Bachelor Modul biol113
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1 Bachelor-Modul biol113 ZELLBIOLOGIE 1: Themen und Stichwörter WS2014/15 Stand: 2.2.2015 Die Folien, die im Rahmen der Vorlesung gezeigt werden, sind u.a. folgenden Büchern und BIUZ-Artikeln entnommen: Buchanan, Gruissem, Jones (2000, 2002) Biochemistry and Molecular Biology of Plants, ASPB, Rockville, Maryland Strasburger (2008) Allgemeine Botanik, Spektrum Verlag Alberts (2011) Molekularbiologie der Zelle, Wiley/VCH Lodish (2012) Molecular Cell Biology, Int. Student Version Karp (2008) Molekulare Zellbiologie, Springer-Verlag Karp (2013) Cell Biology, Int. Student Version Ude/Koch (1994): Die Zelle – Atlas der Ultrastruktur, G. Fischer Verlag Gunning/Steer (1996) Bildatlas zur Biologie der Pflanzenzelle, G. Fischer-Verlag BIUZ-Artikel: Autophagie – Heft 6/2012, S. 374 ff. Grüne Tiere – Heft 3/2009, S. 11 Mitochondrienfalten – Heft 5/2013, S. 270 Mikroskopie jenseits der Auflösungsgrenze – Heft 4/2012, S. 244 Plastiden-Proteinimport – Heft 2/2013, S. 74 Plastidensignale – Heft 5/2011, S. 298 ff. Stromuli – Heft 3/2010, S. 162-170 1. Doppelstunde - Einführung Allgemeines zur Zelle Die Zelle als Grundeinheit des Lebens, Kriterien, Grundeigenschaften aller Zellen Geschichte der Zellbiologie und Mikroskopie Größe von Zellen Vergleich von Procyte und Eucyte Definition: Kompartiment, Organellen, „semiautonome Organellen (Plastiden und Mitochondrien) Kompartimente der Eucyte Kompartimentierungsregel Meristematische und ausdifferenzierte Zellen, Anteile verschiedener Kompartimente am Zellvolumen 1 2 2. Doppelstunde am 3.11.2014 – Methoden der Zellbiologie Mikroskopie Literatur: BIUZ 4/2012, S.244-253 Auflösungsvermögen von Auge, Licht- und Elektronenmikroskop Größenbereiche der Licht- und Elektronenmikroskopie Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (TEM, REM) Physikalische Verfahren zur Verbesserung des Kontrasts: Phasenkontrastmikroskopie Fluoreszenzmikroskopie und CLSM: Anregungs- und Emissionslicht Primärfluoreszenz- und Sekundärfluoreszenz 2 Verfahren zum Nachweis von Proteinen: 1. Immunologischer Nachweis: Unterscheidung zwischen erstem spezifischen und zweitem Antikörper, der mit Fluoreszenzfarbstoff, Enzym oder Goldkügelchen gekoppelt ist 2. Gentechnischer Ansatz: GFP-Fusionskonstrukte, GFP als Reporter Nobelpreis 2008 für die Entdeckung und Anwendung von GFP in der Zellbiologie Mit GFP können auch Kompartimente sichtbar gemacht werden. Hochauflösende Mikroskopie jenseits der Auflösungsgrenze: Nobelpreis 2014 für zwei Verfahren zur Überwindung der Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie: PALM – Photoaktivierte Fluoreszenzmikroskopie STED – stimulated emission depletion Biochemische Schlüsselmethoden der Zellbiologie Trennung von Organellen nach Dichte: 1. Differenentialzentrifugation 2. Dichtegradientenzentrifugation Dichten verschiedener Zellbestandteile: 2 Svedberg Konstante 3 3. Doppelstunde am 10.11.2014 Vorbereitung: großer Alberts (2011) Membranen Funktionen von Membranen: Abgrenzung, Rezeption, Energiegewinnung etc. 2 Seiten der Membran: exoplasmatische und plasmatische Seite Membranen sind dünne zweidimensionale Flüssigkeiten (Fluid mosaic Modell) Grundlage der Struktur: Membranlipide sind amphipatisch