Handout zum Vortrag

BIOTECHNOLOGISCHE LABORÜBUNGEN
SEPTEMBER 2001
DIPL.ING. DR. GUDRUN NAGL
Unterlagen zum Vortrag und Workshop am 24./25.9.2001
GRUNDLAGEN, LEHRINHALTE UND DIDAKTIK IN DEN BIOTECHNOLOGISCHEN
LABORÜBUNGEN
von Dr. Gudrun Nagl
Definition:
Biotechnologie ist die integrierte Anwendung von Natur- und Ingenieurwissenschaften mit
dem Ziel, Organismen, Zellen, Teile von Zellen und molekulare Analoge technisch zu nutzen.
European Federation of Biotechnology EFB
Biotechnologie ist ein Zusammenspiel von Biologie, Chemie und Technik; keine neue
Wissenschaft, sondern ein Arbeitsgebiet mit speziellen Möglichkeiten und Zielsetzungen.
Traditionelle Arbeitsgebiete der Biotechnologie:
 Technische Mikrobiologie
 Technische Biochemie
 Bioverfahrenstechnik: Verfahrenstechnische Aspekte von Biotechnologie und
Biochemie; Analyse, Beschreibung und Entwicklung der einzelnen Verfahrensschritte bei
Produktions- und Entsorgungsprozessen mit MO, Zellkulturen und Enzymen
 industrielle Mikrobiologie
 Angewandte Mikrobiologie
Lebensmittel-Mikrobiologie,
Landwirtschaftliche
M.,
Abwasserund
Gewässerm., Medizinische M., Hygiene
Bildungs- und Lehraufgabe:
Der Schüler soll
elementare mikrobiologische Arbeitsmethoden selbstständig durchführen können.
die hygienische Unbedenklichkeit von Lebensmitteln und daraus abgeleiteten Erzeugnissen in
allen Produktions- und Vermarktungsstufen beurteilen können.
aufbauend auf den Kenntnissen der Biologie und Chemie den interdisziplinären Charakter der
Biotechnologie kennen lernen.
die Ergebnisse seiner Untersuchungen interpretieren können.
sich seiner Verantwortung für die menschliche Gesundheit bewusst sein.
Lehrstoff im 3. Jahrgang mit 2 Wochenstunden:
Einführung in die mikrobiologische Arbeit:
Mikrobiologische
Präparate,
Mikroskopieren,
Konzentrationsbestimmungen,
Keimgruppennachweise
Nachweis und Kultivierung:
Isolierung, Identifizierung, Verdünnungsreihen, Stammerhaltung, Kultivierung, Produktion
Kontrollmethodik der Personal- und Betriebshygiene
Biotechnologische Analytik und Verfahren:
Hemmstoffe, Wuchsstoffe, Stoffwechselprodukte, Gel-Elektrophorese, Fermentationen
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Begriffe und Definition des aseptischen Arbeitens:
Steril:
frei von vermehrungsfähigen Mikroorganismen jeglicher Art (Phagen, Viren,
Sporen miteinbezogen)
Aseptisch: arbeiten unter Bedingungen, die Fremdorganismen ausschalten
Infektion:
ein pathologischer Begriff: Anwesenheit bzw. Parasitierung von einem
Organismus durch einen anderen Organismus
Kontamination:
Anwesenheit von Fremdorganismen
Desinfektion:
weitgehende Abtötung von Mikroorganismen auf Oberflächen
Dekontamination: weitgehende Abtötung von Mikroorganismen in Nährmedien
Keim:
vermehrungsfähiger Mikroorganismus
Mikrobiologische Präparate:
Methylenblau-Färbung
Tusche-Färbung
Gram-Färbung
Konservieren von Reinkulturen
Agarschrägkultur
Einfrieren von Kulturen bei –80°C
Microbank
KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN
Obligat (=strikt) aerob:
Mikroorganismen, die Sauerstoff zum Wachstum brauchen.
Obligat anaerob:
Mikroorganismen, die durch Sauerstoff im Wachstum gehemmt werden.
