Bildung von HOCl durch Endothelzellen
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-0Aus der Abteilung Virologie des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau _Bildung von HOCl durch Endothelzellen_ INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2010 von Stefan Andreas Walker geboren in Heidelberg -1- Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Georg Bauer 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Christoph Hehrlein Jahr der Promotion: 2010 -2Die vorliegende Arbeit besteht aus experimentellen Untersuchungen zur Bildung von HOCl durch nichttransformierte und nichtimmortalisierte Endothelzellen dreier unterschiedlicher Gefäßtypen. Zusätzlich wurde eine zusammenfassende schematische Übersicht über den aktuellen Forschungsstand der Arbeitsgruppe zum Zeitpunkt der Promotion mit umfassender Literaturrecherche entwickelt. -3- Inhaltsverzeichnis 1 ABKÜRZUNGEN ........................................................................................................................ - 5 - 2 EINLEITUNG .............................................................................................................................. - 8 2.1 REAKTIVE SAUERSTOFF- UND STICKSTOFFMOLEKÜLE UND INTERZELLULÄRE APOPTOSEINDUKTION ..................................................................................... - 8 2.1.1 Wichtige Funktion von ROS und RNS im Organismus.................................................. - 8 2.1.2 Transformierte Zellen ..................................................................................................... - 9 2.1.3 Apoptose ...................................................................................................................... - 10 2.1.4 ROS-abhängige interzelluläre Apoptoseinduktion in transformierten Zellen ............... - 14 2.2 ZUSAMMENHÄNGE MIT KARDIOVASKULÄREN ERKRANKUNGEN ................................................... - 20 2.2.1 NO-Synthese und Endotheliale Dysfunktion ............................................................... - 20 2.2.2 Myeloperoxidase und Atherosklerose ......................................................................... - 24 3 MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................. - 27 3.1 MATERIAL ............................................................................................................................... - 27 3.1.1 Zelllinien und Zellkulturmedien .................................................................................... - 27 3.1.2 Induktoren, Inhibitoren und Enzyme ............................................................................ - 29 3.1.3 siRNA ........................................................................................................................... - 32 3.1.4 Sonstige Materialien und Geräte ................................................................................. - 33 3.2 METHODEN............................................................................................................................. - 33 3.2.1 Zellkultur ...................................................................................................................... - 33 3.2.2 Längerfristige Aufbewahrung von Zellen ..................................................................... - 34 3.2.3 RNA-Interferenz mit Hilfe von siRNA-Transfektion...................................................... - 34 3.2.4 Tropfenexperiment ....................................................................................................... - 36 3.2.5 Peroxidasenachweis .................................................................................................... - 38 3.2.6 Messung und Statistik .................................................................................................. - 42 - 4 ERGEBNISSE .......................................................................................................................... - 45 4.1 VORBEMERKUNGEN ................................................................................................................ - 45 4.2 VORVERSUCHE ....................................................................................................................... - 46 4.2.1 HSaVEC und 208F-Zellen als Effektorzellen im Vergleich .......................................... - 46 4.2.2 Effektorzellzahl............................................................................................................. - 47 4.3 EINFLUSS VON TRANSFORMIERTEM STATUS DER ZIELZELLE UND TGF-Β1-ZUGABE .................... - 48 4.4 WOVON HÄNGT DIE REAKTIONSFÄHIGKEIT DER ZIELZELLEN AB? ................................................ - 52 4.4.1 NADPH-Oxidase .......................................................................................................... - 52 4.4.2 Duale Oxidase ............................................................................................................. - 52 4.4.3 Caspase 3, Caspase 8 und Caspase 9 ....................................................................... - 54 4.5 CHARAKTERISIERUNG DER SIGNALWEGE MIT HILFE VON INHIBITOREXPERIMENTEN ..................... - 56 4.6 WOVON HÄNGT DIE WIRKSAMKEIT DER EFFEKTORZELLEN AB? .................................................. - 59 4.6.1 Endotheliale, neuronale und induzierbare NO-Synthetase ......................................... - 59 4.6.2 Duale Oxidase ............................................................................................................. - 62 4.6.3 NADPH-Oxidase .......................................................................................................... - 64 4.6.4 TGF-β-Bildung und TGF-β-Rezeptor ........................................................................... - 65 4.6.5 Signalwege bei Hemmung der endogenen TGF-β-Bildung......................................... - 66 4.7 MESSUNG DER ABGABE VON PEROXIDASE DURCH ENDOTHELZELLEN ........................................ - 68 4.8 ENTKOPPELUNG DER NO-SYNTHETASE ................................................................................... - 77 4.8.1 Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase .............................................. - 77 4.8.2 Tetrahydrobiopterin ...................................................................................................... - 79 4.8.3 L-NAME während des Transfektionsprozesses .......................................................... - 82 4.8.4 Vergleich der Endothelzelllinien................................................................................... - 84 - 5 DISKUSSION............................................................................................................................ - 86 5.1 APOPTOSEINDUKTION ÜBER ABGABE VON NO DURCH ENDOTHELZELLEN ................................... - 86 5.2 APOPTOSEINDUKTION ÜBER ABGABE VON PEROXIDASE DURCH ENDOTHELZELLEN ..................... - 90 5.3 EINFLUSS VON TGF-Β1 AUF DIE ABGABE VON NO UND PEROXIDASE ......................................... - 96 5.4 ABGABE VON TGF-Β1 DURCH ENDOTHELZELLEN ...................................................................... - 98 5.4.1 Abgabe von TGF-β1 beeinflusst den Endothelzelleffekt ............................................. - 98 - -45.4.2 Möglicher Einfluss der endothelialen NADPH-Oxidase ............................................... - 99 5.4.3 Möglicher Einfluss von Matrixmetalloproteinasen ..................................................... - 102 5.5 CYTOCHROM P450-OXIDOREDUKTASE UND NO-SYNTHESE.................................................... - 105 5.6 BETEILIGUNG VON ENDOTHELZELLEN AN DER TUMORABWEHR ................................................ - 112 5.7 BETEILIGUNG VON ENDOTHELZELLEN AN DER ENTSTEHUNG VON ATHEROSKLEROSE ................ - 113 6 ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................................... - 117 - 7 THEORETISCHER TEIL ........................................................................................................ - 118 7.1 TUMORZELLEN, TRANSFORMIERTE ZELLEN UND NICHTTRANSFORMIERTE ZELLEN ..................... - 118 7.2 NO-SYNTHESE UND NO-WEG ............................................................................................... - 118 7.2.1 NO-Synthese ............................................................................................................. - 118 7.2.2 NO-Weg ..................................................................................................................... - 120 7.3 HOCL-WEG ......................................................................................................................... - 120 7.4 NITRYLCHLORIDWEG ............................................................................................................. - 120 7.5 HABER-WEISS-REAKTION...................................................................................................... - 120 7.6 SINGLET-SAUERSTOFF UND KATALASE .................................................................................. - 121 7.7 WEITERE EXTRAZELLULÄRE REAKTIONEN ............................................................................... - 121 7.8 OXIDATIVER STRESS UND ANTIOXIDATIVE SYSTEME ............................................................... - 121 7.8.1 Superoxidanionen und Superoxiddismutase ............................................................. - 121 7.8.2 Antioxidative Systeme ............................................................................................... - 122 7.9 TODESREZEPTOREN.............................................................................................................. - 122 7.10 MITOCHONDRIALE PERMEABILITÄT .................................................................................... - 123 7.11 TGF-Β ............................................................................................................................. - 124 - 8 LITERATUR............................................................................................................................ - 125 - 9 DANKSAGUNG ...................................................................................................................... - 144 - -5- 1 Abkürzungen ABH AIF ANT APAF-1 AUC Bax BH2 BH4 Bid C3i C8i C9i cGMP CyP-D Cyt. C dATP DMSO DR Duox ECGM EDRF EGF EK EMEM Endo G eNOS FAD FADD Fas-L Fas-R FKS FMN G-6-P-DH Gal GC GCH1 GMP Gp GPx GSH GSSG GTP H2O2 HCAEC HK HOCl HPMEC HSaVEC IAPs 4-Aminobenzoyl-Hydrazid Apoptosis inducing factor Adenine nucleotide translocase Apoptotic protease activating factor 1 Area under curve Bcl-2-associated X protein Dihydrobiopterin Tetrahydrobiopterin BH3 interacting domain death agonist Caspase 3-Inhibitor Caspase 8-Inhibitor Caspase 9-Inhibitor Cyclisches GMP Cyclophilin D Cytochrom C Desoxyadenosintriphosphat Dimethylsulfoxid Death receptor Duale Oxidase Endothelial Cell Growth Medium Endothelial Derived Relaxing Factor Epidermal Growth Factor Verwendete Endkonzentration Eagles Minimal Essential Medium Endonuklease G Endotheliale NO-Synthetase = NOSIII Flavin-Adenin-Dinukleotid Fas-associated death-domain Fas-Ligand Fas-Rezeptor Fetales Kälberserum Flavin-Mononukleotid Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Galardin Guanylatzyclase GTP-Cyclohydrolase 1 Guanosinmonophosphat Glycoprotein Glutathion-Peroxidase Glutathion Glutathiondisulfidglutahion Guanosintriphosphat Wasserstoffperoxid Human Coronary Artery Endothelial Cells Herkunft Hypochlorige Säure Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Human Saphenous Vein Endothelial Cells Inhibitors of apoptosis Abkürzungen -6IkB IKK iNOS JNK JNKK LAP LDL L-NAME MEKK MMP MPO MPO-I mRNA mtNOS N2O3 NADH NADPH NF-kB NIK NK-Zelle nNOS ·NO NO¯ NO2¯ NO2· NO2Cl NO3¯ NOD Nox O 2· ¯ 1 O2 ·OH OH¯ ONOO¯ ONOOH PKCζ POD POR PTP RCHO RIP RISC RNA RNH2 RNHCl RNS ROS siRNA SL Smase SOD Inhibitor of kB IkB kinase complex Induzierbare NO-Synthetase =NOSII C-Jun N-terminal kinase JNK Kinase Latency associated protein Low density lipoprotein L-N-φ-nitro-l-Arginin-Methylester-Hydrochlorid MAP-Erk kinase kinase Matrixmetalloproteinase Myeloperoxidase Myeloperoxidase Compound I Messenger RNA Mitochondriale NO-Synthetase Distickstofftrioxid Nikotinamiddinukleotid Nikotinamiddinukleotidphosphat Nukleärer Faktor kB NF kB-inducing kinase Natürliche Killerzelle Neuronale NO-Synthetase =NOSI Stickstoffmonoxid Nitroxylanion Nitrit Stickstoffdioxid Nitrylchlorid Nitrat NO-Dioxygenase NADPH-Oxidase Superoxidanionen Singulett-Sauerstoff Hydroxylradikal Hydroxylanion Peroxynitrit Peroxynitritsäure Proteinkinase Cζ Peroxidase Cytochrom P450-Oxidoreduktase Permeability transition pore Aldehyd Receptor-interacting rotein RNA-induced silencing complex Ribonukleinsäure primäre Aminogruppe Chloramin Reaktive Stickstoffspezies Reaktive Sauerstoffspezies Small interfering RNA Stammlösung Sphingomyelinase Superoxid-Dismutase Abkürzungen -7tBid TGF TGFR TNF TNFR TRADD TRAF TRAIL TRAILR Ü VDAC v-src XO Truncated Bid Transforming Growth Factor TGF-Rezeptor Tumornekrosefaktor TNF-Rezeptor TNF-receptor-associated death domain TNF-receptor-associated factor TNFR-assoziierter apoptoseinduzierender Ligand TRAIL-Rezeptor Überstand Voltage-dependent anion channel Viral sarcoma-Onkogen Xanthinoxidase Abkürzungen -8- Einleitung 2 Einleitung 2.1 Reaktive Sauerstoff- und Stickstoffmoleküle und interzelluläre Apoptoseinduktion 2.1.1 Wichtige Funktion von ROS und RNS im Organismus Die Gruppe der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beinhaltet unter anderem Superoxidanionen (O2·¯), Wasserstoffperoxid (H2O2), hypochlorige Säure (HOCl), Singulett-Sauerstoff ( 1O 2) und Hydroxylradikale (·OH). Zu den reaktiven Stickstoffspezies (RNS) gehören Stickstoffmonoxid (·NO), Stickstoffdioxid (·NO2), Distickstofftrioxid (N2O3) und Peroxynitrit (ONOO¯). ROS und RNS spielen im menschlichen Organismus sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Prozessen eine wichtige Rolle. Entscheidend für die biologischen Auswirkungen sind dabei sowohl die auftretenden Konzentrationen als auch aufgrund geringer Reichweiten durch eine hohe Reaktivität vieler dieser Moleküle der jeweilige Entstehungsort (Bauer, 2000). Sie regulieren unter anderem Transkriptionsfaktoren (Sun und Oberley, 1996), zelluläre Signalwege (Kamata und Hirata, 1999) und Zellproliferation (Burdon, 1995). ROS und RNS entstehen als Nebenprodukte in der mitochondrialen Atmungskette (Han et al., 2001, Turrens, 1997) und werden durch zelluläre Enzyme wie NADPH-Oxidase (Bedard und Krause, 2007) und Xanthinoxidase (Knowles et al., 1969) produziert. Phagozyten bilden im Rahmen der Abwehr von Mikroorganismen ROS und RNS (Hampton et al., 1996), ebenso werden sie aus der Umwelt beispielsweise über Zigarettenrauch aufgenommen (Yamaguchi et al., 2007). Katalase (Chance, 1952), Glutathionperoxidase (Mills, 1959, Thomas et al., 1990) und Thioredoxin (Holmgren, 1977) wirken als antioxidative Systeme einer Zellschädigung durch ROS und RNS entgegen (Kamata und Hirata, 1999). Ein Ungleichgewicht zwischen reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies einerseits sowie Schutzfunktionen antioxidativer Systeme andererseits spielt bei der Pathogenese einer Vielzahl an Erkrankungen eine Rolle. Hierzu gehören beispielsweise kardiovaskuläre Erkrankungen (siehe 2.2), neurodegenerative Erkrankungen (Trushina und McMurray, 2007, Gackowski et al., 2008), die Neurotoxizität von Pestiziden (Castello et al., 2007) und die Verhinderung von bakterieller Vaginose durch Laktobazillen (Bauer, 2001). Untersuchungen zur -9- Einleitung Interaktion von nichttransformierten Zellen mit transformierten Zellen zeigen, dass hier ebenfalls eine Interaktion stattfindet, bei der reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies eine wichtige Rolle spielen (siehe 2.1.2). 2.1.2 Transformierte Zellen Bei transformierten Zellen handelt es sich um Zellen, die Merkmale maligner Zellen und das Potential zur Tumorbildung tragen, die jedoch noch keinen körpereigenen Schutzmechanismen ausgesetzt waren. Maligne Tumoren entstehen in vivo über einen mehrstufigen Prozess, bei dem genetische Veränderungen und exogene Faktoren zusammenwirken und schließlich zu einem unkontrollierten Zellwachstum führen. Diese Entwicklung ist insbesondere durch eine Aktivierung von Protoonkogenen und einer Inaktivierung von Tumorsupressorgenen bedingt (Weinberg, 1989). Dieser bereits in einer frühen Phase der Entstehung maligner Tumoren stattfindende Transformationsprozess kann in vitro durch chemische und physikalische Noxen oder aber auch durch Übertragung eines viralen Plasmids, welches ein Onkogen enthält, erfolgen. Derartig in vitro veränderte, im Folgenden als transformiert bezeichnete Zellen besitzen eine veränderte Morphologie und ein charakteristisches Proliferationsverhalten (siehe 3.1.1), bilden aber noch nicht notwendigerweise in vivo einen Tumor. Sie müssen hierfür unter anderem körpereigene Schutzmechanismen, beispielsweise Apoptoseinduktion durch NKZellen (Hanna, 1982), überwinden sowie hypoxieinduzierte p53-abhängige Apoptoseinduktion verhindern (Weinmann et al., 2004) und Angiogenese induzieren (Gupta und Qin, 2003). An derartigen transformierten Zellen lässt sich also in vitro ein sehr frühes Stadium der Entstehung maligner Tumoren untersuchen. Von besonderem Interesse für die vorliegende Arbeit ist der Zusammenhang zwischen transformiertem Phänotyp und einer konstitutiven Produktion von Superoxidanionen an der Außenmembran dieser Zellen. Diese ist ein Merkmal von transformierten Zellen sowie Tumorzellen aus unterschiedlichen Geweben, während nichttransformierte Zelllinien keine oder eine geringere Superoxidanionenproduktion an der Außenmembran aufweisen (Herdener et al., 2000, Bedard und Krause, 2007, Yantiri und Morré, 2001). Die in den von mir durchgeführten Experimenten verwendeten transformierten Fibroblasten besitzen das viral sarcoma-Onkogen (v-src, siehe 3.1.1), welches aus Rous-Sarkomviren isoliert wurde, konstitutiv aktiv ist und eine Tyrosinkinase kodiert, die wiederum zu - 10 - Einleitung einer verstärkten Phosphorylierung des ras-Proteins führt (Odajima et al., 2000). Dieses wird durch das ras-Gen codiert und ist ebenso wie rac eine GTPase. Eine durch ras verstärkte Aktivierung von rac, welches Bestandteil von membranständigen NADPH-Oxidasen ist, führt zu deren Aktivierung mit Superoxidanionenproduktion durch Übertragung von Elektronen von NADPH auf molekularen Sauerstoff (Irani et al., 1997, Bedard und Krause, 2007): NAD(P)H → NAD(P)+ + H+ + 2e¯ e¯ + O2 → O2·¯ Eine mögliche Erklärung für die vermehrte Bildung von Superoxidanionen an der Außenmembran von transformierten Zellen ist, dass diese günstige Bedingungen für transformerte Zellen schaffen. So konnte gezeigt werden, dass die Expression einer zur NADPH-Oxidase homologen Untereinheit bei gleichzeitig erhöhter Superoxidanionenproduktion den transformierten Phänotyp fördert (Suh et al., 1999), dass eine Hemmung der NADPH-Oxidase zu einer Hemmung des transformierten Phänotyps führt (Irani et al., 1997) und, dass Superoxidanionen die Zellproliferation steigern können (Burdon, 1995). Insgesamt besteht also ein enger Zusammenhang zwischen transformiertem Phänotyp und Superoxidanionenproduktion. Dieser ist insbesondere von Bedeutung für die Induktion von Apoptose in transformierten Zellen durch nichttransformierte Zellen (Herdener et al., 2000) 2.1.3 Apoptose Im Rahmen physiologischer Prozesse wird ein Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Zelltod aufrechterhalten, dabei werden überzählige, infizierte oder anderweitig geschädigte Zellen über einen gesteuerten Prozess, die Apoptose, gezielt eliminiert (Adams, 2003). Diese ist abzugrenzen von der nicht kontrolliert ablaufenden Nekrose. Beide Formen des Zelltodes werden von charakteristischen morphologischen Merkmalen begleitet. Bei apoptotischen Zellen kommt es zu Zellschrumpfung, Kondensation und Fragmentation des Zellkerns sowie Ausstülpung von Bläschen an der Zellmembran (membrane blebbing, siehe 3.2.6.1). Letztlich werden diese Bläschen, die Bestandteile der zerfallenden Zelle enthalten, als apoptotic bodies phagozytiert, ohne dass es zu einer Entzündungsreaktion kommt. Demgegenüber - 11 - Einleitung sind nekrotische Zellen aufgrund eines Verlustes von Funktionen der Zellmembran insbesondere charakterisiert durch eine osmotisch bedingte Volumenzunahme der Zelle und eine in vivo einsetzende inflammatorische Reaktion (Vaux, 1993). Apoptose kann durch eine Vielzahl an Stimuli induziert werden, die über unterschiedliche Wege letztendlich zu der Aktivierung von Cysteinyl-AspartatEndopeptidasen (Caspasen) führen (Adams, 2003). Diese besitzen eine N-terminale Prodomäne, eine kleine und eine große Untereinheit sowie in manchen Fällen eine Linker-Region (Philchenkov et al., 2004). Die Vertreter der Caspasen werden unterteilt in Initiatorcaspasen und Effektorcaspasen. Initiatorcaspasen (insbesondere Caspase 8 und 9) aktivieren Effektorcaspasen durch proteolytische Spaltung von deren großer und kleiner Untereinheit (Wolf und Green, 1999) und tragen dadurch zu einer Verstärkung des apoptoseinduzierenden Signals bei. Effektorcaspasen (insbesondere Caspase 3) führen zu einer Zerstörung der Zelle durch Zersetzung von Proteinen und Aktivierung einer DNAse, welche in der Folge Chromatin abbaut (Adams, 2003). In der Aktivierung der Caspasen werden ein mitochondrialer Weg über Caspase 9 und ein rezeptorvermittelter Weg über Caspase 8 unterschieden (Jin und El-Deiry, 2005). Der mitochondriale Weg kann beispielsweise als Reaktion auf Zellschädigungen durch apoptoseinduzierende Moleküle wie Bax (Villunger et al., 2003), truncated Bid (Li et al., 1998) und Ceramide (Ghafourifar et al., 1999) induziert werden und beruht auf der Bildung einer mitochondrialen permeability transition pore (PTP) aus adenine nucleotide translocase (ANT), cyclophilin-D (CyP-D) und voltage-dependent anion channel (VDAC) (Crompton, 1999). Diese führte zu einem Einstrom von Wasser und Elektrolyten in die mitochondriale Matrix und zu Anschwellen derselben, in der Folge wird die äußere mitochondriale Membran durchlässig (Feldmann et al., 2000). Aufgrund dieser Permeabilisierung kommt es insbesondere zum Austritt von Cytochrom C aus dem Intermembranraum ins Zytosol. Cytochrom C bildet mit den cytosolischen Komponenten Procaspase 9, dATP und Apaf-1 einen Komplex (Apoptosom), der zu einer Aktivierung von Caspase 9 führt (Zou et al., 1999). Diese Initiatorcaspase wiederum aktiviert Caspase 3 (Li et al., 1997) und führt damit über Zersetzung von Proteinen zum apoptotischen Zelluntergang. Bei dem mitochondrialen Weg der Apoptoseinduktion führt also eine Reihe unterschiedlicher Einflüsse zu einer Durchlässigkeit der äußeren mitochondrialen Membran, so dass - 12 - Einleitung Moleküle aus dem Intermembranraum der Mitochondrien austreten können, die zum Zelltod führen. Die rezeptorvermittelte Apoptoseinduktion beruht dagegen auf einer Bindung von Liganden an Todesrezeptoren, beispielsweise den TNF-Rezeptor (tumor necrosis factor-Rezeptor), den TRAIL-Rezeptor (tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand-Rezeptor) und den Apo-1/Fas-Rezeptor (Ashkenazi und Dixit, 1998). Diese Rezeptoren wiederum aktivieren über das Adapterprotein FADD gebundene Procaspase 8 zu Caspase 8 (Muzio et al., 1998), welche ebenso wie Caspase 9 die Effektorcaspase 3 proteolytisch aktiviert (Stennicke et al., 1998) und damit die Zerstörung der Zelle bewirkt. Die Umsetzung von Bid in truncated Bid durch Caspase 8 und eine hierdurch erfolgende Steigerung der mitochondrialen Permeabilität (Li et al., 1998) stellt eine Verbindung zwischen rezeptorvermittelter und mitochondrialer Apoptoseinduktion dar, indem sie eine Aktivierung der mitochondrialen Apoptoseinduktion durch Todesrezeptoren ermöglicht. - 13 - Einleitung Schema 1: Mitochondriale und rezeptorvermittelte Apoptoseinduktion. (1) Eine Vielzahl an Stimuli, darunter die Einwirkung von reaktiven Sauerstoffspezies und von erhöhten Konzentrationen an tBid, Bax und Ceramiden kann zu einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran führen. (2) Hierdurch kommt es zum Einstrom von Wasser und Elektrolyten in die mitochondriale Matrix und einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran. (3) In der Folge aus dem mitochondrialen Intermembranraum austretendes Cytochrom C bildet mit Procaspase 9, dATP und Apaf-1 einen Komplex (Apoptosom), der aktivierte Caspase 9 beinhaltet. (4) Caspase 9 aktiviert Caspase 3, welche unter anderem über Proteolyse zum Zelltod führt. (5) Die Bindung von Liganden an Todesrezeptoren wie den Apo-1/Fas-Rezeptor, den Apo-2/TRAIL-Rezeptor und den TNF-Rezeptor führt zu Aktivierung von Caspase 8. (6) Diese aktiviert Caspase 3 und führt so zum Zelltod. (7) Die Umsetzung von Bid in truncated Bid durch Caspase 8 stellt eine Verbindung zwischen rezeptorvermittelter und mitochondrialer Apoptoseinduktion dar. - 14 - Einleitung 2.1.4 ROS-abhängige interzelluläre Apoptoseinduktion in transformierten Zellen Die Kokultur verschiedener Zelllinien zeigt, dass transformierte Zellen in Anwesenheit von nichttransformierten Zellen verstärkt in Apoptose gehen, ohne dass hierfür ein direkter Zell-zu-Zell-Kontakt nötig ist. (Jürgensmeier et al., 1994, Bauer, 1996, Bauer, 2000). Die Korrelation von transformiertem Phänotyp und Sensitivität gegenüber interzellulärer Apoptoseinduktion konnte ebenfalls bei mit Hilfe chemischer Karzinogene transformierten Zelllinien (Panse et al., 1997) sowie bei Zelllinien mit induzierbarem Onkogen (Schwieger et al., 2001) beobachtet werden. Revertanten, also nichttransformierten ursprünglich Phänotyp transformierte angenommen Zellen, haben, die sind spontan den demgegenüber unempfindlich (Beck et al., 1997). Ebenso haben Tumorzellen, die ex vivo entnommen wurden, einen Resistenzmechanismus gegenüber der apoptoseinduzierenden Wirkung ausgebildet (Engelmann et al., 2000, Engelmann und Bauer, 2000). Diese Apoptoseinduktion in transformierten Zellen durch nichttransformierte Zellen, die potentiell als früher Abwehrmechanismus während der Onkogenese zur Elimination spontan entstehender transformierter Zellen beitragen könnte, läuft insbesondere über einen von Stickstoffmonoxid sowie einen von hypochloriger Säure (HOCl) abhängigen Signalweg ab (Herdener et al., 2000). Die Wirksamkeit beider Reaktionswege beruht insbesondere darauf, dass gering reaktive Moleküle mit einer großen Reichweite (NO beziehungsweise HOCl) selektiv nahe der Membran transformierter Zellen mit dort durch NADPH-Oxidase produzierten ebenfalls gering apoptoseinduzierenden reaktiven Molekülen Superoxidanionen mit geringer zu Reichweite hochreaktiven (Peroxynitrit beziehungsweise Hydroxylradikale) reagieren und so die transformierten Zellen selektiv schädigen (Bauer, 2000). Die geringe Reichweite der an der Membran transformierter Zellen synthetisierten Superoxidanionen bestimmt also den Ort der stattfindenden toxischen Reaktion und damit die selektive Schädigung von transformierten Zellen. - 15 - Einleitung Schema 2: Kokultur unterschiedlicher Zelllinien mit nichttransformierten Fibroblasten. (A) Nichttransformierte Fibroblasten sind unempfindlich gegenüber interzellulärer Apoptoseinduktion, dies gilt auch für Revertanten mit v-src transformierter Fibroblasten (Beck et al., 1997). (B) Transformierte Zellen sind sensitiv gegenüber interzellulärer Apoptoseinduktion. Dies gilt unter anderem für mit v-src transformierte Fibroblasten (Beck et al., 1997), mit Hilfe chemischer Karzinogene transformierte Zellen (Panse et al. 1997) sowie Fibroblasten mit einem induzierbaren ras-Onkogen (Schwieger et al., 2001). (C) Ex vivo entnommene Tumorzellen sind resistent gegenüber interzellulärer Apoptoseinduktion (Engelmann et al., 2000, Engelmann und Bauer, 2000). 2.1.4.1 NO-Weg Stickstoffmonoxid wird je nach Zelllinie durch eine induzierbare (iNOS, Stuehr et al. 1991), eine konstitutive neuronale (nNOS, Bredt und Snyder, 1990) und/oder eine konstitutive endotheliale (eNOS, Förstermann et al., 1991) Form der NO-Synthetase in zwei Teilschritten aus der Aminosäure Arginin synthetisiert. Diese wird in einer ersten, von Tetrahydrobiopterin abhängigen Reaktion unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und NADPH in N-Hydroxy-Arginin umgesetzt, aus welchem in einem zweiten Schritt wiederum unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und NADPH Citrullin und Stickstoffmonoxid gebildet werden (Knowles und Moncada, 1994): - 16 - Einleitung Arginin + O2 + NADPH+H+ → N-Hydroxyl-Arginin + NADP+ + H2O N-Hydroxyl-Arg. + O2 + 1/2(NADPH+H+) → Citrullin + ·NO + 1/2 NADP+ + H2O NO-Synthetasen liegen weit überwiegend zytosolisch vor (Marletta, 1993). NO ist relativ hydrophob und membrangängig (Lancaster, 1994), der Durchtritt wird jedoch wahrscheinlich in einem gewissen Maße durch Aquaporin-1 unterstützt (Herrera et al., 2006). NO besitzt eine hohe Reichweite (Lancaster, 1994). Erreichen Stickstoffmonoxidmoleküle transformierte Zellen, so kann es zu einer Reaktion mit Superoxidanionen der transformierten Zellen kommen. Diese haben im Gegensatz zu NO eine sehr geringe Reichweite (Saran und Bors, 1994), sind nur milde Oxidantien und bewirken selbst keine Apoptoseinduktion (Ivanovas et al., 2002). Aus der Reaktion von Stickstoffmonoxid mit Superoxidanionen entsteht Peroxynitrit (Goldstein und Czapski, 1995): ·NO + O2·¯ → ONOO¯ Dieses und seine protonierte Form Peroxynitritsäure (ONOOH) sind sehr reaktiv und bewirken unter anderem Lipidperoxidation (Rubbo et al., 1994), Oxidation (Radi et al., 1991b), Nitrosylierung (van der Vliet et al., 1998) und Nitrierung (Gow et al., 1996). Bei mehreren Zelllinien konnte eine Apoptoseinduktion durch Peroxynitrit beobachtet werden (Lin et al., 1998, Ivanovas et al., 2002). Hierbei wirkt möglicherweise nicht Peroxyntrit selbst als Induktor, sondern aus Peroxynitritsäure entstehende Hydroxylradikale und Stickstoffdioxid (Bauer, 2000). Die Apoptoseinduktion durch die Reaktion von NO der Effektorzellen, welches eine hohe Reichweite besitzt, und Superoxidanionen der transformierten Zielzellen, welche eine geringe Reichweite besitzen, zu Peroxynitrit nahe der Membran transformierter Zellen wird als NO-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion bezeichnet. Die selektive Wirkung dieses Signalweges auf transformierte Zellen wird hierbei sowohl durch die geringe Reichweite der an den transformierten Zellen gebildeten Superoxidanionen als auch durch die hohe Reaktivität des entstehenden Peroxynitrits gewährleistet. - 17 - Einleitung Schema 3: NO-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion. (1) Die NO-Synthetase von Effektorzellen produziert aus Arginin über N-Hydroxyl-Arginin Citrullin und Stickstoffmonoxid, welches durch die Zellmembran treten kann. (2) Trifft Stickstoffmonoxid auf Superoxidanionen der membranständigen NADPH-Oxidase transformierter Zellen, so resultiert Peroxynitrit, welches Lipidperoxidation und Apoptoseinduktion bewirken kann. 2.1.4.2 HOCl-Weg Neben dem NO-Weg hängt ein weiterer Signalweg der interzellulären Apoptoseinduktion von Superoxidanionen transformierter Zellen ab und wirkt dadurch selektiv auf diese Zellen. Die durch NADPH-Oxidase gebildeten Superoxidanionen (siehe 2.1.2) dismutieren zu einem von ihrer Konzentration abhängigen Anteil spontan zu Wasserstoffperoxid (Fridovich, 1983, Bielski und Allen, 1977): 2 O2·¯ + 2 H+ → H2O2 + O2 Wasserstoffperoxid ist im Gegensatz zu Superoxidanionen relativ langlebig (Saran et al., 1999) und besitzt dadurch eine hohe Reichweite. Es ist ein Substrat der von Phagozyten abgegebenen Myeloperoxidase und wird von dieser über mehrere Zwischenreaktionen in hypochlorige Säure umgesetzt. Im Verlauf dieser Umsetzung liegt die Myeloperoxidase selbst in modifizierter Form vor (Furtmüller et al., 2000, Carr et al., 2000, Kettle et al., 2007): - 18 - Einleitung MPO + H2O2 → MPO-I + H2O MPO-I + Cl¯ → MPO-I-Cl¯ MPO-I-Cl¯ + H+ → MPO + HOCl Es ergibt sich als Gesamtreaktion: H2O2 + Cl¯ + H+ → HOCl + H2O Die Bildung von hypochloriger Säure aus Wasserstoffperoxid wird ebenso von einer Peroxidase nichttransformierter Zellen katalysiert (Herdener et al., 2000), welche Bestandteil der dualen Oxidase ist (Ophoven, in Vorbereitung). Die duale Oxidase ist membranständig und funktioniert gleichzeitig als NADPH-Oxidase. Ein Ca2+bindender Bereich sowie eine flavoproteinhaltige Bindungsstelle für NADPH sind an der cytosolischen Seite der Membran lokalisiert, während sich die Peroxidaseuntereinheit an der Außenseite befindet (Lambeth, 2002). Schema 4: Duale Oxidase. Die duale Oxidase besteht aus 7 Transmembrandomänen, einer intrazellulär gelegenen Flavoproteindomäne, an der die Umsetzung von NADPH in NADP+ und H+ stattfindet, einer Calcium-bindenden Domäne sowie einer an der Membranaußenseite befindlichen Peroxidase-Domäne. - 19 - Einleitung Die duale Oxidase findet sich unter anderem in Schilddrüsenparenchym, respiratorischer und gastrointestinaler Schleimhaut sowie Prostata (Bedard und Krause, 2007). Matrixmetalloproteinasen können die Peroxidaseuntereinheit proteolytisch von der Hauptdomäne abtrennen, so dass diese in den extrazellulären Raum abgegeben wird (Ophoven, in Vorbereitung, siehe 5.2). Befinden sich in der Umgebung transformierter Zellen solche Zellen, die eine Peroxidase abgeben, so kann diese in die Nähe der transformierten Zellen gelangen und hypochlorige Säure bilden (Herdener et al., 2000). HOCl wiederum ist wie Wasserstoffperoxid langlebig (Saran et al., 1999) und hat ebenfalls eine hohe Reichweite, kann jedoch mit den an der Membran transformierter Zellen vorhandenen Superoxidanionen zu Hydroxylradikalen reagieren (Long und Bielski, 1980, Candeias et al., 1993): HOCl + O2·¯ → ·OH + Cl¯ + O2 Diese nahe der Membran entstehenden Hydroxylradikale sind sehr reaktive, kurzlebige Moleküle (Gutteridge, 1984) und bewirken Lipidperoxidation und dadurch Apoptoseinduktion (Tsujimoto et al., 1998, Herdener et al., 2000). Der beschriebene, als HOCl-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion bezeichnete Signalweg beruht also auf einer Umsetzung von Wasserstoffperoxid aus Superoxidanionen der NADPH-Oxidase transformierter Zellen in HOCl, welches wiederum zusammen mit Superoxidanionen sehr reaktive Hydroxylradikale bildet, die schließlich zur Apoptoseinduktion führen. Ähnlich wie bei dem NO-Weg beruht die selektive Wirkung dieses Signalweges einerseits auf der geringen Reichweite der von transformierten Zellen gebildeten Superoxidanionen, andererseits auf der hohen Reaktivität der entstehenden Hydroxylradikale. Das multifunktionale Zytokin Transforming Growth Factor-β (TGF-β) ist über verschiedene Wirkmechanismen unter anderem an der Steuerung von Zellzyklus, Zelldifferenzierung und Zelltod beteiligt (Barcellos-Hoff und Dix, 1996). Es kann die Abgabe von Peroxidase steigern (Ophoven, in Vorbereitung) und verstärkt die interzelluläre Apoptoseinduktion (Eckert und Bauer, 1998). - 20 - Einleitung Schema 5: HOCl-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion. (1) Nichttransformierte Zellen exprimieren membranständige duale Oxidase, die eine NADPH-Oxidase-Aktivität und eine Peroxidaseuntereinheit besitzt. (2) Die Peroxidaseuntereinheit kann freigesetzt werden und gelangt in die Nähe transformierter Zellen. (3) Die NADPH-Oxidase transformierter Zellen bildet Superoxidanionen aus molekularem Sauerstoff, welche spontan zu Wasserstoffperoxid dismutieren. (4) Die von Endothelzellen abgegebene Peroxidase nutzt Wasserstoffperoxid als Substrat für die Bildung von HOCl. (5) Dieses bildet zusammen mit Superoxidanionen der NADPH-Oxidase der transformierten Zellen Hydroxylradikale, welche Lipidperoxidation und Apoptoseinduktion bewirken können. 