Malatbestimmung an CAM

20.08.06
Melanie Thompson (Autor)
Gruppe 4
Pflanzenphysiologischer Kurs Sommersemester 2006
Teil Stoffwechselphysiologie
Versuch: Malatbestimmung an CAM-Pflanzen
Einleitung
In diesem Versuch soll die Malatkonzentration einer Pflanze bestimmt werden, die den sog.
Crassulaceen-Säuremetabolismus oder CAM (crassculacean acid metabolism) betreibt.
Um die Besonderheit des Stoffwechsels von CAM-Pflanzen verstehen zu können, muss man
sich zunächst mit dem der C3- und C4-Pflanzen auseinander setzen.
Die Kohlenstoff-Assimilation bei den weitaus am häufigsten vorkommenden C3-Pflanzen
findet am Tage während der Lichtphase statt. Das Enzym Ribulose-1,5-bisphosphatCarboxylase/Oxygenase (kurz: RubisCO) überträgt das über die Stomata aufgenommene CO2
auf den Akzeptor Ribulose-1,5-bisphosphat (RubP). Das entstandene Reaktionsprodukt 2Carobxy-3-keto-D-arabinit-1,5-bisphosphat ist extrem instabil und zerfällt nach
Wasseranlagerung in zwei Moleküle: 2-Carboxy-D-arabinit-1-phosphat und das erste fassbare
Produkt der Photosynthese, der C3-Körper: D-3-Phosphoglycerat..Dieser wird anschließend in
den Calvin-Zyklus eingespeist, bei dem aus dem assimilierten Kohlenstoff Hexosen gebildet
werden. Diese Vorgänge geschehen alle in derselben Zelle.
Die RubisCO ist ein sehr charakteristisches Enzym für die Photosynthese. Sie kommt in den
Chloroplasten vor und besteht aus je 8 großen und 8 kleinen Untereinheiten, wobei die
kleinen Untereinheiten im Kern, die großen im Chloroplasten selbst codiert werden. Die
Affinität der RubisCO für CO2 ist groß, sinkt jedoch mit steigender Temperatur bei
gleichzeitiger Abnahme der Löslichkeit des CO2 im Wasser. So kommt es bei intensiver
Belichtung und/oder hohen Temperaturen vor, dass die RubisCO anstelle von CO2 O2 auf das
hier ebenfalls als Akzeptor dienende Ribulose-1,5-bisphosphat überträgt, wobei nur ein
Molekül D-3-Phosphoglycerat und zusätzlich ein C2-Körper, das 2-Phosphoglykolat, entsteht.
Die Pflanze betreibt mit Hilfe der Photorespiration (so genannt, da es dabei zu einem
Sauerstoffverbrauch unter Bildung von CO2 kommt) einen erheblichen Aufwand um den,
durch den C2-Körper, dem Calvin-Zyklus entzogenen Kohlenstoff zurückzugewinnen.
Bei den C4-Pflanzen verläuft die Kohlenstoff-Assimilation nach einem anderen Prinzip. Wie
