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PHILIPPS-UNIVERSITÄT MARBURG
FACHBEREICH CHEMIE
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Chromatographie-Seminar – GC, HPLC und DC -
Prof. Dr. Thomas Schrader
Fachbereich Chemie, Universität
Marburg
Hans-Meerwein-Straße
Phone: int. + 6421 / 28-25544
fax: int. + 6421 / 28-28917
e-mail: [email protected]
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1. Literatur:
Problem: viele gute Monographien von Einzelgebieten, wenig Übersichten.
a) allgemein:
E. Heftmann (Hrsg.): Chromatography, part A: Fundamentals and Techniques,
part B: Applications. Elsevier 1983.
G. Schwedt, Chrom. Trennmethoden, 2. Aufl. 1986, Thieme-Verlag.
H. Naumer, W. Heller (Hrsg.): Untersuchungsmethoden in der Chemie, ThiemeVerlag 1986.
D. A. Skoog, J. J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer-Verlag, Berlin 1996.
b) speziell:
G. Schomburg: Gaschromatographie, VCH, Weinheim 1987.
K. K. Unger (Hrsg.): Handbuch der HPLC, Merck, GIT Verlag, Darmstadt
1989.
U. Gruber, W-. Klein (Hrsg.): W. Gottwald, GC für Anwender, VCH, Weinheim
1995.
2. Inhalt:
a) Definition und Illustration (Boote)
b) Thermodynamik = Lage der Peaks: Kapazitätsfaktor k', Trennfaktor ,
Verteilungskoeffizient K in versch. Systemen
c) Kinetischer Teil = Form der Peaks: Standardabweichung , Basisbreite w,
Auflösung RS, theoretische Bodenzahl Ntheor., effektive Bodenzahl Neff., van
Deemter-Gleichung, HETP, Entwicklung zur HPLC (Huber)
d) GC: Aufbau eines GC-Geräts, Trägergas, Strömungsmessung und
-konstanthaltung, Probengeber, Säulen (-ofen), Detektoren, Praxistips
(Derivatisierung, Headspace etc.), Quantitative GC (Response-Wert, innerer
Standard)
e) HPLC: Pumpe, Injektionsventil, Trennsäule, Detektor, Praxistips,
Lösungsmittel, stationäre Phasen (Reversed phase).
f) DC: Prinzip, Reaktionsverfolgung, Anfärbereagenzien
--------------------------------------------------------------------3. Definition und Illustration:
Chromatographie ist: eine Trennmethode, bei der eine Stofftrennung durch
Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) und einer sich bewegenden
(mobilen) Phase erfolgt, die an der ruhenden vorbeigleitet.
Illustration:
Bootsrennen!
Ziel:
t = tR
Boote = Stoffe
Fluß = Trägergas oder
Eluens
Raststätten = stat. Phase
v0
Start:
t=0
t0 + tR' = tR (Gesamtreisezeit = Retentionszeit)
Rf = DR/D0 (Relate to front)
k' = tR' / t0 = tR - t0 / t0 = VR - V0 / V0 = 1 / Rf - 1 (Kapazitätsfaktor =
Rückhaltevermögen)
Abbildung: GC und DC!
4. Thermodynamik:
k' = K Vstat / Vmobil
K = Verteilungskoeffizient
Vstat = Menge an stationärer Phase
Vmobil = Menge an mobiler Phase
VR = K Vstat + Vmobil
VR = Elutionsvolumen
Thermodynamischer Beitrag der Trennleistung:
Verhältnis der Kapazitätsfaktoren = Trennfaktor 

= k1' / k2' = K1 Vstat / Vmobil : K2 Vstat / Vmobil = K1 / K2
K = Verteilungskoeffizient - 4 Fälle:
mobil
1 Adsorption flüssig
2 Adsorption gas
3 Verteilung flüssig
stationär
fest
fest
flüssig
4 Absorption gas
flüssig
Technik
DC, Säulenchr., HPLC
GC (gepackt für Gase)
Ionenaustausch, Molekularsieb,
Elektrophorese
GC (Kapillar, Standard)
zu 1) und 2):
Adsorptionsisotherme von Freundlich, Langmuir, BET.
