Phylogenie der Pflanzen
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KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] Phylogenie der Pflanzen: Evolution der grünen Organismen Man muss sich nur die Umwelt genauer anschauen, um sich der Vielfalt und der Vorherrschaft der Pflanzen bewusst zu werden. Mit dem Sprung auf das Land haben die Landpflanzen einzigartige Innovationen, z.B. die Gametangien, die Leitgefässe und die Spaltöffnungen erfunden, die es ihnen in der Folge ermöglicht haben, die terrestrischen Ökosysteme zu dominieren und so die Umwelt global zu beeinflussen. Was sind die Treiber der ungeheuren Vielfalt im Pflanzenreich? Mit welchen wissenschaftlichen Methoden werden diese Treiber erforscht und die Entstehungsgeschichte der Pflanzen entschlüsselt? Das heutige Praktikum zur Phylogenie der Pflanzen hat zum Ziel, diese Fragen konzeptionell und experimentell zu beantworten. In diesem Praktikum geht es darum, Stammbäume, welche mit molekularbiologischen Methoden erstellt wurden, mit einem klassisch erstellen Stammbaum aufgrund morphologischer Merkmale, also aufgrund der drei Homologiekriterien, zu vergleichen. Dabei wollen wir sehen, ob beide identisch sind und wenn nicht, wie die Unterschiede zu interpretieren sind. Die Ziele dieses Praktikums: Kennenlernen der wissenschaftlichen Konzepte zur Beschreibung der Phänomene der Evolution: Mikroevolution (Veränderungen innerhalb einer Art durch Mutationen, natürliche Selektion und genetische Drift). Makroevolution (Artbildung und Evolutionsgeschichte von Artengruppen) Erstellen verschiedener molekularer phylogenetischer Stammbäume mit Hilfe einer Datenbank (www.uniprot.org) und einer kostenlosen Bioinformatik-Software (http://education.expasy.org/cgi-bin/philophylo/philophylo.cgi) Erstellen klassischer phylogenetischer Stammbäume mit Pflanzen basierend auf phänotypischen Merkmalen (klassische Phylogenie) Kennenlernen von bioinformatischen Programmen Last but not Least: Bestätigung der Evolutionstheorie Seite 1 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] Teil 1: Morphologische Phylogenese (mit Pflanzen) 1. Versuchen Sie, die Pflanzen aufgrund ähnlicher morphologischer Merkmale in gemeinsame Gruppen einzuteilen. Welche Kriterien können herangezogen werden? Gibt es bessere bzw. unbrauchbare Kriterien? Diskutieren Sie gemeinsam in der Gruppe. Bilden Sie nun Gruppen mit den Pflanzen. Praktisch ist es natürlich, wenn Sie die Pflanzen bereits mit den korrekten Namen ansprechen können. Seite 2 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] 2. Versuchen Sie nun, die Pflanzennamen in die richtige Gruppe einzutragen (+ = vorhanden, - = nicht vorhanden): GefässSamenSamenSamenSamenSporenpflanzen pflanzen pflanzen pflanzen pflanzen -> Nackt-> -> Bedeckt- -> Bedecktsamige Bedecktsamige samige samige -> -> -> ZweikeimZweikeimEinkeimblättrige blättrige blättrige -> Rosen-> Asternähnliche ähnliche Pflanzennamen Bilden Sporen als Verbreitungseinheiten Bilden Samen als Verbreitungseinheiten Haben ein sekundäres Dickenwachstum Haben meistens Nadeln Haben Laubblätter Leitgefässe parallel od. gabelig angeordnet Leitgefässe netzartig angeordnet Besitzen eine Blütenhülle Haben Perigonblätter (keine Kelchbl. vorh.) Haben Kelch- und Kronblätter Kronblätter sind miteinander verw. