
müssen korrekt geeicht sein und entsprechend den
Herstelleranleitungen gehandhabt werden.
8.2.11
Restlichen gebrauchsfertigen Waschpuffer nicht für
späteren Gebrauch aufbewahren. Nicht gebrauchte
Waschpuffergefäße mit destilliertem Wasser spülen und
trocknen lassen.
Frisches entionisiertes oder destilliertes Wasser.
7. ZUBEHÖR UND GERÄTE
Es werden folgende Ausstattungen benötigt:
Eine Gebrauchsanleitung.
ROW +31 20 794 7071
K602911-2..........................96 Tests
BURGDORFERI,
6. ZUSÄTZLICH
BENÖTIGTE
ERFORDERLICHES ZUBEHÖR
6.1. REAGENZIEN
Reagenzienbehälter für 8-Kanal-Pipette (optional)
Sauberes saugfähiges Papier (zum Abklopfen der Mikrotiterplatten)
Plastikdeckel für Mikrotiterplatte
Jeweils ein Fläschchen der folgenden Reagenzien:
100mL Probenverdünnungsmittel:
Gepufferte Lösung mit Antibiotikum
und rotem Farbstoff.
1. ZWECKBESTIMMUNG
Das IDEIA™ Borrelia burgdorferi-IgG Testsystem ist ein
immunologischer Enzymtest zur Bestimmung von IgG-Antikörpern
gegen Borrelia burgdorferi sensu lato in Humanserum. Das
Testsystem dient als Hilfsmittel in der Diagnose der LymeBorreliose
8-Kanal-Pipette für 100µL-Volumina (optional)
50mL Waschpuffer Konsentrat x25:
tris gepufferte Lösung mit Detergens
und Antibiotikum.
Schüttler für Mikrotiterplatten, ausgelegt auf eine MindestSchüttelbewegung von 500min-1 mit einem Bahndurchmesser
(kreisförmige Amplitude) von 3-4mm. Informationen über
die Eignung von Mikrotiterplatten-Schüttler können von der
zuständigen Oxoid-Niederlassung oder vom zuständigen Händler
angefordert werden
Stoppuhr.
Waschautomat für Mikrotiterplatten (wahlweise) oder geeignete
Ausstattung für das Waschen von Streifen mit 8 Kavitäten
(Abschnitt 10.2.3)
2. EINFÜHRUNG
Die Lyme-Borreliose ist eine Multisystem-Infektion, die durch
die von Zecken stammende Spirochäte B. burgdorferi sensu
lato1,2 verursacht wird. Die Lyme-Borreliose ist die häufigste
Vektor-vermittelte Erkrankung beim Menschen in Europa und
Nordamerika. Die Krankheit wurde ebenfalls in der Russland,
China und Japan beobachtet.
2,5mL
IgG-Cut-off-Kontrolle:
Humanserum
in
Puffer
mit
Antibiotikum und hellgrün gefärbt.
Eine Infektion mit B. burgdorferi zeichnet sich durch verschiedene
klinische Symptome aus und ist in drei Stadien unterteilt3.
13mL Anti-IgG-Konjugat: Kaninchenanti-Human-IgG, markiert mit HRP
und hellblau gefärbt.
Innerhalb von Tagen bis einigen Wochen nach dem Zeckenbiss
bildet sich im Stadium I ein charakteristischer Hautausschlag,
Erythrema migrans (EM), aus. Die Infektion kann von
unspezifischen Symptomen wie Kopfschmerzen, Unwohlsein,
Fieber, Myalgien und Arthralgien begleitet werden. Im Stadium
II - Wochen bis Monate später - zeigt sich die Krankheit
gewöhnlich mit lymphozytärerer Meningoradikulitis mit oder
ohne kranialer Nervenlähmung der Gliedmaßen (BannwarthSyndrom), Myokarditis oder Arthritis. Einige Jahre nach der
Infektion erstrecken sich die Symptome des Stadiums III auf die
Haut, das zentrale Nervensystem oder die Gelenke und können
sich als Akrodermatitis chronica atrophicans (ACA), chronische
progressive Enzephalomyelitis oder Arthritis manifestieren.
Wegen der extrem geringen Menge von B. burgdorferi in
pathologischen Läsionen und Körperflüssigkeiten sind eine
Kultivierung und die meisten neuen PCR-Techniken für den
direkten Nachweis von spirochätaler DNA in der RoutineDiagnostik der Lyme-Borreliose nicht erfolgreich gewesen. Zur
Zeit ist daher die beste Methode immer noch die Bestimmung
von B. burgdorferi-spezifischen Antikörpern.
