Seminar - Universität des Saarlandes
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Seminar Biotechnologie 1 Lipid rafts und ihre Funktion in biologischen Membranen Universität des Saarlandes Institut für Biophysik Verfasst von: Lisa Finkler Matrikelnummer 2535995 [email protected] Studiengang: Biotechnologie Master Semester: SS 2012 Betreuer: Prof. Dr. I. Bernhardt 1 Inhaltsverzeichnis EINLEITUNG ................................................................................................................. 3 AUFBAU EINER BIOLOGISCHEN MEMBRAN ..................................................................... 3 Membranlipide ....................................................................................................................................................... 5 Phospholipide ..................................................................................................................................................... 5 Sphingolipide ...................................................................................................................................................... 6 Cholesterin ......................................................................................................................................................... 6 Membranproteine .................................................................................................................................................. 7 Integrale Membranproteine............................................................................................................................... 7 Periphere Membranproteine ............................................................................................................................. 8 Lipidverankerte Proteine .................................................................................................................................... 8 FUNKTIONEN DER BIOLOGISCHEN MEMBRAN ................................................................ 9 FLUID MOSAIC MODELL EINER BIOLOGISCHEN MEMBRAN ............................................ 10 LIPID RAFTS ................................................................................................................ 11 Funktionen von Lipid rafts ................................................................................................................................... 12 ERGEBNISDARSTELLUNG DER WISSENSCHAFTLICHEN ARTIKEL ÜBER LIPID RAFTS ........... 15 „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ von Ulrich Salzer, Rainer Prohaska; blood (2001 97:1141-1143) ..................................................................................................... 15 “Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin” von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borken, Rainer Prohaska; blood (2002 99: 2569-2577) ................................................................................................................................. 18 LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................................. 22 ABBILDUNGSVERZEICHNIS........................................................................................... 