Membranlipidklassen: - Phopholipide - Galaktolipide - Ceramide bzw. Sphingolipide - Sterole wie Cholesterin Beweglichkeit der Lipide: lateral, Rotation, Flip-Flop katalysiert durch Flippasen Zwei Grundeigenschaften von Membranen: 1. Asymmetrie Phosphatidylserin als Marker der endoplasmatischen Seite 2. Laterale Heterogenität z.B. Lipid Rafts Fluidität, Schmelztemperatur Regulation von Änderungen durch Umbau Fettsäuren, Sterole, LTP, PLA2 Vergleich verschiedener Membranen der Pflanzenzelle (prozentuale Angaben): Lipidklasse MGDG DGDG SL PC PE PS andere Plastide, Hülle 35 30 6 20 1 0 8 Thylakoidmembran 51 26 7 3 0 0 13 Mito. Inn. Membran 0 0 0 27 29 25 19 Plasmamembran 0 0 0 32 46 0 22 Peroxisom 0 0 0 52 48 0 0 Lipide geben Auskunft über die Evolution: Die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran verschiedener Bakterien und der Membranen der eukaryotischen Organellen liefert Belege für die Endosymbiontentheorie. Beispielsweise kommen in der Plasmamembran von Cyanobakterien Galaktolipide vor, die in der Eucyte nur in den Plastidenmembranen zu finden sind. Markerlipide der Organellen: Chloroplasten: Galaktolipide (MGDG, DGDG), Sulfolipid Mitochondrien: Cardiolipin Die Galaktolipide und Sulfolipide der Chloroplasten sind Phosphor-Sparlipide. 3 4 Membranproteine: Vergleich von Membranen im Hinblick auf Verhältnis von Proteinen zu Lipiden Membran Myelinscheide PM Erythrocyten PM Leberzellen Äußere Mitochondrienmembran Innere Mitochondrienmembran Purpurmembran Protein 18 49 44 52 Lipide 79 43 52 48 Kohlenhydrate 3 8 4 0 75 25 0 75 25 0 75% Protein in innerer Mitochondrienmembran und in Purpurmembran weniger als 20% Protein in Myelinscheidenmembranen Integrale und periphere Membranproteine (MP): Integrale MP: Single- und multi-pass Proteine (alpha-Helices) ß-Fass-Proteine bei Bakterien und Organellen, u.a. Porine mit 16 ß-Faltblättern Integrale MP und Transport: Durchlässigkeit von Membranen Transporter: Carrier (Symporter, Antiporter), Ionenkanäle und Pumpen Verankerung peripherer MP an Membran: 1. nichtkovalente Wechselwirkungen mit integralen MP 2. kovalente Bindung an Lipidanker, z.B. innen: Prenylreste, Myrsitinsäure außen: Phosphatidylinositol (PIP) Gefrierbruchpräparate zur Untersuchung von Membranen: 4 Flächen einer Membranen: Oberflächen und Bruchflächen Visualisierung von Proteinkomplexen (Größe, Verteilung) Nachweis der Beweglichkeit von Proteinen in der Membran Fusion von 2 Zellen mit unterschiedlichen Membranproteinen Antikörper mit Fluoreszenz erkennen Epitope; Messung der Zeit bis zur homogenen Verteilung 4 5 4. Doppelstunde am 17.11.2014 Synthese von Proteinen an verschiedenen Ribosomen Cytoplasma: 80S (40S und 60S) Organellen (Plastiden, Mitochondrien): 70 S (30S und 50S) Targeting von Proteinen, die an 80S Ribosomen hergestellt werden Kompartiment Sequenz Lage der Sequenz Zellkern Peroxisom Plastide im Protein C-Terminus N-Terminus ER/Golgi NLS, basische Aminosäuren PTS: Aminosäuren SKL PTP (Plastiden Target-Peptid) Transitsequenz MTP (Mitochondrien Target-P.) Präsequenz Signalsequenz Vakuole Signalsequenz und VSS N- oder C-Terminus Mitochondrium N-Terminus N-Terminus Transport, Prozessierung gefaltet gefaltet ungefaltet Protease im Stroma ungefaltet Protease in Matrix ungefaltet