Das IDEIA
Borrelia burgdorferi-IgG-Testsystem verwendet
als Testantigen gereinigtes, natives B. afzelii-Flagellum des
Stamms DK1. Es ist äußerst immunogen und bewirkt eine frühe,
starke und anhaltende Immunreaktion4,5,6. Verglichen mit
den konventionellen und zur Zeit am häufigsten verwendeten
Testantigenen, die auf dem Zellextrakt der gesamten Spirochäte
basieren, verbessert das gereinigte, native Flagellum-Antigen die
diagnostische Sensitivität und Spezifität von serologischen LymeBorreliose-Testsystemen7,8. Da die Flagellen keine signifikanten
Variationen zwischen den B. burgdorferi-Subspezies aufweisen,
ist ihre Verwendung als Testantigen in allen geographischen
Gebieten geeignet.
1,5mL
IgG-Positivkontrolle:
Humanserum
in
Puffer
mit
Antibiotikum und dunkelgrün gefärbt
12mL Substrat: Stabilisiertes Peroxid
und 3,3’-5,5’-Tetramethylbenzidin
in
verdünnter
Pufferlösung.
Nach Mitteilungen ist TMB nicht
karzinogen. Um eine direkte
Aussetzung zu vermeiden, ist
dennoch angemessene persönliche
Schutzausrüstung zu tragen.
25mL Stopp-Lösung.
Schwefelsäure.
0,46mol/L
Hinweis: Werden bei einem Streifen weniger als 8 Testkavitäten
mit einem Waschautomaten mit Waschkopf für 8 Kavitäten
gewaschen, müssen die Streifen vollständig mit Leerkavitäten
gefüllt werden
10. TESTVERFAHREN
VOR
DURCHFÜHRUNG
DES
TESTVERFAHRENS
SIND
DIE IN ABSCHNITT 8.2 AUFGEFÜHRTEN TECHNISCHEN
VORSICHTSMASSNAHMEN ZU BEACHTEN.
Spektrophotometer oder EIA-Plattenlesegerät zum Lesen einer 96
Mikrokavitäten-Platte mit 8 Kavitätenstreifen bei einer Extinktion
von 450nm mit einer Referenz bei 620-650nm. (Wahlweise; siehe
Abschnitt 10.5, Ablesen der Testergebnisse)
10.1.ANMERKUNGEN ZUM TESTVERFAHREN
Für diesen Assay stehen Anwendungsmerkblätter für die
Verwendung zusammen mit offenen automatisierten Systemen
zur Verfügung. Weitere Informationen können von der
zuständigen Oxoid-Niederlassung oder vom zuständigen Händler
angefordert werden
8. VORSICHTSMASSNAHMEN
- In-vitro-Diagnostikum. Personen, die Tests mit
diesem Produkt durchführen, müssen in die Durchführung
eingewiesen sein und über entsprechende Laborerfahrung
verfügen
5.2.1
8.1.1
Jedes Spenderserum, das für die Herstellung der IgGPositivkontrollen benutzt wurde, wurde individuell
untersucht und als negativ für Hepatitis-B-VirusOberflächenantigen und Antikörper gegen HIV und
Hepatitis C befunden.
8.1.2
Die Stopplösung enthält Schwefelsäure (0,46mol/L).
Kontakt mit Augen und Haut durch Tragen von
Schutzkleidung und –brille vermeiden.
8.1.3
Essen, Trinken, Rauchen, Aufbewahren und Zubereiten
3. TESTPRINZIP
Im IDEIA Borrelia burgdorferi-IgG-Test werden MikrotiterplattenKavitäten verwendet, die mit gereinigten nativen Borrelia-Flagellen
beschichtet sind. Befinden sich in Humanserumproben Antikörper,
so binden diese während des ersten Inkubationsschrittes an die
mit Flagellen beschichteten Mikrokavitäten. Nach dem Waschen
der Kavitäten, durch das die ungebundenen Serumproteine
entfernt werden, werden Peroxidase-konjugierte Antikörper
gegen humanes IgG den Kavitäten zugesetzt. Das Konjugat bindet
spezifisch an die humanen IgG-Antikörper, die am FlagellumAntigen haften.
Nicht benötigte Kavitätenstreifen sofort zusammen mit dem
Trockenmittel wieder in den versiegelbaren Kunststoffbeutel
einführen. Beutel sorgfältig verschließen und bei 2-8°C lagern. Bei
ordnungsgemäßer Lagerung sind die Mikrotiterplatten-Streifen
nach Öffnen der Originalpackung bis zu 12 Wochen haltbar.
Das überschüssige Konjugat wird anschließend weggewaschen.
Nach Zugabe von Chromogen katalysiert die gebundene
Peroxidase die Entwicklung eines blauen Farbstoffs. Die Reaktion
wird durch Zugabe von Säure gestoppt, wobei die Farbe von blau
nach gelb wechselt.
5.2.3
5.2.2
von Speisen sowie Schminken sind im für Arbeiten
vorgesehenen Bereich (Labor) verboten.
Mikrotiterplatten -
Den Folienbeutel am Verschluss entlang aufschneiden. Streifen
mit der benötigten Anzahl Kavitäten abbrechen und in den
Halterahmen einpassen. Ein Streifen gestattet die doppelte
Bestimmung an einer Patientenptobe, die verbleibenden 6
Mikrokavitäten werden für Probenverdünnungsmittel, IgGCut-off-Kontrolle und IgG-Positivkontrolle verwendet. Jeder
zusätzliche Streifen gestattet das Testen der Proben von 4
Patienten. Werden alle Streifen gleichzeitig genutzt, können die
Proben von 45 Patienten getestet werden.