23 2 Einleitung Eine biologische Membran dient als Grenze zwischen zwei Kompartimenten. Sie kann zum einen als intrazelluläre Trennschicht, innerhalb einer lebenden Zelle dienen, aber auch als Trennschicht zwischen der Zelle und dem Zellaußenraum. Biologische Membranen sind selektivpermeabel, das bedeutet, dass sie neben ihrer Funktion als Grenze auch einen selektiven Stofftransport und Austausch ermöglichen. Eine weitere Aufgabe einer biologischen Membran liegt in dem Informationsaustausch zwischen den beiden anliegenden Kompartimenten. Biologische Membranen bestehen hauptsächlich aus Lipiden und Proteinen. Die Membran und ihre Bestandteile bilden dabei keine starre Struktur, sondern die darin enthaltenen Lipide und Proteine können sich darin leicht bewegen. Im Rahmen der Seminararbeit wird das Modell der „Lipid Rafts“ sowie deren Funktionen weiter erläutert. Lipid Rafts, oder auch Lipidflöße, beschreiben Cholesterin-reiche Mikrodomänen in Zellmembranen. Lipid Rafts weisen ebenfalls ein flüssig-kristallines Verhalten wie andere Bereiche der Zellmembran auf, sind jedoch dichter gepackt und stärker geordnet als ihre Umgebung. Sie schwimmen wie Flöße auf der Lipidmembran [1, 2]. Aufbau einer biologischen Membran Membranen sind flächige hydrophobe Molekülaggregate, welche in wässrigem Milieu von selbst stabile Strukturen ausbilden. Biologische Membranen bestehen aus Proteinen und Lipiden. Des Weiteren können Kohlenhydratketten an die Proteine (Glykoproteine) oder Lipide (Glykolipide) geknüpft sein. Der Anteil der verschiedenen Komponenten variiert je nach Zelltyp und Membran. In den meisten Membranen tierischer Zellen ist außerdem Cholesterin enthalten. 3 Lipide bilden die Grundstruktur der Membran. Sie bestehen aus einem hydrophilen und einem hydrophoben Teil, somit sind die amphiphil. In polarem Lösungsmittel können sie Mizellen (kugelförmige Aggregate) aber auch Lipiddoppelschichten ausbilden, wobei der hydrophile Teil mit dem polaren Lösungsmittel interagiert. Diese Lipiddoppelschicht ist für hydrophile Moleküle sowie Wasser relativ undurchlässig und wirkt somit als passive Trennschicht. Cholesterin geht eine hydrophobe Wechselwirkung mit den Lipiden ein und verfestigt somit die relativ flexible Membran [3, 4]. Die Proteine werden unterschieden in integrierte, periphere und lipidverankerte Proteine. Integrierte Proteine sind in die Membran integriert und durchziehen diese. Periphere Proteine sind an die Membran oder die darin enthaltenen Proteine nichtkovalent gebunden. Lipidverankerte Proteine sind kovalent an in die Membran eingelagerte Lipidmoleküle gebunden. Proteine besitzen nur eine geringe Stützfunktion, sie bewegen sich flexibel in der Biomembran. Zu ihren Augaben zählen Stofftransport, Elektronentransport sowie die Verankerung des Cytoskeletts an der Biomembran [1, 2]. In Abbildung 1 ist schematisch der Aufbau einer biologischen Membran sowie der Hauptbestandteile dargestellt. Abbildung 1: Aufbau einer Biomembran [1] 4 Membranlipide Biologische Membranen bestehen aus den drei Hauptarten von Lipiden, den Phospholipide, Sphingolipiden sowie Cholesterin. Biologische Lipide allgemein sind amphiphil, das bedeutet, dass sie sowohl hydrophil als auch lipophil sind. Sie besitzen einen lipophilen Kohlenwasserstoffrest und eine hydrophile Kopfgruppe. Phospholipide Phospholipide sind phosphorhaltige amphiphile Lipide, wobei sie aus einem hydrophilen Kopf und zwei hydrophoben Kohlenwasserstoffschwänzen aufgebaut sind. Sie besitzen meistens als Grundgerüst Glycerin, weshalb man sie auch Phosphoglyceride nennt. Zu den häufigsten in der Zellmembran vorkommenden Phospholipiden zählen Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin sowie Phosphatidylinositol. Die Strukturformeln sind Abbildung 2 zu entnehmen. Abbildung 2: Strukturformeln der häufigsten Phospholipiden in Biomembranen [2]; R und R´ = Fettsäure an Position 1 und Position 2 des Glycerins 5 Sphingolipide Sphingolipide gehören ebenfalls zu der Gruppe der Lipide. Sie bestehen aus Sphingosin, welches über seine Aminogruppe mit einer Fettsäure (Stearinsäure im Beispiel) verknüpft ist (siehe Abbildung 3). Das Sphingosinrückgrat kann über eine Phosphatgruppe durch Esterbildung mit geladenen Gruppen verbunden sein, wie zum Beispiel Cholin oder Serin. Handelt es sich bei der Kopfgruppe um einen Zucker, können