Protease im ER-Lumen Spaltung vor oder nach Transport Posttranslationale Prozessierung bei Organellenproteinen und ER-Proteinen: N-terminale Targetsequenzen werden durch spezifische Proteasen abgespalten. Bei den MTP und PTP gibt es eindeutige und zweideutige Sequenzen. Mit letzteren gelangen die Proteine in beide Organellen (duales Targeting). Beispiel: Von 24 als GFP-Fusionsproteine getesteten Aminoacyl-tRNA-Synthetasen werden 15 dual in Plastiden und Mitochondrien importiert. Methode zum Test der subzellulären Lokalisation eines Proteins: Biolistische Transformation von Zwiebelepidermiszellen mit GFP-Fusionskonstrukten zur Überprüfung des Targeting, BIUZ 3/2010 Das Endomembransystem Vor- und Nachbereitungsempfehlung: Alberts (2011) Übersicht über das Endomembransystem Kernhülle Endoplasmatisches Retikulum Golgiapparat Hypothese zur Co-Evolution von Zellkern und Endomembransystem; Membranlipide stammen sind eubakteriellen Typs, nicht archaebakteriell, Vesikel aus diesen Lipiden haben sich nach der primären Endosymbiose (Mitochondrien) um Genmaterial herumgelagert Endoplasmatisches Retikulum Hauptdomänen des ER: Kernhülle; raues und glattes ER Weitere funktionelle Subdomänen: Kontaktstellen zu den Organellen Stellen für Proteinkörperchenbildung (raues ER) Stellen für Ölkörperchenbildung (glattes ER) 5 6 Kontakte mit Cytoskelett Ribosomen am ER, Polysomenbildung Vektorielle Translation von Proteinen mit Signalsequenzen am N-Terminus (Ausnahme bei multi pass Membranproteinen, s. Alberts) Signalsequenzerkennungspartikel (SRP): Aufbau aus 5 Proteinen und einer RNA Das SRP ist wie auch die Ribosomen ein Ribonukleoprotein-Komplex. Auf einer Seite bindet es an die Signalsequenz, auf der anderen Seite an den SRP-Rezeptor in der ER-Membran. Prozessierung von löslichen Proteinen: ER-Membranproteine können wie die löslichen Proteine im Lumen prozessiert werden (Abspaltung des N-terminalen Signalpeptids). Dann weist der neue N-Terminus zum Lumen. Das Protein bleibt mit einem hydrophoben Sequenzabschnitt in der Membran (StoppTransfer-Sequenz). anterograder und retrograder Vesikeltransport zwischen ER und Dictyosomen cis- und trans-Seiten von ER und Dictyosomen Was passiert mit Proteinen im ER? Prozessierung durch Signalpeptidase Faltung und Oligomerisierung unter Beteiligung von Chaperonen, u.a. Bip, Calnexin S-S Brücken (intra- und intermolekular) N- Glykosylierung an Asparaginresten – Dolichol als Lipid-Carrier für Oligosaccharide Qualitätskontrolle im ER, Export von falsch gefalteten Proteinen zum Abbau durch Proteasom im Zellkern Besondere Domänen des ER in der Pflanzenzelle: Bildung von Ölkörperchen am glatten ER. Diese auch Oleosomen genannten Körperchen enthalten Triglyzeride, sind von einer monomolekularen Schicht von Phospholipiden umgeben, auf die Oleosine aufgelagert sind. Oleosine stabilisieren die Oleosomen. Bildung von Proteinkörperchen am rauen ER; Speicherproteine (Globuline, Prolamine) 5. Doppelstunde am 24.11.2014 (H.