8.1.4
Reagenzien dürfen nicht mit den Mund pipettiert
werden.
8.1.5
Beim Handhaben von klinischen Proben und Reagenzien
sind immer Einweghandschuhe zu tragen und nach dem
Umgang mit infektiösen Stoffen sind immer die Hände
zu waschen.
8.1.6
Waschpufferkonzentrat -
Alle klinischen Proben entsprechend den geltenden
gesetzlichen Vorschriften entsorgen.
8.1.7
Von fachlich qualifizierten Anwendern kann ein
Sicherheitsdatenblatt angefordert werden.
8.1.8
Das TMB-Substrat enthält 1-Methyl-Pyrrolidon
(NMP) in einer Konzentration von >5 % und
<10 %, das entsprechend den anwendbaren
Richtlinien der Wirtschaftsgemeinschaft (EWG)
als reproduktionsschädigend eingestuft ist. Kat. 2.
Nachfolgend sind die entsprechenden Risiko-(R-) und
Sicherheits-(S-)Sätze aufgeführt.
Probenverdünnungsmittel -
Gebrauchsfertig. Nicht benötigtes Probenverdünnungsmittel bei
2-8°C aufbewahren.
R61
Kann das Kind im Mutterleib
schädigen.
S53
Exposition vermeiden – vor Gebrauch
besondere Anweisungen einholen
S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt
hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett
vorzeigen)
Die Intensität der Farbe entspricht der Konzentration von B.
burgdorferi-spezifischen Antikörpern, die in der Probe vorhanden
Liegt in 25facher Konzentration vor. Waschpuffer in
Arbeitskonzentration ansetzen, indem 1 Teil WaschpufferKonzentrat mit 24 Teilen frischem entionisiertem oder
destilliertem Wasser versetzt wird (oder den Inhalt der Flasche
mit Waschpufferkonzentrat mit 1200mL frischem entionisiertem
oder destilliertem Wasser vermischen).
sind. Die Farbintensität wird spektrophotometrisch bei 450nm
bestimmt. Der Extinktionswert der Probe wird schließlich mit den
Extinktionswerten der Kontrollen verglichen.
Es sollte nur soviel Waschpuffer angesetzt werden, wie am
Versuchstag benötigt wird. Nicht benötigtes Konzentrat bei
2-8°C aufbewahren.
8.2. TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN
4. DEFINITIONEN
Die nachfolgenden Symbole wurden
Produktbeschreibung angewandt:
Unverbrauchte Reste von Waschpuffer in Arbeitskonzentration
dürfen nicht für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden
(siehe Abschnitt 8.2.11).
8.2.1
überall
in
der
Katalognummer
5.2.4
In-vitro-Diagnostikum
Gebrauchsfertig. Nicht benötigte IgG-Cut-off-Kontrolle bei 2-8°C
aufbewahren.
Für Laborgebrauch
In der Packungsbeilage (IFU) nachlesen
Temperatureinschränkungen (Lagertemperatur)
Chargencode (Lotnummer)
„Verwendbar bis“ (Verfallsdatum)
Hergestellt von
5.2.5
IgG-Cut-off-Kontrolle -
IgG-Positivkontrolle -
Gebrauchsfertig. Nicht benötigte IgG-Positivkontrolle bei 2-8°C
aufbewahren.
5.2.6
Anti-IgG-Konjugat -
Die
Reagenzien
werden
in
festgelegten
Arbeitskonzentrationen geliefert.
Die Testleistung
wird beeinträchtigt, falls Reagenzien modifiziert oder
unter anderen als den in Abschnitt 5.2 spezifizierten
Bedingungen gelagert werden.
8.2.3
Mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss
vermieden werden.
8.2.4
Für jede Probe, jede Kontrolle und jedes Reagenz
eine gesonderte Einwegpipette oder Pipettenspitze
verwenden, damit eine Kreuzkontamination der Proben
oder Kontrollen und dadurch entstehende falsche
Ergebnisse vermieden werden.
Substrat -
Gebrauchsfertig. Nicht benötigtes Substrat bei 2-8°C aufbewahren.
5.2.8
Stopplösung -
Gebrauchsfertig.
aufbewahren.
Nicht
benötigte
Stopplösung
bei
2-8°C
Kit-Komponenten dürfen nach Ablauf des auf den
Etiketten vermerkten Verfalldatums (Verwendbar
bis:) nicht mehr verwendet werden. Reagenzien
aus verschiedenen Chargen dürfen nicht vermischt
oder
gegeneinander
ausgetauscht
werden.
Davon ausgenommen sind: Standardreagenzien
(Probenverdünnungsmittel, Waschpuffer, Substrate und
die Stopplösung), die ebenfalls in den Testsystemen
IDEIA Borrelia burgdorferi IgM ( K603011-2) und IDEIA
Lyme Neuroborreliosis Kit ( K602811-2) verwendet
werden.