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Seite 3 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] Wichtige Erklärungen: Die Blütenhülle oder Perianth ist die Gesamtheit der sterilen Blattorgane in der Blüte von bedecktsamigen Pflanzen. Als doppelt wird eine Blütenhülle bezeichnet, die in Kelch und Krone gegliedert ist. Eine einheitliche Blütenhülle ist nicht in Kelch und Krone gegliedert und wird als Perigon bezeichnet. Bei den nacktsamigen Pflanzen (Gymnospermae) ist die Samenanlage "nackt", d.h. sie ist nicht von einem Fruchtblatt eingehüllt. Bei den bedecktsamigen Pflanzen (Angiospermae) ist die Samenanlage "bedeckt", d.h. sie ist von einem Fruchtblatt umschlossen. Bei den bedecktsamigen Pflanzen kann zwischen Einkeimblättrigen und Zweikeimblättrigen unterschieden werden: Wie der Name suggeriert, haben Einkeimblättrige im Samen nur ein Keimblatt im Gegensatz zu den Zweikeimblättrigen, welche zwei Keimblätter im Samen ausbilden und demzufolge auch mit einem statt zwei Keimblättern die Erde durchbohren und das Licht der Welt erblicken. Bei den einkeimblättrigen Pflanzen handelt es sich um krautige Pflanzen, Holzpflanzen kommen nicht vor. Die einzigen baumförmigen einkeimblättrigen Vertreter sind die Palmen. Bei den zweikeimblättrigen Pflanzen gibt es noch solche ohne einer Blütenhülle bzw. nur mit einer sehr einfachen (viele laubtragende Bäume, Wolfsmilchgewächse, u.a.). Um dieses Praktikum nicht allzu kompliziert zu gestalten, wurden diese Vertreter hier weggelassen. 3. Wie würden Sie nun einen Stammbaum der obigen Pflanzengruppen aufgrund morphologischer Kriterien skizzieren? Seite 4 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] Teil 2: Molekulare Phylogenese (am Computer) Für diese Analyse verwenden wir als gemeinsame Eigenschaft zwischen den Arten das Gen RBCL und dessen Genprodukt, das Enzym für die Bildung der grossen Untereinheit des Enzyms RuBisCO (Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase). Dieses Enzym übt eine Schlüsselfunktion in der Fotosynthese (genauer: im Calvin-Zyklus) der Chloroplasten aus, indem es für die Bindung von atmosphärischem CO2 zur Bildung von Traubenzucker (Glucose) verantwortlich ist. Die Chloroplasten sind das evolutionäre Produkt einer Endosymbiose zwischen einer zur Fotosynthese unfähigen Eukaryotenzelle und eines photosynthesefähigen Bakteriums (Endosymbiontentheorie). Die Chloroplasten besitzen eine eigene DNA und werden als halb-autonome Organellen betrachtet. Im Gegensatz zu den Gensequenzen, die für die kleinen Untereinheiten (small chain) von RuBisCO codieren und sich im Zellkern befinden, sind diejenigen, die für die grossen Untereinheiten (large chain) codieren, in der DNA der Chloroplasten zu finden. Da jeder Nachkomme aus der Linie der zur fotosynthesefähigen Organismen die Chloroplasten seiner Mutter besitzt, können wir das Gen der grossen Untereinheit von Rubisco benutzen, um die Evolution der 'grünen' Organismen in den letzten ungefähr 300 Millionen Jahren nachzuverfolgen! Genauso wie wir die mitochondriale DNA verwendet haben, um die Verwandtschaft von Neandertalern und dem modernen Menschen zu ergründen. Wir werden nun die Aminosäuresequenzen von RuBisCO von verschiedenen Pflanzen in Internet-Datenbanken suchen und kopieren. Anschliessend werden wir mit bioinformatischen Algorithmen (multiples Alignment) quasi die Unterschiede ermitteln und versuchen, die verwandtschaftlichen Beziehungen in einem Stammbaum darzustellen. Dabei gehen wir am Computer wie folgt vor: Anleitung: 1. Starten Sie einen Browser und gehen Sie auf: http://www.uniprot.org (frei zugängliche internationale Proteindatenbank) 2. Im grossen Textfeld mit der Bezeichnung « UniProtKB » kann der Name des Enzyms, gefolgt vom Organismenreich und den wissenschaftlichen Bezeichnungen der gesuchten Organismenart eingegeben werden. Suchen Sie als Erstes die Aminosäuresequenz von RuBisCO bei der einheimischen Fichte (Picea abies). Geben Sie dazu folgendes ein: « name: Ribulose bisphosphate carboxylase large chain AND reviewed:yes AND viridiplantae AND Picea abies ». Klicken Sie rechts auf den Button « Search ». 