Regulation of acquired immune responses
during infection with intracelllular bacteria
”Vaccines”
Geschichte der Vakzinierung: eine Erfolgsgeschichte !
Vor und nach Einführung des Impfstoffes (CDC seit 1912)
Polio
Pocken
Masern/Mumps/Röteln
Diphtherie
Keuchhusten
100 % (USA, Westeuropa)
100 % (weltweit)
99 % (USA)
99 % (USA, Westeuropa)
97 % (USA)
Vor und nach Einführung des Impfstoffes (UK seit 1999)
Neisseria meningitidis C
Salmonella Vi Konjugat
92 % (Kleinkinder)
95 % (Heranwachsende)
90 % (2 - 4 jährige Kinder)
Sicherheit ?
Masern-Enzephalopathie
1/1000 natürliche Infektion
1/1.000.000 Impfung
Die drei größten Killer
in Millionen (Jahr 2000)
2.3 AIDS
1,7 TB
0.5 TB/HIV
1.2 Malaria
Dringend benötigte Impfstoffe:
HIV
Tuberkulose
Malaria
Hepatitis C
Chlamydien
Helicobacter pylori
Leishmaniose
Filariose
Schistosomiasis (Bilharziose)
Papilloma Virus
Rotaviren (Durchfallerkrankungen)
Respiratorisches Synzytienvirus (RSV), Rhinoviren
u.v.a.
Nicht nur Infektionskrankheiten
Tumorvakzine
Alzheimer
Neue Ansätze zur Impfstoff-Entwicklung
► Memory/Immuologisches Gedächtnis
► Wirksamkeit von Vakzinen
Nachweis von Immunantworten
► Neue Strategien zur Verbesserung alter
und zur Entwicklung neuer Vakzine !
Memory/Immunologisches Gedächtnis
► B-Zell-Memory
- Antikörper
- Memory-B-Zellen
- Plasmazellen
► T-Zell-Memory
- CD4 Th-Zellen
- CD8 T-Zellen
B-Zellen/Antikörper
► mit wenigen Ausnahmen beruhen alle
zur Zeit verwendeten Impfstoffe auf der
Induktion von B-Zellen/Antikörpern
► Antikörper sind relativ leicht induzierbar
► Die Induktion und Wirksamkeit von
Antikörpern lässt sich relativ einfach
testen.
-> Nachweis der Wirksamkeit der Vakzine
B-Zell-Memory/Antikörper:
Nachweis einer B-Lymphozytenantwort
► Qualitativer und quantitativer Nachweis von
spezifischen Antikörpern
• ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)
• Western-Blot
• Neutralisierungstests
► Nachweis der antikörperbildenden Zellen
• Plaquetest
• ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay)
Memory-T-Zellen
Verschiedene Memory-T-Zellsubpopulationen
► CD4, CD8
► CD4 Th-Zellsubpopulationen (Zytokin-Profil)
- Th1, Th2, Th17….
► Memory-T-Zellsubpopulationen
- central Memory T-Zellen
- effector Memory T-Zellen
► Expression von (hemmenden) Co-Rezeptoren
► Lokalisation der T-Zellen
- Lunge, Darm….
Welche dieser Populationen schützt ??
Central vs Effector-Memory T-Zellen
CD4
CD4
CD8
Sallusto et al, Science 1999
Central vs Effector-Memory T-Zellen
CCR7
CD62L
Gewebe
Proliferation
Effektorfunktion
Cosignale
Lebensdauer
Central
++
++
Lymphgewebe
++
+/?
+
Effector
+/Peripherie
+/++
?
Methoden zur Analyse der erworbenen T-Zellantwort
Problem:
Kein Antigen-spezifisches, den Antikörpern vergleichbares
und einfach messbares Zellprodukt vorhanden!
