Versuchsbeschreibung
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Name: Sabine Bolte, Thorsten Großkurth (12BBI1) Datum: 13.02.2008 Thema des Protokolls: DNA- Extraktion aus Zwiebel und Banane Ziel: Die Isolierung und anschließende Sichtbarmachung der DNA, durch Denaturierung und anschließende Renaturierung. Zwiebel Geräte: - - Chemikalien/Kulturen: Becherglas Wasserbäder (60°C und 0°- 5°C) Mörser Trichter Kaffeefilter oder Papiertuch Glasstab - ½ mittelgroße Zwiebel ½ TL Kochsalz 50 ml Wasser Feinwaschmittel Gekühltes Ethanol 98%ig Durchführung: Zu Beginn mischen Sie das Wasser, das Spülmittel und das Salz in einem Becherglas. Nun schneiden Sie die halbe Zwiebel in sehr kleine Stücke und geben diese in die bereits angesetzte Pufferlösung. Das Becherglas mit der Lösung und der zerkleinerten Zwiebel kommt nun für 15 Min. in das bereits vorgeheizte, 60° C warme, Wasserbad. Anschließend wird es für 5 Min. in kaltem Wasser abgekühlt. Mit dem Mörser wird nun dieses Gemisch zerquetscht bis ein körniges Mus entsteht. Man darf jedoch nicht zu lange und zu stark reiben, weil die DNA sonst zu viel zerrissen wird. Das nun entstandene Gemisch wird in einen Trichter mit Filterpapier gegeben. 2 bis 3 cm des Filtrates werden nun mit dem Feinwaschmittel versetzt. Nachdem dies gut vermischt wurde, überschichtet man den Ansatz vorsichtig mit eiskaltem Alkohol. Beobachtung: Eine schlierenartige Substanz fällt aus der Alkohollösung aus und schwimmt oben auf. Oberste: DNA-Klumpen (Durchsichtig) Unten: Zwiebel (weiß) DNA-Extraktion einer Zwiebel Oberste: DNA-Klumpen (milchig bis leicht rosa) Mitte: Alkohollösung (leicht rot) Unten: Zwiebel (weiß bis gräulich) DNA mit Karminessigsäure angefärbt Banane Geräte: - - Chemikalien/Kulturen: 250 ml Becherglas 50 ml Messzylinder Mörser und Pistill Pipette Reagenzglas Reagenzglasständer Kaffeefilter Messer Schneideunterlage Durchführung: Als erstes wird die Pufferlösung angesetzt: - 11g Natriumcitrat-dihydrat 2,2g Kochsalz 25 ml Spülmittel werden mit 250 ml Wasser vermischt. Nun wird die ¼ Banane klein geschnitten und 30 ml des Extraktionspuffers in ein Becherglas gegeben. Dieses Gemisch wird nun 5 Min. bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschließend wird diese Mischung mindestens 5 Min. gut im Mörser zerrieben. - - ¼ Banane Natriumcitrat-dihydrat Kochsalz Spülmittel dest. Wasser kalter Spiritus Karminessigsäure Das so gewonnen „Mus“ wird nun in den Filter gegeben und das Filtrat in einem weiteren Becherglas aufgefangen. Nun wird der kalte Spiritus etwa 2 cm hoch in ein Reagenzglas gegeben. Mit Hilfe der Pipette wird etwa genauso viel von der Suspension vorsichtig, tropfenweise dazu gegeben. Beobachtung: Eine schlierenartige Substanz fällt aus der Alkohollösung aus und schwimmt oben auf. Oben: DNA-Klumpen (milchig) Unten: Banane (dickflüssig) DNA-Extraktion einer Banane DNA mit Karminessigsäure angefärbt Auswertung für beide Versuchsdurchgänge: Bei diesem Verfahren handelt es sich um eine sehr grobe Methode um die DNA sichtbar zumachen. Das Spülmittel, welches