-P. Mock) Aufbau von Proteinen: Primär- Sekundär-, Tertiärstruktur; Funktion von Co-Chaperonen bei der Proteinfaltung Enzymaktivität; Schlüssel-Schloß-Prinzip vs. Induced fit; Cofaktoren; Michaelis-Menten-Kinetik Dimere/Komplexe; Bespiel RuBisCo Omics-Techniken, Vergleich Transkriptom/Proteom; Post-translationale Modifikation (Bespiele: RuBisCo kleine Untereinheit; Phosphorylierung/Dephosphorylierung der Nitratreduktase) Dynamik des Proteoms, Einfluss von Entwicklungsprogrammen und Stressfaktoren Trenntechniken für komplexe Proteinproben (SDS-PAGE, 2-D Gelelektrophorese) Isoelektrischer Punkt von Proteinen Färbetechniken für Proteine (Sensitivität, dynamischer Bereich) Gezielter Nachweis und Quantifizierung von Proteinen: Western-Blotting 6 7 Identifizierung von Proteinen über Massenspektrometrie: Typtischer Verdau, PeptidmassenFingerprint, Peptidsequenzierung mit MS/MS-Techniken Funktionsweise eines MALDI-TOF-MS. 6. Doppelstunde am 1.12.2014 Der Golgiapparat Aufbau aus Dictyosomen Subzelluläre Lokalisation von Dictyosomen. Tierzelle: um den Kern herum Pflanzenzelle: um Kern und im Cytoplasmasaum am Rand der Zellen Eine normale Pflanzenzelle enthält ca. 20-400 Dictyosomen. Dictyosomen können durch Teilung vermehrt werden. Sortierung von Proteinen zwischen ER und Dictyosomen KDEL-Sequenz bei ER-Proteinen Allgemeine Funktionen des Golgiapparates: O-Glykosylierung Glykolipidsynthese Spezielle Funktionen in der Pflanzenzelle: Synthese komplexer Polysaccharide für die Zellwand Synthese von Lignin-Vorstufen Schleimproduktion bei Zellen der Wurzelhaube (Kalyptra) Vesikel des Endomembransystems (Vesikel haben variablen Inhalt): Vesikelbildung, Hüllproteine: COPI für retrograden Transport (Golgi zum ER) COPII für anterograden Transport (ER zum Golgi) Clathrin für Transport zur Vakuole und für Endocytose Hülle der Vesikel erfüllt mehrere Funktionen: - Bildung der Vesikel (mechanisch) - Sortierung des Inhalts - Zielsteuerung Zielsteuerung über SNARE-Proteine: v-SNARE t-SNARE SNARE-Proteine bilden Dimere an der Zielmembran Energiebedürftiger Prozess: Beteiligung von Rab-GTPasen (phylogenetisch alte Proteinfamilie, typisch für Eucyten) Der Zellkern Aufbau des Zellkerns: Kernhülle (doppelte Hüllmembran, verbunden mit ER) Poren mit Kernporenkomplexen Kernmatrix Kernlamina: Lamine sind Intermediärfilamente, verankert in Kernmembran über einen Prenylrest Phosphorylierung: Auflösung der Lamina vor der Mitose 7 8 Nucleolus: Transkription der ribosomalen Gene (rDNA, hochrepetitiv) Bildungsort für RNA-Proteinkomplexe Präribosomen, Prozessierung der rRNA durch sno-RNA (small nucleolar RNAs) SRP U6-snRNP (Untereinheit des Spleißapparats) Telomerase Kernporenkomplexe (NPC): 30 verschiedene Proteine Achtstrahlige Symmetrie, Korbbildung aus 8 Filamenten (Länge: 100 nm) Transport in den Kern und aus dem Kern, NLS, Importine, NES, Exportine, Ran GTP Kernproteine größer 40kD brauchen eine Kernlokalisationssequenz (NLS), Centromer mit Kinetochoren zur Verankerung der Mikrotubuli Chromatin: Eu- und Heterochromatin (fakultativ und konstitutiv) Histone: H1-Linkerhiston, H2A, H2B, H3, H4 Modifikationen an Histonen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung Nukleosomen: Histonoktamere aus H2A, H2B, H3, H4 und 168 bp DNA Epigenetik, Chromatinmodellierung, Histon-Code Histon-Modifikationen: Acetylierung, Phophorylierung, Methylierung Acetylierung: Lockerung des Chromatins, erhöhte Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren Telomere, Telomerase (RNA-als Matrize) Krebszellen haben erhöhte Telomeraseaktivität 