Qualitative Nachweismethoden für T-Zellen
(z.T. semi-quantitativ)
in vitro
• Proliferation und Zytokinproduktion nach Stimulation mit
dem Antigen
• Zytotoxizität
• Limitierende Verdünnungskultur (Limiting Dilution Assay)
• T-Zellklonierung und Analyse der individuellen Klone
in vivo
• DTH Reaktion (Tuberkulin-Test)
• Bestimmung der schützenden Immunität
“Infektionsexperimente“
Neuere Methoden zur quantitativen und qualitativen
Analyse der T-Lymphozyten-Antwort
• ELISPOT-Assay
• Intrazelluläre Zytokinfärbung nach kurzer
Antigenstimulation
• MHC/Peptid-Komplexe (Tetramere)
Klassisches Beispiel einer
Delayed-Type-Hypersensitivity-Reaction:
Tuberkulin-Test
Zytokintest
Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente)
100
naiv
80
immunisiert mit
einem attenuierten
S. typhimurium-Stamm
60
40
20
0
0
20
40
60
80
Tag nach einer Infektion mit
S. typhimurium (400 i.v.)
Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente)
-> Große Impfstudien können auch als
Infektionsexperiment angesehen werden
ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay)
Methode:
*
*
*
*
APC* ** APC* *
T*
T*
T
*
anti-IFNg-Antikörper
E EE E
Substrat
+ T-Zellen
+ APC
+Antigen
*
*
*
*
APC* ** APC* *
T*
T*
T
*
24h
E EE E
anti-IFNg-Antikörper
-Enzymkomplex
Entfernen
der Zellen
ELISPOT-Assay
Beispiel
ohne
Antigen
mit
Antigen
IFN-g+ Spots/105 Zellen
250
200
150
100
50
0
-
Antigen
naiv
-
Antigen
infiziert
FACS: Intrazelluläre Zytokinfärbung
Prinzip:
Blockade der
Zytokinsekretion
(Brefeldin A)
Fixierung und
Permeabilisierung
der Zellen
intrazelluläre
Zytokinfärbung
mit Antikörpern
Intrazelluläre Zytokinfärbung
Beispiel:
FACS
T
T
T
APZ APZ APZ APZ
T
T
T
T
extra- und
intrazelluläre
Färbung
IFN-g
CD8
T
CD8
Inkubation
APZ APZ APZ APZ
4h
IFN-g
Multizytokin-Produzenten
MHC Klasse I-Tetramere
Prinzip
H-2Kd
Peptid (LLO91-99)
b2-Mikroglobulin
Streptavidin
Biotin
CD8
TZR
Streptavidin
PE
PE
PE
PE
Primärinfektion (103 i.v.)
Titer
Sekundärinfektion (105 i.v.)
0
1
Wochen
2
Primärinfektion
0,02
Tag 4
0,14
Tag 7
2,22
Tag 10
3,11
1,41
Sekundärinfektion
Tag 0
0,36
Tag 3
1,48
Tag 5
20,05
Tag 17
Tag 7
9,44
CD62L FITC
Epitop: Listeriolysin O Peptid 91-99
Tetramer PE
Tag 0
HIV-Infektion
107
3
106
2
105
104
1
103
0
0
100
200
300
Days after HIV infection
Viral load (copies per ml)
HLA-B27-gag 263-272 staining (%)
anti-viral Therapy
102
400
McMichael and Rowland-Jones, Nature 2001 410:908
Akute Infektiöse Mononukleose
(Epstein-Barr-Virus)
Callan et al. JEM 1998 187:1395
Grundlagenforschung und Vakzine-Entwicklung:
Biologie der Immunantwort:
• Welche Immunantwort schützt?
(Welche führt zu Pathologie?)
• Tiermodelle zur Testung
• Korrelat für Schutz im Menschen.
Biologie des Erregers:
• Lokalisation im Wirt, in der Wirtszelle?
• Virulenzfaktoren, Attenuierung (Abschwächung)
• Impfstoff-Kandidatenauswahl.
- Genome, Proteome.
- Welche Antigene macht der Erreger im Wirt?
Hauptproblem:
Wie sieht eine schützende Immunantwort
überhaupt aus?
“Correlates of protection“
Correlates of protection
Für wichtige Krankheitserreger ist unklar wie eine
schützende Immunantwort aussieht!