bei den C3-Pflanzen wird Kohlenstoff während der Lichtphase aufgenommen, jedoch entsteht
als erstes Produkt ein C4-Körper: Oxalacetat. Das Oxalacetat wird in den Mesophyllzellen der
C4-Pflanzen aus Phosphoenolpyruvat und HCO3--Ionen gebildet und anschließend zu Malat
oder Aspartat umgesetzt. Diese Stoffe werden dann in den Calvin-Zyklus eingespeist, dieser
findet jedoch nicht in den Mesophyllzellen, sondern in den Bündelscheidenzellen der C4Pflanzen statt. Damit sind die CO2-Vorfixierung und die Endfixierung, die durch das Enzym
RubisCO vollführt wird, räumlich voneinander getrennt.
Die Reaktionsfolge der CAM-Pflanzen vollzieht sich in ähnlicher Weise, wie die der C4Pflanzen, sie ist ebenfalls malatbildend und auch die CO2-Vorfixierung verläuft von der durch
RubisCO geleisteten Endfixierung von Kohlenstoff getrennt, hier jedoch nicht räumlich,
sondern zeitlich. Dieser Prozess wurde zunächst bei Crassulaceen entdeckt, darum auch als
Crassulaceen-Säuremetabolismus oder CAM (crassculacean acid metabolism) bezeichnet.
Bei allen CAM-Pflanzen wird nachts aus Stärke Phosphoenolpyruvat (PEP) gebildet und
anschließend daraus unter Fixierung von CO2 durch die PEP-Carboxylase Oxalacetat
hergestellt. Das daraus von der cytoplasmatischen, NAD-abhängigen Malatdehydrogenase
gebildete Malat wird über einen Malatkanal in die Vakuole transportiert. Getrieben wird
dieser Transport durch die transmembrane protonmotorische Kraft, die durch eine
wasserstoffionentranslozierende ATPase am Tonoplasten erzeugt wird und zugleich die
Gegenionen zum Malat-Anion liefert. Mit der Zeit sinkt der pH-Wert des Vakuoleninhalts ab,
weshalb Malat in der Dunkelperiode zunehmend als protonierte Äpfelsäure vorliegt, diese
permeiert im Vergleich zum Malat2--Anion besser über die Tonoplastenmembran, wodurch
die steigende Wasserstoffionenkonzentration die Speicherkapazität für Malat in der Vakuole
begrenzt. Da die Speicherkapazität in der Vakuole begrenzt ist, steigt der cytoplasmatische
Malatgehalt an und hemmt daraufhin die PEP-Carboxylase, was mit zunehmender Dauer der
Dunkelperiode die CO2-Vorfixierung limitieren. Am Tage wird das nachts gespeicherte Malat
über den Malatkanal aus der Vakuole entlassen. Bei der Decarboxylierung am Tage gibt es
drei Typen:

NADP-Malatenzym-Typ (Cactaceae, Agavaceae)

NAD-Malatenzym-Typ (Crassulaceae)

PEP-Carboxykinase-Typ (Aclepiadaceae, Bromeliaceae, Liliaceae)
Eine erneute Fixierung des im Licht durch eines dieser drei Enzyme freigesetzten CO2 durch
die PEP-Carboxylase statt durch die RubisCO wird dadurch verhindert, dass die PEPCarboxylase im Licht von der aktiven (= phosphorylierten) „Nacht“-Form mit geringer
Hemmbarkeit durch Malat in eine sehr schwache (= dephosphorylierte) „Tag“-Form mit
großer Malatempfindlichkeit überführt wird. Damit hemmt also das aus der Vakuole
austretende Malat das ohnehin am Tag schwach katalytisch aktive Enzym so stark, dass es
keine CO2-Fixierung durchführen kann, damit steht das aus dem Malat freigesetzte CO2 also
vollständig für die RubisCO zur Verfügung.
Ökologische Vorteile des CAM sind, dass die CO2-Aufnahme durch geöffnete Stomata in der
Nacht bei sehr viel tieferen Temperaturen und dementsprechend höherer Luftfeuchtigkeit als
am Tage ablaufen kann, große Wasserverluste bei diesem Vorgang also vermieden werden.
Am Tag ist bei guter Wasserversorgung nicht nur die Verwertung des CO2, das beim
Malatabbau frei wird, möglich, sondern bei Erschöpfung des Malatspeichers auch die
Öffnung der Stomata und Fixierung externen CO2. Herrscht Dürre schränken CAM-Pflanzen
die Stomataöffnung und die damit verbundene Fixierung von externem CO2 in der Lichtphase
viel schneller ein als im Dunkeln. CAM-Pflanzen erreichen durch ihre spezielle
Reaktionsfolge unter Wassermangel sehr niedrige Transpirationskoeffizienten, haben damit
einen geringeren Wasserbedarf als C3-Pflanzen. Die Speicherkapazität der Vakuole für Malat
ist jedoch begrenzt, damit ist der tägliche Zuwachs an Biomasse bei ausschließlicher CO2Fixierung im Dunkeln sehr gering. CAM-Pflanzen sind v.a. auf trockenen Standorten
konkurrenzfähig, bei denen kühle Nächte die Malatbildung und -speicherung fördern und
gelegentliche, wenn auch seltene, dann aber sehr ausgiebige Niederschläge die Auffüllung der
Wasserspeicher ermöglichen. Einige CAM-Pflanzen führen bei ausreichender
Wasserversorgung eine normale C3-Photosynthese durch. Wassermangel oder auch Salzstress
induziert die Bildung der Enzyme des CAM. Im Extremfall halten Wüstenpflanzen mit CAM
bei großer Wasserknappheit ihre Stomata auch nachts geschlossen und refixieren das durch
die zelluläre Atmung freigesetzte CO2. Um dennoch effektiv Kohlenstoff zu fixieren
benötigen CAM-Pflanzen eine besondere Zellstruktur, großlumige Vakuolen in
chloroplastenführenden Zellen sind ein entscheidender Faktor für Pflanzen mit CAMStoffwechsel.
Um nun CAM-Pflanzen von anderen Pflanzen, vornehmlich den häufig vorkommenden C3Pflanzen, zu unterscheiden kann man als einfachen Versuchsansatz den Malatgehalt der
Pflanzen experimentell bestimmen. Auch die Entwicklung des Malatgehalts im Laufe des
Tages kann Aufschluss darüber geben, ob es sich um eine CAM-Pflanze, oder eine ebenfalls
Malat-bildende C4-Pflanze handelt. Dies sind die diesem Versuch zu Grunde liegende
Überlegung, wobei als Versuchspflanzen die Brutblattkindel (Bryophyllum daigremontiana),
eine Pflanze , die unter normalen Bedingungen einen C3-Stoffwechsel, jedoch nach einem
dreiwöchigen Trockenstress nun vermeintlich den CAM-Stoffwechsel betreibt, und die
Hainbuche (Carpinus bétulus), als C3-Pflanze untersucht werden. Die Hainbuche dient dabei
als Kontrollpflanze, die nicht unter Trockenstress stand und vor dem Versuch frisch
„geerntet“ wurde.
Material und Methoden
Die für diesen Versuch eingesetzten Pflanzen waren zum einen die Brutblattkindel
Bryophyllum daigremontiana, deren systematische Zuordnung wie folgt lautet:

Abteilung: Spermatophyta
o Unterabteilung: Angiospermae
 Klasse: Dicotyledoneae
 Unterklasse: Rosidae
o Ordnung: Saxifragales
 Familie: Crassuláceae
 Gattung: Bryophyllum
o Art: Bryophyllum
daigremontiana
(Brutblattkindel)
und zum anderen die Hainbuche Carpinus bétulus, deren systematische Zuordnung folgende
ist:

Abteilung: Spermatophyta
o Unterabteilung: Angiospermae
 Klasse: Dicotyledoneae
 Unterklasse: Hamamelididae
o Ordnung: Fagales
 Familie: Coryláceae
 Gattung: Carpinus
o Art: Carpinus bétulus
(Hainbuche)
Die genaue Vorgehensweise wurde dem Skript des „Pflanzenphysiologischen Praktikums,
Sommersemester 2006“ der Johann Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt am Main,
entnommen.
Vorgenommene Änderungen betrafen den letzten Teil des Versuches, das Bestücken der
Photometerküvetten. Zum einen wurden die Küvetten zur Bestimmung des Blindwertes statt
mit dem entnommenem Extrakt der Pflanzen mit derselben Menge (also 0,10ml) 3-Amino-1propanol-Puffer bestückt. Zum anderen wurden die Küvetten, die den Pflanzenextrakt
enthielten zunächst nur mit 0,01ml MDH, und nach erfolgter Grundwertmessung mit 0,01ml
GOT bestückt um die Reaktion zu starten. Nach Reaktionsablauf, der sich auf 10 Minuten
belief, erfolgte die zweite Messung.
Ergebnis
Die nach erfolgter Messung zusammengefassten Messwerte sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tab. 1 zeigt die Zusammenfassung der Messergebnisse des Versuches. Dargestellt sind die einzelnen
Proben der CAM-Pflanze entnommen zu verschiedener Uhrzeiten, sowie die Kontrollpflanzen.
Festgehalten wurden die eingesetzten Gramm Frischgewicht, die Menge des abzentrifugierten
Überstandes (z) und die zur pH-Wert-Einstellung benötigte Menge an K2CO2 (y) jeder Probe. Die vor
Beginn der enzymatischen Reaktion gemessene Extinktion (E1) und die nach Start der Reaktion und
Ablauf von 10min festgehaltene Extinktion (E2) jeder Probe. Der daraus ermittelt Wert E ergibt die
schlussendliche Extinktion E, anhand derer die Malatkonzentration in molMalat/gFg der jeweiligen
Probe errechnet wurden. B1 und B2 stellen die benötigten Blindwerte dar.
Probe
CAM
Blätter
entnommen
zu
verschied.
Uhrzeiten
gFg [g] z [ml] y [ml]
5
8
11
14
17
20
Kontrolle
Blindwert
K1
(Gr. 4)
K2
(Gr. 3)
B1
(Gr. 4)
B2
(Gr. 3)
E
E
molMalat
gFg
1,41 -0,098 -0,085 0,013 0,013
4,935
1,78 -0,068 -0,053 0,015 0,015
6,31
1,53
0,036 0,056
0,2
0,2
43,19
1,9
0,065 0,058 -0,007 -0,007 -1,28 bzw. 0
2,4
0,08 0,085 0,005 0,005
0,0996
1,7
0
0,007 0,007 0,007
2,2
ca. 1,6 0,024 0,015 -0,009 -0,009 -8,41 bzw. 0
14,25
17,28
14,87
15
15,1
14,8
13,2
0,5
16,1
1,95
0,102
0,118
0,016
0,016
18,4832
-
-
-
0
0
0
-
-
-
-
-
0
0
0
-
-
Rechnung bestimmt:
Mit:
E2
1,32
1,45
2,43
2,95
2,81
1,68
0,5
Die Malatkonzentration in
c
E1
E  ( z  y )  10  20
(d    gFg )
molMalat
gFg
der Versuchspflanzen wurden anhand folgender

 B  B2 
E = Extinktion, zusammengesetzt aus E  E   1
 ;  E wiederum
2


berechnet sich aus E  E2  E1 .

(z + y), wobei z das Gewicht des abgenommenen Überstandes und y die Menge an
zugegebenem K2CO2 ist.

Die 10 ist bedingt durch die 1:10 Verdünnung des Filtrates, was wiederum den
Extrakt ergibt

Die 20 rührt daher, dass 0,1ml Extrakt in 2ml Gesamtvolumen in der Küvette der
20te Teil von 2ml entspricht, es handelt sich also um eine erneute Verdünnung des
Extraktes um das 20fache

d = Schichtdicke der Küvette (hier: 1cm)

 = Molarer Extinktionskoeffizient ( von NADH+H+ bei 340nm: 6,25cm2/Mol)

gFg = Gramm Frischgewicht, wichtig, da die Konzentration des Malates in dem
verwendeten Gramm Frischgewicht ermittelt wird
Da in diesem Fall die Differenz zwischen B1+B2 gleich Null ist, entspricht E = E.
So berechnet sich bspw. die Malatkonzentration für die 5Uhr Probe wie folgt:
c
E  ( z  y)  10  20 0,013  (14,25 g  1,41ml)  10  20 40,716