7. Doppelstunde am 8.12.2014 Das Cytoskelett Funktionen: Verankerung, Bewegungen von Zellbestandteilen (Komparetimenten, Vesikeln, Ribosomen u.a.), Information über Polarität Grundkomponenten: Untereinheit Aktin Mikrotubuli Intermediärfilamente Grundbaustein G-Aktin α-, ß-Tubulin Heterodimer nicht besprochen Polymer Aktinfilament Mikrotubulus aus 13 Protofilamenten nicht besprochen Durchmesser 6 nm 25 nm 10 nm Polarer Aufbau von Aktinfilamenten und Mikrotubuli (+- und – Pol) Zerfall und Assemblierung Gifte, die auf das Cytoskelelett abzielen: Colchicin, Taxol: Mikrotublin Phalloidin, Cytochalasin B: Aktin Bewegung und Verankerung von Organellen und anderen Kompartimenten bei Tier und Pflanze 8 9 Kompartiment ER Golgi Mitochondrien Plastiden Zellkern Aktinfilamente Pflanze Pflanze Pflanze Pflanze alle Eucyten Mikrotubuli Tier Tier Tier alle Eucyten Plastiden Algen haben einen bis wenige Chloroplasten pro Zelle. Höhere Pflanzen haben viele (ca. 100) Chloroplasten pro Parenchym-Zelle. Verschiedene Plastidentypen, Differenzierungsmöglichkeiten Entwicklung von Chloroplasten aus Proplastiden im Gramineenblatt - Entstehung von Thylakoiden: Vesikel aus der inneren Hüllmembran fusionieren Entwicklung von Chloroplasten aus Etioplasten (Ergrünung) - Etioplasten, Prolammellarkörper - Chlorophyllbiosynthese, Lichtabhängigkeit bei Angiospermen, ProtochlorophyllidOxidoreduktase (POR) - Entstehung von Thylakoiden bei der Ergrünung: Primärthylakoide entwickeln sich ausgehend vom Prolamellarkörper Subkompartimentierung eines Chloroplasten Zwei Hüllmembranen mit Intermembranraum Stroma Thylakoidmembran mit Lumen Struktur des Thylakoidmembransystems: Grana- und Stromathylakoide Laterale Heterogenität in der Verteilung der Komplexe des Photosyntheseapparates: Komponente % Vorkommen in Granathylakoiden % Vorkommen in Stromathylakoiden PSII 85 15 PSI 10 90 Cyt f/b6 50 50 LHCII 90 10 ATP-Synthase 0 100 Plastocyanin (Lumen) 60 9 40 10 8. Doppelstunde am 15.12.2014 Vorteile der lateralen Heterogenität in der Thylakoidmembran: 1. Langfristige Anpassung an Lichtbedingungen durch Änderung des Verhältnisses von Stroma/Granatylakoiden bzw. des Verhältnisses zwischen den Photosystemen 2. Kurzfristige Anpassung an Lichtänderungen durch „State-Transition“ State-Transition: Wanderung des LHCII zwischen PSII und PSI, Wenn PSII aktiver ist als PSI kommt es zur Reduktion des Plastochinon-Pools, dadurch wird eine Kinase aktiv, die den LHC phosphoryliert, dieser wandert dann nach PSI. Umgekehrt, wenn PSI aktiver ist als PSII, wird LHC-P dephosphoryliert und LHC wandert zurück zum PSII im Granabereich. Literatur dazu: Buchanan et al. (2000) Biochemistry & Molecular Biology of Plants, ASPB, S. 590-596 Plastidenteilung arc-Mutanten mit unterschiedlicher Größe und Zahl an Plastiden Proteine des inneren Ringes: FtsZ1,2; ARC6 Proteine des äußeren Ringes: ARC3, ARC5 Ringpositionierung durch die Min-Proteine Immunologischer Nachweis der Ringproteine Methoden: Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen: - FRET (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) - Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFc) 9. Doppelstunde am 12.1.2015 Evolution – Plastiden von höheren Pflanzen und Grünlagen gehen auf eine Endosymbiose vor