bauanleitung - Wiley-VCH

Abb. 1
Messküvette für Internodialzellen, Ableitung von Membranspannung und Strominjektion mit
extrazellulären Elektroden; Aufsicht.
Bauanleitung einer Messküvette zum Artikel "Algen unter Strom" in BIUZ 5/2006
Ein Plexiglasblock mit den Maßen 200 mm Länge, 100 mm Breite und 20 mm Tiefe
wird horizontal mit drei Reihen Bohrungen in gleichen Abständen versehen. Die
Bohrungen sind je 15 mm tief, 10 mm im Durchmesser und besitzen 10 mm Abstände
voneinander. Eine größere Anzahl horizontaler Bohrungen - wie hier gezeigt - erlaubt
die Verwendung unterschiedlich langer Internodialzellen (in der Darstellung bis zu
13 cm lange Internodien).
Die untere Reihe Bohrungen nimmt die Internodialzelle auf; hierfür sind die Bohrungen
horizontal mit einem durchgehenden Kanal von je 1,5 mm Breite und Tiefe versehen.
Die Kanalabschnitte werden entsprechend der Zelllänge mit Vaseline gefüllt, die
extrazellulär einen elektrischen Kurzschluss zwischen den benachbarten Bohrungen
verhindert.
Die Bohrungen der mittleren horizontalen Reihe dienen nach Füllung mit 2%-igem
Agar (w/v in APW) als elektrische Brücken zwischen der unteren und der oberen Reihe.
Dazu verbinden sie Kanäle in vertikaler Richtung von 1,5 mm Breite und 5 mm Tiefe.
Zur Füllung mit flüssigem APW-Agar müssen die benachbarten Bohrungen der unteren
und oberen Reihe mit einem Stopfen verschlossen werden, um das Überlaufen in diese
Bohrungen zu verhindern.
Die obere Reihe Bohrungen nimmt die Elektrodenlösung (1 M KCl) auf, die elektrisch
über die Agar-Brücken mit je einem Zellabschnitt in elektrischer Verbindung stehen.
Die Verwendung identischer KCl-Lösung verhindert das Auftreten einer Cl--abhängigen
Spannung zwischen den Elektroden.
Jedes Küvetten-Kompartiment der oberen bzw. unteren Reihe wird mittig in 10 mm
Tiefe mit einer Bohrung von 0,8 mm Durchmesser versehen. Silberdrähte gleicher
Stärke werden durch die Bohrungen in die Kompartimente geschoben; eventuelle Lecks
können mit Wachs abgedichtet werden (Lötkolben). In den Kompartimenten werden die
Silberdrähte chloriert (1 N HCl, 9 V Batterie, 10 k Widerstand).
Abb. 2
Chlorierung der Silberdrähte in den Kompartimenten der oberen und unteren Reihen.
Die in die Bohrungen (mit Wachs) eingeschweißten Silberdrähte werden an den Plus-Pol einer
9-V-Batterie angelegt, ein beweglicher Silberdraht wird in die Salzsäurelösung eingeführt und
über einen 10 k-Widerstand an den Minus-Pol der Batterie gelegt. Vor der Chlorierung
sollten die Silberdrähte geschliffen (feines Sandpapier) und gereinigt (dest. Wasser) werden,
um Kristallisationskerne zu vermeiden. Der Widerstand begrenzt den Strom (etwa 1 mA) und
bedingt eine gleichmäßige Chlorierung des Silberdrahtes. Die Chlorierung ist nach 15 Minuten
abgeschlossen, danach ist der exponierte Silberdraht im Kompartiment mit einer schwarzen
AgCl-Schicht überzogen.
Anästhetisierung eines Zellabschnitts und osmotische Balance der APW-enthaltenden
Küvetten-Kompartimente: die Behandlung eines Zellabschnitts mit 110 mM KCl hat
eine Depolarisation der Membranspannung bis auf 0 mV zur Folge, während die
Ruhespannung von etwa -200 mV in den APW-Kompartimenten erhalten bleibt. Das
künstliche Teichwasser (Artificial Pond Water) enthält nur je 0,1 mM Konzentrationen
von KCl, NaCl, CaCl2 und zusätzlichem 5 mM Tris-Puffer (pH 7.5). Um einen
tranzellulären Wasserfluss auf Grund des osmotischen Gradienten zwischen 110 mM
KCl und APW zu vermeiden, wird dem APW 180 mM Sorbitol zugesetzt.