 4,935
(d    gFg )
8,25
cm 2
(1cm  6,25
 1,32 g )
Mol
In Abbildung 1 wurde die ermittelten Malatkonzentrationen im Tagesverlauf dargestellt:
Malatkonzentration
50
45
43,19
40
µmolMalat/gFg
35
30
25
Malatkonzentration
20
15
10
5
4,935
6,31
2,2
0
0
5
0
15
10
0,0996
20
25
Uhrzeiten
Abb. 1: Die Graphik zeigt die Malatkonzentration im Verlauf eines Tages. Die einzelnen Proben wurden
zu den verschiedenen Uhrzeiten (5, 8, 11, 14, 17 und 20Uhr) entnommen und anschließend für 20Stunden
eingefroren bevor sie weiter verarbeitet und der jeweilige Malatgehalt experimentell ermittelt wurde.
Der Graphik nach zu urteilen, ist der Malatgehalt pro Gramm Frischgewicht um 5Uhr niedrig
und steigt anschließend leicht an, sodass sich ein geringfügig höherer Wert um 8Uhr ergibt.
Daraufhin steigt die Konzentration rapide an, bis sie laut Graphik um 11Uhr ihr Maximum
erreicht, bis 14Uhr auf 0 absinkt und danach bis 20Uhr wieder leicht ansteigt.
Diskussion
Nach genauerer Betrachtung der Graphik und Vergleich mit den Literaturwerten, lässt sich
erkennen, dass der Versuchsdurchlauf wohl nicht optimal funktioniert hat.
Laut Literatur liegt der Malatgehalt bei CAM-Pflanzen morgens bei ca. 140Mol/gFg und
sinkt im Laufe des Tages auf ca. 40Mol/gFg am Abend ab.
Dies ist, verglichen mit dem Reaktionsmechanismus des CAM-Stoffwechsels, auch ein
nachvollziehbares Ergebnis, denn die CAM-Pflanzen bilden das Malat aus Oxalacetat
während der Nacht und bauen den Malatspeicher im Laufe des Tages ab, indem sie das Malat
abbauen und das daraus freigesetzte CO2 in den Calvin-Zyklus einschleusen.
So müsste der Malatgehalt also am Morgen maximal sein, und dann einen stetigen Abfall im
Laufe des Tages zeigen, bis der Gehalt abends fast auf 0 fällt.
In der hier dargestellten Graphik liegen also vor allem die Werte um 5Uhr und 8Uhr viel zu
niedrig, sie müssten eigentlich über dem Wert von 11Uhr liegen.
Dass der Malatgehalt ab 11Uhr rapide abfällt ist nachvollziehbar, da die Sonneneinstrahlung
ab 11Uhr am stärksten ist, der Photosyntheseapparat hier am intensivsten arbeitet und am
meisten CO2, und damit eben auch das Malat, verbraucht.
Es ist sehr ungewöhnlich, dass der Malatgehalt um 14Uhr auf 0 fällt, dies wäre möglich, wenn
die Sonneneinstrahlung überaus stark war und der Malatspeicher vollständig aufgebraucht
wurde.
In diesem Fall würde die Pflanze, sofern sie genügend Wasser zur Verfügung hat die Stomata
öffnen um externes CO2 aufzunehmen.
Steht ihr nicht genügend Wasser zur Verfügung wird sie eventuell das bei der Zellatmung
entstehende CO2 refixieren.
Also, im Grunde ist es schon möglich, dass die Malatkonzentration um 14Uhr auf 0 fällt,
danach dürfte sie aber nicht mehr ansteigen, da Malat nur in der Dunkelphase gebildet wird.
Die Malatkonzentration dürfte also erst wieder bei Einsetzen der Dunkelheit ansteigen, da
CAM-Pflanzen nur während der Dunkelperiode CO2 in Form von Malat fixieren.
Weiterhin ist ungewöhnlich, dass die Malatkonzentration der Versuchspflanze K2
ungewöhnlich hoch liegt.
Eventuell wurden Fehler bei der Herstellung der Proben begangen, oder aber Werte wurden
vertauscht, dies lässt sich jedoch im Nachhinein nicht mehr nachvollziehen.
Alles in allem scheint dieser Versuch nicht vollkommen fehlerfrei verlaufen zu sein, da die
Werte, vor allem die Werte am Morgen, stark von den Literaturwerten abweichen und auch
im Bezug auf das Prinzip des CAM-Stoffwechsels nicht so erwartet wurden.
Literaturhinweis

Skript des „Pflanzenphysiologischen Praktikums, Sommersemester 2006“ der Johann
Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt am Main

Peter Sitte, Elmar W. Weiler, Joachim W. Kadereit, Andreas Bresinsky, Christian
Körner, Strasburger – Lehrbuch der Botanik für Hochschulen, 35. Auflage, Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg – Berlin, 2002

Wilhelm Nultsch, Allgemeine Botanik, 11. Auflage, Thieme Verlag, Stuttgart – New
York, 2001

Karlheinz Senghas, Siegmund Seybold, Schmeil-Fitschen Flora von Deutschland, 91.
Auflage, Quelle & Meyer Verlag, Wiebelsheim, 2000