Achtung: Nur bei sehr niedrigen Konzentrationen (oder p0), d.h. bis zur
Monoschicht, ist K linear. Also mit sehr geringen Mengen arbeiten (sonst
tailing)
cf
Rechts: cf/p0-Diagramm !
Mono-
Mehrfachschichten
p0
zu 3) und 4):
Henry'sches Gestz: K = cfl / p
Nernst'scher Verteilungssatz: K = cfl (stat) / Cfl (mobil)
Vorteil: K = kaum konzentrationsabhängig
cfl (stat)
(cfl)
Rechts: cfl (stat)/cfl(mobil)
bzw.
cfl/p-Diagramm !
5. Kinetik:
cfl (mobil) (p )
0
Kinetischer Beitrag zur Trennleistung = Peakbreite = Geschwindigkeit der
Verteilungsgleichgewichte
Abbildung: scharfe und breite Peaks mit gleichem !
Standardabweichung (Bestimmung aus Glockenkurve über Basisbreite 4
Auflösung RS = 2 (tR2-tR1 / w2 + w1) = tR2 - tR1 / 4
RS = 1:
RS = 1.5:
tR =  (Thermodynamik)
w1 + w2 = Peakbreite (Kin.)
tR = 4 nur 2% Peaküberlappung)
tR = 6 nur 0.3% Peaküberlappung)
Abbildung: Glockenkurve / zwei Glockenkurven!
Wichtig: Da tR proportional mit der Wanderungslänge wächst, w dagegen nur
mit deren Wurzel, wird eine Trennung im allg. mit der Vergrößerung der
Säulenlänge besser, sie dauert nur länger!
Phänomen der Auflösung auf eine kinetische Größe zurückführen:
RS = (- 1 / ) (k2' / 1 + k2') ( Ntheor. / 16) 0.5
Thermodyn.:
Kinetik:
Selektivität
Trennleistung
Ntheor. = theoretische Bodenzahl = Zahl der Gleichgewichtseinstellungen = Zahl
der Peaks, die nebeneinander aufgelöst werden können.
Neff = Ntheor. (k2' / 1 + k2')2
Kapazitätseinfluß mit in die Bodenzahl einbezogen
Neff ist leicht zu ermitteln. Damit kann man RS bestimmen:
RS = (-1 /  (Neff / 16)0.5
Praktische
Anwendung:
Für
eine
ausreichende Auflösung RS ist bei einem bestimmten Trennproblem ( = x) eine
bestimmte Trennstufenzahl Neff nötig, d.h. eine Säule mit bestimmter
Trennleistung:

1.01
1.05
1.10
1.15
1.20
van Deemter-Gleichung:
nötiges Neff
160.000
6800
1940
940
575
Technik
Optimum in der GC
GC leicht, gute HPLC
HPLC
DC
Säulenchromatographie
Ntheor. ist noch von der Säulenlänge abhängig. Reduzierte Größe ist daher:
H = L / Ntheor. = HETP (Height equivalent of a theoretical plate = Strecke, auf
der sich gerade einmal das Gleichgewicht einstellt. Wovon ist H abhängig?
H = A + B /v + C v
Abhängigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit!
Unterschied zwischen GC und LC: Bei GC werden die Peaks wieder breiter,
wenn v zu klein wird, bei LC nicht!
Genauer: H = A + A' + B / v + (C + C') v
Abbildung: H/v-Diagramm für GC und LC!