Fakultativ anaerob bzw. fakultativ aerob:
Mikroorganismen, die sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen
gedeihen.







Bouillonkulturen
Agarstrich- / Stichkultur
Kultivierung auf Agarplatten (Austrich, Fraktionierter Ausstrich)
Koch`sches Plattenverfahren
Spatel-Verfahren
Petrifilm-Methode
MPN- Technik / Titer
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1. Koch'sches Plattenverfahren
Prinzip:
Dieses Verfahren basiert auf der Annahme, daß aus 1 Keim durch die Bebrütung eine Kolonie
entsteht (es kann aber auch aus einer Keimgruppe eine Kolonie entstehen  KbE), die mit
freiem Auge sichtbar ist. Um die Keimzahl erfassen zu können, bzw. zu sog. "auszählbaren"
Platten zu kommen, muß die Probe entsprechend verdünnt werden. Ist die Probe fest oder
pastös, muß diese zuerst mit einer bestimmten Menge Verdünnungslösung aufgelöst oder
aufgeschwemmt werden.
Herstellen der Verdünnungsreihe für das Plattengießverfahren nach KOCH:
Die Erstverdünnung (Ausgangssuspension) wird aus dem Probenmaterial und der 9-fachen
Menge einer Verdünnungslösung hergestellt, indem man 1:10 Verdünnungen anlegt (im
Routineverfahren sind 1: 100-Verdünnungen gestattet), dabei wird die Probe sorgfältig
gemischt (25mal stürzen) und eine Verdünnung 1 : 10 mit einer ¼ starken Ringerlösung
hergestellt.
Plattengießen:
Vor dem Plattengießen muß der Agar (in Eprouvetten oder Kölbchen) vollständig
aufgeschmolzen werden (30 Minuten im Dampftopf) und im Wasserbad auf ca. 47°C
abgekühlt werden. Bei Entnahme eines Röhrchens aus dem Wasserbad ist das außen
anhaftende Wasser zur Vermeidung von Kontaminationen mit einem Tuch abzuwischen und
der Rand der Eprouvette ist vor dem Ausgießen in die Petrischale abzuflammen.
Beschriften der Platten:
Datum, Probennummer, Name, V und was wurde untersucht
Mischen des Nährbodens mit der Probe: (Hiefür gibt es eine Standardvorschrift)
Im Routinebetrieb genügt es, sofort nach dem Eingießen des Agars die Platten in kreisende
oder 8-schleifenförmige Bewegung zu versetzen und so eine Durchmischung zu erreichen.
Zwischen dem Herstellen der Verdünnungsreihe und dem Ausgießen des Agars sollten
maximal 15 Minuten verstreichen.
1 ml
Milch
1 ml
1 ml
9
ml
9
ml
9
ml
10 -1
10 -2
10 -3
10 0
1 ml
1 ml
V0
V1
1 ml
1 ml
V2
V3
3
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Bebrüten der Petrischalen:
Nach dem Erstarren des Nährbodens werden die umgedrehten Petrischalen (mit dem Boden
nach oben) bei verschiedenen Temperaturen, abhängig von der optimalen
Wachstumstemperatur der Organismen, bebrütet. Gelatineplatten dürfen nicht umgedreht
werden, da hier die Verflüssigung der Gelatine geprüft wird.
Auswertung der Platten:
Zählen der Kolonien:
Unter Zuhilfenahme eines Plattenzählgerätes wird jede Kolonie markiert und gleichzeitig ein
Zählwerk betätigt. Platten, die weniger als 10 Kolonien und mehr als 300 Kolonien
aufweisen, werden ausgeschieden ("auszählbare" Platte: 10 bis 300 Kolonien – GKZ). Zuviele
Keime auf der Platte hemmen sich gegenseitig im Wachstum, weiters wird der Zählfehler und
somit der mathematische Fehler zu groß.
"Laufkolonien" und "pin point"-Kolonien werden jeweils als eine Kolonie gezählt.