8.2.2
Gebrauchsfertig. Nicht benötigtes Anti-IgG-Konjugat bei 2-8°C
aufbewahren.
5.2.7
10.1.1
Die Standardreagenzien (Probenverdünnungsmittel,
Waschpufferkonzentrat, Substrat und Stopplösung) und
das Testverfahren entsprechen denen der Testkits IDEIA
Borrelia burgdorferi IgM ( K603011-2 ) und IDEIA Lyme
Neuroborreliosis ( K602811-2 ). Dies ermöglicht die
gleichzeitige Untersuchung einer einzelnen verdünnten
Patientenserumprobe mit allen drei Tests.
10.1.2
Die Gültigkeit der Testdurchführung basiert auf der
gleichzeitigen Untersuchung von Duplikaten aller
Proben. Einfachbestimmungen von Patientenproben
werden nur empfohlen, wenn der Anwender mit dern
Leistungseigenschaften dieses Tests bereits vertraut
ist. Die Variationen innerhalb eines Tests (intra-TestVariationen, CK%) sind bei der Untersuchung einer
Einzelprobe um etwa 50% erhöht.
10.1.3
Wenn kein Schüttler mit 500 min-1 zur Verfügung
steht, kann die Schüttelgeschwindigkeit für die
Mikrotiterplattenstreifen
während
der
zwei
Inkubationsschritte ohne nachteilige Auswirkung auf
die Testdurchführung auf 300 min-1 reduziert werden.
Alternativ steht ein statisches Protokoll zur Verfügung.
Weitere Informationen über ein geeignetes Protokoll
können von der zuständigen Oxoid-Niederlassung oder
vom zuständigen Händler angefordert werden.
8.1. SICHERHEITSMASSNAHMEN
5.2. ANSETZEN, LAGERUNG UND ERNEUTE VERWENDUNG DER
KIT-KOMPONENTEN
Mit dem IDEIA Borrelia burgdorferi IgG-Kit können innerhalb
einer Zeitspanne von 3 Monaten und vor dem Verfallsdatum
bis zu 10 einzelne Testdurchgänge durchgeführt werden. Um
optimale Leistung der Kit-Komponenten sicherzustellen, müssen
alle nicht genutzten Komponenten in Übereinstimmung mit den
folgenden Anleitungen gelagert werden:
9. GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER PROBEN
Der IDEIA Borrelia burgdorferi-IgG-Kit ist ausschließlich für
die Untersuchung menschlicher Serumproben bestimmt.
Die Untersuchung von trüben und viskosen Seren kann zu
unzuverlässigen Ergebnissen führen, die auf Pipettierfehler
beruhen. Serumproben können bis zur Untersuchung für 14
Tage bei 2-8°C und für bis zu 6 Monate bei -20°C oder kälter
aufbewahrt werden.
10.2.ASSAYVERFAHREN
HINWEIS: Das Assayverfahren erfordert den Einsatz eines
Mikrotiterplatten-Schüttlers. Informationen über die Eignung
von Mikrotiterplatten-Schüttler können von der zuständigen
Händler angefordert werden.
Bei Nutzung mehrerer Streifen wird für die Zugabe von Konjugat,
Substrat und Stopplösung die Verwendung einer Pipette mit 8
Kanälen empfohlen.
10.2.1
Zusetzen von Probe und Kontrollen
Benötigte Anzahl von Mikrokavitäten-Streifen in den Rahmen
einführen. In die entsprechenden Kavitäten 100µL verdünntes
Patientenserum pipettieren. 100µL Positivkontrolle, Cutoff-Kontrolle und Probenverdünnungsmittel in gesonderte
Mikrokavitäten pipettieren. (Mit jeder Charge getesteter Proben
müssen mindestens drei Cut-off-Kontrollkavitäten und 2 positive
Kontrollkavitäten sowie eine Kavität mit Probenverdünnungsmittel
mitgeführt werden).
10.2.2
Probeninkubation
Mikrotiterplatten abdecken und auf dem Schüttler bei
Raumtemperatur (20-25°C) unter Rütteln für einen Zeitraum von
60 Minuten inkubieren.
10.2.3
Waschen der Kavitäten
Die Kavitäten sind mit frisch angesetztem Waschpuffer in
Arbeitskonzentration zu waschen (siehe Abschnitt 5.2.3).
Das Waschverfahren ist für die Testleistung ausschlaggebend
(Abschnitt 8.2.10). Darauf achten, dass alle Kavitäten
vollständig befüllt (mit mindestens 350µL Waschpuffer in
Arbeitskonzentration je Kavität) und wieder entleert werden.
Mindestens 4 Waschzyklen sind unerlässlich, ob sie nun
automatisch oder manuell erfolgen. Das Verfahren muss während
des zweiten Waschschritts eine Einweichphase von 2 Minuten
oder eine Weichzeit von insgesamt 2 Minuten während des
gesamten Waschzyklus einschließen.