an diesen über eine glykosidische Bindung ebenfalls Gruppen angeknüpft werden, sodass Glykosphingolipide entstehen. Abbildung 3: Strukturformel von Sphingomylin als Beispiel für ein Sphingolipid [3] Spingolipide spielen vor allem eine Rolle bei der Signalübertragung, der Interaktion zwischen einzelnen Zellen, sowie Prozessen wie Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Zelltod [5, 6]. Cholesterin Cholesterin gehört zu den Steroiden, welche ebenfalls zu den Lipiden zählen. Der hydrophile Anteil, die OH-Gruppe befindet sich an der Membranoberfläche, der hydrophobe Rest des Moleküls hingegen in der Membran. Cholesterin erhöht die Stabilität der Membran, da es den Fluss in der Lipidschicht verhindert, diese also starrer macht. Des Weiteren ist es an dem Stofftransport von Signalstoffen beteiligt. 6 Abbildung 4: Strukturformel Cholesterin [4] Membranproteine Neben den Membranlipiden stellen die Membranproteine den zweiten großen Anteil in biologischen Membranen dar, welcher je nach Membran variiert. Es wird prinzipiell zwischen drei verschiedenen Arten von Membranproteinen unterschieden: den integralen, peripheren und lipidverankerten Proteinen. Die unterschiedlichen Proteine besitzen unterschiedliche Funktionen und diese verleihen der Membran unterschiedliche Eigenschaften. Membranproteine sind an Stoff- und Signalaustauschprozessen beteiligt und bieten eine Verankerungsstelle für das Cytoskelett. Nach dem Flüssig-Mosaik-Modell sind die Membranproteine flexibel in der Membran eingelagert und können ihre Position verschieben. Die Fluidität der Membran ist abhängig von Lipidzusammensetzung, speziell Cholesterin, sowie der Temperatur [7, 8]. Integrale Membranproteine Integrale Membranproteine sind in die Membran integriert. Sie enthalten ein oder mehrere Helices, welche die Membran durchziehen. Genauso wie Membranlipide sind sie amphipathisch. Der Anteil innerhalb der Lipiddoppelschicht ist dabei hydrophob. Aminosäurereste gehen hydrophobe Wechselwirkungen mit Fettsäureketten der Lipidschicht ein, wodurch eine Verankerung erzielt wird. 7 Der nicht eingebettete Anteil zeigt meist einen hydrophilen Charakter, sodass er mit der umgebenen Flüssigkeit sowie den darin enthaltenen Substanzen wechselwirkt. Integrale Membranproteine sind nicht starr in der Membran verankert sein, sie bewegen sich zu innerhalb der Membran. Periphere Membranproteine Periphere Membranproteine sind an der Membran angelagert. Ihre Bindung an die Membran erfolgt durch elektrostatische, hydrophobe oder anderen nichtkovalenten Wechselwirkungen. Die Proteine können dabei an die Membran bzw. an die darin enthaltenen Proteine binden. Im Vergleich zu den integralen Membranproteinen lassen sich periphere Membranproteine mit Hilfe von hoch konzentrierter Salzlösung einfach extrahieren, da dadurch die elektrostatischen Wechselwirkungen geschwächt werden. Eine klare Abtrennung von integralen zu peripheren Membranproteinen kann nicht immer getroffen werden, da bestimmte Abschnitte der Proteine sich durch die Membran ziehen und anderen an der Außenseite anlagern [9]. Lipidverankerte Proteine Lipidverankerte Proteine sind durch eine kovalente Bindung ein Lipid, welches in der Membran integriert ist, gebunden. Es gibt verschiedene Arten von Verknüpfungen, Prenylierung, S-Acylierung und GPI-Verankerung, welche am häufigsten vorzufinden ist. Bei der S-Acylierung ist die Carboxylgruppe einer Fettsäure-Acylkette mit einer Aminosäureseitenkette durch eine Amid- oder Esterbindung verbunden (siehe Abbildung 5, Beispiel a). Bei der Prenylierung findet die Verknüpfung des Proteins über das Schwefelatom eines Cysteinrestes mit einer Isoprenoidkette statt (siehe Abbildung 5, Beispiel b). Unter GPI-Verankerung versteht man die Verknüpfung eines Proteins über das Glycosylphosphatidylinositol-Molekül (siehe Abbildung 5, Beispiel c) [6]. 