Spi-Ba 2

Pharmakologische und Toxikologische Sicherheitsprüfung:
o akute LD50 und LD90-Einmalgabe
o chronische Mehrfachdosis (30 – 90 Tage)
o Multigenerationstoxizität ( folgen für 2. oder Nachfolgegenerationen)
o Umwelttoxiztät  Auswirkungen auf Umwelt  Nutztiere, Abbaubarkeit
o Immunotoxizität / Allergenes Potential
o Einfluss auf Lebensmittelherstellung
o Karzinogenität (Teratogenität)
o Mutagenität
o Foetotoxizität (Wirkung auf Embryos und Foeten)
„in vitro“- Toxizitätstest: billiger, schneller
Cytotoxicität
Photometrischer Test: Aufnahme (Neutralrot) ( Aufnahme nur von lebenden/toten Zellen)
oder Synthese eines Farbstoffes  nur lebende Zellen können synthetisieren
(Formazan) in lebenden Zellen
Ames- Test (Mutagenität):
Bakterienwachstum: Entstehung von Revertanten ( Rückmutation) aus Mangelmutanten
(metabolischer Defekt)
Zellkommunikation (HG-PRT)
Wachstum von Tumorzellen; wenn resistente und sensitive (nicht kranke) Zellen
nebeneinander wachsen  Zell-Zell-Kommunikation  sensitive geben Schwäche weiter,
Gegenmittel wirkt
Limulus Test (Pyrogene):
Gel-Bildung mit Lectinen Lectine aus Limulus reagien mit Endotoxinen gramneg. Bakterien
Schwesterchromatid-Austausch
Chromosomenschäden Austausch von DNA- Strängen nach BrdU Markierung, Untersuchung
bei Zellteilung ob richtig weitergegeben (Semikonservativ)
„Limb bud“ Test
Embryotoxizität Isolierte Extremitätenknospen werden untersucht  normale Entwicklung?
Mikronukleus- Test
Chromosenarrangement: Mikronuklei werden bei fehlerhafter Zellteilung vermehrt gebildet
 Aktivität: wie lang aktiv unter Feldbedingungen  Abbauzeit (Ernte)
 Routineverfahren zum Rückstandsnachweis  Wartezeit
Angestrebte Eigenschaften:
o wenig Behandlungen  Arbeitsaufwand
o vollständig abbaubar <-> Wirkdauer
o problemlose Beseitigung von Resten  Sondermüll, Kosten
 Unterschiede zwischen Mensch (Säuger) und Arthorpoden
Bsp.: Endoskelett – Exoskelett
Aufbau Exoskelett:
Epicuticula: Wachsschicht  dichtet Insekt ab  Zerstörung führt zu Wasserverlust  nicht
letal
Exo/Endocuticula  Proteinmatrix mit Chitinfasern (sind von Proteinen umgeben, die mit
Matrix vernetzt sind) Schichtdicke variiert, Sperrholzähnlicher Aufbau  hohe Festigkeit bei
geringem Gewicht; teilweise Metalleinlagerungen (willkürlich, Dotierungen  höhere
Festigkeit, Schärfe etc.)
Epidermis  scheidet Cuticula aus, bildet Cuticula für Häutung
Chitinsynthese:
Trehalose  Glucose  Glucose-6-P  Fructose-6-P  Glucosamin-6-P  NAcetylglucosamin-6-P  N-Acetylglucosamin-1-P  Uridindiphosphat-N-Acetylglucosamin
Aufklärung eines Stoffwechselwegs:
Radioaktiv markierter Stoff der am Startpunkt der Synthese steht (z.B. Trehalose) wird
verfüttert  Radioaktivität läuft durch Stoffwechsel: wird in ein Zwischenprodukt nach dem
anderen eingebaut
 sobald es unübersichtlich wird, Zufütterung von kalter Trehalose, verdrängt uneingebaute
radioaktive Trehalose
 Pulse Chase labeling
Vorraussetzung: genauer Start mit Stoffwechselanfang
Probleme: Produkt muss nachweisbar sein  Einbau in das richtige Makromolekül
 vgl. Chemischer Eigenschaften
Glykoproteine: Nachweis über Verwendung von Proteasen / Basen  lösen Proteine auf
Glykolipide: werden durch alkalisches Medium zerstört
Cellulose-Chitin: auflösen in Monomere  Messung Massenspektroskopie
Chitin: Resistent gegen KOH, Proteasen  Abbau durch Säuren, Chitinasen
besteht nur aus N-Acetylglucosaminmonomeren
 Testsystem: Zellkulturen
Angriff auf Exoskelettproduktion
UDP-Glucosamin  wird polymerisiert  ähnlicher Stoff zur kompetitiven Hemmung (z.B.