Manuelles Waschen
Werden die Kavitäten manuell gewaschen, wird der Inhalt der
Kavitäten abgesaugt oder ausgeschüttelt. Danach Kavitäten mit
frisch angesetztem Waschpuffer vollständig füllen und vollständig
wieder entleeren. Zwischen den einzelnen Waschschritten den in
den Kavitäten verbliebenen Puffer durch Klopfen der umgedrehten
Kavitäten auf sauberem saugfähigen Papier entfernen. Die
Waschwirkung wird verbessert, wenn Waschpuffer in einem
Winkel in die Kavität eingefüllt wird, so dass in den Kavitäten eine
Verwirbelung erzeugt wird.
Nach dem abschließenden Waschschritt wird die Mikrotiterplatte
umgedreht und auf saugfähigem Papier abgeklopft, um letzte
Waschpufferreste zu entfernen.
Automatisches Waschen
Waschautomaten sind so einzustellen, dass 4 Waschzyklen
vollständig ablaufen und dass eine 2 Minuten entsprechende
Einweichzeit während des gesamten Waschzyklus vorgesehen
wird. Waschautomaten müssen genau kalibriert sein, damit
vollständige Füllung und Entleerung der Kavitäten zwischen den
Waschschritten gewährleistet wird. Nach dem abschließenden
Waschschritt wird die Mikrotiterplatte umgedreht und auf
saugfähigem Papier abgeklopft, um letzte Waschpufferreste zu
entfernen.
10.2.4 Zusetzen von Anti-IgG-Konjugat
In jede Kavität 100µL Anti-IgG-Konjugat pipettieren.
Wird den Anforderungen an die Qualitätskontrolle nicht
entsprochen, dann sind die Testergebnisse ungültig und der Test
muss wiederholt werden
11.3.PATIENTENPROBEN
Von jeder Patientenprobe (ExtinktionProbe) den Mittelwert bilden.
Die individuellen Extinktionswerte sollten um nicht mehr als 25%
vom Mittelwert abweichen. Stärker abweichende Proben sollten
erneut untersucht werden. Da niedrige Extinktionswerte mit
größerer Ungenauigkeit gemessen werden, kann zwischen zwei
Testkavitäten, die beide ein negatives Ergebnis zeigen, auch eine
Differenz um mehr als 25% akzeptiert werden, ohne dass eine
nochmalige Untersuchung erfolgen muss
11.4.INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
10.2.5 Konjugatinkubation
Mikrotiterplatten abdecken und auf dem Schüttler bei
Raumtemperatur (20-25°C) unter Rütteln für einen Zeitraum von
60 Minuten inkubieren.
10.2.6 Waschen der Kavitäten
Das Waschen der Mikrokavitäten erfolgt wie in Abschnitt 10.2.3
erläutert.
10.2.7 Substratzugabe und Inkubation
In jede Kavität 100µL Substrat pipettieren.
Mikrotiterplatten abdecken und ohne Schütteln bei
Raumtemperatur (20–25°C) für einen Zeitraum von 10 Minuten
inkubieren
10.2.8 Stoppen der Reaktion
In jede Kavität 100µL Stopplösung pipettieren Für sorgfältiges
Vermischen in den Kavitäten sorgen. Das angefärbte Produkt ist
30 Minuten lang stabil. Nicht direktem Sonnenlicht aussetzen,
da es zu lichtbedingtem Ausbleichen des Färbeprodukts kommen
kann.
10.3.ABLESEN DER TESTERGEBNISSE
10.3.1 Photometrische Auswertung
Der IDEIA Borrelia-burgdorferi-IgG-Test schließt eine Cutoff-Kontrolle ein, die eine spezifische Menge für Borrelia
burgdorferi spezifische IgG-Antikörper enthält. Nachgewiesene
Antikörperkonzentrationen, die oberhalb des Werts dieser
Cut-off-Kontrolle liegen, deuten stark auf eine aktive Borreliaburgdorferi-Infektion hin. Das IDEIA Borrelia-burgdorferi-IgGKit weist auch Antikörper in Konzentrationen unterhalb dieses
spezifischen Cut-off-Werts nach; hierbei kann es sich um latente
Antikörper von einer früheren Infektion bzw. um kurz nach
einer Infektion noch in sehr niedriger Konzentration vorliegende
Antikörper handeln. Niedrige Antikörperkonzentrationen müssen
mit Vorsicht interpretiert werden, um die Signifikanz niedriger
Antikörperkonzentrationen sicher zu ermitteln, wird empfohlen,
bei den Patienten nach mindestens zwei Wochen eine zweite
Probe zur Nachkontrolle zu nehmen, um Änderungen bei der
Antikörperkonzentration festzustellen, aus denen sich die
Signifikanz des Antikörpers besser bestimmen lässt.
11.4.1 Qualitative Interpretation
Die Nachweisgrenze (OD IgG-NACHWEIS) für IgG-Antikörper gegen
Borrelia burgdorferi wird berechnet als ODCut-off x 0,5.