2.2 Zusammenhänge mit kardiovaskulären Erkrankungen 2.2.1 NO-Synthese und Endotheliale Dysfunktion Kurz nach der Identifikation des Endothelial Derived Relaxing Factor (EDRF) als Stickstoffmonoxid wurde gezeigt, dass Endothelzellen Stickstoffmonoxid produzieren (Palmer et al., 1988). Während im Rahmen inflammatorischer Reaktionen kurzzeitig sehr hohe Konzentrationen an NO durch Leukozyten abgegeben werden, synthetisieren Endothelzellen konstitutiv eine vergleichsweise geringere Menge, welche über Vasodilatation den systemischen Blutdruck reguliert (Rees et al., 1989). Hierbei wirken unter anderem Acetylcholin und bei hohem systemischem Blutdruck auftretende erhöhte Scherkräfte steigernd auf die NO-Synthese und führen dadurch - 21 - Einleitung zu einer verminderten Gefäßkonstriktion (Buga et al., 1991, Knowles und Moncada, 1994). Diese wird vermittelt über eine Aktivierung von Guanylatcyclase in glatter Muskulatur der Gefäße, welche zu einer verstärkten Umsetzung von Guanosyltriphosphat (GTP) in cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und dadurch zu einer Relaxation der glatten Muskelzellen führt (Ignarro, 1999). Neben dieser antihypertensiven Funktion hemmt durch Endothelzellen produziertes Stickstoffmonoxid die Aggregation und Adhäsion von Blutplättchen und wirkt hierdurch der Bildung von Thromben entgegen (Moncada et al., 1991), ebenso vermindert es die Adhäsion von Leukozyten und wirkt dadurch antiinflammatorisch (Siegenthaler und Blum, 2006). Bei Endothelzellen wurden mit der endothelialen und der neuronalen NO-Synthetase zwei konstitutiv aktive NO-Synthetasen nachgewiesen (Bachetti et al., 2004). Diese weisen als Kofaktoren unter anderem Protoporphyrin IX, Flavin-Mononukleotid (FMN), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) und Tetrahydrobiopterin (BH4) auf (Knowles und Moncada, 1994). Besondere pathophysiologische Bedeutung besitzt hierbei Tetrahydrobiopterin. Dieses wirkt im nichtoxidierten Zustand unter anderem durch Erleichterung der Bindung von Arginin an die NO-Synthetase als essentieller Kofaktor der NO-Synthese (Gesierich et al., 2003). Es wird einerseits über mehrere Zwischenstufen aus Guanosintriphosphat (GTP) neu gebildet, wobei die Umsetzung von GTP in 7,8-Dihydroneopterin-Triphosphat durch GTP-Cyclohydrolase 1 der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist (Hatakeyama et al., 1993, Gesierich et al., 2003), andererseits kann oxidiertes BH4 über Dihydrofolat-Reduktase wieder regeneriert werden (Moens und Kass, 2006). Eine Oxidation von Tetrahydrobiopterin unter anderem zu Dihydrobiopterin (Nichol et al., 1983) führt zu einer verminderten Synthese von Stickstoffmonoxid und einer stattdessen gesteigerten Produktion von Superoxidanionen durch NO-Synthetase (VasquezVivar et al., 1998), das Endothel kann seine durch NO vermittelte Funktion als Regulator der Gefäßweite und Schutz vor Thrombose und Inflammation nicht mehr vollständig wahrnehmen, es kommt zu einer endothelialen Dysfunktion (Alp und Channon, 2004). Diese ist ein gemeinsames Merkmal der klassischen Gefäßrisikofaktoren wie Hypercholesterinämie, arterieller Hypertonie, Diabetes mellitus und Rauchen (Siegenthaler und Blum, 2006, Ross, 1999). Ein Mangel an Tetrahydrobiopterin kann auf einer verminderten Bildung beispielsweise unter Einwirkung von Angiotensin II beruhen (Chalupsky und Cai, 2005) oder aber auf - 22 - Einleitung einer Oxidation vorhandenen Tetrahydrobiopterins über Peroxynitrit aus der Reaktion von Superoxidanionen mit Stickstoffmonoxid (Milstien und Katusic, 1999, Goldstein und Czapski, 1995). Hierbei können die Superoxidanionen beispielsweise aus der mitochondrialen Atmungskette (Turrens, 1997, Han et al., 2001) oder aber von der in Endothelzellen vorhandenen NADPH-Oxidase der Isoformen 1, 2 und 4 stammen (Li und Shah, 2002, Ago et al., 2005). Die Reaktion von Superoxidanionen mit NO zu Peroxnitrit, welches dann Tetrahydrobiopterin oxidiert, wird durch eine erhöhte Konzentration an Superoxidanionen gefördert, welche unter anderem unter Einwirkung von Angiotensin II, bei Hypercholesterinämie, bei Diabetes mellitus und in atherosklerotischen Läsionen auftritt (Förstermann und Münzel, 2006). Die Produktion von Stickstoffmonoxid durch Endothelzellen sowie Superoxidanionen durch transformierte Zellen führt zu der Frage, ob Endothelzellen ähnlich wie nichttransformierte Fibroblasten bei transformierten Fibroblasten Apoptose über eine Bildung von Peroxynitrit (siehe 2.1.4.1) induzieren können. Hierfür spricht insbesondere, dass Endothelzellen konstitutiv bei physiologischen Vorgängen relevante Konzentrationen an NO abgeben. - 23 - Einleitung Schema 6: Entkoppelung der NO-Synthetase. (1a, 1b) Endotheliale und neuronale NO-Synthetase besitzen Tetrahydrobiopterin (BH4) als essentiellen Kofaktor und produzieren NO in Endothelzellen. (2a, 2b) Die Neusynthese von Tetrahydrobiopterin beginnt mit dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, der Umsetzung von GTP in 7,8-Dihydroneopterin-Triphosphat durch GTP-Cyclohydrolase 1, und wird über weitere Zwischenprodukte fortgesetzt. (3a, 3b) BH4 kann zu dem inaktiven BH2 oxidiert werden, dieses wird durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu Tetrahydrobiopterin aktiviert. (4a) NADPH-Oxidase produziert konstitutiv eine geringe Menge Superoxidanionen. (4b) Diese kann bei endothelialer Dysfunktion gesteigert sein, so dass es verstärkt zu einer Bildung von Peroxynitrit kommt, welches BH4 unter anderem zu BH2 oxidiert und damit inaktiviert. (5a) NO der Endothelzellen führt über Aktiverung von Guanylatzyklase zu einer Relaxation von glatter Muskulatur der Gefäßwand. (5b) Aufgrund einer verminderterten Abgabe von NO kann es bei endothelialer Dysfunktion zu einer verstärkten Konstriktion der glatten Muskulatur kommen. - 24 - Einleitung 2.2.2 Myeloperoxidase und Atherosklerose Atherosklerotische Läsionen finden sich an zerebralen, koronaren und peripheren Arterien und sind unter anderem verantwortlich für transitorische ischämische Attacken und Apoplex, Angina pectoris und Myokardinfarkt sowie Claudicatio intermittens und Gangrän. Neben der häufigeren stenosierenden Form der Atherosklerose kommt insbesondere an Aorta, Iliakalarterien und Arteria poplitea eine dilatative Verlaufsform mit Bildung von Aneurysmen vor (Siegenthaler und Blum, 2006). Der Prozess der Entstehung atherosklerotischer Plaques beginnt mit endothelialer Dysfunktion, die zu einer Verminderung der vasodilatatorischen, antithrombotischen und antiinflammatorischen Funktion des Endothels führt (siehe 2.2.1). Es kommt zu einer gesteigerten endothelialen Permeabilität, welche das Eindringen von Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) in den subendothelialen Raum erleichtert (Ross, 1999) und zu einer Retention führt, die wiederum deren oxidative Veränderung fördert, da im subendothelialen Raum die antioxidative Wirkung von Plasma und Plasmaproteinen wie Albumin geringer ist (Williams und Tabas, 1995). Eine Oxidation von LDL kann experimentell durch Inkubation mit Zellkulturen von Endothelzellen, glatter Muskulatur sowie von Makrophagen dargestellt werden, wobei unter anderem die Produktion von Lipoperoxiden durch Lipoxygenasen von Endothelzellen und Makrophagen sowie eine Superoxidanionenproduktion durch glatte Muskulatur, Leukozyten und Endothelzellen eine Rolle spielen könnten (Witztum und Steinberg, 1991, Carr et al., 2000). Insbesondere wurde in atherosklerotischen Läsionen Myeloperoxidase nachgewiesen, welche von aktivierten Makrophagen abgegeben wird und die unter anderem über HOCl zu einer Oxidation von Lipoproteinen führen kann (Daugherty et al., 1994). Ebenso fanden sich durch HOCl modifizierte Lipoproteine in atherosklerotischen Läsionen (Hazell et al., 1996). Untersuchungen der Aktivität von Myeloperoxidase in Blut sowie darin enthaltenen Leukozyten ergaben, dass eine hohe Myeloperoxidaseaktivität in vivo mit einem erhöhten Risiko für eine koronararterielle Erkrankung assoziiert ist (Zhang et al., 2001). Myeloperoxidase setzt Wasserstoffperoxid aus der Dismutation von Superoxidanionen mit Cl¯ in Wasser und hypochlorige Säure (HOCl) um (Furtmüller et al., 2000). HOCl oxidiert LDL entweder direkt oder unter anderem über Umwandlung von Aminogruppen (RNH2) von Lysinresten des Apolipoproteins B in Chloramine (RNHCl), welche wiederum direkt LDL modifizieren oder reaktive - 25 Aldehyde (RCHO) bilden (Carr et al., Einleitung 2000). Des Weiteren kann eine Lipidperoxidation über Bildung von Tyrosylradikalen (Tyr-O·) aus freiem Tyrosin durch Myeloperoxidase erfolgen sowie über eine Umsetzung von Nitrit (NO2¯) in Stickstoffdioxid (NO2·), welche direkt LDL modifizieren (Mertens und Holvoet, 2001, Carr et al., 2000). Durch HOCl modifizierte LDL beeinflussen die Ausschüttung von Chemokinen durch Monozyten, aktivieren neutrophile Granulozyten und steigern ihre Adhärenz an Endothelzellen (Kopprasch et al., 1998, Woenckhaus, 1998). Myeloperoxidase kann also über eine Reihe von Mechanismen in vivo eine Rolle bei der Progression atherosklerotischer Läsionen durch Oxidation von Lipoproteinen spielen. Während im Lumen der Blutgefäße vorhandene oxidierte Lipoproteine durch Kupffer-Zellen der Leber entfernt werden (Van Berkel et al., 1991), reichern diese sich im subendothelialen Raum an, werden verstärkt unter anderem durch Myeloperoxidase anwesender Leukozyten oxidiert und schließlich phagozytiert (Williams und Tabas, 1995). Die in frühen Stadien der Atherosklerose erkennbaren Lipidplaques bestehen aus zunächst diffus, später herdförmig subendothelial angesammelten Makrophagen, die aufgrund zunehmend stärkerer intravakuolärer Lipidbeladung schaumig erscheinen und die durch proinflammatorische Zytokine die Proliferation von glatten Muskelzellen stimulieren (Riede und Schaefer, 2001). Im weiteren Verlauf kommt es zu fibrösen Veränderungen, die schließlich im Spätstadium rupturieren und dadurch zur Bildung von Thromben führen können (Ross, 1999). Die Rolle von Myeloperoxidase insbesondere in frühen Phasen der atherosklerotischen Veränderung von Gefäßen einerseits und die Beobachtung, dass eine Reihe von Zelllinien entweder eine Peroxidase an der Außenmembran besitzt oder diese abgibt, führt zu der Frage, ob potentiell auch Endothelzellen über Abgabe einer Peroxidase zur Modifikation von Lipoproteinen beitragen könnten. - 26 - Einleitung Schema 7: Oxidation von Lipoproteinen durch Myeloperoxidase. Superoxidanionen werden von (1a) glatter Muskulatur, (1b) Endothelzellen und (1c) in die subendotheliale Schicht eingewanderten Makrophagen gebildet und (2) dismutieren spontan zu Wasserstoffperoxid. (3) Dieses wird von Myeloperoxidase, welche von Makrophagen abgegeben wird, in HOCl umgesetzt. (4) HOCl kann direkt Low Density Lipoproteine (LDL) oxidieren sowie (5) Amine in Chloramine umsetzen, (6) welche wiederum direkt oder über Bildung von Aldehyden LDL oxidieren. (7) Myeloperoxidase oxidiert außerdem LDL durch Umsetzung von Nitrit in Stickstoffdioxidradikale. (8) Oxidierte LDL führen unter anderem zur Bildung von Adhäsionsmolekülen an der Endothelzelloberfläche. - 27 - Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Zelllinien und Zellkulturmedien Bei den verwendeten Endothelzellen handelt es sich um nichttransformierte, nicht immortalisierte menschliche Zelllinien. Diese wurden von Promocell, Heidelberg, bezogen: • Human Saphenous Vein Endothelial Cells (HSaVEC): Endothelzellen aus einer Vena saphena des Unterschenkels eines 48jährigen männlichen Spenders. • Human Coronary Artery Endothelial Cells (HCAEC): Endothelzellen aus Koronararterien eines 63jährigen männlichen Spenders. • Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (HPMEC): Endothelzellen aus kleinen Lungengefäßen (Venolen, Kapillaren und Arteriolen) einer 4jährigen weiblichen Spenderin. Für HSaVEC wurde Promocell Endothelial Cell Growth Medium (ECGM), für HCAEC und HPMEC wurde Promocell Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM-MV) verwendet. Konzentrationen enthaltener Substanzen zeigt die folgende Tabelle: ECGM ECGM-MV Fetales Kälberserum 2% 5% Epidermal Growth Factor 0,1 ng/ml 10 ng/ml Hydrocortison 1 µg/ml 1 µg/ml basic Fibroblast Growth Factor 1 ng/ml - Die verwendeten Fibroblasten sind ein Geschenk von Dr. C. Sers und Prof. R. Schäfer, Charité, Berlin, wurden Ratten entnommen und wachsen als Monolayer. • 208F-Fibroblasten (208F-Zellen): Nichttransformierte, immortalisierte Zelllinie mit ausgeprägter Kontaktinhibition. 208F-Zellen besitzen eine flache und rundliche Form mit kurzen Fortsätzen. - 28 • 208F src3-Fibroblasten (208F Material und Methoden src3-Zellen): Transformierte und immortalisierte Zelllinie ohne Kontaktinhibition, die aus der Parenterallinie 208F durch Transfektion mit einem Plasmid hervorgegangen ist. Sie besitzt das virale v-src-Onkogen und bildet Superoxidanionen an der Membranaußenseite (Herdener et al., 2000). 208F src3-Zellen besitzen eine spindelförmige Form mit längeren Fortsätzen und wachsen in einer charakteristischen criss-cross-Formation. Gelegentlich entstehende Revertanten lassen sich morphologisch deutlich von den transformierten Zellen unterscheiden (Beck et al., 1997). Für die Fibroblastenkulturen wurde Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) unter Zusatz von 40U/ml Penicillin, 50µg/ml Streptomycin, 10µg/ml Neomycin, 10U/ml Nystatin, 280µg/ml Glutamin sowie 5% fetalem Kälberserum als Quelle von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren verwendet. Das Serum wurde bei -20°C gelagert, in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut und vor Verwendung für 30 Minuten bei 56°C inkubiert. - 29 - Material und Methoden Abb. 1: HSaVEC Abb. 2: 208F Abb. 3: 208F src3 3.1.2 - 30 - Material und Methoden Induktoren, Inhibitoren und Enzyme Im Folgenden werden zu den verwendeten Reagentien jeweils Herkunft (HK), Konzentration, Lösungsmittel und Lagerungstemperatur der Stammlösung (SL) sowie die – falls nicht abweichend angegeben – verwendete Endkonzentration im Experiment (EK) angegeben. 4-Aminobenzoyl-Hydrazid HK: Acros Organics, USA SL: 1mM in EMEM, 5% FKS +0,1% DMSO bei -20°C EK: 150µM ABH ist ein spezifischer Hemmstoff von Peroxidasen der Myeloperoxidasefamilie. Es wird von diesen oxidiert, entstehende Radikale tragen zu der irreversiblen Inaktivierung bei (Kettle et al., 1997, Burner et al., 1999). Die Wirksamkeit von ABH ist also von Mechanismen der gehemmten Enzyme abhängig und kann diese dadurch sehr selektiv hemmen. Caspase 3- Inhibitor Z-DEVD HK: R&D Systems SL: 20mM in 30% DMSO, 70% Ethanol bei -20°C EK: 50µM Caspase 8- Inhibitor Z-IETD HK: R&D Systems SL: 20mM in 30% DMSO, 70% Ethanol bei -20°C EK: 25µM Caspase 9-Inhibitor Z-LEHD HK: R&D Systems SL: 20mM in 30% DMSO, 70% Ethanol bei -20°C EK: 25µM Euk-8 HK: Calbiochem, Darmstadt SL: 10mM in EMEM, 5% FKS bei -20°C EK: 75µM Euk-8 wird als Superoxiddismutase- und als Katalasemimetikum verwendet (van Empel et al., 2006). In der gewählten Konzentration besitzt es zusätzlich eine Peroxidaseaktivität Fertigstellung). (Daten der Arbeitsgruppe, Dissertation zurzeit in - 31 - Material und Methoden Galardin HK: Biomol Int. SL: 10mM in Ethanol bei -20°C EK: 10µM Galardin ist ein breit wirksamer Hemmstoff von Proteasen, der unter anderem die Matrixmetalloproteinasen 1, 2, 3, 9 und 14 hemmt (Yamamoto et al., 1998). L-N-φ-nitro-l-Arginin-Methylester-Hydrochlorid HK: Sigma, München SL: 60mM in EMEM, 5% FKS bei -20°C EK: 2,4mM L-NAME ist ein breit wirksamer Hemmstoff der NO-Synthetasen (Zou et al., 1998). Mannitol HK: Sigma, München SL: 1M in EMEM, 5% FKS bei -20°C EK: 10mM Mannitol ist ein Hydroxylradikalfänger (Shen et al., 1997), der Zellmembranen nicht passieren kann und somit nur extrazellulär wirksam ist (Elkinton, 1947, Page, 1962). Myeloperoxidase HK: Sigma, München SL: 5U/ml in EMEM, 5% FKS EK: bis 100mU/ml Myeloperoxidase katalysiert die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Chloridanionen zu HOCl und Wasser (Furtmüller et al., 2000). Taurin HK: Sigma, München SL: 500mM in EMEM, 5% FKS bei -20°C EK: 50mM Die Aminosäure Taurin (2-Aminoethansulfonsäure) fängt HOCl durch Reaktion zu Taurinchloramin ab (Wright et al., 1986). Taurinchloramin ist wenig reaktiv, jedoch wurde eine Hemmung der Induktion von NO-Synthese durch die induzierbare NOSynthetase beschrieben (Park et al., 1993, Marcinkiewicz et al., 1995). Tetrahydrobiopterin HK: Sigma, München SL: 1mM in EMEM, 5% FKS bei -20°C EK: 50µM BH4 ist ein Kofaktor der endothelialen, der neuronalen und der induzierbaren NOSynthetase, der in der Zelle über mehrere Schritte aus GTP synthetisiert wird, wobei die geschwindigkeitsbestimmende Reaktion von GTP-Cyclohydrolase abhängig ist (Moens und Kass, 2006). - 32 - Material und Methoden Transforming Growth Factor β1 HK: humane Thrombozyten SL: 1,5ng/µl in EMEM, 5% FKS bei -20°C EK: 20ng/ml Das verwendete TGF-β1 wurde von Prof. Bauer aus humanen Thrombozyten isoliert, die von C.-H. Heldin, Uppsala, zur Verfügung gestellt worden waren. TGF-β ist ein multifunktionales Zytokin, das über verschiedene Wirkmechanismen unter anderem an der Steuerung des Zellzyklus, der Zelldifferenzierung und dem Zelltod beteiligt ist (Barcellos-Hoff und Dix, 1996). 3.1.3 siRNA Sämtliche verwendete siRNA wurde von Qiagen bezogen und in einer Ausgangskonzentration von 20µM gelöst. Nach Inkubation für eine Minute bei 90°C und anschließend einer Stunde bei 37°C wurde die siRNA bei -20°C gelagert. Für die Transfektion wurde eine Konzentration von 10nM verwendet. Im Einzelnen wurden folgende siRNA mit dem jeweils angegebenen Angriffsort verwendet: siRNA nox 1.1 NADPH-Oxidase Isoform 1 siRNA duox 1.1 Dual Oxidase Isoform 1 siRNA tgf-β1 Transforming Growth Factor β1 siRNA tgfR2 Rezeptor für Transforming Growth Factor β siRNA eNOS 4 Endotheliale NO-Synthetase siRNA eNOS 5 Endotheliale NO-Synthetase siRNA eNOS 6 Endotheliale NO-Synthetase siRNA nNOS 2 Neuronale NO-Synthetase siRNA iNOS 2.1 Induzierbare NO-Synthetase siRNA POR 4 Cytochrom P450-Oxidoreduktase siRNA Kontrolle Keine Homologie zu bekannten Genen - 33 - Material und Methoden 3.1.4 Sonstige Materialien und Geräte Mikroskope: Die Auswertung wurde an einem invertierten Phasenkontrastmikroskop Leitz Labovert FS mit Leica Kleinbildfilmkamera (Kodak 200 ASA) vorgenommen. Für einen Teil der Abbildungen wurde das Fluoreszenzmikroskop Leica DM-IRB mit angeschlossener Digitalkamera AxioCam MR3 verwendet. Zählkammern: Es wurden Fuchs-Rosenthal-Zählkammern verwendet, zur Zellzahlbestimmung wurden 8 Felder à 0,0125 µl ausgezählt. Durch Multiplikation mit 10000 ergab sich die Zellzahl pro Milliliter. Zellkulturflaschen: 75cm2 bzw. 162cm2, Costar (Cambridge, USA) Zellkulturplatten: 6-Loch-Platten mit 2,4ml/Ansatz, 12-Loch-Platten mit 1ml/Ansatz, 24-Loch-Platten mit 0,5ml/Ansatz, 96-Loch-Platten mit 0,1ml/Ansatz Zentrifugationsröhrchen: 50ml (Falcon/Beckton Dickinson, USA) Zentrifugen: Heraeus Megafuge 1.0R, Heraeus Biofuge 15 3.2 Methoden 3.2.1 Zellkultur Alle Zellkulturen wurden als Monolayer in Zellkulturflaschen einer Fläche von 75cm2 mit 20ml Medium oder 162cm2 mit 40ml Medium unter täglicher morphologischer Kontrolle bei 37°C, 5% CO2 und Wasserdampfsättigung bei leicht geöffnetem Verschluss kultiviert. Bei Erreichen einer Abdeckung der Kulturflasche von typischerweise ca. 80% durch den Zellrasen wurden die Zellen mit Hilfe der Protease Trypsin (Mischung aus Trypsin und Versen im Verhältnis 1:4, Konzentration 500µg/ml) abgelöst und in geringerer Dichte neu eingesät. Hierfür wurde in einem ersten Schritt das Medium aus der Zellkultur abgenommen und verworfen. Anschließend wurde die Kulturflasche je nach Größe mit 5ml bzw. 10ml Trypsin kurz gespült. In einem zweiten Schritt erfolgte eine Zugabe von 3ml bzw. 6ml Trypsin. Nachdem mikroskopisch erkennbar war, dass sich die Zellen vom Boden der Zellkulturflasche gelöst hatten und die interzellulären Verbindungen gelockert waren, wurden die nun suspendierten Zellen durch mehrfache Aufnahme in - 34 - Material und Methoden eine Glaspipette und Wiederabgabe in die Zellkulturflasche vereinzelt. Von den nun in Trypsin vereinzelt vorliegenden Zellen wurden im Falle der Fibroblasten ca. 10% in der Zellkulturflasche belassen und mit frischem Medium kultiviert. Im Falle der Endothelzellen wurden die in Trypsin suspendierten Zellen in 10ml Medium für 7 Minuten bei 1800 Umdrehungen/Minute und 27°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und zu dem nun sämtliche Endothelzellen der ursprünglichen Zellkulturflasche enthaltenden Pellet wurde frisches Medium gegeben. Nach Durchmischung mit Hilfe einer Glaspipette wurden die Zellen zusammen mit einer entsprechenden Menge Medium auf neue Zellkulturflaschen verteilt. 3.2.2 Längerfristige Aufbewahrung von Zellen Die Zellen wurden für eine längerfristige Aufbewahrung in einem speziellen, in der Phase des Einfrierens und Auftauens schützenden Medium mit 20% fötalem Kälberserum, 7,5% Dimethylsulfoxid in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Nach Entnahme aus dem Stickstofftank wurden die Zellen zügig in 10ml Medium aufgenommen und sofort zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgenommen, das in dem Zentrifugationsröhrchen befindliche Zellpellet wurde vorsichtig in frischem Medium resuspendiert und schließlich in Zellkulturflaschen überführt. Vor Verwendung in Experimenten wurden die Zellen für mindestens 1-2 Wochen gegebenenfalls unter regelmäßigem Wechsel des Mediums kultiviert. 3.2.3 RNA-Interferenz mit Hilfe von siRNA-Transfektion Die RNA-Interferenz beruht auf einer natürlichen Funktion, die dem Schutz von Zellen gegen fremde Nukleinsäuren dient und die mit Hilfe von siRNA-Transfektion experimentell genutzt werden kann. Eine zugegebene doppelsträngige RNA mit einer Länge von ca. 25 Basenpaaren, die an den 3’-Enden eine Einzelstrang-Sequenz von 2-3 Basenpaaren besitzt, bindet an den RNA-induced silencing complex (RISC). Der entstehende siRNA/RISC-Komplex wird aktiviert, die nun als Einzelstrang vorliegende siRNA bindet an die Ziel-mRNA und diese wird mit Hilfe einer Nukleaseaktivität zerstört (Agrawal et al., 2003). Es kann also durch Zugabe einer siRNA, die eine Sequenz beinhaltet, die komplementär zu einem Abschnitt der - 35 - Material und Methoden Sequenz eines kodierenden Gens ist, die Bildung des entsprechenden Genprodukts verhindert werden. Um diese Transfektion durchzuführen, wurden in einem ersten Schritt je nach benötigter Zellzahl Ansätze mit je 80000 bis 250000 Zellen der zu transfizierenden Zelllinie in 6-Loch-Platten mit 2,3ml Medium erstellt und inkubiert. Nachdem die Zellen mikroskopisch eindeutig erkennbar angewachsen waren, wurden die für die Transfektion notwendigen Komponenten hinzugefügt. Je Ansatz wurden 88µl EMEM ohne Serum, 12µl Hiperfect Transfektionsreagenz, das neutrale und kationische Lipide enthält, sowie 1,2µl einer 20µM siRNA-Lösung in ein Eppendorf-Gefäß gegeben und anschließend in einem Vortexer für einige Sekunden durchmischt. Nach einer Wartezeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die nun an die kationischen und neutralen Lipide angelagerte, selbst anionisch geladene, siRNA vorsichtig und langsam zu den Ansätzen mit 2,3 ml Medium gegeben, so dass die siRNA nun im Ansatz in einer Konzentration von 10nM vorlag und die Zellmembranen der zu transfizierenden Zellen durchdringen konnte. Die Kulturplatten wurden vorsichtig geschwenkt und schließlich für 24 Stunden inkubiert. Um die transfizierten Zellen in einem zweiten Schritt für ein Experiment zu nutzen, wurden sie mit Hilfe von Trypsin aus den 6-Loch-Platten gelöst. Hierfür wurde das Medium abgenommen. Die Ansätze wurden nun zuerst mit 3ml Trypsin gespült, anschließend wurde 1ml Trypsin zugegeben. Nachdem mikroskopisch eine Ablösung der Zellen feststellbar war, wurde das Trypsin samt Zellen abgenommen und mit 10ml Medium in ein Zentrifugationsröhrchen gegeben. Durch erneute Spülung der Ansätze mit 1ml Medium und Zugabe des Mediums in das Zentrifugationsröhrchen wurde sichergestellt, dass keine Zellen mehr in den 6-Loch-Platten verblieben waren. Nach Zentrifugation, Verwerfen des Überstands und erneuter Zugabe von frischem Medium waren die Zellen nun als jeweils spezifisch transfizierte Zelllinien für Experimente verwendbar. Da die siRNA nicht in das Genom der Zellen eingefügt wird, ist eine Transfektion nur über 3-4 Zellteilungen wirksam und musste deshalb für jedes Experiment erneut durchgeführt werden. - 36 - Material und Methoden Schema 8: Stark vereinfachte Darstellung der Transfektion von Zellen mit Hilfe von siRNA. (1) Anionische siRNA lagert sich an kationische und neutrale Lipide der HiPerfect Transfektionsreagenz an und kann dadurch Zellmembranen passieren. (2) Innerhalb der zu transfizierenden Zelle wird die siRNA freigegeben und wird zum Bestandteil eines sich bildenden RNA-induced silencing complex (RISC). (3) Zelluläre mRNA wird über die in aktiviertem RISC als Einzelstrang vorliegende siRNA erkannt und durch eine beteiligte Nuklease gespalten. 3.2.4 Tropfenexperiment Experimente, bei denen ein kleiner Bereich mit Zielzellen einer hohen Zelldichte von einem gleichmäßigen Zellrasen an Effektorzellen niedriger Zelldichte umgeben ist, werden nachfolgend als Tropfenexperimente bezeichnet. Als Zielzellen wurden in den gezeigten Experimenten transformierte Fibroblasten (208F src3-Zellen) sowie nichttransformierte Fibroblasten (208F-Zellen) verwendet. Teilweise wurden diese in einem vorgelagerten Arbeitsschritt mit Hilfe von siRNA transfiziert. Als Effektorzellen wurden 208F-Zellen sowie humane nichttransformierte nichtimmortalisierte Endothelzellen aus einer Vena Saphena (HSaVEC), aus Koronararterien (HCAEC) und aus kleinen Lungengefäßen (HPMEC) verwendet. Auch die Effektorzellen wurden für einen Teil der Experimente im Vorfeld mit Hilfe von siRNA transfiziert. - 37 - Material und Methoden In einem ersten Arbeitsschritt wurden die Zellen der Zielzelllinie mit Hilfe von Trypsin vom Boden der entsprechenden Kulturflasche bzw. der Transfektionsansätze abgelöst. Nach Zugabe zu 10ml Medium in einem Zentrifugationsröhrchen wurden die Zellen bei 1800 Umdrehungen pro Minute und 27°C für 7 Minuten zentrifugiert. Nach Dekantieren und Verwerfen des Überstands wurden 1-3 ml Medium zu dem im Zentrifugationsröhrchen verbliebenen Zellpellet gegeben. Mit Hilfe einer Zählkammer wurde die Zellzahl pro Milliliter bestimmt und anschließend die für die Tropfen benötigte Zellzahl von 400000 Zellen pro Milliliter herbeigeführt. 