Grundlagen:
Ampicillin
Plasmid ohne
Resistenzgenen
Bakterien besitzen die Fähigkeit Antibiotika
In ihrer Wirkung abzuschwächen oder total
unwirksam zu machen. Die dafür notwendige
Information findet sich auf den sogenannten
Resistenzgenen. Befindet sich innerhalb des
Resistenzgens eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym, so kann das Plasmid für die Identifizierung transformierte Bakterien verwendet
werden.
Tetracyclin
Plasmid mit
Resistenzgenen
Öffnung des Plasmidringes erfolgt innerhalb
der Gensequenz für die Antibiotikaresistenz.
Dadurch wird die Resistenz gegen Tetracyclin
zerstört!
Ablauf:
Plasmid
Fremdgen
Restriktionsenzym
Das Restriktionsenzym schneidet
Plasmidring und Fremd-DNA an
den durch das Restriktionsenzym
bestimmten Stellen auf.
TCGAATTCGC
AGCTTAAGCG
Ablauf:
Plasmid
Fremdgen
Restriktionsenzym
Das Restriktionsenzym schneidet
Plasmidring und Fremd-DNA an
den durch das Restriktionsenzym
bestimmten Stellen auf.
Dadurch entstehen sticky ends.
Diese sind spiegelbildlich und
lagern sich auf Grund des
„klebrigen Effektes“ leicht wieder
zusammen
Jedoch ist auch der Einbau einer
Fremd-DNA auf Grund der gleichartigen
sticky ends möglich.
TCGAATTCGC
AGCTTAAGCG
Im Versuchsansatz sind zwei
strukturell unterschiedliche
Plasmidringe vorhanden.
Die Plasmidringe sollen nun in
eine Bakterienzelle eingebracht
werden
Das Einbringen der Plasmide
erfolgt durch eine Kombination
von Hitze- und Kälteschock bei
gleichzeitiger Zugabe von CalciumChlorid. Dies führt zu einer Perforation der Zellmembran, die das
Eindringen erleichtert.
Bakterienzelle
Bakterienzelle
Für den Wissenschaftler stellt sich
nun die Frage welches Bakterium
die Fremd-DNA enthält und damit
transformiert ist.
Die Lösung des Problems erfolgt mit Hilfe einer Stempeltechnik
Die Bakteriensuspension, die beide Typen
von Bakterien enthält, wird auf eine Agarplatte mit Ampicillin ausgebracht.
Da beide resistent sind werden sie auf dem
Nährboden heranwachsen.
Durch Verwendung eines Stempels, der
auf die Kolonien gedrückt wird, kann
das Muster auf einen Nährboden übertragen werden der Tetracyclin enthält.
Diejenigen Bakterien , die darauf
heranwachsen sind nicht transformierte Zellen, da sie ihre Resistenz gegen Tetracylin noch
besitzen.
Die transformierten Bakterienzellen können nun aus dem Nährboden herausgestochen, in eine Nährlösung überführt
und darin vermehrt werden. Sie stehen für weitere Experimente zur Verfügung.