8 Abbildung 5: Prinzip von lipidverankerten Proteinen [5] Funktionen der biologischen Membran Biologische Membranen besitzen viele verschiedene Funktionen, welche je nach Zelltyp und Zusammensetzung variieren. Zu den wichtigsten Funktionen zählen die Abgrenzung, bzw. die Kompartimierung der Zellen oder Organellen von ihrer Umwelt, sodass bestimmte Bedingungen in einer Zelle für bestimmte Reaktionen zum Beispiel aufrechterhalten werden. Des Weiteren kann über die selektiv permeable Membran ein kontrollierten Stoffaustausch oder Transport gesteuert werden. Dieser kann passiv oder auch aktiv unter Verbrauch von Energie, wie zum Beispiel ATP, stattfinden. Über die Membran kann eine Signalaufnahme sowie Weiterleitung, aber auch Abgabe von Signalen stattfinden. Zellmembranen fungieren als Ort der Energieumwandlung, wie es zum Beispiel im Rahmen der Atmungskette oder Photosynthese erfolgt. Des Weiteren sind in Membranen eine Vielzahl von Enzymen eingelagert, somit sind biologische Membranen auch Ort von Stoffumwandlungen oder anderen Reaktionen [10]. 9 Fluid mosaic Modell einer biologischen Membran Das Flüssig-Mosaik-Modell wurde 1972 von S.J. Singer und G.L Nicolson vorgeschlagen. Es beschreibt die Anordnung einer biologischen Membran und die darin enthaltenen Bestandteile. Nach diesem Modell ist eine biologische Membran eine Lipiddoppelschicht, wobei die Membranlipide relativ fluid und homogen verteilt sind. Die verschiedenen Proteine sind an und in der Membran eingelagert und können sich lateral frei bewegen. Nach diesem Modell ist eine biologische Membran ein dynamisches Gebilde [11]. Die Membranfluidität ist dabei von einigen Faktoren abhängig. Ist Cholesterin in großen Anteilen Bestandteil der Membran, so ist die Viskosität erhöht. Des Weiteren wird die Fluidität der Membran durch die Länge der Fettsäurereste und Doppelbindungszahl variiert. Die Temperatur spielt ebenfalls eine Rolle, bei sinkender Temperatur sinkt die Fluidität. Die flüssig-kristalline Struktur verändert sich hin zu einem kristallinen Gel. Dieser Temperaturpunkt wird auch als Phasenübergangtemperatur beschrieben. Dieser Punkt hängt wiederum von der Länge der Fettsäureketten und Doppelbindungszahl ab. Je mehr Doppelbindungen die Fettsäure enthält, desto niedriger ist die Phasenübergangstemperatur und je länger die Fettsäureketten sind, desto niedriger ist die Phasenübergangstemperatur [9]. Im Laufe der Zeit wurde jedoch gezeigt, dass die verschiedenen Proteine sowie Lipide nicht homogen verteilt in der Membran vorliegen, wie es das Flüssig-Mosaik-Modell beschreibt. Es gibt verschiedene Bereiche, in welchen es zu Zusammenschlüssen aber auch wieder zum Auflösen der Zusammenlagerungen von bestimmten Proteinen oder bestimmten Lipidtypen kommt. Diese hohen Konzentrationen an Proteinen werden auch Rezeptor-Inseln bezeichnet und die Bereiche der hohen Lipidkonzentrationen als Lipid Rafts. Das Konzept des Lipid Rafts Modell, oder auch Lipidflöße genannt, sowie die Funktion und Eigenschaften werden im Folgenden genauer erläutert. 10 Lipid rafts Das Konzept der Lipid Rafts wurde 1988 von Kai Simons in Deutschland und Gerrit van Meer in den Niederlanden vorgestellt. Lipid Rafts werden als Lipidmikrodomänen beschrieben, welche sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung von anderen Bereichen der biologischen Membran unterscheiden. Sie besitzen hohe Konzentrationen von Sphingolipiden, Glycolipiden und Cholesterin. Des Weiteren besitzen sie eine höhere Konzentration von GPIverankerten Proteinen als ihre umgebenen Membranbereiche (siehe Abbildung 6). Abbildung 6: schematische Darstellung der Lipid Rafts [6] Eine weitere Gruppe, welche sich besonders an Lipid Rafts anlagert sind die