4µl dieser Zellsuspension, also 1600 Zellen, wurden in vorab markierte dezentral gelegene Bereiche der Vertiefungen von 12-Loch-Kulturplatten gegeben. Durch die dezentrale Anordnung des Tropfens sollte eine Beeinflussung des Messergebnisses durch Zellansammlungen frei schwimmender Zellen an der zentral gelegenen tiefsten Stelle des Ansatzes verhindert werden. Nach Zugabe der Tropfen wurden die Platten sofort bei 37°C, 5% CO2 und Wasserdampfsättigung inkubiert, um eine Schädigung der Zellen durch Austrocknung der Tropfen zu verhindern. Effektorzellen wurden nun durch Ablösung mit Hilfe von Trypsin, anschließende Zentrifugation und Bestimmung der Zellzahl vorbereitet. Nachdem mikroskopisch erkennbar war, dass die Zielzellen in der Kulturplatte angewachsen waren (Abb. 4), wurden sie mit 1ml Medium beziehungsweise einer festgelegten Anzahl an Effektorzellen in 1ml Medium überschichtet. In einem letzten Schritt wurden zusätzliche Inhibitoren zugegeben, die Anzahl apoptotischer Zielzellen bei Versuchsbeginn wurde bestimmt und die Effektorzellen wurden auf Vitalität überprüft. - 38 - Material und Methoden Abb. 4: 1600 transformierte Fibroblasten nach Anwachsen in der Zellkulturplatte 3.2.5 Peroxidasenachweis Bei dem verwendeten Peroxidasenachweis handelt es sich um ein Versuchsprotokoll, mit dessen Hilfe Peroxidase im Kulturmedium von Zellen nachgewiesen werden kann (Ophoven, in Vorbereitung). Er beruht auf einer Kultivierung von transformierten Fibroblasten in Anwesenheit einer konstanten Konzentration Euk-8 und einer variablen Menge an Zentrifugationsüberstand des Mediums einer zu testenden Zellkultur. Euk-8 ist ein synthetisches Molekül, das als Katalase- und Superoxiddismutasemimetikum verwendet wird (van Empel et al., 2006), jedoch in der gewählten Konzentration auch Peroxidaseaktivität besitzt. Es kann Wasserstoffperoxid in HOCl umsetzen und führt aufgrund einer gleichzeitig hohen Affinität zu Superoxidanionen zu einer anschließenden direkten Umsetzung von HOCl und Superoxidanionen in Hydroxylradikale (Ophoven, in Vorbereitung), so dass es zu einer sehr effektiven Apoptoseinduktion kommt. Konkurriert nun ein Enzym mit einer vergleichweise geringeren apoptoseinduzierenden Wirkung mit Euk8 um ein Substrat, so kommt es zu einer Verminderung des Anteils apoptotischer - 39 - Material und Methoden transformierter Fibroblasten. Dies ist beispielsweise bei Myeloperoxidase der Fall, die ebenso wie Euk-8 Wasserstoffperoxid als Substrat für die Bildung von HOCl nutzt (Furtmüller et al., 2000) und eine gewisse Affinität zu Superoxidanionen besitzt (Kettle et al., 2007), jedoch die direkte Umsetzung von HOCl und Superoxidanionen in Hydroxylradikale in geringerem Umfang erleichtert (Ophoven, in Vorbereitung). Kommt es nun zu einer Verminderung des Anteils apoptotischer transformierter Fibroblasten, so weist dies auf eine Kompetition hin, erlaubt jedoch keine Aussage über die Art des kompetitierenden Enzyms. Lässt sich aber der Effekt durch Einsatz eines spezifischen Inhibitors hemmen, so ist gezeigt, dass tatsächlich entsprechendes Enzym vorhanden war und zu der Verminderung des Anteils apoptotischer Zellen geführt hat. Geeignet ist beispielsweise der sehr spezifische Inhibitor ABH, der durch Peroxidasen oxidiert wird und diese unter Beteiligung dabei entstehender Radikale irreversibel hemmt (Kettle et al., 1997, Burner et al., 1999), jedoch keine Wirkung auf Euk-8 hat (Ophoven, in Vorbereitung). In diesem experimentellen Ansatz führt also die Zugabe einer bestimmten Menge an Überstand des Kulturmediums einer definierten Anzahl an Zellen im Falle einer Peroxidaseabgabe durch die getesteten Zellen über eine Kompetition der im Überstand vorhandenen wenig effektiv apoptoseinduzierenden Peroxidase mit dem sehr effektiv apoptoseinduzierenden Euk-8 um Wasserstoffperoxid zu einer Verringerung des Anteils apoptotischer Zellen, die durch den sehr spezifischen Peroxidaseinhibitor ABH aufgehoben werden kann. Um eine Beeinflussung der Messergebnisse durch im Überstand vorhandenes zugegebenes oder durch die untersuchten Zellen produziertes TGF-β1 auszuschließen, wurden alle Ansätze zum Peroxidasenachweis durchgeführt. grundsätzlich in Anwesenheit von 20ng/ml TGF-β1 - 40 - Material und Methoden Schema 9: Möglicher Mechanismus des Peroxidasenachweises mit Hilfe von Euk-8 (Ophoven, in Vorbereitung). Im Fall (a) geben die zu testenden Zellen keine Peroxidase ab, im Fall (b) wird Peroxidase abgegeben. (a1, b1) Die NADPH-Oxidase transformierter Zellen produziert Superoxidanionen. (a2, b2) Diese werden durch Euk-8, welches als SOD-Mimetikum wirken kann, in Wasserstoffperoxid umgesetzt. Wasserstoffperoxid wird durch Euk-8, das in der gewählten Konzentration ebenfalls eine Peroxidaseaktivität besitzt, in HOCl umgesetzt. (a3) Das entstandene HOCl kann direkt mit gleichzeitig an Euk-8 gebundenen Superoxidanionen reagieren und wird so bei einer hohen Aktivität von Euk-8 sehr effizient in Hydroxylradikale umgesetzt, welche Lipidperoxidation bewirken können. (b4) Im Falle der Anwesenheit einer Peroxidase (hemmbar durch ABH) im zu untersuchenden Medium konkurriert diese mit Euk-8 um Wasserstoffperoxid. Zwar setzt die Peroxidase dieses ebenfalls in HOCl um, jedoch ist die Wahrscheinlichkeit einer Reaktion von HOCl mit Superoxidanionen geringer als im Falle von Euk-8, weil eine geringere Affinität des Enzyms zu Superoxidanionen besteht. (b3) Aufgrund von Substratmangel kommt es zu einer deutlich verringerten Aktivität von Euk-8 und somit zu einer geringeren Bildung von Hydroxylradikalen. (b4) Diese kann nicht durch eine Bildung von Hydroxylradikalen aus HOCl der Peroxidase und Superoxidanionen ausgeglichen werden. Somit kommt es (a) im Falle einer fehlenden Peroxidasebildung der zu testenden Zellen zu einer (A) sehr ausgeprägten Apoptoseinduktion, während (b) im Falle einer Peroxidaseabgabe durch die getesteten Zellen eine (B) vergleichsweise geringere Apoptoseinduktion beobachtet wird. - 41 - Material und Methoden In einem Vorexperiment wurde die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen an Euk-8 auf transformierte Fibroblasten untersucht. Hierzu wurden 12000 transformierte Fibroblasten je Ansatz in 96-Loch-Platten in Anwesenheit von 20ng/ml TGF-β1 und unterschiedlichen Konzentrationen an Euk-8 kultiviert. Abb. 5 zeigt, dass es mit zunehmender Konzentration an Euk-8 zu einem Anstieg des Anteils apoptotischer transformierter Fibroblasten kommt. Insbesondere bei Ansätzen mit 38µM Euk-8 oder höheren Konzentrationen steigt der Anteil apoptotischer Zellen stark an. Dies zeigt, dass eine Konzentration von 75µM Euk-8 geeignet ist, um eine Hemmung der Apoptoseinduktion durch Kompetition mit im Überstand vorhandener Peroxidase zu messen. Der experimentelle Aufbau wurde anhand von Myeloperoxidase überprüft. Hierzu wurden transformierte Fibroblasten in Anwesenheit von 75µEuk-8 und 20ng/ml TGFβ1 unterschiedlichen Konzentrationen an Myeloperoxidase ausgesetzt. Als Kontrolle wurden Ansätze mit dem Inhibitor ABH erstellt. Abb. 6 zeigt, dass die Zugabe von Myeloperoxidase zur Verringerung des Anteils apopotischer transformierter Fibroblasten führt. Dabei führen bereits geringe Konzentrationen an Myeloperoxidase zu einem deutlichen Effekt, ab ca. 50mU/ml führt zusätzliche Myeloperoxidase nur noch zu einer transformierter geringen Fibroblasten. zusätzlichen Im Senkung Gegensatz dazu des Anteils führt die apoptotischer Zugabe von Myeloperoxidase in Anwesenheit von ABH nur zu einem geringen Absinken des Prozentsatzes apoptotischer transformierter Fibroblasten, welche am ehesten auf eine unvollständige Hemmung durch ABH zurückzuführen ist. Die Differenz zwischen den Ansätzen unter Zugabe von Myeloperoxidase und denen unter zusätzlicher Zugabe von ABH ist ein durch die Peroxidase hervorgerufener durch ABH hemmbarer Effekt, nachfolgend auch als Peroxidaseeffekt bezeichnet. - 42 - 80 Abb. 5: Einfluss von Euk-8 auf transformierte Fibroblasten. In 96-LochPlatten wurden 12000 208F src3 in 100µl Medium zusammen mit 20ng/ml TGF-β1 gegeben. Nach Zugabe der angegebenen Konzentrationen Euk-8 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Experiment wurde in Doppelbestimmung durchgeführt und nach 16 Stunden am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6.1). mit TGF-Zugabe apoptotische Zellen 208F src3 (%) Material und Methoden 60 40 20 0 1 10 100 Konzentration Euk-8 (μM) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 40 MPO +ABH 30 MPO 20 Abb. 6: Kompetition von Euk-8 und Meloperoxidase. 12000 transformierte Fibroblasten wurden in 96-Loch-Platten unter Anwesenheit von 75µM Euk-8, 20ng/ml TGFβ1 sowie der angegebenen Konzentration Myeloperoxidase eingesät. Diese Ansätze sowie solche mit zusätzlich 150µM ABH wurden inkubiert. Das Experiment wurde in Doppelbestimmung durchgeführt und nach 9 Stunden am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6.1). 10 0 0 25 50 75 100 MPO (mU/ml) 3.2.6 Messung und Statistik 3.2.6.1 Ermittlung des Anteils apoptotischer Zellen Die Experimente wurden zu den angegebenen Zeitpunkten an einem Phasenkontrastmikroskop ausgewertet durch Ermittlung des Anteils apoptotischer Zellen. Als Kriterien für apoptotische Zellen wurden hierbei Membranblebbing, Kernkondensation und Kernfragmentation herangezogen. Dabei wurden die Zellen bereits bei Erfüllung eines der drei Kriterien als apoptotische Zellen gewertet. Sämtliche Experimente wurden in Doppelbestimmung durchgeführt, pro Ansatz wurden mindestens 200 Zellen ausgewertet, wobei auf einer Zähluhr alle gezählten Zellen registriert wurden, auf einer anderen nur die apoptotischen Zellen. Die - 43 - Material und Methoden angegebenen Prozentwerte entsprechen dem Mittelwert der beiden Bestimmungen. Zusätzlich ist die sich aus diesen beiden Bestimmungen ergebende Standardabweichung angegeben. Diese kann jedoch in dieser experimentellen Anordnung keine Aussage über statistische Signifikanz machen, da die Zahl der Messungen in voneinander getrennten Experimenten hierfür zu gering ist. Sie ist lediglich ein Maß dafür, wie groß die Abweichung zwischen den Auswertungen zweier identischer Ansätze war. Zentrale Experimente wurden mehrfach durchgeführt. Unterschiede in der Apoptosekinetik im Vergleich identischer, aber getrennter Versuche können sich ergeben durch unterschiedliche Passagezahl der verwendeten Zellen, Schwankungen in der Zelldichte oder Zellverteilung sowie durch die Entnahme des experimentellen Ansatzes aus dem Brutschrank für die Zeit der Auswertung. (1) (2) (3) (4) Abb. 7: Kriterien bei der Ermittlung des Anteils apoptotischer Zellen am Beispiel transformierter Fibroblasten (208F src3). (1) gesunde Zelle, (2) Kernkondensation, (3) Kernfragmentation, (4) Membran-Blebbing 3.2.6.2 Flächenberechnung Für die Erstellung von Schaubildern sowie für Flächenberechnungen wurde GraphPad Prism 5.01 verwendet. Die Fläche zwischen zwei Kurven wurde ermittelt durch Anwendung der Funktion Area Under Curce (AUC) auf beide Datensätze und anschließende Bildung der Differenz. 3.2.6.3 Berechnung von Peroxidaseaktivität Für die Berechnung der Peroxidaseaktivität eines Zentrifugationsüberstands des Mediums von Endothelzellen wurde mit Hilfe von GraphPad Prism 5.01 unter - 44 - Material und Methoden Voraussetzung eines linearen Verlaufs zwischen ermittelten Messwerten die Menge an zugegebenem Überstand (VolumenÜberstand) ermittelt, die in demselben Experiment in Ansätzen mit zugegebenem Überstand (Ansatz 2) einen gleich großen Peroxidaseeffekt, also eine gleich starke Verminderung des Anteils apoptotischer Zellen, hervorruft wie eine vorgegebene Myeloperoxidaseaktivität (Ansatz 1). Dann ist: Aus der Peroxidaseaktivität des Ansatzes 2, der ein Gesamtvolumen von 100µl hat, kann auf die Peroxidaseaktivität des zugegebenen Überstands rückgeschlossen werden: Somit ergibt sich: Angegebene Werte entsprechen dem Mittelwert sowie der Standardabweichung der für verschiedene Myeloperoxidaseaktivitäten erhobenen Vergleichswerte. - 45 - Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Vorbemerkungen Bei den beschriebenen Experimenten handelt es sich in der Mehrzahl um sogenannte „Tropfenexperimente“, bei denen ein kleiner Bereich (Tropfen) mit Zielzellen einer hohen Zelldichte, jedoch einer insgesamt geringen Gesamtzellzahl, von einem gleichmäßigen Zellrasen mit Effektorzellen einer niedrigen Zelldichte, jedoch einer hohen Gesamtzellzahl, umgeben ist. Als Effektorfunktion wird im Zusammenhang der interzellulären Apoptoseinduktion die Fähigkeit bezeichnet, über reaktive Sauerstoff- und Stickstoffmoleküle in anderen Zellen Apoptose zu induzieren, als Zielzellfunktion die Fähigkeit, auf Anwesenheit von Zellen mit Effektorfunktion durch apoptotischen Zerfall zu reagieren. Die Effektorfunktion wird durch Abgabe von Peroxidase und/oder Stickstoffmonoxid vermittelt und ist daher von der Gesamtzellzahl abhängig. Diese ist bei den im Zellrasen befindlichen Zellen besonders groß. Die Zielzellfunktion Superoxidanionenproduktion konzentrationsabhängiger dagegen und hängt von anschließender Dismutation dieser extrazellulärer spontaner Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid ab und ist daher von der Zelldichte abhängig. Diese ist bei den im „Tropfen“ befindlichen Zellen besonders groß. Gemessen wurde die Wirkung von Effektorzellen auf Zielzellen durch Bestimmung einer Beeinflussung des Prozentsatzes apoptotischer Zielzellen durch Anwesenheit von Effektorzellen. Als Zielzellen wurden in den gezeigten Experimenten transformierte Fibroblasten (208F src3-Zellen) sowie als negative Kontrolle nichttransformierte Fibroblasten (208F-Zellen) verwendet. Als Effektorzellen wurden 208F-Zellen sowie humane nichttransformierte nichtimmortalisierte Endothelzellen aus einer Vena Saphena (HSaVEC), aus Koronararterien (HCAEC) und aus kleinen Lungengefäßen (HPMEC) verwendet. Nichttransformierte Fibroblasten üben eine Effektorfunktion aus, indem sie NO und Peroxidase abgeben. Transformierte Fibroblasten zeigen zusätzlich eine Zielzellfunktion, indem sie Superoxidanionen abgeben. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Zellen mit Effektorfunktion und solchen mit Zielzellfunktion kommt es zu interzellulärer Apoptoseinduktion über den NO- und den HOCl-Weg (Herdener et al., 2000). Ziel der experimentellen Arbeit war es, zu klären, ob eine Steigerung des Anteils apoptotischer transformierter Zellen in Anwesenheit von Endothelzellen - 46 - Ergebnisse (Endothelzelleffekt) auftritt und wodurch diese bedingt ist. Es sollte geklärt werden, von welchen Faktoren der transformierten Zellen sowie der Endothelzellen dieser Endothelzelleffekt abhängt und welche Signalwege ablaufen. Dabei wurde mit Hilfe spezifischer Inhibition und der Herabregulation von Molekülen mit Hilfe von siRNA insbesondere untersucht, ob die Endothelzellen eine mit der Effektorfunktion von Fibroblasten vergleichbare Funktion haben, also NO und Peroxidase abgeben. Die Experimente wurden aufgrund besserer Proliferation in Zellkultur zunächst mit HSaVEC durchgeführt. Anschließend wurde überprüft, ob die Ergebnisse auf HCAEC und HPMEC übertragbar sind. 4.2 Vorversuche 4.2.1 HSaVEC und 208F-Zellen als Effektorzellen im Vergleich In einem ersten Experiment wurde überprüft, ob die gemeinsame Kultivierung von Endothelzellen und transformierten Fibroblasten zu einem erhöhten Anteil apoptotischer transformierter Fibroblasten führte, diese also in Apoptose trieb. Als Positivkontrolle wurde die Wirkung von nichttransformierten Fibroblasten (208FZellen) auf transformierte Fibroblasten (208F src3-Zellen) gemessen. Von 208FZellen ist eine durch TGF-β1 verstärkte, selektiv auf transformierte Zellen bestehende Wirkung bekannt (Beck et al., 1997). Für das erste Experiment wurden transformierte Fibroblasten in einem Tropfen, also einem kleinen Bereich mit wenigen Zellen hoher Zelldichte, von einem großen Zellrasen mit vielen nichttransformierten Fibroblasten bzw. Endothelzellen niedriger Zelldichte umgeben. 1600 transformierte Fibroblasten in 4µl Medium wurden in 12-Loch-Platten gegeben und nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. mit 10000 HSaVEC oder 10000 208FFibroblasten in 1ml Medium überschichtet. Die transformierten Fibroblasten, also die Zielzellen, bildeten einen Fokus hoher Zelldichte, die Effektorzellen bildeten einen dünnen gleichmäßigen Zellrasen. Die Ansätze wurden inkubiert, die Apoptosekinetik wurde zu den angegebenen Zeitpunkten durch Auszählung des Anteils apoptotischer transformierter Fibroblasten am Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Abb. 8 zeigt das Ergebnis des ersten Experiments im zeitlichen Verlauf. Auch in Abwesenheit von Effektorzellen kam es zu einem Anstieg des Prozentsatzes apoptotischer transformierter Fibroblasten. Die Anwesenheit von nichttransformierten Fibroblasten führte jedoch zu einer im zeitlichen Verlauf zunehmenden zusätzlichen - 47 - Ergebnisse Apoptoseinduktion. Dieser Effekt war bei den Endothelzellen noch stärker ausgeprägt und führte im Maximum zu einer Verdopplung der Anzahl apoptotischer apoptotische Zellen 208F src3 (%) Zellen im Vergleich zur Kontrolle ohne Effektorzellen. Abb. 8: HSaVEC und 208F-Zellen als Effektorzellen im Vergleich. In 12-LochPlatten wurden 1600 208F src3-Zellen als 4µlTropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 10000 HSaVEC oder 10000 208F-Zellen in 1ml Medium überschichtet und inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). src(HSaVEC) 30 20 src(208F) src 10 0 0 20 40 60 Zeit (h) 4.2.2 Effektorzellzahl Da sich ein Effekt der Endothelzellen auf transformierte Fibroblasten gezeigt hatte, wurde nun in einem nächsten Experiment untersucht, wie dieser von der Endothelzellzahl abhing. Tropfen transformierter Fibroblasten wurden nach Anwachsen mit einer unterschiedlichen Anzahl an Endothelzellen überschichtet. Nach Inkubation wurde der Prozentsatz apoptotischer Zellen im Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Abb. 9 zeigt, dass dieser bei Ansätzen ohne TGF-β1-Zugabe mit zunehmender Effektorzellzahl anstieg und ca. ab 15000 Zellen ein Plateau erreichte. Dieses Plateau war bei Ansätzen mit TGF-β1 bereits bei der geringsten verwendeten Zellzahl, also bei 7500 Zellen, erreicht. Die Zahl an Effektorzellen, die für das Erreichen des Plateaus nötig war, war unabhängig vom Zeitpunkt der Auswertung, jedoch wurden zu späteren Zeitpunkten bzw. bei TGF-β1Zugabe insgesamt höhere Werte erreicht. - 48 - Ergebnisse apoptotische Zellen 208F src3 (%) ohne TGF-Zugabe mit TGF-Zugabe 60 40 69h 20 0 69h 60 40 45h 20 45h 27h 20h 1h 0 10000 20000 30000 0 27h 20h 1h 0 HSaVEC 10000 20000 30000 HSaVEC Abb. 9: Abhängigkeit des Effekts von HSaVEC auf 208F src3-Zellen von der Effektorzellzahl. In 12-Loch-Platten wurden 1600 208F src3-Zellen als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 7500, 15000 oder 30000 HSaVEC in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). 4.3 Einfluss von transformiertem Status der Zielzelle und TGF-β1Zugabe Da sich Hinweise auf eine interzelluläre Apoptoseinduktion ähnlich derer von nichttransformierten Fibroblasten auf transformierte Fibroblasten ergeben hatten, wurden nun Merkmale dieser beschriebenen, selektiv auf transformierte Zellen wirksamen, durch TGF-β1 verstärkten Effektorfunktion (Beck et al., 1997) vergleichend für die drei Endothelzelllinien untersucht: - Wirkung auf transformierte Zellen - Wirkung auf nichttransformierte Zellen - Einfluss von TGF-β1 Hierfür wurden Tropfen transformierter bzw. nichttransformierter Zellen in getrennten Experimenten mit 15000 HSaVEC, HCAEC bzw. HPMEC überschichtet, da sich diese Zellzahl im vorhergehenden Versuch als ausreichend für einen suffizienten Endothelzelleffekt auch ohne TGF-β1-Zugabe herausgestellt hatte. Die Ansätze wurden einmal mit und einmal ohne Zugabe von TGF-β1 erstellt und nach Inkubation zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet. - 49 - Ergebnisse Abb. 10 stellt die Ergebnisse der Experimente dar. - Es zeigte sich eine im zeitlichen Verlauf zunehmende Steigerung des Prozentsatzes apoptotischer transformierter Fibroblasten in Ansätzen mit Endothelzellen gegenüber Ansätzen ohne Endothelzellen, also ein Endothelzelleffekt auf transformierte Fibroblasten. - Im Gegensatz hierzu war keinerlei Wirkung der Endothelzellen auf nichttransformierte Fibroblasten erkennbar. - Die Zugabe von TGF-β bewirkte eine Steigerung der Rate apoptotischer transformierter Zellen auch ohne Zugabe von Effektorzellen. Diese autokrine, TGF-β1-getriggerte apoptotische Selbstzerstörung (Portess et al., 2007) trat im Experiment erwartungsgemäß bei 208F src3-Zellen, jedoch nicht bei 208FZellen auf. Bei Zugabe von Endothelzellen zeigte sich unter Einfluss von TGF-β1 ein etwas stärkerer Endothelzelleffekt als ohne TGF-β1. Das Verhältnis des Endothelzelleffekts ohne TGF-β1 und mit TGF-β1, also das Verhältnis der jeweiligen Flächen zwischen den entsprechenden Kurven, betrug 1,45 für HSaVEC, 1,75 für HCAEC und 1,24 für HPMEC. Zwar konnte aufgrund der Zahl der Messwerte hierfür keine Signifikanz berechnet werden, jedoch deutete dies darauf hin, dass TGF-β1-Zugabe einen steigernden Einfluss auf die Wirkung von Endothelzellen auf transformierte Zellen hatte (zur Berechnung siehe 3.2.6.2). Im Gegensatz dazu war keinerlei Wirkung von TGF-β1 auf nichttransformierte Fibroblasten erkennbar. Abb. 11 zeigt transformierte Fibroblasten unter Zugabe von TGF-β1 nach 22 Stunden Inkubation, aus Abb. 12 wird der im Vergleich hierzu gesteigerte Anteil apoptotischer transformierter Fibroblasten nach 22 Stunden Inkubation in Anwesenheit von TGF-β1 und aus Koronararterien isolierten Endothelzellen ersichtlich. Insgesamt sprechen die Befunde für einen selektiv auf transformierte Zellen wirksamen, in gewissem Maße durch TGF-β1 verstärkten Effekt der Endothelzellen. - 50 +/- HSaVEC apoptotische Zellen (%) 40 30 20 20 10 10 0 20 +/- HCAEC 40 30 0 Ergebnisse 40 60 0 0 20 Zeit (h) 40 60 80 Zeit (h) +/- HPMEC 40 apoptotische Zellen (%) 208F src3 (Endothelzellen) +TGF 208F src3 +TGF 30 208F src3 (Endothelzellen) 208F src3 208F (Endothelzellen) +TGF 20 208F +TGF 208F (Endothelzellen) 10 0 208F 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 10: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von transformiertem Status der Zielzelle und von TGF-β1-Zugabe. In 12-Loch-Platten wurden 1600 208F-Zellen bzw. 1600 208F src3-Zellen als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1 ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde für HSaVEC, HCAEC und HPMEC in getrennten Versuchen jeweils in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 51 - Abb. 11: 208F src3 +TGF-β1 (22h) Abb. 12: 208F src3 +TGF-β1 überschichtet mit HCAEC (22h) Ergebnisse - 52 - Ergebnisse 4.4 Wovon hängt die Reaktionsfähigkeit der Zielzellen ab? 4.4.1 NADPH-Oxidase In weiteren Schritten wurde näher untersucht, inwieweit der Endothelzelleffekt der interzellulären Apoptoseinduktion von nichttransformierten Fibroblasten bei transformierten Fibroblasten ähnelte. Zunächst wurde die NADPH-Oxidase der Zielzellen untersucht, da zielzelleigene Superoxidanionen für den NO- und HOClWeg notwendig sind (Herdener et al., 2000). Hierfür wurden transformierte Fibroblasten mit siRNA gegen NADPH-Oxidase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert und für 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden Tropfen der jeweiligen Zellen nach Anwachsen mit Medium bzw. HSaVEC in Medium überschichtet. Die Ansätze wurden mit und ohne Zugabe von TGF-β1 ausgeführt. Abb. 13A und B zeigen, dass der Anteil apoptotischer transformierter Fibroblasten bei Herabregulation von NADPH-Oxidase gegenüber der Kontrolle ohne Herabregulation verringert war, wenn kein TGF-β1 zugegeben wurde. Bei Überschichtung der Zellen mit HSaVEC zeigte sich bei den mit siRNA gegen NADPH-Oxidase transfizierten Zellen weder mit noch ohne TGF-β1 ein Endothelzelleffekt. Dies spricht für eine Abhängigkeit des Endothelzelleffekts vom HOCl- und/oder NO-Weg und damit für Parallelen zur interzellulären Apoptoseinduktion. 4.4.2 Duale Oxidase Das vorherige Experiment zeigte, dass die Reaktionsfähigkeit von transformierten Fibroblasten von einer funktionsfähigen zielzelleigenen NADPH-Oxidase abhängt, was unter anderem gut mit einem Ablaufen des HOCl-Weges vereinbar ist. Die hierfür benötigte Peroxidase könnte durch die Endothelzellen bereitgestellt werden, ebenso könnten diese jedoch zu einer gesteigerten Aktivität einer zielzelleigenen Peroxidase führen. In diesem Falle würden die Zielzellen sowohl über Superoxidanionenproduktion als auch über Peroxidaseaktivität zum Ablaufen der interzellulären Apoptoseinduktion beitragen. Inwieweit ein solcher Beitrag vorliegt, wurde durch Herabregulation der dualen Oxidase transformierter Fibroblasten untersucht. Abb. 13C und D zeigen, dass eine Herabregulation der dualen Oxidase und damit der Peroxidase der Zielzellen zur Verringerung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen führte. Dies deutet auf eine gewisse Peroxidaseaktivität bereits in Abwesenheit von Effektorzellen hin, deren Herabregulation zu einer verminderten - 53 - Ergebnisse Apoptoseinduktion führte. Bei Überschichtung mit Endothelzellen zeigte sich trotz fehlender Zielzell-Peroxidase ein Endothelzelleffekt, der jedoch gegenüber der Kontrolle ohne Herabregulation der Peroxidase geringer war. Dies deutet darauf hin, dass der Endothelzelleffekt auch ohne Peroxidase der Zielzellen möglich ist, dass diese aber eine Rolle spielen könnte. Dies wäre vorstellbar bei einer Steigerung der Peroxidaseabgabe durch Endothelzellen über TGF-β1 oder andere Chemokine. apoptotische Zellen 208F src3 (%) 20 ohne TGF-Zugabe src si_co (HSaVEC) 30 15 src si_co src si_co 20 10 src si_nox src si_nox (HSaVEC) 10 5 src si_nox src si_nox (HSaVEC) 0 0 20 40 A 0 60 B 0 20 Zeit (h) 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) mit TGF-Zugabe src si_co (HSaVEC) 40 60 Zeit (h) ohne TGF-Zugabe mit TGF-Zugabe src si_co (HSaVEC) 30 src si_co 20 src si_co (HSaVEC) 15 src si_co 10 10 5 src si_duox (HSaVEC) src si_duox 0 0 20 40 Zeit (h) 60 src si_duox (HSaVEC) src si_duox C 0 D 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 13: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von NADPH-Oxidase bzw. dualer Oxidase der Zielzelle. Nach Transfektion von 208F src3-Zellen mit 10nM siRNA gegen NADPH-Oxidase (si_nox) bzw. duale Oxidase (si_duox) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 200000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 der jeweiligen transformierten Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 HSaVEC in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 54 - Ergebnisse 4.4.3 Caspase 3, Caspase 8 und Caspase 9 Im Zusammenhang mit reaktiven Sauerstoffverbindungen wurden, wie bereits erörtert, zwei wesentliche Wege zum apoptotischen Zerfall einer Zelle gezeigt. Zum einen kann dies über Lipidperoxidation, Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran und Aktivierung von Caspase 9 geschehen, zum anderen kann über Todesrezeptoren Caspase 8 aktiviert werden. Beide Wege führen letztendlich zur Aktivierung der Effektorcaspase 3. Um zwischen diesen beiden Wegen zu unterscheiden, wurden Tropfen transformierter Fibroblasten mit HSaVEC überschichtet. Als selektive Hemmstoffe wurden Caspase 3-Inhibitor, Caspase 8-Inhibitor und Caspase 9-Inhibitor verwendet. Das Experiment wurde mit und ohne Zugabe von TGF-β1 erstellt. Abb. 14 zeigt, dass durch Gabe von Caspase 3-Inhibitor und Caspase 9-Inhibitor sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von TGF-β1 der Endothelzelleffekt gehemmt wurde. Caspase 8-Inhibitor wirkte nicht hemmend auf den Endothelzelleffekt. Dies zeigt, dass der Endothelzelleffekt von Caspase 9 und Caspase 3 abhängig ist, was auf einen Zusammenhang mit einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran hindeutet. - 55 - Ergebnisse mit TGF-Zugabe ohne TGF-Zugabe apoptotische Zellen (%) 40 src (HSaVEC) src (HSaVEC) 20 src src 20 10 src (HSaVEC) +C3i src +C3i src (HSaVEC) +C3i src +C3i 0 0 20 40 60 0 0 20 mit TGF-Zugabe apoptotische Zellen (%) ohne TGF-Zugabe src (HSaVEC) src (HSaVEC) +C8i 60 src (HSaVEC) src (HSaVEC) +C8i 40 20 20 10 src src +C8i src src +C8i 0 0 0 20 40 60 0 20 40 60 Zeit (h) Zeit (h) mit TGF-Zugabe ohne TGF-Zugabe 40 src (HSaVEC) apoptotische Zellen (%) 40 Zeit (h) Zeit (h) src (HSaVEC) src (HSaVEC) +C9i 20 src 20 10 src (HSaVEC) +C9i src +C9i src src +C9i 0 0 0 20 40 Zeit (h) 60 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 14: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von Caspase 3, Caspase 8 und Caspase 9. In 12Loch-Platten wurden 1600 208F src3-Zellen als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 HSaVEC in 1 ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1, 50µM Caspase 3Inhibitor, 25µM Caspase 8-Inhibitor bzw. 25µM Caspase 9-Inhibitor zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 56 - 4.5 Charakterisierung der Ergebnisse Signalwege mit Hilfe von Inhibitorexperimenten Um zu bestimmen, ob beim Endothelzelleffekt auf transformierte Fibroblasten der NO-Weg und/oder der HOCl-Weg eine entscheidende Rolle spielt, wurde mit Hilfe von L-NAME die NO-Synthese unterbunden beziehungsweise mit Hilfe von Taurin HOCl abgefangen. Hierzu wurden Tropfen transformierter Fibroblasten mit HSaVEC überschichtet. Als Hemmstoffe wurden L-NAME, Taurin sowie die Kombination beider Inhibitoren verwendet. Sämtliche Ansätze wurden mit und ohne TGF-β1 angefertigt. Abb. 15 zeigt, dass eine Hemmung der NO-Synthese ebenso wie das Abfangen von HOCl oder die Kombination beider Ansatzpunkte zu einer deutlichen Hemmung des Endothelzelleffekts führte. Die Hemmbarkeit durch Zugabe von Taurin war unter Zugabe von TGF-β1 stärker ausgeprägt als ohne TGF-β1. Eine Kombination beider Hemmstoffe führte sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von TGF-β1 zu einer fast vollständigen Hemmung des Endothelzelleffekts. Diese Befunde deuten darauf hin, dass sowohl die NO-Synthese als auch der HOCl-Weg bei dem Endothelzelleffekt eine wichtige Rolle spielen und dass die beiden Wege miteinander kooperieren können. - 57 - apoptotische Zellen 208F src3 (%) 20 src (HSaVEC) 30 15 20 10 src (HSaVEC) +NAME src src +NAME 5 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) mit TGF-Zugabe ohne TGF-Zugabe src (HSaVEC) 0 0 20 40 src (HSaVEC) +NAME src +NAME src 10 60 0 0 ohne TGF-Zugabe 20 40 60 mit TGF-Zugabe src (HSaVEC) 30 src (HSaVEC) 15 20 10 src (HSaVEC) +Taurin src src +Taurin 5 0 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) Ergebnisse 0 20 40 src src (HSaVEC) +Taurin src +Taurin 10 60 0 0 ohne TGF-Zugabe 20 40 60 mit TGF-Zugabe src (HSaVEC) 30 src (HSaVEC) 15 20 10 src src (HSaVEC) +Taurin+NAME src +Taurin+NAME 5 0 0 20 40 Zeit (h) src src +Taurin+NAME src (HSaVEC) +Taurin+NAME 10 60 0 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 15: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von NO-Synthese und HOCl. In 12-Loch-Platten wurden 1600 208F src3-Zellen als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 HSaVEC in 1 ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1, 2,4mM L-NAME bzw. 50mM Taurin zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 58 - Ergebnisse Als weitere Kontrolle der Befunde des Vorexperiments wurde mit Hilfe von Mannitol, eines Fängers von Hydroxylradikalen, deren Bedeutung für den Endothelzelleffekt untersucht. Diese werden insbesondere für den HOCl-Weg benötigt. Das oben beschriebene Experiment wurde mit Mannitol als Inhibitor wiederholt. Abb. 16 zeigt die Hemmung des Effekts von Endothelzellen auf transformierte Fibroblasten durch Mannitol sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von TGF-β1. Dies bestätigt die Hinweise auf eine Rolle des HOCl-Wegs. ohne TGF-Zugabe mit TGF-Zugabe 40 src (HSaVEC) apoptotische Zellen (%) src (HSaVEC) src (HSaVEC) +Mannitol 20 30 20 10 src (HSaVEC) +Mannitol src src +Mannitol 10 src src +Mannitol 0 0 20 40 Zeit (h) 60 0 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 16: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von Hydroxylradikalen. In 12-Loch-Platten wurden 1600 208F src3-Zellen als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 HSaVEC in 1 ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 bzw. 10mM Mannitol zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 59 - Ergebnisse 4.6 Wovon hängt die Wirksamkeit der Effektorzellen ab? 4.6.1 Endotheliale, neuronale und induzierbare NO-Synthetase Da in den gezeigten Experimenten der Endothelzelleffekt durch L-NAME gehemmt wurde, wurde im folgenden Experiment die Auswirkung einer Herabregulation der endothelialen NO-Synthetase auf den Endothelzelleffekt untersucht. Hierfür wurden Endothelzellen mit je einer von drei verschiedenen verfügbaren siRNAs gegen endotheliale NO-Synthetase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert. Anschließend wurden Tropfen transformierter Fibroblasten mit den jeweiligen Endothelzellen überschichtet. Abb. 17 zeigt eine Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der endothelialen NO-Synthetase in den Effektorzellen. Diese war bei Verwendung der verschiedenen siRNAs vergleichbar stark ausgeprägt. Die Befunde deuten darauf hin, dass die endotheliale NO-Synthetase für den Endothelzelleffekt eine wichtige Rolle spielt, was sich gut mit den Reaktionen des NO-Weges vereinbaren lässt. apoptotische Zellen 208F src3 (%) 30 50 ohne TGF-Zugabe src (HSaVEC si_co) mit TGF-Zugabe src (HSaVEC si_co) 40 20 30 20 10 src (HSaVEC si_eNOS4) src (HSaVEC si_eNOS5) src (HSaVEC si_eNOS6) src (HSaVEC si_eNOS4) src (HSaVEC si_eNOS5) 10 src (HSaVEC si_eNOS6) src src 0 0 20 40 Zeit (h) 60 80 0 0 20 40 60 80 Zeit (h) Abb. 17: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von eNOS der Effektorzelle. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen endotheliale NO-Synthetase (si_eNOS4 bzw. si_eNOS5 bzw. si_eNOS6) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 der jeweiligen HSaVEC in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 60 - Ergebnisse Nachdem sich gezeigt hatte, dass die endotheliale NO-Synthetase bei dem gemessenen Endothelzelleffekt eine Rolle spielt, wurde nun vergleichend die Rolle der endothelialen, der neuronalen und der induzierbaren NO-Synthetase untersucht. Hierzu wurden in getrennten Experimenten Zellen der drei verfügbaren Endothelzelllinien jeweils mit siRNA gegen die drei Formen der NO-Synthetase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert. Transformierte Fibroblasten wurden mit diesen unterschiedlich vorbehandelten Endothelzellen überschichtet. Abb. 18 zeigt, dass eine Herabregulation der endothelialen NO-Synthetase übereinstimmend in allen verwendeten Endothelzelllinien sowohl mit als auch ohne Zugabe von TGF-β1 eine starke Hemmung des Endothelzelleffekts bewirkte. Diese war im Falle der Herabregulation der neuronalen NO-Synthetase durchgehend deutlich schwächer ausgeprägt und in keiner der Zelllinien war eine Hemmung durch Herabregulation der induzierbaren NO-Synthetase zu erkennen. Die Befunde zeigen die Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von der endothelialen und in eingeschränktem Ausmaß von der neuronalen NO-Synthetase. Somit sind sie gut vereinbar mit einem Ablaufen des NO-Weges und mit einer NO-Produktion in Endothelzellen durch endotheliale und in geringerem Maße neuronale NO-Synthetase. - 61 apoptotische Zellen 208F src3 (%) 30 src (HSaVEC si_co) src (HSaVEC si_iNOS) src (HSaVEC si_nNOS) 30 20 10 0 20 40 0 60 50 ohne TGF-Zugabe src (HCAEC si_co) src (HCAEC si_iNOS) src (HCAEC si_nNOS) 20 src (HSaVEC si_eNOS4) src 10 src (HSaVEC si_eNOS4) src 30 apoptotische Zellen 208F src3 (%) mit TGF-Zugabe 40 src (HSaVEC si_co) src (HSaVEC si_iNOS) src (HSaVEC si_nNOS) 20 0 0 20 40 60 mit TGF-Zugabe 40 src (HCAEC si_co) src (HCAEC si_iNOS) 30 src (HCAEC si_nNOS) 20 10 30 0 20 40 60 80 ohne TGF-Zugabe 0 50 0 20 40 60 80 mit TGF-Zugabe src (HPMEC si_co) src (HPMEC si_iNOS) src (HPMEC si_nNOS) 40 src (HPMEC si_co) src (HPMEC si_iNOS) src (HPMEC si_nNOS) 20 src (HCAEC si_eNOS4) src 10 src (HCAEC si_eNOS4) src 0 apoptotische Zellen 208F src3 (%) 50 ohne TGF-Zugabe Ergebnisse 30 20 10 src (HPMEC si_eNOS4) src 0 0 0 20 40 Zeit (h) 60 src (HPMEC si_eNOS4) src 10 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 18: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von eNOS, iNOS und nNOS der Effektorzelle. Nach Transfektion der Endothelzellen mit 10nM siRNA gegen induzierbare NO-Synthetase (si_iNOS), neuronale NOSynthetase (si_nNOS) bzw. endotheliale NO-Synthetase (si_eNOS4) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 130000 bis 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde für HSaVEC, HCAEC und HPMEC in getrennten Versuchen jeweils in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 62 - Ergebnisse 4.6.2 Duale Oxidase Dass der Endothelzelleffekt durch Taurin und Mannitol gehemmt wurde, weist auf eine Rolle von HOCl und Hydroxylradikalen, also zweier am HOCl-Weg beteiligter Moleküle, bei dem Endothelzelleffekt hin. Deshalb wurde in einem nächsten Experiment näher untersucht, ob die duale Oxidase der Endothelzellen beziehungsweise deren Peroxidaseuntereinheit für den Endothelzelleffekt notwendig ist. Hierzu wurden analog zum vorangegangenen Abschnitt Endothelzellen der drei verwendeten Zelllinien mit siRNA gegen duale Oxidase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert. Anschließend wurden Tropfen transformierter Fibroblasten mit den vorbehandelten Endothelzellen überschichtet. Abb. 19 zeigt eine starke bis teilweise komplette Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der dualen Oxidase und damit der Peroxidaseuntereinheit in allen Zellreihen sowohl mit als auch ohne Zugabe von TGF-β1. Dieser in räumlicher Distanz messbare Effekt der dualen Oxidase ist am besten zu erklären über deren Peroxidaseuntereinheit. Ob Endothelzellen diese ähnlich wie nichttransformierte Fibroblasten in die Umgebung abgeben, wurde in späteren Experimenten untersucht. - 63 50 +/- HSaVEC apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 50 40 30 20 10 0 0 20 Ergebnisse 40 60 +/- HCAEC 40 30 20 10 0 0 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) 50 40 60 80 Zeit (h) Zeit (h) +/- HPMEC 40 src (Endothelzellen si_co) +TGF src (Endothelzellen si_duox) +TGF 30 src +TGF src (Endothelzellen si_co) 20 src (Endothelzellen si_duox) src 10 0 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 19: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von dualer Oxidase der Effektorzelle. Nach Transfektion der Endothelzellen mit 10nM siRNA gegen duale Oxidasse (si_duox) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 130000 bis 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µlTropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde für HSaVEC, HCAEC und HPMEC in getrennten Versuchen jeweils in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 64 - Ergebnisse 4.6.3 NADPH-Oxidase Um eine mögliche Bedeutung der Superoxidanionenproduktion durch Endothelzellen für den Endothelzelleffekt zu untersuchen, wurde im folgenden Experiment die NADPH-Oxidase der Effektorzellen herabreguliert. Hierzu wurden HSaVEC mit siRNA gegen NADPH-Oxidase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert, anschließend wurden transformierte Fibroblasten mit diesen unterschiedlich vorbehandelten Endothelzellen überschichtet. Abb. 20 zeigt eine inkomplette Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der NADPH-Oxidase. Mögliche Erklärung für diesen Befund wäre die Notwendigkeit einer Aktivierung von endogen produziertem TGF-β über Wasserstoffperoxid aus der Dismutation von Superoxidanionen der NADPH-Oxidase. Da TGF-β die Abgabe von Komponenten der interzellulären Apoptoseinduktion beeinflusst (Portess et al., 2007), könnte ein Mangel an endogenem TGF-β zu einer Verminderung der Effektorfunktion, also der Abgabe von NO und/oder Peroxidase durch Endothelzellen, führen. Um diesen Aspekt weiter abzuklären, wurden in weiteren Experimenten die Peroxidaseabgabe unter Herabregulation der NADPH-Oxidase sowie der Endothelzelleffekt bei Verhinderung der endogenen TGF-β-Bildung gemessen. apoptotische Zellen 208F src3 (%) 30 src(HSaVEC si_co) src(HSaVEC si_nox) 20 10 0 src 0 20 40 Zeit (h) 60 20: Abhängigkeit des Abb. Endothelzelleffekts von NADPH-Oxidase der Effektorzelle. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen NADPH-Oxidase (si_nox) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Anschließend wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 65 - Ergebnisse 4.6.4 TGF-β-Bildung und TGF-β-Rezeptor Aufgrund der Befunde zur NADPH-Oxidase und da sich einerseits eine gewisse Steigerung des Endothelzelleffekts durch Zugabe von TGF-β1 gezeigt hatte, andererseits aber Hinweise auf Bildung von endothelzelleigenem TGF-β bestanden (Briones et al., 2001), wurden diese beiden Faktoren in einem nächsten Experiment näher untersucht. Betrachtet wurde der Einfluss einer Herabregulation des TGF-βRezeptors beziehungsweise der TGF-β-Produktion in Anwesenheit verschiedener TGF-β1-Konzentrationen. Hierfür wurden Endothelzellen mit siRNA gegen TGF-βRezeptor oder TGF-β beziehungsweise mit Kontroll-siRNA transfiziert. Anschließend wurden Tropfen transformierter Fibroblasten mit diesen unterschiedlich vorbehandelten Endothelzellen in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an TGF-β1 überschichtet. Abb. 21 zeigt die Ergebnisse des Experiments in Abhängigkeit von der zugegebenen TGF-β1-Konzentration. Der Endothelzelleffekt war sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von TGF-β1 in einem gewissen Maße von der Expression des TGF-Rezeptors sowie von endogener TGF-β1-Bildung abhängig. Im Falle der Herabregulation des TGF-β-Rezeptors fehlte die Angriffsstelle sowohl für endogen produziertes als auch für exogen im Rahmen des Experiments zugegebenes TGF-β1. Es ließ sich eine Hemmung des Endothelzelleffekts sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 erkennen, was eine Rolle des TGF-β-Rezeptors für den Endothelzelleffekt zeigt. Bei Herabregulation der endogenen TGF-β-Produktion kam es ebenfalls unabhängig von der Anwesenheit von exogenem TGF-β1 zu einer Hemmung des Endothelzelleffekts. Bei Abwesenheit von exogenem TGF-β1 zeigt diese eine Abhängigkeit von endogenem TGF-β1. Die Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation von endogenem TGF-β auch in Anwesenheit von exogenem TGF-β1 deutet darauf hin, dass hier entweder das zugegebene TGF-β1 endogen produziertes TGF-β nicht vollständig ersetzen konnte oder aber, dass im Rahmen der endogenen TGF-βBildung Prozesse ablaufen, die einen Einfluss auf den Endothelzelleffekt haben. - 66 - Ergebnisse apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 20 10 0 23h 0 5 10 15 20 20 10 0 48h 0 5 apoptotische Zellen 208F src3 (%) TGF (ng/ml) 10 15 20 TGF (ng/ml) 30 src (HSaVEC si_co) src (HSaVEC si_tgfR) 20 src (HSaVEC si_tgf) src 10 0 72h 0 5 10 15 20 TGF (ng/ml) Abb. 21: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von TGF-β-Bildung und TGF-β-Rezeptor der Effektorzelle. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen TGF-β (si_tgf) bzw. gegen TGF-β-Rezeptor (si_tgfR) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 200000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe der angegebenen Menge TGF-β1 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). 4.6.5 Signalwege bei Hemmung der endogenen TGF-β-Bildung Da sich gezeigt hatte, dass die Herabregulation der endogenen TGF-β-Bildung Einfluss auf den Endothelzelleffekt hatte, wurde nun untersucht, ob bei fehlender endogener TGF-β-Bildung der NO- und/oder der HOCl-Weg beeinträchtigt sind. Hierfür wurden Endothelzellen mit siRNA gegen TGF-β oder mit Kontroll-siRNA transfiziert. Anschließend wurden transformierte Fibroblasten mit den unterschiedlich - 67 - Ergebnisse vorbehandelten Endothelzellen ohne Zugabe eines Inhibitors bzw. in Anwesenheit von L-NAME oder Taurin überschichtet. Abb. 22 zeigt eine Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der TGF-β-Bildung. In den Ansätzen mit LNAME bewirkt eine Herabregulation der endogenen TGF-β-Bildung eine Inhibition gegenüber der Kontrolle ohne Herabregulation. In den entsprechenden Ansätzen in Anwesenheit von Taurin hatte die Herabregulation der TGF-β-Bildung nur eine minimale Auswirkung auf den Endothelzelleffekt. Vergleicht man die Ansätze unter Herabregulation der endogenen TGF-β-Bildung in Abwesenheit und in Anwesenheit der Inhibitoren, so zeigt sich, dass der bei Herabregulation der TGF-β-Bildung verbliebene Endothelzelleffekt durch Gabe von L-NAME zusätzlich hemmbar war, während Taurin kaum zu einer Hemmung dieses verbliebenen Endothelzelleffekts führte. Diese Befunde sprechen dafür, dass die Herabregulation der TGF-β-Bildung in Endothelzellen den Anteil des durch Taurin hemmbaren HOCl-Weges am Endothelzelleffekt verminderte. Somit ist am wahrscheinlichsten, dass der Mangel an endogenem TGF-β zu einer verminderten Peroxidaseabgabe bei gleich bleibender NO-Abgabe führt. 30 +/- Inhibitor NAME apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 30 20 10 0 0 20 40 Zeit (h) src (HSaVEC si_co) src (HSaVEC si_tgf) src src (HSaVEC si_co) +Inhibitor src (HSaVEC si_tgf) +Inhibitor src +Inhibitor 60 +/- Inhibitor Taurin 20 10 0 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 22: Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von NOSynthese und HOCl bei Hemmung der TGF-β-Bildung der Effektorzelle. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen TGF-β (si_tgf) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 200000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 2,4mM L-NAME bzw. 50mM Taurin zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (s. 3.2.6). - 68 - Ergebnisse 4.7 Messung der Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen Die bisher gezeigten Tropfenexperimente deuten darauf hin, dass der HOCl-Weg wesentlich am Zustandekommen des Endothelzelleffekts, also der zusätzlichen Apoptoseinduktion bei transformierten Fibroblasten in Anwesenheit von Endothelzellen, beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass eine Herabregulation der Proteinsynthese von dualer Oxidase und damit deren Peroxidaseuntereinheit in Endothelzellen zu einer Hemmung des Endothelzelleffekts führte. Mit Hilfe eines speziellen Versuchsaufbaus zum Nachweis von Peroxidase im Überstand von Effektorzellen (Ophoven, in Vorbereitung, siehe 3.2.5) sollte nun in weiteren Versuchen geprüft werden, ob und unter welchen Umständen Endothelzellen tatsächlich funktionierende Peroxidase in den Überstand abgaben. Hierzu wurde das Medium einer definierten Anzahl kultivierter Endothelzellen nach einem definierten Zeitraum abgenommen. Nach Zentrifugation des Mediums und Abnahme des Überstands wurde dieser eingefroren. Transformierte Fibroblasten wurden in Anwesenheit einer konstanten Konzentration Euk-8 und einer variablen Menge des gesammelten Überstands kultiviert. Euk-8 ist ein synthetisches Peroxidase- und Superoxiddismutasemimetikum, das in der gewählten Konzentration Apoptose über den HOCl-Weg induziert. Die im Überstand befindliche Peroxidase tritt mit Euk-8 in Kompetition. Da sie im Vergleich zu Euk-8 eine deutlich geringere Affinität zu Superoxidanionen besitzt, führt sie in geringerem Ausmaß zu Apoptoseinduktion, so dass bei einem peroxidasereichen Überstand weniger transformierte Zellen in Apoptose gehen. Ob dieser Effekt tatsächlich auf Peroxidase im Überstand zurückzuführen war, also die Spezifität der Ergebnisse, wurde mit Hilfe des Peroxidaseinhibitors ABH bestimmt. Alle Ansätze wurden in Anwesenheit von TGFβ1 durchgeführt, um eine Beeinflussung der Ergebnisse durch zugegebenes oder durch Endothelzellen produziertes TGF-β1 im Überstand auszuschließen. Ein erster Peroxidasenachweis wurde mit Medium von 20000 HSaVEC in 24-Loch-Platten durchgeführt. Nach Zentrifugation des Mediums wurde der Überstand abgenommen und bei -20°C aufgewahrt. Anschließend wurden 12000 transformierte Fibroblasten je Ansatz in 96-Loch-Platten in Anwesenheit von 75µM Euk-8, 20ng/ml TGF-β1 und bis zu 25µl Überstand kultiviert. Als Kontrolle wurden Ansätze unter Zugabe von 150µM ABH erstellt. Abb. 23 zeigt, dass weniger transformierte Fibroblasten in Apoptose gingen, je mehr Überstand im Ansatz vorhanden war. Dabei zeigte der Überstand des Mediums von Endothelzellen, die TGF-β1 ausgesetzt waren, einen - 69 - Ergebnisse etwas stärkeren Effekt als solcher von Zellen, die diesem nicht ausgesetzt waren. In beiden Fällen, jedoch stärker ausgeprägt im Falle des Überstands des Mediums von Zellen unter TGF-β1, kam es bereits bei geringen Mengen an Überstand zu einem starken Absinken des Anteils apoptotischer transformierter Fibroblasten, während die Zugabe von mehr als 10µl nur einen geringeren zusätzlichen Effekt bewirkte, so dass es zu einem sich abflachenden Kurvenverlauf kam. In Anwesenheit von ABH zeigte sich in den Ansätzen beider Überstände ein deutlich größerer Anteil apoptotischer transformierter Fibroblasten, der jedoch bei zunehmender Menge an Überstand ebenfalls gegenüber dem Nullwert ohne Überstand absank. Dieses Absinken kann hervorgerufen worden sein durch Faktoren, die sich im Überstand befanden und entweder mit Euk-8 interagierten oder einen anderen Einfluss auf den Apoptoseprozess hatten, ohne durch ABH hemmbar gewesen zu sein. Eine unvollständige Hemmung durch ABH könnte den Effekt ebenfalls hervorrufen. Die Differenz zwischen Ansätzen mit Überstand und ABH sowie solchen mit Überstand, aber ohne ABH, entsprach einem Effekt, der einerseits auf den Überstand zurückzuführen war, da er nur in Anwesenheit von Überstand auftrat, und der andererseits durch den sehr spezifischen Inhibitor ABH hemmbar war, der also auf eine Peroxidase zurückzuführen sein musste. Jedoch wurde hiermit noch nicht überprüft, ob es sich dabei um eine Peroxidase der Endothelzellen oder der transformierten Fibroblasten handelte, weshalb sich weitere Experimente anschlossen. apoptotische Zellen 208F src3 (%) 40 30 Ü +ABH Ü(TGF) +ABH 20 Ü Ü(TGF) 10 0 0 5 10 15 Überstand (μl) 20 25 Abb. 23: Peroxidaseabgabe durch HSaVEC in Abhängigkeit von TGF. Ansätze von je 20000 HSaVEC wurden in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von 20ng/ml TGF-β1 in 24-LochPlatten mit 500µl Medium über 31 Stunden bei morphologischer Überprüfung kultiviert. Nach Zentrifugation des Mediums bei 3000 U./Min. für 3 Minuten wurden je 400µl Überstand (Ü) abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. 12000 transformierte Fibroblasten wurden zu einem späteren Zeitpunkt in 96-Loch-Platten unter Anwesenheit von 75µM Euk-8, 20ng/ml TGF-β1 sowie der angegebenen Menge Überstand eingesät. Diese Ansätze sowie solche mit zusätzlich 150µM ABH wurden inkubiert. Der Peroxidasenachweis (siehe 3.2.5) wurde in Doppelbestimmung durchgeführt und nach 9 Stunden am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 70 - Ergebnisse Um den Beitrag der endothelialen dualen Oxidase zu untersuchen, wurden Endothelzellen mit siRNA gegen duale Oxidase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert. Diese Zellen wurden anschließend kultiviert, die Überstände des Mediums der Endothelzellen wurden eingefroren und analog zum vorherigen Experiment verwendet. Transformierte Fibroblasten wurden in Anwesenheit einer konstanten Konzentration Euk-8 einer variablen Menge Überstand ausgesetzt. Auch hier wurden Kontrollen mit ABH durchgeführt und alle Ansätze in Anwesenheit von TGF-β1 erstellt. Abb. 24 zeigt die Ergebnisse des Experiments. Die Kompetition, also die Menge der im Überstand vorhandenen Peroxidase, war unter Herabregulation der endothelialen dualen Oxidase stark vermindert. Für eine Kompetition, die vergleichbar mit derjenigen von 25µl Überstand von Endothelzellen unter Herabregulation der endothelialen dualen Oxidase war, wurden weniger als 2,5µl Überstand von Endothelzellen ohne Herabregulation benötigt. Dies zeigt, dass die duale Oxidase der Endothelzellen für die Anwesenheit von Peroxidase im Überstand verantwortlich ist. Diese Ergebnisse lassen sich gut mit der Abtrennung der extrazellulären Peroxidaseuntereinheit von der endothelialen membranständigen dualen Oxidase ähnlich wie in Fibroblasten vereinbaren. apoptotische Zellen 208F src3 (%) 50 40 Ü_siduox(TGF) +ABH Ü_sico(TGF) +ABH 30 Ü_siduox(TGF) 20 Ü_sico(TGF) 10 0 0 5 10 15 Überstand (μl) 20 25 Abb. 24: Herabregulation der dualen Oxidase in Endothelzellen. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen duale Oxidase (si_duox) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6Loch-Platten bei 200000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden Ansätze von je 20000 HSaVEC in 24-Loch-Platten mit 500µl Medium über 40 Stunden bei morphologischer Überprüfung kultiviert. Nach Zentrifugation des Mediums bei 3000 U./Min. für 3 Minuten wurden je 400µl Überstand (Ü) abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. 12000 transformierte Fibroblasten wurden zu einem späteren Zeitpunkt in 96-LochPlatten unter Anwesenheit von 75µM Euk-8, 20ng/ml TGF-β1 sowie der angegebenen Menge Überstand eingesät. Diese Ansätze sowie solche mit zusätzlich 150µM ABH wurden inkubiert. Der Peroxidasenachweis (siehe 3.2.5) wurde in Doppelbestimmung durchgeführt und nach 13 Stunden am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 71 - Ergebnisse Da Experimente in der Arbeitsgruppe gezeigt hatten, dass die Freisetzung der Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase durch Fibroblasten von einer Matrixmetalloproteinase abhing, wurde nun in einem weiteren Experiment ein Proteaseinhibitor zugegeben und geprüft, ob dieser eine verminderte Freisetzung von Peroxidase bewirkt. Endothelzellen wurden in Abwesenheit bzw. in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Galardin, einem unspezifischen Inhibitor von Matrixmetalloproteineasen, kultiviert. Der Überstand dieser unterschiedlich vorbehandelten Zellen wurde analog zu den vorigen Experimenten auf Peroxidase untersucht. Abb. 25 zeigt sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von TGFβ1 eine Hemmung der Kompetition, wenn die Zellen mit dem Proteaseinhibitor Galardin behandelt waren. Dies war abhängig von der Konzentration des Inhibitors und erreichte bei Zugabe von 10µM Galardin einen maximalen Effekt. Dies zeigt, dass Endothelzellen sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von TGF-β1 Peroxidase über einen von einer Protease abhängigen Prozess abgaben. Die bisher hierzu erhaltenen Ergebnisse lassen sich gut mit einer von Matrixmetalloproteinasen 40 Kontrollen mit ABH Ü(10Gal) 30 Ü(3,3Gal) 20 Ü(1,1Gal) Ü 10 0 0 5 10 15 Überstand (μl) 20 25 apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) abhängigen Abgabe der Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase vereinbaren. 40 Kontrollen mit ABH Ü(10Gal+TGF) 30 20 Ü(3,3Gal+TGF) 10 Ü(1,1Gal+TGF) Ü(TGF) 0 0 5 10 15 20 25 Überstand (μl) Abb. 25: Hemmung der Peroxidasefreisetzung. Ansätze von je 20000 HSaVEC wurden ohne Zusatz bzw. mit 1,1µM, 3,3µM oder 10µM Galardin und/oder TGF-β1 in den entsprechenden Ansätzen in 24-Loch-Platten mit 500µl Medium über 31 Stunden bei morphologischer Überprüfung kultiviert. Nach Zentrifugation des Mediums bei 3000 U./Min. für 3 Minuten wurden je 400µl Überstand (Ü) abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. 12000 transformierte Fibroblasten wurden zu einem späteren Zeitpunkt in 96-Loch-Platten unter Anwesenheit von 75µM Euk-8, 20ng/ml TGF-β1 sowie der angegebenen Menge Überstand eingesät. Diese Ansätze sowie solche mit zusätzlich 150µM ABH wurden inkubiert. Der Peroxidasenachweis (siehe 3.2.5) wurde in Doppelbestimmung durchgeführt und nach 9 Stunden am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 72 - Ergebnisse Um weiter abzuklären, welchen Einfluss die NADPH-Oxidase der Effektorzellen auf die Vorgänge zwischen Endothelzellen und transformierten Fibroblasten hatte, wurde diese nun in Endothelzellen herabreguliert und die Peroxidasefreisetzung gemessen. Da Konzentrationsänderungen des nach und nach produzierten endogenen TGF-β oder aber sonstige über die Zeit veränderliche Faktoren einen Einfluss auf die Ergebnisse haben konnten, wurde das Experiment mit Überständen von Medium durchgeführt, das nach unterschiedlich langer Zeit abgenommen wurde. Hierfür wurden Endothelzellen mit siRNA gegen NADPH-Oxidase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert. Diese unterschiedlich vorbehandelten Zellen wurden in Anwesenheit sowie in Abwesenheit von exogenem TGF-β1 in dreifacher Ausführung kultiviert, die Überstände wurden je zu einem unterschiedlichen Zeitpunkt abgenommen. Diese Überstände wurden analog zu den vorigen Experimenten für einen Peroxidasenachweis mit Hilfe einer konstanten Konzentration Euk-8 und einer variablen Menge Überstand verwendet. Abb. 26 zeigt, dass bereits bei Abnahme nach 10 Stunden in den Überständen von Medium der Zellen ohne Herabregulation von NADPH-Oxidase sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von TGF-β1 fast der maximal erreichte Peroxidaseeffekt sichtbar war. Eine Abnahme nach 20 bzw. 44 Stunden bewirkte nur noch eine minimale Steigerung der Peroxidasefreisetzung. Dies könnte auf ein Gleichgewicht zwischen Abgabe und Inaktivierung von Peroxidase zurückzuführen sein oder aber darauf, dass in dem experimentellen Aufbau Peroxidasekonzentrationen über einem bestimmten Wert kaum zusätzlichen Effekt bewirkten. In Anwesenheit von exogenem TGF-β1 war kein Einfluss durch Herabregulation der NADPH-Oxidase erkennbar, während in Ansätzen ohne exogenes TGF-β1 die Abgabe von Peroxidase bei Herabregulation der NADPH-Oxidase gegenüber der Kontrolle ohne Herabregulation vermindert war. Dies traf für alle drei nach unterschiedlichen Zeiträumen entnommenen Überstände zu. Abgesehen von einem etwas geringeren Anteil apoptotischer Zellen in den Kontrollen mit ABH in Verbindung mit Überständen, die zu späteren Zeitpunkten abgenommen wurden, ließ sich kein deutlicher Unterschied zwischen den nach unterschiedlichen Zeiträumen abgenommenen Überständen erkennen. Abb. 27 zeigt exemplarisch die starke Apoptoseinduktion bei transformierten Zellen unter dem Einfluss von Euk-8. Demgegenüber wird in Abb. 28 der durch Kompetition verminderte Anteil apoptotischer Zellen unter Zugabe von Überstand von Endothelzellen sichtbar. Abb. 29 zeigt die teilweise Aufhebung dieses Effekts durch - 73 - Ergebnisse den Peroxidaseinhibitor ABH. Die Ergebnisse zeigen eine Abhängigkeit der Peroxidaseabgabe von NADPH-Oxidase in Abwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1. Diese ließe sich vereinbaren mit einer Aktivierung von endogen produziertem TGF-β über Wasserstoffperoxid aus Superoxidanionen der NADPHOxidase. Der Mangel an aktiviertem endogen produziertem TGF-β in gleichzeitiger Abwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 könnte zu einer verminderten Aktivierung der Peroxidaseabgabe geführt haben. 60 apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 60 50 40 30 20 10 40 30 20 10 A Überstand: 10h 0 50 B Überstand: 20h 0 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Überstand (μl) Überstand (μl) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 60 Ü_sinox +ABH 50 Ü_ sico +ABH Ü_sinox(TGF) +ABH 40 Ü_sico(TGF) +ABH 30 Ü_sinox Ü_sico 20 Ü_sinox(TGF) Ü_sico(TGF) 10 C Überstand: 44h 0 0 5 10 15 20 25 Überstand (μl) Abb. 26: Herabregulation der NADPH-Oxidase in Endothelzellen. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen NADPH-Oxidase (si_nox) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6Loch-Platten bei 120000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden Ansätze von je 20000 HSaVEC in 24-Loch-Platten mit 500µl Medium über den angegebenen Zeitraum bei morphologischer Überprüfung kultiviert. Nach Zentrifugation des Mediums bei 3000 U./Min. für 3 Minuten wurden je 400µl Überstand (Ü) abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. 12000 transformierte Fibroblasten wurden zu einem späteren Zeitpunkt in 96-Loch-Platten unter Anwesenheit von 75µM Euk-8, 20ng/ml TGF-β1 sowie der angegebenen Menge Überstand eingesät. Diese Ansätze sowie solche mit zusätzlich 150µM ABH wurden inkubiert. Der Peroxidasenachweis (siehe 3.2.5) wurde in Doppelbestimmung durchgeführt und nach 9 Stunden am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). (A) und (B) wurden aufgrund der Zahl der Ansätze getrennt von (C) durchgeführt. - 74 - Ergebnisse Abb. 27 208F src3-Zellen +TGF-β1 +Euk-8 Abb. 28 208F src3-Zellen +TGF-β1 +Euk-8 +25µl Ü_sico(10h) Abb. 29 208F src3-Zellen +TGF-β1 +Euk-8 +25µl Ü_sico(10h) +ABH - 75 - Ergebnisse Die Befunde zur Peroxidasefreisetzung durch Endothelzellen, welche aus einer humanen Vena Saphena isoliert worden waren, wurden abschließend auf eine Übertragbarkeit auf Endothelzellen aus Koronararterien und kleinen Lungengefäßen hin überprüft. Hierfür wurde bei HCAEC und HPMEC untersucht, ob Peroxidase freigesetzt wurde und ob diese Peroxidasefreisetzung von dualer Oxidase der Endothelzellen, von Matrixmetalloproteinasen, von TGF-β1 und/oder von NADPHOxidase abhängig war. Es wurden Ansätze der beiden Zellreihen mit siRNA gegen duale Oxidase beziehungsweise gegen NADPH-Oxidase oder mit Kontroll-siRNA transfiziert. Zu einem Teil der Ansätze mit Kontroll-siRNA wurde zudem Galardin, ein Proteaseinhibitor, zugegeben. Die Überstände des Mediums dieser unterschiedlich vorbehandelten Endothelzellen wurden zu einem späteren Zeitpunkt abgenommen und eingefroren. Aus diesen aufbewahrten Überständen wurde wie in den vorigen Experimenten die abgegebene Peroxidase mit Hilfe von Euk-8, ABH und TGF-β1 nachgewiesen. Abb. 30 zeigt einen geringeren Anteil apoptotischer transformierter Fibroblasten in Anwesenheit von Überstand im Gegensatz zu Ansätzen mit Überstand und ABH, also eine Kompetition in diesen Ansätzen mit Überständen von HCAEC und HPMEC, die auf Anwesenheit von Peroxidase hinweist. Diese war allenfalls geringfügig verstärkt, wenn die Endothelzellen TGF-β1 ausgesetzt waren. Um auch für diese Zelllinien zu prüfen, ob es sich bei der nachgewiesenen Peroxidase tatsächlich um die Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase der Endothelzellen handelte, wurden Ansätze angefertigt mit Überstand von Endothelzellen, die mit siRNA gegen duale Oxidase transfiziert worden waren. Hier zeigte sich eine deutliche Hemmung des Peroxidaseeffekts. Somit war die Differenz zur Kontrolle auf eine Peroxidase der Endothelzellen zurückzuführen. Eine Hemmung des Peroxidaseeffekts in Ansätzen mit Überständen des Mediums mit Galardin behandelter Endothelzellen bestätigte die Abhängigkeit des Prozesses von einer Protease. Die Ergebnisse zu den Überständen des Mediums der Endothelzellen, deren NADPH-Oxidase herabreguliert war, zeigten, dass auch bei HCAEC und HPMEC die Abgabe von Peroxidase in Anwesenheit von TGF-β1 von NADPH-Oxidase unabhängig war, während in Abwesenheit von exogenem TGF-β1 NADPH-Oxidase für die Peroxidaseabgabe benötigt wurde. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der Experimente mit HSaVEC, HCAEC und HPMEC eine Peroxidaseabgabe über die duale Oxidase der Endothelzellen, die abhängig ist von einer Protease. Des Weiteren besteht in Abwesenheit von - 76 - Ergebnisse exogenem TGF-β1 eine Abhängigkeit der Peroxidaseabgabe von NADPH-Oxidase der Endothelzellen. Somit bestehen Hinweise darauf, dass eventuell Wasserstoffperoxid aus der Dismutation von Superoxidanionen der NADPH-Oxidase HPMEC 50 apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) zur Aktivierung von endogenem TGF-β1 benötigt wird. Kontrollen mit ABH 40 30 20 Ü_sico(Gal) Ü_siduox 10 Ü_sinox Ü_sico 0 0 5 10 15 Kontrollen mit ABH 40 30 Ü_sico(TGF+Gal) 20 Ü_siduox(TGF) Ü_sinox(TGF) Ü_sico(TGF) 10 0 20 0 25 Überstand (μl) 60 HPMEC 50 5 10 15 20 60 HCAEC apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) HCAEC 50 Kontrollen mit ABH 40 30 20 Ü_siduox Ü_sico(Gal) Ü_sinox Ü_sico 10 0 0 5 10 15 Überstand (μl) 20 25 25 Überstand (μl) 50 Kontrollen mit ABH 40 30 Ü_sico(TGF+Gal) 20 Ü_siduox(TGF) 10 Ü_sinox(TGF) Ü_sico(TGF) 0 0 5 10 15 20 25 Überstand (μl) Abb. 30: Peroxidaseabgabe durch HPMEC und HCAEC in Abhängigkeit von dualer Oxidase der Endothelzellen, Matrixmetalloproteinasen, TGF-β1 und NADPH-Oxidase der Endothelzellen. Nach Transfektion von HCAEC bzw. HPMEC mit 10nM siRNA gegen NADPH-Oxidase (si_nox) bzw. gegen duale Oxidase (si_duox) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 80000 (HCAEC) bzw. 200000 (HPMEC) Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden Ansätze von je 20000 unterschiedlich vorbehandelten Endothelzellen in 24-Loch-Platten mit 500µl Medium gegebenenfalls unter Zugabe von 10µM Galardin über 20 (HCAEC) bzw. 40 (HPMEC) Stunden bei morphologischer Überprüfung kultiviert. Nach Zentrifugation des Mediums bei 3000 U./Min. für 3 Minuten wurden je 400µl Überstand (Ü) abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. 12000 transformierte Fibroblasten wurden zu einem späteren Zeitpunkt in 96-Loch-Platten unter Anwesenheit von 75µM Euk-8, 20ng/ml TGF-β1 sowie der angegebenen Menge Überstand eingesät. Diese Ansätze sowie solche mit zusätzlich 150µM ABH wurden inkubiert. Der Peroxidasenachweis (siehe 3.2.5) wurde für HCAEC und HPMEC in getrennten Experimenten jeweils in Doppelbestimmung durchgeführt und nach 9 Stunden (HCAEC) bzw. 10 Stunden (HPMEC) am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 77 - Ergebnisse 4.8 Entkoppelung der NO-Synthetase Das Enzym Cytochrom P450-Oxidoreduktase wird für die Funktion der NODioxygenase benötigt (Hallstrom et al., 2004), welche die NO-Abgabe durch eine Umsetzung von Stickstoffmonoxid in Nitrat limitiert (Gardner et al., 1998). Es war nun in weiteren Experimenten geplant, diese Cytochrom P450-Oxidoreduktase herabzuregulieren, um zu erkennen, ob sich dadurch über eine Steigerung des NOWeges der Endothelzelleffekt verstärken ließe. Jedoch stellte sich überraschenderweise heraus, dass der Endothelzelleffekt sich nicht verstärkte, sondern dass er ganz im Gegenteil gehemmt wurde. Die im Folgenden gezeigten Experimente gaben weiteren Aufschluss darüber, auf welche Mechanismen dieser Effekt am wahrscheinlichsten zurückzuführen ist. 4.8.1 Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase Die erste Untersuchung mit Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase in Endothelzellen zeigte, dass diese zu einer anfangs ausgeprägten und später nachlassenden Hemmung des Endothelzelleffekts führte. Dies führte zu der Vermutung, dass die NO-Abgabe eventuell nicht gesteigert war sondern im Gegenteil sogar verringert worden sein könnte. Deshalb wurde nun in einem erweiterten Experiment zusätzlich überprüft, wie stark der verbliebene Endothelzelleffekt von NO-Synthese abhängig war, also auf den NO-Weg zurückzuführen war. Hierfür wurden Endothelzellen mit siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase sowie mit Kontroll-siRNA transfiziert. Transformierte Fibroblasten wurden mit diesen unterschiedlich vorbehandelten Endothelzellen überschichtet. Die Ansätze wurden ohne weitere Zugabe sowie in Anwesenheit von TGF-β1, L-NAME und der Kombination beider Stoffe erstellt. Abb. 31 zeigt, dass die Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase in Abwesenheit von TGF-β1 zu einer anfänglich fast vollständigen Hemmung des Endothelzelleffekts führte, die sich im zeitlichen Verlauf zunehmend abschwächte und bei der letzten Messung nur noch eine Hemmung um etwa 30% ausmachte. In den entsprechenden Ansätzen mit zusätzlicher Zugabe von L-NAME ließ sich eine deutliche Hemmung des Endothelzelleffekts durch L-NAME bei Endothelzellen ohne Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase erkennen. Vergleicht man die Ansätze unter Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase in Anwesenheit und in - 78 - Ergebnisse Abwesenheit von L-NAME, so findet sich in der Auswertung früher Messzeitpunkte keinerlei Hemmung durch Zugabe von L-NAME, während die Anwesenheit von LNAME in späteren Messungen zu einer Hemmung führte. Diese Befunde ergaben Hinweise darauf, dass die Bedeutung des NO-Weges für den Endothelzelleffekt durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase vermindert war, dass der NO-Weg aber im zeitlichen Verlauf wieder an Bedeutung gewann. Unter Zugabe von TGF-β1 zeigte sich ein hiervon abweichendes Bild. Die Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase führte hier anfänglich zu keiner Änderung des Endothelzelleffekts, im zeitlichen Verlauf kam es jedoch zu einer zunehmenden Hemmung. Eine Zugabe von L-NAME führte auch hier zu einer deutlichen Hemmung des Endothelzelleffekts in Ansätzen ohne Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase. Vergleicht man nun in Ansätzen mit TGF-β1 den Endothelzelleffekt der Zellen unter Herabregulation der Cytochrom P450- Oxidoreduktase in Abwesenheit sowie in Anwesenheit von L-NAME, so fand sich hier eine anfängliche Hemmung der Effektorfunktion durch L-NAME, die sich im zeitlichen Verlauf verlor. Somit deuten die Ergebnisse zur Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase auf eine im zeitlichen Verlauf abnehmende Hemmung des NOWeges in Abwesenheit von TGF-β1 sowie auf eine im zeitlichen Verlauf zunehmende Hemmung des NO-Weges in Anwesenheit von TGF-β1 hin. - 79 - mit TGF-Zugabe ohne TGF-Zugabe apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 20 15 10 5 0 Ergebnisse 30 20 10 0 0 20 40 60 0 src (HSaVEC si_por) src src (HSaVEC si_co) +NAME src (HSaVEC si_por) +NAME src +NAME 40 60 Zeit (h) Zeit (h) src (HSaVEC si_co) 20 Abb. 31: Herabregulation der Cytochrom P450Oxidoreduktase. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase (si_por) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 bzw. 2,4mM L-NAME zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). 