A = Streudiffusionskoeffizient (Maß für die Güte der Packung) =  2 dp
A' = Wulff-Faktor = alle Effekte, die außerhalb der Säule den Peak verbreitern
B = Longitudinal-Diffusionskoeffizient = Bandenverbreiterung bei kleinem v
=  2 DM. DM = Diffusionskoeff. in der mobilen Phase. Wichtig: DM ist in
Gasen (GC, empfindlich gegen B) 105mal größer als in Flüssigkeiten (LC,
unempfindlich gegen B)!
C = Gleichgewichtseinstellungs-Koeffizient = Maß für die Schnelligkeit das
Massenübergangs von mobiler zu stationärer Phase und zurück. Abhängig von:
a) vDiff. d. Substanz in der mobilen Phase: Radialdiffusion soll schnell sein
(Strömungsprofil!). Konvektion an und durch die Partikel soll schnell sein.
Also: C =  dp2 / DM
dp = Partikeldurchmesser
DM = Diffusionskoeff. in mobiler Phase
b) vDiff. d. Substanz in der stationären Phase:
c) Kinetik des Absorptions- und Desorptions-Vorgangs:
Dicke der flüssigen Phase und Diff.koeffizient wichtig.
Also: C' = q k' / (1 + k')2 (d2 / DS) d = Dicke der fl. stat. Phase
DS = Diffusionskoeff. in dieser Phase
d) Verhalten in der nichtbewegten mobilen Phase:
In den Poren des Adsorbens ist mobile Phase gar nicht mobil (langsameres
Gleichgewicht). Abhilfe: kleine, regelmäßige Partikel - möglichst wenig
unbewegte Flüssigkeit - schnelle Gleichgwichtseinstellung: C''
Also lautet die Gesamtformel der van Deemter-Gleichung:
H =  2 dp + A' +  2 DM / v + [q k' / (1 + k')2 (d2 / DS) +  dp2 / DM + C''] v
Entwicklung zur flash- und HPLC-Chromatographie:
Huber fand, daß beim Übergang zu sehr kleinen Teilchen (5m) die
Abhängigkeit der Größe von H von der Strömungsgeschwindigkeit abnimmt.
Also kann man schneller chromatographieren, wenn man kleine Partikel hat.
Nachteil: Man braucht höhere Drücke (High Performance Liquid
Chromatography) (oder High pressure oder high pleasure oder high price!)
Abbildung: H/v-Diagramm bei kleineren Korngrößen!
6. Gaschromatographie:
Inhalt GC:
Aufbau eines GC-Geräts, Trägergas, Strömungsmessung und -konstanthaltung,
Probengeber, Säulen (ofen), Detektoren, Praxistips (Derivatisierung, Headspace
etc.), Quantitative GC (Response-Wert, innerer Standard)
Prinzip:
Probe wird am Anfang der Säule verdampft. Elution durch den Fluß eines
inerten Gases als mobiler Phase; keine Wechselwirkung mit Analyt!
2 Arten: GC an festen Phasen (gas solid chromatography, gsc: Gase)
GC an flüssiger Phase (gas liquid chrom., glc: alles flüchtige)
Erfinder: A.J.P. Martin und R. L. M. Synge (1941).
Aufbau eines GC-Geräts: Abbildung 25.1. Skoog-Leary!
Trägergase:
Helium, Argon, Stickstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff (detektorabhängig).
Druckreglung und -Messung. Hohe Reinheit wichtig!
Strömungsgeschwindigkeit:
extrem wichtig (van Deemter!) Einstellung über Zweistufen-Druckregler an
Gasflasche und Druck-bzw. Strömungsregler im GC. Eingangsdrücke von 1.53.5 bar ~ Fließgeschwindigkeiten von 25-150 mL/min bei gepackten und 1-25
mL/minbei Kapillarsäulen. Annahme: Strömungsgeschwindigkeit bei
konstantem p auch konstant! Messung am genauesten mit einem einfachen
Seifenblasenzähler am Ausgang des Detektors.