als Tensid wirkt, zerstört mit Hilfe der Wärme die Zell- und Kernmembran. Die Membran einer Pflanzlichen Zelle ist aus Lipiden aufgebaut, diese besitzen ihrerseits einen Wasserabweißenden (hydrophoben) und einen Wasserliebenden (hydrophilen) Teil. Treffen nun die im Spüli enthaltenen Detergenzien („Tenside“) auf die Membran, reagieren sie mit den Lipiden der Zellmembran und lösen die Membran auf (das gleiche passiert mit Fettresten im Abwasch). Da in der Pflanze ein wässriges Milieu vorhanden ist, ordnen siech die Lipide mit ihrem lipophoben Teil nach außen, der lipophile Teil zeigt nach unten. Wird nun Spülmittel hinzubegeben, verändert sich das Milieu in ein unpolares Milieu und die Membran wird zerstört, da sich die hydrophilen Teile der Lipide dem umgebenden Milieu abwenden. Dadurch wird die DNS aus dem Zellkern freigesetzt und geht in Lösung. Die Bausteine der DNS, die Nukleotide, tragen Phosphatgruppen, die eine negative Ladung haben. Diese negativen Ladungen bewirken, dass die DNS gut in Wasser löslich ist. Das Ethanol entzieht der DNA das Wasser, an der Stelle, wo das Wasser entzogen wurde setzten sich nun Natriumionen des Kochsalzes (sind positiv geladen) und neutralisieren somit die negativen Ladungen der Phosphatgruppen der DNS. Es entsteht ein in Alkohol unlösliches Salz. An der Schicht zwischen dem Alkohol und der Extraktionslösung klumpt die DNS zusammen und fällt aus – das sieht dann aus wie ein Fadenknäuel und kann herausgefischt werden. Links: DNA der Zwiebel, angefärbt Rechts: DNA der Banane, ohne Karminessigsäure Fehleranalyse: Die erste Fehlerquelle liegt beim Mörsern, denn hier kann man durch zu langes Mörsern die DNA zerstören. Mörsert man jedoch zu wenig, so bleiben zu große Zellverbände bestehen, deren Membranen nicht zerstört werden können. Eine zu lange Hitzeeinwirkung kann ebenfalls zur Zerstörung der DNA führen, deshalb sollte man auf keinen Fall ein heißeres Wasserbad verwenden oder eine längere Zeit zum erhitzen vorsehen. Verbesserungsvorschläge: - Anstelle der RG sollte man Bechergläser nehmen, da die DNA dann eine größere Fläche hat zum Ausbreiten. Zum Mörsern der Mischung sollte man die Pufferlösung abgießen und die Banane/ Zwiebel alleine Mörsern. Um es anschließend zufiltrieren wird die Pufferlösung wieder dazugegeben. Die DNA-Ausbeute kann erhöht werden, wenn eine Mischung aus Extraktionspuffer und CelluloseLösung (w = 2%) im Volumenverhältnis 1 : 1 eingesetzt wird. Hintergrundinformationen: Informationen über DNA bzw. DNS: DNA (Desoxyribonukleinsäure) findet man in fast jedem Nahrungsmittel. Sie enthält Gene, die zur Codierung aller lebensnotwendigen Bestandteile, wie Enzyme oder Proteine notwendig sind. Die DNS bzw. DNA befindet sich im Zellkern oder liegt frei im Cytoplasma vor. Pflanzenzelle: 1 = Zellmembran 6 = DNA 11 = Tüpfel 16 = Tonoplast 2 = Zellwand 7 = Kernpore 12=Dictyosom/Golgi-App. 3 = Nachbarzelle 8 = Nukleolus 13 = Ribosom 4 = Zellplasma/ Cytoplasma 9 = ER 14 = Mitochondrium 5 = Chloroplast 10 = rauhes ER 15 = Vakuole 17 = Golgi-Vesikel