4.8.2 Tetrahydrobiopterin Das vorherige Experiment wies auf eine Störung des NO-Weges durch die Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase hin. Tetrahydrobiopterin (BH4) ist ein essentieller Kofaktor aller dreier Isoformen der NO-Synthetase und kann in Anwesenheit von NO und Superoxidanionen über die Bildung von Peroxynitrit oxidiert werden (Moens und Kass, 2006). Da eine durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase ausgelöste vorübergehende Erhöhung der Stickstoffmonoxidkonzentration in Anwesenheit von Superoxidanionen zu einer verstärkten Oxidation von Tetrahydrobiopterin führen könnte, bestand der Verdacht, dass es sich bei der verminderten Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von der NOSynthese um einen Mangel an funktionellem, also nicht oxidiertem BH4, handeln könnte. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Auswirkung einer Zugabe von - 80 - Ergebnisse Tetrahydrobiopterin untersucht. Hierfür wurde das oben beschriebene Experiment um Ansätze mit Zugabe von BH4 sowie Zugabe einer Kombination aus BH4 und LNAME erweitert. Abb. 32 zeigt, dass der gemessene Effekt der Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase durch Zugabe von BH4 sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 komplett aufgehoben wurde, so dass hier ein von den Ansätzen ohne Herabregulation nicht unterscheidbarer Endothelzelleffekt erkennbar wurde. Die zusätzliche Zugabe von LNAME führte zu einer inkompletten Hemmung des Endothelzelleffekts. Diese Befunde zeigen, dass einerseits die Wirkung der Herabregulation von Cytochrom P450-Oxidoreduktase durch Zugabe von BH4 aufhebbar war und dass es im Zuge dessen zu der Wiederherstellung eines von der NO-Synthese abhängigen Endothelzelleffekts kam. Aus den Befunden ergab sich folgendes Modell als wahrscheinlichste Erklärung: Die Herabregulation der Cytochrom P450- Oxidoreduktase führte noch während der Transfektion zu einer gesteigerten Abgabe von NO durch die Endothelzellen. Aufgrund einer hohen Konzentration an NO und gleichzeitig vorhandener Superoxidanionen konnte sich Peroxynitrit bilden, welches Tetrahydrobiopterin oxidierte und dessen Funktion als Kofaktor von NO-Synthetasen verhinderte. Hierdurch ergab sich die mangelnde Hemmbarkeit des Endothelzelleffekts bei Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase durch L-NAME. Die Zugabe von BH4 hob diesen Effekt auf, indem es eine ausreichende Konzentration an nicht oxidiertem Tetrahydrobiopterin bereitstellte. Folge war ein wiederum durch L-NAME hemmbarer von NO-Synthese abhängiger Endothelzelleffekt. Jedoch kam es nicht zu der unter diesen Umständen erwarteten Steigerung des Endothelzelleffekts über das Ausmaß der Kontrolle ohne Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase hinaus. Wahrscheinlichste Erklärung hierfür ist, dass die erleichterte Abgabe von NO durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase und damit der NO-Dioxygenase nicht ausreichte, um eine nur unvollständig wiederhergestellte Funktion der NO-Synthetasen auszugleichen. - 81 - ohne TGF-Zugabe 15 10 5 15 10 5 0 0 20 ohne TGF-Zugabe 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 20 0 Ergebnisse 40 60 0 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 30 20 10 0 20 60 mit TGF-Zugabe mit TGF-Zugabe 0 40 Zeit (h) Zeit (h) 40 60 30 20 10 0 0 20 Zeit (h) 40 60 Zeit (h) src (HSaVEC si_co) src (HSaVEC si_co) +BH4 src (HSaVEC si_por) src (HSaVEC si_por) +BH4 src src +BH4 src (HSaVEC si_co) +BH4 src (HSaVEC si_co) +NAME+BH4 src (HSaVEC si_por) +BH4 src (HSaVEC si_por) +NAME+BH4 src +BH4 src +NAME+BH4 Abb. 32: Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase von HSaVEC, Zugabe von Tetrahydrobiopterin. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen Cytochrom P450Oxidoreduktase (si_por) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1, 50µM BH4 bzw. 2,4mM L-NAME zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 82 - Ergebnisse 4.8.3 L-NAME während des Transfektionsprozesses Da sich der Verdacht ergeben hatte, dass bei den beobachteten Vorgängen während der Transfektion mit siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase eine gesteigerte NO-Produktion über eine Reaktion mit Superoxidanionen zu Peroxynitrit eine Oxidation von Tetrahydrobiopterin bewirkte, wurde nun in einem nächsten Schritt die NO-Synthese bereits während des Transfektionsprozesses unterbunden. Hierfür wurden Endothelzellen in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit von L-NAME mit siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert. Transformierte Fibroblasten wurden nun mit diesen unterschiedlich vorbehandelten Endothelzellen überschichtet, durch Hemmung mit Hilfe von L-NAME wurde auch hier ermittelt, ob der Endothelzelleffekt von NO-Synthese abhängig war. Abb. 33A zeigt, dass die Zugabe von L-NAME gemeinsam mit siRNA gegen Cytochrom P450Oxidoreduktase zu Beginn der Transfektion dazu führte, dass die Hemmung des Endothelzelleffekts durch die Herabregulation ausblieb. Dies bedeutet, dass der gezeigte Effekt einer Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase tatsächlich von der Anwesenheit von L-NAME während des Transfektionsprozesses abhängig war. Abb. 33C zeigt, dass der auf die beschriebene Weise rekonstituierte Endothelzelleffekt erneut hemmbar war durch eine spätere Zugabe von L-NAME. Dies lässt sich gut mit dem beschriebenen Modell einer Oxidation von Tetrahydrobiopterin durch Peroxynitrit während der Transfektion vereinbaren. Die Unterbindung der NO-Synthese während der Transfektion führte dazu, dass nun mehr funktionierende NO-Synthetase vorhanden war. Aus Abb. 33B hingegen ist ersichtlich, dass im Falle der Anwesenheit von TGF-β1 eine Hemmung des Endothelzelleffekts im späteren zeitlichen Verlauf bestehen blieb, auch wenn die Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase in Anwesenheit von L-NAME erfolgte. Dies deutet darauf hin, dass diese erst zu einem späten Zeitpunkt, etwa ab der 40. Stunde nach Fertigstellung der Ansätze, auftretende Hemmung unabhängig von der Anwesenheit von NO während der Transfektion war. Wie aus Abb. 33D ersichtlich ist, ist der unter Herabregulation von Cytochrom P450-Oxidoreduktase in Anwesenheit von TGF-β1 im späteren Zeitverlauf verringerte Endothelzelleffekt in einem gewissen Maße weiter durch L-NAME hemmbar. Als Erklärung denkbar wäre eine partielle Entkopplung der NO-Synthetasen. - 83 ohne TGF-Zugabe ohne TGF-Zugabe 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) Ergebnisse 15 10 5 15 10 5 C A 0 0 20 40 60 0 80 0 20 Zeit (h) 40 mit TGF-Zugabe apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) 40 40 60 30 20 10 mit TGF-Zugabe 30 20 10 B 0 0 20 40 60 D 80 0 0 20 40 src (HSaVEC si_co) src (HSaVEC si_co/NAME) src (HSaVEC si_por) src (HSaVEC si_por/NAME) src (HSaVEC si_co/NAME) src (HSaVEC si_por/NAME) 60 80 Zeit (h) Zeit (h) src 80 Zeit (h) src src (HSaVEC si_co/NAME) +NAME src (HSaVEC si_por/NAME) +NAME src +NAME Abb. 33: Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase in Anwesenheit von L-NAME. Nach Transfektion von HSaVEC mit 10nM siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase (si_por) oder Kontroll-siRNA (si_co) in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von 2,4mM L-NAME über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 bzw. 2,4mM L-NAME zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 84 - Ergebnisse 4.8.4 Vergleich der Endothelzelllinien Um einen Vergleich bezüglich der Auswirkung einer Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase auf unterschiedliche Zelllinien zu erhalten, wurden HCAEC herangezogen. Auch diese Endothelzellen wurden mit siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase bzw. mit Kontroll-siRNA transfiziert, anschließend wurden transformierte Fibroblasten mit den unterschiedlich vorbehandelten Zellen in Anwesenheit sowie in Abwesenheit von Tetrahydrobiopterin überschichtet. Abb. 34 zeigt, dass bei HCAEC die Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von TGF-β1 nur zu einer geringen Hemmung des Endothelzelleffekts im späten zeitlichen Verlauf führte. Diese war durch Zugabe von Tetrahydrobiopterin aufhebbar. Auch in hier nicht dargestellten Daten zu HPMEC blieb analog zu HCAEC und im Gegensatz zu HSaVEC eine deutliche und zu frühen Zeitpunkten auftretende Hemmung des Endothelzelleffekts in Abwesenheit von TGF-β1 durch Herabregulation der Cytochrom P450- Oxidoreduktase aus. Das Medium von HPMEC und HCAEC enthält eine 100fach höhere Konzentration an Epidermal Growth Factor verglichen mit dem Medium von HSaVEC. Da der Wachstumsfaktor EGF die Synthese von Tetrahydrobiopterin über eine Stimulation des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms der BH4-Synthese, der GTP-Cyclohydrolase, stimuliert (Moens und Kass, 2006), lässt sich das Ausbleiben einer Hemmung des Endothelzelleffekts bei Herabregulation der Cytochrom P450Oxidoreduktase in Abwesenheit von TGF-β1 gut mit einer durch EGF verstärkten Neusynthese von Tetrahydrobiopterin vereinbaren. mit TGF-Zugabe 15 10 5 0 Ergebnisse ohne TGF-Zugabe 20 apoptotische Zellen 208F src3 (%) apoptotische Zellen 208F src3 (%) - 85 - 0 20 40 Zeit (h) src HCAEC si_co) src (HCAEC si_por) src src (HCAEC si_co) +BH4 src (HCAEC si_por) +BH4 src +BH4 60 30 20 10 0 0 20 40 60 Zeit (h) Abb. 34: Herabregulation der Cytochrom P450Oxidoreduktase von HCAEC, Zugabe von Tetrahydrobiopterin. Nach Transfektion von HCAEC mit 10nM siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase (si_por) oder Kontroll-siRNA (si_co) über 24 Stunden in 6-Loch-Platten bei 250000 Zellen pro Ansatz in 2,4ml Medium mit HiPerfect Transfektionsreagenz (siehe 3.2.3) wurden 1600 transformierte Fibroblasten als 4µl-Tropfen nach Anwachsen mit 1ml Medium bzw. 15000 Endothelzellen in 1ml Medium überschichtet. Nach Zugabe von 20ng/ml TGF-β1 bzw. 50µM BH4 zu den entsprechenden Ansätzen wurden die Platten inkubiert. Das Tropfenexperiment (siehe 3.2.4) wurde in Doppelbestimmung bei morphologischer Überprüfung der Effektorzellen durchgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten am Phasenkontrastmikroskop ausgewertet (siehe 3.2.6). - 86 - Diskussion 5 Diskussion Die vorliegende Arbeit basiert auf Untersuchungen zur apoptoseinduzierenden Wirkung von nichttransformierten auf transformierte Fibroblasten über die Abgabe von Stickstoffmonoxid und Peroxidase. Es wird diskutiert, inwieweit humane nicht immortalisierte Endothelzellen ähnlich wie nichttransformierte Fibroblasten Stickstoffmonoxid (siehe 5.1) sowie Peroxidase (siehe 5.2) abgeben und ob dies über die gleichen Reaktionsmechanismen zu einer Apoptoseinduktion bei transformierten Fibroblasten, jedoch nicht bei nichttransformierten Fibroblasten führt. Diese Befunde werden in den Zusammenhang einer möglichen antitumorösen Wirkung gestellt (siehe 5.6), außerdem wird dargelegt, inwieweit die bisher nicht beschriebene Abgabe einer Peroxidase durch Endothelzellen über die Bildung von HOCl möglicherweise Einfluss auf frühe Stadien der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen (siehe 5.7) nehmen könnte. Es wird weiterhin diskutiert, welchen Einfluss exogene Zugabe von TGF-β1 (siehe 5.3) beziehungsweise endogene Produktion von TGF-β durch Endothelzellen (siehe 5.4.1) auf die Interaktion von Endothelzellen und transformierten Fibroblasten hat. Eine mögliche Wirkung von Superoxidanionen (siehe 5.4.2) und Matrixmetalloproteinasen (siehe 5.4.3) auf die Abgabe von TGF-β wird erörtert. Im Verlaufe der Untersuchungen kam es des Weiteren zu der Beobachtung, dass eine experimentell herbeigeführte Entkoppelung der NO-Synthetase durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase erzielt werden kann (siehe 5.5). 5.1 Apoptoseinduktion über Abgabe von NO durch Endothelzellen Die durchgeführten Experimente ergänzen Untersuchungen zur interzellulären Apoptoseinduktion Fibroblasten über in transformierten Peroxynitrit aus Fibroblasten der Reaktion durch nichttransformierte von Superoxidanionen transformierter Fibroblasten mit NO nichttransformierter Fibroblasten (Herdener et al., 2000). In dem vorliegenden Kapitel wird diskutiert, inwieweit dieser als NO-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion bezeichnete Vorgang auch bei der Interaktion von humanen nicht immortalisierten Endothelzellen mit transformierten Zellen stattfindet. - 87 - Diskussion Die Hemmung des Endothelzelleffekts durch L-NAME (Abb. 15), einem breit wirkenden Inhibitor von NO-Synthetasen (Zou et al., 1998), zeigt eine klare Abhängigkeit der Apoptoseinduktion von der NO-Synthese. Da damit noch nicht gezeigt ist, ob es sich dabei um Synthese durch die Endothelzellen handelt und welche Isoformen daran beteiligt sind, wurden in einem Folgeexperiment die induzierbare, die neuronale und die endotheliale NO-Synthetase der Endothelzellen herabreguliert (Abb. 18). Es zeigt sich übereinstimmend in den drei verwendeten Endothelzelllinien eine Abhängigkeit der Apoptoseinduktion in transformierten Fibroblasten durch Endothelzellen von endothelialer NO-Synthetase und in geringerem Maße von neuronaler NO-Synthetase. Jedoch hat der Einsatz von siRNA gegen induzierbare NO-Synthetase der Endothelzellen keinen Einfluss. Diese Daten sprechen für eine von NO der Endothelzellen abhängige Apoptoseinduktion über den NO-Weg und lassen sich gut vereinbaren mit einer Expression von endothelialer und gleichzeitig neuronaler NO-Synthetase in Endothelzellen aus einer Vena Saphena, aus Koronararterien und aus kleinen Lungengefäßen, wie sie für Endothelzellen aus Umbilicalvenen bereits gezeigt wurde (Bachetti et al., 2004). Auf eine Beteiligung von Superoxidanionen der Zielzellen an der Interaktion weist bereits hin, dass im Gegensatz zu transformierten Fibroblasten, die Superoxidanionen an der Außenmembran bilden (Herdener et al., 2000), nichttransformierte Fibroblasten ohne Superoxidanionenbildung keinerlei Reaktion auf die Anwesenheit von Endothelzellen zeigen (Abb. 10). Da es sich jedoch auch um einen von der Superoxidanionenbildung unabhängigen, jedoch trotzdem mit dem transformierten Status verbundenen Mechanismus handeln könnte, ist eine Herabregulation der NADPH-Oxidase, also der Quelle von Superoxidanionen transformierter Zellen an deren Außenmembran (Irani et al., 1997, Odajima et al., 2000), aussagekräftiger. Hierbei zeigt sich ebenfalls eine deutliche Hemmung der apoptoseinduzierenden Wirkung von Endothelzellen (Abb. 13A und B). Da eine Beteiligung von NO der Endothelzellen und von Superoxidanionen der transformierten Fibroblasten gezeigt ist, und da NO eine relativ hohe Reichweite hat (Lancaster, 1994), die an der Membran von transformierten Fibroblasten produzierten Superoxidanionen aber eine sehr geringe Reichweite haben (Saran und Bors, 1994), sprechen diese Ergebnisse für eine Reaktion dieser beiden Komponenten nahe der Membran der transformierten Fibroblasten. Weil die außen entstehenden Superoxidanionen die Membran nicht durchqueren können (Hassan - 88 - Diskussion und Fridovich, 1979), muss dies extrazellulär geschehen. Hierbei entsteht Peroxynitrit (Goldstein und Czapski, 1995), welches zu Lipidperoxidation an Membranen (Rubbo et al., 1994) und zu einer über Caspase 3 vermittelten Apoptoseinduktion (Lin et al., 1998) führen kann. In Experimenten mit Caspaseinhibitoren zeigte sich eine Abhängigkeit der Apoptoseinduktion in transformierten Fibroblasten durch Endothelzellen von Caspase 3 und 9, jedoch nicht von Caspase 8 (Abb. 14). Da Caspase 8 an den Signalwegen unter anderem des Fas- und des TNF-Rezeptors (Ashkenazi und Dixit, 1998) sowie des TRAILRezeptors (Martin et al., 2005) beteiligt ist, die Apoptoseinduktion jedoch von Caspase 8 unabhängig war, ist eine Apoptoseinduktion über diese rezeptorvermittelten Wege unwahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wäre die Abhängigkeit von Caspase 9 und Caspase 3 mit einer im Folgenden beschriebenen Apoptoseinduktion über eine Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran vereinbar: Lipidperoxidation bewirkt einen Verbrauch an Glutathion (Palamanda und Kehrer, 1992), in dessen Folge es zu Apoptoseinduktion kommen kann (Zucker et al., 1997). Ein Mangel an Glutathion führt unter anderem zu einer erhöhten Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies (Armstrong et al., 2002) und einer verminderten Inhibition der magnesiumabhängigen membrangebundenen Sphingomyelinase mit neutralem pH-Optimum (Liu und Hannun, 1997). Das durch die Sphingomyelinase vermehrt gebildete Ceramid kann zu einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran (Ghafourifar et al., 1999) und Bildung eines Apoptosoms aus Cytochrom C aus dem mitochondrialen Intermembranraum sowie cytosolischem Apaf-1, dATP und Procaspase 9 führen (Zou et al., 1999). Hierdurch aktivierte Caspase 9 wiederum kann Caspase 3 aktivieren (Li et al., 1997) mit nachfolgendem apoptotischem Zerfall der Zelle. Aufgrund der Zellgängigkeit von NO wäre ebenfalls eine intrazelluläre Reaktion mit Superoxidanionen der Zielzellen beispielsweise aus Komplex I und III aus deren Atmungskette (Turrens, 1997) denkbar. Hiergegen spricht, dass diese Reaktion sowohl bei transformierten als auch bei nichttransformierten Zellen auftreten müsste (vgl. Abb. 10) und dass sie nicht von Expression der NADPH-Oxidase der transformierten Fibroblasten abhängig sein dürfte (vgl. Abb. 13A und B). Eine direkte Apoptoseinduktion durch Stickstoffmonoxid ohne Beteiligung von Superoxidanionen ist ebenfalls aufgrund der selektiven Reaktionsfähigkeit von transformierten Fibroblasten (Abb. 10) und der Hemmbarkeit durch NADPH-Oxidase - 89 - Diskussion (Abb. 13A und B) sehr unwahrscheinlich. Des Weiteren steht einer analog ablaufenden, jedoch durch NO ohne Beteiligung von Superoxidanionen initiierten Apopoptoseinduktion entgegen, dass NO nicht zu Lipidperoxidation führt, sondern im Gegenteil in geeigneter Konzentration eine durch Peroxynitrit induzierte Lipidperoxidation in einem gewissen Maße hemmen kann (Rubbo et al., 1994). Insgesamt zeigen die Befunde, dass humane nicht immortalisierte, aus einer Vena Saphena, aus Koronararterien beziehungsweise aus kleinen Lungengefäßen isolierte Endothelzellen in vitro über Abgabe von Stickstoffmonoxid transformierte Zellen, die sich in ihrer Umgebung befinden, in Apoptose treiben können. Dies könnte eventuell als Kontrollschritt in frühen Stadien der Onkogenese spontan entstehende transformierte Zellen einem erhöhten Selektionsdruck aussetzen (siehe 5.6). Schema 10: Möglicher Mechanismus einer Apoptoseinduktion in transformierten Fibroblasten aufgrund einer Abgabe von NO durch Endothelzellen. (1) Endotheliale und neuronale NO-Synthetase der Endothelzellen (hemmbar durch L-NAME und Herabregulation) produzieren NO. (2) Dieses reagiert mit Superoxidanionen der NADP-Oxidase von transformierten Fibroblasten (hemmbar durch Herabregulation) zu Peroxynitrit. (3) Eine Lipidperoxidation durch Peroxynitrit bewirkt Verbrauch von Glutathion und führt dadurch zu einer verminderten Hemmung von magnesiumabhängiger membrangebundener Sphingomyelinase mit neutralem pH-Optimum. (4) Hierdurch entsteht vermehrt Ceramid, welches zu einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran führt. (5) Aus dem mitochondrialen Intermembranraum austretendes Cytochrom C führt zur Bildung eines Apoptosoms aus Cyochrom C, Procaspase 9, dATP und Apaf-1. (6) Die dadurch aktivierte Caspase 9 (hemmbar durch Caspase-9-Inhibitor) wiederum aktiviert Caspase 3 (hemmbar durch Caspase-3-Inhibitor), was zu Proteolyse und apoptotischem Zerfall der Zelle führt. (*) Für eine Beteiligung von induzierbarer NO-Synthetase der Endothelzellen (hemmbar durch L-NAME und Herabregulation) sowie einer rezeptorvermittelten Apoptoseinduktion über Caspase 8 der transformierten Fibroblasten (hemmbar durch Caspase-8-Inhibitor) konnten experimentell keine Hinweise gefunden werden. - 90 - 5.2 Apoptoseinduktion über Diskussion Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen Untersuchungen zur Wirkung von nichttransformierten Fibroblasten auf transformierte Fibroblasten deuten auf eine Umsetzung von Wasserstoffperoxid aus der Dismutation von Superoxidanionen transformierter Zellen durch eine Peroxidase nichttransformierter Zellen in HOCl hin, welches wiederum mit Superoxidanionen transformierter Zellen Hydroxylradikale bildet und so Apoptose induziert (HOCl-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion, Herdener et al., 2000). In einer Reihe von Experimenten wurde nun untersucht, inwieweit eine analoge Reaktionsfolge bei der Interaktion von Endothelzellen mit transformierten Fibroblasten besteht. Im Vordergrund stand insbesondere die Abgabe einer Peroxidase durch Endothelzellen, da diese zur interzellulären Apoptoseinduktion über den HOCl-Weg benötigt wird und gleichzeitig über die Bildung von HOCl möglicherweise zur Oxidation von LDL in atherosklerotischen Läsionen beintragen könnte (Zouaoui Boudjeltia et al., 2004). Um Hinweise auf eine mögliche Bildung von HOCl unter Beteiligung einer durch Endothelzellen abgegebenen Peroxidase zu erhalten, ist eine Herabregulation der dualen Oxidase dieser Zellen geeignet. Diese ist membranständig und funktioniert als NADPH-Oxidase, besitzt aber gleichzeitig eine Peroxidaseuntereinheit. Ein Ca2+bindender Bereich sowie eine Bindungsstelle für NADPH befinden sich an der cytosolischen Seite der Membran, während sich die Peroxidaseuntereinheit an der Außenseite befindet (Lambeth, 2002). In den Untersuchungen mit einer Herabregulation der Proteinsynthese der dualen Oxidase von Endothelzellen lässt sich eine starke Hemmung des Endothelzelleffekts in allen drei verwendeten Zelllinien erkennen (Abb. 19). Dies zeigt eine Beteiligung des Enzyms am Endothelzelleffekt, die entweder auf einer Wirkung von Reaktionsprodukten innerhalb der Endothelzellen, der Abgabe von Molekülen mit hoher Reichweite durch die Zellen oder aber auf einer Abgabe des Enzyms durch die Endothelzellen beruhen könnte. Da andere Zelllinien Peroxidase abgeben (Herdener et al., 2000, Portess et al., 2007), wurde mit Hilfe eines speziellen Versuchsaufbaus zum Nachweis von Peroxidase im Überstand von Zellen (Ophoven, in Vorbereitung, siehe 3.2.5) untersucht, ob sich im Überstand von Endothelzellen Peroxidaseaktivität befindet. Diese Versuchsanordnung beruht auf einer Kompetition von Peroxidase aus dem Überstand von zu untersuchenden Zellen mit dem Enzymmimetikum Euk-8 in - 91 - Diskussion Anwesenheit von transformierten Fibroblasten. Dabei führt Euk-8 zu einer deutlich stärkeren Apoptoseinduktion als die im untersuchten Überstand befindliche Peroxidase, so dass eine hohe Peroxidasekonzentration im Überstand zu einer Verringerung der Apoptoseinduktion führt. Die Spezifität der Ergebnisse wird durch den sehr spezifischen Peroxidaseinhibitor ABH sichergestellt. In den durchgeführten Experimenten zeigt sich das Vorhandensein eines durch ABH hemmbaren Enzyms, also einer Peroxidase im Überstand von Endothelzellen (Abb. 23, Abb. 30). Hierfür kämen neben der membranständigen dualen Oxidase alle intrazellulären durch Endothelzellen exprimierten Enzyme mit Peroxidaseaktivität infrage. Weitere Untersuchungen des Überstands nun unter Herabregulation der Proteinsynthese der dualen Oxidase zeigen, dass die im Überstand gemessene Menge an Peroxidase unter Herabregulation der dualen Oxidase stark absinkt (Abb. 19, Abb. 30). Auch wenn es bei der Herabregulation von Proteinsynthese mit Hilfe von siRNA unter Umständen zur Wirkung auch auf andere als die Zielstrukturen kommen kann, ist dies doch ein starkes Indiz dafür, dass die duale Oxidase tatsächlich für eine Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen zumindest mitverantwortlich ist. Diese Abgabe könnte über eine proteolytische Abspaltung der Peroxidaseuntereinheit von der membranständigen dualen Oxidase (Lambeth, 2002) an der Außenmembran erfolgen oder zum Beispiel über eine Abgabe von Vesikeln. Für eine proteolytische Abtrennung der Peroxidase spricht, dass die Zugabe von Galardin, einem relativ wenig spezifischen extrazellulären Proteaseinhibitor, der unter anderem mehrere Matrixmetalloproteinasen hemmt (Yamamoto et al., 1998), zu einer Verminderung der im Überstand des Mediums von Endothelzellen vorhandenen Peroxidase führt (Abb. 25, Abb. 30). Die Hemmung ist von der Konzentration des Inhibitors abhängig und erreicht bereits bei 3,3µM einen deutlichen Effekt (Abb. 25). Da einerseits eine Produktion von Matrixmetalloproteinase 1, 2, 9 und 14 durch Endothelzellen und eine Abgabe von Matrixmetalloproteinasen über eine Abschnürung von Vesikeln gezeigt wurde (Taraboletti et al., 2002), andererseits Galardin diese Proteasen hemmt (Yamamoto et al., 1998), ist die Hemmung einer für die Loslösung von Peroxidase von der endothelialen Außenmembran notwendigen Proteolyse durch eine oder mehrere der genannten Proteasen durch Galardin plausibel. Ebenfalls denkbar wäre, dass Vesikel mit dualer Oxidase und Matrixmetalloproteinasen abgegeben werden und dass die Proteolyse erst zu einem späteren Zeitpunkt erfolgt. Die Befunde für die drei verwendeten Endothelzelllinien - 92 deuten also insgesamt auf eine Diskussion proteolytische Abspaltung der Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase mit Hilfe von Matrixmetalloproteinasen und eine Abgabe in die Umgebung hin. Die dabei erreichte Aktivität der abgegebenen Peroxidase kann mit Hilfe des gewählten Versuchsaufbaus nur äußerst grob geschätzt werden. Zeitgleich wurde innerhalb eines Experiments die Kompetition von Euk-8 mit Myeloperoxidase (Abb. 6) und mit Überstand des Mediums von Endothelzellen (Abb. 23) verglichen. Vergleicht man die Verminderung des Anteils apoptotischer transformierter Fibroblasten durch Konzentrationen von 25100 mU/ml Myeloperoxidase gegenüber der Kontrolle mit ABH mit dem Effekt des Überstands von Medium der Endothelzellen in unterschiedlicher Verdünnung, so ergibt sich bei Annahme eines linearen Verlaufs zwischen den Messpunkten eine Aktivität der abgegebenen Peroxidase, die mit der Aktivität von 426mU/ml Myeloperoxidase bei einer Standardabweichung von 141mU/ml vergleichbar ist (zur Berechnung siehe 3.2.6.3). Jedoch muss bei der Interpretation dieser eher spekulativen Aussage beachtet werden, dass sie auf sehr wenigen Messpunkten beruht, dass sie einen konstanten Zusammenhang zwischen Peroxidaseaktivität und Änderung des Anteils apoptotischer Zellen bei unterschiedlichen Ausgangspunkten des Anteils apoptotischer Zellen unterstellt, und dass unbekannte möglicherweise im Überstand vorhandene beeinflussende Faktoren, die bei alleiniger Zugabe von Myeloperoxidase nicht vorhanden sind, nicht berücksichtigt werden. Die Befunde zeigen, dass die drei verwendeten humanen nichtimmortalisierten Endothelzelllinien in vitro Peroxidase mit hoher Wahrscheinlichkeit durch proteolytische Abspaltung der Peroxidaseuntereinheit von dualer Oxidase abgeben können. Diese bisher bei Endothelzellen nicht beschriebene Funktion könnte eine Apoptoseinduktion bei transformierten Zellen über den HOCl-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion ermöglichen sowie zu einer Oxidation von LDL in atherosklerotischen Läsionen beitragen (siehe 5.7). Eine Reihe weiterer Untersuchungen konzentriert sich darauf, zu ermitteln, ob es bei der direkten Interaktion von Endothelzellen mit transformierten Fibroblasten zu einer Apoptoseinduktion über den von Superoxidanionen transformierter Zellen und Peroxidaseabgabe nichttransformierter Zellen abhängigen HOCl-Weg mit Bildung von Hydroxylradikalen kommt (Herdener et al., 2000). Diese Experimente dienten gleichzeitig dazu, durch weitere Versuchsanordnungen die tatsächliche Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen zu kontrollieren. - 93 - Diskussion Bereits im Zusammenhang mit dem NO-Weg wurde eine grundsätzliche Beteiligung von Superoxidanionen transformierter Zellen am Endothelzelleffekt gezeigt (siehe 5.1). So bewirkt die Anwesenheit von Endothelzellen bei transformierten Zellen eine zusätzliche Apoptoseinduktion, nicht jedoch bei nichttransformierten Zellen (Abb. 10), weiterhin wird der Endothelzelleffekt durch Herabregulation der NADPH-Oxidase gehemmt (Abb. 13A und B), welche für die Superoxidanionenproduktion transformierter Zellen verantwortlich ist (Irani et al., 1997, Odajima et al., 2000). Diese Befunde für sich genommen lassen sich jedoch unter anderem sowohl mit einem Ablaufen des NO-Weges als auch des HOCl-Weges gut vereinbaren, so dass durch Betrachtung weiterer Experimente zwischen diesen beiden Reaktionswegen unterschieden werden muss. Eine Hemmbarkeit des Endothelzelleffekts durch Taurin (Abb. 15), welches mit HOCl das wesentlich inaktivere Taurinchloramin bildet (Wright et al., 1986), deutet auf eine Beteiligung von HOCl an der Interaktion hin. Jedoch bestehen Hinweise auf eine Hemmung der Induktion von NO-Synthese der induzierbaren NO-Synthetase durch das bei der Reaktion entstandene Taurinchloramin (Park et al., 1993, Marcinkiewicz et al., 1995). Die Herabregulation von induzierbarer NO-Synthetase in Endothelzellen zeigte keinen Einfluss auf den Endothelzelleffekt (Abb. 18), so dass auch eine mögliche Hemmung von deren Induktion durch Taurinchloramin keinen Einfluss haben sollte. Eine Beeinflussung des Ergebnisses durch die Hemmung einer grundsätzlich denkbaren Induktion von induzierbarer NO-Synthetase der transformierten Fibroblasten kann mit den beschriebenen Experimenten jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Die Experimente zeigen also die Beteiligung von Superoxidanionen transformierter Zellen (Abb. 10, Abb. 13A und B) und deuten auf eine Beteiligung von HOCl hin (Abb. 15). Superoxidanionen können mit HOCl zu Hydroxylradikalen reagieren (Candeias et al., 1993, Long und Bielski, 1980), welche Lipidperoxidation bewirken können (Tsujimoto et al., 1998). Somit lässt sich die Hemmbarkeit des Endothelzelleffekts durch Zugabe von Mannitol (Abb. 16), eines Fängers von Hydroxylradikalen (Shen et al., 1997), gut mit einer Bedeutung dieser Reaktion für die Wirkung von Endothelzellen auf transformierte Fibroblasten und damit mit einem Ablaufen des HOCl-Weges vereinbaren. Mannitol greift jedoch durch Abfangen von Hydroxylradikalen auch in die Haber-Weiss-Reaktion ein, bei der Hydroxylradikale durch Übertragung eines Elektrons von Fe2+-Ionen auf Wasserstoffperoxid entstehen (Schimmel und Bauer, 2002). Eine Stimulation der Superoxidanionenproduktion in - 94 - Diskussion transformierten Fibroblasten durch Endothelzellen mit dadurch verstärkt ablaufender Haber-Weiss-Reaktion wäre denkbar und könnte in Verbindung mit anderen Glutathion verbrauchenden Prozessen zu dem beobachteten Effekt beitragen. Im Zusammenhang mit dem NO-Weg (siehe 5.1) wurde bereits eine Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von den Caspasen 9 und 3, jedoch nicht von Caspase 8, beschrieben (Abb. 14). Eine Lipidperoxidation durch Hydroxylradikale könnte beim Ablaufen des HOCl-Weges analog über einen Verbrauch an Glutathion (Palamanda und Kehrer, 1992) und verminderte Hemmung der magnesiumabhängigen membrangebundenen Sphingomyelinase mit neutralem pH-Optimum (Liu und Hannun, 1997) zu vermehrter Ceramidsynthese und einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran führen (Ghafourifar et al., 1999). Die anschließende Bildung eines Apoptosoms (Zou et al., 1999) kann über Aktivierung von Caspase 9 zu einer Aktivierung von Caspase 3 (Li et al., 1997) und anschließendem apoptotischem Zerfall der Zelle führen. Die gezeigten Experimente weisen also auf eine Abhängigkeit des Endothelzelleffekts von Superoxidanionen, HOCl, Hydroxylradikalen sowie Caspase 9 und Caspase 3 hin und lassen sich in Verbindung mit der gezeigten Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen sehr gut mit dem im Zusammenhang mit der Wirkung von nichttransformierten Fibroblasten auf transformierte Fibroblasten gezeigten HOCl-Weg vereinbaren (Herdener et al., 2000). Es kommt also zu einer Umsetzung von Wasserstoffperoxid aus der Dismutation von Superoxidanionen (Fridovich, 1983) der NADPH-Oxidase transformierter Zellen durch Peroxidase der Endothelzellen in HOCl, welches durch Reaktion mit Superoxidanionen der transformierten Zellen Hydroxylradikale bildet und über eine Lipidperoxidation Apoptose induzieren kann. Die drei verwendeten humanen nichtimmortalisierten Endothelzelllinien können also in vitro ähnlich wie über den NO-Weg auch über den HOCl-Weg in ihrer Umgebung befindliche transformierte Zellen in Apoptose treiben. Dies könnte spontan transformierte Zellen einem verstärkten Selektionsdruck aussetzen (siehe 5.6). Weiterhin bestätigen diese Befunde die Abgabe einer endothelzelleigenen Peroxidase, welche möglicherweise eine Rolle in frühen Stadien der Entstehung atherosklerotischer Läsionen spielen könnte (siehe 5.7). - 95 - Diskussion Schema 11: Möglicher Mechanismus einer Apoptoseinduktion in transformierten Fibroblasten aufgrund einer Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen. (1) Endothelzellen exprimieren die membranständige duale Oxidase (hemmbar durch Herabregulation), die eine NADPH-OxidaseAktivität und eine Peroxidaseuntereinheit besitzt. (2) Matrixmetalloproteinasen (hemmbar durch Galardin) trennen die Peroxidaseuntereinheit ab, so dass diese sich frei im Medium bewegen kann. (3) Die NADPH-Oxidase transformierter Zellen (hemmbar durch Herabregulation) bildet Superoxidanionen, welche spontan