3. Wählen Sie unter „Results“ die gewünschte Proteinsequenz aus, indem Sie auf das Quadrat auf der linken Seite klicken. 4. Klicken Sie oben auf den Button « Add to basket ». Nun haben Sie die Aminosäuresequenz des Enzyms (= Protein) Ribulose bisphosphate carboxylase large chain von Picea abies in den Zwischenspeicher von UniProtKB gelegt. (Sie können maximal 400 Aminosäureketten im Zwischenspeicher deponieren!) 5. Verfahren Sie nun genauso mit den restlichen 17 Arten vom letzten Praktikum, indem Sie jeweils in der Suchanfrage nur den Gattungs- und Artnamen ändern. Also geben Sie für die zweite Art (Rosa damascena) folgende Text-Anfrage ein: « name: Ribulose bisphosphate carboxylase large chain AND reviewed:yes AND viridiplantae AND Rosa damascena ». Kontrollieren Sie durch Anklicken des Dreieckssymbols rechts vom Warenkorb-Bild mit der Bezeichnung „Basket“, ob sich die Aminosäuresequenz auch tatsächlich im Zwischenspeicher (Korb) befindet. Wichtig: Sollte von einer gewünschten Art die Proteinsequenz noch nicht vorhanden sein (Meldung: Sorry, no results found for Seite 5 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] 6. 7. your search term.), so können Sie lediglich mit dem Gattungsnamen der Pflanze suchen, indem Sie das Art-Epitheton löschen, und irgendeine andere Art aus dieser Gattung aus der List ankreuzen bzw. auswählen. Folgende Pflanzenarten haben wir letztes Mal für den morphologischen Stammbaum verwendet: 1) Picea abies (Fichte), 2) Rosa damascena, 3) Geranium robertianum (Storchschnabel), 4) Gladiolus communis, 5) Euonymus europaeus (Pfaffenhütchen), 6) Ginkgo biloba, 7) Zea mays (Mais), 8) Pinus sylvestris (Föhre), 9) Lavandula angustifolia (Lavendel) 10) Cichorium intybus (Wegwarte), 11) Daucus carota (Wilde Möhre), 12) Triticum aestivum (Weizen), 13) Hordeum vulgare (Gerste), 14) Avena sativa (Hafer), 15) Nymphaea alba (Seerose), 16) Polystichum aculeatum (Schildfarn), 17) Lotus corniculatus (Hornklee), 18) Equisetum hyemale (Schachtelhalm) Haben Sie alle Proteinsequenzen gefunden und im Zwischenspeicher deponiert, so kontrollieren Sie nun, ob Sie wirklich von allen gesuchten Arten die Aminosäuresequenz gespeichert haben. Klicken Sie hierzu wiederum auf das Dreieckssymbol rechts vom Warenkorb. Klicken Sie anschliessend auf den Button mit der Bezeichnung „Download“, selektieren Sie „Download all“ und wählen Sie als Format „FASTA (canonical)“. Speichern Sie die fasta-Datei an einem Ort, wo Sie sie später wiederfinden. Hinweis: Das FASTA-Format ist ein textbasiertes Format zur Darstellung und Speicherung der Primärstruktur von Nukleinsäuren (Nukleinsäuresequenz) und Proteinen (Proteinsequenz) in der Bioinformatik. Die Nukleinbasen bzw. Aminosäuren werden durch einen Ein-BuchstabenCode dargestellt. Das Format erlaubt es, den Sequenzen einen Namen und Kommentare voranzustellen. Aminosäuren (Ein- und Drei-Buchstaben Code): A (Ala) Alanin C (Cys) Cystein D (Asp) Asparaginsäure E (Glu) Glutaminsäure F (Phe) Phenylalanin G (Gly) Glycin H (His) Histidin I (Ile) Isoleucin K (Lys) Lysin L (Leu) Leucin M (Met) Methionin N (Asn) Asparagin P (Pro) Prolin Q (Gln) Glutamin 8. R (Arg) Arginin S (Ser) Serin T (Thr) Threonin V (Val) Valin W (Trp) Tryptophan Y (Tyr) Tyrosin Um den Inhalt der fasta-Datei anzuzeigen, öffnen Sie die Datei in einem gewöhnlichen Text-Editor. Wählen Sie im Editor-Fenster mit der Tastenkombination « Ctrl + A » sämtliche Aminosäuresequenzen aus und kopieren Sie diese mit der Tastenkombination « Ctrl + C » in den Zwischenspeicher des Computers. 