Platten, die mehr als ein Viertel von Laufkolonien bedeckt sind, werden verworfen.
Berechnung des Keimgehaltes:
Die Keimzahl wird immer auf 1 ml (bei flüssigen Produkten) bzw. 1 g (bei festen Produkten)
der Probe bezogen. Die Berechnung des Keimgehaltes erfolgt mit dem gewogenen
arithmetischen Mittel, d. h. die Summe aller ausgezählten Kolonien wird dividiert durch die
Summe der untersuchten. Berechnung des Ergebnisses erfolgt nach der Formel:
c
-------------------------- x d = KBE/ml bzw. g
(1 x n1 + 0,1 x n2)
c = Summe aller ausgezählten Kolonien
n1 = Zahl der Platten der 1. Verdünnungsstufe
n2 = Zahl der Platten der 2. Verdünnungsstufe
d = Verdünnungsstufe der ersten ausgezählten Platte(n)
n = ausgezählten Platten
2. Spatel-Verfahren
Von der Probe bzw. den Verdünnungen werden 0,1 ml auf der Oberfläche eines festen
Nährbodens ausgespatelt. Das Verfahren ist anwendbar bei der Untersuchung aller
Lebensmittel.
Teilmengen von etwa 15 ml des geschmolzenen Nährbodens werden in sterile Petrischalen
überführt und zum Verfestigen stehengelassen. Platten, die vorher hergestellt wurden, sollten
nicht länger als 4 Std. bei Raumtemperatur oder einen Tag bei 5 °C aufbewahrt werden. Wenn
die Platten gegen Austrocknung geschützt sind, können sie bei einer Aufbewahrung bei 5 °C
bis zu 7 Tagen verwendet werden. Unmittelbar vor der Verwendung werden die Platten mit
der Agaroberfläche nach unten, schräg auf dem abgenommenen Deckel liegend, in einem
Brutschrank ca. 30 min. bei 50 °C getrocknet. Beginnend bei der höchsten Verdünnung
werden 0,1 ml auf die Agarplatten geben. Mit einem sterilen Drigalski-Spatel wird die Menge
gleichmäßig unter kreisenden Bewegungen verteilt. Für jede Platte ist ein steriler Spatel zu
verwenden. Die Platten werden mit dem Boden nach oben bei der für die nachzuweisenden
Mikroorganismen erforderlichen Temperatur und Zeit bebrütet.
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3. Petrifilm-Methode
Die Petrifilmmethode ist eine Abart des Koch’schen Plattenverfahrens; anstelle von
Petrischalen werden vorgefertigte Scheiben benutzt, die den betreffenden Agar in
teilentwässerten Zustand enthalten. Auf jede Agarscheibe wird 1 ml Probelösung aufgebracht
und der Agar quillt auf. Mit Hilfe eines Stempels wird das Deckblatt auf das Agar-Areal
gedrückt. Der Petrifilm kann bebrütet werden.
Vorteil: Fertigmedium (kein Nährbodenkochen mehr!) geringer Platzbedarf im Brutschrank
(es können bis zu 20 Petrifilme übereinandergestapelt werden)
Nachteil: hohe Materialkosten.
4. Ermittlung der höchstwahrscheinlichen Keimzahl - Most probable
number (MPN)
a) Für die Ermittlung einer MPN müssen Röhrchen über einen weiten Bereich (mindestens
drei aufeinander folgende Verdünnungsstufen) beimpft werden. Für jede Verdünnungsstufe
sind mindestens zwei, überlicherweise drei Parallelröhrchen notwendig. Die
Verdünnungsreihe wird nach demselben Prinzip, wie bei Koch'schen Plattenverfahren
beschrieben, durchgeführt.
b) Die beimpften Röhrchen werden bei der jeweils festgesetzten Zeit bei der vorgegebener
Temperatur bebrütet.
c) Die bebrüteten Röhrchen werden hinsichtlich des Auftretens eines positiven Ergebnisses
beurteilt (z.B. Gasbildung im Durhamröhrchen, Schwarzfärbung, Farbumschlag u.a.) und die
Anzahl der positiven Ergebnisse für jede Verdünnungsstufe festgestellt.