zu Wasserstoffperoxid dismutieren. (4) Die von Endothelzellen abgegebene Peroxidase (hemmbar durch ABH) nutzt Wasserstoffperoxid als Substrat für die Bildung von HOCl (hemmbar durch den Fänger Taurin). (5) Dieses bildet zusammen mit Superoxidanionen der NADPH-Oxidase der transformierten Zellen Hydroxylradikale (hemmbar durch den Fänger Mannitol), welche Lipidperoxidation bewirken können. (6) Lipidperoxidation durch Hydroxylradikale bewirkt Verbrauch von Glutathion und führt dadurch zu einer verminderten Hemmung von magnesiumabhängiger membrangebundener Sphingomyelinase mit neutralem pH-Optimum. (7) Hierdurch entsteht vermehrt Ceramid, welches zu einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran führt. (8) Aus dem mitochondrialen Intermembranraum austretendes Cytochrom C führt zur Bildung eines Apoptosoms aus Cyochrom C, Procaspase 9, dATP und Apaf-1. (9) Die dadurch aktivierte Caspase 9 (hemmbar durch Caspase-9-Inhibitor) wiederum aktiviert Caspase 3 (hemmbar durch Caspase-3-Inhibitor), was zu Proteolyse und apoptotischem Zerfall der Zelle führt. (*) Für eine Beteiligung einer rezeptorvermittelten Apoptoseinduktion über Caspase 8 der transformierten Fibroblasten (hemmbar durch Caspase-8-Inhibitor) konnten experimentell keine Hinweise gefunden werden. - 96 - 5.3 Diskussion Einfluss von TGF-β1 auf die Abgabe von NO und Peroxidase Die Anwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 führt zu einer Steigerung der zusätzlichen Apoptoseinduktion bei transformierten Fibroblasten in Anwesenheit von Endothelzellen (Abb. 10), dem entgegengesetzt führt eine Herabregulation der endogenen TGF-β1-Bildung bzw. des TGF-β-Rezeptors zu einer Verminderung dieses Effekts (Abb. 21). Dies zeigt einen Einfluss von TGF-β1 auf die Wirkung von Endothelzellen auf transformierte Fibroblasten, gleichzeitig bestehen Hinweise auf eine Steigerung der NO-Abgabe durch TGF-β1 (Inoue et al., 1995). Um Aufschluss über die Art der durch TGF-β1 hervorgerufenen Veränderungen zu erhalten, wurde die endogene TGF-β1-Bildung in Abwesenheit von exogenem TGFβ1 unter Zugabe von Inhibitoren herabreguliert. Dass der dann verbleibende Effekt von Endothelzellen auf transformierte Fibroblasten sich durch Zugabe von L-NAME, also einem Hemmstoff der NO-Synthese weiter hemmen lässt (Abb. 22), zeigt, dass der NO-Weg zumindest in einem gewissen Maße weiter ablaufen kann. Dies spricht eher gegen eine starke Beeinflussung der NO-Abgabe durch TGF-β1 in der verwendeten Endothelzelllinie aus einer humanen Vena Saphena, schließt diese jedoch nicht aus. Während als zugrunde liegender Mechanismus für die verstärkte Apoptoseinduktion durch TGF-β1 also eine Steigerung der NO-Abgabe durch Endothelzellen eher unwahrscheinlich zu sein scheint, wäre alternativ eine verstärkte Sensitivierung der transformierten Zielzellen durch das im Medium vorhandene TGF-β1 oder die Steigerung der Sekretion anderer Substanzen durch Endothelzellen in Anwesenheit von TGF-β1 denkbar. Hierfür käme unter anderem eine gesteigerte Abgabe von Peroxidase in Betracht (Portess et al., 2007). Die Experimente zum Nachweis von Peroxidase im Überstand des Mediums von Endothelzellen wurden zusätzlich mit Medium mit TGF-β1 behandelter Endothelzellen durchgeführt. Sie zeigen eine gering ausgeprägte Steigerung der im Überstand des Mediums vorhandenen Peroxidase (Abb. 23, Abb. 26). Die Peroxidaseabgabe in Anwesenheit von TGF-β1 ist ebenfalls wie die in Abwesenheit von TGF-β1-Zugabe übereinstimmend bei den drei verwendeten Endothelzelllinien abhängig von dualer Oxidase (Abb. 24, Abb. 30) und Proteasen (Abb. 25, Abb. 30). Dies deutet auf eine Steigerung der Peroxidaseabgabe durch exogen zugegebenes TGF-β1 über duale Oxidase hin. Da auch Hinweise auf eine endogene TGF-β1-Produktion durch Endothelzellen - 97 - Diskussion bestehen (Briones et al., 2001), ist eine Beeinflussung der Peroxidaseabgabe durch TGF-β1 auch ohne exogene Zugabe möglich. Die Hemmbarkeit des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der endogenen TGF-β1-Produktion beziehungsweise des TGF-β-Rezeptors in Abwesenheit von exogener TGF-β1Zugabe (Abb. 21) deutet auf einen Einfluss von endogenem TGF-β1 hin. Der unter Herabregulation der endogenen TGF-β1-Synthese verbleibende Endothelzelleffekt wird durch Anwesenheit von Taurin, welches HOCl unter Bildung von wenig reaktivem Taurinchloramin abfängt, nur geringfügig weiter gehemmt (Abb. 22), während die Zugabe von Taurin ohne Herabregulation zu einer deutlichen Hemmung des Endothelzelleffekts führt (Abb. 15). Somit spielt der HOCl-Weg in Abwesenheit sowohl von exogenem als auch von endogen produziertem TGF-β1 nur eine geringe Rolle. Dies erhärtet den Verdacht, dass neben exogen zugegebenem TGF-β1 auch endogen produziertes TGF-β1 über eine Steigerung der Peroxidaseabgabe zum Endothelzelleffekt beitragen könnte. Jedoch ist nicht geklärt, in welcher Weise eine Aktivierung des TGF-β-Rezeptors über die duale Oxidase zu gesteigerter Abgabe von Peroxidase führt. Denkbar wäre eine Steigerung der Expression der dualen Oxidase oder eine vermehrte Abgabe von Peroxidase. Diese könnte über eine Steigerung der Aktivität von Matrixmetalloproteinasen, beispielsweise von MMP-9 (Behzadian et al., 2001), durch TGF-β1 erfolgen oder aber theoretisch über eine Steigerung der Aktivität abgegebener Peroxidase durch einen von TGF-β1abhängigen Prozess. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass TGF-β1 die durch Peroxidaseabgabe vermittelte Wirkung von Endothelzellen auf transformierte Zellen sowie möglicherweise auf Prozesse im Rahmen der Atheroskleroseentstehung verstärken könnte. - 98 - Diskussion Schema 12: Möglicher Mechanismus einer Steigerung der Peroxidaseabgabe von Endothelzellen durch TGF-β1. (1) Sowohl durch Endothelzellen produziertes TGF-β1 (hemmbar durch Herabregulation) als auch in der Umgebung vorhandenes TGF-β1 (simulierbar durch Zugabe) greifen am TGF-Rezeptor (hemmbar durch Herabregulation) an. (2) Dies führt auf einem noch ungeklärten Weg zu einer Steigerung der Peroxidaseabgabe über duale Oxidase (hemmbar durch Herabregulation). (3) Die Abgabe von Peroxidase (hemmbar durch ABH) ist abhängig von Matrixmetalloproteinasen (hemmbar durch Galardin) 5.4 Abgabe von TGF-β1 durch Endothelzellen 5.4.1 Abgabe von TGF-β1 beeinflusst den Endothelzelleffekt Wie beschrieben (siehe 5.3) deuten mehrere im Rahmen der Arbeit durchgeführte Experimente auf eine endogene Produktion von TGF-β durch Endothelzellen hin. Insbesondere führte eine Herabregulation der Proteinsynthese von TGF-β1 beziehungsweise des TGF-β-Rezeptors (Abb. 21) in Endothelzellen aus einer humanen Vena Saphena zu einer Verminderung der beobachteten zusätzlichen Apoptoseinduktion bei transformierten Fibroblasten in Anwesenheit dieser Zellen, also einer Verminderung des Endothelzelleffekts. Diese Befunde stehen im Einklang - 99 - Diskussion mit Beobachtungen einer TGF-β1-Synthese durch Endothelzellen aus humanen Umbilicalvenen sowie einer Bildung von TGF-β1 und TGF-β2 durch humane koronararterielle Endothelzellen (Briones et al., 2001). Die Ergebnisse von Experimenten mit Zugabe eines Fängers von HOCl bzw. eines Inhibitors der NOSynthese bei gleichzeitiger Herabregulation der endogenen Synthese von TGF-β1 (Abb. 22) deuten darauf hin, dass endogenes TGF-β1 die Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen steigern kann, jedoch keinen in dem gewählten Testsystem messbaren Einfluss auf deren NO-Synthese hat. Befunde einer Steigerung der Peroxidaseabgabe und der NO-Synthese nichttransformierter Fibroblasten durch TGF-β1 (Inoue et al., 1995) führen zu der Frage, inwieweit durch Endothelzellen produziertes TGF-β1 eine direkte Wirkung auch auf die in den Tropfenexperimenten verwendeten transformierten Fibroblasten ausüben kann. Die inkomplette Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der dualen Oxidase der Zielzellen (Abb. 13C und D) weist auf die Beteiligung einer Stimulation der Peroxidaseabgabe der Zielzellen durch Anwesenheit von Endothelzellen hin. Ein Einfluss von TGF-β1 auf diese Stimulation wäre denkbar, jedoch sind für eine Klärung dieser Frage und der einer möglichen Stimulation der NO-Synthese in den transformierten Fibroblasten weitere Untersuchungen notwendig. 5.4.2 Möglicher Einfluss der endothelialen NADPH-Oxidase Endothelzellen besitzen die Isoformen 1, 2 und 4 der NADPH-Oxidase, diese stellen eine der Hauptquellen von Superoxidanionen in Endothelzellen dar (Ago et al., 2005) und weisen untereinander starke Homologien auf (Lambeth, 2002). Eine NADPH-Oxidase-Aktivität wurde in mehreren subzellulären Lokalisationen von Endothelzellen nachgewiesen, sie tritt sowohl in einem relativ geringen Maße an der Zelloberfläche membrangebunden (Lassègue und Clempus, 2003) als auch zu einem größeren Anteil intrazellulär an das Zytoskelett gebunden auf (Li und Shah, 2002) und produziert somit sowohl intrazellulär als auch extrazellulär Superoxidanionen. In den durchgeführten Tropfenexperimenten zeigt sich eine Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der Proteinsynthese der Isoform 1 der endothelialen NADPH-Oxidase in Abwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 (Abb. 20). Diese könnte grundsätzlich unter anderem auf eine Verminderung der endothelialen Abgabe von NO (siehe 5.1), von Peroxidase (siehe 5.2) oder von TGF-β1 (siehe 5.4.1) zurückzuführen sein. Eine Verminderung - 100 - Diskussion der NO-Abgabe ist eher unwahrscheinlich, da bekannt ist, dass in Endothelzellen durch NADPH-Oxidase intrazellulär produzierte Superoxidanionen mit NO zu Peroxynitrit reagieren können (Goldstein und Czapski, 1995), und dass dieses über eine Oxidation des Kofaktors Tetrahydrobiopterin zu einer Entkoppelung der NOSynthetase und damit einer verminderten NO-Synthese führen kann (Moens und Kass, 2006). Dagegen zeigt sich in Kompetitionsexperimenten zum Nachweis von Peroxidase im Überstand des Mediums von Endothelzellen, dass Zellen der drei verwendeten Zelllinien übereinstimmend unter Herabregulation der NADPH-Oxidase 1 eine geringere Menge an Peroxidase freisetzen, jedoch tritt diese Verminderung der Peroxidaseabgabe nicht auf, wenn die Endothelzellen in Anwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 kultiviert werden (Abb. 26, Abb. 30). Diese Befunde sind also Hinweise darauf, dass die NADPH-Oxidase 1 der Endothelzellen einen steigernden Effekt auf die Abgabe von Peroxidase hat, der in Ansätzen mit exogener Zugabe von TGF-β1 nicht auftritt. Einerseits führt die Herabregulation der Proteinsynthese von TGF-β1 beziehungsweise des TGF-β-Rezeptors (Abb. 21) zu einer am ehesten durch verminderte Peroxidaseabgabe (siehe 5.3) erklärbaren Verminderung des Endothelzelleffekts, andererseits tritt unter Herabregulation der NADPH-Oxidase 1 ebenso eine Verminderung der Peroxidaseabgabe auf, welche jedoch wiederum durch Zugabe von exogenem TGF-β1 aufhebbar ist. Somit scheint ein Zusammenhang zwischen der NADPH-Oxidase 1 und TGF-β1 zu bestehen. Ein denkbarer Zusammenhang wäre, dass TGF-β1 die Herabregulation der NADPHOxidase 1 durch Aktvierung anderer Enzyme ausgleicht, die die Verminderung der endothelialen Superoxidanionenkonzentration aufheben und so zu einem Zellstatus führen, der den Zellen ohne Herabregulation der NADPH-Oxidase entspricht. Untersuchungen an anderen Zelllinien deuten auf die Möglichkeit hin, dass diese Verminderung durch eine Stimulation der Isoform 2 (Lassègue und Clempus, 2003) beziehungsweise der Isoform 4 der NADPH-Oxidase durch TGF-β1 (Rocic und Lucchesi, 2005), ausgeglichen werden könnte. Ebenso wäre der Ausgleich der Superoxidanionenkonzentration über eine Stimulation oxidativer oder eine Hemmung antioxidativer Enzyme durch TGF-β1, beispielsweise der γ-Glutamylcystein- Synthetase (Jardine et al., 2002), denkbar. Für eine andere Erklärung, nämlich die Wirkung einer Veränderung der Superoxidanionenproduktion auf die Aktivität von TGF-β1 spricht jedoch, dass durch Bestrahlung bzw. durch oxidative Prozesse experimentell erzeugte reaktive Sauerstoffspezies zu einer Aktivierung von TGF-β1 - 101 - Diskussion führen können (Barcellos-Hoff und Dix, 1996). Eine teilweise durch NADPHOxidase 1 ermöglichte Aktivierung von endogen produziertem TGF-β1 würde in diesem Falle die Abgabe von Peroxidase und damit den vollständig ausgeprägten Endothelzelleffekt ermöglichen. Dieses Modell steht im Einklang mit dem Befund, dass eine Herabregulation der NADPH-Oxidase nur in Abwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 zu einer Verminderung der Peroxidaseabgabe und des Endothelzelleffekts führt, da unter exogener Zugabe bereits ausreichend aktiviertes TGF-β1 vorhanden ist, so dass sich eine mangelnde Aktivierung des endogen produzierten TGF-β1 nicht auswirkt. Schema 13: Möglicher Mechanismus einer Beeinflussung der TGF-β-Abgabe durch NADPHOxidase. (1) Endothelzellen besitzen mehrere Isoformen der NADPH-Oxidase (Isoform 1 hemmbar durch Herabregulation), diese setzen sowohl intrazellulär als auch in geringerem Maße extrazellulär Sauerstoff in Superoxidanionen um. (2) Endogen zunächst in einer inaktiven Form sezerniertes TGFβ1 (hemmbar durch Herabregulation) und TGF-β2 kann durch Superoxidanionen der NADPHOxidase aktiviert werden. (3) Sowohl in der Umgebung vorhandenes TGF-β1 (simulierbar durch Zugabe) als auch aktiviertes endogen produziertes TGF-β1 und TGF-β2 wirken auf den TGF-βRezeptor 2. (4) Eine Aktivierung des TGF-β-Rezeptors 2 führt zu einer Stimulation der NADPHOxidase sowie auf noch ungeklärtem Wege zu einer Stimulation der dualen Oxidase. - 102 - Diskussion 5.4.3 Möglicher Einfluss von Matrixmetalloproteinasen Endothelzellen bilden die Matrixmetalloproteinasen 1, 2, 9 und 14 (Taraboletti et al., 2002). Bei retinalen Endothelzellen besteht ein steigernder Einfluss von TGF-β auf die Produktion der Matrixmetalloproteinase 9 (Behzadian et al., 2001). Ebenso steigert TGF-β die Produktion der Isoformen 2 und/oder 9 bei Fibroblasten (Stuelten et al., 2005, Saed et al., 2000) und Gliomzellen (Wick et al., 2001) sowie die einer Vielzahl an Matrixmetalloproteinasen kornealer Epithelzellen (Kim et al., 2004). Bei der Interpretation dieser Daten ist zu beachten, dass TGF-β unter Umständen gleichzeitig die Produktion von Inhibitoren der Matrixmetalloproteinasen steigern kann, so dass der durch TGF-β bewirkte Effekt einer Steigerung der Sekretion proteolytischer Enzyme aufgehoben oder umgekehrt werden kann (Puyraimond et al., 1999). Jedoch bewirkt TGF-β eine von Matrixmetalloproteinase 9 abhängige Permeabilisierung als Monolayer kultivierter retinaler Endothelzellen (Behzadian et al., 2001), was auf eine verstärkte Proteolyse hinweist und im Einklang mit einer Bedeutung von Matrixmetalloproteinasen für endotheliale Permeabilität (Alexander und Elrod, 2002) und Angiogenese (Taraboletti et al., 2002) steht. Gleichzeitig bestehen Hinweise auf eine relativ gering ausgeprägte Aktivierung von TGF-β1, jedoch eine starke Aktivierung von TGF-β2 und TGF-β3 durch Matrixmetalloproteinase 9 (Yu und Stamenkovic, 2000). In Endothelzellen aus humanen Umbilicalvenen wurde die Bildung von TGF-β1 und in Endothelzellen aus humanen Koronararterien diejenige von TGF-β1 und TGF-β2 nachgewiesen (Briones et al., 2001). Ebenso weisen mehrere im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Experimente auf eine endogene Produktion von TGF-β hin (siehe 5.4.1). Es wäre also ein Kreislauf denkbar, in dem die Produktion von TGF-β durch Endothelzellen zu einer autokrinen Stimulation der Abgabe von Matrixmetalloproteinase 9 führt. Diese könnte endogen produziertes TGF-β1 und TGF-β2 aktivieren und damit wiederum zu einer verstärkten Produktion von Matrixmetalloproteinase 9 führen. Ein derartiger Prozess könnte möglicherweise durch exogene Zugabe von TGF-β1 in Gang gebracht oder verstärkt werden, ebenso könnte er sich ergänzen mit der beschriebenen Möglichkeit einer Aktivierung von TGF-β durch reaktive Sauerstoffspezies beispielsweise der durch TGF-β aktivierbaren NADPH-Oxidase (siehe 5.4.2). Dieses Modell ließe sich außerdem gut vereinbaren mit einer Steigerung der Peroxidaseabgabe von Endothelzellen durch - 103 - Diskussion TGF-β1 (siehe 5.3) über eine Steigerung der Aktivität von Matrixmetalloproteinasen. In diesem Falle könnte Galardin, ein Hemmstoff von Proteasen, der unter anderem die Matrixmetalloproteinasen 1, 2, 9 und 14 hemmt (Yamamoto et al., 1998), seinen vermindernden Einfluss auf die Peroxidasemenge im Überstand des Mediums von Endothelzellen (siehe 5.2) sowohl über eine Verminderung der Freisetzung der Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase als auch über eine verminderte Aktivierung von TGF-β bewirken. Dass allerdings Galardin die Peroxidasefreisetzung in Anwesenheit einer exogenen Zugabe von TGF-β1 ähnlich stark hemmt wie in deren Abwesenheit (Abb. 25, Abb. 30), spricht dafür, dass der TGF-β-unabhängige Prozess einer potentiellen Hemmung der proteolytischen Abspaltung der Peroxidaseuntereinheit von der dualen Oxidase durch Galardin alleine ausreicht, um die Peroxidaseabgabe stark zu hemmen. Um ein abschließendes Bild der Rolle von Matrixmetalloproteinasen und NADPH-Oxidase im Zusammenhang mit TGF-β1 und der Freisetzung von Peroxidase zu erhalten, werden jedoch weitere Experimente benötigt. - 104 - Diskussion Schema 14: Möglicher Mechanismus einer Beeinflussung der TGF-β-Abgabe durch Matrixmetalloproteinase 9 und NADPH-Oxidase. (1) In der Umgebung vorhandenes TGF-β1 (simulierbar durch Zugabe) sowie bereits aktiviertes durch Endothelzellen produziertes TGF-β1 (hemmbar durch Herabregulation) und TGF-β2 aktivieren den TGF-β-Rezeptor 2 (hemmbar durch Herabregulation). (2) Hierdurch kommt es zu einer Verstärkung der Abgabe von Matrixmetalloproteinase 9 (hemmbar durch Galardin). (3) Diese führt zu einer proteolytischen Ablösung der Peroxidaseuntereinheit von der dualen Oxidase (hemmbar durch Herabregulation). (4) Desweiteren führt die Matrixmetalloproteinase 9 zu einer Aktivierung des von Endothelzellen sezernierten TGF-β1 und TGF-β2. (5) Die dadurch verstärkte Aktivierung des TGF-β-Rezeptors 2 führt neben der Steigerung der Abgabe von Matrixmetalloproteinase 9 zu einer gesteigerten Aktivität der intrazellulären sowie der membrangebundenen NADPH-Oxidase (hemmbar durch Herabregulation). (6) Die hierbei entstehenden Superoxidanionen tragen gemeinsam mit der Matrixmetalloproteinase 9 zu einer Aktivierung von TGF-β1 und TGF-β2 bei. (7) Die duale Oxidase wird möglichweise zusätzlich direkt durch Aktivierung des TGF-β-Rezeptors 2 stimuliert. - 105 - 5.5 Diskussion Cytochrom P450-Oxidoreduktase und NO-Synthese Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Endothelzellen besitzen sehr wahrscheinlich sowohl eine Aktivität endothelialer als auch in geringerem Umfang neuronaler NO-Synthetase (siehe 5.1). Diese bilden unter Beteiligung des Kofaktors Tetrahydrobiopterin N-Hydroxyl-Arginin aus Arginin und setzen dieses anschließend in Citrullin und NO um (Knowles und Moncada, 1994). Die StickstoffmonoxidProduktion wird kontrolliert durch Umsetzung von NO in NO3- unter Verbrauch von NADPH durch NO-Dioxygenase (Gardner et al., 1998), welche an die Cytochrom P450-Oxidoreduktase gekoppelt ist und diese zur Funktion benötigt (Hallstrom et al., 2004). Gleichzeitig bestehen sowohl strukturell als auch in Bezug auf die ablaufenden Teilreaktionen Ähnlichkeiten der NO-Synthetasen mit der Cytochrom P450-Oxidoreduktase (Knowles und Moncada, 1994). Im Zytosol von Endothelzellen werden sowohl NO als auch Superoxidanionen (Li und Shah, 2002) produziert. Hieraus entstehendes Peroxynitrit (Goldstein und Czapski, 1995) wiederum führt zu einer Entkoppelung der NO-Synthetasen mit verminderter NOProduktion und stattdessen einsetzender Superoxidanionenproduktion über eine Oxidation von Tetrahydrobiopterin (Moens und Kass, 2006). Gleichzeitig kann eine kurzfristig hohe NO-Konzentration über eine Hemmung der GTP-Cyclohydrolase 1 die Neubildung von Tetrahydrobiopterin vermindern (Shiraishi et al., 2003). Dieses wird aus GTP über mehrere Zwischenreaktionen gebildet , wobei die von der GTPCyclohydrolase 1 beschleunigte Umsetzung von GTP in 7,8-Dihydroneopterintriphosphat der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist (Gesierich et al., 2003, Hatakeyama et al., 1993). Oxidiertes inaktives Tetrahydrobiopterin kann durch Dihydrofolat-Reduktase wieder hergestellt werden, jedoch kompensiert die Regeneration einen Mangel an Neusynthese nicht vollständig (Moens und Kass, 2006). Eine Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase könnte unter Berücksichtigung dieser Zusammenhänge also sowohl eine Steigerung der NOAbgabe über eine Verminderung der Aktivität der NO-Dioxygenase als auch eine Verminderung der NO-Abgabe über mehrere mögliche Mechnismen bewirken: - Strukturelle Ähnlichkeiten der NO-Synthetasen mit der herabregulierten Cytochrom P450-Oxidoreduktase könnten zu einer Beeinträchtigung der Funktion der NO-Synthetasen durch die Transfektion führen. - 106 - Diskussion Eine Oxidation von Tetrahydrobiopterin durch eine aufgrund verminderter NOD-Aktivität kurzfristig hohe NO-Konzentration in gleichzeitiger Anwesenheit von Superoxidanionen könnte zu einer Entkoppelung der NO-Synthetasen mit konsekutiver zusätzlicher Bildung von Superoxidanionen führen. - Eine kurzfristig hohe NO-Konzentration könnte alternativ oder zusätzlich über eine verminderte Neusynthese an Tetrahydrobiopterin zur Entkoppelung der NO-Synthetasen beitragen. In den durchgeführten Experimenten bewirkte die Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase bei aus einer Vena Saphena entnommenen Endothelzellen eine fast vollständige Hemmung des Endothelzelleffekts, die sich im Verlauf von zwei Tagen zunehmend abschwächte. Der im zeitlichen Verlauf wieder einsetzende Endothelzelleffekt war durch einen Inhibitor der NO-Synthetasen hemmbar (Abb. 31), so dass die Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase am ehesten auf eine verminderte Aktivität der endothelialen und neuronalen NO-Synthetase zurückzuführen ist. Dies könnte auf einen Einfluss der siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase auf die Funktionsfähigkeit der NO-Synthetase oder aber auf eine Entkoppelung der NOSynthetase zurückzuführen sein. Die Wiederherstellung des Endothelzelleffekts im zeitlichen Verlauf könnte im ersten Fall auf eine Neubildung von NO-Synthetase oder eine Steigerung der Aktivität nicht beeinträchtigter NO-Synthetase-Moleküle, im zweiten Fall auf einen Ersatz von oxidiertem Tetrahydrobiopterin durch Neusynthese oder Regeneration beziehungsweise auf eine wieder einsetzende, zuvor verminderte Neusynthese von Tetrahydrobiopterin hindeuten. Ein wichtiges Argument für eine Rolle von Tetrahydrobiopterin an der beschriebenen Hemmung des Endothelzelleffekts ist die Beobachtung, dass eine exogene Zugabe von Tetrahydrobiopterin die Hemmung des Endothelzelleffekts vollständig aufhebt und dass der dann wieder erhaltene vollständige Endothelzelleffekt durch Inhibition der NO-Synthetasen gemindert wird (Abb. 32). Dies weist zum einen darauf hin, dass die Verminderung des Endothelzelleffekts mit Tetrahydrobiopterin in Verbindung steht, andererseits bestätigt es eine Beeinträchtigung der Aktivität von NOSynthetasen durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase. Wäre die ebenso in geringem Ausmaß vorhandene NO-Synthese durch Cytochrom P450abhängige Monooxygenasen verringert worden, so wäre dieser Effekt eher nicht durch BH4 aufhebbar, da diese kein Tetrahydrobiopterin enthalten (Morgan et al., - 107 - Diskussion 2001), und eine Inhibition der NO-Synthetasen müsste sich sowohl mit als auch ohne Tetrahydrobiopterin ähnlich stark auswirken. Interessanterweise zeigte sich in Experimenten mit Endothelzellen aus humanen Koronararterien, welche aufgrund anderer Anforderungen an die Zellkulturbedingungen in Medium mit einer 100fach höheren Konzentration an EGF kultiviert werden (siehe 3.1.1), im Gegensatz zu Ansätzen mit Endothelzellen aus einer Vena Saphena keine anfängliche Hemmung des Endothelzelleffekts durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase (Abb. 34). Dies lässt sich in Anbetracht einer Steigerung der GTP-Cyclohydrolase 1-Aktivität durch EGF (Moens und Kass, 2006) gut mit der Beteiligung einer Oxidation oder einer mangelnden Neusynthese von Tetrahydrobiopterin an der Hemmung des Endothelzelleffekts bei den Endothelzellen aus einer humanen Vena Saphena vereinbaren. Während die beobachtete Inhibition bei diesen Zellen erst im Verlauf von 2 Tagen nachließ, kam es im Falle der Endothelzellen aus Koronararterien in Verbindung mit dem verwendeten Medium mit einem hohen Gehalt an EGF möglicherweise zu einer wesentlich stärkeren Neubildung von Tetrahydrobiopterin mit Wiederherstellung der NO-Abgabe zu einem Zeitpunkt noch vor Beginn der Auswertbarkeit des Experiments. Ein mögliches Modell zur Erklärung der Beobachtungen im Zusammenhang mit einer Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase wäre also eine schnell einsetzende Steigerung der NO-Abgabe nach der Transfektion durch Verringerung der Aktivität von NO-Dioxygenase. Diese könnte noch während des Transfektionsprozesses zu einer Oxidation von Tetrahydrobiopterin führen, wodurch für eine gewisse Zeit nur ein verringerter Endothelzelleffekt nachweisbar ist, bis wieder ausreichend Tetrahydrobiopterin neu gebildet oder regeneriert wurde. Ein Experiment, bei dem der Transfektionsprozess unter Zugabe von L-NAME, also unter Hemmung der NO-Synthetasen, durchgeführt wurde, zeigt in der anschließenden Kokultur von Endothelzellen und transformierten Fibroblasten in Abwesenheit von LNAME eine deutlich verringerte Hemmung des Endothelzelleffekts nach Transfektion mit siRNA gegen Cytochrom P450-Oxidoreduktase und wiederum eine Hemmbarkeit des nun fast vollständig vorhandenen Endothelzelleffekts durch L-NAME (Abb. 33). Somit deuten die Daten einerseits darauf hin, dass NO-Synthese für den die Hemmung des Endothelthelzelleffekts bewirkenden Prozess notwendig ist, dass aber andererseits die Hemmung auf eine geringere NO-Synthese zurückzuführen ist. - 108 - Diskussion Auch dies lässt sich sowohl mit einer Oxidation von Tetrahydrobiopterin als auch mit einer Verminderung der Aktivität der GTP-Cyclohydrolase durch die Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase vereinbaren, so dass zwischen diesen beiden Fällen, die möglicherweise additiv oder synergistisch wirken können, mit den durchgeführten Experimenten nicht unterschieden werden kann. Dass es in Ansätzen, in denen die NO-Synthese während der Transfektion gehemmt war oder denen Tetrahydrobiopterin zugeführt wurde, die also potentiell eine zumindest teilweise funktionsfähige NO-Synthetase bei gleichzeitig verminderter Aktivität ihrer NO-Dioxygenase besitzen, nicht oder nur geringfügig zu einer Steigerung des Endothelzelleffekts gegenüber der Kontrolle ohne Herabregulation kommt, deutet darauf hin, dass eine nur unvollständig wieder hergestellte Funktion der NOSynthetasen nicht vollständig durch eine verminderte Aktivität der NO-Dioxygenase kompensiert werden kann. Die nachfolgenden Schaubilder zeigen die möglichen Vorgänge in Endothelzellen ohne Herabregulation der Cytochrom P450- Oxidoreduktase (Schema 15) sowie während des Transfektionsvorganges mit zunehmender Entkoppelung der NO-Synthetasen (Schema 16) und in der darauffolgenden Phase mit einer Hemmung des Endothelzelleffekts, die sich nach und nach verliert (Schema 17). Die Entkoppelung der NO-Synthetase hat einen Einfluss auf die NO-Synthese von Endothelzellen und damit auf die Gefäßweite, weshalb Ansätze bestehen, arterielle Hypertonie durch eine Substitution von Tetrahydrobiopterin zu behandeln (Moens und Kass, 2006). Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass in vitro gezielt eine von NO abhängige, sich innerhalb einiger Tage zurückbildende Entkoppelung der NO-Synthetase durch Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase erzeugt werden kann. Dies könnte beispielsweise genutzt werden, um die Vulnerabilität von Endothelzellen gegenüber einer Entkoppelung der NO-Synthese in Abhängigkeit verschiedener äußerer Faktoren zu untersuchen. - 109 - Diskussion Schema 15: Mögliche Vorgänge in Endothelzellen vor Herabregulation der Cytochrom P450Oxidoreduktase. (1) Endotheliale und neuronale NO-Synthetase besitzen Tetrahydrobiopterin (BH4) als essentiellen Kofaktor und produzieren NO (hemmbar durch L-NAME) in Endothelzellen. (2) Dieses wird zu einem großen Teil in NO3- umgesetzt durch NO-Dioxygenase, welche an Cytochrom P450-Oxidoreduktase gekoppelt ist und diese für ihre Funktion benötigt. (3) Das verbleibende NO kann Zellmembranen passieren und reagiert mit Superoxidanionen der membranständigen NADPHOxidase transformierter Zellen zu Peroxynitrit, welches über Lipidperoxidation an Membranen bei diesen Apoptose induzieren kann. (4) Die Neusynthese von Tetrahydrobiopterin beginnt mit dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, der Umsetzung von GTP in 7,8-dihydroneopterin-triphosphat durch GTP-Cyclohydrolase 1, und wird über weitere Zwischenprodukte fortgesetzt. (5) BH4 kann zu dem inaktiven BH2 oxidiert werden, dieses wird durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu Tetrahydrobiopterin aktiviert. - 110 - Diskussion Schema 16: Mögliche Vorgänge in Endothelzellen während Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase. (1) Endotheliale und neuronale NO-Synthetase besitzen Tetrahydrobiopterin (BH4, exogene Zugabe möglich) als essentiellen Kofaktor und produzieren NO (hemmbar durch LNAME) in Endothelzellen. (2) Dieses wird während der Herabregulation der Cytochrom P450Oxidoreduktase in zunehmend geringerem Maße in NO3- umgesetzt durch NO-Dioxygenase, welche an Cytochrom P450-Oxidoreduktase gekoppelt ist und diese für ihre Funktion benötigt. (3) Aufgrund einer hohen Konzentration an NO sowie einer konstitutiv vorhandenen Superoxidanionenproduktion durch NADPH-Oxidase kommt es zu einer Bildung von Peroxynitrit, welches Tetrahydrobiopterin oxidieren und damit inaktivieren kann. (4) Des Weiteren kommt es durch die hohe Konzentration an NO zu einer Inhibition der GTP-Cyclohydrolase 1, welche den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Tetrahydrobiopterin-Neusynthese, die Umsetzung von GTP in 7,8-dihydroneopterin-triphosphat, katalysiert. (5) Aufgrund der verstärkten Bildung von Peroxynitrit liegt eine erhöhte Konzentration an inaktivem BH2 vor, dieses kann zu einem Teil durch Dihydrofolat-Reduktase regeneriert werden. (6) Das verbleibende NO kann Zellmembranen passieren und reagiert mit Superoxidanionen der membranständigen NADPH-Oxidase transformierter Zellen zu Peroxynitrit, welches über Lipidperoxidation an Membranen bei diesen Apoptose induzieren kann. - 111 - Diskussion Schema 17: Mögliche Vorgänge in Endothelzellen nach Herabregulation der Cytochrom P450Oxidoreduktase. (1) Endotheliale und neuronale NO-Synthetase besitzen nur noch eine geringe Menge des essentiellen Kofaktors Tetrahydrobiopterin (BH4, exogene Zugabe möglich) und produzieren dadurch nur niedrige Konzentrationen an NO (hemmbar durch L-NAME) in Endothelzellen, jedoch nun zusätzlich Superoxidanionen. (2) NO wird nach Herabregulation der Cytochrom P450-Oxidoreduktase nicht mehr abgefangen durch NO-Dioxygenase, welche an Cytochrom P450-Oxidoreduktase gekoppelt ist und diese für ihre Funktion benötigt. (3) Aufgrund einer geringen Konzentration an NO reagieren Superoxidanionen sowohl der NADPH-Oxidase als auch der NO-Synthetase nur noch in eingeschränktem Maße zu Peroxynitrit, welches Tetrahydrobiopterin oxidieren und damit inaktivieren kann. (4) Des Weiteren kommt es durch die niedrige Konzentration an NO nur noch zu einer geringen Inhibition der GTP-Cyclohydrolase 1, welche den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Tetrahydrobiopterin-Neusynthese, die Umsetzung von GTP in 7,8-dihydroneopterin-triphosphat, katalysiert. (5) Aufgrund der Vorgänge während der Transfektion liegt eine erhöhte Konzentration an inaktivem BH2 vor, dieses kann zu einem Teil durch Dihydrofolat-Reduktase regeneriert werden. (6) Das verbleibende NO kann Zellmembranen passieren und reagiert mit Superoxidanionen der membranständigen NADPHOxidase transformierter Zellen zu Peroxynitrit, welches über Lipidperoxidation an Membranen bei diesen Apoptose induzieren kann. - 112 - Diskussion Die Experimente zur Entkoppelung der NO-Synthetase wurden zusätzlich unter Zugabe von TGF-β1 durchgeführt. TGF-β1 führt zu einer Steigerung der Bildung von Superoxidanionen (Sturrock et al., 2006, Rocic und Lucchesi, 2005). Diese tragen gemeinsam mit Stickstoffmonoxid zur Entkoppelung der NO-Synthese bei. Sie dismutieren spontan zu Wasserstoffperoxid (Bielski und Allen, 1977), welches zu einer Steigerung der Tetrahydrobiopterinbildung führt, während TGF-β1 die Tetrahydrobiopterinsynthese hemmt (Shi et al., 2004). Die Beeinflussung einer Entkoppelung der NO-Synthese durch TGF-β1 über mehrere Wege ist also sehr wahrscheinlich. In Anwesenheit von exogen zugegebenem TGF-β1 zeigte sich im Gegensatz zu Ansätzen ohne TGF-β1-Zugabe unter Herabregulation der Cytochrom P450Oxidoreduktase anfänglich keine Inhibition des Endothelzelleffekts, jedoch eine im zeitlichen Verlauf zunehmende Hemmung, die mit einer verminderten Hemmbarkeit des verbleibenden Endothelzelleffekts durch Inhibition der NO-Synthese einherging (Abb. 31). Der NO-Weg konnte also im zeitlichen Verlauf in immer geringerem Ausmaß ablaufen. Der Endothelzelleffekt ließ sich auch hier durch Zugabe von Tetrahydrobiopterin wiederherstellen (Abb. 32), was mit einer im zeitlichen Verlauf zunehmenden Entkoppelung der NO-Synthese unter dem Einfluss von TGF-β1 vereinbar ist. Eine Inhibition der NO-Synthese während des Transfektionsprozesses führte nicht zu einer Verhinderung der Hemmung der NO-Synthese (Abb. 33), was darauf hindeutet, dass hier Prozesse entscheidend sind, die in einer späteren Phase nach Abschluss der Transfektion stattfinden und die im Verlauf des Transfektionsprozesses noch nicht zum Tragen kommen. Unter dem Einfluss einer erhöhten Superoxidanionenkonzentration und einer möglicherweise ungenügenden Tetrahydrobiopterinsynthese könnte es zu einer im zeitlichen Verlauf zunehmenden Entkoppelung der NO-Synthetase kommen. 