9. Öffnen Sie im Browser einen neuen Tab und geben Sie dort folgende Internet-Adresse ein: http://education.expasy.org/cgi-bin/pyphylo/index.cgi?lang=de Wählen Sie auf der PyPhylo-Webseite den Radio-Button « Fasta-Sequenzen reinigen » aus und klicken Sie anschliessend auf « Weiter ». (Hinweis: Manchmal ist dieser Server ausgelastet, und Ihre Anfrage kann nicht bearbeitet werden. In diesem Fall müssen Sie in einem Texteditor die Fasta-Sequenzen selber bereinigen, indem Sie in der ersten Zeile jeder Art alles ausser das „>“-Zeichen und den Artnamen (z. B. Picea abies) löschen. Achten Sie aber darauf, dass die Textzeile mit dem „>“-Zeichen und die nachfolgende Aminosäurekette durch einen Zeilenumbruch voneinander getrennt sind. Genauso muss die nächste Artbezeichnung mit einer neuen Zeile beginnen.) 10. Mittels der Tastenkombination « Ctrl + A » werden sämtliche bereinigte Aminosäuresequenzen ausgewählt und mit der Tastenkombination « Ctrl + C » in den Seite 6 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] Zwischenspeicher des Computers transferiert. Fügen Sie dessen Inhalt mit der Tastenkombination « Ctrl + V » auf der Website http://www.genome.jp/tools/clustalw/ in das freie Feld ein. Wählen Sie als Ausgabeformat „CLUSTAL“. Klicken Sie auf den Button « Execute Multiple Alignment». Anschliessend müssen Sie noch unter „Select tree menu“ das Feld „Rooted phylogenetic tree (UPGMA)“ auswählen. Klicken Sie zum Schluss auf den Button „Exec“. 11. Zeichnen Sie den Stammbaum in den nachfolgend freien Platz hinein. Hinweis zur Interpretation: Beim dargestellten Phylogramm ist die Länge der Zweige proportional zu den (Aminosäure-)Unterschieden. Sie hängt von der Geschwindigkeit der Evolution ab (Anzahl Änderungen in einem gegebenen Zeitraum). 4. Vergleichen Sie den molekularbiologischen mit dem morphologischen Stammbaum vom letzten Praktikum. Wo gibt es Übereinstimmungen? Wo erhalten Sie ganz andere Ergebnisse? Was könnten die Gründe dafür sein? Seite 7 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] Quellen: Dr. Carole B. Rapo: http://www.swissplantscienceweb.ch/education/secondary-school-interface/ Dr. Peter Linder: WBZ-Weiterbildungsveranstaltung im Botanischen Garten der Universität Zürich Wikipedia Seite 8 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] Lösungen: 2. Pflanzennamen Bilden Sporen als Verbreitungseinheiten Bilden Samen als Verbreitungseinheiten Haben ein sekundäres Dickenwachstum Haben meistens Nadeln Haben Laubblätter Leitgefässe parallel od. gabelig angeordnet Leitgefässe netzartig angeordnet Besitzen eine Blütenhülle Haben Perigonblätter (keine Kelchblätter vorh.) Haben Kelch- und Kronblätter Kronblätter sind miteinander verwachsen GefässSporenpflanzen -> Farne, Schachtelhalme Samenpflanzen -> Nacktsamige Samenpflanzen -> Bedecktsamige -> Einkeimblättrige Samenpflanzen -> Bedecktsamige -> Zweikeimblättrige -> Rosenähnliche Samenpflanzen -> Bedecktsamige -> Zweikeimblättrige -> Asternähnliche Polystichum aculeatum, Equisetum hyemale Picea abies, Pinus sylvestris, Ginkgo