Es gibt nur positiv-negativ-Ergebnisse!
d) Ermittlung der Indexziffer (Stichzahl): Die Indexziffer beschreibt den Bereich der
"Grenzverdünnung", also den Bereich, in dem die Probemengen sowohl Keime enthalten oder
auch nicht enthalten. (Probemengen, die soviele Keime enthalten, daß auf jeden Fall ein
positives Ergebnis nach der Bebrütung auftritt oder Probemengen, die keine Keime mehr
enthalten und daher auf jeden Fall negative Reaktionen ergeben, sind für die Bildung der
Indexziffer nicht brauchbar). Aus den aus drei aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen
erhaltenen Ergebnisse wird die Indexziffer gebildet. Nach Möglichkeit sollen dazu die drei
Verdünnungsstufen, die noch positive Ergebnisse zeigen, herangezogen werden. Enthält die
Verdünnungsreihe keine drei Verdünnungsstufen mit positiven Ergebnissen, so dürfen auch
Verdünnungsstufen mit negativen Ergebnissen zur Bildung der Indexziffer herangezogen
werden.
e) Berechnung der Keimzahl: Aus der MPN-Tabelle für dreifachen Ansatz wird die zur
Indexziffer gehörige wahrscheinliche Anzahl entnommen. Diese bezieht sich auf die
niedrigste Verdünnungsstufe, die zur Bildung der Indexziffer herangezogen wurde. Die
Keimzahl je ml bzw. g Probe wird durch Multiplikation der Keimzahl mit dem
Verdünnungsfaktor errechnet.
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Sind sämtliche angelegten Verdünnungsstufen negativ (Indexziffer 000), so ist die
Keimzahl kleiner als das 0,3 fache der niedrigsten vorhandenen Verdünnungsstufe. Sind
sämtliche Ansätze positiv (Indexziffer 333), so ist die Keimzahl größer als das 110fache
der niedrigsten zur Bewertung herangezogenen Verdünnungsstufe.
Die Vertrauensgrenzen berücksichtigen ausschließlich die zufällige Streuung der Ergebnisse.
Andere Variationsquellen, wie z.B. Fehler beim Ansatz der Proben, gehen damit nicht in die
MPN-Schätzung ein. Um derartige Einflüsse erkennen zu können, wurden die
Röhrchenkombinationen nach der Wahrscheinlichkeit ihres Vorkommens in Kategorien
eingeteilt. Der Anwender kann seine Arbeitsweise kontrollieren, indem er überprüft, wie
häufig die unwahrscheinlichen Kategorien 2 und 3 im Material vorkommen.
Durchführung:
1 ml
1 ml
1 ml
V1
Probe
1 ml
V2
1 ml
V3
1 ml
V0
Beispiel:
1
2
3
4
5
Vo
3
3
2
3
2
V1
3
3
2
3
2
1 ml
1 ml
1 ml
V1
V2
V3
Anzahl der positiven Röhrchen
V2
V3
V4
1
0
2
0
3
0
1
1
0
0
0
0
1
0
0
Kategorie 1: Sehr wahrscheinliche
Auftretens insgesamt 95%.
Röhrchenkombination.
MPN
V5
0
0
0
0
0
1 x 102
2,4 x 102
7,4 x 101
2,4 x 101
2,1
Wahrscheinlichkeit
des
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Kategorie 2: Weniger wahrscheinliche Röhrchenkombination. Wahrscheinlichkeit des
Auftretens maximal 5%.
Kategorie 3: Sehr wenig wahrscheinliche Röhrchenkombination. Wahrscheinlichkeit des
Auftretens maximal 1%.
Röhrchenkombinationen, die nach der Wahrscheinlichkeit ihres Vorkommens noch unterhalb
der Grenze der Kategorie 3 liegen, sind in der Tabelle nicht enthalten.