Injektionssystem:
Möglichst geringe Probemenge, als Dampfpfropfen injizieren, sonst
Bandenverbreiterung. Mikroliterspritze (vorsichtig, teuer!) durch eine
Membran
aus
Silicongummi,
Septum
in
einen
Einspritzblock
(Verdampfungskammer) oder direkt in die Säule (on-column). Temperatur soll
hier 50°C über dem Siedepunkt der am wenigsten flüchtigen Substanz liegen.
Probenvolumina 0,3-20 L bei gepackten und ~1 nl bei Kapillarsäulen. Zur
Verhinderung der Überbeladung: Split = Stromteiler, der den größten Teil der
Probe wieder aus dem GC abführt.
Direkteinspritz-Injektionssystem: Abb. 25.3. Skoog-Leary
Trennsäulen und Öfen:
Gepackte Säulen 2-10 m, Kapillarsäulen ~50 m lang.
Säulenmaterial früher Edelstahl, Glas, heute auch Quarz und Teflon. Meist zu
einer Spirale von 10-30 cm Durchmesser zusammengerollt.
Zur Thermostatisierung in einem Säulenofen, der die Temperatur genau regelt.
Temperatur soll gleich oder etwas höher sein als Siedetemperatuer der Probe (320 min Elutionszeit). Bei weit auseinanderliegenden Siedepunkten Zeitraffer
durch T-Programm. Beste Auflösung natürlich bei niedrigster Temperatur.
T-Einfluß auf Gasachromatogramme: Abb. 25.4. Skoog-Leary!
Detektoren: ein idealer Detektor ist:
a) hochempfindlich; b) stabil und reproduzierbar; c) kurze Ansprechzeit;
ähnliche Responsewerte für unterschiedliche Analyte; d) zerstört Probe
nicht. - (kein Detektor schafft das alles!)
Flammen-Ionisations-Detektor (FID):
am weitesten verbreitet. Prinzip: Ausströmendes Gas wird mit Wasserstoff und
Luft vermischt und im Brenner angezündet. Bei der Verbrennung entstehen vor
allem aus C-Atomen Ionen und Elektronen, die Elektrizität durch die Flamme
leiten. Zwischen dem Brennerende und einer Sammelelektrode wird eine
Spannung von einigen Hundert Volt angelegt. Stromfluß von ~ 10 -12 Volt wird
verstärkt und als Signal aufgezeichnet.
FID-Aufbau: Abb. 25.5. Skoog-Leary!
Zahl der erzeugten Ionen = proportional der Zahl von reduzierten C-Atomen.
C-reiche Substanzen geben ein starkes Signal, also eher massenabhängiger
Detektor. Funktionelle Gruppen geben fast überhaupt kein Signal: Universeller
Detektor. Hohe Empfindlichkeit: 10-13 g/s und großer dynamischer Bereich
(~107). Robust und einfach. Nachteil: zerstört die Probe.
Wärmeleitfähigkeits-Detektor (WLD):
älterer Detektor. Prinzip: Wärmeleitfähigkeit des Gastroms sinkt stark bei
Anwesenheit von Probenmolekülen. Der Widerstand eines dünnen Drahts (Pt,
Au) gibt die Wärmeleitfähigkeit des Gases wieder; bei Probendurchgang heizt
sich der Draht auf. Nachteil: Nur bei Wasserstoff oder Helium ist die eigene
WLF viel höher als die von organischen Proben. Außerdem relativ wenig
empfindlich - keine Kapillar-GC (10-8 g/ mL). Vorteil: zerstörungsfrei präparative GC.
Thermionischer Detektor (TID):
hochselektiv für P und N-haltige Verbindungen (gut für Pflanzenschutzmittel).
Prinzip: ähnlich dem FID. Das Gas fließt um eine geheizte Rubidiumperle bei
180V Spannung gegenüber der Sammelelektrode. Dabei bildet sich ein Plasma
mit 600-800°C. Hohe Ionenströme besonders bei N- und P-haltigen
Verbindungen.