ca. 1,5 Milliarden Jahren zurück, sind also monophyletisch Entstehung der Plastiden durch Endosymbiose; ein einmaliger Vorgang in der Evolution? Beispiel für eine andere Endosymbiose vor ca. 1 Million Jahren: Paulinella hat sog. Cyanellen mit ca. 1 Million bp DNA, d.h. noch 25% des ursprünglichen Genoms des Vorläufer-Cyanobakteriums (andere Gruppe als Vorläufer der Chloroplasten) Die Schnecke Elysia nimmt Chloroplasten auf und kann damit Energie gewinnen (BIUZb3/2009). Plastiden-DNA ist verpackt in polyploiden Nukleoiden, hohe Kopienzahl pro Plastide (mehrere Hundert) und pro Zelle (mehrere Tausend Kopien) Größe von Plastidengenomen: Porphyra purpurea Nicotiana tabacum Arabidopsis thaliana Hordeum vulgare Epifagus Apicomplexa 10 191 kbp 156 kbp 154 kbp 136 kbp 70 kbp 35-40 kbp 11 Sekundäre Endosymbiosen, z.B. Dinoflagellaten, Apicomplexa Apicomplexa mit Apicoplasten: Malariaerreger Biosynthesen in Plastiden ohne Photosynthese: Fettsäuren Stärke Aromatische Aminosäuren Häm Isoprenoide Plastiden-DNA (ptDNA) Größe (ca. 150 kbp) und Struktur: LSC, IRa, IRb, SSC Kodierungspotential Gennomenklatur: Tabelle BIUZ, 2011 psa, psb, pet, atp, ndh, trn, rrn, rps, rpl Evolution: Gentransfer in den Kern findet immer noch statt Beteiligung von kernkodierten und plastidenkodierten Proteinen am Aufbau des Photosynthesepparates u. a. Proteinkomplexe der Plastiden ca. 85 Proteine der Plastiden sind plastidenkodiert; 3000-4000 Proteine sind kernkodiert Aufbau des PS-Apparates erfordert Proteine von außen, innen und Kofaktoren wie Chlorophyll Import kernkodierter Plastidenproteine: TOC und TIC, Importexperiment mit radioaktioven in vitro Translationsprodukten TOM/TIM, ähnlicher Importapparat und Mechanismus bei Mitochondrien: Präsequenzen für Import; Prozessierung in Matrix und Stroma Ergänzung zum Import in Organellen Überraschungen von Proteomuntersuchungen. An einer Auswahl von 500 Proteinen des Proteoms der Chloroplasten stellte man fest: 260 haben eine PTP-Sequenz 40 haben eine MTP-Sequenz Daraus folgt:Duales Targeting in Plastiden und Mitochondrien 50 haben eine Signalpeptid (SP)-Sequenz Daraus folgt: Alternativer Importweg in die Plastiden: ER- oder Golgi-Vesikel Diese Proteine kann man auch an Glykosylierung erkennen. 140 haben keine N-terminale Targetingsequenz Bei diesen weiß man noch nicht, wie sie in das Organelle gelangen Regulation des Proteinimportapparates über das UPS (Ubiquitin-Proteasom-System): Während der Ergrünung wird Importrezeptor von TOC abgebaut und neuer inseriert. Dies hat andere Spezifität zum Import von Proteinen zur Folge (BIUZ 2/2013, S. 74). 11 12 10. Doppelstunde am 19.1.2015. Mitochondrien und Peroxisomen Evolution der Mitochondrien Archaezoen-Hypothese: eukaryotische Zellen ohne Mitochondrien Aber: Archaezoen (Parasiten) haben reduzierte Mitochondrien: Mitosomen ohne Genom Verwandt mit Mitochondrien: Hydrogenosomen, entwickeln Wasserstoff, können Genom besitzen Zahl der Mitochondrien pro Zelle ist stark variabel: Wurzelspitze Mais: 200-2000; Hefezelle: 1-50; Leberzelle: 1000 Subkompartimentierung: Intermembranraum und Matrix Innere Hüllmembran: Cristae Funktionen von Mitochondrien Übersicht über die Atmung: Glykolyse, Citratzyklus, Atmungskette Komplexe der Atmungskette, Alternative Oxidase