Die Membranspannung kann zwischen Elektroden der oberen Reihe (‚Cytoplasma’ im
110-KCl-Kompartiment und einem beliebigen APW/Sorbitol-Kompartiment) gemessen
werden. Das Messinstrument sollte einen Eingangswiderstand von mindestens 109 
besitzen; in der Regel muss zwischen Registriergerät und Elektroden ein Vorverstärker
(Impedanzwandler) geschaltet werden.
Die chlorierten Elektroden der unteren Reihe Bohrungen dienen der Zuführung eines
definierten Stroms. Hier ist eine Salzbrücke zur Umgehung von Potentialdifferenzen
zwischen den Elektroden nicht notwendig, da sie lediglich der Strominjektion, nicht der
Spannungmessung dienen und vom Spannung messenden Kreis unabhängig sind. Strom
wird über einen hohen Vorwiderstand im 110-mM-Kompartiment in die Zelle injiziert
und tritt in einem APW/Sorbitol-Kompartiment (in dem auch die Membranspannung
abgeleitet wird) wieder aus der Zelle aus.
Wird eine 9-V-Batterie zur Stromapplikation benutzt, so können Vorwiderstände von
10 - 65 M verwendet werden. In diesem Widerstandsbereich wird der Membranstrom
auf ein Maximum von 0,25 µA·cm2 begrenzt und mit weniger als 1% Fehler definiert.
Abb. 3
Ableitung der Membranspannung und Strominjektion mit Hilfe frei beweglicher
Elektroden. Die Elektroden für die Spannungmessung bestehen je aus einem chlorierten
Silberdraht, der in eine 1 M KCl-Lösung in einer Pipettenspitze ragt. Der Silberdraht kann mit
Wachs in die Pipettenspitze eingeschmolzen werden oder einen Stopfen durchbohren. Über die
mit 1 M KCl gefüllte Pipettenspitze wird ein Silikonschlauch gestülpt, der ein 2%-iges Gel aus
APW/Agar enthält. Für zukünftige Versuche können Agar-gefüllte Schlauchstücke in APW im
Kühlschrank aufbewahrt werden. Die Außenkompartimente der Küvette enthalten 110 mM
KCl, das zentrale Kompartiment mit 180 mM Sorbitol osmotisch ausbalanciertes APW. Für die
Stromelektroden wird keine Agar-Brücke benötigt, die Silberdrähte sollten jedoch chloriert
sein. Appliziert man den Strom in beiden Außenkompartimenten, so fließt der Membranstrom
im zentralen Kompartiment weitgehend homogen über die Zellmembran ab.
Man kann die Membranspannung auch mit Hilfe beweglicher Elektroden ableiten. Die
Küvette besteht aus mindestens zwei Kompartimenten; ein oder zwei äußere
Kompartimente sollten groß genug sein, um verschieden lange Internodialzellen
verwenden zu können, zwischen diesen befindet sich eine zentrale Bohrung. Für die
Strominjektion können ebenfalls frei bewegliche Elektroden benutzt werden. Die
Abmessungen der Küvette sind ähnlich denen in Abbildung 1; der Plexiglasblock kann
flacher gehalten werden, weil nun die Bohrungen für die Silberdrähte fehlen. Zur
Strominjektion wird die unten beschriebene Schaltung benutzt (Abbildung 4).
Abb. 4
Schaltkreis zur Strominjektion in Internodialzellen.
Ein Schalter mit drei Positionen wird wie in Abbildung 4 mit einer Batterie
(vorzugsweise 9 V) verbunden. Der kreuzweise Kurzschluss der gegenüberliegenden
Außenkontakte führt dazu, dass durch Schalterstellung die Stromrichtung durch die
Zelle geändert werden kann (rote Schalterstellung: depolarisierender oder blaue
Schalterstellung: hyperpolarisierender Strom), da entweder der eine oder der andere
Batteriepol mit Erde kurzgeschlossen wird. Der Stromkreis wird durch den Schalter S
geschlossen.
Über einen Wahlschalter können verschiedene Vorwiderstände (RV) in den Stromkreis
gebracht werden.
Hinrich Lühring, Jülich