Polyoxin D, Nikkomycin Z)
 andere Chitinsynthese bei Pilzen und Hefen  niedermolekulares Chitin in einzelnem
Polymerisationsschritt
bei Insekten in Zelle: Bildung von Oligomeren, Polymerisation außerhalb der Zelle
 mehrstufiger Prozess, Membrangebundene Enzyme
 aber: Ähnlichkeit zur Wirbeltier-Glykoproteinsynthese  darf nicht gehemmt werden
(Bsp.: Tunicamycin: kompetitive Hemmung hemmt die Bildung von Chitin und
Glycoproteinen)
Benzoyl-Phenyl-Harnstoff: hemmt Chitinsynthese bei Arthropoden aber nicht bei Pilzen und
die Glycoproteinsynthese  hemmt vermutlich am Transport zur Zellmembran (GolgiVesikel  spezifischer Zwischenschritt)
 Zufallsentdeckung, Entwicklungsstadien werden angegriffen, Adultformen nicht
 Entwicklungsinhibitor
z.B. Plumbagin, Avemectin (Wurmmittel), Triazin (sehr reaktiv)
weiterer Vorteil: keine Rückstände  Harnstoffe hydrolisierbar
Enzymtests für Chitinasen  ohne Chitinauflösung keine Häutung
 einfacher Test ob Chitinasen nach Testmittel noch in der Lage sind Chitin aufzulösen
1. Zugabe von N-Acetylglucosamin-O-Farbstoff  bei Exochitinase  gebunden
farblos, bei Spaltung bunt/fluoriszierend
2. Zugabe von N-Acetylglucosaminoligomeren  bei Endonukleasen  gleiches
Prinzip wie bei 1
3. Zugabe von radioaktiven Chitin  molekulare Spaltstücke
 Herstellung Chemisch: Glucosamin + Acetanhydrid*  N-Acetylglucosamin*
 kompetitive Inhibition: PUCNACTM  funktioniert nicht im Feld (nicht Umweltstabil)
Chitin kann über unterschiedliche Wege abgebaut werden
z.B. Versuch Aminozucker zur kompetetiven Hemmung des Substratumsatzes  nicht
Feldstabil
Hemmung mit Allosamidin  hemmt Endochitinasen  Problem ist die komplizierte
Synthese (2 Aminozucker und 5er Heterocyclus)  Riesenaufwand
 Herstellung von (einfacheren) Derivaten und Überprüfung der Effektivität anhand der
Leitstruktur  1 Zucker kann eingespart werden
 Abwandlung der Struktur und Vergleich der Wirkungskurven  Detektion der für die
Wirksamkeit wichtigen Strukturen
 Berechnung sehr kompliziert  Enzym-Substrat-Komplex  gegenseitige Verformung
Züchten von Proteinkristallen  Strukturaufklärung  Röntgenstrukturanalyse 
Untersuchung der Substratbindungsstelle  kein Wasser  fixierte Struktur  nicht
realistisch
 Einsatz der NMR-Spektroskopie  realistischer aber niedrige Auflösung
 Einsatz aller 3 Methoden ist sinnvoll, genauste Auswertung wenn alle drei verwendet
Allosamidin  breites Wirkspektrum aber nicht marktreif (nicht Feldstabil, Großsynthese)
Styloguanidin  Bakteriensyntheseprodukt  keine Insektizide
cyclische Dipeptide  z.B. von Bacillus, Saccharomyces  instabil, nicht für Feldeinsatz
Chitinase-Hemmer: gute Ansätze, aber keine verwendbaren Substanzen