5.6 Beteiligung von Endothelzellen an der Tumorabwehr Die erhobenen Befunde zeigen, dass Endothelzellen transformierte Zellen über den NO-Weg (siehe 5.1) und den HOCl-Weg (siehe 5.2) in Apoptose treiben können. Unter Annahme einer ungerichteten Abgabe des membrangängigen Stickstoffmonoxids (Lancaster, 1994) sowie von Peroxidase, sowohl basal als auch apikal, ist aufgrund der im Gefäßlumen vorherrschenden Strömung eher von einer - 113 - Diskussion Wirksamkeit auf der basalen Zellseite auszugehen. An der basalen Endothelzellseite sowie an glatter Gefäßmuskulatur könnte unter Umständen eine ausreichend hohe Konzentration an Stickstoffmonoxid und Peroxidase erreicht werden, um spontan transformierte Zellen einem verstärkten Selektionsdruck durch selektive Apoptoseinduktion auszusetzen. Da viele Tumorzelllinien im Gegensatz zu transformierten Zellen eine membranständige Katalase ausbilden, sind sie gegenüber einer Apoptoseinduktion über den NO- und den HOCl-Weg geschützt (Schenke, 2006, Jang und Hanash, 2003). Es ist jedoch unter Umständen denkbar, dass metastasierende Tumorzellen, die während der Anheftung an Endothelzellen einen vom Gefäßlumen getrennten Raum zwischen Tumorzelle und Endothelzelle bilden und einer hohen Konzentration an Stickstoffmonoxid von Endothelzellen ausgesetzt sind, hierdurch ihren Schutz durch Katalase verlieren. Untersuchungen der Arbeitsgruppe (Bauer, unpublizierte Daten, siehe 7.6) zur Möglichkeit einer Zerstörung von Katalase durch kurzfristig hohe Konzentrationen an Stickstoffmonoxid ergaben folgendenden Mechanismus einer Katalasezerstörung: Stickstoffmonoxid und Superoxidanionen reagieren zu Peroxynitrit (Goldstein und Czapski, 1995). Eine Reaktion von Peroxynitrit mit Wasserstoffperoxid wiederum führt unter anderem zur Bildung von Singlet-Sauerstoff (Di Mascio et al., 1994), welcher die Katalase inaktiviert (Escobar et al., 1996). Allerdings wäre es möglich, dass es hierbei bei gleichzeitiger Anwesenheit hoher Konzentrationen an Superoxidanionen der Tumorzelle sowie Stickstoffmonoxid und Peroxidase der Endothelzelle in einem durch die Tumorzellanheftung abgeschlossenen Raum zu einer Schädigung von Endothelzellen über den NO- und HOCl-Weg kommen würde, die dann gleichzeitig zu einem leichteren Durchtritt von Tumorzellen durch die Endothelzellschicht führen würde. 5.7 Beteiligung von Endothelzellen an der Entstehung von Atherosklerose Atherosklerotische Veränderungen beginnen mit einer endothelialen Dysfunktion, die zu einer gesteigerten endothelialen Permeabilität führt und das Eindringen von Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) in den subendothelialen Raum ermöglicht (Ross, 1999). In atherosklerotischen Läsionen wurden Myeloperoxidase (Daugherty et al., 1994) sowie durch HOCl modifizierte Lipoproteine (Hazell et al., 1996) - 114 - Diskussion nachgewiesen. HOCl oxidiert LDL entweder direkt oder über Umwandlung von Aminogruppen von Lysinresten des Apolipoproteins B in Chloramine, welche wiederum direkt LDL modifizieren oder reaktive Aldehyde bilden (Carr et al., 2000). Durch HOCl modifizierte LDL beeinflussen die Ausschüttung von Chemokinen durch Monozyten, aktivieren neutrophile Granulozyten und steigern ihre Adhärenz an Endothelzellen (Kopprasch et al., 1998, Woenckhaus, 1998). Hierdurch verstärkt einwandernde Leukozyten wiederum produzieren Myeloperoxidase und führen dadurch zu einer verstärkten Oxidation von LDL (Daugherty et al., 1994). Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente zeigen eine Abgabe der Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase von Endothelzellen und deuten auf eine Bildung von HOCl durch diese Peroxidase hin (siehe 5.2). Somit stellt sich die Frage, ob möglicherweise bereits in einem sehr frühen Stadium der Entstehung atherosklerotischer Läsionen LDL durch HOCl einer endothelzelleigenen Peroxidase modifiziert werden könnten. Bereits geringfügig oxidierte LDL können eine Einwanderung von Leukozyten in den subendothelialen Raum erleichtern (Mertens und Holvoet, 2001) und so einen Prozess aus verstärkter Oxidation von LDL und hierdurch wiederum verstärkter Einwanderung von Leukozyten in Gang setzen. Somit könnten Faktoren, die die Abgabe von Peroxidase beziehungsweise die Verfügbarkeit des Substrats Wasserstoffperoxid verändern, die Pathogenese von atherosklerotischen Läsionen beeinflussen. Das multifunktionale Zytokin TGF-β könnte neben anderen Effekten eine Steigerung der Oxidation von LDL über eine vermehrte Abgabe von Peroxidase durch Endothelzellen (siehe 5.3) sowie möglicherweise über eine gesteigerte Superoxidanionenproduktion (Sturrock et al., 2006, Lucchesi, 2005) und damit eine höhere Konzentration an Wasserstoffperoxid bewirken. Ebenso könnte Superoxidanionenproduktion durch sowohl eine NADPH-Oxidase Hochregulation in der Endothelzellen beispielsweise durch Angiotensin II oder Endothelin-1 als auch eine Herabregulation beispielsweise durch Statine (Lassègue und Clempus, 2003) eine von Peroxidase abhängige Oxidation von LDL beeinflussen. - 115 - Diskussion Schema 18: Mögliche Beteiligung von Endothelzellen an der Oxidation von Lipoproteinen vor Einwanderung von Leukozyten in die subendotheliale Schicht. Superoxidanionen werden von (1a) glatter Muskulatur sowie (1b) Endothelzellen gebildet und (2) dismutieren spontan zu Wasserstoffperoxid. Dieses wird von (3) der Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase von Endothelzellen in HOCl umgesetzt. (4) HOCl kann direkt Low Density Lipoproteine (LDL) oxidieren sowie (5) Amine in Chloramine umsetzen, (6) welche wiederum direkt oder über Bildung von Aldehyden LDL oxidieren. (7) Oxidierte LDL führen unter anderem zur Bildung von Adhäsionsmolekülen an der Endothelzelloberfläche. - 116 - Diskussion Schema 19: Mögliche Beteiligung von Endothelzellen an der Oxidation von Lipoproteinen nach Einwanderung von Leukozyten in die subendotheliale Schicht. Superoxidanionen werden von (1a) glatter Muskulatur, (1b) Endothelzellen und (1c) in die subendotheliale Schicht eingewanderten Makrophagen gebildet und (2) dismutieren spontan zu Wasserstoffperoxid. Dieses wird von (3a) Myeloperoxidase, welche von Makrophagen abgegeben wird, und (3b) der Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase von Endothelzellen in HOCl umgesetzt. (4) HOCl kann direkt Low Density Lipoproteine (LDL) oxidieren sowie (5) Amine in Chloramine umsetzen, (6) welche wiederum direkt oder über Bildung von Aldehyden LDL oxidieren. (7) Myeloperoxidase oxidiert außerdem LDL durch Umsetzung von Nitrit in Stickstoffdioxid. (8) Oxidierte LDL führen unter anderem zur Bildung von Adhäsionsmolekülen an der Endothelzelloberfläche. - 117 - Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit zeigt, dass drei aus unterschiedlichen Gefäßtypen isolierte humane nichttransformierte und nichtimmortalisierte Endothelzelllinien ein Enzym mit Peroxidaseaktivität in ihre Umgebung abgeben. Diese Peroxidaseaktivität ist durch den spezifischen Peroxidaseinhibitor ABH hemmbar. Durch Verwendung von siRNA wurde die Verwandtschaft oder Identität des Enzyms mit dualer Oxidase (Duox) nahegelegt. Ebenso führt die Hemmung von Matrixmetalloproteinasen durch Galardin zu einer geringeren Abgabe der Peroxidase, was insgesamt auf eine proteolytische Abtrennung der extrazellulären Peroxidaseuntereinheit der dualen Oxidase von der Endothelzelloberfläche hindeutet. Die funktionelle Bedeutung wurde durch Kokultur der Endothelzellen mit transformierten Fibroblasten bestätigt. Hierbei kommt es über den HOCl-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion zu einer selektiven Schädigung von transformierten Zellen, nicht jedoch von nichttransformierten Zellen. Die endothelzelleigene Peroxidase führt also zu einer Bildung von HOCl und könnte somit ähnlich wie die durch eingewanderte Leukozyten abgegebene Myeloperoxidase eine Rolle in der Pathogenese atherosklerotischer Läsionen spielen. Es ist denkbar, dass die Peroxidase der Endothelzellen in einem sehr frühen Stadium der Atheroskleroseentstehung geringe Mengen in die subendotheliale Schicht eingedrungener Lipoproteine geringer Dichte (LDL) oxidiert. Bereits geringfügig oxidierte LDL können eine Einwanderung von Leukozyten in den subendothelialen Raum erleichtern und so einen Prozess aus verstärkter Oxidation von LDL durch Myeloperoxidase und hierdurch wiederum verstärkter Einwanderung von Leukozyten in Gang setzen. Des Weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Endothelzellen auch über den NO-Weg der interzellulären Apoptoseinduktion selektiv transformierte Zellen schädigen können. Eine Elimination von transformierten Zellen durch Endothelzellen sowohl über den HOCl-Weg als auch über den NO-Weg könnte als Abwehrmechanismus in einem frühen Stadium der Tumorentstehung wirken und so möglicherweise entgegenwirken. einer hämatogenen Metastasierung von Tumorzellen - 118 - Theoretische Ausführungen 7 Theoretische Ausführungen Das folgende Kapitel ergab sich aus einer umfassenden Literaturrecherche und stellt eine zusammenfassende Übersicht über den aktuellen Forschungsstand der Arbeitsgruppe zum Zeitpunkt der Promotion dar. Durch die Integration der verschiedenen bearbeiteten Themenbereiche konnte die Übersicht als Besprechungsgrundlage innerhalb der Arbeitsgruppe verwendet werden. Die integrierte Darstellung diente dabei einerseits der Erfassung der sich gegenseitig beeinflussenden Abläufe, andererseits der Planung weiterer Experimente. 7.1 Tumorzellen, transformierte Zellen und nichttransformierte Zellen Die Abbildung zeigt modellhaft (1a) eine nichttransformierte Zelle als Effektorzelle im Rahmen der interzellulären Apoptoseinduktion sowie (1b) eine Tumorzelle, die gleichzeitig Effektor- und Zielzellfunktion besitzt. (1c) Transformation von Zellen mit dem viral-sarcoma-Onkogen führt zur Bildung einer Tyrosinkinase, welche die GTPase ras aktiviert (Odajima et al., 2000). (1d) Diese steigert die Aktivität von rac, welches Bestandteil von membranständiger NADPH-Oxidase ist und diese aktiviert (Irani et al., 1997), was (1e) zu einer Superoxidanionenproduktion an der Membranaußenseite führt (Lambeth, 2002, Bedard und Krause, 2007). (1f) Im Zusammenhang mit interzellulärer Apoptoseinduktion entscheidender Unterschied zwischen Tumorzellen und transformierten Zellen ist die Ausbildung einer membranständigen extrazellulären Katalase durch Tumorzellen (Schenke, 2006, Jang und Hanash, 2003). 7.2 NO-Synthese und NO-Weg 7.2.1 NO-Synthese (2a) NO wird je nach Zelllinie von neuronaler NO-Synthetase (NOS I, Bredt und Snyder, 1990), induzierbarer NO-Synthetase (NOS II, Stuehr et al., 1991) und/oder endothelialer NO-Synthetase (NOS III, Förstermann et al., 1991) produziert. (2b) An der inneren mitochondrialen Membran ist eine mitochondriale NO-Synthetase - 119 - Theoretische Ausführungen lokalisiert (Ghafourifar und Richter, 1997). (2c) Die endotheliale und die neuronale NO-Synthetase werden konstitutiv exprimiert, jedoch ist ihre Aktivität von der Anwesenheit von Ca2+ abhängig (Bredt und Snyder, 1990, Förstermann et al., 1991). (2d) Die Expression der induzierbaren NO-Synthetase wird hingegen insbesondere durch Zytokine und bakterielle Lipopolysaccharide induziert (Stuehr et al., 1991). NO-Synthetasen bilden Stickstoffmonoxid über zwei Teilreaktionen. (2e) Arginin wird in einer ersten, von Tetrahydrobiopterin abhängigen Reaktion unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und NADPH in N-Hydroxy-Arginin umgesetzt. (2f) Aus N-Hydroxy-Arginin wird in einem zweiten Schritt wiederum unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und NADPH Citrullin und Stickstoffmonoxid gebildet (Knowles und Moncada, 1994). (2g) Der Kofaktor Tetrahydrobiopterin wird aus Guanosintriphosphat über 7,8Dihydroneopterin-Triphosphat und 6-Pyruvoyl-5,6,7,8-Tetrahydropterin unter Beteiligung von GTP-Cyclohydrolase 1,6-Pyruvoyl-Tetrahydrobiopterin-Synthetase und Sepiapterin-Reduktase synthetisiert (Hatakayama et al., 1993, Moens und Kass, 2006). (2h) Oxidation von Tetrahydrobiopterin führt unter anderem zu Dihydrobiopterin, (2i) Dihydrofolat-Reduktase regeneriert dieses zu Tetrahydrobiopterin (Nichol et al., 1983). (2j) Das Substrat der NO-Synthetase, Arginin, kann von Arginase, welche je nach Zelllinie in sehr unterschiedlicher Aktivität vorliegt, in Ornithin und Harnstoff umgesetzt werden (Pohjanpelto und Hölttä, 1983). (2k) Durch NO-Synthetase produziertes Stickstoffmonoxid wird teilweise in Nitrat umgesetzt durch NO-Dioxygenase (Gardner et al., 1998), welche (2l) an Cytochrom P450-Oxidoreduktase gekoppelt ist und diese zur Funktion benötigt (Hallstrom et al., 2004). (2m) Superoxidanionen können mit Stickstoffmonoxid beispielsweise der intrazellulären NADPH-Oxidase unter Bildung von Peroxynitrit reagieren (Goldstein und Czapski, 1995), (2n) Peroxynitrit führt durch Oxidation von Tetrahydrobiopterin (BH4) unter anderem zu Dihydrobiopterin (BH2, Milstien und Katusic, 1999). (2o) Ein Mangel an Tetrahydrobiopterin führt zu einer Entkoppelung der NO-Synthetase mit verminderter NO-Synthese bei gleichzeitiger Steigerung der Superoxidanionenbildung (Vasquez-Vivar et al., 1998). (2p) Stickstoffmonoxid entfaltet seine Wirkung unter anderem durch Aktivierung von löslicher Guanylatzyklase (Ignarro, 1999) - 120 - Theoretische Ausführungen 7.2.2 NO-Weg (2q) In Effektorzellen produziertes Stickstoffmonoxid ist membrangängig und hat eine hohe Reichweite (Lancaster, 1994). (2r) Trifft es nahe der Zielzelle auf dort produzierte Superoxidanionen, so bildet sich Peroxynitrit (Goldstein und Czapski, 1995), (2s) Peroxynitrit bewirkt Lipidperoxidation an Membranen Rubbo et al., 1994, Radi et al., 1991a, Darley-Usmar et al., 1992). 7.3 HOCl-Weg (3a) Die duale Oxidase besteht aus einer NADPH-Oxidase und einer an der Membranaußenseite befindlichen Peroxidaseuntereinheit (Lambeth, 2002). (3b) Diese kann proteolytisch durch Matrixmetalloproteinasen abgetrennt werden und in die Umgebung gelangen (Burger, 2007, siehe 5.2). (3c) Peroxidase setzt Wasserstoffperoxid aus Superoxidanionen transformierter Zellen in hypochlorige Säure um (Herdener et al., 2000, Furtmüller et al., 2000). (3d) HOCl reagiert mit Superoxidanionen zu Hydroxylradikalen, Chloridionen und molekularem Sauerstoff (Long und Bielski, 1980, Candeias et al., 1993). (3e) Hydroxylradikale wiederum können Lipidperoxidation bewirken (Tsujimoto et al., 1998). 7.4 Nitrylchloridweg (4a) Stickstoffmonoxid bildet mit molekularem Sauerstoff Stickstoffdioxid. (4b) Dieses wiederum kann mit Stickstoffmonoxid Distickstofftrioxid bilden, welches (4c) unter Beteiligung von Wasser zu Nitrit reagieren kann (Kharitonov et al., 1995). (4d) Nitrit bildet mit hypochloriger Säure Nitrylchlorid (Eiserich et al., 1996), (4e) dieses bewirkt Lipidperoxidation (Panasenko et al., 1997). 7.5 Haber-Weiss-Reaktion (5a) Fe2+ katalysiert in einer Fenton-Reaktion die Umsetzung von Wasserstoffperoxid in Hydroxylradikale und Hydroxylanionen, (5b) Superoxidanionen regenerieren das entstehende Fe3+ wieder zu Fe2+ (Schimmel und Bauer, 2002, Kehrer, 2000,). (5c) Die entstehenden Hydroxylradikale können Lipidperoxidation bewirken (Tsujimoto et al., 1998). - 121 - Theoretische Ausführungen 7.6 Singlet-Sauerstoff und Katalase (6a) Katalase baut Wasserstoffperoxid zu Wasser und molekularem Sauerstoff ab (Chance, 1952). (6b) Ebenso kann Peroxynitrit abgebaut werden, wobei Nitrit entsteht (Kono et al., 1998). (6c) Katalase wird durch Singlet-Sauerstoff inaktiviert (Escobar et al., 1996), (6d) dieser kann unter anderem gemeinsam mit Nitrit aus der Reaktion von Peroxynitrit mit Wasserstoffperoxid entstehen (Di Mascio et al., 1994). (6e) Singlet-Sauerstoff führt außerdem zu einer Aktivierung des Fas-Rezeptors (Morita et al., 1997, Zhuang et al., 2001). 7.7 Weitere extrazelluläre Reaktionen (7a) Stickstoffmonoxid bildet in Anwesenheit von Sauerstoff mit Wasserstoffperoxid die Reaktionsprodukte Peroxynitrit, Nitrit und Protonen (Goldstein und Czapski, 1996). (7b) Wasserstoffperoxid reagiert mit hypochloriger Säure zu Wasser, molekularem Sauerstoff, Protonen und Chloridionen (Connick, 1947, Saran et al., 1999). (7c) Stickstoffmonoxid kann durch Autooxidation Nitrit bilden (Kharitonov et al., 1994). (7d) Bei der Umsetzung von Peroxynitrit durch Peroxidase entsteht Nitrit (Floris et al., 1993). (7e) Ebenso kann Peroxynitrit durch Homolyse umgesetzt werden in Stickstoffdioxid und Hydroxylradikale (Gatti et al., 1998, Merenyi und Lind, 1997, Merenyi und Lind, 1998). 7.8 Oxidativer Stress und Antioxidative Systeme 7.8.1 Superoxidanionen und Superoxiddismutase Superoxidanionen werden intrazellulär unter anderem durch (8a) die mitochondriale Atmungskette (Han et al., 2001), (8b) Xanthinoxidase (Knowles et al., 1969) und (8c) intrazelluläre NADPH-Oxidase produziert (Bedard und Krause, 2007). (8d) Sie dismutieren zu einem von ihrer Konzentration abhängigen Anteil spontan zu Wasserstoffperoxid (Bielski und Allen, 1977, Fridovich, 1983), Superoxiddismutase beschleunigt diese Reaktion. Die (8e) extrazelluläre, die (8f) zytosolische sowie die (8g) im Intermembranraum der Mitochondrien befindliche Superoxiddismutase enthalten Cu2+ und Zn2+ (Markowitz et al., 1959, Barra et al., 1980, Weisiger und Fridovich, 1973, Hjalmarsson et al., 1987,), während (8h) die Superoxiddismutase der mitochondrialen Matrix Mn2+ enthält (Barra et al., 1984). Kupfer-Zink- - 122 - Theoretische Ausführungen Superoxiddismutase katalysiert in der Cu+-Form neben der Dismutation von Superoxid zu Wasserstoffperoxid und molekularem Sauerstoff auch (8i) die Umsetzung von Stickstoffmonoxid in Nitroxylanionen (Murphy und Sies, 1991) sowie (8j) die Bildung von Hydroxylradikalen aus Wasserstoffperoxid (Yim et al., 1990). 7.8.2 Antioxidative Systeme Wasserstoffperoxid wird intrazellulär durch (8k) Katalase (Chance, 1952) und über das Glutathion/Thioredoxin-System entgiftet. (8l) Die intrazelluläre Katalaseaktivität wird durch extrazelluläres Wasserstoffperoxid gesteigert (Schimmel und Bauer, 2002). (8m) Das Tripeptid Glutathion (γ-L-Glutamyl-L-Cysteinylglycin) wird in zwei Teilschritten über γ-Glutamylcystein aus Glutaminsäure, Cystein und Glycin synthetisiert (Minnich et al., 1971). Ebenso kann oxidiertes Glutathion NADPHabhängig (8n) über Glutathion-Reduktase (Carlberg und Mannervik, 1975) oder (8o) über Thioredoxin regeneriert werden, (8p) Reduziertes Thioredoxin wiederum wird NADPH-abhängig von Thioredoxin-Reduktase bereitgestellt (Pigiet und Conley, 1977, Holmgren, 1977). (8q) Thioredoxin-Reduktase und GluthationReduktase erhalten NADPH unter anderem von Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase (G-6-P-DH, Kanji et al., 1976). (8r) Glutathion-Peroxidase 4 reduziert Lipidperoxide unter Verbrauch von Glutathion (Thomas et al., 1990), (8s) Glutathion-Peroxidase 1 nutzt Glutathion zur Entgiftung von Wasserstoffperoxid zu Wasser (Mills, 1959). 7.9 Todesrezeptoren (9a) Der TNF-Rezeptor 1 (tumor necrosis factor-Rezeptor) bindet die Adapterproteine FADD (Fas-associated death domain) und RIP (receptor interacting protein) über TRADD (TNF-receptor associated death domain), während (9b) TRAIL-Rezeptoren (TNF related apoptosis inducing ligand-Rezeptoren, DR4 und DR5) sowie (9c) FasRezeptor FADD direkt binden (Ashkenazi und Dixit, 1998, Kischkel et al., 2000). (9d) Durch FADD gebundene Procaspase 8 oligomerisiert und wird dadurch aktiviert (Muzio et al., 1998). (9e) Aktivierte Caspase 8 aktiviert Procaspase 3 zu Caspase 3, welche zum apoptotischen Zerfall der Zelle beiträgt (Stennicke et al., 1998, - 123 - Theoretische Ausführungen Fernandes-Alnemri et al., 1994). (9f) Caspase 8 aktiviert außerdem Bid (BH3 interacting domain death agonist) durch Spaltung zu tBid (truncated Bid), (9g) welches zu einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran mit Freisetzung von Cytochrom C führt und dadurch den mitochondrialen Weg der Apoptoseinduktion einleitet (Li et al., 1998). (9h) Eine Aktivierung des Fas-Rezeptors führt des Weiteren zu erhöhter Aktivität der Sphingomyelinase mit pH-Optimum im sauren Bereich und damit (9i) zu einer verstärkten Umsetzung von Sphingomyelin in Ceramid (Cifone et al., 1994, Reinehr et al., 2005), welches ebenso eine (9j) Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran mit Freisetzung von Cytochrom C bewirken kann (Ghafourifar et al., 1999). (9k) Des Weiteren wirkt Ceramid steigernd auf die Aktivität von Proteinkinase Cζ (Lozano et al., 1994, Reinehr et al., 2005), welche (9l) über eine Phosphorylierung von Glycoprotein 47 zu einer Aktivierung von NADPH-Oxidase und dualer Oxidase führt (Dang et al., 2001, Reinehr et al., 2005). (9m) Eine Stimulation des Fas-Rezeptors führt außerdem zu einer Induktion der induzierbaren NO-Synthetase (Selleri et al., 1997). (9n) RIP bindet TRAF-2 (TNF-receptor associated factor 2). (9o) Dies führt zu einer Aktivierung von MEKK-1 (MAP-Erk kinase kinase 1), welche über JNKK (JNK kinase) das Enzym JNK (C-Jun N-terminal kinase) aktiviert. (9p) Der durch JNK phosphorylierte Transkriptionsfaktor C-Jun reguliert den apoptotischen Zelluntergang. (9q) Mit RIP assoziiertes TRAF-2 aktiviert außer MEKK-1 auch NIK (NK-kB-inducing kinase), welche wiederum IKK (inhibitor of kB kinase complex) aktiviert. IKK phosphoryliert IkB (inhibitor of kB) und führt so zu dessen Abbau und (9r) verstärkter Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-kB, der den apoptotischen Zelluntergang reguliert (Ashkenazi und Dixit, 1998). 7.10 Mitochondriale Permeabilität Eine Permeabilität der äußeren mitochondrialen Membran kann durch unterschiedliche Faktoren induziert werden und wird meist von der Bildung einer (10a) mitochondrialen Permeability Transition Pore (PTP) aus Adenine nucleotide translocase (ANT), Cyclophilin-D (CyP-D) und Voltage-dependent anion channel (VDAC) begleitet (Crompton, 1999), (10b) die zu einem Einstrom von Wasser und Elektrolyten in die mitochondriale Matrix und zu deren Anschwellen führt, was eine Ruptur der äußeren mitochondrialen Membran bewirkt (Feldmann et al., 2000). - 124 - Theoretische Ausführungen (10c) Dieser Prozess kann unter anderem über eine DNA-Schädigung induziert werden, hierbei führt eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 zur Bildung der proapoptotischen BCL-Proteine Noxa und Puma. (10d) Eine Interaktion dieser mit dem antiapoptotischen BCL-2 führt zu einer verstärkten Aktivierung von Bax (Villunger et al., 2003) und in der Folge einer Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran (Kluck et al., 1999). Diese kann ebenso im Rahmen einer Aktivierung von Todesrezeptoren durch truncated Bid sowie Ceramide erfolgen (siehe 7.9). Des Weiteren führt ein Verbrauch von Glutathion beispielsweise durch Lipidperoxidation oder reaktive Sauerstoffspezies (siehe 7.8) über (10e) eine verminderte Hemmung der Sphingomyelinase mit neutralem pH-Optimum zu (10f) einer Steigerung der Ceramidkonzentration (Liu und Hannun, 1997) und Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran (Ghafourifar et al., 1999). (10g) Diese Permeabilisierung führt zum Austritt von Cytochrom C aus dem mitochondrialen Intermembranraum, welches im Zytosol mit dATP, Apaf-1 und Procaspase 9 ein Apoptosom bildet, wodurch Procaspase 9 zu Caspase 9 aktiviert wird (Zou et al., 1999). (10h) Caspase 9 wiederum aktiviert Caspase 3, welche zum apoptotischen Zerfall der Zelle beiträgt (Li et al., 1997). (10i) Neben Cytochrom C treten Endonuklease G (Endo G) und Apoptosis inducing factor (AIF) aus dem Intermembranraum aus und führen zu DNA-Fragmentation (Daugas et al., 2000, Li et al., 2001. (10j) Ebenso gelangen die Proteine Smac/DIABLO und Omi ins Zytosol und führen zu einer Hemmung von Apoptoseinhibitoren (IAPs, inhibitors of apoptosis, Wu et al., 2000, Yang et al., 2003). (10k) Die Gruppe der Apoptoseinhibitoren hemmt unter anderem Caspase 3 sowie die Aktivierung von Procaspase 9 zu Caspase 9 (Deveraux et al., 1998). 7.11 TGF-β (11a) TGF-β1 wird in einer nichtkovalent an das Latency associated protein (LAP) gebundenen Form sezerniert (Barcellos-Hoff und Dix, 1996) und (11b) wirkt über membranständige TGF-beta-Rezeptoren (Massague et al., 1982). (11c) Eine Aktivierung von TGF-beta-Rezeptoren führt zu einer gesteigerten Abgabe von Peroxidase (Portess et al., 2007) und (11d) gesteigerter Aktivität von NADPHOxidase (Sturrock et al., 2006, Rocic und Lucchesi, 2005). - 125 - Literatur 8 Literatur Adams J.M. (2003) Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. Genes Dev. 2003 17(20):2481-2495 Ago T., Kitazono T., Kuroda J., Kumai Y., Kamouchi M., Ooboshi H., Wakisaka M., Kawahara T., Rokutan K., Ibayashi S., Iida M. (2005) NAD(P)H oxidases in rat basilar arterial endothelial cells. Stroke 36(5):1040-1046 Agrawal N., Dasaradhi P.V.N., Mohammed A., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K. (2003) RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67(4):657-685 Alexander J.S., Elrod J.W. (2002) Extracellular matrix, junctional integrity and matrix metalloproteinase interactions in endothelial permeability regulation. J. Anat. 200(6):561-574 Alp N.J., Channon K.M. (2004) Regulation of endothelial nitric oxide synthase by tetrahydrobiopterin in vascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24(3):413420 Armstrong J.S., Steinauer K.K., Hornung B., Irish J.M., Lecane P., Birrell G.W., Peehl D.M., Knox S.J. (2002) Role of glutathione depletion and reactive oxygen species generation in apoptotic signaling in a human B lymphoma cell line. Cell Death Differ. 9(3):252-263 Ashkenazi A., Dixit V.M. (1998) Death Receptors: Signaling and Modulation. Science 281(5381):1305-1308 Bachetti T., Comini L., Curello S., Bastianon D., Palmieri M., Bresciani G., Callea F., Ferrari R. (2004) Co-expression and modulation of neuronal and endothelial nitric oxide synthase in human endothelial cells. J. Mol. Cell Cardiol. 37(5):939-945 Barcellos-Hoff M.H., Dix T.A. (1996) Redox-Mediated Activation of Latent Transforming Growth Factor-β1. Mol. Endocrinol. 10(9):1077-1083 Barra D., Martini F., Bannister J.V., Schininà M.E., Rotilio G., Bannister W.H., Bossa F. (1980) The complete amino acid sequence of human Cu/Zn superoxide dismutase. FEBS Lett. 120(1):53-56 - 126 - Literatur Barra D., Schininà M.E., Simmaco M., Bannister J.V., Bannister W.H., Rotilio G., Bossa F. (1984) The primary structure of human liver manganese superoxide dismutase. J. Biol. Chem. 259(20):12595-12601 Bauer G. (1996) Elimination of transformed cells by normal cells: a novel concept for the control of carcinogenesis. Histol. Histopathol. 11(1):237-255 Bauer G. (2000) Reactive oxygen and nitrogen species: efficient, selective, and interactive signals during intercellular induction of apoptosis. Anticancer Res. 20(6B):4115-4139 Bauer G. (2001) Lactobacilli-mediated control of vaginal cancer through specific reactive oxygen species interaction. Med. Hypotheses. 57(2):252-257 Beck E., Schäfer R., Bauer G. (1997) Sensitivity of Transformed Fibroblasts for Intercellular Induction of Apoptosis Is Determined by Their Transformed Phenotype. Exp. Cell Res. 234:47-56 Bedard K., Krause K.H. (2007) The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87(1):245-313 Behzadian M.A., Wang X.-L., Windsor L.J., Ghaly N., Caldwell R.B. (2001) TGF-β Increases Retinal Endothelial Cell Permeability by Increasing MMP-9: Possible Role of Glial Cells in Endothelial Barrier Function. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42:853-859 Bielski B.H.J., Allen A.O. (1977) Mechanism of the Disproportionation of Superoxide Radicals. J. Phys. Chem. 87(11):1048-1050 Bredt D.S., Snyder S.H. (1990) Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulinrequiring enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87(2):682-685 Briones M.A., Phillips D.J., Renshaw M.A., Hooper W.C. (2001) Expression of chemokine by human coronary-artery and umbilical-vein endothelial cells and its regulation by inflammatory cytokines. Coron. Artery Dis. 12(3):179-186 Buga G.M., Gold M.E., Fukuto J.M., Ignarro L.J. (1991) Shear stress-induced release of nitric oxide from endothelial cells grown on beads. Hypertension. 17(2):187-193 Burdon R.H. (1995) Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation. Free. Radic. Biol. Med. 18(4):775-794 - 127 - Literatur Burger N. (2007) Bedeutung der interzellulären Apoptose-Induktion für die Apo/Fasabhängige Apoptose und für Gammastrahlung. Dissertation an der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Burner U., Obinger C., Paumann M., Furtmüller P.G., Kettle A.J. (1999) Transient and steady-state kinetics of the oxidation of substituted benzoic acid hydrazides by myeloperoxidase. J. Biol. Chem. 74(14):9494-9502 Candeias L.P., Patel K.B., Stratford M.R., Wardman P. (1993) Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophil-derived species superoxide anion and hypochlorous acid. FEBS Lett. 333(1-2):151-153 Carlberg I., Mannervik B. (1975) Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. J. Biol. Chem. 250(14):5475-5480 Carr A.C., McCall M.R., Frei B. (2000) Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species: reaction pathways and antioxidant protection. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20(7):1716-1723 Castello P.R., Drechsel D.A., Patel M. (2007) Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. J. Biol. Chem. 282(19):14186-14193 Chalupsky K., Cai H. (2005) Endothelial dihydrofolate reductase: critical for nitric oxide bioavailability and role in angiotensin II uncoupling of endothelial nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(25):9056-9061 Chance B. (1952) Effect of pH upon the reaction kinetics of the enzyme-substrate compounds of catalase. J. Biol. Chem. 194(2):471-481 Chanvorachote P., Nimmannit U., Wang L., Stehlik C., Lu B., Azad N., Rojanasakul Y. (2005) Nitric oxide negatively regulates Fas CD95-induced apoptosis through inhibition of ubiquitin-proteasome-mediated degradation of FLICE inhibitory protein. J. Biol. Chem. 280(51):42044-42050 Cifone M.G., De Maria R., Roncaioli P., Rippo M.R., Azuma M., Lanier L.L., Santoni A., Testi R. (1994) Apoptotic signaling through CD95 (Fas/Apo-1) activates an acidic sphingomyelinase. J. Exp. Med. 180(4):1547-1552 Connick R.E. (1947) The Interaction of Hydrogen Peroxide and Hypochlorous Acid in Acidic Solutions Containing Chloride Ion. J. Am. Chem. Soc. 69:1509-1514 - 128 - Literatur Crompton M. (1999) The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem. J. 341(Pt 2):233-249 Cushing S.D., Berliner J.A., Valente A.J., Territo M.C., Navab M., Parhami F., Gerrity R., Schwartz C.J., Fogelman A.M. (1990) Minimally modified low density lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and smooth muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87(13):5134-5138 Dang P.M., Fontayne A., Hakim J., El Benna J., Périanin A. (2001) Protein kinase C zeta phosphorylates a subset of selective sites of the NADPH oxidase component p47phox and participates in formyl peptide-mediated neutrophil respiratory burst. J. Immunol. 166(2):1206-1213 Darley-Usmar V.M., Hogg N., O'Leary V.J., Wilson M.T., Moncada S. (1992) The simultaneous generation of superoxide and nitric oxide can initiate lipid peroxidation in human low density lipoprotein. Free Radic. Res. Commun. 17(1):9-20 Daugas E., Susin S.A., Zamzami N., Ferri K.F., Irinopoulou T., Larochette N., Prévost M.C., Leber B., Andrews D., Penninger J., Kroemer G. (2000) Mitochondrionuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. FASEB J. 14(5):729-739 Daugherty A., Dunn J.L., Rateri D.L., Heinecke J.W. (1994) Myeloperoxidase, a catalyst for lipoprotein oxidation, is expressed in human atherosclerotic lesions. J. Clin. Invest. 