Die Konzentration, oberhalb der der Antikörper wahrscheinlich
auf eine aktive Infektion zurückzuführen ist, ist gleich dem ODIgG
Cut-off-Wert.
Die Mikrotiterplatten-Kavitäten müssen innerhalb von 30
Minuten nach Zugabe der Stopplösung photometrisch abgelesen
werden. Den Inhalt der Mikrotiterplatten-Kavitäten mischen
und den Extinktionswert jeder Kavität mit einem geeigneten
Spektrophotometer oder EIA-Plattenlesegerät bei 450nm ablesen.
Sicherstellen, dass vor dem Ablesen der Boden der Kavitäten
sauber ist und sich keine Fremdkörper in den Kavitäten befinden.
Vor dem Scannen der Platte wird das Absorptionsspektrum gegen
Luft als Referenz (Referenzküvettenhalter bleibt leer) vermessen.
Wenn das Spektophotometer oder das EIA-Plattenlesegerät
die Anwendung einer Referenzwellenlänge (bei 620 bis
650nm) gestatten, ist eine doppelte Wellenlängenablesung
durchzuführen, um mögliche Interferenzen durch Aberrationen,
wie z. B. Verschmutzungen oder Flecken auf der optischen
Oberfläche der Mikrotiterplatten-Kavitäten, zu beseitigen.
Zwischen diesen beiden Konzentrationen liegende ODWerte von Proben weisen auf das Vorliegen von niedrigen
Antikörperkonzentrationen hin, die mit Vorsicht interpretiert
werden müssen. Die Interpretation sollte folgendermaßen
erfolgen:
ODPROBE <ODIgG-NACHWEIS Negativ für IgG-Antikörper gegen B. burgdorferi
ODPROBE >ODIgG-NACHWEIS et <ODIgG-Cut-off Vorliegen von Antikörpern.
Es wird empfohlen, nach zwei Wochen eine Probe zur
Nachkontrolle zu nehmen, um den Infektionsstatus des Patienten
zu bestätigen.
ODPROBE >ODIgG-Cut-off Sicherstellen, dass Reagenzien vor der
Raumtemperatur angenommen haben (15–30°C)
11.4.2 Semiquantitative
Einheiten) Positives Ergebnis - aktive Produktion von IgG-Antikörpern gegen B. burgdorferi
Interpretation
(frei
gewählte
Serumproben 1+200 durch Zugabe von 10µL Serum zu 2mL
Probenverdünnungsmittel verdünnen.
Die Extinktionswerte, die zwischen ExtinktionIgG-Cut-off und
ExtinktionIgG-positiv liegen, korrespondieren direkt mit dem
100µL Kontrolle oder Probe zusetzen
Abdecken und unter
Rütteln 60 Minuten bei
20–25°C inkubieren
Logarithmus der frei gewählten Einheiten für spezifische
Antikörper in der Probe. Dies veranschaulicht Abbildung 1 anhand
von Ergebnissen einer Verdünnungsreihe von anti-B. burgdorferiIgG-Positivserum, das in Negativserum verdünnt wurde.
2.500
IgG-Positivkontrolle
Waschen (x4)
2.000
100µL Anti-IgG-Konjugat zusetzen
OD
1.500
IgG-Cut-off-Kontrolle
0.500
0.000
10
100
1000
Log (Verdünnung)
Abdecken und ohne
Rütteln 10 Minuten lang
bei 20-25°C inkubieren
100µL Stopplösung zusetzen
Extinktionswert photometrisch bei 450nm ablesen
(reterenzwellenlänge bei 620 bis 650nm)
11. QUALITÄTSKONTROLLE UND INTERPRETATION DER
TESTERGEBNISSE
11.1.PROBENVERDÜNNUNGSMITTEL
Der Extinktionswert der Probenverdünnung muss weniger als
0,100 aber mehr als 0,000 (doppelte Wellenlänge) betragen.
Liegt der Wert über 0,100 kann dies durch unangemessenes
Waschen oder durch Kontamination des Strubstrats bedingt sein.
Bei einem Wert unter 0,000 sollte der Platereader erneut gegen
Luft vermessen und die Mikrokavitäten erneut abgelesen werden.
Wird den Anforderungen an die Qualitätskontrolle nicht
entsprochen, dann sind die Testergebnisse ungültig und der Test
muss wiederholt werden
11.2.IgG-CUT-OFF-KONTROLLE UND IgG-POSITIVKONTROLLE
Die Extinktionsmittelwerte für die 3 IgG-Cut-off-Kontrollen
(ExtinktionIgG-Cut-off) und die 2 IgG-Positivkontrollen
(ExtinktionIgG-positiv)
bestimmen.
Die
individuellen
Extinktionswerte sollten um nicht mehr als 25% vom
Extinktionsmittelwert abweichen. Wenn einer der IgG-Cut-offKontrollwerte um mehr als 25% vom Mittelwert abweicht, sollte
dieser von der Auswertung ausgeschlossen und der Mittelwert
neu berechnet werden.