5. Titer-Verfahren
Das Titerverfahren ist eine Abart des MPN-Verfahrens, wobei nur 1 Verdünnungsstufe
angelegt wird. Es wird meist dann angewendet, wenn man nur „Negativ-Positiv“-Ergebnisse
benötigt (Presence-Absence-Tests). Für Titeransätze gibt es ebenfalls Tabellen, aus welchen
man die wahrscheinliche Keimzahl ablesen kann (verschiedene Tabellen je nach Anzahl der
Parallelröhrchen).
BEISPIELE:
1. BESTIMMUNG DER GESAMTKEIMZAHL IN ROHMILCH:
Prinzip der Methode:
Es werden alle Mikroorganismen (Bakterien, Hefen und Schimmelpilze) gezählt, die unter
den Bebrütungsbedingungen anwachsen. Es werden in erster Linie aerobe und fakultative
anaerobe mesophile Keime erfaßt.
Anlegen einer Verdünnungsreihe (1:10)
Herstellung von Gussplatten: 2 Platten pro Verdünnungsstufe
Kulturmedium: Plate-Count-Agar mit Magermilchzusatz (12-15 ml)
Bebrütung: aerob bei 30°C +/- 1°C; 72+/- 2 Stunden
Nur Platten auswerten, die mit 10 - 300 Kolonien besetzt sind. Die Berechnung des
Ergebnisses erfolgt nach der Formel.
Zur Unterscheidung von Säurebildnern und Nichtsäurebildnern wird Chinablau-Laktose-Agar
herangezogen. Das Chinablau dient als pH-Indikator um laktosevergärende von nichtlaktosevergärenden Mikroorganismen zu unterscheiden.
Säurebildner: blaue Kolonien oder Kolonien mit blauem Rand
Nicht-Säurebildner: weiße Kolonien
2. BESTIMMUNG DER COLIFORMEN KEIME IN ROHMILCH:
Bedeutung der Coliformen Keime:
 technologische Bedeutung bei innerbetrieblichen Untersuchungen und Qualitätskontrollen
(Erfolg bei Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen)
 bes. Bedeutung bei allen Produktuntersuchungen (Rekontaminationsflora besteht nicht nur
aus Coliformen)
 Schadkeim (z.T. pathogen, Toxinbildner und Bildung von biogenen Aminen oder
Fehllochung bei Käse)
 Zur Beurteilung der hygienischen Beschaffenheit – Hygieneindikator
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Nährmedium:
Methode:
Bebrütung:
Auswertung:
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VRBL-Agar (15ml)
Plattengussverfahren mit Overlayer. Die erstarrten Agarplatten werden
mit ca. 4 ml VRB-Agar überschichtet, um anaerobe Bedingungen zu
erhalten.
24+/- 2 h bei 30 °C
10 – 150 Kolonien/Platte, rote Kolonien mit/ohne rötl. Präzipitathof
3. BEISPIEL: UNTERSUCHUNG VON NICHT AUFBEREITETEM TRINKWASSER
Kriterium
Grenzwerte
Gesamtkeimzahl bei 22°C
100/ml
Gesamtkeimzahl bei 37°C
20/ml
Coliforme
Negativ/100ml
E. coli
Negativ/100ml
Enterokokken
Negativ/100ml
NACHWEIS VON HEMMSTOFFEN IN MILCH
Im weitesten Sinn versteht man unter Hemmstoffen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung.
Wenn aber von "Hemmstoffnachweis" gesprochen wird, meint man im allgemeinen den
Nachweis von Antibiotika, speziell von Penicillin.
1. Agardiffusionsverfahren -Beispiel: Papierscheibchenmethode nach Galesloot
Testkeim: Bac. stearothermophilus
Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,0025 IE/ml.