94(1):437-444 Deveraux Q.L., Roy N., Stennicke H.R., Van Arsdale T., Zhou Q., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Salvesen G.S., Reed J.C. (1998) IAPs block apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome c by direct inhibition of distinct caspases. EMBO J. 17(8):2215-2223 Di Mascio P., Bechara E.J., Medeiros M.H., Briviba K., Sies H. (1994) Singlet molecular oxygen production in the reaction of peroxynitrite with hydrogen peroxide. FEBS Lett. 355(3):287-289. Eckert S., Bauer G. (1998) TGF-beta isoforms and fibroblast growth factor exhibit analogous indirect antioncogenic activity through triggering of intercellular induction of apoptosis. Anticancer Res. 18(1A):45-52 - 129 - Literatur Eiserich J.P., Cross C.E., Jones A.D., Halliwell B., van der Vliet A. (1996) Formation of nitrating and chlorinating species by reaction of nitrite with hypochlorous acid. A novel mechanism for nitric oxide-mediated protein modification. J. Biol. Chem. 271(32):19199-19208 Elkinton J.R. (1947) The volume of distribution of mannitol as a measure of the volume of extracellular fluid, with a study of the mannitol method. J. Clin. Invest. 26(6):1088-1097 Engelmann I., Bauer G. (2000) How can tumor cells escape intercellular induction of apoptosis? Anticancer Res. 20(4):2297-2306. Engelmann I., Eichholtz-Wirth H., Bauer G. (2000) Ex vivo tumor cell lines are resistant to intercellular induction of apoptosis and independent of exogenous survival factors. Anticancer Res. 20(4):2361-2370 Escobar J.A., Rubio M.A., Lissi E.A. (1996) Sod and catalase inactivation by singlet oxygen and peroxyl radicals. Free Radic. Biol. Med. 20(3):285-290 Feldmann G., Haouzi D., Moreau A., Durand-Schneider A.M., Bringuier A., Berson A., Mansouri A., Fau D., Pessayre D. (2000) Opening of the mitochondrial permeability transition pore causes matrix expansion and outer membrane rupture in Fas-mediated hepatic apoptosis in mice. Hepatology 31(3):674-683 Fernandes-Alnemri T., Litwack G., Alnemri E.S. (1994) CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. J. Biol. Chem. 269(49):3076130764 Floris R., Piersma S.R., Yang G., Jones P., Wever R. (1993) Interaction of myeloperoxidase with peroxynitrite. A comparison with lactoperoxidase, horseradish peroxidase and catalase. Eur. J. Biochem. 215(3):767-775 Förstermann U., Pollock J.S., Schmidt H.H., Heller M., Murad F. (1991) Calmodulindependent endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide synthase activity is present in the particulate and cytosolic fractions of bovine aortic endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(5):1788-1792 Förstermann U., Münzel T. (2006) Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease: from marvel to menace. Circulation. 113(13):1708-1714 - 130 - Literatur Fridovich I. (1983) Superoxide radical: an endogenous toxicant. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 23:239-257 Furtmüller P.G., Obinger C., Hsuanyu Y., Dunford H.B. (2000) Mechanism of reaction of myeloperoxidase with hydrogen peroxide and chloride ion. Eur. J. Biochem. 267(19):5858-5864 Gackowski D., Rozalski R., Siomek A., Dziaman T., Nicpon K., Klimarczyk M., Araszkiewicz A., Olinski R. (2008) Oxidative stress and oxidative DNA damage is characteristic for mixed Alzheimer disease/vascular dementia. J. Neurol. Sci. 266(12):57-62 Gardner P.R., Gardner A.M., Martin L.A., Salzman A.L. (1998) Nitric oxide dioxygenase: an enzymic function for flavohemoglobin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(18):10378-10383 Gatti R.M., Alvarez B., Vasquez-Vivar J., Radi R., Augusto O. (1997) Formation of spin trap adducts during the decomposition of peroxynitrite. Arch. Biochem. Biophys. 349(1):36-46 Gesierich A., Niroomand F., Tiefenbacher C.P. (2003) Role of human GTP cyclohydrolase I and its regulatory protein in tetrahydrobiopterin metabolism. Basic Res. Cardiol. 98(2):69-75 Ghafourifar P., Richter C. (1997) Nitric oxide synthase activity in mitochondria. FEBS Lett. 418(3):291-296 Ghafourifar P., Klein S.D., Schucht O., Schenk U., Pruschy M., Rocha S., Richter C. (1999) Ceramide induces cytochrome c release from isolated mitochondria. Importance of mitochondrial redox state. J. Biol. Chem. 274(10):6080-6084 Goldstein S., Czapski G. (1995) The reaction of NO with O2°- and HO2°: A pulse radiolysis study. Free Radic. Biol. Med. 19(4):505-210 Goldstein S., Czapski G. (1996) Formation of Peroxynitrite from the Nitrosation of Hydrogen Peroxide by an Oxygenated Nitric Oxide Solution. Inorg. Chem. 35:59355940 Gow A., Duran D., Thom S.R., Ischiropoulos H. (1996) Carbon dioxide enhancement of peroxynitrite-mediated protein tyrosine nitration. Arch. Biochem. Biophys. 333(1):42-48 - 131 - Literatur Gupta M.K., Qin R.Y. (2003) Mechanism and its regulation of tumor-induced angiogenesis. World J. Gastroenterol. 9(6):1144-1155 Gutteridge J.M. (1984) Reactivity of hydroxyl and hydroxyl-like radicals discriminated by release of thiobarbituric acid-reactive material from deoxy sugars, nucleosides and benzoate. Biochem J. 224(3):761-767 Hallstrom C.K., Gardner A.M., Gardner P.R. (2004) Nitric oxide metabolism in mammalian cells: substrate and inhibitor profiles of a NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase-coupled microsomal nitric oxide dioxygenase. Free Radic. Biol. Med. 37(2):216-228 Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. (1996) Involvement of superoxide and myeloperoxidase in oxygen-dependent killing of Staphylococcus aureus by neutrophils. Infect Immun. 64(9):3512-3517 Han D., Williams E., Cadenas E. (2001) Mitochondrial respiratory chain-dependent generation of superoxide anion and its release into the intermembrane space. Biochem J. 353(Pt 2):411-416 Hanna N. (1982) Inhibition of experimental tumor metastasis by selective activation of natural killer cells. Cancer Res. 42(4):1337-1342 Hassan H.M., Fridovich I. (1979) Paraquat and Escherichia coli. Mechanism of production of extracellular superoxide radical. J. Biol. Chem. 254(21):10846-10852 Hatakeyama K., Hoshiga M., Suzuki S., Kagamiyama H. (1993) Enzymatic synthesis of 6R-[U-14C]tetrahydrobiopterin from [U-14C]GTP. Anal. Biochem. 209(1):1-5 Hazell L.J., Arnold L., Flowers D., Waeg G., Malle E., Stocker R. (1996) Presence of hypochlorite-modified proteins in human atherosclerotic lesions. J. Clin. Invest. 97(6):1535-1544 Herdener M., Heigold S., Saran M., Bauer G. (2000) Target cell-derived superoxide anions cause efficiency and selectivity of intercellular induction of apoptosis. Free Radic. Biol. Med. 29(12):1260-1271 Herrera M., Hong N.J., Garvin J.L. (2006) Aquaporin-1 Transports NO Across Cell Membranes. Hypertension 48:157-164 - 132 - Literatur Hjalmarsson K., Marklund S.L., Engström A., Edlund T. (1987) Isolation and sequence of complementary DNA encoding human extracellular superoxide dismutase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84(18):6340-6344 Holmgren A. (1977) Bovine thioredoxin system. Purification of thioredoxin reductase from calf liver and thymus and studies of its function in disulfide reduction. J. Biol. Chem. 252(13):4600-4606 Ignarro L.J. (1999) Stickstoffmonoxid: ein einzigartiges Signalmolekül in der Gefäßbiologie (Nobel-Vortrag). Angew. Chem. 111:2002-2013 Inoue N., Venema R.C., Sayegh H.S., Ohara Y., Murphy T.J., Harrison D.G. (1995) Molecular regulation of the bovine endothelial cell nitric oxide synthase by transforming growth factor-beta 1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15(8):1255-1261 Irani K., Xia Y., Zweier J.L., Sollott S.J., Der C.J., Fearon E.R., Sundaresan M., Finkel T., Goldschmidt-Clermont P.J. (1997) Mitogenic signaling mediated by oxidants in Ras-transformed fibroblasts. Science 275(5306):1649-1652 Ivanovas B., Zerweck A., Bauer G. (2002) Selective and non-selective apoptosis induction in transformed and non-transformed fibroblasts by exogenous reactive oxygen and nitrogen species. Anticancer Res. 22(2A):841-856. Jang J.H., Hanash S. (2003) Profiling of the cell surface proteome. Proteomics 3(10):1947-1954 Jardine H., MacNee W., Donaldson K., Rahman I. (2002) Molecular mechanism of transforming growth factor (TGF)-beta1-induced glutathione depletion in alveolar epithelial cells. Involvement of AP-1/ARE and Fra-1. J. Biol. Chem. (24):21158-21166 Jin Z., El-Deiry W.S. (2005) Overview of cell death signaling pathways. Cancer Biol. Ther. 4(2):139-163 Jürgensmeier J.M., Schmitt C.P., Viesel E., Höfler P., Bauer G. (1994) Transforming growth factor beta-treated normal fibroblasts eliminate transformed fibroblasts by induction of apoptosis. Cancer Res. 54(2):393-398 Kamata H., Hirata H. (1999) Redox regulation of cellular signalling. Cell Signal. 11(1):1-14 Kanji M.I., Toews M.L., Carper W.R. (1976) Glucose-6-phosphate dehydrogenase. Purification and partial characterization. J. Biol. Chem. 251(8):2255-2257 - 133 - Literatur Kehrer J.P. (2000) The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology 149(1):43-50 Kettle A.J., Gedye C.A., Winterbourn C.C. (1997) Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem. J. 321(Pt.2):503-508 Kettle A.J., Anderson R.F., Hampton M.B., Winterbourn C.C. (2007) Reactions of superoxide with myeloperoxidase. Biochemistry 46(16):4888-4897 Kharitonov V.G., Sundquist A.R., Sharma V.S. (1994) Kinetics of nitric oxide autoxidation in aqueous solution. J. Biol. Chem. 269(8):5881-5883 Kharitonov V.G., Sundquist A.R., Sharma V.S. (1995) Kinetics of nitrosation of thiols by nitric oxide in the presence of oxygen. J. Biol. Chem. 270(47):28158-28164 Kim H.S., Shang T., Chen Z., Pflugfelder S.C., Li D.Q. (2004) TGF-beta1 stimulates production of gelatinase (MMP-9), collagenases (MMP-1, -13) and stromelysins (MMP-3, -10, -11) by human corneal epithelial cells. Exp. Eye Res. 79(2):263-274 Kischkel F.C., Lawrence D.A., Chuntharapai A., Schow P., Kim K.J., Ashkenazi A. (2000) Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and 5. Immunity 12(6):611-620 Kluck R.M., Esposti M.D., Perkins G., Renken C., Kuwana T., Bossy-Wetzel E., Goldberg M., Allen T., Barber M.J., Green D.R., Newmeyer D.D. (1999) The proapoptotic proteins, Bid and Bax, cause a limited permeabilization of the mitochondrial outer membrane that is enhanced by cytosol. J. Cell Biol. 147(4):809-822 Knowles P.F., Gibson J.F., Pick F.M., Bray R.C. (1969) Electron-spin-resonance evidence for enzymic reduction of oxygen to a free radical, the superoxide ion. Biochem. J. 111(1):53-58 Knowles R.G., Moncada S. (1994) Nitric oxide synthases in mammals. Biochem. J. 298(Pt.2):249-258 Kono Y., Yamasaki T., Ueda A., Shibata H. (1998) Catalase catalyzes of peroxynitrite-mediated phenolic nitration. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62(3):448-452 Kopprasch S., Leonhardt W., Pietzsch J., Kühne H. (1998) Hypochlorite-modified low-density lipoprotein stimulates human polymorphonuclear leukocytes for enhanced production of reactive oxygen metabolites, enzyme secretion, and adhesion to endothelial cells. Atherosclerosis. 136(2):315-324 - 134 - Literatur Lambeth J.D. (2002) Nox/Duox family of nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidases. Curr. Opin. Hematol. 9(1):11-17 Lancaster J.R. (1994) Simulation of the diffusion and reaction of endogenously produced nitric oxide. Proc. Natl. Acac. Sci. 91:8137-8141 Lassègue B., Clempus R.E. (2003) Vascular NAD(P)H oxidases: specific features, expression, and regulation. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 285(2):R277-R297 Li H., Zhu H., Xu C.J., Yuan J. (1998) Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94(4):491-501 Li J.M., Shah A.M. (2002) Intracellular localization and preassembly of the NADPH oxidase complex in cultured endothelial cells. J. Biol. Chem. 277(22):19952-19960 Li L.Y., Luo X., Wang X. (2001) Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature 412(6842):95-99 Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S., Wang X. (1997) Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91(4):479-489 Lin K.T., Xue J.Y., Lin M.C., Spokas E.G., Sun F.F., Wong P.Y. (1998) Peroxynitrite induces apoptosis of HL-60 cells by activation of a caspase-3 family protease. Am. J. Physiol. 274(4Pt.1):C855-860 Liu B., Hannun Y.A. (1997) Inhibition of the neutral magnesium-dependent sphingomyelinase by glutathione. J. Biol. Chem. 272(26):16281-16287 Long C.A., Bielski B.H.J. (1980) Rate of Reaction of Superoxide Radical with Chloride-Containing Species. J. Phys. Chem. 84:555-557 Lozano J., Berra E., Municio M.M., Diaz-Meco M.T., Dominguez I., Sanz L., Moscat J. (1994) Protein kinase C zeta isoform is critical for kappa B-dependent promoter activation by sphingomyelinase. J. Biol. Chem. 269(30):19200-19202 Marcinkiewicz J., Grabowska A., Bereta J., Stelmaszynska T. (1995) Taurine chloramine, a product of activated neutrophils, inhibits in vitro the generation of nitric oxide and other macrophage inflammatory mediators. J. Leukoc. Biol. 58(6):667-674 - 135 - Literatur Markowitz H., Cartwright G.E., Wintrobe M.M. (1959) Studies on copper metabolism. XXVII. The isolation and properties of an erythrocyte cuproprotein (erythrocuprein). J. Biol. Chem. 234(1):40-45 Marletta M.A. (1993) Nitric Oxide Synthase Structure and Mechanism. J. Biol. Chem. 268(17):12231-12234 Martin S., Phillips D.C., Szekely-Szucs K., Elghazi L., Desmots F., Houghton J.A. (2005) Cyclooxygenase-2 inhibition sensitizes human colon carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis through clustering of DR5 and concentrating deathinducing signaling complex components into ceramide-enriched caveolae. Cancer Res. 65(24):11447-11458 Massague J., Czech M.P., Iwata K., DeLarco J.E., Todaro G.J. (1982) Affinity labeling of a transforming growth factor receptor that does not interact with epidermal growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79(22):6822-6826 Merényi G., Lind J. (1997) Thermodynamics of peroxynitrite and its CO2 adduct. Chem. Res. Toxicol. 10(11):1216-1220. Merényi G., Lind J. (1998) Free radical formation in the peroxynitrous acid (ONOOH)/peroxynitrite (ONOO-) system. Chem. Res. Toxicol. 11(4):243-246. Mertens A., Holvoet P. (2001) Oxidized LDL and HDL: antagonists in atherothrombosis. FASEB J. 15(12):2073-2084 Mills G.C. (1959) The purification and properties of glutathione peroxidase of erythrocytes. J. Biol. Chem. 234(3):502-506 Milstien S., Katusic Z. (1999) Oxidation of tetrahydrobiopterin by peroxynitrite: implications for vascular endothelial function. Biochem. Biophys. Res. Commun. 63(3):681-684 Minnich V., Smith M.B., Brauner M.J., Majerus P.W. (1971) Glutathione biosynthesis in human erythrocytes. I. Identification of the enzymes of glutathione synthesis in hemolysates. J. Clin. Invest. 50(3):507-513 Moens A.K., Kass D.A. (2006) Tetrahydrobiopterin and Cardiovascular Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26:2439-2444 Moncada S., Palmer R.M., Higgs E.A. (1991) Nitric oxide: pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev. 43(2):109-142 physiology, - 136 - Literatur Morgan E.T., Ullrich V., Daiber A., Schmidt P., Takaya N., Shoun H., McGiff J.C., Oyekan A., Hanke C.J., Campbell W.B., Park C.S., Kang J.S., Yi H.G., Cha Y.N., Mansuy D., Boucher J.L. (2001) Cytochromes P450 and flavin monooxygenases targets and sources of nitric oxide. Drug. Metab. Dispos. 29(11):1366-1376 Morita A., Werfel T., Stege H., Ahrens C., Karmann K., Grewe M., Grether-Beck S., Ruzicka T., Kapp A., Klotz L.O., Sies H., Krutmann J. (1997) Evidence that singlet oxygen-induced human T helper cell apoptosis is the basic mechanism of ultravioletA radiation phototherapy. J. Exp. Med. 186(10):1763-1768 Murphy M.E., Sies H. (1991) Reversible conversion of nitroxyl anion to nitric oxide by superoxide dismutase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(23):10860-10864 Muzio M., Stockwell B.R., Stennicke H.R., Salvesen G.S., Dixit V.M. (1998) An induced proximity model for caspase-8 activation. J. Biol. Chem. 273(5):2926-2930 Nichol C.A., Lee C.L., Edelstein M.P., Chao J.Y., Duch D.S. (1983) Biosynthesis of tetrahydrobiopterin by de novo and salvage pathways in adrenal medulla extracts, mammalian cell cultures, and rat brain in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80(6):1546-1550 Odajima J., Matsumura I., Sonoyama J., Daino H., Kawasaki A., Tanaka H., Inohara N., Kitamura T., Downward J., Nakajima K., Hirano T., Kanakura Y. (2000) Full oncogenic activities of v-Src are mediated by multiple signaling pathways. Ras as an essential mediator for cell survival. J. Biol. Chem. 275(31):24096-24105 Page E. (1962) Cat heart muscle in vitro. III. The extracellular space. J. Gen. Physiol. 46:201-213 Palamanda J.R., Kehrer J.P. (1992) Inhibition of protein carbonyl formation and lipid peroxidation by glutathione in rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 293(1):103-109 Palmer R.M., Ashton D.S., Moncada S. (1988) Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature 333(6174):664-666 Panasenko O.M., Briviba K., Klotz L.O., Sies H. (1997) Oxidative modification and nitration of human low-density lipoproteins by the reaction of hypochlorous acid with nitrite. Arch. Biochem. Biophys. 343(2):254-259 - 137 - Literatur Panse J., Hipp M.L., Bauer G. (1997) Fibroblasts transformed by chemical carcinogens are sensitive to intercellular induction of apoptosis: implications for the control of oncogenesis. Carcinogenesis 18(2):259-264 Park E., Quinn M.R., Wright C.E., Schuller-Levis G. (1993) Taurine chloramine inhibits the synthesis of nitric oxide and the release of tumor necrosis factor in activated RAW 264.7 cells. J. Leukoc. Biol. 54(2):119-124 Philchenkov A., Zavelevich M., Kroczak T.J., Los M. (2004) Caspases and cancer: mechanisms of inactivation and new treatment modalities. Exp. Oncol. 26(2):82-97 Pigiet V.P., Conley R.R. (1977) Purification of thioredoxin, thioredoxin reductase, and glutathione reductase by affinity chromatography. J. Biol. Chem. 252(18):63676372 Pohjanpelto P., Hölttä E. (1983) Arginase activity of different cells in tissue culture. Biochim. Biophys. Acta. 757(2):191-195. Portess D.I., Bauer G., Hill M.A., O´Neill P. (2007) Low-dose irradiation of nontransformed cells stimulates the selective removal of precancerous cells via intercellular induction of apoptosis. Cancer Res. 67(3):1246-1253 Puyraimond A., Weitzman J.B., Babiole E., Menashi S. (1999) Examining the relationship between the gelatinolytic balance and the invasive capacity of endothelial cells. J. Cell. Sci. 112(Pt.9):1283-1290 Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. (1991a) Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch. Biochem. Biophys. 288(2):481-487 Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. (1991b) Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. J. Biol. Chem. 266(7):4244-4250 Rees D.D., Palmer R.M., Moncada S. (1989) Role of endothelium-derived nitric oxide in the regulation of blood pressure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(9):3375-3378 Reinehr R., Becker S., Eberle A., Grether-Beck S., Häussinger D. (2005) Involvement of NADPH oxidase isoforms and Src family kinases in CD95-dependent hepatocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 280(29):27179-27194 - 138 - Literatur Riede U.N., Schaefer H.E. (1999) Allgemeine und spezielle Pathologie. 4., aktualisierte Auflage. Georg Thieme Verlag Rocic P., Lucchesi P.A. (2005) NAD(P)H oxidases and TGF-beta-induced cardiac fibroblast differentiation: Nox-4 gets Smad. Circ. Res. 97(9):850-852 Ross R. (1999) Atherosclerosis - an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340(2):115-126 Rubbo H., Radi R., Trujillo M., Telleri R., Kalyanaraman B., Barnes S., Kirk M., Freeman B.A. (1994) Nitric oxide regulation of superoxide and peroxynitritedependent lipid peroxidation. Formation of novel nitrogen-containing oxidized lipid derivatives. J. Biol. Chem. 269(42):26066-26075 Saed G.M., Zhang W., Diamond M.P. (2000) Effect of hypoxia on stimulatory effect of TGF-beta 1 on MMP-2 and MMP-9 activities in mouse fibroblasts. J. Soc. Gynecol. Investig. 7(6):348-354 Saran M., Bors W. (1994) Signalling by O2-. and NO.: how far can either radical, or any specific reaction product, transmit a message under in vivo conditions? Chem. Biol. Interact. 90(1):35-45 Saran M., Beck-Speier I., Fellerhoff B., Bauer G. (1999) Phagocytic killing of microorganisms by radical processes: consequences of the reaction of hydroxyl radicals with chloride yielding chlorine atoms. Free Radic. Biol. Med. 26(3-4):482-490 Schenke J. (2006) Apoptoseinduktion bei humanen Tumorzellen durch Hemmung ihrer Katalase. Dissertation an der Medizinischen Fakultät der Albert-LudwigsUniversität Freiburg Schimmel M., Bauer G. (2002) Proapoptotic and redox state-related signaling of reactive oxygen species generated by transformed fibroblasts. Oncogene 21(38):5886-5896 Schmidt K., Mayer B. (2004) Consumption of nitric oxide by endothelial cells: evidence for the involvement of a NAD(P)H-, flavin- and heme-dependent dioxygenase reaction. FEBS Lett. 577(1-2):199-204 Schwieger A., Bauer L., Hanusch J., Sers C., Schäfer R., Bauer G. (2001) ras oncogene expression determines sensitivity for intercellular induction of apoptosis. Carcinogenesis. 22(9):1385-1392 - 139 - Literatur Selleri C., Sato T., Raiola A.M., Rotoli B., Young N.S., Maciejewski J.P. (1997) Induction of nitric oxide synthase is involved in the mechanism of Fas-mediated apoptosis in haemopoietic cells. Br. J. Haematol. 99(3):481-489 Shen B., Jensen R.G., Bohnert H.J. (1997) Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals. Plant Physiol. 115(2):527-532 Shi W., Meininger C.J., Haynes T.E., Hatakeyama K., Wu G. (2004) Regulation of tetrahydrobiopterin synthesis and bioavailability in endothelial cells. Cell Biochem. Biophys. 41(3):415-434 Shiraishi H., Kato T., Atsuta K., Sumi-Ichinose C., Ohtsuki M., Itoh M., Hishida H., Tada S., Udagawa Y., Nagatsu T., Hagino Y., Ichinose H., Nomura T. (2003) cGMP inhibits GTP cyclohydrolase I activity and biosynthesis of tetrahydrobiopterin in human umbilical vein endothelial cells. J. Pharmacol. Sci. 93(3):265-271 Siegenthaler W., Blum H.E. (2006) Klinische Pathophysiologie. 9., völlig neu bearbeitete Auflage. Georg Thieme Verlag Stennicke H.R., Jürgensmeier J.M., Shin H., Deveraux Q., Wolf B.B., Yang X., Zhou Q., Ellerby H.M., Ellerby L.M., Bredesen D., Green D.R., Reed J.C., Froelich C.J., Salvesen G.S. (1998) Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. J. Biol. Chem. 273(42):27084-27090 Stuehr D.J., Cho H.J., Kwon N.S., Weise M.F., Nathan C.F. (1991) Purification and characterization of the cytokine-induced macrophage nitric oxide synthase: an FADand FMN-containing flavoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(17):7773-7777 Stuelten C.H., DaCosta Byfield S., Arany P.R., Karpova T.S., Stetler-Stevenson W.G., Roberts A.B. (2005) Breast cancer cells induce stromal fibroblasts to express MMP-9 via secretion of TNF-alpha and TGF-beta. J. Cell. Sci. 118(Pt.10):2143-2153 Sturrock A., Cahill B., Norman K., Huecksteadt T.P., Hill K., Sanders K., Karwande S.V., Stringham J.C., Bull D.A., Gleich M., Kennedy T.P., Hoidal J.R. (2006) Transforming growth factor-beta1 induces Nox4 NAD(P)H oxidase and reactive oxygen species-dependent proliferation in human pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290(4):L661-L673 Suh Y.A., Arnold R.S., Lassegue B., Shi J., Xu X., Sorescu D., Chung A.B., Griendling K.K., Lambeth J.D. (1999) Cell transformation by the superoxidegenerating oxidase Mox1. Nature 401(6748):79-82 - 140 - Literatur Sun Y., Oberley L.W. (1996) Redox regulation of transcriptional activators. Free Radic. Biol. Med. 21(3):335-348. Taraboletti G., D'Ascenzo S., Borsotti P., Giavazzi R., Pavan A., Dolo V. (2002) Shedding of the matrix metalloproteinases MMP-2, MMP-9, and MT1-MMP as membrane vesicle-associated components by endothelial cells. Am. J. Pathol. 160(2):673-680 Thomas J.P., Maiorino M., Ursini F., Girotti A.W. (1990) Protective action of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase against membrane-damaging lipid peroxidation. In situ reduction of phospholipid and cholesterol hydroperoxides. J. Biol. Chem. 265(1):454-461 Trushina E., McMurray C.T. (2007) Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience 145(4):1233-1248 Tsujimoto Y., Saitoh K., Kashima M., Shiozawa A., Kozuka M., Hashizume H., Kimura K., Yamazaki M., Fujii A. (1998) Effect of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on lipid peroxidation by hydroxyl radical. Gen. Pharmacol. 31(3):405-408 Turrens J.F. (1997) Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Biosci. Rep. 17(1):3-8 Van Berkel T.J., De Rijke Y.B., Kruijt J.K. (1991) Different fate in vivo of oxidatively modified low density lipoprotein and acetylated low density lipoprotein in rats. Recognition by various scavenger receptors on Kupffer and endothelial liver cells. J. Biol. Chem. 266(4):2282-2289 Van der Vliet A., Hoen P.A., Wong P.S., Bast A., Cross C.E. (1998) Formation of Snitrosothiols via direct nucleophilic nitrosation of thiols by peroxynitrite with elimination of hydrogen peroxide. J. Biol. Chem. 273(46):30255-30262 Van Empel V.P., Bertrand A.T., van Oort R.J., van der Nagel R., Engelen M., van Rijen H.V., Doevendans P.A., Crijns H.J., Ackerman S.L., Sluiter W., De Windt L.J. (2006) EUK-8, a superoxide dismutase and catalase mimetic, reduces cardiac oxidative stress and ameliorates pressure overload-induced heart failure in the harlequin mouse mutant. J. Am. Coll. Cardiol. 48(4):824-832 Vásquez-Vivar J., Kalyanaraman B., Martásek P., Hogg N., Masters B.S., Karoui H., Tordo P., Pritchard K.A. Jr. (1998) Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(16):9220-9225 - 141 - Literatur Vaux D.L. (1993) Toward an understanding of the molecular mechanisms of physiological cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(3):786-789 Villunger A., Michalak E.M., Coultas L., Müllauer F., Böck G., Ausserlechner M.J., Adams J.M., Strasser A. (2003) p53- and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa. Science. 302(5647):1036-1038 Weinberg R.A. (1989) Oncogenes, antioncogenes, and the molecular bases of multistep carcinogenesis. Cancer Res. 49(14):3713-3721 Weinmann M., Jendrossek V., Güner D., Goecke B., Belka C. (2004) Cyclic exposure to hypoxia and reoxygenation selects for tumor cells with defects in mitochondrial apoptotic pathways. FASEB J. 18(15):1906-1908 Weisiger R.A., Fridovich I. (1973) Mitochondrial superoxide dismutase. Site of synthesis and intramitochondrial localization. J. Biol. Chem. 248(13):4793-4796 Wick W., Platten M., Weller M. (2001) Glioma cell invasion: regulation of metalloproteinase activity by TGF-beta. J. Neurooncol. 53(2):177-185 Williams K.J., Tabas I. (1995) The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15(5):551-561 Witztum J.L., Steinberg D. (1991) Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis. J. Clin. Invest. 88(6):1785-1792 Woenckhaus C., Kaufmann A., Bussfeld D., Gemsa D., Sprenger H., Gröne H.J. (1998) Hypochlorite-modified LDL: chemotactic potential and chemokine induction in human monocytes. Clin. Immunol. Immunopathol. 86(1):27-33 Wolf B.B., Green D.R. (1999) Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases. J. Biol. Chem. 274(29):20049-20052 Wright C.E., Tallan H.H., Lin Y.Y., Gaull G.E. (1986) Taurine: biological update. Annu. Rev. Biochem. 55:427-453 Wu G., Chai J., Suber T.L., Wu J.W., Du C., Wang X., Shi Y. (2000) Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO. Nature 408(6815):1008-1012 Yamaguchi Y., Nasu F., Harada A., Kunitomo M. (2007) Oxidants in the gas phase of cigarette smoke pass through the lung alveolar wall and raise systemic oxidative stress. J. Pharmacol. Sci. 103(3):275-282 - 142 - Literatur Yamamoto M, Tsujishita H., Hori N., Ohishi Y., Inoue S., Ikeda S., Okada Y. (1998) Inhibition of membrane-type 1 matrix metalloproteinase by hydroxamate inhibitors: an examination of the subsite pocket. J. Med. Chem. 41(8):1209-1217 Yang Q.H., Church-Hajduk R., Ren J., Newton M.L., Du C. (2003) Omi/HtrA2 catalytic cleavage of inhibitor of apoptosis (IAP) irreversibly inactivates IAPs and facilitates caspase activity in apoptosis. Genes Dev. 17(12):1487-1496 Yantiri F., Morré D.J. (2001) Isolation and characterization of a tumor-associated NADH oxidase (tNOX) from the HeLa cell surface. Arch. Biochem. Biophys. 391(2):149-159 Yim M.B., Chock P.B., Stadtman E.R. (1990) Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87(13):5006-5010 Yu Q., Stamenkovic I. (2000) Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14(2):163-176 Zhang R., Brennan M.L., Fu X., Aviles R.J., Pearce G.L., Penn M.S., Topol E.J., Sprecher D.L., Hazen S.L. (2001) Association between myeloperoxidase levels and risk of coronary artery disease. JAMA 286(17):2136-2142 Zhuang S., Demirs J.T., Kochevar I.E. (2001) Protein kinase C inhibits singlet oxygen-induced apoptosis by decreasing caspase-8 activation. Oncogene 20(46):6764-6776 Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. (1999) An APAF-1 cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem. 274(17):1154911556 Zou L.B., Yamada K., Tanaka T., Kameyama T., Nabeshima T. (1998) Nitric oxide synthase inhibitors impair reference memory formation in a radial arm maze task in rats. Neuropharmacology 37(3):323-330 Zouaoui Boudjeltia K., Moguilevsky N., Legssyer I., Babar S., Guillaume M., Delree P., Vanhaeverbeek M., Brohee D., Ducobu J., Remacle C. (2004) Oxidation of low density lipoproteins by myeloperoxidase at the surface of endothelial cells: an additional mechanism to subendothelium oxidation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325(2):434-438 - 143 - Literatur Zucker B., Hanusch J., Bauer G. (1997) Glutathione depletion in fibroblasts is the basis for apoptosis-induction by endogenous reactive oxygen species. Cell Death Differ. 4(5):388-395 - 144 - Danksagung 9 Danksagung Ich möchte mich vor allem bei Professor Georg Bauer dafür bedanken, dass ich meine Promotion in seinem Labor durchführen konnte, insbesondere danke ich für kontinuierliches großes Interesse an meiner Arbeit, spannende Diskussionen und viele Ideen. Außerdem danke ich Ania und Nils für die Einarbeitung in die Arbeitstechniken zu Beginn der Laborzeit, für viele anregende Gespräche sowie Kathrin und Florentina für eine gute Zusammenarbeit. Herrn Brandel möchte ich für das schnelle und unkomplizierte Einscannen der Zellkulturbilder danken. Ganz besonders möchte ich mich bei Miriam bedanken für die schöne Zeit, ihre Unterstützung und ihr Verständnis. Vielen Dank meinen Eltern für ihre Unterstützung während des Studiums und der Promotion. (11b) TGFβR (2p) H2O2 NO nNOS •— NA D O2 ra c (8m) Sp h my ingo elin - Fa CD s-L 95L TR AP AIL O2 L S mtNO FADD Procasp. 8 TR AD D TN F-α N-HydroxyArginin (2h) BH2 BH4 (2e) Arginin (2i) DihydrofolatReduktase Ornithin Arg ina se Harnstoff -P Glutamin Cystein (8r) ase H2O γ-Glutamylcystein-Synthetase (3a) gp47 Katalase GSH Synthetase id H-Ox NADP POD POD (8k) NADP GPx 4 H2O+O2 (8g) GSH +ROOR + γ-Glutamylcystein Glycin 1 in yel GP x m ngo (8s) G-6-PDH ase (8q) Sm (10e) NADPH x1 P G (8l) hi Sp rale Fe H2O2 Thioredoxin-S2 (8o) (8n) GSH Reduktase H2O D PO ThioredoxinReduktase ROH+ GSSG (8s) P (10f) ut Ne 2+ IV O2 ase xid -P H2O2 III H2O2 (5b) *OH +OH— (5a) (8p) MM (8q) NADPH NADP+ (10a) OD S Mn (3i) 7 • O2 — O2 Fe3+ (8f) • (3h) gp4 O2 — •— CuZnSOD (2b) II • (1c) (8a) O2 — (3e) (1d) Thioredoxin-(SH)2 O2 O2 +Cl—+O2 G-6-PDH (8h) D SO Zn Cu -P rac (8c) (10i) NO XO H2O OH ras • O2 HOCl -O PH NIK O2 (3d) v-src (10b) IkB-P +H2O+Cl—+H+ (1e) (10g) + yte l O H 2 kt ro e l E IkB O2 D NA NF-kB I 7 gp4 ac Sm i Om . C t Cy oG d En AIF (3c) (7b) O2 ra c (9q) Cl— (8d) •— (3b) • Procaspase 9 Apaf-1 dATP (10j) (9r) -1 MEKK (9o) -P (9p) JNK O2 (5b) (5c) Caspase 9 Apoptosom (10k) IAPs (8b) se ida x -O PH X-1 D NA NO Bax (10h) (1b) (2a) MMP O2 (9g) Procaspase 3 Zytokine Ca2+ OS II N n SI O =N S O II S eN O =N S O iN (2f) (2j) Fe2+ Fe3+ Caspase 3 (9e) (2d) • O2 — (2a) OH+OH— ase xid H-O -1 DP NA NOX Caspase 8 Ca2+ (6a) H2O2 (9f) (2c) (1a) (2n) (2o) SI O =N (7c) (4d) • BCL-2 c ra (2l) (2a) (4e) VDAC (9a) Bid DD A F 8 p. s a oc r P IKK (4c) N2O3 (9j) (9h) JNKK NO2 (5a) (10d) ANT P RI 2 FA TR (9n) NOXA (11c) Citrullin NO3- OH NO2Cl Ceramid CyP-D T Re NFzep tor1 H2 truncated Bid DD A F .8 sp a oc Pr (9b) • • PUMA Saure Smase C-Jun (2k) H+ (10c) p53 (9d) O2 (4b) (9k) (9m) R5 (4a) (1f) 7 gp4 DR 4 /D O2 NO2— (9i) (9c) eNOS (9m) pkczeta -P iNOS gp47 (11a) Fa =C s D =A 9 5 po1 H2O+O2 gp4 7 (1e) PH NO Oxida X-1 se (8d) O2 se a d xi -O -1 PH OX D A N (7e) (7d) 1 se tala Ka H2O2 O2 (6b) (2a) 47 p g (8c) N O NO — O NO O OH Cyt Oxido . P450 reduk tase TG FβR (2s) (6c) (9l) O2 +OH— (2m) ONOO— ONOOH NOD Cyt. P450 Oxidored. (11d) •— (2q) D PO TGFβ1 LAP OH -P O2 (7a) H+ -P (11b) (8d) (2r) O2 (2l) H2O2 (6d) (2k) (11d) (8b) • NO— 7 gp4 NO3- (8i) • XO (8j) O2 (11a) H2O2 NOD -P gp4 7 ida se PO D NA DP H-O x rac O2 •— (1e) D SO Zn + ] Cu [Cu H O2 ase xid H-O -1 DP NA NOX (6e) + (8e) D SO Zn + ] Cu [Cu (4a) OD CuZnS GC TGFβ1 LAP Sep i Red apterin 6-P ukta yr se Tet uvoylra h 5 , 6 ydr 7,8 opt ,7,8-Dih erin yd Trip roneo hos p 6 Tet pha terinrah -Pyruv t ydr opt oylerin GT GT -Sy P P-C nth . yclo GC hydrol ase H1 (2g)