Die Differenz zwischen den Extinktionswerten der IgG-Cut-offKontrolle und der IgG-Positivkontrolle muss mindestens 0,500
betragen. Durch unzureichendes Waschen oder Schütteln während
der Inkubation oder durch niedrige Umgebungstemperatur,
insbesondere während der Inkubation mit der Substratlösung,
könnte dieser Wert unter 0,500 liegen.
8. 8.Karlsson M. (1990) Western immunoblot and flagellum enzyme-linked
immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol
28: 2148-50.
Positive Ergebnisse
Ein positives Ergebnis zeigt eine kürzlich stattgefundene Infektion
mit B. burgdorferi an.
Uneindeutige Ergebnisse
Jedes Ergebnis innerhalb von ±20% der ExtinktionIgG-Cut-off sollte als
uneindeutig betrachtet und mit Vorsicht ausgewertet werden.
Eine Wiederholung des Tests mit diesen Proben ist ratsam.
Bei einem nicht eindeutigen Ergebnis sollte innerhalb von
zwei Wochen eine zweite Probe untersucht werden. Wenn die
Ergebnisse beider (oder mehrerer aufeinanderfolgender) Proben
uneindeutig sind, kann der Patient als IgG-negativ angesehen
werden.
12. LEISTUNGSGRENZEN
12.1.Ein negatives Resultat schließt die Möglichkeit einer B.
burgdorferi-Infektion des Patienten nicht aus. Faktoren
wie Probengewinnung zu einem unangemessenen
Zeitpunkt vor Auftreten nachweisbarer Antikörper, falsche
Probennahme und/oder Probenhandhabung können dazu
führen, dass B. burgdorferi nicht nachgewiesen wird.
Eine frühzeitig einsetzenden Behandlung mit Antibiotika
kann die Antikörperreaktion unterdrücken und die
Antikörperexpression einiger Individuen liegt potentiell
unter einem nachweisbaren Niveau.
12.2.Ein positives Ergebnis verweist auf vorherige
immunologische Aussetzung und ist kein Nachweis einer
aktiven Infektion.
12.3.Alle positiven Ergebnisse müssen im Kontext der klinischen
Informationen des einzelnen Patienten und der Daten
aus epidemiologischen Studien interpretiert werden und
rechtfertigen nicht die Behandlung eines Patienten. Die
Möglichkeit einer Aussetzung zu einem Zeckenbiss ist
immer mit zu berücksichtigen.
13. VALEURS ATTENDUES
Die IgG Cut-Off Kontrolle wurde so eingestellt, dass der Kit
eine Spezifität von 98% für normale Seren aufweist. Die
Antikörperantwort auf das B. burgdorferi-Flagellum hängt
von der klinischen Manifestation der Infektion und der Dauer
der Erkrankung ab. Bei einigen häufig auftretenden klinischen
Manifestation von B. burgdorferi-Infektionen wurde die
diagnostische Sensitivität eines indirekten IgM-Assays mit
gereinigtem nativen B. burgdorferi-Flagellum als Testantigen
ermittelt als6,8:
Klinische Manifestation
Erythema migrans
Lymphozytische Meningoradikulitis
Akrodermatitis chronica atrophicans
Diagnostische Sensitivität
36%
77%
100%
14. LEISTUNGSMERKMALE
14.1.SPEZIFITÄT
Die Spezifität des IDEIA Borrelia burgdorferi IgG wurde von einem
unabhängigen Routinelabor in Schweden ermittelt. Bei der
Studie wurden 200 Serumproben von gesunden Blutspendern
untersucht, die in einem für Lyme Borreliose endemischen Gebiet
leben.
14.2.DIAGNOSTISCHE SENSITIVITÄT
1
Waschen (x4)
100µL Substrat zusetzen
Ein negatives Ergebnis schließt einen Kontakt mit B. burgdorferi
nicht aus. Besteht weiterhin Verdacht auf eine Lyme-BorrelioseErkrankung, dann sollten weitere Proben zu einem späteren
Zeitpunkt gewonnen werden.
Spezifität
Erwartet
Ermittelt*
98%
98.5%
* Uneindeutige Ergebnisse wurden als negativ gewertet.
1.000
Abdecken und unter
Rütteln 60 Minuten bei
20–25°C inkubieren
Negative Ergebnisse
7. Hansen K, Hindersson P, Pedersen NS. (1988) Measurement of
antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in
Lyme disease.J Clin Microbiol 26: 338-46.
12.4.Die Testleistung wird beeinträchtigt, falls Reagenzien
modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5.2
spezifizierten Bedingungen gelagert werden.
10.4.ZUAMMENFASSUNG DES IDEIA BORRELIA BURGDORFERI
IgG-ASSAYVERFAHRENS
Verwendung
11.4.3 Anmerkungen zur Interpretation der Ergebnisse
Abbildung 1:
Ergebnis einer Verdünnungsreihe eines
für IgG-Antikörper gegen B. burgdorferi positiven Serums in
Negativ¬serum. Zusätzlich sind die Extinktionswerte der IgG-Cutoff und der IgG-Positivkontrolle eingetragen.