► B-Zellen und/oder T-Zellen?
► Zielstrukturen/Antigene für T- und B-Zellen?
► Quantität der Memory-T-Zellen?
► Qualität der Memory-T-Zellen?
- Zytokinprofil (multi-Zytokinproduzenten)
- Oberflächenmoleküle
- Langlebigkeit
- Effektorfunktionen/Proliferation
Neue Strategien:
1. Subunit-Vakzine: - rekombinante Proteine
- Peptide, Peptide-Agglomerate
2. Lebend attenuiert: gezielte Eliminierung von Virulenzfaktoren
3. Lebend rekombinant:
- Antigene (Eigen-, Fremd-)
- Zytokine (IL-12, GM-CSF)
- Zytolysine (Listeriolysin)
4. DNA: Antigene, Zytokine, CpG-Motive
5. Neue Adjuvantien
6. Prime-Boost-Ansätze
Subunit-Vakzine
+
rekombinante
Proteine
sicher, definiert, stabil
richtige Konformation
(B-Zellen)
wenig immunogen
keine CD8 T-Zellen
-> Lipoproteine, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate
Peptide
sicher, definiert, stabil
billig
wenig immunogen
keine CD8 T-Zellen
Konformation (B-Zellen)
MHC (Impflöcher)
-> Lipopeptide, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate,
Choleratoxoid-Konjugate, Polypeptide mit Schnittstellen
für Proteasomen
Attenuierte (rekombinante) Lebend-Vakzine
+
Lebend/
attenuiert
ähnlich der Infektion,
immunogen, Gedächtnis,
mukosale Immunität,
Persistenz,
multivalent
immunstimulatorisch
lange Erfahrung
(Vaccinia, Adenoviren,
BCG, Salmonellen)
Entzündung
Sicherheit
Immunsuppression
Reversion
Rekombination
-> Expression rekombinanter Fremdantigene,
Zytokine; Prime/Boost Vakzinierung
Nackte DNA Vakzine
+
Nackte
DNA
Persistenz, ähnlich
der Infektion,
billig, haltbar
CD4, CD8 T-Zellen,
B-Zellen
Sicherheit ?
Einbau
Zytokingene
CpGs: hohe konzentrationen nicht-methylierter Motive
Aktivierung von TLR-9 -> TH1 -Antwort
Adjuvantien
+
-
Adjuvantien Depoteffekt
Entzündung
alle Prozessierungswege
Immunstimulation
Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat
ISCOMs, Saponin, Mannosepolymere
Öl in Wasser, Liposomen
Virus-like Particles
Lipid A
Cholera-Toxoid (B-Untereinheit)
Prime-Boost-Vakzinierung
McShane et al. Nat. Med. 2004 10:1240
TB reactive T-Zellen
Prime-Boost-Vakzinierung
Tuberkulose
Ist eine Impfung möglich?
Tuberkuloseerreger leben in Wirtsmakrophagen
Mykobakterien
T-Zellen schützen gegen
Tuberkulose-Erreger
1927: Der Impfstoff M. bovis Bacille-Calmette-Guerin (BCG)
attenuierte M. bovis-Stamm
Léon Charles Albert Calmette
(1.7.1863 - 29.10.1933)
Jean-Marie Camille Guérin
(22.12.1872 - 9.6.1961)
# wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff
# zunehmender Wirkungsverlust!!
Listerien entweichen ins Zytoplasma der Zelle:
Listeriolysin
Listeria
monocytogenes
O min
20 min
Schutz durch einen gentechnisch
veränderten Impfstamm: rBCGureC-Hly
Aerosol Infektion mit dem Beijing Stamm in der Maus.
ungeimpft
BCG
BCG ureC Hly
Grode et al. JCI 2005
Verschiedene Vakzinierungsstrategien gegen SIV gag
in Rhesusaffen
CD4 Zellen
viral load
McElrath et al. Lancet 2008
Die Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung gibt
ihnen mehrere Millionen Euro zur Impfstoffentwicklung.
Wie gehen sie vor?