2. Brillantschwarz-Reduktionstest (BR-Test) §35 LMBG 01.0042-52(EG) Kap. VIII
Testkeim: Bac. stearothermophilus var. calidolactis mit Brillantschwarz als Redox-Indikator
3. Joghurt-Test nach FRANK
Die Milchprobe wird durch Erhitzen keimarm gemacht, mit Joghurt, Methylenblau und einem
Wuchsfaktor für Streptococcus thermophilus versetzt und bebrütet. Die Reduktion des
Methylenblaus wird als Maß für eventuell in der Milch vorhandene Hemmstoffe gewertet. Die
Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,01 IE/ml
4. Penzymtest
Der Penzymtest ist ein enzymatischer Farbschnelltest zum Nachweis von ß-LaktamAntibiotika (z.B. Penicillin). Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei ca 0,017 IU/ml.
Der Test dauert ca. 20 Minuten.
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5. Charm-Test
Der Charmtest ist ein sogenannter mikrobieller Rezeptortest. Die Nachweisgrenze dieser
Methode liegt bei 3-4 ppb Penicillin.
6. Nachweis von Antibiotika mittels ELISA
Immunologischer Test; Antigen = Antibiotikum
METHODEN DER KEIMZAHLBESTIMMUNG VON OBERFLÄCHEN,
GEBINDEN UND LUFT
Abklatschverfahren:
Abklatsch mit Schwämmen
Rodac-Platten
Bacto-Strip-Streifen
Agaroid-Stangen
Abschwemmverfahren
Abstrichverfahren
Überschichtungsverfahren
Bestimmung der Luftkeimzahl
Obwohl die Luft als Kontaminationsträger häufig überschätzt wird, ist es trotzdem ratsam, die
Luftkeimzahl besonders in Räumen mit unverpackten Roh- und Fertigwaren regelmäßig zu
überprüfen. Dabei können unter Umständen nicht nur Keimmengen, sondern auch die
vorhandenen Keimarten von Interesse sein.
In der Praxis beschränkt man sich im allgemeinen auf den Nachweis koloniebildender
Einheiten von Bakterien und Pilzen. Dabei bedient man sich folgender Methoden:
- Sedimentationsverfahren
- Gelatine-Membranfilter-Verfahren
- Impingment-Verfahren
- Impaction-Verfahren
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MATERIALAUFWENDUNGEN - UND BESCHAFFUNG, DIDAKTIK IN DEN ÜBUNGEN
Inhalt und Abfolge der Übungseinheiten:
Laborordnung – Einführung in die Laborbegebenheiten
Definition von mikrobiologischem - aseptischem Arbeiten
Mikroskop – mikroskopische Präparate
Nährmedienbereitung – Sterilisationstechnik
Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen
 Bouillonkulturen
 Agarstrich-, Agarstichkulturen
 Kultivierung auf Agarplatten
 Koch`sches Plattenguss-Verfahren
 Spatel-Verfahren
 Petrifilm-Methode
 Most probable number MPN-Technik
 Titer-Verfahren
 Schüttelkulturen
Nachweismethoden gleich an verschiedenen Lebensmitteln
Rohmilch; Wasser, Eis, Käse, Wurst
Personal- und Betriebshygiene
Hemmstoffe
Identifizierung – API, VIDAS....
Stoffwechselprodukte – Essigsäureproduktion im Schüttelkolben
Gel-Elektrophorese - Einsatzbereiche
Bücher:
-
Jürgen Baumgart, Mikrobiologische Untersuchungen von Lebensmittel. Behr´s Verlag
Losblattsammlung
Behr´s Verlag: Grundlagen, Milch und Milchprodukte, Fleisch und Fleischerzeugnisse,
Getränke, pflanzliche Lebensmittel, Hygiene Management, HACCP in der Praxis
R. Näveke & K. Tepper, Einführung in die mikrobiologischen Arbeitsmethoden mit
Praktikumsaufgaben. Gustav Fischer Verlag
R. Süßmuth, Biochemisch-mikrobiologisches Praktikum. Thieme Verlag
H. G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie. Thieme Verlag
Bergey`s, Manual of Determinative Bakteriology, Williams-Wilkins Comp., Baltimore
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