Elektroneneinfang-Detektor (ECD):
Säuleneluat strömt über einen -Strahler (z.B. 63Ni oder 3H, absorbiert an PtFolie). Elektronen des -Strahlers ionisieren das Trägergas (N2) und erzeugen
langsame Elektronen. Diese werden von elektronegativen Atomen und
elektronenziehenden Gruppen organischer Moleküle eingefangen (Halogenide,
Peroxide, Cinone, Nitroverbb. etc.). Damit sinkt ein vorher konstant gehaltener
Nullstrom zwischen einem Elektrodenpaar. Selektiv also für Halogenide etc. (gut
für chlorhaltige Insektizide etc., z.B. PCB's etc.)
Atomemissions-Detektor (AED):
neuere Entwicklung. Prinzip: Eluat wird in ein Heliumplasma geleitet, das mit
einem Diodenarray Emissionsspektrometer gekoppelt ist. Alle Elemente der
Probe
werden
atomisiert
und
strahlen
ihr
charakteristisches
Atomemissionsspektrum aus. Diese Spektren werden mit einem Diodenarray
beobachtet, das von 170-780 nm mißt. Jeweils 2-4 Elemente gleichzeitig
beobachtbar. Leistungsfähigkeit: Man kann z.B. aus einem wilden
Benzingemisch die in kleinen Mengen vorhandenen Alkohol-Verunreinigungen
selektiv detektieren , indem man die O-Linie verfolgt.
Aufbau und Chromatogramm eines AED's: Abb. 25.7 und 25.8 Skoog-Leary!
GC-Säulen und stationäre Phasen:
Gepackte Säulen: aus Glas, Metall, oder Teflon, 2-3 m lang, Innendurchmesser:
2-4 mm. feinverteiltes Trägermaterial (Kieselgur = Skelette einzelliger
Meerespflanzen) mit dünnem Film (1m) aus stationärer Phase. Spulen mit 15
cm Durchmesser. Trägermaterial immobilisiert die stationäre Phase auf
größtmöglicher Oberfläche, kleine Kügelchen 0.15-0.25 mm.
Kapillarsäulen: a) wandbeschichtet (wall-coated open tubular, WCOT, dünner
Film direkt an der Wand) oder b) trägerbeschichtet (support-coated open
tubular, SCOT, dünne Schicht Kieselgur mit stationärer Phase). Entweder
höhere Kapazität oder Trennleistung - je nach Problem. c) Quarzkapillaren
(fused silica open tubular, FSOT) viel dünner als normale Glaskapillaren, durch
Polyimidbeschichtung trotzdem stabil, heute weitverbreitet. Innendurchmesser
0.3 mm! Problem der Adsorption von polaren Molekülen an den
Säulenpackungen und Kapillarwänden gelöst durch Verkappung der freien
Silanol-OH-Gruppen mit Alkylsilanen.
Charakteristika typischer GC-Säulen: Tabelle 25.1 Skoog-Leary!
Stationäre Phase: Bedingungen:
a) geringe Flüchtigkeit (Siedepunkt >100°C höher als Ofen-T (bis 250°C)!)
b) thermisch stabil 200-300°C)
c) chemisch inert
d) geeignete Kapazitätsfaktoren
Substanz muß in der stationären Phase gelöst werden (gleiche Polarität), aber
auch wieder herausgehen. Polarität von Molekülen (~Dipolmoment) dem
Säulenmaterial anpassen. Unpolare Materialien enthalten viele Alkylgruppen
(vor allem Dialkylsiloxane), polare vor allem viele OH-Gruppen (vor allem
Polyethylenglykole). Bei guter genereller Übereinstimmung eluieren die
Analyten in der Reihenfolge ihrer Siedepunkte. Oft gebraucht werden nur 6
Typen: 5 sind Polysiloxane mit Resten R = Alkyl, Phenyl, Trifluoropropyl und
Cyanopropyl, in steigender Polarität. 6. ist Polyethylenglykol.