biloba Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Avena sativa, Zea mays, Gladiolus communis Nymphaea alba, Euonymus europaeus, Geranium robertianum, Rosa damascena Cychorium intybus, Lavandula angustifolia, Daucus carota, Lotus corniculatus + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Seite 9 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] 3. Bedecktsamer (mit Fruchtknoten) Zweikeimblättrige Bärlapp (Selaginella) Psilotum Farn & Schachtelhalm Nacktsamer Einkeimblättrige Rosenähnlich e Asternähnliche Kronbl. verw. Kelch- u. Kronbl. Fruchtgehäuse Samen Sporen Ein mögliches Resultat mit Ribulose bisphosphate carboxylase large chain: Seite 10 KANTONSSCHULE SCHAFFHAUSEN, Biologie, Raphael Riederer E-Mail: [email protected] 4. Interpretation: Gute Übereinstimmung gibt es bei den Farnen und Nacktsamern. Auch die Getreidearten bilden eine mehr oder weniger natürliche Verwandtschaftsgruppe (in der Pflanzenzüchtung jahrelang untereinander gekreuzt). Asteridae und Rosidae werden schlecht getrennt. Gründe: Wahrscheinlich bilden diese beiden Gruppen keine natürliche Verwandtschaftsgruppe, oder die verwachsenen bzw. freien Kronblätter sind mehrfach in der Evolution durch Konvergenz entstanden. Prinzipiell ist das Verfahren des multiple Alignment mit Fehlern behaftet: Gibt es eine Mutation z. B. von F nach A und anschliessend eine zweite von A nach F, bleibt diese unerkannt, somit wird diese evolutionäre Veränderung nicht bemerkt. Andererseits, wenn es eine Mutation z. B. von R nach F und anschliessend eine zweite von F nach Y gibt, wird diese lediglich als eine gezählt. Auch hier ist die evolutionäre Distanz tatsächlich höher als mit dem multiplen Alignment erkannt. Mögliches Pflanzenmaterial im August (mind. jeweils zwei Vertreter): Gefäss-Sporenpflanzen: Farne: Gemeiner Wurmfarn (Dryopteris filix-mas), Gelappter Schildfarn (Polystichum aculeatum) Schachtelhalme: Überwinternder Schachtelhalm (Equisetum hyemale) Gymnospermae: Eibe (Taxus baccata), Weisstanne (Abies alba), Fichte (Picea abies), Waldföhre (Pinus sylvestris), Lebensbaum (Thuja occidentalis, T. orientalis, T. plicata), Ginkgo (Ginkgo biloba) Monokotyledonae: Schwimmendes Laichkraut (Potamogeton natans), Aronstab (Arum maculatum), SeeFlechtbinse (Schoenoplectus lacustris), Weissliche Hainsimse (Luzula luzuloides), Segge (Carex sp.), Weizen (Triticum aestivum), Gerste (Hordeum vulgare), Hafer (Avena sativa), Mais (Zea mays), Schilf (Phragmites australis), Breitblättriger Rohrkolben (Typha latifolia), Herbst-Zeitlose (Colchicum autumnale), Weinberg-Lauch (Allium vineale), Gemeine Zwiebel (Allium cepa), Knoblauch (Allium sativum), Zartblättriger Spargel (Asparagus tenuifolius), Salomonssiegel (Polygonatum sp.), Garten-Gladiole (Gladiolus communis) Rosidae (nie verwachsene Kronblätter): Storchschnabel (Geranium sp.), Pfaffenhütchen (Euonymus europaeus), Sauerklee (Oxalis acetosella), Hülsenfrüchtler (als Ausnahme! – aber molekularbiologisch ergibt sich nähere Verwandtschaft), Rose (Rosa sp.), Seerose (Nymphaea alba), Malve (Malva sp.), Stockrose (Alcea rosea), Kreuzblütler (Brassica napus), Rot-Klee (Trifolium pratense) Asteridae (verwachsene Kronblätter): Besenheide (Calluna vulgaris), Winden (Convolvulus sp.), Gewürzfenchel (Foeniculum vulgare), Wilde Möhre (Daucus carota), Origano (Origanum vulgare), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Pfefferminze (Mentha sp.), Wegwarte (Cychorium intybus), Bocksbart (Tragopogon orientale), Lavendel (Lavandula angustifolia) Seite 11