ATP-Synthase, Protonengradient Photorespiration Alter: Abnahme in der Faltung der inneren Hüllmembran, Verlust der lateralen Heterogenität, Bildung von Vesikeln, Austritt von Cytochrom c: Signal für Apoptose (s. 12. Vorlesung) Größe, Form, Zahl pro Zelle Dynamik: Gleichgewicht von Fusion und Spaltung Vor Teilung von Zellen: Bildung eines grossen mitochondrialen Netzwerkes FtsZ in der Rotalge Mallomonas, sonst während der Evolution verloren gegangen Spaltung erfordert DRP (Dynamin related proteins) Genom der Mitochondrien, Mastergenom und subgenomische Formen Größe und Gengehalt der mtDNA: Mensch 17 kbp 13 Gene für Proteine, 22 tRNAs, 2 rRNAs Hefe 86 kbp 30 Gene für Proteine Pflanzen 367 kbp (At) 58 Gene für Proteine Pflanzen: Plastidengene in mitochondrialer DNA: Pseudogene Mitochondriale Gene und Funktionen Gen cob coxI nad rrn trn atp Protein Cytochrom c Apoprotein Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase Untereinheit der NADH Dehydrogenase 18SrRNA, 26SrRNA tRNA ATP Synthase rpo Gene nur bei Reclinomonas (Protozoa) 5SRNA wurde bei Pflanzen beibehalten 12 Funktion ATMUNG ATMUNG ATMUNG Proteinbiosynthese Proteinbiosynthese ATP-Synthese 13 SSS=substoichiometrisches Shiften: bestimmte Gene können in höherer Kopienzahl vorhanden sein CMS: Cytoplasmatisch männliche Sterilität, wichtiges Instrument für Züchter Wenn Mitochondrien nicht richtig funktionieren, ist Pollenentwicklung gestört. Peroxisomen Anderer Name: Microbody Leitenzym: Katalase: Disproportionierung von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff Entstehung aus dem ER oder Vermehrung durch Teilung (ähnlich wie bei Mitochondrien) Import von peroxisomalen Proteinen: SKL-Sequenz am C-Trminus; gefaltet Funktionen:in der Pflanze: Photorespiration (zusammen mit Plastiden und Mitochondrien) ß-Oxidation von Fettsäuren Tier: ß-Oxidation in den Mitochondrien Funktionelle Spezialisierung: Glyoxisomen in fettreichen Samen führen Gluconeogenese durch 11. Doppelstunde am 26.1.2015 Genexpression allgemein (Kerngene: meist Exone und Introne) Regulation auf verschiedenen Ebenen: Transkription; RNA-Polymerasen in der Pflanzenzelle (Zellkern: I, II, III, IV+V) Mitochondrien: mtNEP (und MEP bei Reclinomonas) Plastiden: PEP (mit kernkodiertem Sigmafaktor) und ptNEP Prozessierung von RNA, u.a. Spleissen und Edierung Translation Stabilität von Proteinen, Proteasom im Zellkern und Cytoplasma: Abbau ubiquitinylierter Proteine Die Genexpression in Organellen kann auch über Gendosis (Kopienzahl der DNA ) reguliert werden. Hauptregulationsebene im Zellkern: Transkription Hauptregulationsebenen in den Organellen: Prozessierung, Spleissen, Edierung, Translation Für alle dieser pottranskriptionellen Prozesse werden kernkodierte Proteinfaktoren benötigt, d.h. die Genexpresssion wird von Zellkern kontrolliert (anterograde Kontrolle). Pflanzenzellen haben drei Genome Koordination der Genexpression in drei Kompartimenten: Retrograde Signale (BIUZ 5/2011): u.a. ROS, Intermediate der Chlorophyllbiosynthese, Häm, Störungen der Proteinbiosynthese Plastiden können Stromuli bilden. Diese können bei der Übertragung von Signalen eine Rolle spielen (BIUZ 3/2010). 