Caveoline. Sie bewirken kleine Ausbuchtungen in der Membran, welche als Caveolae bezeichnet werden. Die Bezeichnung „Lipid Rafts“ stammt daher, dass die Mikrodomänen wie Lipidflöße auf der Lipidmembran schwimmen. Lipid Rafts zeigen immer noch ein fluides Verhalten, sind jedoch auf Grund der gesättigten Fettsäurereste der Sphingolipide stärker geordnet und dichter gepackt. Die Größe solchen Lipidflöße liegt zwischen 10 und 200 nm. Lipid Rafts sind hochdynamische Strukturen, welche sich im Bereich von Sekunden/ Minuten zusammenlagern aber auch wieder auflösen. Man unterscheidet des Weiteren zwischen planaren Lipid Rafts und Caveola, also ausgestülpten Lipid Rafts Bereichen (siehe Abbildung 7) [2, 12]. 11 Funktionen von Lipid rafts Lipid Rafts verändern ihren Ort ständig. Bei einem Zusammenschluss können diese Bereiche und die darin enthaltenen Proteine verschiedenen Funktionen übernehmen. Des Weiteren sind sie an Membranverschmelzungen, an Vesikulation, also Bläschenbildung, an Signalübertragungsprozessen sowie an Antigenerkennung über T-Zell-Rezeptoren beteiligt. In Abbildung 7 und 8 sind verschiedene Mechanismen und Funktionen der Lipid Rafts schematisch dargestellt. Abbildung 7: planare Lipid Rafts sowie Caveola, Funktionen [7] In Abbildung 7 ist zum einen der Mechanismus der Endozytose bei Caveola (a) sowie bei planaren Lipid Rafts (b) dargestellt. In Beispiel a ist die dynaminabhängige Endozytose dargestellt. Dynamin ist ein Enzym, welches bei der bei der Enodzytose involviert ist. Im Bereich der Caveola ist Caveolin in die Membran integriert, des weiteren G-Protein gekoppelte Rezeptoren. 12 Diese wirken an vielen Prozessen mit, wie der Signaltransduktion (Licht-, Geruchs-, Geschmacksreize), Zellbewegung, Transport von Stoffen durch Endo- oder Exocytose. Des Weiteren sind sie Zielstrukturen für Hormone und Neurotransmittern, wie in Abbildung 7 dargestellt. Außerdem nutzen auch Viren solche G-Protein-gekoppelten Rezeptoren als Angriffspunkt, wie zum Beispiel das HIV-Virus. Bindet nun ein Neurotransmitter, ein biochemischer Botenstoff, an solch einem Protein, so findet eine Endozytose statt. Die Biomembran stülpt sich mit den eingeschlossenen Neurotransmittern ein. Diese können nun transportiert werden, bzw. auch wieder abgebaut werden. Das gleiche Prinzip kann auch bei planaren Lipid Rafts erfolgen. Findet eine Translokation der G-Protein gekoppelten Rezeptoren in der Bereich der Lipid Rafts statt, so können auch hier Neurotransmitter binden und schließlich eine Endozytose mit den eingeschlossenen Neurotransmittern auslösen [14]. In Abbildung 8 ist die Signalübertragung über Immunoglobulin E (a) und T-Zell Antigenrezeptor (b) dargestellt. Vom Ablauf ähneln sich die beiden Prinzipien, es sind jeweils aber andere Moleküle beteiligt. Im ersten Schritt findet in Abbildung a eine Dimerisation, eine Zusammenlagerung des Fc Rezeptors und der Bindung des Immunoglobulins E (IgE) an den Fc-epsilon Rezeptor (FcεR) statt bzw. in Abbildung b findet eine Bindung zwischen dem T Zell Antigenrezeptor und dem major histocompatibility complex (MHC) der antigenpräsentierenden Zelle statt. Im zweiten Schritt folgt bei a sowie bei b eine Phosphorylierung der „immune receptor tyrosine-based activation motifs“ (ITAMs) durch die jeweilige Tyrosinkinase (a: Lyn; b: Lck oder Fyn). Die phosphorylierten ITAMs fungieren als Membranbindestellen für weitere Tyrosinkinasen (a: Syk; b: ZAP). Diese wiederum bewirken eine Aktivierung weiterer Proteine wie LAT (linker of activated T cell), ein Lipid Raft assoziiertes Protein, das Signal weiterzugeben 13 Abbildung 8: Signalübertragung Immunoglobulin E (a) T-Zell Antigenrezeptor (b) [8] 14 Ergebnisdarstellung der wissenschaftlichen Artikel über Lipid Rafts Im Rahmen der Seminararbeit werden im Folgenden zwei