Allgem. Formel:
R
R Si O
R
R
Si O
R
R
Si R
R
n
Stationäre Phasen in der GC: Tabelle 25.2 Skoog-Leary!
Chemisch gebundene und vernetzte stationäre Phasen: Sinn: Verhinderung des
Ausblutens der stationären Phase bei Auswaschen mit Lösungsmittel etc. längere Lebensdauer. Entweder monomolekulare Schicht stationärer Phase
kovalent ans Glas gebunden. Oder nachträgliche Vernetzung der Polysiloxae
mit Peroxid (radikalische Alkylvernetzung).
Chirale Phasen: Enantiomerenanalytik sehr wichtig (Medikamente, Futter,
Kosmetika)! Viel einfacher als chirale Derivatisierung der Probe ist chirale
Säule der unbehandelten Probe. Bsp. Polysiloxan mit Aminosäurederivaten; in
jüngerer Zeit viele Cyclodextrin-Phasen mit speziell geschützten OH-Gruppen
am oberen oder unteren Rand.
Cyclodextrin:
Aminosäuresiloxan:
O
Si
O
Si
N
H
H
N
O
Qualitative Analyse: besser mit Spektroskopie; aber man kann
Reinheitskontrolle sehr einfach durchführen. Bei Verwendung eines inneren
Standards auch Identitätsprüfung leicht möglich (Anwachsen des gewünschten
Peaks).
Retentionsindex I: 1958 erstmals von Kovats eingeführt (Kovats-Index).
Parameter zur Identifizierung von Substanzen aus dem GC. Chromatogramm
aus Gemisch von unverzweigten Alkanen mit größerer und kleinerer
Retentionszeit als die Probe. Nettoretentionszeiten von unverzweigten Alkanen
gegen die Anzahl der C-Atome aufgetragen ergibt eine Gerade. Interpolation
der gemessenen Proben-tR's ergibt die Kovats-Indices, die unabhängig von den
Chromatographiebedingungen sind. Sie bilden aber ein gutes Maß für die
Polarität des Säulenmaterials (Rohrschneider-Index).
Graphische Bestimmung des Kovats-Index: Abb. 25.10. Skoog-Leary!
Quantitative Analyse: Sehr wichtig, viele standardisierte Bestimmungen, z.B. in
der Lebensmittelchemie. Für uns vor allem: relatives Verhältnis von
Reaktionsprodukten aus der Integration der Peaks (automatisch im
Chromatogramm angegeben).
Gekoppelte Techniken: GC-MS-Kopplung: vereinigt die Trennleistung der GC
mit der Analytik der MS (siehe Versuch); dito GC-IR (vgl. Spektrosk. Kurs).
7. HPLC (High Performance Liquid Chromatography):
Inhalt HPLC: Pumpe, Injektionsventil, Trennsäule, Detektor, Praxistips,
Lösungsmittel, stationäre Phasen (Reversed phase).
Trick: Partikelverkleinerung von 0.1-0.2 mm zu 3-10 m - kaum Vergrößerung
der theoretischen Bodenhöhe (HETP). Aber: hohe Drücke nötig: Teure
Stahlapparaturen, die Drücke bis 400 bar aushalten!
Heute > 1 Mrd. DM-Umsatz jährlich. Anwendung sehr universell auch für
nichtflüchtige und thermisch empfindliche Substanzen wie Aminosäuren,
Nucleinsäuren, Kohlenwasserstoffe, Kohlenhydrate, Arzneimittel, Steroide,
Insektizide metallorganische Verbindungen etc.
Aufbau einer HPLC-Anlage:
● bei isokratischer Elution nur ein, bei Gradientenelution mehrere
Vorratsbehälter aus Glas oder Stahl für ultrareine Lösungsmittel mit
Gasduschen
Schema eines HPLC-Geräts: Abb. 26.4. Skoog-Leary!