Der spezifische Antikörper-Spiegel in der IgG-Cut-off-Kontrolle
wurde als 1 definiert (UIgG-Cut-off = 1 Einheit). Die Menge an
spezifischen Antikörpern in der IgG-Positivkontrolle wurde auf 8 x
UIgG-Cut-off eingestellt (UIgG-Positiv = 8 Einheiten).
Für eine Probe können frei gewählte Einheiten von spezifischen
Antikörpern (UProbe) nach folgender Formel berechnet werden:
ExtinktionPROBE - Extinktion IgG Cut-off
UPROBE=10a, a = x 0,9*
ExtinktionIgG positiv - Extinktion IgG Cut-off
*logUIgG Positiv -logUIgG Cut-off = log8 - log1 = 0,9
Uneindeutige Ergebnisse
Die Nachweisgrenze von IgG-Antikörpern entspricht 0,9
Einheiten. Die Konzentration, oberhalb der der Antikörper
höchstwahrscheinlich auf eine aktive Infektion zurückzuführen
ist, entspricht 1,1 Einheit.
Proben mit weniger als 0,9
Einheiten spezifischen Antikörpers werden als negativ für
IgG-Antikörper gegen B. burgdorferi interpretiert. Proben mit
0,9 bis 1,1 Einheiten deuten auf das Vorliegen von niedrigen
Antikörperkonzentrationen hin, die mit Vorsicht interpretiert
werden müssen; es wird empfohlen, nach zwei Wochen eine
Probe zur Nachkontrolle zu nehmen, um den Infektionsstatus
des Patienten zu bestätigen. Proben mit 1,1 Einheit oder mehr
spezifischen Antikörpers werden als positiv für IgG-Antikörper
gegen B. burgdorferi interpretiert.
Im Fall von Proben, deren Extinktionswerte über ExtinktionIgG-positiv
liegen, sollten die Einheiten der spezifischen Antikörper gegen B.
burgdorferi mit größer als 8 angegeben werden.
Eine Änderung des spezifischen Antikörper-Spiegels bei einem
Patienten könnte als signifikant angesehen werden, wenn sich
die frei gewählten Einheiten in einer später genommenen Probe
entweder verdoppeln oder auf die Hälfte absinken.
Die diagnostische Sensitivität des IDEIA Borrelia burgdorferi IgG
wurde ebenfalls von dem unabhängigen Routinelabor in Schweden
ermittelt. Bei dieser Studie wurden 3 Panels mit Serumproben
von Patienten mit den häufigsten klinischen Manifestation
einer B. burgdorferi-Infektion untersucht: 45 Serumproben von
Patienten mit Erythema migrans, 38 Serumproben von Patienten
mit Lymphozytischer Meningoradikulitis, und 20 Serumproben
von Patienten mit Akrodermatitis chronica atrophicans. Die
Ergebnisse werden mit den zuvor mitgeteilten erwarteten
Werten verglichen6, 8.
Diagnostische Sensitivität
Klinische Manifestation
Erwartet
Ermittelt*
Erythema migrans
36%
38%
Lymphozytische Meningoradikulitis 77%
79%
Akrodermatitis chronica atrophicans 100%
100%
* Uneindeutige Ergebnisse wurden als negativ gewertet.
14.3.KREUZREAKTIVITÄT
Seren von Patienten mit Syphilis und entzündlichen Erkrankungen
(Rheumafaktor (RF) positiv) wurden mit dem IDEIA Borrelia
burgdorferi-IgG untersucht und ergaben folgende Ergebnisse:
Patientenserum Anzahl der Seren
Anzahl positiv*
Syphilis
25
0
FR
18
1
* Grenzwertige Ergebnisse wurden als negativ gewertet.
15. REFERENCES/REFERENZEN
1. Burgdorferi W, Barbour AG, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis JP.
(1982) Lyme disease - a tick-borne spirochetosis? Science 216: 1317-9.
2. Steere AC, Grodzicki RL, Kornblatt AN, Craft JE, Barbour AG, Burgdorferi
W, et al. (1983) The spirochetal etiology of Lyme disease. N Engl J Med 308:
733-40.
3. Steere AC. (1989)Lyme disease. N Engl J Med 321: 586-96.
4. Craft JE, Duncan KF, Shimamoto GT, Steere AC. (1986) Antigens of
Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a
new immunoglobulin M response and expansion of the immunoglobulin G
response late in the illness. J Clin Invest 78: 934-9.
5. 5.Zöller L, Burkard S, Schäfer H. (1991) Validity of Western immunoblot
band patterns in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 29:
174-82.
6. Hansen K, Pii K, Lebech A-M. (1991) Improved immunoglobulin M
serodiagnosis in Lyme borreliosis by using a µ-capture enzyme-linked
immunosorbent assay with biotinylated Borrelia burgdorferi flagella. J Clin
Microbiol 29: 166-73.
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