weitere wissenschaftliche Artikel hinsichtlich weiterer Erkenntnisse über Lipid Rafts betrachtet. Lipid Rafts bestehen zu einem hohen Anteil aus Sphingolipiden und Cholesterol, sowie GPI verankterte Proteine. Im Rahmen des ersten Artikels werden zwei weitere Hauptkomponenten identifiziert, Stomatin, Flotillin-1 und Flotillin-2. Im Rahmen des zweiten Artikels wird gezeigt, dass nach einer calciumabhängigen Vesikulation, zwei weitere Komponenten, Sorcin und Synexin, in den Vesikeln zu finden sind und somit auch Bestandteile der Lipid Rafts sind. „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ von Ulrich Salzer, Rainer Prohaska; blood (2001 97:1141-1143) In der wissenschaftlichen Arbeit von Ulrich Salzer und Rainer Prohaska werden weitere Erkenntnisse zu der Zusammensetzung von Lipid Rafts dargestellt. Lipid Rafts bestehen zu einem großen Anteil aus Sphingolipiden und Cholesterol. Im Rahmen dieser Studie wurden Erythrozyten verwendet und die Bereiche der Lipid Rafts isoliert und auf ihre Bestandteile analysiert. Die verwendeten Methoden sind Gelelektrophorese, sowie anschließender Silberfärbung bzw. immunologisch durch Western Blot. Acetylcholinesterase (ACheE), welche in den Membranen von roten Blutzellen vorhanden ist, wird als Membranproteinmarker verwendet. Zusätzlich werden massenspektrometrische Analysen durchgeführt um die Ergebnisse abzusichern. Es werden zwei verschiedene Methoden durchgeführt um die Lipid Rafts zu isolieren. In Methode A und B werden die Erythorzyten lysiert, in 0,5 % eiskaltem Triton X-100 extrahiert und zentrifugiert. In Methode A (diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation) wird das Pellet zunächst in kalter 60 % Saccharose und 0,5 % Triton X-100 in TBS haltiger Lösung resuspendiert. 15 Anschließend werden 500 μl mit 1,5 ml 30 % Saccharoselösung in TBS und 1 ml 10 % Saccharoselösung in TBS überschichtet und 10 Stunden bei 230000 g und 4 °C zentrifugiert. Es werden von oben jeweils 150 μl Fraktionen abpipettiert, zentrifugiert und das Pellet analysiert. In Abbildung 9 (Spur 1-4) sind die Ergebnisse dargestellt. Spur 1 zeigt das Pellet, nach 10 Stunden Zentrifugation, Spur 2 Fraktion 17-20 (hohe Dichte), Spur 3 Fraktion 9-16 (mittlere Dichte) und Spur 4 Fraktion 7 und 8 (Lipid Rafts). Im Methode B wird die Lösung nach dem Extraktionsschritt mit 80 % Saccharoselösung in 0,2 M Na2CO3 vermischt und mit 2 ml 30 % und 1 mL 10 % Saccharoselösung in TBS überschichtet und anschließend nach den gleichen Parametern zentrifugiert. In Abbildung 9 (Spur T,S,P) sind die Ergebnisse dargestellt. T ist die Spur der Suspension bevor der Extraktion, S ist der Überstand nach der Zentrifugation und P das Pellet. Des Weiteren ist Abbildung 9 das Ergebnis des Western Blots mit Hilfe von monoclonalen Antikörpern sowie die AChE Aktivität zu entnehmen. Abbildung 9: Ergebnisse Gelektrophorese, Western Blot sowie AchE Aktivität [7] 16 Ein weiterer Versuch wurde durchgeführt, um festzustellen ob sich die identifizierten Proteine in oligomeren Komplexen zusammenlagern. Die Proteine von den isolierten Lipid Rafts werden mit Hilfe von Immunblot analysiert und aufgrund ihrer molaren Masse eine Aussage über die Komplexbildung getroffen. In Abbildung 10 ist das Ergebnis des Western Blots dargestellt. Abbildung 10: Ergebnisse des Immunblots der Lipid Raft Proteine nach Saccharosegradientenzentrifugation [7] In Abbildung 11 ist ein Western Blot einer Erythrozytenmembran von OHSt krankem Patienten (1,2) sowie einer gesunden Person (N) dargestellt. OHSt steht für Overhydrated Hereditary Stomatocytosis, einer erbliche Anämie-Form. Abbildung 11: Ergebnisse des Immunblots [7] Anhand von Abbildung 9 ist erkennbar, dass über 70 % der Acetylcholinesterase, welche zu den GPI-verankertem Proteinen zählt, in Spur 4 