13 14 12. Doppelstunde am 2.2.2015 Die Vakuolen der Pflanzenzellen Die Vakuole ist das größte Kompartiment in ausdifferenzierten Zellen: 30-90% des Volumens. In meristematischen Zellen gibt es viele kleine Vakuolen, die während der Differenzierung fusionieren. Funktionen der Vakuole 1. Ionenhomeostase 2. Entgiftung 3. Abbau von geschädigten Organellen (Autophagie) 4. Stickstoffremobilisierung im Herbst: massiver Abbau von Chloroplasten-Proteinen, u.a. RUBISCO 5. Speicherung von Proteinen 6. Abbau von Speicherproteinen im Holz und in Samen 7. Zelltod 1.Osmoregulation, pH-Homeostase (pH Wert im Cytoplasma ca. 7,5 und in Vakuole ca. 5,5): Protonentransportsysteme im Tonoplasten: Pyrophosphatase und ATP-abhängige Protonenpumpe 2. Entgiftung: Bildung von GSH-Konjugaten unter Katalyse durch Gluthathiontransferasen Transport der Konjugate über ABC-Transporter im Tonoplasten ABC-Transporter heißen auch MDRP (multidrug resistance proteins) GSH: Tripeptid aus Cystein, Glutamat, Glycin; enzymatische Biosynthese, Redoxsystem Bildung von Phytochelatinen durch Transpeptisierung von GSH: (Glu-Cys)nGly n=2-11 Phytochelatine komplexieren Schwermetallionen, z.B. Cd2+ 3. Autophagie: Isolierung von defekten Organellen und anderen Teilen des Cytoplasmas, Bildung von Autophagosomen, die von Vakuole aufgeneommen werden und deren Inhalt dann verdaut wird. Autophagie bei Hefezellen unter Mangelbedingungen: Autolyse einzelner Zellen zum Vorteil der Kultur. Autophagie als Entgiftungsprozeß: Autophagie-Mutanten sterben schneller, weil Kompartimente mit toxischem Inhalt nicht mehr entfernt werden können (Autophagie verhindert Zelltod) 4. Chloroplasten werden im Herbst abgebaut (Blattseneszenz), weil sie Stickstoff liefern. 70% des Proteins in den Chloroplasten entfallen auf RUBISCO. RUBISCO u.a. Proteine werden aber nicht in den Plastiden abgebaut. Bildung von Vesikeln (RCB: RUBISCO containing bodies), Fusion mit Vakuole, Abbau durch Proteasen in der Vakuole. Auch ganze Chloroplasten können während der Seneszenz von der Vakuole aufgenommen werden. Aminosären werden in Amide umgewandet, Transport zum Holz, dort Bildung von Speicherproteinen 5. Speicherung von Proteinen Es gibt mehrere Typen von Vakuolen, u.a PSV (Proteinspeicher) Proteintransport in die Vakuole: Prolamine in ER Proteinkörperchen, Aufnahme durch Autophagie Globuline in Golgivesikeln, Fusion mit Vakuole 6. Abbau von Speicherproteinen im Holz und Samen Proteasen gelangen vom ER über Golgi in Vesikeln zur Vakuole (LV lytische Vakuolen). 14 15 Beispiel: Aleuronprotoplasten: Fusion von PSV und LV bei der Keimung 7. Zelltod Beispiele: Bildung von Gefäßen, Hypersensitive Reaktion auf Pathogene, Aerenchymbildung, Blattseneszenz (spätes Stadium) u.a. Autolyse ganzer Zellen: Zellsaft ist nicht mehr kompartimentiert, Hydrolasen aus Vakuole werden freigesetzt Reaktive Sauerstoffspezies in Organellen als Auslöser des Zelltods: ROS bewirkt in Mitochondrien Freisetzung von Cytochrom c, Aktivierung von Caspasen, Apoptose=Programmierter Zelltod (PCD) ROS, vor allem Singulettsauerstoff, bewirkt bei Chloroplasten Freisetzung stromaler Proteine (Nachweis mit GFP im Stroma transgener Pflanzen) Nachweis von Zelltod: - DNA-Fragmentierung, 180 bp Differenz in der Fragmentlänge - TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling) - Färbungen mit Propidium-Jodid, Evans Blau, Trypan Blau 15