Gradientenelution: Abb. Skoog-Leary 26.5.
● Pumpen müssen:
- Drücke bis 400 bar erzeugen
- einen pulsationsarmen Fluß erzeugen
- Fließgeschwindigkeiten zwischen 0.1 mL/min und 10 mL/min erreichen
- Flußkontrolle und Reproduzierbarkeit von 0.5% aufweisen
- korrosionsbeständig sein.
Aber: keine Explosionsgefahr, denn Flüssigkeiten sind kaum kompressibel!
Hubkolbenpumpen: kleine Kammer, in die das Eluens mit einem
motorgetriebenen Kolben hinein- und herausgepumpt wird. Kugelventile öffnen
zur Apparatur und zum Reservoir. Vorteil: kleine Volumina < 1mL, hohe
Drücke. Nachteil: pulsierender Fluß - deswegen meist Doppelhubkolbenpumpen.
Hubkolbenpumpe Abb. 26.6. Skoog-Leary!
● Probeneinlaßsystem:
Heute allgemein übliche Probenschleifen mit geringem Volumen (1-500 L) =
Rheodyne.
Probeninjektionssystem: Abb. 26.7. Skoog-Leary!
Säulen:
Rostfreie Stahlrohre mit ebenen Innenflächen (300 - 2000.- DM). 25 cm lang,
Innendurchmesser 5 mm, Teilchengröße der Packungen 3-10 m. Dabei haben
sie ~50.000 theoretische Böden.
Hochgeschwindigkeitsttrennung: Abb 26.8. Skoog-Leary!
HPLC-Säule: Abbildung S. 72, Eppert!
Vorsäulen: erhöhen die Lebensdauer der Trennsäulen: Entfernung fester
Teilchen und Lösungsmittel-Verunreinigungen.
Säulenpackungen: a) filmüberzogene (Vorsäulen) oder b) poröse Teilchen
(Trennsäulen): gleichmäßig dicke kleine Kügelchen aus Kieselgel,
Aluminiumoxid oder Ionentauscherharz. Gewinnung aus Kieselgel mit 1 m
Durchmesser durch Agglomeration (sehr einheitliche Größe). Oft mit dünnem
organischen Filmen beschichtet.
Detektoren:
● kein universell einsetzbarer Detektor - Lösungsmittel in großem Überschuß
vorhanden!
2 Arten: Lösungsensitive Detektoren sprechen auf Brechungsindex (RI, 5%
verbreitet), Dielektrizitätskoeffizient oder Dichte an.
Analytsensitive Detektoren sprechen auf UV (78% verbreitet), Fluoreszenz
(15% verbreitet) oder Diffusion des Analyten an.
UV-Detektor:
kleine Zelle, Z-förmiger Fluß, Zweistrahlgeräte mit reinem Eluens als Referenz,
oft Hg-Lichtquelle, aus der mit Filtern oder einem Monochromator eine
Wellenlänge (meist im Bereich von 250 - 365 nm) ausgewählt wird. Besser:
Diodenarray-Detektoren: Schar von Photoelementen nimmt bei jedem Peak ein
ganzes UV-Spektrum auf - so hat man gleichzeitig die Substanzen
charakterisiert!
UV-Durchflusszelle: Abb. 26.9. Skoog-Leary!
Diodenarray-Detektor: Abb. 7.22. Skoog-Leary! und 26.10. Skoog-Leary!
IR-Detektor: FT-IR-Geräte können auch von jedem Peak durch schnelles
Pulsen ein ganzes IR-Spektrum aufnehmen. Nachteil: Wasser, Alkohole etc.
absorbieren zu stark - unmögliche LM.
Fluoreszenzdetektor: Anregung der Substanz in der Durchflußzelle mit UV/VisStrahlung, und Messung der Fluoreszenz senkrecht dazu: Hg-, Xe- oder
Laserlicht. Vorteil: Sehr hohe Empfindlichkeit! Nachteil: nicht alle Substanzen
fluoreszieren. Abhilfe: Derivatisierung mit Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1naphthylsulfonylchlorid) o.ä. (Amine, Aminososäuren, Phenole).