zu identifizieren ist. Des Weiteren ist Stomatin, ein integrales Transmembranprotein von humanen Erythrozyten in Spur 4 zu sehen. Stomatin besitzt nur eine geringe Löslichkeit in Triton X-100. Der Nachweis liegt jedoch mit einer vermutlichen Assoziation mit der Lipid Raft Region begründet, wodurch eine Bildung vorhanden ist und somit Stomatin nachgewiesen werden kann. 17 Spectrin, Actin, Protein 4.1 und 4.2 können auch in der Fraktion der Lipid Rafts nachgewiesen werden, sie gehören zu den Cytoskelettproteinen. Glycophorin C, eine weiteren Cytoskelettprotein kann hingegen nicht in Spur 4 nachgewiesen werden. Durch massenspektrometrische Untersuchungen zeigte sich, dass die 45 kd Bande Flotillin-1 und Flotillin-2 entspricht, ein weiteres integrales Membranprotein. Um zwischen peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde eine Extraktion in alkalischer Lösung (Na2CO3) durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass Stomatin, Flotillin sowie AChE integrale Membranproteine sind und die restlichen Cytoskelettproteine abgelöst wurden und somit in Spur P nicht nachgewiesen werden. Aus Abbildung 10 (Saccharosegradientenzentrifugation sowie anschließender Immunblot) wird ersichtlich, dass sich Flotillin 1 und 2 sowie Stomatin zu heteroligomeren Komplexen zusammenlagern, da ihre molare Masse größer als einem Monomer entspricht. Anhand von Abbildung 11 ist erkennbar, dass Flotillin 1 und 2 in Erythrozytmembranen von OHSt Patienten nachgweisen werden können, jedoch Stomatin nur bei gesunden Menschen. Stomatin fehlt also in der Membran von OHSt Patienten, was Auswirkungen auf den K +/Na+ Haushalt sowie auf die Signaltransduktion mit sich bringen kann [14, 15]. “Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin” von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borken, Rainer Prohaska; blood (2002 99: 25692577) Der wissenschaftliche Artikel von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borlen und Rainer Prohaska beschäftigt sich mit der calciumabhängigen Vesikulation von roten Blukörperchen und den Bestandteilen Stomatin, Synexin und Sorcin von Lipdi Rafts. Dabei wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM, atomic force microscopoy) die Größe der Vesikel bestimmt. Es werden zwei weitere Proteine in Lipid Rafts bestimmt, Synexin und Sorcin. Dabei unterscheidet man bei der Vesikulation in Nanovesikel und Mikrovesikel, welche beide Lipid Rafts enthalten. Es kann gezeigt werden, dass Synexin und Sorcin besonders in Nanovesikeln vorhanden ist und Stomatin vor allem in Mikrovesikeln. 18 Es werden rote Blutkörperchen verwendet und mittels Methode A und Methode B Mikrobzw. Nanovesikel erzeugt. Dazu werden bei beiden Methoden die Erythrozyten in CaCl2 haltigem TBS Puffer resuspendiert, anschließend EDTA hinzugefügt und zentrifugiert (15000 g, 30 sec). Bei Methode A wird der Überstand zentrifugiert (15000 g, 4°C, 20 min), das resultierende Pellet, welches die Mikrovesikel enthält, in TBS resuspendiert, kurz zentrifugiert und der Überstand analysiert. Der Überstand nach 20 min Zentrifugation mit den enthaltenen Nanovesikeln wird Ultrazentrifugiert (100000 g, 4°C, 60 min) und das Pellet in TBS resuspendiert. Die Vorbereitungen bei Methode B verlaufen nach dem gleichen Ablauf, jedoch wird die Zentrifugationszeit variiert (10, 20 und 30 Minuten, 15000 g 4 °C). Jedes Pellet wird in TBS resuspendiert. Die Ultrazentrifugation verläuft nach dem gleichen Schema wie in Methode A. Die Proben werden mit Hilfe von Gelelektrophorese und Silberfärbung sowie Western Blot mittels monoclonaler Antikörper analysiert (siehe Abbildung 12). Des Weiteren wird ein Versuch durchgeführt um die Bindung von Proteinen an die Membran nach Zugabe von CaCl2 bzw. EDTA zu den Vesikeln festzustellen. Anschließend werden die Proben zentrifugiert. Pellet sowie Überstand werden ebenfalls mittels Western Blot und Gelektrophorese analysiert (siehe Abbildung 13 A). Des Weiteren wird eine Phasenseperation der Membranproteine in Triton X-114 aufgrund der unterschiedlichen Hydrophobizität durchgeführt. Es werden aquatische sowie detergente Phase mittels Immunblot und Gelelektrophorese analysiert (siehe Abbildung 13 B). Mittels Rasterkraftmikroskopie konnte gezeigt werden, dass Mikrovesikel im Durchschnitt um die 179 nm und Nanovesikel ca. 81 nm Durchmesser besitzen, was mit bereits vorhandenen Literaturwerten übereinstimmt. Mikrovesikel sind dabei sowohl im Durchmesser als auch in ihrer Höhe größer als Nanopartikel. Anhand von Abbildung 12 kann man die Hauptkomponenten von Mikro- und Nanovesikeln erkennen. In Abbildung A Spur 1 ist die komplette Erythrozytenmembran zu sehen, Spur 2 zeigt die der isolierten Mikrovesikel und Spur 3 die der Nanovesikel. Sowohl Mikro- als auch Nanovesikel beinhalten Hämoglobin (Hb) und Carboanhydrase (CA). Als Hauptprotein in 19 Mikrovesikeln ist deutlich Stomatin zu erkennen (Spur 2), hingegen in Nanovesikeln Synexin und Sorcin (Spur 3). Diese Ergebnisse werden durch Methode B sowie Western Blots nochmals bestätigt. In Abbildung B entspricht Spur 1 der kompletten Erythrozytenmembran, Spur 2 (10 min Zentrifugation) und 3 (20 min Zentrifugation) den Mikrovesikeln und Spur 4 (Ultrazentrifugation) den Nanovesikeln. Abbildung 12: Ergebnisse Gelektrophorese sowie Western Blot [8] Anhand von Abbildung 13 A ist erkennbar, dass sowohl Synexin als auch Sorcin bei Calciumzugabe deutlich in der Fraktion des Pellet erkennbar ist, und somit eine Bindung an die Membran stattgefunden hat. Ersetz man hingegen die Zugabe durch EDTA sind beide Substanzen nicht mehr nachzuweisen, da mit Hilfe des Komplexbildners EDTA eine Änderung der Salzkonzentration bewirkt wird und somit periphere Membranproteine abgelöst werden können. Bei Stomatin hingegen ist keine Änderung durch EDTA erkennbar, was darauf schließen lässt, dass Stomatin ein integrales Membranprotein ist. Betrachtet man Abbildung 13 B so kann man feststellen, dass Stomatin nach Zugabe des Detergenzes Triton X-114 nur noch in der detergenten Phase nachzuweisen ist. 20 Mit Hilfe von Detergenzien können integrale Membranproteine isoliert werden. Dies bestätigt nochmals die Ergebnisse von Versuch A, Stomatin ist ein integrales Membranprotein. Abbildung 12: Ergebnisse Gelektrophorese sowie Western Blot [8] Stomatin, Synexin und Sorcin sind also weitere Bestandteile von Lipid Rafts. Stomatin ist ein integrales Membranprotein, welchem eine wichtige Rolle bei der VesikelAbschnürung und Membranfusion zugesprochen wird. Des Weiteren spielt es eine Rolle bei dem Kationentransport einer Zelle (Na+/K+). Im Falle der erblichen Krankheit Overhydrated Hereditary Stomatocytosis fehlt Stomatin in der Zellmembran. Synexin ist ein kalziumbindendes Protein, welches die Aggregation und Fusion von chromaffinen Granula auslöst. Des Weiteren ist es beteiligt an Exozytoseprozessen. Sorcin gehört zu den peripheren Membranproteinen, welches ebenfalls Calcium bindet. Es spielt eine Rolle bei calciumausgelöster Signaltransduktion. Lipid Rafts spielen eine Rolle bei exocytotischen und endozytotischen Transport. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die calciumausgelöste Vesikulation von Mikro- sowie Nanovesikeln von Erythrozyten ebenfalls Lipid Raft abhängige Prozesse sind, wobei Synexin, Sorcin und Stomatin als Haupt-Lipid-Raft Proteine zu nennen sind [16, 17, 18]. 21 Literaturverzeichnis [1] Biochemie der Ernährungvon Gertrud Rehner,Hannelore Daniel, Spektrum, 3. Auflage (2010) [2] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. 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