Brechungsindex (RI)-Detektor: Lösungsmittel und Eluat wandern auf
unterschiedlichen Wegen durch je eine Hälfte der Zelle. Dabei wird der Strahl
der Lichquelle gekrümmt, wenn er durch die Trennwand aus Glas dringt und
die Brechungsindices sich unterscheiden. Die Verschiebung des Strahls wird als
Signal aufgezeichnet. Vorteil: universell für alle Verbindungen und LM
einsetzbar. Nachteil: sehr genaue Thermostatisierung nötig (1/1000°C) und nicht
sehr empfindlich.
Schema eines RI-Detektors: Abb. 29.11. Skoog-Leary!
Reversed Phase HPLC:
Bei sehr polaren Verbindungen wird das Kieselgel mit langkettigen
Alkylgruppen verkappt, und mit einem polaren Laufmittel (Wasser, Methanol,
Acetonitril) eluiert, so daß nun die polarsten Verbindungen am schnellsten
eluieren und danach die unpolareren, je nach van-der-Waals und hydrophoben
Wechselwirkungen.
Polysiloxane mit R = C8 (n-Octyl-) oder C18 (n-Octadecyl-): Alkylreste stehen
parallel nebeneinander wie bei einer Bürste. Vorteile auch: größere
Probenmengen toleriert! Heute etwa 3/4 aller Phasen = RP-Phasen!
8. Dünnschichtchromatographie (TLC):
Oft unterschätzte schnelle, hochempfindliche Analytik; besonders wertvoll zur
direkten Reaktionsverfolgung!
Prinzip: Ein Adsorbens (Kieselgel etc.) befindet sich in dünner Schicht auf
einem Aluminium- oder Glasträger. Auf der Startlinie werden die zu
trennenden Gemische als Punkt aufgetragen. Nach Eintauchen in das Eluens
wird die Laufmittelfront durch Kapillarkräfte hochgesaugt. Kleinste Mengen im
ng-Bereich und gute Trennleistung (1 - 50 m große Partikel). Für höchste
1:1
Ansprüche gibt es HPTLC (höchste Trennstufenzahl, mitEA/HX
GC vergleichbar).
Nutzen Sie DC intensiv! Tüpfeln Sie Edukt, Produkt (falls schon vorhanden),
Reaktionsgemisch und verfolgen Sie den Reaktionsverlauf! Cospotten: Wenn
nicht klar ist, welcher Fleck das Edukt ist, tüpfeln Sie zu dem Fleck der
Reaktionsmischung das Edukt hinzu: Dieser Fleck sollte dicker werden, sonst
käme ein anderer hinzu!
E
R C
P
E = Edukt
R = Reaktion
C = Cospot mit Produkt
P = Produkt
2D-Technik: Art Gradientenelution: Man läßt erst in einem Laufmittel laufen,
trocknet das DC und läßt in einem anderen Laufmittel (z.B. polarer) senkrecht
dazu laufen:
2D-Chromatogramm.
2D-Chromatogramm:
3. Aceton
1.EA/HX 1:1
5
1
4
2. 90° drehen
4
2
3
3
2
1
Start
5
Start
Nachweis von Substanzklassen durch Ansprühen oder Eintauchen in FärbeReagenzien:
a) Amine: Ninhydrin (lila)
b) Zucker: Cerammoniummolybdat (CAM, blau)
c) Alkene, Alkine: KMnO4: weiß
braun (MnO2).
d) Phosphorhaltige Verbb: Molybdato-Phosphorsäure in Ethanol (PME, blau).
e) viele org. Verbb.: Iodkammer
braun (reversibel abphönen).
f) alle organische Verbb: konz. Schwefelsäure (schwarz)